【課題】タンパク質標的の検出のような方法論にＣＰ材料を取り入れることで、アッセイの性能を劇的に向上させ、従来の色素では実現できなかった検出レベルを得る。
【解決手段】多発色団および／または標的生体分子を同定するための多発色団複合体を含む組成物および方法が得られる。抗体などのセンサ生体分子は、多発色団と共有結合的に連結可能である。また、シグナル伝達発色団も多発色団と共有結合的に連結可能である。シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができるように配置される。センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できるため、多発色団および／または多発色団複合体によって標的生体分子用の検出シグナルを強めることが可能である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001] 本出願は、２００６年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６０／８２５，６１５号明細書（この出願を本明細書に援用する）の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[0002] 蛍光ハイブリダイゼーションプローブが、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列特異的検出における重要な手段のひとつとなっている。付加された蛍光標識（または色素）によって生じるシグナルをリアルタイムで監視し、生物学的標的および事象を検出するための単純かつ高速で堅実な方法とすることができる。マイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲから蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に至るまで、さまざまな用途で実用性が認められている。
【０００３】
[0003] 多発色団の分野、特に共役ポリマー（ＣＰ）に関する最近の研究では、このような方法の検出感度を大幅に高める上で、これらの材料が持つ潜在的な可能性に注目している（Liu and Bazan, Chem. Mater., 2004）。これらの材料の集光構造を水溶性にして、さまざまなプローブ標識の蛍光出力を増幅できるようにすることが可能である（２００３年６月２０日に出願された米国特許第１０／６００，２８６号明細書およびGaylord, Heeger, and Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci., 2002、いずれもその内容全体を本明細書に援用する）。
【０００４】
[0004] 特に、カチオン性ＣＰには、電荷の異なる核酸に対する強い親和性があり、光励起ポリマー（集光性供与体）から蛍光標識されたプローブ／標的対までエネルギを移動させるのに必要な距離が保証されることが分かっている。直接に励起させた色素単独の場合と比較して、光出力を７５倍にすることができる（Liu and Bazan, J. Am. Chem. Soc., 2005）。シグナル増幅によって、同種と異種の両方の検出形式に多種多様な利点が付与されることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0005] このような結果から、核酸診断の分野、特に試料の量が十分ではない場合に、ＣＰが極めて有望であることが分かる。しかしながら、核酸標的については増幅（または複製）するための方法すなわち、ＰＣＲがある。これに対して、タンパク質認識の分野では、標的材料を増幅するためのこのような単純な方法はない。それ自体、ＣＰの用途から生じるシグナル強調は、この分野で重要なものである。
【０００６】
[0006] 色素標識抗体は通常、免疫組織化学、タンパク質アレイ、ＥＬＩＳＡ試験、フローサイトメトリーなどの用途において、タンパク質標的の検出に用いられる。このような方法論にＣＰ材料を取り入れることで、こうしたアッセイの性能が劇的に向上することになり、従来の色素では実現できなかった検出レベルが得られるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
[0007] 概して、一態様では、アッセイ方法が、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、シグナル伝達発色団と共役し、標的生体分子と相互作用できるセンサを提供し、
【化１】

を含むがこれに限定されるものではない共役ポリマーであって、
[0008] センサと静電的に相互作用し、励起時に、センサシグナル伝達発色団にエネルギを移動できるポリマーを提供し、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサが結合可能な条件下で、溶液中にて試料をセンサおよび多発色団に接触させ、多発色団を励起可能な光源を試料に適用し、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出することを含む。
【０００８】
[0009] 一実施形態では、Ｒ基がスルホネートである。別の実施形態では、センサが、タンパク質、核酸または抗体などの生体分子である。
【０００９】
[0010] 別の実施形態では、センサが、複数のシグナル伝達発色団と共役する複数のセンサを含み得るものであり、複数の発色団のうちの少なくとも２つが、多発色団からのエネルギ移動時に波長の異なる光を放出する。
【００１０】
[0011] 概して、別の態様では、少なくとも１つの生体分子に結合される多発色団を含む多発色団複合体が得られる。この生体分子としては、センサ生体分子、バイオコンジュゲート、標的生体分子があげられるが、これに限定されるものではない。複合体の多発色団は、シグナル伝達発色団にさらに結合され、以下の構造を含む。
【化２】

【００１１】
[0012] 式中、ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は、互いに同一または異なる、置換されていてもよい共役ポリマーセグメントまたはオリゴマー構造である。一実施形態では、共役ポリマーがカチオン性共役ポリマーである。別の実施形態では、共役ポリマーがアニオン性共役ポリマーである。さらに別の実施形態では、共役ポリマーが電荷中性共役ポリマーである。一実施形態では、ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、チオフェン、フラン、ピリジンおよびオキサジアゾールからなる群から選択される芳香族繰り返し単位であり、各々置換されていてもよく、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、リンカーによって連結された、１つまたは複数の独特なバイオコンジュゲーション部位を含み得る。
【００１２】
[0013] 別の実施形態では、多発色団が、マレイミド、チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）、アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）およびスルホ−ＳＢＥＤスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネートを含むがこれに限定されるものではない、バイオコンジュゲーション部位を含む。
【００１３】
[0014] 複合体の多発色団は、構造
【化３】

を有し、
[0015] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含むがこれに限定されるものではない、可溶化基である。
【００１４】
[0016] あるいは、別の実施形態では、複合体の多発色団が、構造
【化４】

を有し、
[0017] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である。特定の実施形態では、１および２が、構造
【化５】

を有するａ〜ｇの連結基を含むものであってもよい。
【００１５】
[0018] ３は、構造
【化６】

を有する基ｈであってもよい。
【００１６】
[0019] 別の実施形態では、複合体の多発色団が、構造
【化７】

を有するものであってもよく、
[0020] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含むがこれに限定されるものではない、可溶化基である。
【００１７】
[0021] さらに別の実施形態では、複合体の多発色団は、構造
【化８】

を有するものであってもよく、
[0022] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である。
【００１８】
[0023] さらに別の実施形態では、複合体の多発色団は、構造
【化９】

を有するものであってもよく、
[0024] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含む可溶化基である。
【００１９】
[0025] 概して、別の態様では、多発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたセンサ生体分子と、多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できる、標的生体分子を同定するための多発色団複合体が得られる。一実施形態では、シグナル伝達発色団とセンサ生体分子の両方が、複数のリンカーを介して、多発色団に共有結合的に連結される。別の実施形態では、シグナル伝達発色団とセンサ生体分子の両方が、多発色団、シグナル伝達発色団およびセンサ生体分子を共有結合的に結合する三官能性リンカーを介して、多発色団に共有結合的に連結される。
【００２０】
[0026] 一実施形態では、リンカーが、マレイミド／チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）／アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／アミン、アミン／スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールおよびアミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールを含むがこれに限定されるものではない、連結化学を有する。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００２１】
[0027] 概して、別の態様では、得られるアッセイ方法が、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供するステップと、多発色団と、共有結合的に連結されるシグナル伝達発色団と、共有結合的に連結されるセンサ生体分子と、を含み、シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できる、多発色団複合体を提供するステップと、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサ生体分子が結合可能な条件下で、溶液中にて試料を多発色団複合体に接触させるステップと、多発色団を励起可能な光源を試料に適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出するステップと、を含むものである。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００２２】
[0028] 概して、別の態様では、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供するステップと、シグナル伝達発色団と共役し、標的生体分子と相互作用できる第１のバイオコンジュゲートを提供するステップと、構造
【化１０】

[0029] （式中、ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は、互いに同一または異なる、置換されていてもよい共役ポリマーセグメントまたはオリゴマー構造であり、第２のバイオコンジュゲートが、第１のバイオコンジュゲートと結合可能であり、そのような結合時に、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる）を含む多発色団と共役する第２のバイオコンジュゲートを提供するステップと、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子に第１のバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を第１のバイオコンジュゲートに接触させるステップと、溶液を第２のバイオコンジュゲートに接触させるステップと、多発色団を励起可能な光源を試料に適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出するステップと、を含むアッセイ方法が得られる。一実施形態では、ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、チオフェン、フラン、ピリジンおよびオキサジアゾールを含むがこれに限定されるものではない芳香族繰り返し単位であり、各々置換されていてもよく、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、リンカーによって連結された、１つまたは複数の独特なバイオコンジュゲーション部位を含み得る。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００２３】
[0030] 関連の実施形態では、多発色団が、マレイミド、チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）、アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）およびスルホ−ＳＢＥＤスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネートを含むがこれに限定されるものではない、バイオコンジュゲーション部位を有する。
【００２４】
[0031] 特定の実施形態では、多発色団が、構造
【化１１】

を有し、
[0032] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である。
【００２５】
[0033] さらに別の実施形態では、多発色団が、構造
【化１２】

を有し、
[0034] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である。
【００２６】
[0035] さらに別の実施形態では、１および２が、
構造
【化１３】

を有する１つまたは複数のａ〜ｇの連結基を含むものであってもよい。
【００２７】
[0036] 一実施形態では、３が基ｈであり、構造
【化１４】

を有する。
【００２８】
[0037] 別の実施形態では、複合体の多発色団が、構造
【化１５】

を有するものであってもよく、
[0038] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含むがこれに限定されるものではない、可溶化基である。
【００２９】
[0039] さらに別の実施形態では、複合体の多発色団が、構造
【化１６】

を有するものであってもよく、
[0040] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含むがこれに限定されるものではない、可溶化基である。
【００３０】
[0041] 別の実施形態では、複合体の多発色団は、構造
【化１７】

