持続性インスリン誘導体及びその方法
【課題】本発明は、インスリン分子及び血液成分に共有結合する反応基を含むインスリン誘導体の提供。
【解決手段】当該インスリン分子は、ヒト天然インスリン分子であり、そして当該反応基は、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９の位置から選ばれる位置でインスリン分子のアミノ酸と結合される誘導体による。
【解決手段】当該インスリン分子は、ヒト天然インスリン分子であり、そして当該反応基は、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９の位置から選ばれる位置でインスリン分子のアミノ酸と結合される誘導体による。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
（ａ） 本発明の分野
［0001］ 本発明は、持続性インスリン誘導体に関する。より特異的に、当該インスリン誘導体は、インスリン分子及びそれに結合される反応基を含み、当該反応基は、血液成分と共有結合するためのものであり、それゆえ持続性インスリン誘導体を作成する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ） 従来技術の記載
［0002］ インスリンは、細胞表面受容体に結合して、血液からのグルコース吸収を高める出来事のカスケードを開始させる。正常に機能しないインスリンのレベルは、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病などの重篤な障害を導く。Ｉ型糖尿病は、生命を脅かす疾患であり、患者は、生存するために複数回のインスリンの自己投与を毎日行わなければならない。ＩＩ型糖尿病はまた重篤な内科疾患であり、ＩＩ型糖尿病では、インスリンの内部レベルに対して患者により発達された抵抗性のため、インスリンの内部レベルは、血糖の正しいレベルをもはや維持できなくなる。長期間の使用の開始を低減するために、インスリンでの治療は、ライフスタイルの変化の失敗又は従来の血糖制御薬剤が無効になったときに必要となる。
【０００３】
［0003］ 血糖疾患のコントロールの成功は、治療に対する患者の服薬遵守と密接に関わっており、そして必要とされる注射の頻度を減らすことが望まれている。そうするため、新たな持続性インスリン誘導体を提供すること高く望まれている。
【発明の概要】
【０００４】
［0004］ 本発明に従って、インスリン分子と血液成分に共有結合するための反応基を含むインスリン誘導体が提供される。
【０００５】
［0005］ 本発明の好ましい実施態様では、当該インスリン分子は以下の式Ｉ：
【化１】
で表される分子であり、そして反応基は、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９の位置から選ばれる位置でインスリンのアミノ酸に結合される。
【０００６】
［0007］ 本発明の好ましい実施態様では、選択された反応基は、マイケル・アクセプター（α，β不飽和カルボニル部分）、スクシンイミジル含有基、及びマレイミド含有基、より好ましくはＭＰＡ（３-マレイミドプロピオン酸）からなる群由来である。
【０００７】
［0008］ 本発明の好ましい実施態様では、反応基は、インスリン分子のアミノ酸に、リンカー、例えば非限定的に、（２アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、アミノ・エトキシ・エトキシ・スクシニミン酸（amino ethoxy ethoxy succinimic acid）（ＡＥＥＳ）、ＡＥＥＳ-ＡＥＥＳ、２-［２-（２-アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、ＡＥＥＡ-ＡＥＥＡ、-ＮＨ2- （ＣＨ2）n-ＣＯＯＨ、［式中、ｎは１〜２０の整数である］、及び酸素、窒素、又は硫黄原子が取り込まれうる飽和又は不飽和アルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）モチーフ、例えば非限定的にグリシン、３-アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＯＡ）、及び４-アミノ安息香酸（ＡｐｈＡ）、並びにそれらの組合せを介してインスリン分子のアミノ酸に結合される。
【０００８】
［0009］ 本発明の好ましい実施態様では、血液成分は血液タンパク質であり、より好ましくは血清アルブミンである。
【０００９】
［0010］ 本発明に従って、本発明のインスリン誘導体と血液成分を含むインスリン複合体が提供され、ここで当該反応基及び当該血液成分は、当該反応基と当該血液成分との間で形成された共有結合を介して複合体化される。当該複合体は、インビボ又はイクスビボで形成される。
【００１０】
［0011］ 本発明に従って、本発明のインスリン誘導体を、医薬として許容される担体と供に含む医薬組成物が提供される。
【００１１】
［0012］ 本発明に従って、本発明のインスリン複合体を、医薬として許容される担体と供に含む医薬組成物が提供される。
【００１２】
［0013］ 本発明に従って、血糖関連疾患又は障害を患う対象において、血糖関連疾患又は障害を治療する方法であって、本発明のインスリン誘導体、本発明の複合体、及び本発明の医薬組成物の少なくとも１を、当該対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１３】
［0014］ 本明細書中の全ての参考文献は、援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】［0015］ 図１は、天然ヒトインスリンから派生された実施例Ｉ〜実施例ＶＩＩＩを示す。
【図２】［0016］ 図２は、ｗｉｓｔａｒラットの肝臓膜上のインスリン、インスリン誘導体、及びインスリン誘導体の複合体の競合的結合を示す。
【図３】［0017］ 図３は、ｗｉｓｔａｒラットの肝臓膜上のインスリン、インスリン誘導体、及びインスリン誘導体の複合体の競合的結合を示す。
【図４】［0018］ 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞分化段階を示す。
【図５】［0018］ 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞分化段階を示す。
【図６】［0018］ 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞分化段階を示す。
【図７】［0019］ 図７は、インスリン、実施例ＩＩＩ、及びＩＶ、並びにそれらの対応する複合体についての、３Ｔ３-Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース輸送を示す。
【図８】［0020］ 図８は、インスリン、実施例ＩＩＩ、及びＶＩ、並びにそれらの対応する複合体についてのｗｉｓｔｅｒラット脂肪細胞由来の副睾丸脂肪細胞におけるグルコース輸送を示す。
【図９】［0021］ 図９は、インスリン３.６ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１０】［0022］ 図１０は、実施例Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１１】［0023］ 図１１は、実施例Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１２】［0024］ 図１２は、インスリン及び実施例Ｉのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで、並びに実施例Ｉのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１３】［0025］ 図１３は、インスリン及び実施例ＩＩのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで、並びに実施例ＩＩのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１４】［0026］ 図１４は、インスリン及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで、並びに実施例ＩＩＩのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１５】［0027］ 図１５は、皮下注射及び静脈注射された未変性のインスリンの薬物動態プロファイルを示す。
【図１６】［0028］ 図１６は、皮下注射及び静脈注射された実施例ＩＩＩの複合体のインスリンの薬物動態プロファイルを示す。
【図１７】［0029］ 図１７は、皮下注射及び静脈注射された実施例ＩＩＩの薬物動態プロファイルを示す。
【図１８】［0030］ 図１８は、皮下注射されたインスリン、実施例ＩＩＩ、及び実施例ＩＩＩの複合体の薬物動態プロファイルの比較を示す。
【図１９】［0031］ 図１９は、静脈注射されたインスリン、実施例ＩＩＩ、及び実施例ＩＩＩの複合体の薬物動態プロファイルの比較を示す。
【図２０】［0032］ 図２０は、ストレプトゾシン誘発糖尿病ラットにおいて、インスリン、実施例Ｉ〜ＩＶ、及び溶媒の皮下注射後の薬力学プロファイルの比較を示す。
【図２１】［0033］ 図２１は、ストレプトゾシン誘発糖尿病ラットにおいて、インスリン、実施例Ｉ〜ＩＶの複合体、及び溶媒の皮下注射後の比較の薬力学プロファイルを示す。
【図２２】［0034］ 図２２は、実施例ＩＩＩの繰り返しの皮下注射の比較の薬力学プロファイル（1日目対６日目対１２日目対コントロール）を示す。そして
【図２３】［0035］ 図２３は、実施例ＩＩＩの複合体の繰り返された皮下注射の比較の薬理学プロファイル（１日目対６日目対１２日目対コントロール）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［0036］ 本発明に従って、持続性インスリン誘導体が提供される。より特異的に、当該インスリン誘導体は、インスリン分子及びそれに結合する反応基を含み、当該反応基は、血液成分に共有結合するためのものである。本出願では、インスリン反応基−血液成分の複合体の形成をもたらす共有結合は、本発明のインスリン誘導体を投与した際に、インビボで形成されうるということが意図される。当該共有結合が、本発明のインスリン誘導体を、組み換えアルブミンであるアルブミンソース又は対象の血漿から抽出されたアルブミンソースと接触することにより、又は他の適切なソースのいずれかから提供することによりイクスビボで生じうるということも意図される。ここで当該ソースは、当業者により知られている。
【００１６】
［0037］ インスリン分子は、未変性のヒトインスリン（例えば、下記式Ｉにおける未変性ヒトインスリンの配列を参照のこと）であるか、又はそのアナログ、例えばアミノ酸置換（１又は複数）、アミノ酸欠失（１又は複数）、又はアミノ酸添加（１又は複数）を有するインスリン分子などでありうる。以下は、本発明に従って使用されうるインスリン・アナログの例として記載されており、本アナログを制限する意図はない：Aventis Pharmaceuticals Inc.,のランタス（商標）と呼ばれるインスリン・グラルギン（当該薬剤はＡ２１の位置で置換されたグリセリンを有し、そしてＢ鎖のＣ−末端において加えられた２のアルギニン残基を有する）、Novo Nordisk A/Sのレべミール（商標）と呼ばれるインスリン・デテミール（当該薬剤は、Ｂ３０の位置でスレオニンが欠失され、そしてリジンＢ２９の側鎖上に加えた未変性ヒト・ヒトインスリンである）；Eli lillyのヒューマログ（商標）と呼ばれるインスリン・リスプロ（当該薬剤は、Ｌｙｓ Ｂ２８、ＰｒｏＢ２９ヒトインスリンである）；Novo Nordisk A/S、ノボログ（商標）と呼ばれるインスリン・アスパート（該薬剤はＡｓｐ Ｂ２８ヒト・インスリンである）；並びにAventisのアピドラ（Ａｐｉｄｒａ）（商標）と呼ばれるインスリン・グルリシン（Glulisine）（当該薬剤は、Ｌｙｓ Ｂ３、Ｇｌｕ Ｂ２９ヒト・インスリンである）である。
【化２】
【００１７】
［0038］ 反応基は、インスリン分子又はそのアナログ上の異なる官能基に結合されうる。好ましくは、当該反応基は、インスリン分子の利用できるアミノ基、例えばＡ鎖及びＢ鎖のＮ−末端アミノ酸のαアミノ基、又はＬｙｓ Ｂ２９のε−アミノ基に結合される。本発明に従って、置換された及び／又は加えられたアミノ酸（１又は複数）を含むインスリン・アナログは、反応基を結合するためのさらなるアミノ基を含んでもよいか；或いは反応基が結合するために適した他の官能基を含みうる。インビボ又はイクスビボで、血液成分を共有結合することができる好ましい反応基は、マイケル・アクセプター（α，β、不飽和カルボニル部分）スクシンイミジル含有基及びマレイミド含有基である。より好ましい反応基は、マレイミド含有基であり、そしてより得意的にＭＰＡ（３−マレイミド・プロピオン酸）である。
【００１８】
［0039］ 場合により、反応基は、リンカーを介してインスリン分子に結合される。当該リンカーは、好ましくは、ヒドロキシエチル・モチーフ、例えば（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、アミノ・エトキシ・エトキシ・スクシニミン酸（ＡＥＥＳ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ・酢酸（ＡＥＥＡ）、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ、−ＮＨ2−（ＣＨ2）ｎ−ＣＯＯＨ［式中、ｎは１〜２０の整数である］、飽和又は不飽和の１以上のアルキル鎖（Ｃ１−Ｃ１０）であって、酸素、窒素、又は硫黄原子を含みうるアルキル鎖モチーフ、例えばグリシン、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡｐｈＡ）からなる群から選ばれる。リンカーの組合せの例は、非限定的にＡＥＥＡ−ＥＤＡ、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ、ＡＥＡ−ＡＥＥＡ、ＡＥＥＳ−ＡＥＥＳなどを含む。好ましいリンカーは、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）であるか、又は反応基（ＭＰＡ）でリンカーを使用しないものである。当業者は、どのタイプのリンカーが、本発明の目的のために適しているかを容易に知るであろう。
【００１９】
［0040］ 本発明はまた、インスリン複合体に関する。当該複合体は、その反応基が、共有結合を形成するために、インビボ又はイクスビボで血液成分と反応されたインスリン誘導体を含む。それゆえ、当該複合体は、インビボにおいて、インスリン誘導体の投与により形成されるか、又はイクスビボにおいて、インスリン誘導体を血液溶液又は精製血液成分と、共有結合の形成を許容するイクスビボの条件下で接触することにより形成されうる。精製血液成分は、血液成分からの抽出及び精製により提供されうるか、又は組み替え技術により産生されうる。好ましい血液成分は、血液タンパク質であり、より好ましくは血清アルブミンである。
