排水処理性能の高い新規活性汚泥
【課題】排水処理性能の高い新規活性汚泥の提供。
【解決手段】
複数の製紙工場から採取した活性汚泥を比較することで排水処理性能の高い新規活性汚泥を特定するとともに、該新規活性汚泥の生物学的な特徴を見出した。
【解決手段】
複数の製紙工場から採取した活性汚泥を比較することで排水処理性能の高い新規活性汚泥を特定するとともに、該新規活性汚泥の生物学的な特徴を見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、排水処理性能の高い新規活性汚泥に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有するプライマーのセットを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅される遺伝子断片を有する、排水処理性能の高い新規活性汚泥に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、工業排水、家庭排水等の様々な排水や下水等を細菌の力で浄化する処理方法が広く利用されている。この処理方法には、生育に酸素を必要とする細菌を用いる好気性処理と、生育に酸素を必要としない細菌を用いる嫌気性処理とがあり、好気性処理技術である活性汚泥法は特に広範に用いられている代表的な技術である。
活性汚泥法は、細菌の酸化的有機物分解能を利用する生物学的な排水処理法であり、曝気槽において有機汚濁物質を主にバイオマスまたは二酸化炭素に変換することにより、排水中の汚濁物質を除去する方法である。さらに、この方法では、細菌のフロック形成能を利用し、活性汚泥バイオマスが沈殿槽において沈降分離されるため、処理後の上澄み液を処理水として得ることができるという利点もある。
【０００３】
排水に含まれる有機物は多様であり、その種類によっては細菌が容易に処理できない場合もあった。そこで、排水や、排水中に含まれる有機物の種類によって、活性汚泥に作用させる前に特定の細菌を作用させる前処理をしたり、微生物製剤を利用したり、使用する活性汚泥の種類や順番を変えたり、活性汚泥に含まれる細菌群を最適化する試み等が近年なされている。
例えば、アルカリゲネス属菌、シュウドモナス属菌、バチルス属菌、アエロバクター属菌、フラボバクター属菌などの好気性細菌で有機物を酸化分解する前処理をした後、活性汚泥を作用させる方法（特許文献１、２参照）や、オゾンや過酸化水素から生成したヒドロキシラジカルで有機物を酸化分解する方法（特許文献３参照）などが開示されている。しかし、これらの方法では、前処理のための新規な設備投資が必要となる。また、操業条件が煩雑になるため処理コストが高くなるという問題もある。
【０００４】
また、排水が硝化槽、脱窒槽、再曝気槽、沈殿槽等を経て処理される生物処理方法において、硝化槽にはニトロソモナス（Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ニトロソコッカス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ）等のアンモニア酸化細菌等を含む活性汚泥を収容し、脱窒槽にはアルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、アゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌等の脱窒活性に関する細菌を含有させた活性汚泥を収容する方法等も開示されている（例えば、特許文献４参照）。
しかし、活性汚泥に含有されるアゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌等の脱窒活性に関する細菌は、微生物製剤として活性汚泥に加えられるものである。微生物製剤は加えたからといって、必ずしも活性汚泥の排水処理性能を向上できるとは限らず、また効果が出ても最低数日間はかかる上に、コストが高いという問題もある。
【０００５】
アゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌は、嫌気的条件下で芳香族炭化水素を分解する能力を有することが知られており、ベンゼン等の揮発性芳香族炭化水素により汚染された環境を浄化するために利用することが開示されている（例えば、特許文献５参照）。
また、活性汚泥から単離したアゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌の特定の菌株をセレン酸還元菌として、金属精錬工業排水、ガラス工業排水、石炭または石油系燃焼非ガス処理プロセスからの排水等、セレン化合物を多く含む排水の処理に利用できること等も開示されており（例えば、特許文献６〜８参照）、この菌株を活性汚泥中に添加し、この菌株がどの程度含まれるかをＦＩＳＨ法により定量する方法等も開示されている（たとえば、特許文献９参照）。しかし、この菌株も微生物製剤と同様に利用されるだけであり、必ずしも排水処理において効果があるとはいえなかった。
【０００６】
製紙工場では、ＫＰ系排水、ＤＩＰ系排水、マシン系排水などあるが、それらの中で主として、ＫＰ系排水とＤＩＰ系排水の二種類の排水処理に活性汚泥法が利用されている。ＫＰ系排水には、リグニン、リグニン分解物、糖や有機酸等を主成分とする漂白系排水と、メタノール等を主成分とするドレン系排水があり、ＤＩＰ系排水はリグニン、デンプン、脂肪酸系界面活性剤や高級アルコール系界面活性剤を主成分とするものである。このうち、特に漂白系排水は、ドレン系排水やＤＩＰ系排水と比較して分解されにくい。
製紙工場ごとにこれらの排水の比率が異なっており、この排水の処理は、各工場の経験則に負うところが大きく、排水の生分解性と活性汚泥中の細菌の関係についての知見はほとんどないのが現状である。しかし、いずれの製紙工場においても、より安価で簡便かつ確実にこれらの排水が処理できる、排水処理性能の高い新規活性汚泥の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２１０６９２号公報
【特許文献２】特開２００６−０５１４１４号公報
【特許文献３】特開２００１−２３９２８０号公報
【特許文献４】特開２００９−１３１８４８号公報
【特許文献５】特開２００７−２２２００４号公報
【特許文献６】特開２００１−３４７２９２号公報
【特許文献７】特開２００２−１８４８２号公報
【特許文献８】特開２００１−１０４９８９号公報
【特許文献９】特開２００１−３４６５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、排水処理性能の高い新規活性汚泥の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、複数の製紙工場から採取した活性汚泥を比較することで排水処理性能の高い新規活性汚泥を特定するとともに、この排水処理性能の高い新規活性汚泥を遺伝子診断することにより、排水処理性能の高い新規活性汚泥の生物学的な特徴を見出した。さらに、該活性汚泥を作用させることにより、高効率に製紙工場排水を処理できる方法を確立するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、次の（１）〜（７）に示される活性汚泥、該活性汚泥を作用させることによる製紙工場排水の処理方法等に関する。