を有するものであってもよく、
[0042] 式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含むがこれに限定されるものではない、可溶化基である。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００３１】
[0043] 一実施形態では、第１および第２のバイオコンジュゲートのうちの少なくとも１つが抗体である。特定の実施形態では、第１および第２のバイオコンジュゲートが抗体である。
【００３２】
[0044] 概して、別の態様では、得られるアッセイ方法が、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供するステップと、共有結合的に連結された第１のバイオコンジュゲートを含む多発色団を提供するステップと、標的分子と相互作用できるセンサ生体分子と、シグナル伝達発色団と、第１のバイオコンジュゲートに結合でき、そのような結合時に、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、共有結合的に連結された第２のバイオコンジュゲートと、を有するセンサ生体分子複合体を提供するステップと、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサ生体分子が結合可能な条件下で、溶液中にて試料をセンサ生体分子複合体に接触させるステップと、溶液を多発色団に接触させるステップと、多発色団を励起可能な光源を試料に適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出するステップと、を含む。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００３３】
[0045] 一実施形態では、第１および第２のバイオコンジュゲートとして、タンパク質、抗体および核酸があげられるが、これに限定されるものではない。関連の実施形態では、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンまたはビオチンであり、センサ生体分子が抗体であり、第２のバイオコンジュゲートについては、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンであればビオチンであり、第１のバイオコンジュゲートがビオチンであればストレプトアビジンである。別の実施形態では、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンまたはビオチンであり、センサ生体分子が核酸であり、第２のバイオコンジュゲートについては、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンであればビオチンであり、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンであればビオチンである。
【００３４】
[0046] 概して、別の態様では、生体分子を同定するための生体認識複合体が得られる。この複合体は、バイオコンジュゲートと、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、を含むものであってもよく、その場合、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる。
【００３５】
[0047] 一実施形態では、バイオコンジュゲートとして、抗体またはストレプトアビジンがあげられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００３６】
[0048] 概して、一態様では、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、バイオコンジュゲートと、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、生体認識複合体を提供するステップと、標的生体分子または標的関連生体分子が存在する場合に、この標的生体分子または標的関連生体分子にバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を生体認識複合体に接触させるステップと、多発色団を励起可能な光源を溶液に適用し、およびシグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出するステップと、を含むアッセイ方法が得られる。特定の実施形態では、多発色団は、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００３７】
[0049] 概して、別の態様では、バイオコンジュゲートと、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、標的生体分子を同定するための生体認識複合体が得られる。一実施形態では、バイオコンジュゲートが抗体である。別の実施形態では、バイオコンジュゲートがストレプトアビジンである。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００３８】
[0050] 概して、別の態様では、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供するステップと、バイオコンジュゲートと、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、バイオコンジュゲート複合体を含む生体認識複合体を提供するステップと、標的生体分子または標的関連生体分子が存在する場合に、この標的生体分子または標的関連生体分子にバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を生体認識複合体に接触させるステップと、多発色団を励起可能な光源を溶液に適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出するステップと、を含む、アッセイ方法が得られる。特定の実施形態では、多発色団が、ポリカチオン性共役ポリマー、アニオン性共役ポリマーおよび／または電荷中性共役ポリマーなどの共役ポリマーである。
【００３９】
[0051] 別の態様では、本明細書に開示した多数の方法のいずれにおいても、標的生体分子の検出時に遺伝子の発現が検出される方法が提供される。
【００４０】
[0052] 別の態様では、本明細書に開示した多数の方法のいずれにおいても、標的生体分子の検出によって、患者の病状を診断するのに用いられる結果が得られる、方法が提供される。一実施形態では、疾患を診断する方法が、試料中における標的生体分子の存在に関するデータを精査または分析するステップと、疾患の診断に関するデータの精査または分析に基づく結論を、患者、ヘルスケア提供者またはヘルスケア管理者に提供するステップと、を含む。結論を提供する関連の実施形態では、ネットワーク経由でのデータの伝送を含む。
【００４１】
[0053] 通常、別の態様では、標的生体分子を同定するためのキットが得られる。一実施形態では、キットが、多発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたセンサ生体分子と、多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できる。特定の実施形態では、キットが基質をさらに含む。
【００４２】
援用
[0054] 本明細書で言及する刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物または特許出願を具体的かつ個別に援用した場合と同程度に、本明細書に援用される。
【００４３】
図面の簡単な説明
[0055] 本発明の新規な特徴については、添付の特許請求の範囲において詳細に記載する。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明ならびに添付の図面を参照することで、本発明の特徴および利点が一層よく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】[0056]本発明の一実施形態における多発色団の静電結合を概略的に示す。
【図２】[0057]増幅色素放出を示すＦＩＴＣ標識抗体の直接励起のプロット（左）と、本発明の一実施形態による多発色団の構造についての概略（右）である。
【図３】[0058]増幅色素放出を示すCy3標識抗体の直接励起のプロット（左）と、本発明の一実施形態による多発色団の構造についての概略（右）である。
【図４】[0059]本発明の一実施形態による、バイオコンジュゲートされる多発色団を概略的に示す。
【図５】[0060]抗体（左）または色素（右）に共役された多発色団を概略的に示す。
【図６】[0061]色素で標識される一次抗体に結合する二次抗体に共役された多発色団を概略的に示す。
【図７】[0062]色素標識一次抗体およびビオチン標識一次抗体（左）または色素標識核酸およびビオチン標識核酸（右）への結合用にストレプトアビジンに共役された多発色団を概略的に示す。
【図８】[0063]色素と共役関係にある抗体に共役された多発色団（左）ならびに、色素と共役関係にあるストレプトアビジンに共役された多発色団（右）を概略的に示す。
【図９】[0064]本発明の一実施形態による多発色団の構造を概略的に示す。
【図１０】[0065]本発明の一実施形態によるバイオコンジュゲーション部位を有するモノマーを概略的に示す。
【図１１】[0066]本発明の一実施形態によるモノマーへの合成経路を概略的に示す。
【図１２】[0067]本発明の別の実施形態によるモノマーへの合成経路を概略的に示す。
【図１３】[0068]リンカー（左）または三官能性リンカー（右）を介して色素と生体分子にバイオコンジュゲートされた多発色団を概略的に示す。
【図１４】[0069]色素と抗体の両方に共役された多発色団（左）と、色素とタンパク質の両方に共役された多発色団（右）を概略的に示す。
【図１５】[0070]２種類の色素で標識したＤＮＡプローブの単一・多検出をプロットしたものである。
【図１６】[0071]タンパク質を標的する一次抗体に特異的な二次抗体と色素とに連結された多発色団を概略的に示す。
【図１７】[0072]二次抗体でのビオチンとの結合用に色素およびストレプトアビジンに連結された多発色団を概略的に示す。二次抗体は、タンパク質を標的する一次抗体に特異的なものとして示されている。
【図１８】[0073]本発明の一実施形態による共役ポリマー多発色団の構造を概略的に示す。
【図１９】[0074]本発明の別の実施形態による共役ポリマー多発色団の構造を概略的に示す。
【図２０】[0075]本発明の実施形態によるさまざまな芳香族単位の構造を概略的に示す。
【図２１】[0076]マレイミドバイオコンジュゲーション部位を有する共役ポリマー多発色団の構造を概略的に示す。
【図２２】[0077]代表例の論理素子を示すブロック図である。
【図２３】[0078]代表例のキットを示すブロック図である。
【図２４】[0079]本発明の実施形態による赤外線（ＩＲ）分光分析のプロットである。
【図２５】[0080]本発明の実施形態による光学スペクトルのプロットである。
【図２６】[0081]本発明の実施形態による蛍光スペクトルのプロットである。
【図２７Ａ】[0082]本発明の一実施形態によるビオチニル化に関連する構造を概略的に示す。
【図２７Ｂ】[0083]本発明によるビオチン−アビジン結合アッセイを概略的に示す。
【図２７Ｃ】[0084]本発明の一実施形態でのビオチン−アビジン結合アッセイに関連する蛍光スペクトルのプロットである。
【図２８】[0085]本発明の別の実施形態による赤外線（ＩＲ）分光分析のプロットである。
【図２９】[0086]本発明の別の実施形態による光学スペクトルのプロットである。
【図３０Ａ】[0087]対照ポリマー構造を概略的に示す。
【図３０Ｂ】[0088]本発明の一実施形態に関連する実験ポリマー構造を概略的に示す。
【図３０Ｃ】[0089]前記対照ポリマーおよび実験ポリマーに関連する蛍光スペクトルのプロットである。
【図３１Ａ】[0090]本発明の一実施形態に関連する対照ポリマー構造と実験ポリマー構造を概略的に示す。
【図３１Ｂ】[0091]対照ポリマーおよび実験ポリマーに関連する蛍光アッセイを概略的に示す。
【図３２Ａ】[0092]本発明のポリマーの一実施形態での蛍光スペクトルのプロットである。
【図３２Ｂ】[0093]本発明の一実施形態による蛍光スペクトルの補正値を示すプロットである。
【図３３Ａ】[0094]本発明の一実施形態によるポリマーの蛍光シグナル強度のプロットである。
【図３３Ｂ】[0095]本発明の一実施形態によるポリマーに関連するシグナル増幅のプロットである。
【図３４】[0096]本発明のさらに他の実施形態による光学スペクトルのプロットである。
【図３５Ａ】[0097]本発明のビオチン−アビジン結合アッセイを概略的に示す。
【図３５Ｂ】[0098]本発明の一実施形態でのフルオレセイン放出のプロットである。
【図３６Ａ】[0099]本発明の一実施形態に関連するポリマー構造を概略的に示す。
【図３６Ｂ】[00100]本発明の一実施形態によるポリマーに関連する蛍光アッセイを概略的に示す。
【図３６Ｃ】[00101]本発明のポリマーの一実施形態での蛍光スペクトルのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
[00102] 色素標識した抗体の増幅には、荷電した多発色団構造と基本静電相互作用が有効となり得るが、これよりもさらに指向性の高い多発色団会合方法では、バックグラウンドを減らしてシグナル伝達を改善することが可能である。多発色団材料は、抗体および／または色素に対して直接的に共役（共有結合的に連結）可能であり、アッセイ時の制御性（多発色団−色素距離）が高まる。基本的に、シグナル伝達用の色素は増幅ポリマーに密着する。さらに、多発色団の共役は色素または抗体に限定されるものではなく、多発色団は、タンパク質（アビジン／ストレプトアビジンなど）、核酸、親和性リガンド、糖類、脂質、ペプチドおよび酵素の基質をはじめとするさまざまな生体分子のいずれに対しても共役可能である。これらの形式は、ＤＮＡマイクロアレイ、ＦＩＳＨアッセイ、ＰＣＲアッセイなどの多岐にわたる用途に適用できるものであり、上述したタンパク質ベースの検出用途も含まれる。ポリマー材料の特性がゆえに、単一の励起波長（レーザ、フィルタなど）を用いて２種類以上の色素を増幅することができる。このため、複数の標的の同時検出（多重化）が可能になる。多発色団およびその用途についての詳細は、本明細書に各々援用する以下の明細書に開示されている。２００６年１月１０日に出願され、米国特許出願公開第２００６−０１８３１４０Ａ１号明細書として公開された米国特許第１１／３２９，４９５号明細書；２００６年１月１０日に出願され、米国特許出願公開第２００６−０２１６７３４Ａ１号明細書として公開された米国特許第１１／３２９，８６１号明細書；２００６年１月３１日に出願され、米国特許出願公開第２００６−０２０４９８４Ａ１号明細書として公開された米国特許第１１／３４４，９４２号明細書；２００３年８月２６日に出願され、米国特許出願公開第２００４−０１４２３４４Ａ１号明細書として公開された米国特許第１０／６４８，９４５号明細書；２００３年６月２０日に出願され、米国特許出願公開第２００４−０２１９５５６Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／６００，２８６号明細書；２００３年９月１７日に出願され、米国特許出願公開第２００５−００５９１６８Ａ１号明細書として公開された米国特許第１０／６６６，３３３号明細書；２００４年２月１３日に出願され、米国特許出願公開第２００５−０００３３８６Ａ１号明細書として公開された米国特許第１０／７７９，４１２号明細書。
【００４６】
[00103] 本発明について詳細に説明する前に、ここで説明する特定の方法、器具、溶液または装置は、言うまでもなく変更可能であるため、本発明はこのような方法論、器具、溶液または装置に限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではない旨も理解されたい。
【００４７】
[00104] 単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」を使用する文脈では、特に断りがなければ、複数形についても言及しているものとする。よって、たとえば、「集合センサ」は複数の集合センサを含み、「プローブ」は複数のプローブを含むといった具合である。また、「２（つ／個）」「３（つ／個）」など具体的に複数形の表現を用いている箇所では、文脈上特に断りがなければ、同じ対象物についてそれよりも多くの数も含むものとする。
【００４８】
[00105] 「接続される」「結合される」「共役される」および「連結される」などの表現は、本明細書では同義に用いられ、文脈上特に断りがなければ、直接ならびに間接的な接続、結合、連結または共役を包含する。一例において、「共役ポリマー」という語句は、当該技術分野における通常の意味で用いられ、かつ伸長した一連の不飽和結合を含有するポリマーを示すものであって、その文脈では「共役される」という表現を単なる直接または間接的接続、結合または連結以上に解釈すべきである。
【００４９】
[00106] 値の範囲を示す場合、その範囲の上限と下限との間に含まれる整数値ならびに分数も各々、値の部分的な範囲とともに明確に開示されることは理解されたい。どのような範囲にしろ、上限値と下限値は、独立してその範囲に含まれるものであっても含まれないものであってもよく、上限と下限のうち一方が含まれる、両方とも含まれない、あるいは両方が含まれるかを問わず、各々の範囲が本発明に包含される。成分が０％から１００％の濃度で存在可能な場合あるいは、水溶液のｐＨが１から１４の範囲である場合のように、対象となる値に固有の限界値が存在する場合は、この固有の限界値が具体的に開示される。ある値を明記する場合、明記した値とほぼ同じ数または量の値も、それに基づく範囲と同様に本発明の範囲に包含されることを理解されたい。組み合わせを開示する場合、その組み合わせの要素の部分的な組み合わせも具体的に開示され、本発明の範囲内である。逆に、異なる要素または要素群が開示される場合、これらの組み合わせも開示される。ある発明の何らかの要素が複数の代替物を持つものとして開示される場合、各々の代替物を単独あるいは他の代替物との組み合わせで除外した発明も、本明細書に開示される。ある発明の２つ以上の要素が、そのような除外をすることができ、こうした除外内容のある要素のあらゆる組み合わせも本明細書に開示される。
【００５０】
[00107] 別途定義されるか、文脈上別段に断りがなされるかでない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味である。本明細書で説明する方法および材料と類似または等価のあらゆる方法および材料を本発明の実施もしくは試験において用いることが可能であるが、好ましい方法および材料をここで説明する。
【００５１】
[00108] 本明細書で言及するすべての刊行物は、その文献を引用するに至った特定の材料および方法論を開示・説明する目的で援用するものである。本明細書で論じる刊行物は、本願の出願日以前の開示内容についてのみ提示される。本明細書の記載内容はいずれも、本発明が、従来発明によってそのような開示に先行する権利を享受できないことを認めるものではない。
【００５２】
定義
[00109] 本発明について説明するにあたって以下の用語を用いるが、これらの用語を下記のとおり定義する。
【００５３】
[00110] 「アルキル」とは、１箇所または複数箇所で置換されていてもよい、炭素数１〜２４の分枝、未分枝または環状の飽和炭化水素基を示し、多環式化合物を含む。アルキル基の例としては、置換されていてもよいメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ヘキシルオクチル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど、ならびに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、アダマンチルおよびノルボルニルなどのシクロアルキル基があげられる。「低級アルキル」という用語は、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基を示す。置換アルキル基の置換基の例としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、カルボキシアルキル、アミン、アミド、チオエーテルおよび−ＳＨがあげられる。
【００５４】
[00111] 「アルコキシ」は「−Ｏアルキル」基を示し、この場合のアルキルは上記にて定義したとおりである。「低級アルコキシ」基とは、１〜６個、一層好ましくは１〜４個の炭素原子を含むアルコキシ基を意図したものである。
【００５５】
[00112] 「アルケニル」とは、１箇所または複数箇所で置換されていてもよい、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、炭素数２〜２４の分枝、未分枝または環状の炭化水素基を指す。アルケニル基の例としては、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、１−メチルビニル、シクロプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、１，４−ブタジエニル、シクロブテニル、１−メチルブト−２−エニル、２−メチルブト−２−エン−４−イル、プレニル、ペント−１−エニル、ペント−３−エニル、１，１−ジメチルアリル、シクロペンテニル、へキス−２−エニル、１−メチル−１−エチルアリル、シクロヘキセニル、ヘプテニル、シクロヘプテニル、オクテニル、シクロオクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなどがあげられる。本明細書で好ましいアルケニル基は、２〜１２個の炭素原子を含む。「低級アルケニル」という用語は、炭素数２〜６、好ましくは炭素数２〜４のアルケニル基を意図したものである。「シクロアルケニル」という用語は、炭素数３〜８、好ましくは５または６の環状アルケニル基を示す。置換アルケニル基の置換基の例としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アミン、チオエーテルおよび−ＳＨがあげられる。
【００５６】
[00113] 「アルケニルオキシ」とは、「−Ｏアルケニル」基を示し、この場合のアルケニルは上記にて定義したとおりである。
【００５７】
[00114] 「アルキルアリール」とは、アリール基に対して共有結合的に接合されるアルキル基を示す。好ましくは、アルキルが低級アルキルである。一例としてのアルキルアリール基としては、ベンジル、フェネチル、フェノプロピル、１−ベンジルエチル、フェノブチル、２−ベンジルプロピルなどがあげられる。
【００５８】
[00115] 「アルキルアリールオキシ」とは、「−Ｏアルキルアリール」基を示し、この場合のアルキルアリールは上記にて定義したとおりである。
【００５９】
[00116] 「アルキニル」は、１箇所または複数箇所で置換されていてもよい、少なくとも１つの−Ｃ≡Ｃ−三重結合を含む、炭素数２〜２４の分枝または未分枝炭化水素基を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、プロパルギル、ブト−２−イニル、３−メチルブト−１−イニル、オクチニル、デシニルなどがあげられる。本明細書で好ましいアルキニル基は、２〜１２個の炭素原子を含む。「低級アルキニル」という用語は、炭素数が２〜６、好ましくは２〜４であり、−Ｃ＝Ｃ−三重結合を１つ含むアルキニル基を意図したものである。置換アルキニル基の置換基の例としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アミン、チオエーテルおよび−ＳＨがあげられる。
【００６０】
[00117] 本明細書で言及する場合、「抗体」は最も広い意味で用いられ、具体的には、選択した抗原に対して結合活性または結合親和性を呈するかぎりにおいて、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（二重特異性抗体など）、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖなど）を包含する。
【００６１】
[00118] 「抗原」とは、本明細書で使用する場合、免疫反応を誘発できるあらゆる物質を示す。
【００６２】
[00119] 「アミド」とは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’を示し、ここで、Ｒ’およびＲ’’は、水素、アルキル、アリールおよびアルキルアリールから独立して選択される。
【００６３】
[00120] 「アミン」とは−Ｎ（Ｒ’）Ｒ’’基を示し、ここで、Ｒ’およびＲ’’は、水素、アルキル、アリールおよびアルキルアリールから独立して選択される。
【００６４】
[00121] 「アリール」とは、共役π電子系を有する、少なくとも１個の環を有する芳香族基を示し、炭素環式、複素環式、架橋および／または多環式アリール基を含み、１箇所または複数箇所で置換されていてもよい。代表的なアリール基は、縮合および／または連結されていてもよい、１〜５個の芳香族環を含む。一例としてのアリール基には、フェニル、フラニル、アゾリル、チオフラニル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、トリアジニル、ビフェニル、インデニル、ベンゾフラニル、インドリル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、ピリドピリジニル、ピロロピリジニル、プリニル、テトラリニルなどがある。置換されていてもよいアリール基の置換基の例としては、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルケニルカルボキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、飽和または不飽和で置換されていてもよい縮合環、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、スルホニル、−ＳＯ_３Ｒ、−ＳＲ、−ＮＯ_２、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−（ＣＨ_２）_ｎＣＯ_２Ｒまたは−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＲＲ’があげられ、式中、ｎは０〜４であり、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。
【００６５】
[00122] 「アリールオキシ」とは、「−Ｏアリール」基を示し、この場合のアリールは上記にて定義したとおりである。
【００６６】
[00123] 「炭素環式」とは、少なくとも１個の環を含み、すべての環原子が炭素であり、飽和または不飽和であってもよい、置換されていてもよい化合物を示す。
【００６７】
[00124] 「炭素環式アリール」とは、環原子が炭素である置換されていてもよいアリール基を示す。
【００６８】
[00125] 「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを示す。「ハロゲン化物」とは、ハロゲンのアニオン形態を示す。
【００６９】
[00126] 「ハロアルキル」とは、１箇所または複数箇所にてハロゲンで置換されたアルキル基を示し、これには、１タイプのハロゲン原子でのみ置換されたアルキル基ならびに、異なるタイプのハロゲン原子の混合物で置換されたアルキル基が含まれる。一例としてのハロアルキル基としては、トリフルオロメチルなどのトリハロメチル基があげられる。
【００７０】
[00127] 「ヘテロアルキル」とは、１個または複数の炭素原子と付随する水素原子が、置換されていてもよいヘテロ原子によって代置されるアルキル基を示し、１つのタイプのヘテロ原子のみで置換されたアルキル基ならびに、異なるタイプのヘテロ原子の混合物で置換されたアルキル基を含む。ヘテロ原子としては、酸素、硫黄および窒素があげられる。本明細書で使用する場合、窒素ヘテロ原子および硫黄ヘテロ原子には、窒素および硫黄の酸化形態ならびに、プロトン化された形態を含む、４つの共有結合を有する窒素のあらゆる形態が含まれる。置換されていてもよいヘテロ原子とは、窒素原子に結合される１個または複数の水素が、アルキル、アリール、アルキルアリールまたはヒドロキシルで代置されることを示す。
【００７１】
[00128] 「複素環」とは、少なくとも１個のヘテロ原子を有し、１箇所または複数箇所で置換されていてもよい、少なくとも１個の飽和環もしくは不飽和環を含む化合物を示す。代表的な複素環基は、縮合および／または連結されていてもよい、１〜５個の環を含み、これらの環が各々５個または６個の原子を含む。複素環基の例としては、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニルがあげられる。置換されていてもよい複素環基に対する置換基の例は、環炭素でのアルキルおよびアリールの場合と同様であり、ヘテロ原子ではヘテロアルキルの場合と同様である。
【００７２】
[00129] 「複素環アリール」とは、少なくとも１つの芳香族環に少なくとも１個のヘテロ原子を有するアリール基を示す。一例としての複素環アリール基には、フラニル、チエニル、ピリジル、ピリダジニル、ピロリル、Ｎ−低級アルキル−ピロロ、ピリミジル、ピラジニル、トリアジニル、テトラジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ビピリジル、トリピリジル、テトラピリジル、フェナジニル、フェナントロリニル、プリニルなどがある。
【００７３】
[00130] 「ヒドロカルビル」とは、分枝、未分枝および環状の種ならびに、飽和種および不飽和種をはじめとして、アルキル基、アルキリデニル基、アルケニル基、アルキルアリール基、アリール基などの１から約２０個の炭素原子を含むヒドロカルビル置換基を示す。「低級ヒドロカルビル」という用語は、炭素数１〜６、好ましくは、炭素数１〜４のヒドロカルビル基を意図する。
【００７４】
[00131] 「置換基」とは、炭素または窒素に結合した１つまたは複数の水素を代置する基を示す。一例としての置換基には、アルキル、アルキリデニル、アルキルカルボキシ、アルコキシ、アルケニル、アルケニルカルボキシ、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、−ＯＨ、アミド、カルボキサミド、カルボキシ、スルホニル、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、置換されていてもよい縮合飽和環または不飽和環、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＳＲ、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−（ＣＨ２）_ｎＣＯ_２Ｒまたは−（ＣＨ２）_ｎＣＯＮＲＲ’があり、式中、ｎは０〜４であり、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。また、置換基には、炭素原子と１つまたは複数の付随する水素原子が、置換されていてもよいヘテロ原子で代置されるものも含まれる。
【００７５】
[00132] 「スルホニル」は−Ｓ（Ｏ）_２Ｒを示し、式中、Ｒは、アルキル、アリール、−Ｃ（ＣＮ）＝Ｃ−アリール、−ＣＨ_２ＣＮ、アルキルアリールまたはアミンである。
【００７６】
[00133] 「チオアミド」は−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’を示し、式中、Ｒ’およびＲ’’は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立して選択される。
【００７７】
[00134] 「チオエーテル」は−ＳＲを示し、式中、Ｒは、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。
【００７８】
[00135] 本明細書で使用する場合、「結合対」という表現は、試料中の他の成分に対してよりも高い親和性で互いに特異的に結合する第１の分子と第２の分子を示す。結合対の要素間の結合は一般に、非共有結合である。一例としての結合対には、免疫学的結合対（対応する抗体または結合部分またはそのフラグメントとの組み合わせでのハプテンまたは抗原化合物、たとえば、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン、フルオレセインと抗フルオレセイン、ジニトロフェノールと抗ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンと抗ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンとヤギ抗マウス免疫グロブリンなど）ならびに非免疫学的結合対（ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン［たとえば、チロキシンとコルチゾール］−ホルモン結合タンパク質、受容体−受容体アゴニストまたはアンタゴニスト（たとえば、アセチルコリン受容体−アセチルコリンまたはその類似体）ＩｇＧ−タンパク質Ａ、レクチン−糖質、酵素−酵素補助因子、酵素−酵素−阻害因子、核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対など）などがある。結合対の一方または両方の要素は、別の分子に共役可能である。
【００７９】
[00136] 「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」「核酸」「核酸分子」という用語は、本明細書では任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を示して同義に用いられ、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、これらの類似体またはこれらの混合物を含むことができる。これらの用語は、分子の一次構造のみを示すものである。よって、これらの用語には、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖、一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）も含む。また、ポリヌクレオチドをアルキル化および／またはキャッピングなどによって修飾した形態と、未修飾の形態も含む。これらの用語のさらに詳細ならびに、塩基対形成の詳細については、２００６年１月３１日に出願された米国特許出願第１１／３４４，９４２号明細書（その全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【００８０】
[00137] 「相補的」または「実質的に相補的」とは、たとえば、センサペプチド核酸と標的ポリヌクレオチドとの間など、ヌクレオチドもしくは核酸間でハイブリダイズまたは塩基対を形成可能であることを示す。相補的ヌクレオチドは一般に、ＡとＴ（またはＡとＵ）あるいはＣとＧである。２つの一本鎖ポリヌクレオチドまたはＰＮＡは、最適に整列および比較され、かつ適切な挿入または欠失を含む一方の鎖の塩基が、他方の鎖の塩基の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、一層好ましくは約９８％〜１００％対形成する場合、実質的に相補的であると言われる。
【００８１】
[00138] あるいは、実質的相補性は、ポリヌクレオチドまたはＰＮＡが自らの相補体に対して選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。一般に、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４個〜２５個の塩基配列に対して少なくとも約６５％相補、好ましくは少なくとも約７５％、一層好ましくは少なくとも約９０％相補である場合に起こる。M.Kanehisa Nucleic Acids Res. 12:203(1984)を参照のこと。
【００８２】
[00139] 「優先的結合」または「優先的ハイブリダイゼーション」とは、試料における非相補的ポリマーと比較した場合に、１つのポリヌクレオチドまたはＰＮＡが試料で自らの相補体に結合しやすい傾向を示す。
【００８３】
[00140] ポリヌクレオチドの場合のハイブリダイゼーション条件では一般に、塩濃度が約１Ｍ未満、一層普通なのは約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満である。ペプチド核酸とポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、塩をわずかしか含まないかまったく含まない溶液中でハイブリダイゼーションを実施することが可能である。ハイブリダイゼーション温度は、５℃まで下げることが可能であるが、一般的に２２℃より高く、さらに一般的には約３０℃より高く、好ましくは約３７℃を超える。さらに長いフラグメントであれば、特異的ハイブリダイゼーションのためにこれよりも高いハイブリダイゼーション温度が必要になることもある。相補鎖の塩基組成や長さ、有機溶媒の存在、塩基ミスマッチの程度をはじめとする他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響することもあり、使用するパラメーターの組み合わせのほうが、いずれかひとつだけの絶対的測定値よりも重要である。制御できる他のハイブリダイゼーション条件として、緩衝液のタイプと濃度、溶液のｐＨ、反復配列などのバックグラウンド結合を減らすブロッキング試薬またはブロッキングタンパク質溶液の存在と濃度、洗浄剤のタイプと濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を高めるポリマーなどの分子、金属イオンおよびその濃度、キレート化剤およびその濃度、当該技術分野において周知の他の条件があげられる。
【００８４】
[00141] 本明細書における「多重化」とは、複数の検体を同時にアッセイ可能なアッセイまたは他の分析方法を示す。
【００８５】
[00142] 「有する（Having）」は、「含む（comprising）」および「含む（including）」同様にオープンエンドの言い回しであり、別の要素が含まれる状況やこれが含まれない状況を含む。
【００８６】
[00143] 「任意の」または「任意に」とは、この表現に続いて説明される事象または状況が生じても生じなくてもよく、事象または状況が起こる場合とそれが起こらない場合が説明に含まれることを意味する。
【００８７】
[00144] 本明細書に開示する本発明は、広義には、多発色団を含む複合体およびアッセイと、シグナル増幅を高めて標的生体分子または標的分子に関連した生体分子を同定するのに有用なシグナル伝達発色団とに関する。
【００８８】
[00145] 概して、一態様において、本発明は、バイオコンジュゲート（抗体など）をはじめとする生体分子であってもよいセンサ上の色素への多発色団エネルギ移動を含む。
【００８９】
[00146] 一実施形態では、Gaylord, Heeger, and Bazan, J. Am. Chem. Soc., 2003に記載されているような核酸センサアッセイに関して以下のような形式を変更した手法を利用することが可能である。具体的には、多発色団のシグナル増幅を非特異的静電結合事象に基づく形にして、ハイブリダイゼーション事象を示すことが可能である。確立された多発色団を供与体として選択し、１種または複数の色素、好ましくは効率的なエネルギ移動歴のあるフルオレセインおよびCy3などの色素を受容体として選択することが可能である。色素については、センサ分子に直接共役できると想定される。図１に概略的に示すように、センサは、溶液中または基質上の生体分子（抗体など）であればよく、これに多発色団を付加することができる。図１に示す実施形態では、正味の負電荷を有する抗体（Ｙ字形構造）に色素を共有結合的に連結（バイオコンジュゲート）することが可能である。カチオン性多発色団（波線で図示）を付加すると、多発色団と抗体との間に静電結合が生じ、多発色団と色素とを近接させることができる。よって、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）のための距離的な要件が満たされ、光（ｈνで図示）でポリマーを励起させると増幅色素放出が発生する。色素が有意な吸光度を持たない波長で多発色団を励起できると想定される。一実施形態では、多発色団の放出よりも色素の放出のほうが波長を長くすることが可能である。実用上、アッセイ方法には、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供するステップと、シグナル伝達発色団と共役し、標的生体分子と相互作用できるセンサを提供するステップと、センサと静電的に相互作用し、励起時に、センサシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる多発色団を提供するステップと、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサが結合可能な条件下で、溶液中にて試料をセンサおよび多発色団に接触させるステップと、を含み得ると想定される。次に、この方法は、多発色団を励起可能な光源を試料に適用し、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出することを含み得る。
【００９０】
[00147] 図１に示す実施形態で得られるデータの一例を図２に示す。グラフに示されるように、ＦＩＴＣ標識マウス−抗ヒトＣＤ２２抗体を、直接（ＦＩＴＣと表示した下側の線）あるいは、励起、静電的に結合した多発色団（図２の右に示す構造）ならびに、これに続くＦＲＥＴによるエネルギ移動によって間接的（ポリマーによって増幅されるシグナルと表示した上側の線）に励起可能である。実験の細目には、ＦＩＴＣ標識マウス−抗ヒトＣＤ２２抗体の直接励起（ＦＩＴＣと表示した下側の線、４９６ｎｍで励起、［ＦＩＴＣ標識マウス−抗ヒトＣＤ２２］＝１ｎｇ／ｍＬ）と、１×ＳＳＰＥ２ｍＬ中での多発色団−増幅色素放出（上側の線、３８０ｎｍで励起、［多発色団］＝１×１０^−６Ｍ（繰り返し単位）、ＲＵ）が含まれていた。供与体多発色団の構造をグラフの右に示す。都合のよいことに、多発色団の共存下でエネルギ移動をすると、直接励起の場合と比べて色素シグナル強度が５倍に増幅された。
【００９１】
[00148] 図１に示す実施形態で得られるデータの第２の例を図３に示す。ここで、グラフでは、Cy3標識ロバ−抗マウス二次抗体の直接励起（下側の線、Cy3と表示、５４０ｎｍで励起）および間接励起（上側の線、３８０ｎｍで励起）のための光学レポーティング（optical reporting）シグナルを比較して示してある。実験条件は、容量を半分にしたこと以外は前の実験の場合と同様とした。供与体多発色団構造を図３の右側に示す。多発色団増幅色素強度は、この色素を直接励起した場合と比較して１０倍の強度であった。
【００９２】
[00149] 本明細書で開示するように、荷電した多発色団と色素標識抗体との間の静電結合は、たとえば生体分子標的の検出感度を高めるための実行可能な手法となり得る。さらに別の実施形態では、多発色団（抗体複合体など）を色素／生体分子に共有結合的に結合させることで、バックグラウンドの低減やエネルギ移動の改善といった複数の利点が得られる。生体分子への直接連結の場合、静電結合事象ではなく生体認識事象が多発色団の存在を支配することになる。このようにして、生体分子に対する多発色団の非特異的結合を排除でき、多発色団自体に起因するバックグラウンド放出が低減される。上述の生体分子としては、タンパク質、ペプチド、親和性リガンド、抗体、抗体フラグメント、糖類、脂質および核酸（ハイブリダイゼーションプローブおよび／またはアプタマーとして）があげられるが、これに限定されるものではない。