【００２０】
［0041］ 本発明はさらに、血糖関連疾患又は障害の治療方法であって、インスリン誘導体又はインスリン複合体の投与を含む方法に関する。血糖関連疾患又は障害は、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病、並びに妊娠性糖尿病を含む。また、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、膵炎及び他の膵臓関連疾患もまた、本発明のインスリン誘導体又はインスリン複合体を投与することにより治療されうる。インスリンはまた、成長因子として知られており、そしてそれゆえ、本発明のインスリン誘導体又はインスリン複合体は、傷の治癒及び他の関連する適応のための局所投与に有用でありうる。
【００２１】
［0042］ 以下の実施例は、本発明の範囲を制限する目的ではなく、上記される発明をさらに例示する目的である。
【実施例】
【００２２】
［0043］ 図１は、インスリン分子並びに以下の実施例にそって言及されるＧｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９部位を示す。
【００２３】
実施例Ｉ
（Ｇｌｙ Ａ１）−ＭＰＡ −インスリンの合成
［0044］ インスリン（１００ｍｇ）を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）（２０ｍｌ）及びＴＦＡ（１００μｌ）中に溶解した。当該溶液に、ＮＭＭ（４−メチルモルホリン、２００μｌ）及びＭＰＡ−ＯＳｕ（Ｎ−スクシンイミジル・３マレイミドプロパノエート、９.２ｍｇ２.５当量）を加え、そして当該反応液を２時間攪拌した。水を加えることにより反応を止め、そしてＡｃＯＨ（酢酸）でｐＨ４に調節した。アセトニトリルを加えて、沈殿を溶解し、そして水／アセトニトリル（３：１）の全体の体積は２０ｍｌであった。当該溶液を半調製ＨＰＬＣ中に注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３１％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量で回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。Ｒｔ＝３６〜４６分で純粋な分画を回収し、混合し、そして凍結乾燥して、２３ｍｇの回収されたインスリンと供に白色粉末（４０ｍｇ）を与えた。
【００２４】
［0045］ 計算された質量は、５９５８.５ｇ／molであり、そしてＬＣ−ＭＳにより計測された質量は、５９５８.０ｇ／molである。
【００２５】
［0046］ 表１は、アミノ酸配列分析（フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解）を示し、当該分析は、Ａ鎖のＮ末端がブロックされ、そしてＮ-末端（フェニルアラニン）が、いまだに遊離していたということを確かめるために行われた。
【００２６】
【表１】
【００２７】
実施例ＩＩ
（Ｐｈｅ Ｂ１）-ＭＰＡ-インスリンの合成
［0047］ インスリン（１００ｍｇ）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（４ｍｌ）及びＥｔ3Ｎ（トリエチルアミン）（１００μｌ）中に、超音波処理して溶解した。当該溶液に、Ｂｏｃ2Ｏ（ジ-tert-ブチル・ジカルボネート）（９.３ｍｇ、２.５当量）を加え、そして当該反応液を室温で３０分間攪拌した。反応溶液を、ＡｃＯＨでｐＨ４に調節した。当該溶液を、半調製ＨＰＬＣ中に注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から４０％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。３の産物（Ｂｏｃ-インスリン、Ｇｌｙ Ａ１Ｌｙｓ Ｂ２９-ＢｉｓＢｏｃ-インスリン、及びＴｒｉｓＢｏｃ-インスリン）を単離し、そして所望の（Ｇｌｙ Ａ１ Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＢｉｓＢｏｃ-インスリンを混合し、そして凍結乾燥して白色粉末を与えた（７２ｍｇ）。
【００２８】
［0048］ ＤＭＦ（３ｍｌ）中の（Ｇｌｙ Ａ１ Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＢｉｓＢｏｃ-インスリン（５１mg） を、ＭＰＡ-ＯＳｕ（３６ｍｇ）と、Ｅｔ3Ｎ（３０μｌ）の存在下で反応させた。当該反応液を２時間室温で攪拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させた。当該残基を、ＴＦＡ（２ｍｌ）で１０分間処理し、そして次にＴＦＡを蒸発させた。粗製生成物を水/アセトニトリル（３；１）中で溶解し、そして当該溶液を、半調製ＨＰＬＣ中に注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（ＣＨ３ＣＮ中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３２％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。純粋な分画を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末を与えた（２９ｍｇ）。
【００２９】
［0049］ 計算された質量は、５９５８.５ｇ/ｍｏｌであり、そしてＬＣ-ＭＳにより計測された質量は、５９５８.４ｇ/ｍｏｌであった。
【００３０】
［0050］ アミノ酸配列分析（フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解）を使用して、Ｂ鎖のＮ末端がブロックされ、そしてＡ鎖のＮ末端（グリシン）がいまだに遊離していたことを確認した（表１参照のこと）。
【００３１】
実施例ＩＩＩ
（Ｂ１）-ＭＰＡ-ＯＡ-インスリンの合成
［0051］ （Ｇｌｙ Ａ１ Ｌｙｓ Ｂ２９）−ＢｉｓＢｏｃ−インスリン（３９ｍｇ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）及びＥｔ3Ｎ（３０μＬ）を、ＭＰＡ−ＯＡ−ＯＳｕ（［Ｎ−スクシンイミジル８−Ｎ−（３−マレイミドプロパニルカルボニル）アミノオクタノエート］２５ｍｇ）と４時間反応させた。ＤＭＦを蒸発させ、そして残渣をＴＦＡで１０分間処置した。ＴＦＡを蒸発させた後、残渣を水/アセトニトリル（１：３）中に溶解した。当該溶液を半調製ＨＰＬＣに注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３６％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。純粋な分画を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末（２１ｍｇ）を与えた。
【００３２】
［0052］ 計算されたＭａｓｓは６０９９.５ｇ/ｍｏｌであり、そしてＬＣ-ＭＳにより計測された質量は、６０９９.６ｇ/ｍｏｌである。
【００３３】
実施例ＩＶ
（Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＭＰＡ-インスリンの合成
［0053］ インスリン７４ｍｇをＤＭＳＯ（２ｍｌ）及びＡｃＯＨ（４６μＬ）中に溶解した。当該溶液にＢｏｃ2Ｏ６.９ｍｇ、２.５当量）を加え、そして反応液を５時間室温で攪拌した。水（１５ｍｌ）及びアセトニトリル（５ｍｌ）を加え、そして反応液を半調製ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８フェニル-へキシル）に、流速９.５ｍｌ/分、そして勾配を２７％〜４０％で１２０分間で注入した。４３分での分画を混合し、そして凍結乾燥して（Ｇｌｙ Ａ１ Ｐｈｅ Ｂ１）−Ｂｏｃ２−インスリン（３０ｍｇ）を与えた。
【００３４】
［0054］ （Ｇｌｙ Ａ１ Ｐｈｅ Ｂ１）−Ｂｏｃ2−インスリン（３０ｍｇ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）及びＮＭＭ（４−メチルモルフォリン、１００μＬ）をＭＰＡ−ＯＳｕ（１０ｍｇ）と６０分間反応させた。ＤＭＦを蒸発させ、そして残渣をＴＦＡで１０分間処理した。該残渣を水/アセトニトリル（３：１）中で溶解し、そして溶液を半調製ＨＰＬＣに注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３２％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。純粋な分各を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末を与えた（２２.２ｍｇ）。
【００３５】
［0055］ 計算された質量は、５９５８.５ｇ/ｍｏｌであり、そしてＬＣ-ＭＳにより計測された質量は、５９５８.０ｇ/ｍｏｌである。
【００３６】
［0056］ アミノ酸配列分析（フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解）を使用して、Ｂ鎖Ｎ末端（フェニルアラニン）及びＡ鎖Ｎ末端（グリシン）の両方が、遊離であることを確認した（表１を参照のこと）。
【００３７】
実施例Ｖ
ＭＰＡ（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨリンカーの合成
［0057］ フラッシュカラム・クロマトグラフィーをBiotage（商標）"40iフラッシュ・クロマトグラフィー”モジュラー・システムを使用して行った。半調製ＨＰＬＣ精製を、Phenomex luna（RP-１８、１０μフェニル-へキシル２５０×２１.２ｍｍ）カラムを使用してＷａｔｅｒｓ”Ｂｒｅｅｚｅ”システム１５００シリーズにおいて、９.５ｍｌ/分の移動層流速で行った。Phenomex luna（RP-１８、１０μフェニル-へキシル２５０×５０.０ｍｍ）カラムを、５０ｍｌ/分移動層流速で使用して、Glison６９０システムを調製スケールの精製に使用した。水（０.１％ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）（０.１％ＴＦＡ）の勾配を、各化合物の合成方法において指示された詳細に基づいて使用した。ＬＣ−ＭＳを、ＥＳ１エレクトロスプレー・ソースを備えるＡｇｌｉｅｎｔ１１００シリーズＬＣ-ＭＳＤシングル４極子質量分析計を使用して行った。
【００３８】
【化３】
【００３９】
実施例ＶＩ
（Ｐｈｅ Ｂ１）−ＭＰＡ−（ＡＥＥＳ）2−インスリン
【００４０】
［0058］ メタノール（１５０ｍｌ）中の２-（２-アミノエトキシ）エタノール（５０.０ｇ）を、Ｂｏｃ2Ｏ（９３.４ｇ）と３０分間反応させた。メタノールを吸引下で蒸発させ、そして残渣を酢酸エチル中に溶解し、水、塩類溶液で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発後、粗製生成物を、次のステップに使用した。ＭＳ ｍ/Ｚ ２０５。
【００４１】
［0059］ 保護アルコールを、Ｅｔ3Ｎ（６６ｍｌ）の存在下で、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（５００ｍｌ）中に溶解した。ＭｓＣｌ（メシレート・クロリド）を０℃で３０分かけて滴下して加え、そして室温で１時間攪拌した。ＮａＮ3（１２７.６ｇ）を次に反応混合液に加え、次にＮＭＭ（Ｎ-メチルモルフォリン、２１５ｍｌ）を加え、そして反応液を４０〜５０℃で１６時間攪拌した。反応混合液を酢酸エチル（２ｌ）に注ぎ、そして水で洗浄した。水層を酢酸エチル（２Ｌ）で戻し抽出し、そして混合酢酸エチル層を水、塩類溶液で洗浄し、そして乾燥した。当該溶媒の蒸発後、粗製生成物を次のステップに使用した（１０１.４ｇ、いくらかのＤＭＦを含む）。ＭＳ m/ｚ ２３１。
【００４２】
［0060］ 当該粗製生成物（６２.４ｇ）をメタノール（３００ｍｌ）中に溶解し、次にＰｄ（ＯＡｃ）2（３.０ｇ）及びギ酸（９６％、６２ｇ）を加えた。反応終了後、Ｐｄ種を、セライトを通したろ過により取り除いた。メタノールを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥させた。粗製生成物を次のステップに使用した。
【００４３】
［0061］ 粗製生成物をジクロロメタン中に溶解し、そしてＥｔ3Ｎで塩基性になるまで中和した。無水コハク酸（３２.３ｇ）を一回で加えた。当該反応液を室温で１時間攪拌した。溶媒を吸引下で取り除き、そして残渣を、ＨＣｌ（１Ｎ）により、ｐＨ３に酸性化した。当該生成物を酢酸エチルで抽出した。当該酢酸エチル層を、シリカゲル・プラグ（１ｋｇ）を通した。次に該シリカゲルを、２〜４％メタノールを含む酢酸エチルで洗浄した。純粋な分画（薄層クロマトグラフィーにより判断される）を混合し、そして溶媒を吸引下で取り除いて、Ｂｏｃ-ＡＥＥＳを油状残渣として与えた（３６ｇ、４４％）。ＭＳ ｍ/ｚ ３０５。
【００４４】
［0062］ Ｂｏｃ-ＡＥＥＳ（５.５g）を、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ４.５７ｇ）及びエチル-（ジメチルアミノプロピル）カルボジミド・ヒドロクロリド（ＥＤＣ,７.６２ｇ）を含むジクロロメタン（３０ｍｌ）で２時間処理した。ＮＨＳエステルを酢酸エチル（５００ｍｌ）中に注ぎ、０.１Ｎ・ＨＣｌで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を吸引下で取り除き、そして当該残渣をそのまま次のステップで使用した。
【００４５】
［0063］ Ｂｏｃ-ＡＥＥＳ（６.０５g）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍｌ）で１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥した。（ＡＥＥＳ）アミノ酸をＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）中に溶解し、そして過剰量のＮＭＭで塩基性化した。次に実施例Ｖの粗製生成物を加え、そして反応液を室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、そして残渣を、５〜４０％の勾配を６０分かけて使用する調製ＨＰＬＣに注入した。当該溶媒を取り除き、そして残渣を減圧下で乾燥して、Ｂｏｃ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨを油として与えた（５.６４ｇ、８４％）。ＭＳ ｍ/ｚ４７８.