（１）次のａ〜ｃから選択される少なくとも１組のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（２）次のｂおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（３）次のａおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（４）次のｂのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（５）遺伝子断片がβプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目のデクロロモナス属に属する細菌の遺伝子またはアゾアーカス属に属する細菌の遺伝子である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の活性汚泥。
（６）製紙工場排水に上記（１）〜（５）のいずれかに記載の活性汚泥を作用させる製紙工場排水の処理方法。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の活性汚泥を絶乾重量比率が５％以上となるように、他の活性汚泥に混合し、製紙工場排水に作用させる上記（６）に記載の製紙工場排水の処理方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の排水処理性能の高い新規活性汚泥により、製紙工場排水を高効率に処理することが可能となった。本発明の該活性汚泥は、他の活性汚泥と混合し、他の活性汚泥の排水処理性能を高めるために利用することもできる。また、本発明の新規活性汚泥の生物学的な特徴を指標として、他の活性汚泥の排水処理性能を診断することも可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「活性汚泥」は、次の１．〜４．のいずれかの生物学的特徴を有する「活性汚泥」であれば、いずれのものも含まれる。
１．次のａ〜ｃから選択される少なくとも１組のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
２．次のｂおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
３．次のａおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
４．次のｂのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
【００１３】
本発明のａ〜ｃのプライマーセットには、以下のものが挙げられる。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、プライマーを特定している配列番号に示される塩基配列を有するプライマーであればよく、該塩基配列からなるプライマーであっても良い。
【００１４】
本発明の「ポリメラーゼ連鎖反応」には、ＰＣＲ、タッチダウン法によるＰＣＲ等、従来知られているいずれの「ポリメラーゼ連鎖反応」も含まれる。「活性汚泥」に含まれる遺伝子断片を鋳型として、以下のａ〜ｃのプライマーセットを用いて行う「ポリメラーゼ連鎖反応」であれば良い。
なお、この「ポリメラーゼ連鎖反応」は、本発明の活性汚泥以外の活性汚泥の排水処理性能の診断のためにも使用することができる。
【００１５】
本発明のプライマーセットａまたはプライマーセットｂを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片は、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌の遺伝子であることが好ましく、さらに、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌の１６Ｓリボゾーム遺伝子であることが好ましい。
また、プライマーセットｃを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片は、アゾアーカス属に属する細菌の遺伝子であることが好ましく、さらに、アゾアーカス属に属する細菌の１６Ｓリボゾーム遺伝子であることが好ましい。
【００１６】
βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌とアゾアーカス属に属する細菌は易分解有機物から難分解有機物まで幅広く分解できることが知られている（参考文献１〜３参照）。また、これらはいずれも通性嫌気性細菌であり、呼吸のときの電子受容体として酸素だけではなく硫酸イオン、硝酸イオン、塩素酸イオンを利用することが知られている（参考文献１）。
排水処理において利用される曝気槽では、経済的な理由から空気または酸素の曝気量を抑えていることが多く、曝気槽内において、部分的な酸素不足が起きていることがある。しかし、これらの細菌は酸素が不足していても、排水中に比較的多く存在する硫酸イオン、硝酸イオン、塩素酸イオンを電子受容体として利用しながら排水中有機物を分解することが可能である。
従って、本発明の「活性汚泥」が有する生物学的特徴が、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌またはアゾアーカス属に属する細菌のどちらか１種以上が本発明の「活性汚泥」中に存在することによる生物学的特長であればさらに好ましい。
［参考文献１］
Ｓａｎｄｅｒ Ａ．Ｂ．Ｗｅｅｌｉｎｋ，
Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｅｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ｂｙ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ （２００８）
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｃｈｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｏ−Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
［参考文献２］
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ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＶＯＬＵＭＥ ２
［参考文献３］