【００９３】
[00150] 色素または生体分子／色素複合体への直接連結の場合は、静電結合の強さに左右されるのではなく、供与体−受容体間の距離を固定でき、エネルギ移動効率を有意に高めることが可能である。これは、色素シグナル伝達の改善と、供与体−受容体クロストークに関連したバックグラウンド蛍光の低減という観点で、非常に重要なことである。この場合のクロストークとは、多発色団（供与体）と色素（受容体）との放出ピークが重なることを示す。エネルギ移動には長すぎる距離で非特異的に結合する多発色団は、バックグラウンド蛍光（またはクロストーク）の原因となり得る。供与体と受容体との間の距離を短く（固定に）することで、直接的な色素増幅が容易になるばかりでなく、供与体の放出を大幅に抑えることが可能である。これによって、受容体の放出波長での供与体放出量が減り、結果としてクロストーク補正の必要性が低減されるか、必要性がなくなることすらある。
【００９４】
[00151] 概して、別の態様では、本発明は、親和性リガンド（親和性リガンドとは、別の生体分子に対する親和性を有する生体分子のことである）に対する多発色団のバイオコンジュゲーションを含む。多発色団（波線で示す）が、色素、生体分子または生体分子／色素複合体（Ｘと表示）に連結されるクラスの材料を図４に示す。多発色団への連結は、生体分子および／または色素（Ｘ参照）に連結された第２の機能性リンカーＡ’と共有結合的に連結可能なバイオコンジュゲーション部位として機能する、多発色団の第１の機能性リンカーＡを介して行うことが可能である。このようにすることで、多発色団とＸとの距離を一定にすることが可能であり、よって、多発色団とＸとの間には特定の相互作用だけが保証される。本実施形態の生体分子成分Ｘは、抗体、タンパク質、親和性リガンドまたは核酸を含むがこれに限定されるものではない、本明細書に開示するさまざまな生体分子のうちのどのような生体分子であってもよいと思われる。
【００９５】
[00152] この文脈でのＸとしては、色素、蛍光タンパク質、ナノ材料（Quantum Dotなど）、色素と化学発光生成分子とのコンジュゲート、蛍光タンパク質と化学発光生成分子とのコンジュゲート、ナノ材料（Quantum Dotなど）と化学発光生成分子とのコンジュゲート、ストレプトアビジン、アビジン、酵素、酵素用の基質、酵素用の基質類似物、受容体、受容体用のリガンド、受容体用のリガンド類似物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、修飾核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、抗体、抗原、ファージ、細菌または上述した任意の物質２つのコンジュゲートを用いることが可能であると思われるが、これに限定されるものではない。
【００９６】
[00153] Ａ−Ａ’およびＢ−Ｂ’の連結化学としては、マレイミド／チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）／アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／アミン、アミン／スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールおよびアミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００９７】
[00154] 別の態様では、本発明は、標識された多発色団を含む。標識された多発色団の２つの例を図５に示す。一実施形態では、左側に、多発色団（波線で示す）が、１°または２°抗体などであればよい抗体と共役された状態で示されている。多発色団と抗体とのコンジュゲートについては、アッセイなどでレポーターとして利用することができる。光（図示せず）で多発色団を励起させると、この多発色団が放出され、抗体（１°または２°）が存在することが分かる。図５の右側に示す別の実施形態では、多発色団を発色団などの色素で標識する。この場合、図示のＦＲＥＴプロセスにおいて多発色団は供与体として作用でき、色素は受容体として作用できる。ここで、多発色団は、集光器として作用でき、多発色団の励起に続いてＦＲＥＴプロセスによる色素への励起のチャネリングが生じる。この結果、（色素の直接励起ではなく）増幅色素放出が生じる。供与体多発色団の蛍光は、一実施形態では、消光可能（たとえば、＞９０％消光）である。
【００９８】
[00155] 概して、別の態様では、本発明は、標的生体分子またはタグ付き標的生体分子向けのアッセイ方法を含む。図６に示すように、一実施形態では、多発色団（波線で示す）を、１°抗体などの第２の色素標識バイオコンジュゲートに特異的な２°抗体などの第１のバイオコンジュゲート（Ｙ字形の物体として示す）に連結することが可能である。ここで、１°抗体と２°抗体との間の認識事象がゆえに、供与体多発色団と受容体色素との間の距離が短くなる。この認識事象の後、光（ｈνで図示）で供与体多発色団が励起されて受容体色素へのＦＲＥＴ（曲がった矢印で表示）が生じ、（色素の直接励起ではなく）増幅色素放出が観察される。実用上、アッセイ方法には、シグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子と相互作用できる１°抗体などの第１のバイオコンジュゲートを提供するステップによって、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供することを含み得ると思われる。続いて、多発色団と共役される２°抗体などの第２のバイオコンジュゲートを提供し、この場合、第２のバイオコンジュゲートが、第１のバイオコンジュゲートと結合可能であり、そのような結合時に、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる。次に、この方法は、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子に第１のバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を第１のバイオコンジュゲートに接触させ、溶液を第２のバイオコンジュゲートに接触させることを含む。さらに、この方法は、標的生体分子またはタグ付きの標的生体分子に光源を適用（この場合の光源は、多発色団を励起可能なものである）し、続いてシグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出することを含む。
【００９９】
[00156] 概して、別の態様では、本発明は、多発色団とセンサ生体分子複合体とを利用して試料をアッセイする方法を含む。図７の左側に示されるように、多発色団（波線で示す）を、ビオチンに対する親和性の高いストレプトアビジン（ＳＡ）などの第１のバイオコンジュゲートに共役させることが可能である。図７の左では、センサ生体分子（１°抗体または２°抗体であり得る抗体など）を色素と第２のバイオコンジュゲート（ビオチン部分など）の両方に共役させる。第１のバイオコンジュゲートと第２のバイオコンジュゲートとの間（ＳＡとビオチンとの間など）での生体認識事象の後、多発色団と色素が近接することになり、供与体多発色団の励起によって受容体色素へのＦＲＥＴが生じる。色素が放出されることで、第１のバイオコンジュゲート（抗体など）が存在することが分かる。色素を直接励起する場合とは異なり、ＦＲＥＴによって間接的に励起されると色素シグナル強度の増幅が観察されることになる。
【０１００】
[00157] 別の実施形態では、図７の右側に示されるように、核酸などのセンサ生体分子が、色素と第１のバイオコンジュゲート（ビオチン部分など）の両方と共役される。第２のバイオコンジュゲート（ＳＡなど）と第１のバイオコンジュゲート（ビオチンなど）との間の生体認識事象の後、多発色団と色素が近接することになり、供与体多発色団の励起によって受容体色素へのＦＲＥＴが生じる。色素を直接励起する場合とは異なり、ＦＲＥＴによって間接的に励起されると色素シグナル強度の増幅が観察されることになる。色素が放出されることで、センサ生体分子（核酸など）が存在することが分かる。
【０１０１】
[00158] 図７に示す実施形態を用いる方法は、標的生体分子を含有するとみられる試料を提供するステップと、共有結合的に連結された第１のバイオコンジュゲート（ＳＡなど）を含む多発色団を提供するステップと、標的分子と相互作用できるセンサ生体分子と、シグナル伝達発色団と、第１のバイオコンジュゲートに結合でき、そのような結合時に、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、共有結合的に連結された第２のバイオコンジュゲートと、を含むセンサ生体分子複合体を提供するステップと、を含み得る。この方法はさらに、標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサ生体分子が結合可能な条件下で、溶液中にて試料をセンサ生体分子複合体に接触させるステップと、溶液を多発色団に接触させるステップと、多発色団を励起可能な光源を試料に適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出するステップと、を含み得る。
【０１０２】
[00159] 概して、別の態様では、本発明は、バイオコンジュゲートと、シグナル伝達発色団と、多発色団とを含む生体分子を同定するための生体認識複合体を提供するものである。抗体などの色素標識バイオコンジュゲートに直接共役された多発色団（左）を図８に示す。図８はさらに、多発色団が色素標識ＳＡと共役される別の実施形態（右）も示している。左側に示す実施形態では、バイオコンジュゲート（Ｙ字形で図示）および色素と多発色団との共有連結によって、供与体多発色団と受容体色素とが近接する。抗体などのバイオコンジュゲートと、抗原などのその標的との間での生体認識事象の際、供与体多発色団の励起によって受容体色素へのＦＲＥＴが生じる。図８の右側に示す別の一実施形態では、多発色団と色素とが一定の近接した位置に保たれる。それ自体、結合事象の際に、たとえば、ＳＡとビオチン部分との間で、供与体多発色団の励起によって受容体色素へのＦＲＥＴが生じる。図８に示すいずれの実施形態でも、増幅色素の放出が多発色団の励起に起因して生じるものでなければならない。
【０１０３】
[00160] ＣＰ構造の非限定的な例を図９に示す。骨格は主に、フルオレン−フェニレン繰り返し単位からなるものであればよく、ＦＲＥＴプロセスでの供与体として機能する。ＣＰはＲ１基とＲ２基で官能化される。どちらも、第４級アミンまたはＰＥＧタイプの官能基を含むがこれに限定されるものではない親水基でＣＰを可溶化するよう機能できるのに対し、Ｒ２は、エネルギレベルの変更によって光学特性を調節するよう機能することもできる。部位Ａで官能化された第３のコ−モノマーフェニル基は、色素または生体分子へのバイオコンジュゲーションを可能にするものである。リンカーＡとしては、マレイミド、チオール、スクシミジルエステル（またはＮＨＳ−エステル）、アミン、アジド、ビオチン、アビジン／ストレプトアビジンあるいは、生体分子または色素で得られるＡ’リンカーと反応する他のいくつかのリガンド−受容体（図４の場合などを参照）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０４】
[00161] 図９に示す一例としてのポリマーの合成を可能にする独特なモノマーを図１０に示す。このモノマーには、鈴木カップリングが可能な２つの部位があり（Liu and Bazan, J. Am. Chem. Soc., 2005；Liu and Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 2005；Bazan, Liu、２００３年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／６６６，３３３号明細書を参照のこと）、重要なことに、バイオコンジュゲーションを可能にする部位Ａもある。部位Ａは、バイオコンジュゲーション部位自体であってもよいし、フタルイミド（保護アミン）などの前駆体であってもよい。
【０１０５】
[00162] 適したモノマー合成のいくつかの例を図１１および図１２に示す。図１１は、保護アミンとして機能するフタルイミド官能基を用いるモノマーの合成について概略的に示している。図１２は、チオールへのバイオコンジュゲートが可能なマレイミドを用いるモノマーの合成について説明するものである。
【０１０６】
[00163] 重合用の２種類のモノマー構造の合成例を以下に示す。最初は、スクシミジルエステルへのバイオコンジュゲーションを目的として保護アミン（フタルイミドの形を取る）で官能化されたモノマーの一段合成、２つ目は、チオールへのバイオコンジュゲーションを目的としてマレイミドで官能化されたモノマーの四段合成である。
【０１０７】
[00164] Ｎ−４’−（３’’，５’’−ジブロモフェノキシ）ブチルフタルイミドまたは１−（４’−フタルイミドブトキシ）３，５−ジブロモベンゼン。３，５−ジブロモフェノール（９７０ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）をヘキサンから再結晶化した。溶媒を除去した後、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミド（１．３８ｇ、４．８９ｍｍｏｌ）と、Ｋ_２ＣＯ_３（１．８８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）と、１８−クラウン−６（５３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）と、アセトン（２０ｍＬ）とを加えた。これを１時間還流した後、水１００ｍＬに注ぎ入れた。水性相をジクロロメタンで抽出（４×３０ｍＬ）した。有機層同士を組み合わせ、水、飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて濾過した。溶媒を除去したところ、白色の固体が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（４：１ヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製した後、ヘキサン中にて再結晶化させて、無色の針状物質（６５０ｍｇ、８７％）を得た。
【０１０８】
[00165] Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド。マレイミド（２．００ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（２．０８ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）との酢酸エチル溶液を０℃まで冷却した。クロロギ酸メチル（１．４ｍＬ、２０．７ｍｍｏｌ）を滴下して添加したところ、白色の沈殿が生じた。この溶液を０℃で１時間攪拌した後、固体を濾過により除去した。濾液を濃縮すると、桃色の油が生じ、これをカラムクロマトグラフィ（溶離液３：１ヘキサン：酢酸エチル）で精製して淡い黄色の結晶を得た。
【０１０９】
[00166] Ｎ−（ω−ヒドロキシヘキシル）マレイミド。６−アミノ−１−ヘキサノールと飽和ＮａＨＣＯ_３（２０ｍＬ）とを０℃まで冷却した。攪拌しながらＮ−メトキシカルボニルマレイミドを数回に分けて加えた。固体は完全には溶解されなかった。これを０℃で３０分間攪拌（２０分を経過するとほとんどの固体が溶解）し、続いて氷浴を取り除き、溶液をさらに３０分間攪拌したところ、この時点で溶液は淡い桃色になった。これを水で３倍に希釈し、クロロホルムで洗浄（３×４０ｍＬ）し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて濾過し、回転蒸発によって溶媒を除去した。
【０１１０】
[00167] １−（６’−ブロモヘキシルオキシ）−３，５−ジブロモベンゼン。３，５−ジブロモフェノールをヘキサンから再結晶化した。溶媒を除去した後、１，６−ジブロモヘキサン、Ｋ_２ＣＯ_３、１８−クラウン−６およびアセトンを加えた。これを１時間還流した後、水１００ｍＬに注ぎ入れた。水性相をジクロロメタンで抽出（４×３０ｍＬ）した。有機層同士を組み合わせ、水、飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させて濾過した。溶媒を除去したところ、乳白色の固体が得られ、これをカラムクロマトグラフィで精製して白色の固体を得た。
【０１１１】
[00168] １−（６’−（６’’マレイミドヘキシルオキシ）ヘキシルオキシ）−３，５−ジブロモベンゼン。Ｎ−（ω−ヒドロキシヘキシル）マレイミドと、１−（６’−ブロモヘキシルオキシ）−３，５−ジブロモベンゼンと、Ｋ_２ＣＯ_３と、１８−クラウン−６と、アセトンとを１時間還流した後、水１００ｍＬに注ぎ入れる。水性相をジクロロメタンで抽出（４×３０ｍＬ）する。有機層同士を組み合わせ、水、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させて濾過する。溶媒を除去すると、粗材料が得られ、これをカラムクロマトグラフィで精製して精製生成物を得る。
【０１１２】
[00169] 概して、別の態様では、本発明は、多発色団と、センサ生体分子と、シグナル伝達発色団とを含む、標的生体分子を同定するための多発色団複合体を提供するものである。図１３に示すように、一実施形態では、多発色団を色素と生体分子（生体認識分子など）の両方にバイオコンジュゲートすることが可能である。有用な生体分子としては、抗体、親和性リガンド、核酸、タンパク質、ナノ粒子または酵素用の基質があげられるが、これに限定されるものではない。色素を多発色団と近接して共有結合的に連結することの利点については、上述した。受容体色素と生体認識分子の両方を多発色団に付加すると、受容体が供与体多発色団付近にくるように（あるいはその逆）供与体−受容体距離を一定にし、生体認識事象を示すための多発色団結合の特異性を高めることで、利点が二倍になる。これらの共有結合複合体は、本明細書で説明するモノマーと連結化学によって生成可能なものである。
【０１１３】
[00170] 図１３の左側に示すように、一実施形態では、多発色団（波線）をリンカー官能基Ａ−Ａ’によって色素Ｘにバイオコンジュゲートし、リンカー官能基Ｂ−Ｂ’によって生体分子Ｙにバイオコンジュゲートすることができる。図１３の右側に示す別の実施形態では、三官能性リンカーによって、リンカー官能基Ａ−Ａ’、Ｂ−Ｂ’、Ｃ−Ｃ’を介して多発色団を色素Ｘと生体分子Ｙにバイオコンジュゲートすることができる。図１３に示す実施形態では、Ｘとしては、色素、蛍光タンパク質、ナノ材料（Quantum Dotなど）、色素と化学発光生成分子とのコンジュゲート、蛍光タンパク質と化学発光生成分子とのコンジュゲート、またはナノ材料（Quantum Dotなど）と化学発光生成分子とのコンジュゲートを用いることが可能であると思われるが、これに限定されるものではない。Ｙとしては、ストレプトアビジン、アビジン、酵素、酵素用の基質、酵素用の基質類似物、受容体、受容体用のリガンド、受容体用のリガンド類似物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、修飾核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、抗体、抗原、ファージ、細菌または上述した任意の物質２つのコンジュゲートを用いることが可能であると思われるが、これに限定されるものではない。
【０１１４】
[00171] Ａ−Ａ’、Ｂ−Ｂ’、Ｃ−Ｃ’の連結化学としては、マレイミド／チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）／アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／アミン、アミン／スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールおよびアミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールがあげられるが、これに限定されるものではない。市販のスルホ−ＳＢＥＤスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネートなどの三官能性リンカーであれば、Ｘ、Ｙ、多発色団の三方向への連結にうまく作用することができる。
【０１１５】
[00172] 実用上、図１３に示す実施形態は、標的生体分子を同定するための多発色団複合体であってもよく、この場合、複合体は、多発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたセンサ生体分子とを含む。複合体のシグナル伝達発色団は、多発色団の励起時に多発色団からエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子は、標的生体分子と相互作用できる。生体分子には、抗体、タンパク質、親和性リガンド、ペプチドまたは核酸を用いることが可能であるが、これに限定されるものではないと想定される。
【０１１６】
[00173] 概して、別の態様では、本発明は、生体分子を同定するための生体認識複合体を提供するものであり、この場合の複合体は、バイオコンジュゲートと、多発色団と、シグナル伝達発色団とを含む。図１４の左側に示す一実施形態では、多発色団が、抗体（１°または２°）などのバイオコンジュゲートおよび色素の両方と共役される。供与体多発色団と受容体色素とが共有結合的に連結されることで、これらが確実に近接することになる。供与体多発色団が励起されると、受容体色素へのＦＲＥＴが生じることになる。バイオコンジュゲートが抗体である場合、抗体がその標的（抗原など）に結合すると、それが供与体多発色団の励起時に色素の放出によって示される。別の実施形態では、図１４の右側に示されるように、多発色団をＳＡおよび色素の両方に共役させることが可能である。繰り返すが、供与体多発色団と受容体色素とが共有結合的に連結されることで、これらが確実に近接し、供与体多発色団が励起されると受容体色素へのＦＲＥＴが生じる。ＳＡ複合体を利用して、ビオチニル化抗体または核酸などのビオチン標識生体分子を標識または検出することが可能である。色素標識へのＦＲＥＴを伴う多発色団の励起によって、検出シグナルが大幅に増強される（すなわち感度が高まる）ことになる。
【０１１７】
[00174] レポーター色素と２°抗体（Ｙ字形構造）の両方にバイオコンジュゲートした二重標識多発色団（波線で示す）の一例を図１６に示す。アッセイでは、未標識の１°抗体が、標的タンパク質（黒い三角形で示す）などの抗原に結合可能である。多発色団と共役され、さらに色素と共役される２°抗体の付加物（addition）を、１°抗体に特異的に結合することが可能である。多発色団を光学励起させると、直接励起での結果とは違って色素にエネルギを移動し、増幅色素を放出することが可能である。
【０１１８】
[00175] 本発明の一実施形態によるサンドイッチタイプの複合体の一例を図１７に示す。ここで、多発色団複合体は、色素と生体分子（ストレプトアビジン（ＳＡ）など）の両方にバイオコンジュゲートされる多発色団（波線で示す）で構成される。未標識の１°抗体が、黒い三角形で示す標的タンパク質に結合した後、ビオチン標識２°抗体が１°抗体に特異的に結合する。別のステップでは、色素の直接励起とは異なり、多発色団複合体を付加するとビオチンとストレプトアビジンとの間に特異的結合が生じ、多発色団の励起によって増幅色素放出が生じる。色素放出に伴うシグナルが、標的タンパク質の存在を示すことになる。
【０１１９】
[00176] さらに他の態様では、本発明は、供与体から複数の受容体へのエネルギ移動を多重化するものである。多発色団をＦＲＥＴ系での供与体として利用することで、利点には多重化する機能も含まれる。単一の供与体で複数の色素にエネルギを移動させることができるため、単一の励起源を用いて、複数の色素の強度を監視することが可能である。これは、タンパク質−抗体認識事象によって異なるタイプの細胞を監視可能な細胞の画像化（すなわち免疫組織化学）を含むがこれに限定されるものではない用途に有用である。
【０１２０】
[00177] 一実施形態では、２種類の色素標識抗体を培養細胞株などの生物学的材料と一緒にインキュベートすることが可能である。抗体は、表面で標的タンパク質が発現された細胞を認識し、これらのタンパク質にのみ特異的に結合することができる。２種類の抗体を異なる色素で標識することで、２種類の異なるタンパク質または異なる細胞型の発現を同時に監視することが可能である。一般に、これには、正しい励起波長で各々に１回ずつ２回の走査または２つの画像が必要である。分析前の最終ステップとして、これらの２つの画像を重ねなければならない。色素と多発色団の両方に共役される抗体を利用することで、１つの励起波長を両方の色素に利用することができ、１つの画像に２つの抗体の各々から得られるデータセットが含まれることになる。
【０１２１】
[00178] この実施形態と関連する例を図１５に示す。図中、フルオレセイン標識ＤＮＡプローブへのエネルギ移動（点線）、Texas red標識ＤＮＡプローブへのエネルギ移動（破線）、両方のプローブへのエネルギ移動（実線）の場合について、単一の供与体多発色団での放出スペクトルが示されている。また、２種類の色素の直接励起で生じるスペクトルも図１５の下に向かう実線で示す。３つの事例のいずれにおいても色素の有意な増幅が認められる。さらに、他の色素の有無を問わずそれぞれの色素で強いシグナルが観察されることから、多重化の見込みがあることが分かる。タンパク質診断で並列の結果が想定される。
【０１２２】
[00179] 多重化分析の可能性を考慮すると、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Texas Red、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン6G、カルボキシロードル（carboxyrhodol）、カルボキシローダミン１１０、Cascade Blue、Cascade Yellow、クマリン、Cy2（登録商標）、Cy3（登録商標）、Cy3.5（登録商標）、Cy5（登録商標）、Cy5.5（登録商標）、Cy-Chrome、フィコエリトリン、PerCP（ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質）、PerCP-Cy5.5、JOE（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、NED、ROX（５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor.RTM. 350、Alexa Fluor（登録商標）430、Alexa Fluor（登録商標） 488、Alexa Fluor（登録商標） 532、Alexa Fluor（登録商標） 546、Alexa Fluor（登録商標） 568、Alexa Fluor（登録商標） 594、Alexa Fluor（登録商標） 633、Alexa Fluor（登録商標） 647、Alexa Fluor（登録商標） 660、Alexa Fluor（登録商標） 680、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、BODIPY.RTM. FL、BODIPY（登録商標） FL-Br.sub.2、BODIPY（登録商標） 530/550、BODIPY（登録商標） 558/568、BODIPY（登録商標） 564/570、BODIPY（登録商標） 576/589、BODIPY（登録商標） 581/591、BODIPY（登録商標） 630/650、BODIPY（登録商標） 650/665、BODIPY（登録商標） R6G、BODIPY（登録商標） TMR、BODIPY（登録商標） TR、これらのコンジュゲートおよびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、多数の色素に多発色団を連結できると想定される。
【０１２３】
[00180] 本明細書に記載の本発明を利用して、経口流体試料用のＦＤＡ認可ＨＩＶ診断試験であるOraSure Technologies, Inc.（Bethlehem , PA）製のOraQuick Rapid HIV-1/2 Antibody Testを含むがこれに限定されるものではない、業務利用可能な多数の試験の感度を高めることが可能であると想定される。この試験を用いると、わずか２０分間で９９パーセントを超える精度でスクリーニングを行うことができる。
【０１２４】
[00181]多発色団
[00182] 集光性多発色団系は、近接する発光種に対してエネルギを効率的に移動することができる。エネルギ移動の機序としては、たとえば、共鳴エネルギ移動（Forster（または蛍光）型共鳴エネルギ移動すなわちＦＲＥＴ）、量子電荷交換（Dexter型エネルギ移動）などがあげられる。しかしながら、これらのエネルギ移動機序は一般に、その範囲が比較的短く、エネルギを効率的に移動させるには集光性多発色団系がシグナル伝達発色団に近接している必要がある。集光性多発色団系の個々の発色団の数が多い場合は、放出が増幅される。つまり、入射光（「ポンプ光」）が集光性多発色団系で吸収される波長にあってフルオロフォアに移動される場合のほうが、フルオロフォアがポンプ光で直接励起される場合よりも、フルオロフォアからの放出のほうが強い。
【０１２５】
[00183] 本発明で用いる多発色団は、電荷が中性であってもよいし、カチオン性またはアニオン性であってもよい。いくつかの実施形態では、多発色団がポリカチオン性多発色団である。
【０１２６】
[00184] 多発色団がポリカチオン性である実施形態では、これを、多糖、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、抗体などの複数のアニオン性基を含む生体分子と相互作用させることが可能である。いくつかの実施形態では、多発色団が標的抗体またはポリヌクレオチドと静電的に相互作用するため、センサポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションまたは抗体−抗原認識によって、荷電していないセンサポリヌクレオチドのシグナル伝達発色団をエネルギ受容近位に持っていくことが可能である。光を吸収し、好ましくはエネルギを放出または移動させるポリカチオン性多発色団であれば、どのようなポリカチオン性多発色団でもここに述べる方法で使用することが可能である。使用可能な一例としての多発色団としては、多数の発色団を実現可能な形で取り入れた、共役ポリマー（ＣＰ）、飽和ポリマーまたはデンドリマーあるいは、半導体ナノ結晶（ＳＣＮＣ）があげられる。ＣＰ、飽和ポリマーおよびデンドリマーは、複数のカチオン種を取り込むよう調製可能なものであり、誘導体化して合成後にこれをポリカチオン性にすることも可能である。一方、半導体ナノ結晶は、その表面にカチオン種を付加することでポリカチオン性にすることができるものである。いくつかの実施形態では、ポリカチオン性多発色団は、励起時にエネルギを移動させる機能で検出されるわけではないため、このような検出スキームを伴う方法では、多発色団でエネルギを放出または移動させる必要がない。
【０１２７】
[00185] いくつかの実施形態では、多発色団がＣＰである。特定の実施形態では、ＣＰが、約４５０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲でポリマーに吸収性を与えるタイプおよび量の「低バンドギャップ繰り返し単位」を含むものである。低バンドギャップ繰り返し単位は、重合前にこのような吸収を呈するものであってもよいし、呈するものでなくてもよいが、共役ポリマーに取り入れられるとその吸収を導くものである。このような吸収特性がゆえに、生物学的試料の分析および画像形成および／または分子の検出時を含む、さまざまな設定で、バックグラウンド蛍光が少ない波長でのポリマー励起が可能になる。ＣＰの吸光度を、エネルギが低く波長の長いほうにシフトさせると、一層感度が高く堅実な方法が得られることになる。さらに、市販の機器の多くは、こうした問題を少なくともいくらかは回避する波長で動作する画像形成部品を取り入れている。たとえば、この領域で動作する、増幅反応時にリアルタイムの検出を行うサーマルサイクラーと、マイクロアレイリーダとが入手可能である。この領域で吸収するポリマーを提供ことで、検出方法をこのような形態に適合させることが可能になり、まったく新しい方法を実施することも可能になる。
【０１２８】
[00186] バンドギャップを低減する繰り返し単位を取り入れると、このような特性を持つ共役ポリマーを生成することが可能である。そのような波長で光を吸収するポリマーが得られる、置換されていてもよい種の例としては、２，１，３−ベンゾチアジアゾール、ベンゾセレナジアゾール、ベンゾテルロジアゾール、ナフトセレナジアゾール、４，７−ジ（チエン−２−イル）−２，１，３−ベンゾチアジアゾール、スクアライン色素、キノキサリン、低バンドギャップの業務用色素、オレフィンおよびシアノ置換オレフィンおよびこれらの異性体があげられる。好適な多発色団の組成、構造、特性および合成に関するさらに詳細については、２００５年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／６４２，９０１号明細書、２００６年１月１０日に出願され、現在は米国特許出願公開第２００６−０１８３１４０Ａ１号明細書として公開されている、米国特許第１０／６００，２８６号明細書（ともに本明細書に援用する）に記載されている。
【０１２９】
[00187] 多発色団については、一組の共有結合的に結合した発色単位または発色団の共有結合集合として説明することができる。多発色団としては、共役ポリマー（ＣＰ）などの直鎖状構造と樹状構造（Wang, Gaylord, and Bazan, Adv. Mater., 2004, Wang, Hong, and Bazan, Org. Lett., 2005）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１３０】
[00188] 直鎖状多発色団としてのＣＰの一般的な構造を図１８に示す。一実施形態では、このようなＣＰは、米国特許第１０／６６６，３３３号明細書：Conformationally Flexible Cationic Conjugated Polymers（LiuおよびBazan）の表１および表２またはスキーム１に記載されている単位で構成可能なものであり、本明細書の図１０に示すような１つまたは複数の独特なバイオコンジュゲーション部位を含むモノマーを含むものである。ＣＰは、好ましくは少なくとも約０．０１ｍｏｌ％のバイオコンジュゲーション部位を含み、少なくとも約０．０２ｍｏｌ％、少なくとも約０．０５ｍｏｌ％、少なくとも約０．１ｍｏｌ％、少なくとも約０．２ｍｏｌ％、少なくとも約０．５ｍｏｌ％、少なくとも約１ｍｏｌ％、少なくとも約２ｍｏｌ％、少なくとも約５ｍｏｌ％、少なくとも約１０ｍｏｌ％、少なくとも約２０ｍｏｌ％または少なくとも約３０ｍｏｌ％を含むものであってもよい。ＣＣＰは、最大で１００ｍｏｌ％のバイオコンジュゲーション部位を含むものであってもよく、約９９ｍｏｌ％またはそれ未満、約９０ｍｏｌ％またはそれ未満、約８０ｍｏｌ％またはそれ未満、約７０ｍｏｌ％またはそれ未満、約６０ｍｏｌ％またはそれ未満、約５０ｍｏｌ％またはそれ未満，または約４０ｍｏｌ％またはそれ未満を含むものであってもよい。
【０１３１】
[00189] 図１８では、単位ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は、置換されていてもよい共役ポリマーセグメントまたはオリゴマー構造であり、互いに同一であっても異なっていてもよい。ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は、芳香族繰り返し単位であってもよく、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、チオフェン、フラン、ピリジンおよびオキサジアゾールからなる群から選択されるものであってもよく、各々が置換されていてもよい。また、ＣＰ３およびＣＰ４が、図３ｈのように、リンカーＬによって連結された、１つまたは複数の独特なバイオコンジュゲーション部位を含み得る。これらのバイオコンジュゲーション部位は、マレイミド、チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）、アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）またはスルホ−ＳＢＥＤスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（図１３でＸ、ＹおよびＣＰの三方向への連結として機能できる）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１３２】
[00190] 典型的な芳香族繰り返し単位が、米国特許第１０／６６６，３３３号明細書：Conformationally Flexible Cationic Conjugated Polymers（LiuおよびBazan）の表１に、代表的なポリマーセグメントおよびオリゴマー構造が表２に示されている。
【０１３３】
[00191] 図１８は、角度をなす（angled）リンカー（ｍｅｔａ位）であってもよく、５〜２０個の原子を有する単環式または多環式の置換されていてもよいアリール基であってもよいＣＰ_３およびＣＰ_４を含む。ＣＰ_３およびＣＰ_４単位は、ポリマーの主鎖に沿って均等に分布していてもよいし、ランダムに分布していてもよい。
【０１３４】
[00192] ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は各々、１箇所または複数箇所において、−−Ｒ１−−Ａ、−−Ｒ２−−Ｂ、−−Ｒ３−−Ｃおよび−Ｒ４−−Ｄから選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよく、これは、架橋官能基−−Ｅ−−および−−Ｆ−−を介して結合されていてもよいが、ただし、全体としてのポリマーが、カチオン性、アニオン性または電荷が中性の複数の水溶性基で置換されていなければならない。
【０１３５】
[00193] Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルおよびポリアルキレンオキシドから独立して選択され、各々置換されていてもよく、これが１つまたは複数のヘテロ原子を含むものであってもよいし、存在しないものであってもよい。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、Ｃ１〜２２アルキル、Ｃ１〜２２アルコキシ、Ｃ１〜２２エステル、１〜約２２個の炭素原子を有するポリアルキレンオキシド、１〜約２２個の炭素原子を有する環状クラウンエーテルから独立して選択可能であり、存在しなくてもよい。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、１〜約１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝状のアルキル基あるいは、１〜約１２個の炭素原子を有するアルコキシ基から選択されてもよい。１箇所または複数箇所で式に示されるように、２つ以上の官能基を環に付加してもよいことは理解されたい。
【０１３６】
[00194] Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、Ｈ、−−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−−Ｎ^＋Ｒ’Ｒ’’Ｒ’’’、グアニジウム基、ヒスチジン、ポリアミン、ピリジニウム基およびスルホニウム基から独立して選択される。Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、水素、Ｃ_１〜１２アルキルおよびＣ_１〜１２アルコキシおよびＣ_３〜１２シクロアルキルからなる群から独立して選択される。Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’が低級アルキルまたは低級アルコキシ基であると好ましい。
【０１３７】
[00195] ＥおよびＦは、存在せず、−−Ｏ−−、−−Ｓ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−、−−Ｃ（Ｒ）（Ｒ’）−−、−−Ｎ（Ｒ’）−−および−−Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ’’）から独立して選択され、式中、Ｒ’およびＲ’’は、上記にて定義したとおりである。
【０１３８】
[00196] Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−−Ｎ（Ｒ’）−−または−−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）−−であり、ＹおよびＺは、−−Ｃ（Ｒ）＝および−−Ｎ＝から独立して選択され、式中、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は上記にて定義したとおりである。
【０１３９】
[00197] 図１９は、フルオレン単位と、芳香族単位１、２および３とを含む骨格からなるＣＰを示す。単位１および２は、図２０に示す構造であってもよいが、これに限定されるものではない。単位３は、バイオコンジュゲーション部位を含む。Ｒ１官能基には、可溶化基として示されており、荷電したアルキル官能基（すなわち（ＣＨ２）ｎＮＭｅ３Ｂｒまたは（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｎａ）あるいは親水性基（すなわち、エチレングリコール単位（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ）が可能であるが、これに限定されるものではない。
【０１４０】
[00198] 図１９のπ−共役単位１、２、３は、LiuおよびBazan、米国特許第１０／６６６，３３３号明細書：Conformationally Flexible Cationic Conjugated Polymersの表１および表２ならびにスキーム１に記載されているものを含む。図２０は、図１９に示される一般的なＣＰ構造に含まれていてもよいπ−共役単位のいくつかの具体例を示すものであり、図中、アスタリスクはＣＰ骨格への共有結合点を示す。これらの単位は、ＣＰ骨格に対して一般的なｐａｒａ位（ａ、ｂおよびｅ）で接続されるか、ｍｅｔａ形式で接続されるベンゼン単位を含み、これによってＣＰ骨格（ｃおよびｄ）内の柔軟性が高くなる。これらの単位は、供与基（アルコキシまたはエチレングリコール単位）および求引基（フッ素）をはじめとする電子構造を変化させる（ｂ、ｄおよびｅ）か、第四級アミンまたはスルホネートなどの親水性エチレングリコール単位または荷電した基で水溶性を改善する（ｅ）部分で官能化可能なものである。また、チオフェン（ｆ）およびベンゾチアジアゾール基（ｇ）などの単位も含まれるが、これらは電子構造を変化させるための手段として作用する。これらの単位もまた、上述したように官能化可能なものである。単位ｈは、アルコキシ基などのリンカーＬを介してπ−共役セグメントに共有結合的に結合されたマレイミドなどの特異的バイオコンジュゲーション部位Ａであり、ＣＰの骨格に、ｏｒｔｈｏ、ｐａｒａまたはｍｅｔａ位で取り入れられてもよい。
【０１４１】
[00199] 具体的なポリマー構造のいくつかの変形例として、図２１に示すものがあげられるが、これは、マレイミドまたはスクシミジルエステルバイオコンジュゲーション部位がエーテルおよびアルコキシ連結を介して連結された単位を一定の割合で含む。
【０１４２】
[00200] 本発明において有用な共役ポリマーは、以下を含むがこれに限定されるものではない。
【化１８】