【００４６】
［0064］ Ｂｏｃ−（ＡＥＥＳ）2−ＣＯＯＨ（３.６０ｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍｌ）で１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥させた。（ＡＥＥＳ）2アミノ酸を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド中に溶解し、そしてＮＭＭで塩基性にした。ＭＰＡ-ＯＳｕ（２.９４）を加え、そして混合液を、３０分間攪拌した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除いた。残渣を水中に溶解し、そして４〜５０％の勾配を６０分かけて使用する調製ＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を取り除いて、ＭＰＡ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨを、灰白色固体（３.８ｇ、９５％）として与えた。ＭＳ ｍ/ｚ５４２.２.
【００４７】
［0065］ ＭＰＡ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨ（３.０４ｇ）を、ＮＭＭ（１.１３ｍｌ）を含むＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）中に溶解し、そしてｐ-ニトロフェニル・クロロホルメートで処理した（１.１３ｇ）。反応混合液を室温で２時間攪拌した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除いた。残渣を、Ｂｉｏｔａｇｅ（商標）システムを使用するフラッシュ・カラム・クロマトグラフィーにより精製した。カラムを酢酸エチル（５００ｍｌ）で洗浄し、続いて１０％メタノールを含む酢酸エチル（１ｌ）で洗浄した。純粋な分画を、混合し、そして溶媒を取り除いて、ＭＰＡ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯ2ＰＮＰを固体として与えた（１.３９ｇ、３７％）。ＭＳ ｍ/ｚ ６６３。
【００４８】
［0066］ ＮＭＭ（２００μＬ）の存在下で室温にて、Ｇｌｙ Ａ１、Ｌｙｓ Ｂ２９−ＢｉｓＢｏｃ−インスリン（２００ｍｇ）を含むＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０mL）を、実施例ＶＩＩＩからのＭＰＡ−（ＡＥＥＳ）2−ＣＯ2ＰＮＰ（２００ｍｇ）と１６時間結合させた。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除き、そして残渣をＴＦＡで１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除き、該残渣を水中に溶解し、そして１２０分かけて２７〜３２％勾配を使用するＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、（Ｐｈｅ Ｂ１）-ＭＰＡ（ＡＥＥＳ）2-インスリンを、白色粉末として与えた（９５.０ｍｇ、４３.７％）。ＭＳ ｍ/ｚ ６３３０.４.
【００４９】
実施例ＶＩＩ
ＮＭＭ（２００μＬ）の存在下で室温にて、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１−ＢｉｓＢｏｃ−インスリン（２００ｍｇ）を含むＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０mL）を、実施例ＶＩからのＭＰＡ−（ＡＥＥＳ）2−ＣＯ２ＰＮＰ（２００ｍｇ）と１６時間結合させた。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除き、そして残渣をＴＦＡで１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除いた後、該残渣を水中に溶解し、そして１２０分かけて２７〜３２％勾配を使用するＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、（Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＭＰＡ（ＡＥＥＳ）2-インスリンを、白色粉末として与えた（５６.３.０ｍｇ、２５.９％）。ＭＳ ｍ/ｚ ６３２８.８.
【００５０】
実施例ＶＩＩＩ
（Ｂ２９）-ＭＰＡ（ＯＡ）-インスリンの合成
［0068］ Ｇｌｙ Ａ１ Ｐｈｅ Ｂ１-ＢｉｓＢｏｃ-インスリン（２０５ｍｇ）を含むＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）を、ＭＰＡ-ＯＡ-ＣＯ2ＳＵ（１３９ｍｇ）と、室温で１６時間、ＮＭＭ（２０μＬ）の存在下で結合した。溶媒を減圧下で取り除き、そして残渣を水中で溶解し、そして１２０分かけて２７〜３６％勾配を使用するＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、（Ｌｙｓ Ｂ２９-ＭＰＡ（ＯＨ）-インスリンを、白色粉末（６４.２ｍｇ、３１％）として与えた。ＭＳ ｍ/ｚ ６０９８.８.
【００５１】
実施例ＩＸ
インビトロ結合アッセイ
［0069］ Ｗｉｓｔａｒラットの肝臓膜を、［１２５Ｉ］インスリン、及びさらなる濃度インスリン、図１において記載されるＤＡＣ：インスリン、並びにその対応する複合体と、４℃で１６時間インキュベーションした。膜をろ過し、そして３回洗浄し、そしてフィルターをカウントして、特異的に結合された［１２５Ｉ］インスリンを測定した。ＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【００５２】
［0070］ ＩＣ５０の結果を、表２に記載した。
【表２】
【００５３】
図２及び図３は、本発明のインスリン誘導体の濃度関数における阻害割合（％）の点で、ラット肝臓膜に結合するインスリンを記載する。
【００５４】
実施例Ｘ
インビトロ 生物活性
［0072］ インビトロ活性を評価するために、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを使用した。生物アッセイにおいて使用するために、３Ｔ３-Ｌ１細胞、マウス線維芽細胞系列を脂肪細胞に分化させた。３Ｔ３-Ｌ１細胞をＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中に撒き、そしてコンフルエントになるまで成長させ、続いて２日間インキュベーションした。デキサメタソン及びインスリンを加えることにより分化を誘導した（Ｄ０）。７日目に、９０％より多い細胞が、脂肪細胞の表現型、つまり脂肪滴の増加を示した。図４Ａ-４Ｃは、３日後の前脂肪細胞を示し、そして７日目の脂肪細胞を示す。図５Ａ及び５Ｂは、４日目での脂肪細胞及び７日目の脂肪細胞のオイルレッドＯ染色を示す。図６Ａ及び６Ｂは、４日目及び７日目でのオイルレッドＯ染色及びメチレン・ブルー染色を示す。
【００５５】
［0073］ ３Ｔ３-Ｌ１脂肪細胞を、５ｍＭグルコース及び０.５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で一晩飢餓状態にした。細胞を、１％ＢＳＡを含むクレブ-リンゲル-Ｈｅｐｅｓ緩衝液中で洗浄し、そして増加濃度のインスリン、ＤＡＣ：インスリン誘導体、及びその対応する複合体で、２０分間、３７℃でインキュベーションし、そして［14Ｃ］-２-デオキシ-Ｄ-グルコース（１μＣｉ/ウェル）でさらに２０分間インキュベーションした。細胞を可溶化し、そして放射活性を計測した。グルコース取り込みを、インスリン・コントロールに対して計算し、そしてＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して計算した。
【００５６】
［0074］ 表３は、試験された化合物に対するＥＣ５０の結果を示し、そして図７は、当該化合物の濃度（Ｍ）の関数におけるコントロールのグルコース取り込みの割合（％）を示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】
実施例ＸＩ
［0075］ さらに、インビトロ活性を評価するために、脂肪細胞の他のソースにおいてグルコース取り込みを使用した。体重１７５±２５ｇのＷｉｓｔｅｒ由来雄ラットから得た副睾丸脂肪を使用する。組織（０.０３ｇ/ｍｌ）を、コラゲナーゼを含む改変ＨＥＰＥＳ溶液ｐＨ７.４により、３７℃で分解した。試験化合物及び/又は溶媒を、５００μＬの一定量の改変ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７.４でインキュベーションし、そしてＤ-［３−３−Ｈ］グルコース（２.５μＣｉ/ｍｌ）を次に加えて、２時間インキュベーションした。試験化合物誘導性のグルコース取り込みであって、コントロール２ｎＭインスリンの応答に対して５０％以上多いグルコースの取り込みの増加は、有力なインスリン受容体アゴニスト活性を指し示す。５０％を超えて、インスリン誘導性グルコースの取り込み応答を阻害する試験化合物は、インスリン受容体アンタゴニスト活性を指し示す。化合物は、１０、１、０.１、０.０１、及び０.００１μＭでスクリーニングされる。
【００５９】
［0076］ 表４は、試験される化合物についてのＥＣ５０の結果を示し、そして図８は、化合物の濃度（Ｍ）関数におけるコントロールのグルコース取り込み割合（％）を示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
実施例ＸＩＩ
インビボ実験
［0077］ 組換えヒトインスリンと本発明のインスリン誘導体との間の血中グルコース低下効力の評価は、糖尿病の雌ｄｂ/ｄｂマウスに皮下投与される際に、比較される。
【００６２】
［0078］ 試験化合物を、一回の皮下ボーラス注射により、５〜６週齢のメスｄｂ/ｄｂマウス、体重２４.３〜３３.３ｇに投与した。注射された投与溶液の平均体積は、０.３５ｍｌ/マウス（１２.５ｍｌ/ｋｇ）であった。
【００６３】
［0079］ 組換え（イー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ））ヒト・インスリン（以下でｒＨインスリンと呼ぶ）は、ＩＣＮＴＭにより、２８ＩＵ/ｍｇの濃度で提供される。
【００６４】
インスリン誘導体のストック溶液を、合成インスリン誘導体を酸性水（〜ｐＨ２）で再構成することにより、１４.２９ｍｇ/ｍｌ（〜４００ＩＵ/ｍｌ）で調製した。ストック溶液を次に０.９％ＮａＣｌで希釈し、そして０.２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ）を通して、表５に表される投与溶液を得た。群Ｉは、コントロール溶液として、０.９％ＮａＣｌ・ＵＳＰを受けた。
【００６５】
【表５】
【００６６】
［0081］ 群と処理は、表６において要約される。
【表６】
【００６７】
［0082］ 血液採取（一滴）を、尻尾の先で行い、そしてグルコースレベルを、手持ちグルコメーター（モデル：ワンタッチUltraTM、Lifescan Canada）を使用して測定した。血液グルコースレベルを、投与前に一度全ての動物で測定し、そして投与後１、２、３、４、６、２４、３０、４８、及び７２時間で測定した。
【００６８】
インビボ結果：
［0083］ 全ての動物は、試験化合物の投与前に通常であるようにみえた。投与後およそ１時間で、１００ＩＵ/ｋｇの組換えヒト・インスリン（ｒＨインスリン）で皮下投与された群２の動物は、活動が少し低下し、そして非強調的な歩行を示した。他の処置を受けた動物は、実験を通して通常であるように見えた。食餌消費のわずかな減少が、実施例ＩＩＩの１７.９ｍｇ/ｋｇの化合物で処置された動物において観測された。
【００６９】
［0084］ 表７は、ｒＨインスリン及びインスリン誘導体の一回投与の後の食餌消費（全重量/ケージ（ｇ））を示す。
【表７】
【００７０】
［0085］ 表８は、ｒＨインスリン及びインスリン誘導体の一回投与後のコントロールに対する食餌消費（全重量/ケージ）を示す。
【表８】
【００７１】