Ｔｈｏｍａｓ Ｈｕｒｅｋ，Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ Ｂｕｒｇｇｒａｆ，Ｃａｒｌ Ｒ． Ｗｏｅｓｅ，ａｎｄ Ｂａｒｂａｒａ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ，
１６Ｓ ｒＲＮＡ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐｐ．， Ｇｒａｓｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ （１９９３） Ｐ３８１６−３８２４
ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
【００１７】
本発明のこれらの「活性汚泥」はどのような排水の処理にも利用できるが、特に製紙工場排水を高効率に処理するために利用することが好ましい。特に、セルロース分解物由来の糖類や有機酸、リグニン分解物由来の芳香族や塩素化有機物など、製紙工場排水中の易分解有機物から難分解有機物までを幅広く、かつ高効率に分解できる「活性汚泥」であることが好ましい。
【００１８】
本発明の「製紙工場排水の処理方法」は、本発明の「活性汚泥」を「製紙工場排水」に作用させる工程を含む「製紙工場排水の処理方法」であれば、従来知られているいずれの方法も利用することができる。
例えば、本発明の「活性汚泥」を収容した曝気槽に「製紙工場排水」を加えることで作用させてもよい、「製紙工場排水」が入った容器に、本発明の「活性汚泥」を加えることで作用させても良い。
ここで「作用させる」とは、「活性汚泥」と「製紙工場排水」を接触させることにより、「製紙工場排水」中に含まれる物質を分解させることをいう。
【００１９】
本発明の「製紙工場排水」は、製紙工場において紙の製造過程において発生するいずれの排水も含まれ、リグニン、リグニン分解物、糖や有機酸等を主成分とする漂白系排水またはメタノール等を主成分とするドレン系排水であるＫＰ系排水や、リグニン、デンプン、脂肪酸系界面活性剤や高級アルコール系界面活性剤を主成分とするＤＩＰ系排水が挙げられる。これらの一種類からなる排水であってもよく、これらが複数混合された排水であっても良く、特に限定されるものではない。
ドレン系排水やＤＩＰ系排水と比較して、漂白系排水は分解されにくいが、本発明の「活性汚泥」は漂白系排水に対しても高い分解性能を発揮することができる。
【００２０】
また、本発明の「活性汚泥」は、排水処理性能が高いため、高効率に排水処理を行うことができる。従来知られている微生物製剤と異なり、「活性汚泥」としてもともと排水に馴化されているため、どのような排水であっても、例えば、異なる製紙工場で発生した製紙工場排水に対しても馴化に時間がかからないためだと予測される。また、微生物製剤と比較して、本発明の「活性汚泥」は細菌種類の多様性があることも、理由の一つであると考えられる。
【００２１】
本発明の「活性汚泥」はそのまま利用することもでき、形態はとくに限定されるものではないが、余剰汚泥（汚泥濃度が１％〜５％）として利用されることが好ましい。
本発明の「活性汚泥」は、余剰汚泥の形態でも、常温、曝気無しで輸送することができ、「活性汚泥」の性能は維持されたままである。また、本発明の「活性汚泥」は、自然乾燥あるいは凍結乾燥してもよく、これらにおいても「活性汚泥」の性能は維持されたままである。
【００２２】
本発明の「活性汚泥」は、そのまま製紙工場排水に作用させることもできるが、他の活性汚泥に混合し、製紙工場排水に作用させることもできる。この際に、本発明の「活性汚泥」は、混合する他の活性汚泥に対し、絶乾重量比率が５％以上となるように混合すればよく、さらに１０％以上、より好ましくは２０％以上となるように混合すること好ましい。
【００２３】
本発明の「製紙工場排水の処理方法」において、曝気槽や返送汚泥ピットなどで本発明の「活性汚泥」を「製紙工場排水」に作用させることもできる。
曝気槽を使用する場合、ＭＬＳＳ（ｍｉｘｅｄ ｌｉｑｕｏｒ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄｓ（活性汚泥浮遊物質量）；以下、ＭＬＳＳと示す）は３０００ｍｇ／Ｌ〜１００００ｍｇ／Ｌとなるように管理することが好ましい。３０００ｍｇ／Ｌより少ないと排水処理が不十分となり、１００００ｍｇ／Ｌより多くしても汚泥性能は上がらず、汚泥の単位量あたりの性能が低くなり不経済となる。
その他の活性汚泥（曝気槽）の運転および管理条件については通常通りであれば良く、例えば、ｐＨは７〜８、温度は３５℃〜４０℃、ＤＯ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ（溶存酸素量）；以下、ＤＯと示す）は１ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌでコントロールすればよい。
本発明の排水処理性能の高い新規活性汚泥を利用することにより、高効率に排水を処理することができ、処理効率を向上することもできる。
【００２４】
以下に、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
活性汚泥の評価
製紙工場排水の処理における性能を調べるとともに、遺伝子診断により各活性汚泥に含まれる細菌を推定することで各活性汚泥の評価を行った。
１．材料
１）活性汚泥
製紙工場Ａ〜Ｅにおいて、製紙工場排水を処理するための曝気槽から汚泥懸濁液５０ｍｌを採取した。これを２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、残存した沈殿をそれぞれ本発明の実施例に用いる活性汚泥Ａ〜Ｅとした。製紙工場Ａ〜Ｅにおいて、処理されている排水の種類と曝気槽におけるＭＬＳＳを表１に示した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
２）製紙工場排水
製紙工場Ｆで採取した漂白系排水（Ｌ材）を本発明の実施例に用いる製紙工場排水とした。
【００２８】
３）原核生物用プライマーセット
配列表配列番号１および同配列番号２に示される塩基配列からなる原核生物用プライマーセット（参考文献４、参照）を（オペロンバイオテクノロジー株式会社）に委託して作製した。この原核生物用プライマーセットは、１６Ｓリボゾーム遺伝子上に存在する、全ての原核生物共通の塩基配列を増幅対象とするものである。
［参考文献４］
石井浩介、中川達功、福井学
微生物生態学への変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法の応用
Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｖｏｌ．１５， Ｎｏ．１， ５９−７３， ２０００
【００２９】
２．活性汚泥の性能評価