【０１４３】
[00201]抗原−抗体相互作用
[00202] 抗原と抗体との間の相互作用は、他の非共有結合タンパク質−タンパク質相互作用と同じである。通常、抗原と抗体との間には、（ｉ）水素結合、（ｉｉ）分散力、（ｉｉｉ）ルイス酸とルイス塩基との間の静電力、（ｉｖ）疎水性相互作用という４タイプの結合相互作用がある。特定の物理力が、抗原−抗体結合の一助となり、たとえば、異なる抗体結合部位を持つエピトープ形状のフィットまたは優遇（the fit or complimentary）。さらに、他の材料および抗原が抗体と交差反応することで、利用可能な遊離抗体と拮抗するものであってもよい。
【０１４４】
[00203] 使用するのに最適な抗原および抗体調製物を評価するためだけでなく、基本的なイムノアッセイデザインが整った後で品質制御を維持するためのイムノアッセイの有効性を判断する上でのピボット要素に、抗原と抗体との結合の親和定数と特異性の測定がある。
【０１４５】
[00204]抗体
[00205] 抗体分子は、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリに属するものであり、その基本的な構成要素である免疫グロブリンフォールドまたはドメインが、免疫系や他の生物学的認識系の多くの分子でさまざまな形で利用されている。一般的な免疫グロブリンには、可変部として知られる抗原結合領域と定常部として知られる非可変部とを含む４つのポリペプチド鎖がある。
【０１４６】
[00206] 天然の抗体および免疫グロブリンは通常、２つの等しい軽（Ｌ）鎖と２つの等しい重（Ｈ）鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、ジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖ごとに異なる。重鎖および軽鎖は各々、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。重鎖は各々、一端に可変領域（ＶＨ）を有し、これに多数の定常領域が続いている。軽鎖は各々、一端に可変領域（ＶＬ）を有し、その他端に定常領域がある。軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域と整列され、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列される。
【０１４７】
[00207] その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに振り分けることが可能である。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという少なくとも五（５）種類の主なクラスがあり、これらのいくつかがさらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２といった具合にサブクラス（アイソタイプ）に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成が周知である。抗体の構造、機能、用途および調製に関するさらに詳細については、２００６年２月１４日に発行された米国特許第６，９９８，２４１号明細書（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【０１４８】
[00208]サンドイッチアッセイ
[00209] １９８４年１２月４日に発行された米国特許第４，４８６，５３０号明細書ならびに、そこに引用された参考文献に開示されているものをはじめとして、抗体または複数抗体サンドイッチアッセイが当業者間で周知である。図６、図７、図８および図１４で説明した構造を、説明のように直接に利用するか、あるいはさまざまなサンドイッチ構成で利用することが可能である。サンドイッチ構成またはサンドイッチアッセイとは、連続した認識事象を使用してさまざまな生体分子およびレポート要素からなる層を構成し、標的生体分子または標的関連生体分子などの特定の生体分子の存在をシグナル伝達することを指す。これの標準的な例として、抗体の連続使用があげられる。これらのアッセイでは、一次抗体が標的に結合し、二次抗体が一次抗体に結合し、第３の抗体が二次抗体に結合できるといった具合である。順次並んだ各々の層ｗ用いて、別のレポート基を加えてもよい。別の戦略として、マルチマー構造の形をとる成分の一方または両方を含む２つ（またはそれ以上の）相互に認識可能な成分または３以上の成分を鎖認識関係で交互の層にした繰り返し付加を用いることがある。このようなセットアップでは、各々のマルチマー構造の１つまたは複数の官能基をレポート基で標識することが可能であり、占領されていない（unoccupied）官能基が他の成分の認識部位として機能でき、この系が後にシグナル増幅のプラットフォームとなる。この手法の一般的な例として、ストレプトアビジン−レポーターコンジュゲートとビオチニル化抗ストレプトアビジン抗体を用いることがある。そのようなアッセイでは、ビオチニル化センサ分子（核酸または抗体）を使って、標的生体分子を結合することが可能であり、これが後に、ストレプトアビジン−レポーターコンジュゲートとビオチニル化抗ストレプトアビジン抗体とを含む検出系で認識される。この場合のサンドイッチ構造は、シグナル増幅を達成するためのビオチニル化抗体と標識されたストレプトアビジン複合体相互作用の連続したラウンド（round）によって構成可能なものである。ビオチニル化抗体またはストレプトアビジン−レポーター複合体のいずれかに対して多発色団をさらにコンジュゲーションすると、シグナル出力をさらに増すことが可能である。要するに、このタイプのシグナル増幅系に多発色団を取り込むと、シグナルをさらに高いレベルまで増幅することが可能なのである。
【０１４９】
[00210] 図６、図７、図８、図１４、図１６および図１７で説明したバイオ共役ポリマー複合体を利用すると、集光性多発色団を一般に用いられている認識要素に直接取り込むことで、光学的に強化されたサンドイッチアッセイを作製することが可能である。連続的な認識要素を用いることなく、多発色団共役構造の利点を直接に一次標識認識要素に適用することが可能である。たとえば、図１４に示すように一次抗体を多発色団−色素複合体に直接に共役することが可能である。このような複合体は、標的生体分子の存在を直接にプローブする目的で利用可能なものである。
【０１５０】
[00211]ポリヌクレオチド
[00212] 増幅された標的ポリヌクレオチドに対して、増幅後処理をほどこしてもよい。たとえば、場合によっては、より一層容易に利用可能なセグメントを得るために、ハイブリダイゼーションの前に標的ポリヌクレオチドを断片化することが望ましいことがある。核酸の断片化については、実施対象となるアッセイで有用なサイズのフラグメントを生成する方法であれば、どのような方法で実施しても構わない。好適な物理的方法、化学的方法、酵素的な方法が当該技術分野において周知である。
【０１５１】
[00213] 増幅サイクルの少なくとも一部の間に、センサポリヌクレオチドを増幅産物にハイブリダイズすることを可能にする条件で増幅反応を実施可能である。このようにしてアッセイを実施すると、増幅時の光の放出を監視することで、このハイブリダイゼーション事象をリアルタイムに検出することが可能である。
【０１５２】
[00214] リアルタイムＰＣＲ生成物分析（ならびに関連のリアルタイムの逆転写ＰＣＲ）によって、多種多様な場面で用いられているリアルタイムＰＣＲ監視のための周知の技術が得られ、これを本明細書に記載の方法で用いるのに合わせることが可能である（Laurendeau et al. (1999) “TaqMan PCR-based gene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency” Clin Chem 45(7):982-6； Laurendeau et al. (1999) “Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay” Clin Chem 59(12):2759-65；Kreuzer et al. (1999) “LightCycler technology for the quantitation of bcr/abl fusion transcripts” Cancer Research 59(13):3171-4を参照のこと。これらをすべて援用する）。
【０１５３】
試料
[00215] 原理上、試料は、集合センサの集合を引き起こすことができる凝集物（aggregant）を含有するとみられるどのような材料であってもよい。いくつかの実施形態では、試料は、細胞、組織または流体をはじめとして、生きた臓器から直接または間接に得られるポリヌクレオチドを含むどのような生物学的材料源に由来するものであってもよく、ウイルス、マイコプラズマおよび化石をはじめとするその微生物によって沈着物が残る。試料は、合成手段で調製された凝集物を全体または一部含むものであってもよい。一般に、試料は、主に水性の媒体として得られるか、主に水性の媒体に分散される。試料の非限定的な例としては、血液、尿、精液、乳、痰、粘液、頬の拭き取り検体、膣の拭き取り検体、直腸の拭き取り検体、吸引液、針生検、たとえば手術または解剖で得られた組織の切片、血漿、血清、髄液、リンパ液；皮膚、呼吸器、腸および泌尿生殖器の外分泌；涙、唾液、腫瘍、臓器、in vitro細胞培養構成物の試料（細胞培地での細胞増殖に由来する条件培地、推定的にウイルス感染した細胞、組換え細胞、細胞成分を含むがこれに限定されるものではない）およびポリヌクレオチド配列を含む組換えライブラリがあげられる。
【０１５４】
[00216] 試料は、凝集物あるいは、結果としてサロゲートを含有することが知られている正の対照試料であってもよい。凝集物を含有するとは思えないが、（１つまたは複数の試薬による汚染が原因で）凝集物または偽陽性を生成可能な別の成分を含有する疑いのある負の対照試料も利用可能であり、特定のアッセイで用いられる試薬の標的ポリヌクレオチドによる汚染の欠如を確認し、特定のセットのアッセイ条件で偽陽性（試料に標的ポリヌクレオチドが存在しないにもかかわらず生じる陽性シグナル）が生成するか否かを判断する目的で試験される。
【０１５５】
[00217] 試料については、希釈、溶解、懸濁、抽出またはそうでなければ処理して、存在する標的ポリヌクレオチドを可溶化および／または精製するかあるいは、増幅スキームで用いられている試薬が到達可能にするか、あるいは試薬を検出することが可能である。試料が細胞を含有する場合、この細胞を溶解または透過処理して細胞内のポリヌクレオチドを放出することが可能である。一段階透過処理緩衝液を利用して、細胞を溶解することが可能であるが、これはたとえばポリメラーゼ鎖反応など、溶解後に直接実施できるようにするものである。
【０１５６】
シグナル伝達発色団
[00218] いくつかの実施形態では、光学的に活性の単位の励起状態からのエネルギを受け取る、あるいは、標識プローブとあるいは複数のエネルギ移動スキームでエネルギを交換する目的で、シグナル伝達発色団またはフルオロフォアを利用してもよい。本明細書にて説明する本発明で有用なフルオロフォアとしては、適切な波長でエネルギを吸収あるいは、エネルギを放出・移動可能な物質があげられる。多重化アッセイでは、検出可能な異なる発行スペクトルで、複数の異なるフルオロフォアを利用することが可能である。代表的なフルオロフォアとしては、蛍光色素、半導体ナノ結晶、ランタニドキレートおよび緑色蛍光タンパク質があげられる。
【０１５７】
[00219] 一例としての蛍光色素としては、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Texas Red、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン6G、カルボキシロードル（carboxyrhodol）、カルボキシローダミン１１０、Cascade Blue、Cascade Yellow、クマリン、Cy2（登録商標）、Cy3（登録商標）、Cy3.5（登録商標）、Cy5（登録商標）、Cy5.5（登録商標）、Cy-Chrome、フィコエリトリン、PerCP（ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質）、PerCP-Cy5.5、JOE（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、NED、ROX（５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor（登録商標） 350、Alexa Fluor（登録商標） 430、Alexa Fluor（登録商標） 488、Alexa Fluor（登録商標） 532、Alexa Fluor（登録商標） 546、Alexa Fluor（登録商標） 568、Alexa Fluor（登録商標） 594、Alexa Fluor（登録商標） 633、Alexa Fluor（登録商標） 647、Alexa Fluor（登録商標） 660、Alexa Fluor（登録商標） 680、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、BODIPY（登録商標） FL、BODIPY（登録商標） FL-Br_２、BODIPY（登録商標） 530/550、BODIPY（登録商標） 558/568、BODIPY（登録商標） 564/570、BODIPY（登録商標） 576/589、BODIPY（登録商標） 581/591、BODIPY（登録商標） 630/650、BODIPY（登録商標） 650/665、BODPY（登録商標） R6G、BODIPY（登録商標） TMR、BODIPY（登録商標） TR、これらのコンジュゲートおよびこれらの組み合わせがあげられる。一例としてのランタニドキレートとしては、ユーロピウムキレート、テルビウムキレートおよびサマリウムキレートがあげられる。
【０１５８】
[00220] 多岐にわたる蛍光半導体ナノ結晶（「ＳＣＮＣ」）が当該技術分野において周知である。半導体ナノ結晶を生成および利用する方法が、Bawendiらが発明者である１９９９年５月２７日公開の国際公開第９９／２６２９９号パンフレット；Weissらに付与された１９９９年１１月２３日発行の米国特許第５，９９０，４７９号明細書；Bruchez et al., Science 281:2013, 1998に記載されている。十分に確定されたピーク放出波長を有する非常に幅の狭い放出バンドを呈する半導体ナノ結晶を得ることができるため、多数の異なるＳＣＮＣを同一アッセイにおいてシグナル伝達発色団として（任意で他の非ＳＣＮＣタイプのシグナル伝達発色団と組み合わせて）用いることが可能となる。
【０１５９】
[00221] ポリヌクレオチド特異的色素の一例として、アクリジンオレンジ、アクリジンホモ二量体、アクチノマイシンＤ、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、９−アミノ−６−クロル−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）、BOBO（商標）-1ヨージド（462/481）、BOBO（商標）-3ヨージド（570/602）、BO-PRO（商標）-1ヨージド（462/481）、BO-PRO（商標）-3ヨージド（575/599）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二乳酸塩（ＤＡＰＩ、二乳酸塩）、ジヒドロエチジウム（ヒドロエチジン）、ジヒドロエチジウム（ヒドロエチジン）、臭化エチジウム、エチジウムジアジドクロリド、エチジウムホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモ二量体−２（ＥｔｈＤ−２）、エチジウムモノアジドブロマイド（ＥＭＡ）、ヨウ化ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、ヒドロキシスチルバミジン、メタンスルホネート、JOJO（商標）-1ヨージド（529/545）、JO-PRO（商標）-1ヨージド（530/546）、LOLO（商標）-1ヨージド（565/579）、LO-PRO（商標）-1ヨージド（567/580）、NeuroTrace（商標） 435/455、NeuroTrace（商標） 500/525、NeuroTrace（商標） 515/535、NeuroTrace（商標） 530/615、NeuroTrace（商標） 640/660、OliGreen、PicoGreen（登録商標） ssDNA、PicoGreen（登録商標） dsDNA、POPO（商標）-1ヨージド（434/456）、POPO（商標）-3ヨージド（534/570）、PO-PRO（商標）-1ヨージド（435/455）、PO-PRO（商標）-3ヨージド（539/567）、ヨウ化プロピジウム、RiboGreen（登録商標）、SlowFade（登録商標）、SlowFade（登録商標） Light、SYBR（登録商標） Green I、SYBR（登録商標） Green II、SYBR（登録商標） Gold、SYBR（登録商標） 101、SYBR（登録商標） 102、SYBR（登録商標） 103、SYBR（登録商標） DX、TO-PRO（登録商標）-1、TO-PRO（登録商標）-3、TO-PRO（登録商標）-5、TOTO（登録商標）-1、TOTO（登録商標）-3、YO-PRO（登録商標）-1（オキサゾールイエロー）、YO-PRO（登録商標）-3、YOYO（登録商標）-1、YOYO（登録商標）-3、TO、SYTOX（登録商標） Blue、SYTOX（登録商標） Green、SYTOX（登録商標） Orange、SYTO（登録商標） 9、SYTO（登録商標） BC、SYTO（登録商標） 40、SYTO（登録商標） 41、SYTO（登録商標） 42、SYTO（登録商標） 43、SYTO（登録商標） 44、SYTO（登録商標） 45、SYTO（登録商標） Blue、SYTO（登録商標） 11、SYTO（登録商標） 12、SYTO（登録商標） 13、SYTO（登録商標） 14、SYTO（登録商標） 15、SYTO（登録商標） 16、SYTO（登録商標） 20、SYTO（登録商標） 21、SYTO（登録商標） 22、SYTO（登録商標） 23、SYTO（登録商標） 24、SYTO（登録商標） 25、SYTO（登録商標） Green、SYTO（登録商標） 80、SYTO（登録商標） 81、SYTO（登録商標） 82、SYTO（登録商標） 83、SYTO（登録商標） 84、SYTO（登録商標） 85、SYTO（登録商標） Orange、SYTO（登録商標） 17、SYTO（登録商標） 59、SYTO（登録商標） 60、SYTO（登録商標） 61、SYTO（登録商標） 62、SYTO（登録商標） 63、SYTO（登録商標） 64、SYTO（登録商標） Red、ネトロプシン、ジスタマイシン、アクリジンオレンジ、３，４−ベンゾピレン、チアゾールオレンジ、TOMEHE、ダウノマイシン、アクリジン、ペンチル−ＴＯＴＡＢおよびブチル−ＴＯＴＩＮがあげられる。不斉シアニン色素をポリヌクレオチド特異的色素として用いることができる。目的の他の色素としては、Geierstanger, B.H. and Wemmer, D.E., Annu. Rev. Vioshys. Biomol. Struct. 1995,24,463-493, by Larson, C.J. and Verdine, G.L., Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids, Hecht, S.M., Ed., Oxford University Press: New York, 1996; pp 324-346およびGlumoff, T. and Goldman, A. Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2^nd ed., Blackburn, G.M. and Gait, M.J., Eds., Oxford University Press: Oxford, 1996, pp375-441に記載されているものがあげられる。ポリヌクレオチド特異的色素は、挿入色素であってもよく、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的であってもよい。他の色素およびフルオロフォアについては、www.probes.com (Molecular Probes, Inc.)に記載されている。
【０１６０】
[00222] 「緑色蛍光タンパク質」という用語は、天然のイクオレア（Aequorea）緑色蛍光タンパク質と、変更された励起および放出最大値ならびに、異なる形状の励起および放出スペクトルを含む、変更された蛍光特性を示すことが確認されている変異型（Delagrave, S. et al. (1995) Bio/Technology 13:151-154；Heim, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504；Heim, R. et al. (1995) Nature 373:663-664）の両方を示す。Delgraveらは、励起スペクトルが赤方偏移しているクローン化オワンクラゲＧＦＰの変異体を単離した。Bio/Technology 13:151-154 (1995)。Heim, R.らは、青色蛍光を有する変異体（Ｔｙｒ６６がＨｉｓに変異）を報告した（Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) USA 91:12501-12504）。
【０１６１】
基板
[00223] いくつかの実施形態では、アッセイ成分を基板上に配置することが可能である。基板は、生物学的、非生物学的、有機、無機またはこれらの任意の組み合わせのいずれかの広範囲にわたる材料を含むものであってもよい。たとえば、基板は、重合したLangmuir Blodgett膜、機能性ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ_２、ＳｉＮ_４、変性シリコンあるいは、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコリド）、ポリ酸無水物、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリシロキサン、高分子シリカ、ラテックス、デキストランポリマー、エポキシ樹脂、ポリカーボネートまたはこれらの組み合わせなど、多岐にわたるゲルまたはポリマーのいずれかであればよい。導電性ポリマーおよび光伝導性材料を利用することも可能である。
【０１６２】
[00224] 基板には、シリカベースの基板（ガラス、石英など）などの平面結晶基板あるいは、シリコン、ガリウムヒ素、インジウム添加ＧａＮなどの半導体およびマイクロプロセッサ産業で利用される結晶基板を用いることが可能であり、半導体ナノ結晶がこれに含まれる。
【０１６３】
[00225] 基板は、光ダイオード、光電半導体チップまたは光電薄膜半導体などの光電センサ、またはバイオ素子の形態をとりうる。基板上のプローブの位置は、アドレス指定可能なものである。これは高密度フォーマットで行うことが可能であり、その位置はマイクロアドレス指定可能なものまたはナノアドレス指定可能なものとすることができる。
【０１６４】
[00226] シリカエーロゲルを基板として使用することも可能であり、これを当該技術分野において周知の方法で調製することができる。エーロゲル基板を自立基板として、あるいは別の基板材料用の表面コーティングとして用いてもよい。
【０１６５】
[00227] 基板はどんな形態もとりうるが、一般に、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、粒子、微粒子、ナノ粒子、撚糸、沈殿物、任意で多孔質のゲル、シート、チューブ、球体、容器、毛管、パッド、薄片、フィルム、チップ、マルチウェルプレートまたは皿、光ファイバなどである。基板は、硬質または半硬質の形態をとることもできる。基板はアッセイ成分が配置される凸または凹領域を含んでいてもよい。基板の表面を周知技術でエッチング処理することにより、所望の表面特徴、たとえば溝、Ｖ溝、メサ構造などを提供することができる。
【０１６６】
[00228] 基板の表面は、基板と同一の材料で構成してもよいし、別の材料から作製しても構わない。また、この表面を化学的または物理的手段により基板に結合することができる。このように結合された表面は、多岐にわたる材料、たとえばポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス、膜のうちのいずれかあるいは、上記にて列挙した基板材料のうちのいずれかで構成されていてもよい。表面を光学的に透明にしてもよいし、表面にシリカ表面で見られるような表面Ｓｉ−ＯＨ機能を持たせることもできる。
【０１６７】
[00229] 基板および／またはその任意の表面については、使用する合成および／または検出方法に適した特性が得られるように選択可能である。基板および／または表面を透明にすることで、複数の方向からの光に基板を曝露することができる。基板および／または表面に反射「鏡」構造を設け、光の回収率を高めてもよい。
【０１６８】
[00230] 基板および／またはその表面は通常、使用時に曝露される条件に対して耐性であるか、あるいは耐性となるよう処理されており、任意に処理することで、このような条件への曝露後に耐性材料を除去することができる。
【０１６９】
[00231] ポリヌクレオチドプローブは、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、国際公開第９２／１００９２号パンフレット、１９９０年１２月６日に出願された米国特許出願第０７／６２４，１２０号明細書（放棄されている）、Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991)、国際公開第９０／１５０７０号パンフレットに記載されている方法などの好適な方法で、基板上にて製造または基板に結合可能なものである。機械的な合成法でこれらのアレイを合成するための技術が、たとえば、国際公開第９３／０９６６８号パンフレットおよび米国特許第５，３８４，２６１号明細書に記載されている。
【０１７０】
[00232] さらに別の技術としては、米国特許出願第９３／０４１４５号明細書に記載されているようなビーズを用いる技術、米国特許第５，２８８，５１４号明細書に記載されているようなピンを用いる方法があげられる。
【０１７１】
[00233] センサポリヌクレオチドを基板に付加する目的で適用できる別のフローチャネルまたはスポット法が、１９９２年１１月２０日に出願された米国特許出願第０７／９８０，５２３号明細書および米国特許第５，３８４，２６１号明細書に記載されている。（１）所定の領域上の定められたチャネル内を流すか、あるいは（２）所定の領域上に「スポット」することにより、試薬が基板に送達される。親水性または疎水性のコーティング（溶媒の性質によって決まる）などの保護コーティングを、場合によっては他の領域においてこの反応溶液による湿潤を容易にする材料と併用して、保護対象となる基板の一部に対して使用することができる。このようにして、流れている溶液が指定された流路の外に流れ出すのをさらに防ぐ。
【０１７２】
[00234] 一般的なディスペンサとしては、さまざまな試薬を連続または同時に反応領域へ送達することができるように、任意でロボット制御されるマイクロピペット、インクジェットプリンタ、一連のチューブ、マニフォルド、ピペットのアレイなどがあげられる。
【０１７３】
[00235] 照会対象の基板または領域上にあるセンサの同定を行えるように、基板またはその領域をコードしてもよい。光学コード、ＲＦＩＤタグ、磁気コード、物理コード、蛍光コード、これらのコードの組み合わせなど、どのようなコーディングスキームでも利用できる。
【０１７４】
励起および検出
[00236] 集合センサを励起でき、検出対象となる放出波長よりも短い波長を出力する機器であれば、そのような機器でも励起用に利用可能である。市販の装置を用いて、好適な励起波長ならびに好適な検出成分を得ることが可能である。
【０１７５】
[00237] 励起源の例としては、適切なフィルタを付けたジュウテリウムランプなどの広帯域ＵＶ光源、キセノンランプまたはジュウテリウムランプなどの白色光源の出力をモノクロメータに通して所望の波長を抽出したもの、連続波（ｃｗ）ガスレーザ、固体状態のダイオードレーザまたは任意のパルスレーザがあげられる。放射光については、好適な装置または技術で検出することが可能である。多くの好適な手法が当該技術分野において周知である。たとえば、蛍光光度計または分光光度計を利用して、多発色団の励起時に試験試料がシグナル伝達発色団の波長特性を持つ光を放出するか否かを検出してもよい。
【０１７６】
合成物
[00238] さまざまな形態をとる本明細書に記載の分子からなる合成物も提供される。本明細書に記載されているような多発色団ならびに、多発色団を含む複合体を、精製および／または単離された形態で得るようにしてもよい。また、多発色団ならびに、多発色団を含む複合体を結晶形態で得るようにしてもよい。
【０１７７】
[00239] 多発色団ならびに、多発色団を含む複合体を、多くの場合は水溶液であればよい溶液中で提供してもよく、この水溶液には、別の溶媒、緩衝液、生体分子、ポリヌクレオチド、フルオロフォアなどを含むがこれに限定されるものではない、本明細書に記載の１つまたは複数の他の溶液成分が含まれていてもよい。多発色団ならびに、多発色団を含む複合体については、第１の光学的に活性な単位からの第１の放出を、生体分子標的またはこれに関連する生体分子の非存在下で検出可能な濃度で溶液中に存在させることが可能である。この溶液は、多発色団ならびに、多発色団を含む複合体について、あるクラスの生体分子標的またはこれに関連する生体分子の種に特異的な蛍光標識抗体またはポリヌクレオチドなどの標識プローブをはじめとする本明細書に記載するような別の成分を含むものであってもよい。
【０１７８】
[00240] 多発色団ならびに、多発色団を含む複合体は、フィルムの形で提供されるものであってもよい。合成物は、提案された構造、合成方法、吸収および／または放出スペクトル、要素分析、ＮＭＲスペクトルまたは他の任意の特性または特徴をはじめとする、本明細書に記載の特性によって権利請求されるものであればよい。
【０１７９】
[00241] いくつかの実施形態では、試料で遺伝子の発現を検出する。さらに別の実施形態では、検出生体分子標的またはこれに関連する生体分子の測定結果を用いて、患者の病状を診断することが可能である。さらに別の実施形態では、本発明の検出方法に、病状を診断する方法をさらに含むことが可能である。関連の実施形態では、疾患を診断する方法が、生体分子標的またはこれに関連する生体分子の存在と関するデータを精査または分析し、疾患の診断に関するデータの精査または分析に基づく結論を、患者、ヘルスケア提供者またはヘルスケア管理者に提供することを含むものであってもよい。このようなデータの精査または分析については、本明細書で説明するように、コンピュータまたは他のデジタルデバイスとネットワークとを利用して容易にすることが可能なものである。このようなデータに関する情報をネットワーク経由で送信できることも想定される。
【０１８０】
[00242] 本発明の方法を実施するにあたり、分子生物学分野における従来の多くの技術を利用してもよい。これらの技術は周知であり、たとえば、Ausubel et al. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, (1997)、Ausubel et al. (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5^th Ed., John Wiley & Sons, Inc. (2002)、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)およびInnis et al. (Eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990)（いずれも本明細書に援用する）に説明されている。
【０１８１】
[00243] 図２２は、代表例の論理素子を示すブロック図であり、この論理素子によって、本発明に関する精査または分析データを実現できる。このようなデータは、被検体の疾患、機能障害または症状に関連するものであり得る。図２２は、たとえば、結果を生成する目的で、多発色団または多発色団複合体８２４と一緒に用いられる装置８２０に接続されたコンピュータシステム（またはデジタルデバイス）８００を示す。コンピュータシステム８００は、固定媒体８１２を有するサーバ８０９に任意に接続可能な媒体８１１および／またはネットワークポート８０５からの指示を読むことのできる論理装置として理解できよう。図２２に示すシステムは、ＣＰＵ８０１と、ディスクドライブ８０３と、キーボード８１５および／またはマウス８１６などの任意選択の入力装置と、任意選択のモニタ８０７とを含む。ローカルまたは遠隔地で、指定の通信媒体を介してサーバ８０９へのデータ通信を実現できる。通信媒体には、データの伝送手段および／または受信手段を含み得る。たとえば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続またはインターネット接続であってもよい。本発明に関するデータをこのようなネットワークまたは接続経由で伝送可能であると想定される。
【０１８２】
[00244] 一実施形態では、コンピュータ読み取り可能な媒体が、生物学的試料の分析結果の伝送に適した媒体を含む。この媒体は、被検体の疾患の状況または状態に関する結果を含み得るものであり、このような結果は、本明細書に記載の方法で導かれるものである。
【０１８３】
キット
[00245] ここに記載の方法を実施するのに有用な試薬を含むキットも提供される。
【０１８４】
[00246] いくつかの実施形態では、キットが、本明細書に記載したような、多発色団または多発色団複合体、抗体などのバイオコンジュゲートおよび他の成分を含む試薬を含む。
【０１８５】
[00247] キットは、多発色団または多発色団複合体に取り入れることが可能な１つまたは複数の標識のうちの１つまたは複数と、アレイを含むものであっても含まないものであってもよい１種または複数の基質と含むものであってもよい。
【０１８６】
[00248] キットの構成要素は、ハウジングに保持可能なものである。記載された方法を実施するためのキットの使用説明書をハウジングに同梱可能であり、固定媒体にて提供することも可能である。また、説明書をハウジングの中に入れておいてもよいし、ハウジングの外に添付してもよく、説明書の内容が読みやすいようにハウジングをなす表面の内側または外側に印刷してもよい。１つまたは複数の異なる標的生体分子またはこれに関連する生体分子の検出用に、キットを多重式としてもよい。
【０１８７】
[00249] 本明細書にて説明し、図２３に示すように、特定の実施形態では、キット９０３に、さまざまな構成要素を収容するための容器またはハウジング９０２を含み得る。図２３に示し、本明細書にて説明するように、一実施形態では、１つまたは複数の多発色団または多発色団複合体試薬９０５と、任意に基質９００とを含むキット９０３が提供される。図２３に示し、本明細書にて説明するように、キット９０３は、説明書９０１を含むものであってもよい。構成要素が本明細書に記載のさまざまな別の特徴を有するキット９０３の他の実施形態も想定される。
【実施例】
【０１８８】
実施例
実施例１
[00250] ポリマー−色素共役抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法のための汎用的なプロトコール：
[00251] １．９６ウェルのポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）マイクロタイタープレートにて、抗体溶液約５０μＬを各ウェル（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ）に加え、未標識の抗体を各ウェルの底に結合させる。ＰＶＣは、約１００ｎｇ／ウェル（３００ｎｇ／ｃｍ^２）結合する。抗体の使用量はアッセイごとに決まる。
[00252]２．プレートを４℃で一晩インキュベートして、完全に結合させる。
[00253]３．ウェルをＰＢＳで２回洗浄する。
[00254]４．マイクロタイタープレートでのタンパク質結合用の残りの部位を、ブロッキング緩衝液と一緒にインキュベートして飽和させる必要がある。０．０２％ナトリウムアジドを加え３％ＢＳＡ／ＰＢＳでウェルを上まで満たす。湿った雰囲気中、室温にて２時間から一晩インキュベートする。
[00255]５．ウェルをＰＢＳで２回洗浄する。
[00256]６．抗原（または試料）溶液５０μＬをウェルに加える（抗原溶液を滴定しておく）。希釈はすべてブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で実施する。湿った雰囲気中、室温にて少なくとも２時間インキュベートする。
[00257]７．プレートをＰＢＳで４回洗浄する。
[00258]８．ポリマー−色素−第２抗体コンジュゲート（実施例ＡまたはＣ）またはビオチン標識抗体のいずれかをアクセス量（access amount）で加える。
[00259]９．湿った雰囲気中、室温にて２時間またはそれよりも長くインキュベートする。
[00260]１０．ＰＢＳを数回交換して洗浄する。
[00261]１１．ビオチン標識抗体をステップ８に利用する場合、ストレプトアビジン−ポリマー−色素コンジュゲート（実施例ＢまたはＤ、１ＭのＮａＣｌ含有ＰＢＳ中）を加え、湿った雰囲気中、室温にて２時間またはそれよりも長くインキュベートする。
[00262]１２．ＥＬＩＳＡプレートリーダーにて標的波長での光学密度を測定する。
【０１８９】
[00263] 定量的な結果を得るには、未知試料のシグナルを標準曲線と比較する。精度を高めるために、アッセイごとに標準を用いる必要がある。
【０１９０】
[00264] ＥＬＩＳＡアッセイでは、マイクロタイタープレートのウェルの側面と底に一次抗体分子が結合する。標的分子を含む試料をウェルに入れると、固定化された一次抗体はこれらの標的を捕捉するのみであり、試料の残りの成分は洗い流されることになる。一般に用いられている蛍光標識抗体と比較して、ここで説明するポリマー−色素−二次抗体コンジュゲートは、集光能が高く、エネルギ移動効率をよくする同じ分子内の設計になっていることから、通常のセットアップよりもかなり強いシグナル（１０〜１００倍）を放出できる。これらの利点を、さらに感度の高いアッセイに結び付けることも可能である。ポリマー−色素−二次抗体コンジュゲートと、シグナル増幅機能のある他の二次抗体（たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗体）とをさらに比較すると、ポリマー−色素−二次抗体コンジュゲートを用いると一段階プロセス（酵素基質を別途必要としない）でシグナル増幅の目的を達成することが可能である。ここで説明するコンジュゲートのコスト効率のよさ（時間と材料の両方）からも、市場に受け入れられやすいものと見込まれる。
【０１９１】
実施例２
[00265]ポリマー−色素共役抗体でのマイクロアレイ標識のための汎用的なプロトコール：
[00266]１．全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
[00267]２．Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、１サイクルまたは２サイクルのｃＤＮＡ合成を行う。
[00268]３．二本鎖ｃＤＮＡを精製（cleanup）する。
[00269]４．ＩＶＴ（in vitro転写）増幅キットを利用して、ビオチン標識リボヌクレオチドをｃＲＮＡに取り込む。
[00270]５．ｃＲＮＡを断片化する。
[00271]６．ｃＲＮＡフラグメントをチップ上でハイブリダイズする。
[00272]７．残ったｃＲＮＡを洗い流し、チップをストレプトアビジン−ポリマー−色素コンジュゲート（実施例ＢまたはＤ）で染色する。
[00273]８．チップ上に残った試薬を洗い流す。
[00274]９．マイクロアレイを走査する。
【０１９２】
[00275] マイクロアレイ方法の通常の実施時、ビオチン標識ヌクレオチドをｃＲＮＡ配列に組み込むことは、ストレプトアビジンフィコエリトリンコンジュゲートおよびビオチニル化抗ストレプトアビジン抗体を増幅シグナルレポート用に隔離するための手段である。ストレプトアビジンフィコエリトリンコンジュゲートの製造上の複雑さがゆえに、バッチ間のばらつきが大きい。したがって、ストレプトアビジン−ポリマー−色素コンジュゲートが、ストレプトアビジンフィコエリトリンコンジュゲートに代わる極めて良好な代替手段となり得る。さらに、過去の刊行物では、MULTICHROMOPHORESを用いると、その集光性とエネルギ移動機能を利用して、蛍光シグナルを最大７５倍まで増幅可能であることが示されている。ストレプトアビジン−ポリマー−色素コンジュゲートが、フィコエリトリンと同等またはこれよりも良好に働くと考えることは、もっともである。
【０１９３】
[00276] 以上、本明細書において本発明の好ましい実施形態について図示し、説明してきたが、このような実施形態が一例にすぎないことは当業者であれば自明であろう。当業者であれば、本発明から逸脱せずに多数の変形例、変更および置き換えを行うことになろう。本発明を実施するにあたっては、本明細書に記載の本発明の実施形態にさまざまな改変をほどこし得ることは理解されたい。以下の特許請求の範囲で本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法および構造ならびにその等価物が包含されることを意図している。
【０１９４】
実施例３
[00277]アミン官能基を有するカチオン性共役ポリマーＣＡ００１の合成：
【化１９】