血糖の差分は、図９、１０、１１、１２、１３、及び１４において報告された各々のマウスについて、投与後の血中グルコース・レベル対投与前のグルコース・レベルから計算される。一般的に、インスリン誘導体（実施例Ｉ、実施例ＩＩ、及び実施例ＩＩＩ）は、用量依存的様式で血中グルコース濃度を低下でき、そして一回の投与量（１００ＩＵ/ｋｇ）のみで試験された組換えインスリンは、２時間活性であった。３.６ｍｇ/ｋｇにおいて、実施例２は、最初の２時間インスリンと同程度の活性であり、一方実施例Ｉ及び実施例ＩＩＩでは不十分な効果しか得られない。ｒＨインスリンの低下効果は、１７.９ｍｇ/ｋｇでより強調された。なぜなら、当該効果が２４時間まで観察されたからである。全体図は、インスリン誘導体が、２４時間まで（コントロール群に比べて）活性であることを示したが、グルコース・レベルが投与後１〜２時間減少し、次に３〜４時間で増加し、そして再び６時間で減少しているということに留意することは重要である。この「上昇と下降」応答は、マウスの食性および代謝が、薬剤の効力に影響を与えうる重要なパラメーターであるということを示唆しうる。ｄｂ/ｄｂマウスが、年齢につれてインスリン抵抗性を発達させ、このことが、グルコース低下効果を得るために注射されなければならないかなり高用量のインスリンを説明しうるということについて言及することは重要である。
【００７２】
実施例ＸＩＩＩ
通常ラットにおける薬物動態プロファイル
［0087］ Ｒｈインスリン、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体、及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体を、７〜８週齢の雄ＣＤラットに、３６ｎｍｏｌ/ｋｇ ｓｃ又は１２ｎｍｏｌ/ｋｇ静脈内（iv）のいずれかで投与した。血液サンプルを、７２時間まで（ｒｈインスリン-処置した動物については３時間まで）回収した。薬剤レベルを、ヒト・インスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ）を使用して測定した。薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用して、化合物/投与経路あたりＮ＝４で非区画分析により計算した。図１５は、通常のＳＤラットにおけるインスリンの薬物動態プロファイルである。ここでインスリンは、ｓｃで３６ｎｍｏｌ/ｋｇで投与され、そしてｉｖで１２ｎｍｏｌ/ｋｇで投与された。図１６は、通常のＳＤラットにおける実施例ＩＩＩの複合体の薬物動態プロファイルであり、ここで複合体は、ｓｃで３６ｎｍｏｌ/ｋｇ、及びｉｖで１２ｎｍｏｌ/ｋｇで投与された。図１７は、通常のＳＤラットにおける実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の薬物動態プロファイルであり、ここでインスリン誘導体は、ｓｃで３６ｎｍｏｌ/ｋｇで投与され、そしてｉｖで１２ｎｍｏｌ/ｋｇで投与された。図１８は、インスリン、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体、及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体の皮下投与のＰＫプロファイルである。図１９は、インスリン、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体、及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体の静脈内投与のＰＫプロファイルである。
【００７３】
実施例ＸＩＶ
糖尿病ラットにおける一回用量の薬力学
［0088］ 雄ＣＤラットにおいて、ストレプトゾトシン（６０ｍｇ/ｋｇ）の一回ｉｖ注射で、糖尿病を誘導した。２日後、ＤＡＣ（商標）：インスリン誘導体を１２０ｎｍｏｌ/ｋｇ、前もって成形された複合体３００ｎｍｏｌ/ｋｇ、ｒｈインスリン２０Ｕ/ｋｇ（１２０ｎｍｏｌ/ｋｇ）、又は溶媒を、ラットに１回ｓｃ注射した。血中グルコースレベルを手持ちグルコメーターで、注射直前、及び投与後１、２、３、４、６、８、１０、１１、２４、３０、及び４８時間後、５匹のラット/群で測定した。但し溶媒群については３匹のラット/群で試験した。通常のラットにおける血糖の範囲は、５.２〜７.６ｍｍｏｌ/ｌであった。
【００７４】
［0089］ 図２０は、１２０ｎｍｏｌ/ｋｇの実施例Ｉ〜ＩＶを投与した後のラットにおける血中グルコースレベルを示す。図２１は、本発明の実施例Ｉ〜ＩＶの対応する複合体を３００ｎｍｏｌ/ｋｇで投与した後の、ラットにおける血糖レベルを示す。
【００７５】
実施例ＸＶ
繰返し皮下注射後の、ＤＡＣ：インスリン誘導体の効力及び前もって成形された対応の複合体の効力の評価
［0090］ 本アッセイは、成獣雄ＣＤ（商標）ラットに繰返し皮下注射した後の、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体及びその複合体の効力対遊離ヒト組換えインスリンの効力を評価するために行われた。
【００７６】
［0091］ １型糖尿病を、ストレプトゾトシン（６０ｍｇ/ｋｇ、ｐＨ４.５）の１回静脈（ｉｖ）注射により、実験１日目に雄ＣＤ（商標）ラットに誘導した。高血糖は、血液を試験する血中グルコースモニターを使用して確認された。試験化合物を、実験３日目から１４日目まで１日１回、皮下（ｓｃ）注射により１ｍｌ/ｋｇ体重で投与した。血中グルコースレベルを、それぞれの日の投与の直前、及び投与後２、８、１９時間で試験した。食餌と水の消費量を、毎日モニターした。体重を、実験１、３、６、９、１２、１５、及び１７日目に集めた。
【００７７】
［0092］ 図２２は、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体についての１日目、６日目、及び１２日目における１日の血中グルコース・プロファイルを示し、そして図２３は、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体について、１日目、６日目、及び１２日目での１日の血中グルコース・プロファイルを示す。
【００７８】
［0093］ 本発明は、その特異的な実施態様に関して記載される一方で、さらなる改良が可能であり、そして当該出願が、本発明の原理に一般的に従う発明、並びに本発明が関連する技術において既知又は慣習的な慣行の範囲内であり、本明細書に記載された基本的特徴に適用され、そして添付の特許請求の範囲内に従う開示からの逸脱を含む発明の全てのバリエーション、使用、又は適応をカバーすることが意図されることが、理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
（ａ） 本発明の分野
［0001］ 本発明は、持続性インスリン誘導体に関する。より特異的に、当該インスリン誘導体は、インスリン分子及びそれに結合される反応基を含み、当該反応基は、血液成分と共有結合するためのものであり、それゆえ持続性インスリン誘導体を作成する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ） 従来技術の記載
［0002］ インスリンは、細胞表面受容体に結合して、血液からのグルコース吸収を高める出来事のカスケードを開始させる。正常に機能しないインスリンのレベルは、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病などの重篤な障害を導く。Ｉ型糖尿病は、生命を脅かす疾患であり、患者は、生存するために複数回のインスリンの自己投与を毎日行わなければならない。ＩＩ型糖尿病はまた重篤な内科疾患であり、ＩＩ型糖尿病では、インスリンの内部レベルに対して患者により発達された抵抗性のため、インスリンの内部レベルは、血糖の正しいレベルをもはや維持できなくなる。長期間の使用の開始を低減するために、インスリンでの治療は、ライフスタイルの変化の失敗又は従来の血糖制御薬剤が無効になったときに必要となる。
【０００３】
［0003］ 血糖疾患のコントロールの成功は、治療に対する患者の服薬遵守と密接に関わっており、そして必要とされる注射の頻度を減らすことが望まれている。そうするため、新たな持続性インスリン誘導体を提供すること高く望まれている。
【発明の概要】
【０００４】
［0004］ 本発明に従って、インスリン分子と血液成分に共有結合するための反応基を含むインスリン誘導体が提供される。
【０００５】
［0005］ 本発明の好ましい実施態様では、当該インスリン分子は以下の式Ｉ：
【化１】
で表される分子であり、そして反応基は、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９の位置から選ばれる位置でインスリンのアミノ酸に結合される。
【０００６】
［0007］ 本発明の好ましい実施態様では、選択された反応基は、マイケル・アクセプター（α，β不飽和カルボニル部分）、スクシンイミジル含有基、及びマレイミド含有基、より好ましくはＭＰＡ（３-マレイミドプロピオン酸）からなる群由来である。
【０００７】
［0008］ 本発明の好ましい実施態様では、反応基は、インスリン分子のアミノ酸に、リンカー、例えば非限定的に、（２アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、アミノ・エトキシ・エトキシ・スクシニミン酸（amino ethoxy ethoxy succinimic acid）（ＡＥＥＳ）、ＡＥＥＳ-ＡＥＥＳ、２-［２-（２-アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、ＡＥＥＡ-ＡＥＥＡ、-ＮＨ2- （ＣＨ2）n-ＣＯＯＨ、［式中、ｎは１〜２０の整数である］、及び酸素、窒素、又は硫黄原子が取り込まれうる飽和又は不飽和アルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）モチーフ、例えば非限定的にグリシン、３-アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＯＡ）、及び４-アミノ安息香酸（ＡｐｈＡ）、並びにそれらの組合せを介してインスリン分子のアミノ酸に結合される。
【０００８】
［0009］ 本発明の好ましい実施態様では、血液成分は血液タンパク質であり、より好ましくは血清アルブミンである。
【０００９】
［0010］ 本発明に従って、本発明のインスリン誘導体と血液成分を含むインスリン複合体が提供され、ここで当該反応基及び当該血液成分は、当該反応基と当該血液成分との間で形成された共有結合を介して複合体化される。当該複合体は、インビボ又はイクスビボで形成される。
【００１０】
［0011］ 本発明に従って、本発明のインスリン誘導体を、医薬として許容される担体と供に含む医薬組成物が提供される。
【００１１】
［0012］ 本発明に従って、本発明のインスリン複合体を、医薬として許容される担体と供に含む医薬組成物が提供される。
【００１２】
［0013］ 本発明に従って、血糖関連疾患又は障害を患う対象において、血糖関連疾患又は障害を治療する方法であって、本発明のインスリン誘導体、本発明の複合体、及び本発明の医薬組成物の少なくとも１を、当該対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１３】
［0014］ 本明細書中の全ての参考文献は、援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】［0015］ 図１は、天然ヒトインスリンから派生された実施例Ｉ〜実施例ＶＩＩＩを示す。
【図２】［0016］ 図２は、ｗｉｓｔａｒラットの肝臓膜上のインスリン、インスリン誘導体、及びインスリン誘導体の複合体の競合的結合を示す。
【図３】［0017］ 図３は、ｗｉｓｔａｒラットの肝臓膜上のインスリン、インスリン誘導体、及びインスリン誘導体の複合体の競合的結合を示す。
【図４】［0018］ 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞分化段階を示す。
【図５】［0018］ 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞分化段階を示す。
【図６】［0018］ 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞分化段階を示す。
【図７】［0019］ 図７は、インスリン、実施例ＩＩＩ、及びＩＶ、並びにそれらの対応する複合体についての、３Ｔ３-Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース輸送を示す。