上記１．１）にて調製した活性汚泥Ａ〜Ｅに、それぞれ上記１．２）の排水を加えて全量が５０ｍｌの汚泥懸濁液とした。この汚泥懸濁液を２５℃ ６時間で曝気処理した後、２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、得られた上澄み液（処理水）を採取した。上澄み液（処理水）を０．４５μｍ孔のフィルターで濾過した後、ＴＯＣ（全有機炭素量）測定器で測定し、処理水中のＤＯＣ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃａｒｂｏｎ（溶存有機炭素）；以下、ＤＯＣと示す）を調べた。処理水中のＤＯ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ（溶存酸素量））は１〜２ｐｐｍであった。
ＤＯＣ分解率は以下の式１に従って算出し、各活性汚泥が排水中の有機物をどの程度分解したかを調べることにより、各活性汚泥の性能を評価した。ＤＯＣ分解率が高いほど、活性汚泥の排水処理性能が高いことを示す。
【００３０】
［式１］
ＤＯＣ分解率（％）＝（排水ＤＯＣ※−処理水ＤＯＣ）／排水ＤＯＣ※×１００
※排水ＤＯＣ：上記１．２）の製紙工場排水を２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上澄み液を０．４５μｍ孔のフィルター濾過した後、ＴＯＣ（全有機炭素量）測定器で測定した製紙工場排水中のＤＯＣ（溶存有機物）を指す。
【００３１】
その結果、表２に示したように、活性汚泥Ａ〜Ｃは、ＤＯＣ分解率（％）が５０％以上と高く、活性汚泥Ｄ，Ｅと比べて排水処理性能が高い活性汚泥であることが確認された。
【表２】
【００３２】
３．遺伝子診断
１）遺伝子診断用プライマーセットの作製
工程１：ＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析
上記１．１）にて調製した活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれるＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（Ｕｌｔｒａ ＣｌｅａｎTM Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて抽出した。このＤＮＡを鋳型として、上記１．３）の原核生物用プライマーセットを用いて、ＰＣＲによって活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれると推定される細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとし、それぞれ増幅させた。
ＰＣＲ反応液の組成は、１．２５ｕｎｉｔｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．） ｇｅｌａｔｉｎ、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌ プライマーおよび１０ｎｇの鋳型となるＤＮＡを含むものであり、このＰＣＲ反応液を用い、タッチダウン法によりＰＣＲの遺伝子増幅プログラムを行った。ＰＣＲの反応条件は以下のとおりであった。
反応条件：
ステップ１（１サイクル）：９５℃−５分
ステップ２（１９サイクル）：９５℃−１分、６２℃−１分、７２℃−１分
このとき６２℃のアニーリング温度を１サイクルごとに０．８℃ずつ下げていった。
ステップ３（９サイクル）：９５℃−１分、５２℃−１分、７２℃−１分
ステップ４（１サイクル１）：７２℃−１０分
【００３３】
増幅したＰＣＲ産物を、変性剤（８Ｍの尿素を含むアクリルアミド１００％）を含むアクリルアミドゲル（変性剤濃度幅２０〜５０％）中で電気泳動した。このうちシグナルの強いバンドをアクリルアミドゲルから切り出し、２００μＬのＴＥバッファーでＤＮＡを抽出した。
抽出したＤＮＡを鋳型として、原核生物用プライマーセットを用い、上記と同様の組成のＰＣＲ反応液を作成し、ＰＣＲによって１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲの反応は以下のとおりであった。
反応条件：
ステップ１（１サイクル）：９５℃−１０分
ステップ２（２５サイクル）：９５℃−１分、５４℃−１分、７２℃−１分
ステップ３（サイクル１）：７２℃−１０分
【００３４】
工程２：シークエンス解析
増幅したＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサー（３１００−Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ， ＡＢＩ‐ＰＲＩＳＭ）にて解析した。解析した各ＤＮＡ塩基配列の結果を基にデータベースを利用して相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）検索を行い、活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれると推定される細菌の近縁種を調べた。相同性検索はＮＣＢＩ（国際塩基配列データベース）ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を利用した。
その結果、活性汚泥Ａ〜Ｅにはそれぞれ表３に示された細菌が含まれている可能性が高いことが示された。各細菌に対する相同性が確認されたものについては相同性を示した。また、各細菌の塩基配列を配列表配列番号３〜６に示した（配列番号３：βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属、配列番号４：アゾアーカス属、配列番号５：βプロテアバクテリア綱バークホルデリア目、配列番号６：βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目）。
【００３５】
【表３】
【００３６】
工程３：遺伝子診断用プライマーセットの作製
βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属（以下、デクロロモナス属と示す場合がある）、アゾアーカス属およびβプロテアバクテリア綱バークホルデリア目（以下、バークホルデリア目と示す場合がある）において、それぞれ１６Ｓリボゾーム遺伝子上に存在する共通の塩基配列を増幅対象とするプライマーセットを参考文献２，３、５、６より選択し、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して作製した。作製した遺伝子診断用プライマーセットをそれぞれ表４に示した。
［参考文献５］
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［参考文献６］
Ｍａｒｉａ−Ｓｏｌｅｄａｄ Ｂｅｎｉｔｅｚ， ｅｔ． ａｌ．，
Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｉｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ： Ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ Ｓｏｉｌｂｏｒｎｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ （２００９） Ｐ９１５−９２４
ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
【００３７】
【表４】
【００３８】
２）活性汚泥の遺伝子診断
上記１．１）にて調製した活性汚泥Ａ〜ＥのＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（Ｕｌｔｒａ ＣｌｅａｎTM Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、活性汚泥からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、上記３．２）にて作製した遺伝子診断用プライマーセットを用いて、ＰＣＲによって活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれると推定される細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をそれぞれ増幅させた。
ＰＣＲ反応液の組成は、１．２５ｕｎｉｔｓＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．） ｇｅｌａｔｉｎ、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌ プライマーおよび１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含むものであり、このＰＣＲ反応液を用いて以下の条件でＰＣＲの反応を行った。
反応条件：
ステップ１（１サイクル）：９４℃−１分
ステップ２（３０サイクル）：９４℃−１分、６０℃−２分、 ７２℃−２分
ステップ３（１サイクル）：７２℃−１０分
【００３９】
上記の条件でＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動により増幅の有無を確認した。
遺伝子診断用プライマーセットａで遺伝子が増幅されれば１１５０ｂｐ、同プライマーセットｂで増幅されれば４００ｂｐ、同プライマーセットｃで増幅されれば８００ｂｐ、同プライマーセットｄで増幅されれば４００ｂｐ、同プライマーセットｅで増幅されれば１３００ｂｐ、同プライマーセットｆで増幅されれば４００ｂｐまたは同プライマーセットｇで増幅されれば４００ｂｐのサイズの遺伝子断片がそれぞれ確認される。
【００４０】
その結果、表５に示したように、いずれの活性汚泥も遺伝子診断用プライマーセットｅ、ｆ、ｇによって増幅されることから、アゾアーカス属とβプロテアバクテリア綱バークホルデリア目の細菌が含まれていると推定された。また、処理後の排水のＤＯＣ分解率（％）を５０％以上とできる、排水処理性能が特に高い活性汚泥Ａ〜Ｃは、遺伝子診断用プライマーセットａまたはｂによっても増幅されることから、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属の細菌も含まれていると推定された。
また、この結果より、遺伝子診断用プライマーセットａ〜ｃのいずれか一種以上を用いるＰＣＲによって、増幅される遺伝子断片を有する細菌を含む活性汚泥は、ＤＯＣ分解率（％）を５０％以上とできる、特に高い排水処理性能を有する活性汚泥といえることが示唆された。
【００４１】
【表５】
【実施例２】
【００４２】
排水処理性能の向上
上記実施例１において高い排水処理性能を有することが確認された活性汚泥Ａ〜Ｃのいずれかと活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅを組み合わせることにより、活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅにおける排水処理性能の向上を試みた。
即ち、実施例１と同様に、各製紙工場から採取した汚泥懸濁液をそれぞれ表６に記載の組合せ、絶乾重量比率で混合した後、２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、残存する沈殿を活性汚泥の混合物とした。これにそれぞれ実施例１と同様の製紙工場排水を加えて汚泥懸濁液を得た。ここで得られた汚泥懸濁液のＭＬＳＳは、排水処理性能を向上させたい活性汚泥ＤおよびＥのＭＬＳＳ（即ち、製紙工場ＤおよびＥにおける曝気槽のＭＬＳＳ）に合わせた（表６）。
この汚泥懸濁液を実施例１と同様に曝気処理し、上澄み液（処理水）を採取して濾過したもののＤＯＣを調べ、ＤＯＣ分解率を算出した。
【００４３】
【表６】
【００４４】
その結果、表６に示したように、活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅに、排水処理性能の高い活性汚泥Ａ〜Ｃのいずれかを添加することによって、活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅの排水処理性能を活性汚泥Ａ〜Ｃと同等にすることができた。
従ってこの結果より、活性汚泥Ａ〜Ｃは、排水処理性能があまり高くない活性汚泥において、排水処理性能の向上させるものとしても使用できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の排水処理性能の高い新規活性汚泥は、製紙工場排水処理用活性汚泥として広く販売することができる。また、他の活性汚泥に混合し、他の活性汚泥の排水処理性能を高めるための活性汚泥として販売することもできる。さらに、本発明の新規活性汚泥の生物学的な特徴を指標として、他の活性汚泥の排水処理性能を診断することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、排水処理性能の高い新規活性汚泥に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有するプライマーのセットを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅される遺伝子断片を有する、排水処理性能の高い新規活性汚泥に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、工業排水、家庭排水等の様々な排水や下水等を細菌の力で浄化する処理方法が広く利用されている。この処理方法には、生育に酸素を必要とする細菌を用いる好気性処理と、生育に酸素を必要としない細菌を用いる嫌気性処理とがあり、好気性処理技術である活性汚泥法は特に広範に用いられている代表的な技術である。
活性汚泥法は、細菌の酸化的有機物分解能を利用する生物学的な排水処理法であり、曝気槽において有機汚濁物質を主にバイオマスまたは二酸化炭素に変換することにより、排水中の汚濁物質を除去する方法である。さらに、この方法では、細菌のフロック形成能を利用し、活性汚泥バイオマスが沈殿槽において沈降分離されるため、処理後の上澄み液を処理水として得ることができるという利点もある。