【０１９５】
[00278] １−（４’−フタルイミドブトキシ）−３，５−ジブロモベンゼン：３，５−ジブロモフェノール（９７０ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）をヘキサンから再結晶化した。溶媒を除去した後、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミド（１．３８ｇ、４．８９ｍｍｏｌ）と、Ｋ_２ＣＯ_３（１．８８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）と、１８−クラウン−６（５３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）と、アセトン（２０ｍＬ）とを加えた。これを１時間還流した後、水１００ｍＬに注ぎ入れた。水性相をジクロロメタンで抽出（４×３０ｍＬ）した。有機層同士を組み合わせ、水、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて濾過した。溶媒を除去したところ、白色の固体が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（４：１ヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製した後、ヘキサン中にて再結晶化させて、無色の針状物質（６５０ｍｇ、８７％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：７．８６０（ｍ，２Ｈ）；７．７３３（ｍ，２Ｈ）；７．２２０（ｔ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）；６．９６４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．９６２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．７７０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）；１．８４６（ｍ，４Ｈ）。
【化２０】

【０１９６】
[00279] ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−フタルイミドブトキシ）フェニレン）］：２，７−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）フルオレン（１．００１ｇ、１．３４ｍｍｏｌ）と、１，４−ジブロモ−２，５−ジフルオロベンゼン（３４６．６ｍｇ、１．２７４ｍｍｏｌ）と、１−（４’−フタルイミドブトキシ）−３，５−ジブロモベンゼン（３０．８ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム（２．１５ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）と、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３７．２ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）とを、ウォータージャケット付き還流凝縮器を取り付けた１００ｍＬ容の丸底フラスコでＴＨＦ（４５ｍＬ）および水（１５ｍＬ）に入れた溶液を、４回の凍結−ポンプ−解凍サイクルで脱気した（３回目と４回目の脱気後にアルゴンを導入）。この溶液をアルゴン雰囲気下にて還流するまで４８時間加熱した。冷却後、この溶液４０ｍＬを攪拌メタノールに滴下して加えてポリマーを沈殿させ、これを遠心処理により回収した。続いてデカントし、メタノールで洗浄（２回）して低分子量画分を除去し、淡い黄色のふわふわした粉末（５００ｍｇ、６２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：７．９１２〜７．４１９（ｍ，８Ｈ）；３．３２２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ）；２．１２０（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；１．６９３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ）；１．２３７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；１．１５３（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；０．７８８（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。Ｍｎ １７Ｋ、ＰＤＩ ２．１。
【０１９７】
[00280] ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（６’−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド）ヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（６’−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド）ヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−フタルイミドブトキシ）フェニレン）］：トリメチルアミン（１ｍＬ）を、ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−フタルイミドブトキシ）フェニレン）］（１３０ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に減圧下にて凝縮した。この溶液を２４時間攪拌し、その時点でポリマーが溶液から沈殿した。メタノールを加えて（５０ｍＬ）ポリマーを可溶化した後、別に１ｍＬのトリメチルアミンを減圧下で反応フラスコに凝縮した。これをさらに２４時間攪拌した後、すべての溶媒と過剰なトリメチルアミンを減圧下で除去して、淡い黄色の膜（１４０ｍｇ、９０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：７．８７１〜７．４２３（ｍ，８Ｈ）；３．１４８（ｍ，４Ｈ）；２．９７０（ｂｒ ｓ，１８Ｈ）；２．１１６（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；１．５２５（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；１．１１９（ｂｒ ｓ，８Ｈ）；０．６８１（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。
【０１９８】
[00281] ＣＡ００１、ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（６’−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド）ヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（６’−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド）ヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−アミノブトキシ）フェニレン）］：ヒドラジン一水和物の溶液（７３．１ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）と、ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（６’−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド）ヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（６’−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド）ヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−フタルイミドブトキシ）フェニレン）］（１００ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液を、５時間還流した。室温まで冷却した後、溶液に０．９ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを加え、これをさらに２時間還流した。得られた溶液を５０％メタノール水溶液に対して透析した後、蒸発乾固させた。
【０１９９】
[00282] 官能化モノマーの最終ポリマー構造への取り込みを評価するための方法を決定した。重合反応時にはアミン官能基をフタルイミドとして保護し、触媒汚染を防止した。この保護基には、赤外線（ＩＲ）分光法で図２４に実線で示すような独特のサインがある。示されたピークが、フタルイミド保護基だけに存在する独特なＣ＝Ｏピークに対応する。フタルイミド基の脱保護後（遊離アミンを生成）に、フタルイミドのサインであるＣ＝Ｏピークが欠如したＣＡ００１のＩＲサインが生じ（破線、図２４）、活性なアミンを共役に利用できることを示している。
【０２００】
[00283] ＣＡ００１の光学スペクトルを図２５に示す。図中、実線は吸収を示し、点線は放出スペクトルを示す。
【０２０１】
実施例４
[00284]カチオン性共役ポリマー−ＦＡＭコンジュゲートＣＡ００１−ＦＡＭの合成：
[00285] 脱保護したポリマーＣＡ００１（遊離アミンを有する）を、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ（最後に訪問したのは１０／０４／０７）で入手可能なプロトコールのスクシミジルエステルFAM、5(6)FAM-SE（Invitrogen、＃Ｃ１３１１）と反応させた。負の対照として、同じポリマーをフルオレセイン（反応性基なし）と一緒に同じ反応条件でインキュベートした。この手順のプロトコールは以下のとおりである。
【０２０２】
[00286]ＮＨＳ−ＦＡＭのＣＡ００１へのコンジュゲーション
[00287]目的：
[00288] ＣＡ００１をＮＨＳ−ＦＡＭでビオチニル化し、共有結合した色素へのＦＲＥＴを示す。
【０２０３】
[00289]材料：
[00290]ＵＶ透過性キュベット付き蛍光光度計
[00291]ＵＶ−ＶＩＳ機器
[00292]精製済みＣＡ００１
[00293]ＮＨＳ−ＦＡＭ（Invitrogen ＃Ｃ−１３１１）
[00294]０．５Ｍ ＮＥｔ３（ストック（７．２Ｍ）ＮＥｔ３の１：１４希釈）
[00295]ＭＣ３０フィルタ
【０２０４】
[00296]手順：
[00297]１．アミン−ポリマーに対するＮＨ−ＦＡＭの１０倍ＸＳを用いて反応物をセットアップ。１０ｕＬ ｒｘｎあたりポリマー５０ｕｇとＮＨＳ−ＦＡＭ ８．０ｕｇとを使用。
【０２０５】
【表１】