【図８】［0020］ 図８は、インスリン、実施例ＩＩＩ、及びＶＩ、並びにそれらの対応する複合体についてのｗｉｓｔｅｒラット脂肪細胞由来の副睾丸脂肪細胞におけるグルコース輸送を示す。
【図９】［0021］ 図９は、インスリン３.６ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１０】［0022］ 図１０は、実施例Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１１】［0023］ 図１１は、実施例Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１２】［0024］ 図１２は、インスリン及び実施例Ｉのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで、並びに実施例Ｉのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１３】［0025］ 図１３は、インスリン及び実施例ＩＩのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで、並びに実施例ＩＩのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１４】［0026］ 図１４は、インスリン及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体３.６ｍｇ／ｋｇで、並びに実施例ＩＩＩのインスリン誘導体１７.９ｍｇ／ｋｇで処置された動物における時間関数で、血糖の差分を示す。
【図１５】［0027］ 図１５は、皮下注射及び静脈注射された未変性のインスリンの薬物動態プロファイルを示す。
【図１６】［0028］ 図１６は、皮下注射及び静脈注射された実施例ＩＩＩの複合体のインスリンの薬物動態プロファイルを示す。
【図１７】［0029］ 図１７は、皮下注射及び静脈注射された実施例ＩＩＩの薬物動態プロファイルを示す。
【図１８】［0030］ 図１８は、皮下注射されたインスリン、実施例ＩＩＩ、及び実施例ＩＩＩの複合体の薬物動態プロファイルの比較を示す。
【図１９】［0031］ 図１９は、静脈注射されたインスリン、実施例ＩＩＩ、及び実施例ＩＩＩの複合体の薬物動態プロファイルの比較を示す。
【図２０】［0032］ 図２０は、ストレプトゾシン誘発糖尿病ラットにおいて、インスリン、実施例Ｉ〜ＩＶ、及び溶媒の皮下注射後の薬力学プロファイルの比較を示す。
【図２１】［0033］ 図２１は、ストレプトゾシン誘発糖尿病ラットにおいて、インスリン、実施例Ｉ〜ＩＶの複合体、及び溶媒の皮下注射後の比較の薬力学プロファイルを示す。
【図２２】［0034］ 図２２は、実施例ＩＩＩの繰り返しの皮下注射の比較の薬力学プロファイル（1日目対６日目対１２日目対コントロール）を示す。そして
【図２３】［0035］ 図２３は、実施例ＩＩＩの複合体の繰り返された皮下注射の比較の薬理学プロファイル（１日目対６日目対１２日目対コントロール）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［0036］ 本発明に従って、持続性インスリン誘導体が提供される。より特異的に、当該インスリン誘導体は、インスリン分子及びそれに結合する反応基を含み、当該反応基は、血液成分に共有結合するためのものである。本出願では、インスリン反応基−血液成分の複合体の形成をもたらす共有結合は、本発明のインスリン誘導体を投与した際に、インビボで形成されうるということが意図される。当該共有結合が、本発明のインスリン誘導体を、組み換えアルブミンであるアルブミンソース又は対象の血漿から抽出されたアルブミンソースと接触することにより、又は他の適切なソースのいずれかから提供することによりイクスビボで生じうるということも意図される。ここで当該ソースは、当業者により知られている。
【００１６】
［0037］ インスリン分子は、未変性のヒトインスリン（例えば、下記式Ｉにおける未変性ヒトインスリンの配列を参照のこと）であるか、又はそのアナログ、例えばアミノ酸置換（１又は複数）、アミノ酸欠失（１又は複数）、又はアミノ酸添加（１又は複数）を有するインスリン分子などでありうる。以下は、本発明に従って使用されうるインスリン・アナログの例として記載されており、本アナログを制限する意図はない：Aventis Pharmaceuticals Inc.,のランタス（商標）と呼ばれるインスリン・グラルギン（当該薬剤はＡ２１の位置で置換されたグリセリンを有し、そしてＢ鎖のＣ−末端において加えられた２のアルギニン残基を有する）、Novo Nordisk A/Sのレべミール（商標）と呼ばれるインスリン・デテミール（当該薬剤は、Ｂ３０の位置でスレオニンが欠失され、そしてリジンＢ２９の側鎖上に加えた未変性ヒト・ヒトインスリンである）；Eli lillyのヒューマログ（商標）と呼ばれるインスリン・リスプロ（当該薬剤は、Ｌｙｓ Ｂ２８、ＰｒｏＢ２９ヒトインスリンである）；Novo Nordisk A/S、ノボログ（商標）と呼ばれるインスリン・アスパート（該薬剤はＡｓｐ Ｂ２８ヒト・インスリンである）；並びにAventisのアピドラ（Ａｐｉｄｒａ）（商標）と呼ばれるインスリン・グルリシン（Glulisine）（当該薬剤は、Ｌｙｓ Ｂ３、Ｇｌｕ Ｂ２９ヒト・インスリンである）である。
【化２】
【００１７】
［0038］ 反応基は、インスリン分子又はそのアナログ上の異なる官能基に結合されうる。好ましくは、当該反応基は、インスリン分子の利用できるアミノ基、例えばＡ鎖及びＢ鎖のＮ−末端アミノ酸のαアミノ基、又はＬｙｓ Ｂ２９のε−アミノ基に結合される。本発明に従って、置換された及び／又は加えられたアミノ酸（１又は複数）を含むインスリン・アナログは、反応基を結合するためのさらなるアミノ基を含んでもよいか；或いは反応基が結合するために適した他の官能基を含みうる。インビボ又はイクスビボで、血液成分を共有結合することができる好ましい反応基は、マイケル・アクセプター（α，β、不飽和カルボニル部分）スクシンイミジル含有基及びマレイミド含有基である。より好ましい反応基は、マレイミド含有基であり、そしてより得意的にＭＰＡ（３−マレイミド・プロピオン酸）である。
【００１８】
［0039］ 場合により、反応基は、リンカーを介してインスリン分子に結合される。当該リンカーは、好ましくは、ヒドロキシエチル・モチーフ、例えば（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、アミノ・エトキシ・エトキシ・スクシニミン酸（ＡＥＥＳ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ・酢酸（ＡＥＥＡ）、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ、−ＮＨ2−（ＣＨ2）ｎ−ＣＯＯＨ［式中、ｎは１〜２０の整数である］、飽和又は不飽和の１以上のアルキル鎖（Ｃ１−Ｃ１０）であって、酸素、窒素、又は硫黄原子を含みうるアルキル鎖モチーフ、例えばグリシン、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡｐｈＡ）からなる群から選ばれる。リンカーの組合せの例は、非限定的にＡＥＥＡ−ＥＤＡ、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ、ＡＥＡ−ＡＥＥＡ、ＡＥＥＳ−ＡＥＥＳなどを含む。好ましいリンカーは、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）であるか、又は反応基（ＭＰＡ）でリンカーを使用しないものである。当業者は、どのタイプのリンカーが、本発明の目的のために適しているかを容易に知るであろう。
【００１９】
［0040］ 本発明はまた、インスリン複合体に関する。当該複合体は、その反応基が、共有結合を形成するために、インビボ又はイクスビボで血液成分と反応されたインスリン誘導体を含む。それゆえ、当該複合体は、インビボにおいて、インスリン誘導体の投与により形成されるか、又はイクスビボにおいて、インスリン誘導体を血液溶液又は精製血液成分と、共有結合の形成を許容するイクスビボの条件下で接触することにより形成されうる。精製血液成分は、血液成分からの抽出及び精製により提供されうるか、又は組み替え技術により産生されうる。好ましい血液成分は、血液タンパク質であり、より好ましくは血清アルブミンである。
【００２０】
［0041］ 本発明はさらに、血糖関連疾患又は障害の治療方法であって、インスリン誘導体又はインスリン複合体の投与を含む方法に関する。血糖関連疾患又は障害は、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病、並びに妊娠性糖尿病を含む。また、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、膵炎及び他の膵臓関連疾患もまた、本発明のインスリン誘導体又はインスリン複合体を投与することにより治療されうる。インスリンはまた、成長因子として知られており、そしてそれゆえ、本発明のインスリン誘導体又はインスリン複合体は、傷の治癒及び他の関連する適応のための局所投与に有用でありうる。
【００２１】
［0042］ 以下の実施例は、本発明の範囲を制限する目的ではなく、上記される発明をさらに例示する目的である。
【実施例】
【００２２】
［0043］ 図１は、インスリン分子並びに以下の実施例にそって言及されるＧｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９部位を示す。
【００２３】
実施例Ｉ
（Ｇｌｙ Ａ１）−ＭＰＡ −インスリンの合成
［0044］ インスリン（１００ｍｇ）を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）（２０ｍｌ）及びＴＦＡ（１００μｌ）中に溶解した。当該溶液に、ＮＭＭ（４−メチルモルホリン、２００μｌ）及びＭＰＡ−ＯＳｕ（Ｎ−スクシンイミジル・３マレイミドプロパノエート、９.２ｍｇ２.５当量）を加え、そして当該反応液を２時間攪拌した。水を加えることにより反応を止め、そしてＡｃＯＨ（酢酸）でｐＨ４に調節した。アセトニトリルを加えて、沈殿を溶解し、そして水／アセトニトリル（３：１）の全体の体積は２０ｍｌであった。当該溶液を半調製ＨＰＬＣ中に注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３１％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量で回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。Ｒｔ＝３６〜４６分で純粋な分画を回収し、混合し、そして凍結乾燥して、２３ｍｇの回収されたインスリンと供に白色粉末（４０ｍｇ）を与えた。
【００２４】
［0045］ 計算された質量は、５９５８.５ｇ／molであり、そしてＬＣ−ＭＳにより計測された質量は、５９５８.０ｇ／molである。
【００２５】
［0046］ 表１は、アミノ酸配列分析（フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解）を示し、当該分析は、Ａ鎖のＮ末端がブロックされ、そしてＮ-末端（フェニルアラニン）が、いまだに遊離していたということを確かめるために行われた。
【００２６】
【表１】
【００２７】
実施例ＩＩ
（Ｐｈｅ Ｂ１）-ＭＰＡ-インスリンの合成
［0047］ インスリン（１００ｍｇ）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（４ｍｌ）及びＥｔ3Ｎ（トリエチルアミン）（１００μｌ）中に、超音波処理して溶解した。当該溶液に、Ｂｏｃ2Ｏ（ジ-tert-ブチル・ジカルボネート）（９.３ｍｇ、２.５当量）を加え、そして当該反応液を室温で３０分間攪拌した。反応溶液を、ＡｃＯＨでｐＨ４に調節した。当該溶液を、半調製ＨＰＬＣ中に注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から４０％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。３の産物（Ｂｏｃ-インスリン、Ｇｌｙ Ａ１Ｌｙｓ Ｂ２９-ＢｉｓＢｏｃ-インスリン、及びＴｒｉｓＢｏｃ-インスリン）を単離し、そして所望の（Ｇｌｙ Ａ１ Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＢｉｓＢｏｃ-インスリンを混合し、そして凍結乾燥して白色粉末を与えた（７２ｍｇ）。