【０００３】
排水に含まれる有機物は多様であり、その種類によっては細菌が容易に処理できない場合もあった。そこで、排水や、排水中に含まれる有機物の種類によって、活性汚泥に作用させる前に特定の細菌を作用させる前処理をしたり、微生物製剤を利用したり、使用する活性汚泥の種類や順番を変えたり、活性汚泥に含まれる細菌群を最適化する試み等が近年なされている。
例えば、アルカリゲネス属菌、シュウドモナス属菌、バチルス属菌、アエロバクター属菌、フラボバクター属菌などの好気性細菌で有機物を酸化分解する前処理をした後、活性汚泥を作用させる方法（特許文献１、２参照）や、オゾンや過酸化水素から生成したヒドロキシラジカルで有機物を酸化分解する方法（特許文献３参照）などが開示されている。しかし、これらの方法では、前処理のための新規な設備投資が必要となる。また、操業条件が煩雑になるため処理コストが高くなるという問題もある。
【０００４】
また、排水が硝化槽、脱窒槽、再曝気槽、沈殿槽等を経て処理される生物処理方法において、硝化槽にはニトロソモナス（Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ニトロソコッカス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ）等のアンモニア酸化細菌等を含む活性汚泥を収容し、脱窒槽にはアルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、アゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌等の脱窒活性に関する細菌を含有させた活性汚泥を収容する方法等も開示されている（例えば、特許文献４参照）。
しかし、活性汚泥に含有されるアゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌等の脱窒活性に関する細菌は、微生物製剤として活性汚泥に加えられるものである。微生物製剤は加えたからといって、必ずしも活性汚泥の排水処理性能を向上できるとは限らず、また効果が出ても最低数日間はかかる上に、コストが高いという問題もある。
【０００５】
アゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌は、嫌気的条件下で芳香族炭化水素を分解する能力を有することが知られており、ベンゼン等の揮発性芳香族炭化水素により汚染された環境を浄化するために利用することが開示されている（例えば、特許文献５参照）。
また、活性汚泥から単離したアゾアーカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属細菌の特定の菌株をセレン酸還元菌として、金属精錬工業排水、ガラス工業排水、石炭または石油系燃焼非ガス処理プロセスからの排水等、セレン化合物を多く含む排水の処理に利用できること等も開示されており（例えば、特許文献６〜８参照）、この菌株を活性汚泥中に添加し、この菌株がどの程度含まれるかをＦＩＳＨ法により定量する方法等も開示されている（たとえば、特許文献９参照）。しかし、この菌株も微生物製剤と同様に利用されるだけであり、必ずしも排水処理において効果があるとはいえなかった。
【０００６】
製紙工場では、ＫＰ系排水、ＤＩＰ系排水、マシン系排水などあるが、それらの中で主として、ＫＰ系排水とＤＩＰ系排水の二種類の排水処理に活性汚泥法が利用されている。ＫＰ系排水には、リグニン、リグニン分解物、糖や有機酸等を主成分とする漂白系排水と、メタノール等を主成分とするドレン系排水があり、ＤＩＰ系排水はリグニン、デンプン、脂肪酸系界面活性剤や高級アルコール系界面活性剤を主成分とするものである。このうち、特に漂白系排水は、ドレン系排水やＤＩＰ系排水と比較して分解されにくい。
製紙工場ごとにこれらの排水の比率が異なっており、この排水の処理は、各工場の経験則に負うところが大きく、排水の生分解性と活性汚泥中の細菌の関係についての知見はほとんどないのが現状である。しかし、いずれの製紙工場においても、より安価で簡便かつ確実にこれらの排水が処理できる、排水処理性能の高い新規活性汚泥の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２１０６９２号公報
【特許文献２】特開２００６−０５１４１４号公報
【特許文献３】特開２００１−２３９２８０号公報
【特許文献４】特開２００９−１３１８４８号公報
【特許文献５】特開２００７−２２２００４号公報
【特許文献６】特開２００１−３４７２９２号公報
【特許文献７】特開２００２−１８４８２号公報
【特許文献８】特開２００１−１０４９８９号公報
【特許文献９】特開２００１−３４６５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、排水処理性能の高い新規活性汚泥の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、複数の製紙工場から採取した活性汚泥を比較することで排水処理性能の高い新規活性汚泥を特定するとともに、この排水処理性能の高い新規活性汚泥を遺伝子診断することにより、排水処理性能の高い新規活性汚泥の生物学的な特徴を見出した。さらに、該活性汚泥を作用させることにより、高効率に製紙工場排水を処理できる方法を確立するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、次の（１）〜（７）に示される活性汚泥、該活性汚泥を作用させることによる製紙工場排水の処理方法等に関する。
（１）次のａ〜ｃから選択される少なくとも１組のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（２）次のｂおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（３）次のａおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（４）次のｂのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
（５）遺伝子断片がβプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目のデクロロモナス属に属する細菌の遺伝子またはアゾアーカス属に属する細菌の遺伝子である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の活性汚泥。