【０２０６】
[00298]２．色素以外をすべて混合したら、１３０ｕＬ無水ＤＭＳＯ／ｍｇ色素の割合で色素１〜２ｍｇをＤＭＳＯに溶解させる。溶解後、すみやかにＮＨＳ−試薬を使用。
[00299]３．ヒートブロックにて２５℃で３０分間インキュベート。
[00300]４．９０Ｍ１Ｔ（４００ｕｌ中１０ｕＬ）で希釈。
[00301]５．ＭＣ３０で脱塩、２Ｘ
[00302]６．ＵＶ／Ｖｉｓにより濃度をアッセイ
【０２０７】
[00303] 各反応生成物で得られた蛍光スペクトルを図２６に示す。正の対照からの蛍光を実線で示す。ポリマーが励起されると、受容体色素（ポリマーに共有結合している）へのＦＲＥＴが生じ、強いフルオレセイン放出が起こる。負の対照からの蛍光を点線で示す。負の対照のフルオレセインはポリマーと結合できないため、ポリマーが励起されてもＦＲＥＴは発生せず、ポリマーの放出だけが観察される。これらのデータから、ＣＡ００１上のアミンをコンジュゲーションに利用できることが分かる。
【０２０８】
実施例５
[00304]ビオチニル化共役ポリマーすなわちビオチニル−ＣＡ００１の合成：
【化２１】

【０２０９】
[00305] Pierce社から入手可能なＮＨＳ−ビオチンリンカー（＃２０２１７）を利用して、ＣＡ００１上のアミン官能基をビオチン官能基に変換した。この手順のプロトコールは、Pierce社のウェブサイトwww.piercenet.com（最後に訪問したのは０９／２３／２００７）にあるPierce社のプロトコールを変更したものである。この手順のプロトコールは、実施例１２で説明するものに同じように従っている。
【０２１０】
実施例６
[00306]ビオチニル−ＣＡ００１、Avidin DN、ビオチニル−フルオレセインによるシグナル増幅法：
[00307]目的：
[00308] ビオチニル−ＣＡ００１、Avidin DN、ビオチニル−フルオレセインを利用してＦＲＥＴによる蛍光シグナル増幅を示す
[00309]材料：
[00310]NanoDrop蛍光光度計
[00311]Perkin-Elmer蛍光光度計、型番ＰＥ−ＬＳ５５
[00312]ＵＶ透過性プラスチックキュベット（１ｍｌ）
[00313]ピペッター＋先端
[00314]ビオチニル−ＣＡ００１（ＢＣＡ）
[00315]ＣＡ００１（ＣＡ）
[00316]ビオチニル−フルオレセイン（ＢＦＬ）
[00317]Avidin DN（ＡＤＮ）
[00318]ＴＢＳ
[00319]手順：
[00320]１．エッペンドルフチューブで、以下の表に列挙した試薬を混合する。このとき、ＡＤＮを最後に加えるようにし、ＡＤＮを加える前に他の試薬を混合する。蛍光光度計での測定前に、NanoDropの場合は１００ｕＬで１ｕＬ、ベンチトップ蛍光光度計の場合は１ｍＬキュベットで１０ｕｌとして、混合物を１００倍に希釈する。
[00321]２．フルオレセインを４８８ｎｍで直接励起させるとともに、ポリマーを３８０ｎｍで励起させてＦＲＥＴで間接的に励起させる。
[00322]３．関連する波長でピーク高についてのデータを集める。これらのソースを含めて、ピーク高からバックグラウンドを差し引く。
[00323]３ａ）緩衝液単独の対照
[00324]３ｂ）ＦＲＥＴからフルオレセインピークへのポリマーピークテイル（約５％）
【０２１１】
【表２】