【００２８】
［0048］ ＤＭＦ（３ｍｌ）中の（Ｇｌｙ Ａ１ Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＢｉｓＢｏｃ-インスリン（５１mg） を、ＭＰＡ-ＯＳｕ（３６ｍｇ）と、Ｅｔ3Ｎ（３０μｌ）の存在下で反応させた。当該反応液を２時間室温で攪拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させた。当該残基を、ＴＦＡ（２ｍｌ）で１０分間処理し、そして次にＴＦＡを蒸発させた。粗製生成物を水/アセトニトリル（３；１）中で溶解し、そして当該溶液を、半調製ＨＰＬＣ中に注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（ＣＨ３ＣＮ中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３２％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。純粋な分画を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末を与えた（２９ｍｇ）。
【００２９】
［0049］ 計算された質量は、５９５８.５ｇ/ｍｏｌであり、そしてＬＣ-ＭＳにより計測された質量は、５９５８.４ｇ/ｍｏｌであった。
【００３０】
［0050］ アミノ酸配列分析（フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解）を使用して、Ｂ鎖のＮ末端がブロックされ、そしてＡ鎖のＮ末端（グリシン）がいまだに遊離していたことを確認した（表１参照のこと）。
【００３１】
実施例ＩＩＩ
（Ｂ１）-ＭＰＡ-ＯＡ-インスリンの合成
［0051］ （Ｇｌｙ Ａ１ Ｌｙｓ Ｂ２９）−ＢｉｓＢｏｃ−インスリン（３９ｍｇ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）及びＥｔ3Ｎ（３０μＬ）を、ＭＰＡ−ＯＡ−ＯＳｕ（［Ｎ−スクシンイミジル８−Ｎ−（３−マレイミドプロパニルカルボニル）アミノオクタノエート］２５ｍｇ）と４時間反応させた。ＤＭＦを蒸発させ、そして残渣をＴＦＡで１０分間処置した。ＴＦＡを蒸発させた後、残渣を水/アセトニトリル（１：３）中に溶解した。当該溶液を半調製ＨＰＬＣに注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３６％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。純粋な分画を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末（２１ｍｇ）を与えた。
【００３２】
［0052］ 計算されたＭａｓｓは６０９９.５ｇ/ｍｏｌであり、そしてＬＣ-ＭＳにより計測された質量は、６０９９.６ｇ/ｍｏｌである。
【００３３】
実施例ＩＶ
（Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＭＰＡ-インスリンの合成
［0053］ インスリン７４ｍｇをＤＭＳＯ（２ｍｌ）及びＡｃＯＨ（４６μＬ）中に溶解した。当該溶液にＢｏｃ2Ｏ６.９ｍｇ、２.５当量）を加え、そして反応液を５時間室温で攪拌した。水（１５ｍｌ）及びアセトニトリル（５ｍｌ）を加え、そして反応液を半調製ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８フェニル-へキシル）に、流速９.５ｍｌ/分、そして勾配を２７％〜４０％で１２０分間で注入した。４３分での分画を混合し、そして凍結乾燥して（Ｇｌｙ Ａ１ Ｐｈｅ Ｂ１）−Ｂｏｃ２−インスリン（３０ｍｇ）を与えた。
【００３４】
［0054］ （Ｇｌｙ Ａ１ Ｐｈｅ Ｂ１）−Ｂｏｃ2−インスリン（３０ｍｇ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）及びＮＭＭ（４−メチルモルフォリン、１００μＬ）をＭＰＡ−ＯＳｕ（１０ｍｇ）と６０分間反応させた。ＤＭＦを蒸発させ、そして残渣をＴＦＡで１０分間処理した。該残渣を水/アセトニトリル（３：１）中で溶解し、そして溶液を半調製ＨＰＬＣに注入した。Phenomenex Luna１０ｍフェニル−ヘキシル２１ｍｍ×２５０ｍｍカラムを、水性ＴＦＡ溶液（水中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ａ）及びアセトニトリルＴＦＡ溶液（アセトニトリル中に０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ）で平衡化した。２７％から３２％までのＢの勾配を１２０分かけて流すことにより、９.５ｍｌ／分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、２１４及び２５４ｎｍでＵＶ吸収により検出した。分画を９.５ｍｌの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接ＬＣ／ＭＳに注入後に質量検出により同定した。純粋な分各を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末を与えた（２２.２ｍｇ）。
【００３５】
［0055］ 計算された質量は、５９５８.５ｇ/ｍｏｌであり、そしてＬＣ-ＭＳにより計測された質量は、５９５８.０ｇ/ｍｏｌである。
【００３６】
［0056］ アミノ酸配列分析（フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解）を使用して、Ｂ鎖Ｎ末端（フェニルアラニン）及びＡ鎖Ｎ末端（グリシン）の両方が、遊離であることを確認した（表１を参照のこと）。
【００３７】
実施例Ｖ
ＭＰＡ（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨリンカーの合成
［0057］ フラッシュカラム・クロマトグラフィーをBiotage（商標）"40iフラッシュ・クロマトグラフィー”モジュラー・システムを使用して行った。半調製ＨＰＬＣ精製を、Phenomex luna（RP-１８、１０μフェニル-へキシル２５０×２１.２ｍｍ）カラムを使用してＷａｔｅｒｓ”Ｂｒｅｅｚｅ”システム１５００シリーズにおいて、９.５ｍｌ/分の移動層流速で行った。Phenomex luna（RP-１８、１０μフェニル-へキシル２５０×５０.０ｍｍ）カラムを、５０ｍｌ/分移動層流速で使用して、Glison６９０システムを調製スケールの精製に使用した。水（０.１％ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）（０.１％ＴＦＡ）の勾配を、各化合物の合成方法において指示された詳細に基づいて使用した。ＬＣ−ＭＳを、ＥＳ１エレクトロスプレー・ソースを備えるＡｇｌｉｅｎｔ１１００シリーズＬＣ-ＭＳＤシングル４極子質量分析計を使用して行った。
【００３８】
【化３】
【００３９】
実施例ＶＩ
（Ｐｈｅ Ｂ１）−ＭＰＡ−（ＡＥＥＳ）2−インスリン
【００４０】
［0058］ メタノール（１５０ｍｌ）中の２-（２-アミノエトキシ）エタノール（５０.０ｇ）を、Ｂｏｃ2Ｏ（９３.４ｇ）と３０分間反応させた。メタノールを吸引下で蒸発させ、そして残渣を酢酸エチル中に溶解し、水、塩類溶液で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発後、粗製生成物を、次のステップに使用した。ＭＳ ｍ/Ｚ ２０５。
【００４１】
［0059］ 保護アルコールを、Ｅｔ3Ｎ（６６ｍｌ）の存在下で、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（５００ｍｌ）中に溶解した。ＭｓＣｌ（メシレート・クロリド）を０℃で３０分かけて滴下して加え、そして室温で１時間攪拌した。ＮａＮ3（１２７.６ｇ）を次に反応混合液に加え、次にＮＭＭ（Ｎ-メチルモルフォリン、２１５ｍｌ）を加え、そして反応液を４０〜５０℃で１６時間攪拌した。反応混合液を酢酸エチル（２ｌ）に注ぎ、そして水で洗浄した。水層を酢酸エチル（２Ｌ）で戻し抽出し、そして混合酢酸エチル層を水、塩類溶液で洗浄し、そして乾燥した。当該溶媒の蒸発後、粗製生成物を次のステップに使用した（１０１.４ｇ、いくらかのＤＭＦを含む）。ＭＳ m/ｚ ２３１。
【００４２】
［0060］ 当該粗製生成物（６２.４ｇ）をメタノール（３００ｍｌ）中に溶解し、次にＰｄ（ＯＡｃ）2（３.０ｇ）及びギ酸（９６％、６２ｇ）を加えた。反応終了後、Ｐｄ種を、セライトを通したろ過により取り除いた。メタノールを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥させた。粗製生成物を次のステップに使用した。
【００４３】
［0061］ 粗製生成物をジクロロメタン中に溶解し、そしてＥｔ3Ｎで塩基性になるまで中和した。無水コハク酸（３２.３ｇ）を一回で加えた。当該反応液を室温で１時間攪拌した。溶媒を吸引下で取り除き、そして残渣を、ＨＣｌ（１Ｎ）により、ｐＨ３に酸性化した。当該生成物を酢酸エチルで抽出した。当該酢酸エチル層を、シリカゲル・プラグ（１ｋｇ）を通した。次に該シリカゲルを、２〜４％メタノールを含む酢酸エチルで洗浄した。純粋な分画（薄層クロマトグラフィーにより判断される）を混合し、そして溶媒を吸引下で取り除いて、Ｂｏｃ-ＡＥＥＳを油状残渣として与えた（３６ｇ、４４％）。ＭＳ ｍ/ｚ ３０５。
【００４４】
［0062］ Ｂｏｃ-ＡＥＥＳ（５.５g）を、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ４.５７ｇ）及びエチル-（ジメチルアミノプロピル）カルボジミド・ヒドロクロリド（ＥＤＣ,７.６２ｇ）を含むジクロロメタン（３０ｍｌ）で２時間処理した。ＮＨＳエステルを酢酸エチル（５００ｍｌ）中に注ぎ、０.１Ｎ・ＨＣｌで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を吸引下で取り除き、そして当該残渣をそのまま次のステップで使用した。
【００４５】
［0063］ Ｂｏｃ-ＡＥＥＳ（６.０５g）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍｌ）で１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥した。（ＡＥＥＳ）アミノ酸をＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）中に溶解し、そして過剰量のＮＭＭで塩基性化した。次に実施例Ｖの粗製生成物を加え、そして反応液を室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、そして残渣を、５〜４０％の勾配を６０分かけて使用する調製ＨＰＬＣに注入した。当該溶媒を取り除き、そして残渣を減圧下で乾燥して、Ｂｏｃ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨを油として与えた（５.６４ｇ、８４％）。ＭＳ ｍ/ｚ４７８.
【００４６】
［0064］ Ｂｏｃ−（ＡＥＥＳ）2−ＣＯＯＨ（３.６０ｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍｌ）で１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥させた。（ＡＥＥＳ）2アミノ酸を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド中に溶解し、そしてＮＭＭで塩基性にした。ＭＰＡ-ＯＳｕ（２.９４）を加え、そして混合液を、３０分間攪拌した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除いた。残渣を水中に溶解し、そして４〜５０％の勾配を６０分かけて使用する調製ＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を取り除いて、ＭＰＡ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨを、灰白色固体（３.８ｇ、９５％）として与えた。ＭＳ ｍ/ｚ５４２.２.