（６）製紙工場排水に上記（１）〜（５）のいずれかに記載の活性汚泥を作用させる製紙工場排水の処理方法。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の活性汚泥を絶乾重量比率が５％以上となるように、他の活性汚泥に混合し、製紙工場排水に作用させる上記（６）に記載の製紙工場排水の処理方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の排水処理性能の高い新規活性汚泥により、製紙工場排水を高効率に処理することが可能となった。本発明の該活性汚泥は、他の活性汚泥と混合し、他の活性汚泥の排水処理性能を高めるために利用することもできる。また、本発明の新規活性汚泥の生物学的な特徴を指標として、他の活性汚泥の排水処理性能を診断することも可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「活性汚泥」は、次の１．〜４．のいずれかの生物学的特徴を有する「活性汚泥」であれば、いずれのものも含まれる。
１．次のａ〜ｃから選択される少なくとも１組のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
２．次のｂおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
３．次のａおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
４．次のｂのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥
【００１３】
本発明のａ〜ｃのプライマーセットには、以下のものが挙げられる。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、プライマーを特定している配列番号に示される塩基配列を有するプライマーであればよく、該塩基配列からなるプライマーであっても良い。
【００１４】
本発明の「ポリメラーゼ連鎖反応」には、ＰＣＲ、タッチダウン法によるＰＣＲ等、従来知られているいずれの「ポリメラーゼ連鎖反応」も含まれる。「活性汚泥」に含まれる遺伝子断片を鋳型として、以下のａ〜ｃのプライマーセットを用いて行う「ポリメラーゼ連鎖反応」であれば良い。
なお、この「ポリメラーゼ連鎖反応」は、本発明の活性汚泥以外の活性汚泥の排水処理性能の診断のためにも使用することができる。
【００１５】
本発明のプライマーセットａまたはプライマーセットｂを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片は、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌の遺伝子であることが好ましく、さらに、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌の１６Ｓリボゾーム遺伝子であることが好ましい。
また、プライマーセットｃを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片は、アゾアーカス属に属する細菌の遺伝子であることが好ましく、さらに、アゾアーカス属に属する細菌の１６Ｓリボゾーム遺伝子であることが好ましい。
【００１６】
βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌とアゾアーカス属に属する細菌は易分解有機物から難分解有機物まで幅広く分解できることが知られている（参考文献１〜３参照）。また、これらはいずれも通性嫌気性細菌であり、呼吸のときの電子受容体として酸素だけではなく硫酸イオン、硝酸イオン、塩素酸イオンを利用することが知られている（参考文献１）。
排水処理において利用される曝気槽では、経済的な理由から空気または酸素の曝気量を抑えていることが多く、曝気槽内において、部分的な酸素不足が起きていることがある。しかし、これらの細菌は酸素が不足していても、排水中に比較的多く存在する硫酸イオン、硝酸イオン、塩素酸イオンを電子受容体として利用しながら排水中有機物を分解することが可能である。
従って、本発明の「活性汚泥」が有する生物学的特徴が、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属に属する細菌またはアゾアーカス属に属する細菌のどちらか１種以上が本発明の「活性汚泥」中に存在することによる生物学的特長であればさらに好ましい。
［参考文献１］
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［参考文献２］
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［参考文献３］
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ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
【００１７】
本発明のこれらの「活性汚泥」はどのような排水の処理にも利用できるが、特に製紙工場排水を高効率に処理するために利用することが好ましい。特に、セルロース分解物由来の糖類や有機酸、リグニン分解物由来の芳香族や塩素化有機物など、製紙工場排水中の易分解有機物から難分解有機物までを幅広く、かつ高効率に分解できる「活性汚泥」であることが好ましい。
【００１８】
本発明の「製紙工場排水の処理方法」は、本発明の「活性汚泥」を「製紙工場排水」に作用させる工程を含む「製紙工場排水の処理方法」であれば、従来知られているいずれの方法も利用することができる。
例えば、本発明の「活性汚泥」を収容した曝気槽に「製紙工場排水」を加えることで作用させてもよい、「製紙工場排水」が入った容器に、本発明の「活性汚泥」を加えることで作用させても良い。
ここで「作用させる」とは、「活性汚泥」と「製紙工場排水」を接触させることにより、「製紙工場排水」中に含まれる物質を分解させることをいう。
【００１９】
本発明の「製紙工場排水」は、製紙工場において紙の製造過程において発生するいずれの排水も含まれ、リグニン、リグニン分解物、糖や有機酸等を主成分とする漂白系排水またはメタノール等を主成分とするドレン系排水であるＫＰ系排水や、リグニン、デンプン、脂肪酸系界面活性剤や高級アルコール系界面活性剤を主成分とするＤＩＰ系排水が挙げられる。これらの一種類からなる排水であってもよく、これらが複数混合された排水であっても良く、特に限定されるものではない。
ドレン系排水やＤＩＰ系排水と比較して、漂白系排水は分解されにくいが、本発明の「活性汚泥」は漂白系排水に対しても高い分解性能を発揮することができる。
【００２０】
また、本発明の「活性汚泥」は、排水処理性能が高いため、高効率に排水処理を行うことができる。従来知られている微生物製剤と異なり、「活性汚泥」としてもともと排水に馴化されているため、どのような排水であっても、例えば、異なる製紙工場で発生した製紙工場排水に対しても馴化に時間がかからないためだと予測される。また、微生物製剤と比較して、本発明の「活性汚泥」は細菌種類の多様性があることも、理由の一つであると考えられる。
【００２１】
本発明の「活性汚泥」はそのまま利用することもでき、形態はとくに限定されるものではないが、余剰汚泥（汚泥濃度が１％〜５％）として利用されることが好ましい。
本発明の「活性汚泥」は、余剰汚泥の形態でも、常温、曝気無しで輸送することができ、「活性汚泥」の性能は維持されたままである。また、本発明の「活性汚泥」は、自然乾燥あるいは凍結乾燥してもよく、これらにおいても「活性汚泥」の性能は維持されたままである。