【０２１２】
実施例７
[00325]ビオチニル−ＣＡ００１、Avidin DN、ビオチニル−フルオレセインによるシグナル増幅の分析：
[00326] ＣＡ００１のビオチニル化を図２７Ａに示す。アミンポリマーＣＡ００１（ビオチニルポリマーの前駆体）はアビジンに結合しないものとし、負の対照ポリマーとして利用する。このアッセイを図２７Ｂに概略的に示す。ビオチン−アビジン結合によって、ビオチニル化色素とポリマーとを特異的に一緒にする。負の対照ポリマー（アミンポリマーＣＡ００１、ＣＡと表示）はアビジンと結合することがないものとする。上記プロトコール（実施例６）でのアッセイの蛍光スペクトルを図２７Ｃに示す。点線はAvidin DN（ＡｖＤＮ）とビオチニル化フルオレセイン（Ｂ−Ｆｌ）を含む溶液中で非特異的ポリマー（ＣＡ）を３８０ｎｍで励起させた場合の蛍光スペクトルを示す。４２０ｎｍが中心波長となるポリマー放出のみが観察される。実線は、Avidin DN（ＡｖＤＮ）とビオチニル化フルオレセイン（Ｂ−Ｆｌ）とを含む溶液中でビオチニル化ポリマー（ＢＣＡ）を３８０ｎｍで励起させた場合の蛍光スペクトルを示す。強いエネルギ移動が観察され、中心５３０ｎｍでフルオレセインからさらに放出が発生する。ＦＲＥＴはビオチニル−ＣＡ００１の場合にしか生じないことから、供与体のビオチニル−ＣＡ００１と受容体のフルオレセインとが、ビオチン−アビジン結合によって近接していることが分かる。これは、Pierce社手順によるＣＡ００１のビオチニル化（実施例５）を裏付けるものである。４８８ｎｍでの色素の直接励起を破線で示す。破線と実線とを比較すると、直接励起させた場合に対して間接的に（ＦＲＥＴによって）励起させると色素が１９倍増幅していることが明らかになる。
【０２１３】
実施例８
[00327]カルボキシレート官能基を有するカチオン性共役ポリマー前駆体ＣＣ００１の合成：
【化２２】

【０２１４】
[00328] ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛７’−エチルエステルヘプトキシ）フェニレン）］：２，７−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−９，９−ビス（６’−ブロモヘキシル）フルオレン（５００ｍｇ、０．６７０ｍｍｏｌ）と、１，４−ジブロモ−２，５−ジフルオロベンゼン（１７３．２ｍｇ、０．６３７ｍｍｏｌ）と、１−（７’−エチルエステルヘプトキシ）−３，５−ジブロモベンゼン（１３．６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム（１．１２ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）と、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）とをＴＨＦ（１５ｍＬ）および水（５ｍＬ）に入れた溶液を、ウォータージャケット付き還流凝縮器を取り付けた５０ｍＬ容の丸底フラスコで、４回の凍結−ポンプ−解凍サイクルで脱気した（３回目と４回目の脱気後にアルゴンを導入）。この溶液を加熱してアルゴン雰囲気下にて４８時間還流した。冷却後、この溶液を４０ｍＬの攪拌メタノールに滴下して加えてポリマーを沈殿させ、これを遠心処理により回収した。続いてデカントし、メタノールで洗浄（２回）して低分子量画分を除去し、淡い黄色のふわふわした粉末を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：７．８８７〜７．４０６（ｍ，８Ｈ）；３．３２２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ）；２．０８０（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；１．７１０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ）；１．２６９（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；１．１５８（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；０．７９９（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。Ｍｎ ３９．５Ｋ、ＰＤＩ ２．１。
【０２１５】
[00329] ＩＲ分光法を利用して、官能化モノマーの最終ポリマー構造への取り込みを評価した。重合反応時にはカルボキシレート官能基をエステルとして保護し、触媒汚染を防止した。この保護基には、赤外線（ＩＲ）分光法で図２８に示すような独特のサインがある。示されたピークが、カルボキシレート保護基だけに存在する独特なＣ＝Ｏピークに対応する。図２８の破線がモノマーのＩＲスペクトルに対応し、実線がポリマーのＩＲスペクトルに対応する。どちらの場合も、カルボキシレートピークが観察され、機能的モノマーの取り込みを示している。
【０２１６】
実施例９
[00330]アミン官能基を有するアニオン性共役ポリマーＡＡ００３の合成：
【化２３】

【０２１７】
[00331] ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−フタルイミドブトキシ）フェニレン）］：２，７−ジブロモ−９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）フルオレン（１２９．５ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）と、１，４−ジボロン酸（３７．４ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）と、１−（４’−フタルイミドブトキシ）−３，５−ジブロモベンゼン（１０．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム（３６６ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）と、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（８．８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）との、ＤＭＦ（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）中の溶液を、ウォータージャケット付き還流凝縮器を取り付けた１００ｍＬ容の丸底フラスコで、４回の凍結−ポンプ−解凍サイクルで脱気した（３回目と４回目の脱気後にアルゴンを導入）。この溶液を加熱してアルゴン雰囲気下にて４８時間還流した。反応の過程で、黒色の沈殿物が形成された。冷却後、溶液を除去し、沈殿物をアセトンで洗浄して、褐色の粉末を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：７．９１０〜７．５９７（ｍ，１０Ｈ）；２．２０６（ｂｒ ｓ，８Ｈ）；１．４００（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；０．６６８（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。ＩＲ：１６９６ｃｍ−１、保護アミン（フタルイミド）を示す。
【０２１８】
[00332] ＡＡ００３、ポリ［（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−アミノブトキシ）フェニレン）］：ヒドラジン一水和物（２９．９ｍｇ、０．５９８ｍｍｏｌ）とポリ［（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−オルト−１，４−｛２，５−ジフルオロ｝フェニレン）−コ−（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−オルト−３，５−１−｛４’−アミノブトキシ）フェニレン）］（４５ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）との、５０％メタノール／水（５ｍＬ）中の溶液を５時間還流した。室温まで冷却した後、１ＭのＨＣｌを用いて溶液のｐＨを３に調整し、続いてさらに２時間還流した。冷却して１５ｍＬ容のFalconチューブに移した後、以下のプロトコールでＡＡ００３を精製した。
【０２１９】
[00333]脱保護したＡＡ００３の精製
[00334]目的：
[00335]アミン活性化アニオン性ポリマーを豊富にする
[00336]材料：
[00337]ＵＶ透過性プラスチックキュベット（１ｍＬ）
[00338]遠心機
[00339]ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計
[00340]ピペッター＋先端
[00341]ＮａＯＨ、１．０Ｍ、０．１ｍＬ：
[00342] ＮａＯＨ、１０Ｍ １０ｕＬ
[00343] Ｈ_２Ｏ ９０ｕＬ
[00344]粗ＡＡ００３
[00345]９０％ＭｅＯＨ、１％Ｔ２０（９０Ｍ１Ｔ、５０ｍＬ）
[00346]ＭＣ３０フィルタ
[00347]手順：
[00348]１．画分を選別：
[00349]１ａ）チューブの内側にフィルムライニング（沈殿ポリマー）がある場合、上清を新しいチューブに注ぎ出す。ピペットの先端を使って、上清全てを完全に取り出し、取り分けておく。
[00350]１ｂ）チューブを覆っているフィルム（ｐｐｔ）を処理：
[00351] ｉ．水０．５ｍＬを加え、リトマスでｐＨを確認する。必要があれば、ＮａＯＨを加えて（最初に０．１ＭのＮａＯＨを１〜５ｕＬの量で加え、さらに実施するのであれば１．０ＭのＮａＯＨ）ｐＨ約７〜８に中和し、混合し、ペレット化し、リトマスで確認する。ｐＨ８に維持されるまで、添加−混合−ペレット化−ｐＨ試験確認のサイクルを数回実施する。
[00352]ｉｉ．水抽出物を除去し、１．５ｍＬのeppiに入れる。
[00353]ｉｉｉ．１４ｋｒｃｆで２秒間スピンさせる。上澄み（sup.）を保管してペレット化する。
[00354]ｉｖ．ペレットを凍結乾燥させる。
[00355]１ｃ）ステップ１ａ）の上清を処理：
[00356]ｉ．上清０．５ｍＬ（通常は懸濁液）を分取し、１．５ｍＬのeppi.に入れる。
[00357]ｉｉ．リトマスでｐＨを調べ、ｐＨを記録する。
[00358]ｉｉｉ．上記ステップ１ｂ１と同様にしてｐＨ約７〜８に中和する。
[00359]ｉｖ．１４ｋｒｃｆで２秒間遠心処理する。
[00360]ｖ．ペレットから上澄みを分離し、両方を保管する。
[00361]ｖｉ．ペレットを凍結乾燥させる。
[00362]ｖｉｉ．ペレットを最低限の量の無水ＤＭＳＯで再懸濁させる。
[00363]ｖｉｉｉ．水中にてＵＶ／Ｖｉｓ分光分析を実施し、吸光度を記録し、有効な消散係数（Ext. Coef.）を利用してすべての画分の濃度を計算する。
[00364]２．ＭＣ３０による脱塩。
[00365] ＡＡ００３の光学スペクトルを図２９に示す。図中、実線は吸収を示し、破線は放出スペクトルを示す。脱保護したポリマーＡＡ００３（遊離アミンを有する）を、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ（最後に訪問したのは１０／０４／０７）で入手可能なプロトコールのスクシミジルエステルFAM、5(6)FAM-SE（Invitrogen、＃Ｃ１３１１）と反応させた。負の対照として、同じポリマーをフルオレセイン（反応性基なし）と一緒に同じ反応条件でインキュベートした。この手順のプロトコールは、実施例４で説明したものと同様に従っている。
【０２２０】
実施例１０
[00366]マレイミド官能基を有するアニオン性共役ポリマーＡＡ００３−Ｍ０１の合成：
【化２４】

【０２２１】
[00367] ＧＭＢＳなどの二官能性リンカーを利用して、多発色団上のアミン官能基を他の官能基に変換することが可能である。この手法を採用して、ＡＡ００３をＡＡ００３−Ｍ０１に変換した。この手順のプロトコールは、Pierce社のウェブサイトwww.piercenet.com（最後に訪問したのは０９／２３／２００７）にあるPierce社のプロトコールを変更したものである。使用したプロトコールは以下のとおりである。
【０２２２】
[00368]ＧＭＢＳのＡＡ００３へのコンジュゲーション
[00369]目的：
[00370] ＧＭＢＳでＡＡ００３を官能化し、マレイミド部分を得る
[00371]材料：
[00372]遠心機
[00373]ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計
[00374]ＵＶ透過性キュベット（１ｍＬ）
[00375]ピペッター＋先端
[00376]ＡＡ００３
[00377]GMBS(Pierce #22309)
[00378]９０％ＭｅＯＨ、１％Ｔ２０（９０Ｍ１Ｔ、５０ｍＬ）
[00379]ＤＭＳＯ
[00380]ＮＥｔ３
[00381]ＭＣ３０フィルタ
[00382]手順：
[00383]１．マレイミドでＡＡ００３を官能化するには、本明細書において有用な使用量がある：
[00384]１ａ）４０Ｘ ＸＳの場合、０．３ｍＭのポリマーと１２ｍＭのＧＭＢＳを使用する。これは、以下のようにポリマー３．０ｎｍｏｌ／１０ｕＬ ｒｘｎを意味する。
【０２２３】
【表３】

【０２２４】
[00385]２．リンカー以外のすべての試薬を混合する場合：
[00386]２ａ）ＧＭＢＳをＤＭＳＯに溶解させる（溶解後すみやかにＧＭＢＳを使用）：
[00387]ｉ．１２０ｍＭ ＧＭＢＳ＝３．４ｍｇ／０．１ｍＬ ＤＭＳＯまたは３０ｕＬ／ｍｇ
[00388]２ｂ）ヒートブロックにて２５℃で３０分間インキュベート。透明度を確認。
[00389]３．ＭＣ３０でＸＳ ＧＭＢＳを除去：
[00390]３ａ）ＭＣカップに適用する前に、ＤＭＳＯを＜５％まで希釈
[00391]３ｂ）反応物ｗ／４００ｕＬ ９０Ｍ１Ｔ各々を別途混合
[00392]３ｃ）カップに適用
[00393]３ｄ）１４ｋ ｒｃｆで１０分間スピン
[00394]３ｅ）未透過流の容積を推定してさらにスピンを継続する必要があるかどうかを判断
[00395]３ｆ）濾液を廃棄
[00396]３ｇ）９０Ｍ１Ｔをさらに４００ｕＬ加え、再度スピン
[00397]３ｈ）未透過流がほぼ乾燥したように見えたら、９０Ｍ１Ｔを２０ｕＬ加え、カップ内で若干渦を作る
[00398]３ｉ）ひっくり返し、スピンして未透過流を回収
[00399]３ｊ）未透過流の最終容積を測定＝＿＿＿＿＿ｕＬ
[00400]３ｋ）ＵＶ−ｖｉｓで濃度を求めた後、０．５Ｘ ９０Ｍ１Ｔにて最終濃度を２５ｕＭに調節
【０２２５】
実施例１１
[00401]アニオン性共役ポリマー−フルオレセインコンジュゲートＡＡ００３−Ｍ０１−Ｆｌの合成：
[00402] ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ（最後に訪問したのは１０／０４／０７）で入手可能なプロトコールを用いて、ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン（Invitrogen）と反応させることで、ＡＡ００３−Ｍ０１上のマレイミド官能基のチオール反応性を試験した。ＡＡ００３を負の対照として利用した。改変後のプロトコールは以下のとおりである。
【０２２６】
[00403]マレイミドのＳＡＭＳＡアッセイ
[00404]目的：ＡＡ００３−Ｍ０１に対する１０Ｘ ＸＳ ＳＡＭＳＡ−フルオレセインを用いてＡＡ００３−Ｍ０１が活性なマレイミド部分であることを示す
[00405]材料：
[00406]遠心機
[00407]ＵＶ透過性キュベット（１ｍＬ）
[00408]蛍光光度計、型番ＰＥ−ＬＳ５５
[00409]ピペッター＋先端
[00410]リン酸カリウム０．５Ｍ、ｐＨ７．０、０．２ｍＬ：
[00411]Ｋ２ＨＰＯ４、１Ｍ ６２ｕＬ
[00412]ＫＨ２ＰＯ４、１Ｍ ３９ｕＬ
[00413]Ｈ２０ １００ｕＬ
[00414]ＨＣｌ、６Ｍ、０．２ｍＬ：
[00415]Ｈ２Ｏ ０．１ｍＬ
[00416]ＨＣｌ、１２Ｍ ０．１ｍＬ
[00417]ＮａＯＨ、０．１Ｍ、１ｍＬ：
[00418]ＮａＯＨ、１０Ｍ １０ｕＬ
[00419]Ｈ２Ｏ ９９０ｕＬ
[00420]ＡＡ００３
[00421]ＡＡ００３−Ｍ０１
[00422]ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン（Invitrogen、製品Ａ６８５）
[00423]ＭＣ３０フィルタ
[00424]手順：
[00425]１．１．０ｍＭの脱保護ＳＡＭＳＡを調製：
[00426]１ａ）１．０ｍｇ ＳＡＭＳＡ／９５ｕＬ ０．１Ｍ ＮａＯＨ（２０ｍＭ ＳＡＭＳＡ）を溶解させる
[00427]１ｂ）室温にて１５分間インキュベートし、アセチル保護基を除去する
[00428]１ｃ）６Ｍ ＨＣｌ：１．４ｕＬ／ｍｇ ＳＡＭＳＡ（２０ｍＭ ＳＡＭＳＡ）で中和する
[00429]１ｄ）２０ｕＬ ０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７／ｍｇ ＳＡＭＳＡ（１６ｍＭ ＳＡＭＳＡ）で緩衝する
[00430]１ｅ）１．０ｍＭ ＳＡＭＳＡまで水で１６倍に希釈する。
[00431]２．以下のものを加えてｒｘｎをセットアップ。
[00432]２ａ）ＡＡ００３−Ｍ０１の場合：１０ｕＬの１．０ｍＭ脱保護ＳＡＭＳＡと１０ｕＬの２５ｕＭ ＡＡ００３＋ＧＭＢＳ（実施例１０のプロトコールから３．ｋ＋Ｇ）
[00433]２ｂ）ＡＡ００３の場合：１０ｕＬの１．０ｍＭ脱保護ＳＡＭＳＡと１０ｕＬの２５ｕＭ ＡＡ００３−ＧＭＢＳ（実施例１０のプロトコールから３．ｋ−Ｇ）
[00434]３．ヒートブロックにて２５℃で３０分間インキュベート
[00435]４．ＭＣ３０でＸＳ ＳＡＭＳＡを除去：
[00436]４ａ）ＭＣカップに適用する前に、ＤＭＳＯを＜５％まで希釈
[00437]４ｂ）ｒｘｎ ｗ／４００ｕＬ ９０Ｍ１Ｔ各々を別途混合
[00438]４ｃ）カップに適用
[00439]４ｄ）１４ｋ ｒｃｆで１０分間スピン
[00440]４ｅ）未透過流の容積を推定してさらにスピンを継続する必要があるかどうかを判断
[00441]４ｆ）濾液を廃棄
[00442]４ｇ）９０Ｍ１Ｔをさらに４００ｕＬ加え、再度スピン
[00443]４ｈ）未透過流がほぼ乾燥したように見えたら、９０Ｍ１Ｔを２０ｕＬ加え、カップ内で若干渦を作る
[00444]４ｉ）ひっくり返し、スピンして未透過流を回収
[00445]５．ステップ４．ｉで得られたＡＡ００３−Ｍ０１試料とＡＡ００３試料の両方を４８８および３８０励起で蛍光分析
【０２２７】
[00446] このアッセイの結果を図３０Ｃに示す。上記の手順で、ＡＡ００３−Ｍ０１（図３０Ｂにマレイミド官能性ポリマーとして示す）と負の対照ポリマー（マレイミドなし、ＡＡ００３、図３０Ａに負の対照ポリマーとして示す）をチオール化フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン）と反応させた。マレイミド官能化ポリマーＡＡ００３−Ｍ０１は、チオール化フルオレセインと反応し、フルオレセインに共有結合して、供与体ポリマーと受容体色素との間の距離が一定になる。よって、ポリマーの励起が受容体色素へのＦＲＥＴにつながり、強い色素放出が観察される（実線、図３０Ｃ）。負の対照はフルオレセインに共有結合せず、ポリマーを励起させてもポリマーの放出だけが観察される（点線、図３０Ｃ）。
【０２２８】
実施例１２
[00447]ビオチニル化アニオン性共役ポリマー、ビオチニル−ＡＡ００３の合成：
【化２５】

【０２２９】
[00448] Pierce社から入手可能なＮＨＳ−ビオチンリンカー（＃２０２１７）を利用して、ＡＡ００３上のアミン官能基をビオチンに変換した。この手順のプロトコールは、Pierce社のウェブサイトｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ（最後に訪問したのは０９／２３／２００７）にあるPierce社のプロトコールを変更したものである。使用したプロトコールは以下のとおりである。
【０２３０】
[00449]ＡＡ００３へのＮＨＳ−ビオチンのコンジュゲーション手順
[00450]目的：
[00451] ＮＨＳ−ビオチンでＡＡ００３をビオチニル化する
[00452]材料：
[00453]ＵＶ透過性キュベット付き蛍光光度計
[00454]ＵＶ−ＶＩＳ機器
[00455]精製済みＡＡ００３（ＡＡ３）
[00456]ＮＨＳ−ビオチン（Pierce ＃２０２１７）
[00457]０．５Ｍ ＮＥｔ３（ストック（７．２Ｍ）ＮＥｔ３の１：１４希釈）
[00458]ＤＭＳＯ
[00459]ＭＣ３０フィルタ
[00460]手順：
[00461]１．反応物すなわち０．５ｍＭポリマーと２０ｍＭＮＨＳ−ビオチンをセットアップ：
【０２３１】
【表４】