【００４７】
［0065］ ＭＰＡ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯＯＨ（３.０４ｇ）を、ＮＭＭ（１.１３ｍｌ）を含むＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）中に溶解し、そしてｐ-ニトロフェニル・クロロホルメートで処理した（１.１３ｇ）。反応混合液を室温で２時間攪拌した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除いた。残渣を、Ｂｉｏｔａｇｅ（商標）システムを使用するフラッシュ・カラム・クロマトグラフィーにより精製した。カラムを酢酸エチル（５００ｍｌ）で洗浄し、続いて１０％メタノールを含む酢酸エチル（１ｌ）で洗浄した。純粋な分画を、混合し、そして溶媒を取り除いて、ＭＰＡ-（ＡＥＥＳ）2-ＣＯ2ＰＮＰを固体として与えた（１.３９ｇ、３７％）。ＭＳ ｍ/ｚ ６６３。
【００４８】
［0066］ ＮＭＭ（２００μＬ）の存在下で室温にて、Ｇｌｙ Ａ１、Ｌｙｓ Ｂ２９−ＢｉｓＢｏｃ−インスリン（２００ｍｇ）を含むＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０mL）を、実施例ＶＩＩＩからのＭＰＡ−（ＡＥＥＳ）2−ＣＯ2ＰＮＰ（２００ｍｇ）と１６時間結合させた。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除き、そして残渣をＴＦＡで１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除き、該残渣を水中に溶解し、そして１２０分かけて２７〜３２％勾配を使用するＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、（Ｐｈｅ Ｂ１）-ＭＰＡ（ＡＥＥＳ）2-インスリンを、白色粉末として与えた（９５.０ｍｇ、４３.７％）。ＭＳ ｍ/ｚ ６３３０.４.
【００４９】
実施例ＶＩＩ
ＮＭＭ（２００μＬ）の存在下で室温にて、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１−ＢｉｓＢｏｃ−インスリン（２００ｍｇ）を含むＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０mL）を、実施例ＶＩからのＭＰＡ−（ＡＥＥＳ）2−ＣＯ２ＰＮＰ（２００ｍｇ）と１６時間結合させた。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドを減圧下で取り除き、そして残渣をＴＦＡで１０分間処理した。ＴＦＡを吸引下で取り除いた後、該残渣を水中に溶解し、そして１２０分かけて２７〜３２％勾配を使用するＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、（Ｌｙｓ Ｂ２９）-ＭＰＡ（ＡＥＥＳ）2-インスリンを、白色粉末として与えた（５６.３.０ｍｇ、２５.９％）。ＭＳ ｍ/ｚ ６３２８.８.
【００５０】
実施例ＶＩＩＩ
（Ｂ２９）-ＭＰＡ（ＯＡ）-インスリンの合成
［0068］ Ｇｌｙ Ａ１ Ｐｈｅ Ｂ１-ＢｉｓＢｏｃ-インスリン（２０５ｍｇ）を含むＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）を、ＭＰＡ-ＯＡ-ＣＯ2ＳＵ（１３９ｍｇ）と、室温で１６時間、ＮＭＭ（２０μＬ）の存在下で結合した。溶媒を減圧下で取り除き、そして残渣を水中で溶解し、そして１２０分かけて２７〜３６％勾配を使用するＨＰＬＣ中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、（Ｌｙｓ Ｂ２９-ＭＰＡ（ＯＨ）-インスリンを、白色粉末（６４.２ｍｇ、３１％）として与えた。ＭＳ ｍ/ｚ ６０９８.８.
【００５１】
実施例ＩＸ
インビトロ結合アッセイ
［0069］ Ｗｉｓｔａｒラットの肝臓膜を、［１２５Ｉ］インスリン、及びさらなる濃度インスリン、図１において記載されるＤＡＣ：インスリン、並びにその対応する複合体と、４℃で１６時間インキュベーションした。膜をろ過し、そして３回洗浄し、そしてフィルターをカウントして、特異的に結合された［１２５Ｉ］インスリンを測定した。ＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【００５２】
［0070］ ＩＣ５０の結果を、表２に記載した。
【表２】
【００５３】
図２及び図３は、本発明のインスリン誘導体の濃度関数における阻害割合（％）の点で、ラット肝臓膜に結合するインスリンを記載する。
【００５４】
実施例Ｘ
インビトロ 生物活性
［0072］ インビトロ活性を評価するために、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを使用した。生物アッセイにおいて使用するために、３Ｔ３-Ｌ１細胞、マウス線維芽細胞系列を脂肪細胞に分化させた。３Ｔ３-Ｌ１細胞をＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中に撒き、そしてコンフルエントになるまで成長させ、続いて２日間インキュベーションした。デキサメタソン及びインスリンを加えることにより分化を誘導した（Ｄ０）。７日目に、９０％より多い細胞が、脂肪細胞の表現型、つまり脂肪滴の増加を示した。図４Ａ-４Ｃは、３日後の前脂肪細胞を示し、そして７日目の脂肪細胞を示す。図５Ａ及び５Ｂは、４日目での脂肪細胞及び７日目の脂肪細胞のオイルレッドＯ染色を示す。図６Ａ及び６Ｂは、４日目及び７日目でのオイルレッドＯ染色及びメチレン・ブルー染色を示す。
【００５５】
［0073］ ３Ｔ３-Ｌ１脂肪細胞を、５ｍＭグルコース及び０.５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で一晩飢餓状態にした。細胞を、１％ＢＳＡを含むクレブ-リンゲル-Ｈｅｐｅｓ緩衝液中で洗浄し、そして増加濃度のインスリン、ＤＡＣ：インスリン誘導体、及びその対応する複合体で、２０分間、３７℃でインキュベーションし、そして［14Ｃ］-２-デオキシ-Ｄ-グルコース（１μＣｉ/ウェル）でさらに２０分間インキュベーションした。細胞を可溶化し、そして放射活性を計測した。グルコース取り込みを、インスリン・コントロールに対して計算し、そしてＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して計算した。
【００５６】
［0074］ 表３は、試験された化合物に対するＥＣ５０の結果を示し、そして図７は、当該化合物の濃度（Ｍ）の関数におけるコントロールのグルコース取り込みの割合（％）を示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】
実施例ＸＩ
［0075］ さらに、インビトロ活性を評価するために、脂肪細胞の他のソースにおいてグルコース取り込みを使用した。体重１７５±２５ｇのＷｉｓｔｅｒ由来雄ラットから得た副睾丸脂肪を使用する。組織（０.０３ｇ/ｍｌ）を、コラゲナーゼを含む改変ＨＥＰＥＳ溶液ｐＨ７.４により、３７℃で分解した。試験化合物及び/又は溶媒を、５００μＬの一定量の改変ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７.４でインキュベーションし、そしてＤ-［３−３−Ｈ］グルコース（２.５μＣｉ/ｍｌ）を次に加えて、２時間インキュベーションした。試験化合物誘導性のグルコース取り込みであって、コントロール２ｎＭインスリンの応答に対して５０％以上多いグルコースの取り込みの増加は、有力なインスリン受容体アゴニスト活性を指し示す。５０％を超えて、インスリン誘導性グルコースの取り込み応答を阻害する試験化合物は、インスリン受容体アンタゴニスト活性を指し示す。化合物は、１０、１、０.１、０.０１、及び０.００１μＭでスクリーニングされる。
【００５９】
［0076］ 表４は、試験される化合物についてのＥＣ５０の結果を示し、そして図８は、化合物の濃度（Ｍ）関数におけるコントロールのグルコース取り込み割合（％）を示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
実施例ＸＩＩ
インビボ実験
［0077］ 組換えヒトインスリンと本発明のインスリン誘導体との間の血中グルコース低下効力の評価は、糖尿病の雌ｄｂ/ｄｂマウスに皮下投与される際に、比較される。
【００６２】
［0078］ 試験化合物を、一回の皮下ボーラス注射により、５〜６週齢のメスｄｂ/ｄｂマウス、体重２４.３〜３３.３ｇに投与した。注射された投与溶液の平均体積は、０.３５ｍｌ/マウス（１２.５ｍｌ/ｋｇ）であった。
【００６３】
［0079］ 組換え（イー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ））ヒト・インスリン（以下でｒＨインスリンと呼ぶ）は、ＩＣＮＴＭにより、２８ＩＵ/ｍｇの濃度で提供される。
【００６４】
インスリン誘導体のストック溶液を、合成インスリン誘導体を酸性水（〜ｐＨ２）で再構成することにより、１４.２９ｍｇ/ｍｌ（〜４００ＩＵ/ｍｌ）で調製した。ストック溶液を次に０.９％ＮａＣｌで希釈し、そして０.２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ）を通して、表５に表される投与溶液を得た。群Ｉは、コントロール溶液として、０.９％ＮａＣｌ・ＵＳＰを受けた。
【００６５】
【表５】
【００６６】
［0081］ 群と処理は、表６において要約される。
【表６】
【００６７】
［0082］ 血液採取（一滴）を、尻尾の先で行い、そしてグルコースレベルを、手持ちグルコメーター（モデル：ワンタッチUltraTM、Lifescan Canada）を使用して測定した。血液グルコースレベルを、投与前に一度全ての動物で測定し、そして投与後１、２、３、４、６、２４、３０、４８、及び７２時間で測定した。
【００６８】
インビボ結果：
［0083］ 全ての動物は、試験化合物の投与前に通常であるようにみえた。投与後およそ１時間で、１００ＩＵ/ｋｇの組換えヒト・インスリン（ｒＨインスリン）で皮下投与された群２の動物は、活動が少し低下し、そして非強調的な歩行を示した。他の処置を受けた動物は、実験を通して通常であるように見えた。食餌消費のわずかな減少が、実施例ＩＩＩの１７.９ｍｇ/ｋｇの化合物で処置された動物において観測された。
【００６９】
［0084］ 表７は、ｒＨインスリン及びインスリン誘導体の一回投与の後の食餌消費（全重量/ケージ（ｇ））を示す。
【表７】
【００７０】
［0085］ 表８は、ｒＨインスリン及びインスリン誘導体の一回投与後のコントロールに対する食餌消費（全重量/ケージ）を示す。
【表８】
【００７１】
血糖の差分は、図９、１０、１１、１２、１３、及び１４において報告された各々のマウスについて、投与後の血中グルコース・レベル対投与前のグルコース・レベルから計算される。一般的に、インスリン誘導体（実施例Ｉ、実施例ＩＩ、及び実施例ＩＩＩ）は、用量依存的様式で血中グルコース濃度を低下でき、そして一回の投与量（１００ＩＵ/ｋｇ）のみで試験された組換えインスリンは、２時間活性であった。３.６ｍｇ/ｋｇにおいて、実施例２は、最初の２時間インスリンと同程度の活性であり、一方実施例Ｉ及び実施例ＩＩＩでは不十分な効果しか得られない。ｒＨインスリンの低下効果は、１７.９ｍｇ/ｋｇでより強調された。なぜなら、当該効果が２４時間まで観察されたからである。全体図は、インスリン誘導体が、２４時間まで（コントロール群に比べて）活性であることを示したが、グルコース・レベルが投与後１〜２時間減少し、次に３〜４時間で増加し、そして再び６時間で減少しているということに留意することは重要である。この「上昇と下降」応答は、マウスの食性および代謝が、薬剤の効力に影響を与えうる重要なパラメーターであるということを示唆しうる。ｄｂ/ｄｂマウスが、年齢につれてインスリン抵抗性を発達させ、このことが、グルコース低下効果を得るために注射されなければならないかなり高用量のインスリンを説明しうるということについて言及することは重要である。
【００７２】
実施例ＸＩＩＩ
通常ラットにおける薬物動態プロファイル
［0087］ Ｒｈインスリン、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体、及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体を、７〜８週齢の雄ＣＤラットに、３６ｎｍｏｌ/ｋｇ ｓｃ又は１２ｎｍｏｌ/ｋｇ静脈内（iv）のいずれかで投与した。血液サンプルを、７２時間まで（ｒｈインスリン-処置した動物については３時間まで）回収した。薬剤レベルを、ヒト・インスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ）を使用して測定した。薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用して、化合物/投与経路あたりＮ＝４で非区画分析により計算した。図１５は、通常のＳＤラットにおけるインスリンの薬物動態プロファイルである。ここでインスリンは、ｓｃで３６ｎｍｏｌ/ｋｇで投与され、そしてｉｖで１２ｎｍｏｌ/ｋｇで投与された。図１６は、通常のＳＤラットにおける実施例ＩＩＩの複合体の薬物動態プロファイルであり、ここで複合体は、ｓｃで３６ｎｍｏｌ/ｋｇ、及びｉｖで１２ｎｍｏｌ/ｋｇで投与された。図１７は、通常のＳＤラットにおける実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の薬物動態プロファイルであり、ここでインスリン誘導体は、ｓｃで３６ｎｍｏｌ/ｋｇで投与され、そしてｉｖで１２ｎｍｏｌ/ｋｇで投与された。図１８は、インスリン、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体、及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体の皮下投与のＰＫプロファイルである。図１９は、インスリン、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体、及び実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体の静脈内投与のＰＫプロファイルである。
【００７３】
実施例ＸＩＶ
糖尿病ラットにおける一回用量の薬力学
［0088］ 雄ＣＤラットにおいて、ストレプトゾトシン（６０ｍｇ/ｋｇ）の一回ｉｖ注射で、糖尿病を誘導した。２日後、ＤＡＣ（商標）：インスリン誘導体を１２０ｎｍｏｌ/ｋｇ、前もって成形された複合体３００ｎｍｏｌ/ｋｇ、ｒｈインスリン２０Ｕ/ｋｇ（１２０ｎｍｏｌ/ｋｇ）、又は溶媒を、ラットに１回ｓｃ注射した。血中グルコースレベルを手持ちグルコメーターで、注射直前、及び投与後１、２、３、４、６、８、１０、１１、２４、３０、及び４８時間後、５匹のラット/群で測定した。但し溶媒群については３匹のラット/群で試験した。通常のラットにおける血糖の範囲は、５.２〜７.６ｍｍｏｌ/ｌであった。
【００７４】
［0089］ 図２０は、１２０ｎｍｏｌ/ｋｇの実施例Ｉ〜ＩＶを投与した後のラットにおける血中グルコースレベルを示す。図２１は、本発明の実施例Ｉ〜ＩＶの対応する複合体を３００ｎｍｏｌ/ｋｇで投与した後の、ラットにおける血糖レベルを示す。
【００７５】
実施例ＸＶ
繰返し皮下注射後の、ＤＡＣ：インスリン誘導体の効力及び前もって成形された対応の複合体の効力の評価
［0090］ 本アッセイは、成獣雄ＣＤ（商標）ラットに繰返し皮下注射した後の、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体及びその複合体の効力対遊離ヒト組換えインスリンの効力を評価するために行われた。
【００７６】
［0091］ １型糖尿病を、ストレプトゾトシン（６０ｍｇ/ｋｇ、ｐＨ４.５）の１回静脈（ｉｖ）注射により、実験１日目に雄ＣＤ（商標）ラットに誘導した。高血糖は、血液を試験する血中グルコースモニターを使用して確認された。試験化合物を、実験３日目から１４日目まで１日１回、皮下（ｓｃ）注射により１ｍｌ/ｋｇ体重で投与した。血中グルコースレベルを、それぞれの日の投与の直前、及び投与後２、８、１９時間で試験した。食餌と水の消費量を、毎日モニターした。体重を、実験１、３、６、９、１２、１５、及び１７日目に集めた。
【００７７】
［0092］ 図２２は、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体についての１日目、６日目、及び１２日目における１日の血中グルコース・プロファイルを示し、そして図２３は、実施例ＩＩＩのインスリン誘導体の複合体について、１日目、６日目、及び１２日目での１日の血中グルコース・プロファイルを示す。
【００７８】
［0093］ 本発明は、その特異的な実施態様に関して記載される一方で、さらなる改良が可能であり、そして当該出願が、本発明の原理に一般的に従う発明、並びに本発明が関連する技術において既知又は慣習的な慣行の範囲内であり、本明細書に記載された基本的特徴に適用され、そして添付の特許請求の範囲内に従う開示からの逸脱を含む発明の全てのバリエーション、使用、又は適応をカバーすることが意図されることが、理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン分子及び血液成分に共有結合するための反応基を含むインスリン誘導体。
【請求項２】
前記インスリン分子が以下の式Ｉ：
【化１】
の分子であり、そして前記反応基が、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９の位置から選ばれる位置で、インスリン分子のアミノ酸に結合する、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
前記反応基が、マイケル・アクセプター、スクシンイミジル含有基、及びマレイミド含有基からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
前記マイケル・アクセプターが、α,β，不飽和カルボニル部分である、請求項３に記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
前記反応基が、マレイミド含有基である、請求項１又は２に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記反応基が、３-マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）である、請求項１又は２に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
前記反応基が、リンカーを介して、前記インスリン分子のアミノ酸に結合される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
前記リンカーが、（２-アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、アミノ・エトキシ・エトキシ・スクシニミン酸（ＡＥＥＳ）、ＡＥＥＳ-ＡＥＥＳ、２-［２-（２-アミノ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、ＡＥＥＡ-ＡＥＥＡ、-ＮＨ2-（ＣＨ2）n-ＣＯＯＨ、［式中、ｎが、１〜２０の整数である］、及びアルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）モチーフ、並びにそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項７に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
前記アルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）モチーフが、酸素、窒素、又は硫黄原子が取り込まれうる飽和又は不飽和の１以上のアルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）である、請求項８に記載のインスリン誘導体。
【請求項１０】
前記アルキル鎖が、グリシン、３-アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８-アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、及び４-アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）からなる群から選ばれる、請求項９に記載のインスリン誘導体。
【請求項１１】
前記組合せが、ＡＥＥＡ-ＥＤＡ、ＡＥＥＡ-ＡＥＥＡ、及びＡＥＡ-ＡＥＥＡからなる群から選ばれる、請求項８に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
前記リンカーが、-ＮＨ2-（ＣＨ2）7-ＣＯＯＨである、請求項６に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
以下の式：
【化２】
を有する、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１４】
以下の式：
【化３】
を有する請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１５】
以下の式：
【化４】
を有する、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１６】
前記血液成分が、血液タンパク質である、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１７】
前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載されるインスリン誘導体及び血液成分を含むインスリン複合体であって、当該反応基及び当該血液成分が、当該反応基と当該血液成分との間で形成される共有結合を介して結合される、前記複合体。
【請求項１９】
前記血液成分が、血液タンパク質である、請求項１８に記載のインスリン複合体。
【請求項２０】
前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、請求項１９に記載のインスリン複合体。
【請求項２１】
前記複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏで形成される、請求項１８に記載のインスリン複合体。
【請求項２２】
医薬として許容される担体と供に、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のインスリン誘導体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
医薬として許容される担体と供に、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のインスリン複合体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
血糖関連疾患又は障害を患う対象において血糖関連疾患又は障害を治療する方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のインスリン誘導体を、当該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１８〜２１のいずれか１項のインスリン複合体の投与を含む、血糖関連疾患又は障害の治療方法。
【請求項２８】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２２及び２３のいずれか１項に記載の医薬組成物の投与を含む、血糖関連疾患又は障害の治療方法。
【請求項３１】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
血糖関連疾患又は障害の治療用医薬の製造のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の誘導体の使用。
【請求項３４】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
血糖関連疾患又は障害の治療用医薬の製造のための、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項３７】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項３７に記載の使用。
【請求項１】
インスリン分子及び血液成分に共有結合するための反応基を含むインスリン誘導体。
【請求項２】
前記インスリン分子が以下の式Ｉ：
【化１】
の分子であり、そして前記反応基が、Ｇｌｙ Ａ１、Ｐｈｅ Ｂ１、及びＬｙｓ Ｂ２９の位置から選ばれる位置で、インスリン分子のアミノ酸に結合する、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
前記反応基が、マイケル・アクセプター、スクシンイミジル含有基、及びマレイミド含有基からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
前記マイケル・アクセプターが、α,β，不飽和カルボニル部分である、請求項３に記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
前記反応基が、マレイミド含有基である、請求項１又は２に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記反応基が、３-マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）である、請求項１又は２に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
前記反応基が、リンカーを介して、前記インスリン分子のアミノ酸に結合される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
前記リンカーが、（２-アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、アミノ・エトキシ・エトキシ・スクシニミン酸（ＡＥＥＳ）、ＡＥＥＳ-ＡＥＥＳ、２-［２-（２-アミノ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、ＡＥＥＡ-ＡＥＥＡ、-ＮＨ2-（ＣＨ2）n-ＣＯＯＨ、［式中、ｎが、１〜２０の整数である］、及びアルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）モチーフ、並びにそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項７に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
前記アルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）モチーフが、酸素、窒素、又は硫黄原子が取り込まれうる飽和又は不飽和の１以上のアルキル鎖（Ｃ１-Ｃ１０）である、請求項８に記載のインスリン誘導体。
【請求項１０】
前記アルキル鎖が、グリシン、３-アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８-アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、及び４-アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）からなる群から選ばれる、請求項９に記載のインスリン誘導体。
【請求項１１】
前記組合せが、ＡＥＥＡ-ＥＤＡ、ＡＥＥＡ-ＡＥＥＡ、及びＡＥＡ-ＡＥＥＡからなる群から選ばれる、請求項８に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
前記リンカーが、-ＮＨ2-（ＣＨ2）7-ＣＯＯＨである、請求項６に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
以下の式：
【化２】
を有する、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１４】
以下の式：
【化３】
を有する請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１５】
以下の式：
【化４】
を有する、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１６】
前記血液成分が、血液タンパク質である、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１７】
前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載されるインスリン誘導体及び血液成分を含むインスリン複合体であって、当該反応基及び当該血液成分が、当該反応基と当該血液成分との間で形成される共有結合を介して結合される、前記複合体。
【請求項１９】
前記血液成分が、血液タンパク質である、請求項１８に記載のインスリン複合体。
【請求項２０】
前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、請求項１９に記載のインスリン複合体。
【請求項２１】
前記複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏで形成される、請求項１８に記載のインスリン複合体。
【請求項２２】
医薬として許容される担体と供に、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のインスリン誘導体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
医薬として許容される担体と供に、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のインスリン複合体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
血糖関連疾患又は障害を患う対象において血糖関連疾患又は障害を治療する方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のインスリン誘導体を、当該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１８〜２１のいずれか１項のインスリン複合体の投与を含む、血糖関連疾患又は障害の治療方法。
【請求項２８】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２２及び２３のいずれか１項に記載の医薬組成物の投与を含む、血糖関連疾患又は障害の治療方法。
【請求項３１】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
血糖関連疾患又は障害の治療用医薬の製造のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の誘導体の使用。
【請求項３４】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
血糖関連疾患又は障害の治療用医薬の製造のための、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項３７】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記血糖関連疾患が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項３７に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−６２３１１（Ｐ２０１２−６２３１１Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１８４９５８（Ｐ２０１１−１８４９５８）
【出願日】平成２３年８月２６日（２０１１．８．２６）
【分割の表示】特願２００６−５２１３５７（Ｐ２００６−５２１３５７）の分割
【原出願日】平成１６年７月２６日（２００４．７．２６）
【出願人】（５１１２０９１１４）コンジュシェム リミティド ライアビリティ カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８４９５８（Ｐ２０１１−１８４９５８）
【出願日】平成２３年８月２６日（２０１１．８．２６）
【分割の表示】特願２００６−５２１３５７（Ｐ２００６−５２１３５７）の分割
【原出願日】平成１６年７月２６日（２００４．７．２６）
【出願人】（５１１２０９１１４）コンジュシェム リミティド ライアビリティ カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
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