【０２３２】
[00462]２．ビオチン以外をすべて混合したら、１５ｕＬ無水ＤＭＳＯ／ｍｇ ＮＨＳ−ビオチン（または１．７ｍｇ／０．０２５ｍＬ；２００ｍＭ）の割合でＮＨＳ−ビオチン１〜２ｍｇをＤＭＳＯに溶解させる。溶解後、すみやかにＮＨＳ−試薬を使用。
[00463]３．ヒートブロックにて２５℃で３０分間インキュベート
[00464]４．９０Ｍ１Ｔにて１：１００に希釈（１００中１ｕＬまたは４００ｕＬ中４）
[00465]５．ＭＣ３０で脱塩、２Ｘ
[00466]６．ＵＶ／Ｖｉｓにより濃度をアッセイ
【０２３３】
実施例１３
[00467]ビオチニル−ＡＡ００３およびAvidin D−フルオレセインによるシグナル増幅法：
[00468]目的：
[00469] ビオチニル−ＡＡ００３およびAvidin D−フルオレセインを利用して、ＦＲＥＴによる特異的蛍光シグナルを示す
【０２３４】
[00470]材料：
[00471]蛍光光度計（NanoDropまたはPerkin-Elmer製ＰＥ−ＬＳ５５）
[00472]ＵＶ透過性プラスチックキュベット（１ｍｌ）
[00473]ピペッター＋先端
[00474]ビオチニル−ＡＡ００３（ＢＡＡ）
[00475]ＡＡ００３（ＡＡ）
[00476]Avidin D−フルオレセイン（Ａ−Ｆｌ）
[00477]ＴＢＳ
[00478]手順：
[00479]１．エッペンドルフチューブで、以下の表に列挙した試薬を混合する。５分間インキュベートした後、蛍光光度計での測定前に、NanoDropの場合は１００ｕＬで１ｕＬ、ベンチトップ蛍光光度計の場合は１ｍＬキュベットで１０ｕＬとして、混合物を１００倍に希釈する。
[00480]２．Ａ−Ｆｌを４８８ｎｍで直接励起させるとともに、ポリマーを３８０ｎｍで励起させてＦＲＥＴで間接的に励起させる。
[00481]３．関連する波長でピーク高についてのデータを集める。これらのソースを含めて、ピーク高からバックグラウンドを差し引く。
[00482]３ａ）緩衝液単独の対照
[00483]３ｂ）ＦＲＥＴからフルオレセインピークへのポリマーピークテイル（約５％）
【０２３５】
【表５】

【０２３６】
実施例１４
[00484]ビオチニル−ＡＡ００３およびフルオレセイン標識Avidin Dによるシグナル増幅分析：
[00485] このアッセイについては、実施例１３で手続き的に説明する。このアッセイのスキームを図３１Ｂに示す。ビオチニル−ＡＡ００３（ビオチニルポリマーとして示す図３１Ａ参照）をフルオレセイン標識Avidin Dと一緒にインキュベートする。負の対照として、アミンポリマーＡＡ００３（負の対照ポリマーとして示す図３１Ａ参照）をフルオレセイン標識Avidin Dと一緒に同じようにしてインキュベートする。いずれの場合も、ポリマーが励起し、フルオレセイン放出が観察される。負の対照ＡＡ００３では、ポリマー放出のみ（中心波長４２０ｎｍ）が観察されるのに対し、ビオチニル−ＡＡ００３では、強い色素放出が観察される。
【０２３７】
[00486] このアッセイの結果を図３２Ａ〜Ｂに示す。アビジン１あたり４の色素を含有するAvidin Dでビオチニル−ＡＡ００３を試験した。対照ポリマーからのシグナルと色素のみの場合のシグナルも記録し、図３２Ａ〜Ｂに示す。図３２Ａは、得られる蛍光スペクトルを示す。このデータセットの５２３ｎｍでの色素シグナルを図３２Ｂにまとめておく。
【０２３８】
[00487] これらのデータから、ポリマーの共存下にてフルオレセインシグナル（５２３ｎｍ）が増幅され（図３２Ａ、実線対波線スペクトル（左）とビオチニル−ＡＡ００３対色素単独（右））、観察されたシグナルが特異的ポリマー−Avidin D複合体によるものである（図３２Ａ、実線対点線スペクトル（左）、ビオチニル−ポリマー対対照（右））ことが分かる。アミンポリマー対照（ビオチンなし）はアビジンを結合できず、最小限のエネルギ移動が観察された（８８％特異性）。特異性は１−（対照シグナル／特異的色素シグナル）で定義される。右図に、ポリマーがある場合とない場合、正と負の対照試料での色素シグナルの差を示す。図３２Ｂに示すデータは、緩衝液およびポリマーテイルからのシグナルについて補正したものである。５２３ｎｍでのポリマーテイルの寄与率は４１９ｎｍでのポリマーピーク高の５％である。
【０２３９】
実施例１５
[00488]さまざまな色素：Avidin D比での増幅効果：
[00489] ポリマーと色素の異なる比について試験した。これについては、アビジン１あたり平均して０．８、１．５、４のフルオレセイン色素を含むVector Laboratoriesから入手したAvidin Dコンジュゲートを用いて評価した。色素数が増えるにつれて、ポリマーと色素との吸光係数の比（吸光度）が低下する。したがって、このセットのフルオレセイン標識Avidin Dでは、含有色素数が最小のアビジンコンジュゲートで最適な増幅値が観察されると思われた。Avidin Dあたり２当量のポリマーについて、ポリマー濃度を一定に保った。
【０２４０】
[00490] 図３３Ａ〜Ｂに示すデータから、予想どおりポリマー対色素の比に依存していることが分かる。ポリマーとアビジンの濃度を一定にしてAvidin Dあたりの色素数を増やすことで、この比が変化した。データから、色素：アビジンの比が０．８から４に増すと、色素のシグナル強度も高まる（図３３Ａ）が、観察される増幅が低下する（図３３Ｂ）ということが分かる。色素数が増えるにつれて、吸光度が高まり蛍光が強まる（灰色の棒、図３３Ａ）ことで、直接的な色素シグナルも増す。
【０２４１】
実施例１６
[00491]４０５ｎｍで励起可能なアミン官能基を有するアニオン性共役ポリマーＡＡ００２の合成：
【化２６】

【０２４２】
[00492] ポリ［２，７−｛９，９−ビス（１−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）））｝−コ−オルト−（２，７−｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン−コ−２，７−｛９，９−ビス（１−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）））｝−コ−オルト−３，５−１−｛４’−フタルイミドブトキシ）フェニレン）］：２，７−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−９，９−ビス（１−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）））フルオレン（１２０．１ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）と、２，７−ジブロモ｛９，９−ビス（４’−（ナトリウムスルホネート）ブチル）｝フルオレン（９１．３ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）と、１−（４’−フタルイミドブトキシ）−３，５−ジブロモベンゼン（３．７ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム（２３４ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）と、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６．２ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）とをＤＭＦ（３．８ｍＬ）、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）および水（２．５ｍＬ）に入れた溶液を、４８ｍＬ容のSchlenckチューブで、アルゴンで拡散しながら２０分間脱気した。この溶液をアルゴン雰囲気下にて３日間かけて８５℃まで加熱した。この溶液を攪拌アセトンに滴下して加え、暗褐色の固体を得た。この固体をメタノールと一緒に攪拌し、濾液を回収し、溶媒を除去して明るい黄色の固体を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８．０５５〜７．８２８（ｍ，１２Ｈ）；３．５５８〜３．２９３（ｍ，２４Ｈ）；３．１８８（ｍ，１２Ｈ）；２．２１７〜２．１６１（ｍ，８Ｈ）；１．４１７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；０．６６４（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。二峰性、Ｍｎ７．３Ｋ、ＰＤＩ１．０２およびＭｎ４９Ｋ、ＰＤＩ１．２。
【０２４３】
[00493] 次に、実施例９で説明した手順と同様の手順を利用してこのポリマーを脱保護し、精製してＡＡ００２を得た。ＡＡ００２の光学スペクトルを図３４に示す。図中、実線は吸収を示し、破線は放出スペクトルを示す。
【０２４４】
実施例１７
[00494]ビオチニル化共役ポリマー、ビオチニル−ＡＡ００２の合成：
【化２７】

【０２４５】
[00495] Pierce社から入手可能なＮＨＳ−ビオチンリンカー（＃２０２１７）を利用して、ＡＡ００２上のアミン官能基をビオチン官能基に変換した。この手順のプロトコールは、Pierce社のウェブサイトｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ（最後に訪問したのは０９／２３／２００７）にあるPierce社のプロトコールを変更したものである。この手順のプロトコールは、実施例１２で説明したものと同様に従っている。
【０２４６】
実施例１８
[00496]さまざまなポリマー：Avidin D比での増幅効果
[00497] 一定濃度に保持したフルオレセイン標識Avidin DまたはAvidin D-Fl（アビジン１あたり０．８の色素）を、ビオチニル−ＡＡ００２濃度を０から８当量に増加させながらインキュベートした。これを、最初の２当量のビオチニル−ＡＡ００２について図３５Ａに概略的に示す。それぞれの比で、色素蛍光を直接および間接励起（ＦＲＥＴによる）で記録した。図３５Ｂすなわちフルオレセイン放出をＡＡ００２対Avidin D-Flの比の関数としたプロットに示すように、ポリマー対色素比が高くなるにつれて、直接励起によるシグナルはかなり一定に保たれたが、間接励起によるシグナルは増加した。このシグナル増加の安定期は、ビオチニル−ＡＡ００２のほぼ４当量に達し、Avidin Dのすべてのビオチン結合部位が占有されていることと一致する。
【０２４７】
[00498] これらのデータは、フルオレセイン標識Avidin Dに対するビオチニル−ＡＡ００２の特異的結合と一致する。高いシグナル増幅が観察されるが、これはポリマーの４当量で頭打ちになることから、すべての利用できるビオチン結合部位が占有されていることが分かる。
【０２４８】
実施例１９
[00499]色素シグナルの静電増幅
[00500] 図３６Ｂに概略的に示すように、色素標識タンパク質（Cy3標識ＩｇＧおよびフルオレセイン標識ＢＳＡ）を各々独立してカチオン性ポリマーＰＦＰ−２Ｆと一緒にインキュベートした（図３６Ａ参照）。ポリマーと各色素標識タンパク質との間に非特異的静電会合が生じた。各溶液を３８０ｎｍで励起させ、放出スペクトルを集めた。これらのスペクトルを、色素の直接励起で得られた放出スペクトルと比較したところ、図３６Ｃに示すように、Cy3標識ＩｇＧが３０倍増幅、フルオレセイン標識ＢＳＡが２５倍増幅されていた。使用したCy3標識ＩｇＧは、標的ジゴキシゲニン標識抗体を用いる抗ジゴキシゲニン抗体であった。
【０２４９】
[00501] 以上、本明細書において本発明の好ましい実施形態について図示し、説明してきたが、このような実施形態が一例にすぎないことは当業者であれば自明であろう。当業者であれば、本発明から逸脱せずに多数の変形例、変更および置き換えを行うことになろう。本発明を実施するにあたっては、本明細書に記載の本発明の実施形態にさまざまな改変をほどこし得ることは理解されたい。以下の特許請求の範囲で本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法および構造ならびにその等価物が包含されることを意図している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、
シグナル伝達発色団と共役し、標的生体分子と相互作用できるセンサを提供し、
【化１】

からなる群から選択される共役ポリマーであって、センサと静電的に相互作用し、励起時に、センサシグナル伝達発色団にエネルギを移動できるポリマーを提供し、
標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサが結合可能な条件下で、溶液中にて試料をセンサおよび多発色団に接触させ、
多発色団を励起可能な光源を試料に適用し、
シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項２】
Ｒ基がスルホネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
センサが生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生体分子が抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
センサが、複数のシグナル伝達発色団と共役する複数のセンサを含み、複数の発色団のうちの少なくとも２つが、多発色団からのエネルギ移動時に波長の異なる光を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
センサ生体分子、バイオコンジュゲートおよび標的生体分子からなる群から選択される少なくとも１つの生体分子に結合される多発色団であって、シグナル伝達発色団にさらに結合され、構造
【化２】

（式中、ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は、互いに同一または異なる、置換されていてもよい共役ポリマーセグメントまたはオリゴマー構造である）を含む多発色団を備える、
多発色団複合体。
【請求項７】
共役ポリマーがカチオン性共役ポリマーである、請求項６に記載の多発色団。
【請求項８】
共役ポリマーがアニオン性共役ポリマーである、請求項６に記載の多発色団。
【請求項９】
共役ポリマーが電荷中性共役ポリマーである、請求項６に記載の多発色団。
【請求項１０】
ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、チオフェン、フラン、ピリジンおよびオキサジアゾールからなる群から選択される芳香族繰り返し単位であり、各々置換されていてもよく、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、リンカーによって連結された、１つまたは複数の独特なバイオコンジュゲーション部位を含み得る、請求項６に記載の多発色団。
【請求項１１】
マレイミド、チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）、アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）およびスルホ−ＳＢＥＤスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネートからなる群から選択されるバイオコンジュゲーション部位をさらに含む、請求項６に記載の多発色団。
【請求項１２】
多発色団が、構造
【化３】

を含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項６に記載の多発色団。
【請求項１３】
多発色団が、構造
【化４】

を含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項６に記載の多発色団。
【請求項１４】
１および２が、構造
【化５】

を有するａ〜ｇの連結基からなる群から選択され、３が、構造
【化６】

を有する基ｈである、請求項１２または１３に記載の多発色団。
【請求項１５】
構造
【化７】

をさらに含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項１２または１３に記載の多発色団。
【請求項１６】
構造
【化８】

をさらに含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項１２または１３に記載の多発色団。
【請求項１７】
構造
【化９】

をさらに含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩を含む可溶化基である、請求項１２または１３に記載の多発色団。
【請求項１８】
多発色団と、
多発色団と共有結合的に連結されたセンサ生体分子と、
多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できる、
標的生体分子を同定するための多発色団複合体。
【請求項１９】
シグナル伝達発色団とセンサ生体分子の両方が、複数のリンカーを介して、多発色団に共有結合的に連結される、請求項１８に記載の多発色団複合体。
【請求項２０】
シグナル伝達発色団とセンサ生体分子の両方が、多発色団、シグナル伝達発色団およびセンサ生体分子を共有結合的に結合する三官能性リンカーを介して、多発色団に共有結合的に連結される、請求項１８に記載の多発色団複合体。
【請求項２１】
リンカーが、マレイミド／チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）／アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／アミン、アミン／スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールおよびアミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールからなる群から選択される連結化学を含む、請求項１８に記載の多発色団複合体。
【請求項２２】
多発色団が共役ポリマーである、請求項１８に記載の多発色団複合体。
【請求項２３】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項１８に記載の多発色団複合体。
【請求項２４】
標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、
多発色団と、共有結合的に連結されるシグナル伝達発色団と、共有結合的に連結されるセンサ生体分子と、を含み、シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できる、多発色団複合体を提供し、
標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサ生体分子が結合可能な条件下で、溶液中にて試料を多発色団複合体に接触させ、
多発色団を励起可能な光源を試料に適用し、
シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出する、
アッセイ方法。
【請求項２５】
多発色団が共役ポリマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、
シグナル伝達発色団と共役し、標的生体分子と相互作用できる第１のバイオコンジュゲートを提供し、
構造
【化１０】

（式中、ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４は、互いに同一または異なる、置換されていてもよい共役ポリマーセグメントまたはオリゴマー構造であり、第２のバイオコンジュゲートが、第１のバイオコンジュゲートと結合可能であり、そのような結合時に、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる）を含む多発色団と共役する第２のバイオコンジュゲートを提供し、
標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子に第１のバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を第１のバイオコンジュゲートに接触させ、
溶液を第２のバイオコンジュゲートに接触させ、
多発色団を励起可能な光源を試料に適用し、
シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項２８】
共役ポリマーがカチオン性共役ポリマーである、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項２９】
共役ポリマーがアニオン性共役ポリマーである、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項３０】
共役ポリマーが電荷中性共役ポリマーである、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項３１】
ＣＰ_１、ＣＰ_２、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、チオフェン、フラン、ピリジンおよびオキサジアゾールからなる群から選択される芳香族繰り返し単位であり、各々置換されていてもよく、ＣＰ_３およびＣＰ_４が、リンカーによって連結された、１つまたは複数の独特なバイオコンジュゲーション部位を含み得る、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項３２】
マレイミド、チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）、アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）およびスルホ−ＳＢＥＤスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネートからなる群から選択されるバイオコンジュゲーション部位をさらに含む、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項３３】
多発色団が、構造
【化１１】

を含み、
式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項３４】
多発色団が、構造
【化１２】

を含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項３５】
１および２が、構造
【化１３】

を有するａ〜ｇの連結基からなる群から選択され、３が、構造
【化１４】

を有する基ｈである、請求項３３または３４に記載の多発色団。
【請求項３６】
構造
【化１５】

をさらに含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項３３または３４に記載の多発色団。
【請求項３７】
構造
【化１６】

をさらに含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項３３または３４に記載の多発色団。
【請求項３８】
構造
【化１７】

をさらに含み、式中、Ｒ^１は、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩およびω−スルホネートアルコキシ塩からなる群から選択される可溶化基である、請求項３３または３４に記載の多発色団。
【請求項３９】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
共役ポリマーがアニオン性共役ポリマーである、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項４１】
共役ポリマーが電荷中性共役ポリマーである、請求項２７に記載の多発色団。
【請求項４２】
第１および第２のバイオコンジュゲートのうちの少なくとも１つが抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
第１および第２のバイオコンジュゲートが抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、
共有結合的に連結された第１のバイオコンジュゲートを含む多発色団を提供し、
標的分子と相互作用できるセンサ生体分子と、シグナル伝達発色団と、第１のバイオコンジュゲートに結合でき、そのような結合時に、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、共有結合的に連結された第２のバイオコンジュゲートと、を有するセンサ生体分子複合体を提供し、
標的生体分子が存在する場合に、この標的生体分子にセンサ生体分子が結合可能な条件下で、溶液中にて試料をセンサ生体分子複合体に接触させ、
溶液を多発色団に接触させ、
多発色団を励起可能な光源を試料に適用し、
シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項４５】
多発色団が共役ポリマーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
第１および第２のバイオコンジュゲートが、タンパク質、抗体および核酸からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンまたはビオチンであり、センサ生体分子が抗体であり、第２のバイオコンジュゲートが、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンであればビオチンであり、第１のバイオコンジュゲートがビオチンであればストレプトアビジンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンまたはビオチンであり、センサ生体分子が核酸であり、第２のバイオコンジュゲートが、第１のバイオコンジュゲートがストレプトアビジンであればビオチンであり、第１のバイオコンジュゲートがビオチンであればストレプトアビジンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
バイオコンジュゲートと、
バイオコンジュゲートと共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、
バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、
生体分子を同定するための生体認識複合体。
【請求項５１】
バイオコンジュゲートが抗体である、請求項５０に記載の生体認識複合体。
【請求項５２】
バイオコンジュゲートがストレプトアビジンである、請求項５０に記載の生体認識複合体。
【請求項５３】
多発色団が共役ポリマーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、
バイオコンジュゲートと、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、生体認識複合体を提供し、
標的生体分子または標的関連生体分子が存在する場合に、この標的生体分子または標的関連生体分子にバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を生体認識複合体に接触させ、
多発色団を励起可能な光源を溶液に適用し、
シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項５６】
多発色団が共役ポリマーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
バイオコンジュゲートと、
バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、
多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、
標的生体分子を同定するための生体認識複合体。
【請求項５９】
バイオコンジュゲートが抗体である、請求項５８に記載の生体認識複合体。
【請求項６０】
バイオコンジュゲートがストレプトアビジンである、請求項５８に記載の生体認識複合体。
【請求項６１】
多発色団が共役ポリマーである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
標的生体分子を含有するとみられる試料を提供し、
バイオコンジュゲートと、バイオコンジュゲートと共有結合的に連結された多発色団と、多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、多発色団の励起がシグナル伝達発色団にエネルギを移動できる、バイオコンジュゲート複合体を含む生体認識複合体を提供し、
標的生体分子または標的関連生体分子が存在する場合に、この標的生体分子または標的関連生体分子にバイオコンジュゲートが結合可能な条件下で、溶液中にて試料を生体認識複合体に接触させ、
多発色団を励起可能な光源を溶液に適用し、
シグナル伝達発色団から光が放出されたか否かを検出すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項６４】
多発色団が共役ポリマーである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
共役ポリマーがポリカチオン性共役ポリマーである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
標的生体分子の検出時に遺伝子の発現が検出される、請求項１、２４、２７、４４、５４および６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
標的生体分子の検出によって、患者の病状を診断するのに用いられる結果が得られる、請求項１、２４、２７、４４、５４および６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
疾患を診断する方法が、
試料中における標的生体分子の存在に関するデータを精査または分析し、
疾患の診断に関するデータの精査または分析に基づく結論を、患者、ヘルスケア提供者またはヘルスケア管理者に提供することを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
結論を提供することが、ネットワーク経由でのデータの伝送を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
多発色団と、
多発色団と共有結合的に連結されたセンサ生体分子と、
多発色団と共有結合的に連結されたシグナル伝達発色団と、を含み、シグナル伝達発色団が、多発色団の励起時に多発色団からのエネルギを受け取ることができ、センサ生体分子が、標的生体分子と相互作用できる、
標的生体分子を同定するためのキット。
【請求項７１】
キットが基質をさらに含む、請求項７０に記載のキット。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２８】

【図２９】

【図３０Ａ】

【図３０Ｂ】

【図３０Ｃ】

【図３１Ａ】

【図３１Ｂ】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

【図３４】

【図３５Ａ】

【図３５Ｂ】

【図３６Ａ】

【図３６Ｂ】

【図３６Ｃ】

【公表番号】特表２０１０−５４０８８５（Ｐ２０１０−５４０８８５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１６４２（Ｐ２００９−５３１６４２）
【出願日】平成１９年１０月８日（２００７．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０７３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００３４４
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０９０８９６２７）シリゲン，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】