【００２２】
本発明の「活性汚泥」は、そのまま製紙工場排水に作用させることもできるが、他の活性汚泥に混合し、製紙工場排水に作用させることもできる。この際に、本発明の「活性汚泥」は、混合する他の活性汚泥に対し、絶乾重量比率が５％以上となるように混合すればよく、さらに１０％以上、より好ましくは２０％以上となるように混合すること好ましい。
【００２３】
本発明の「製紙工場排水の処理方法」において、曝気槽や返送汚泥ピットなどで本発明の「活性汚泥」を「製紙工場排水」に作用させることもできる。
曝気槽を使用する場合、ＭＬＳＳ（ｍｉｘｅｄ ｌｉｑｕｏｒ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄｓ（活性汚泥浮遊物質量）；以下、ＭＬＳＳと示す）は３０００ｍｇ／Ｌ〜１００００ｍｇ／Ｌとなるように管理することが好ましい。３０００ｍｇ／Ｌより少ないと排水処理が不十分となり、１００００ｍｇ／Ｌより多くしても汚泥性能は上がらず、汚泥の単位量あたりの性能が低くなり不経済となる。
その他の活性汚泥（曝気槽）の運転および管理条件については通常通りであれば良く、例えば、ｐＨは７〜８、温度は３５℃〜４０℃、ＤＯ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ（溶存酸素量）；以下、ＤＯと示す）は１ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌでコントロールすればよい。
本発明の排水処理性能の高い新規活性汚泥を利用することにより、高効率に排水を処理することができ、処理効率を向上することもできる。
【００２４】
以下に、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
活性汚泥の評価
製紙工場排水の処理における性能を調べるとともに、遺伝子診断により各活性汚泥に含まれる細菌を推定することで各活性汚泥の評価を行った。
１．材料
１）活性汚泥
製紙工場Ａ〜Ｅにおいて、製紙工場排水を処理するための曝気槽から汚泥懸濁液５０ｍｌを採取した。これを２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、残存した沈殿をそれぞれ本発明の実施例に用いる活性汚泥Ａ〜Ｅとした。製紙工場Ａ〜Ｅにおいて、処理されている排水の種類と曝気槽におけるＭＬＳＳを表１に示した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
２）製紙工場排水
製紙工場Ｆで採取した漂白系排水（Ｌ材）を本発明の実施例に用いる製紙工場排水とした。
【００２８】
３）原核生物用プライマーセット
配列表配列番号１および同配列番号２に示される塩基配列からなる原核生物用プライマーセット（参考文献４、参照）を（オペロンバイオテクノロジー株式会社）に委託して作製した。この原核生物用プライマーセットは、１６Ｓリボゾーム遺伝子上に存在する、全ての原核生物共通の塩基配列を増幅対象とするものである。
［参考文献４］
石井浩介、中川達功、福井学
微生物生態学への変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法の応用
Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｖｏｌ．１５， Ｎｏ．１， ５９−７３， ２０００
【００２９】
２．活性汚泥の性能評価
上記１．１）にて調製した活性汚泥Ａ〜Ｅに、それぞれ上記１．２）の排水を加えて全量が５０ｍｌの汚泥懸濁液とした。この汚泥懸濁液を２５℃ ６時間で曝気処理した後、２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、得られた上澄み液（処理水）を採取した。上澄み液（処理水）を０．４５μｍ孔のフィルターで濾過した後、ＴＯＣ（全有機炭素量）測定器で測定し、処理水中のＤＯＣ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃａｒｂｏｎ（溶存有機炭素）；以下、ＤＯＣと示す）を調べた。処理水中のＤＯ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ（溶存酸素量））は１〜２ｐｐｍであった。
ＤＯＣ分解率は以下の式１に従って算出し、各活性汚泥が排水中の有機物をどの程度分解したかを調べることにより、各活性汚泥の性能を評価した。ＤＯＣ分解率が高いほど、活性汚泥の排水処理性能が高いことを示す。
【００３０】
［式１］
ＤＯＣ分解率（％）＝（排水ＤＯＣ※−処理水ＤＯＣ）／排水ＤＯＣ※×１００
※排水ＤＯＣ：上記１．２）の製紙工場排水を２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上澄み液を０．４５μｍ孔のフィルター濾過した後、ＴＯＣ（全有機炭素量）測定器で測定した製紙工場排水中のＤＯＣ（溶存有機物）を指す。
【００３１】
その結果、表２に示したように、活性汚泥Ａ〜Ｃは、ＤＯＣ分解率（％）が５０％以上と高く、活性汚泥Ｄ，Ｅと比べて排水処理性能が高い活性汚泥であることが確認された。
【表２】
【００３２】
３．遺伝子診断
１）遺伝子診断用プライマーセットの作製
工程１：ＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析
上記１．１）にて調製した活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれるＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（Ｕｌｔｒａ ＣｌｅａｎTM Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて抽出した。このＤＮＡを鋳型として、上記１．３）の原核生物用プライマーセットを用いて、ＰＣＲによって活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれると推定される細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとし、それぞれ増幅させた。
ＰＣＲ反応液の組成は、１．２５ｕｎｉｔｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．） ｇｅｌａｔｉｎ、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌ プライマーおよび１０ｎｇの鋳型となるＤＮＡを含むものであり、このＰＣＲ反応液を用い、タッチダウン法によりＰＣＲの遺伝子増幅プログラムを行った。ＰＣＲの反応条件は以下のとおりであった。
反応条件：
ステップ１（１サイクル）：９５℃−５分
ステップ２（１９サイクル）：９５℃−１分、６２℃−１分、７２℃−１分
このとき６２℃のアニーリング温度を１サイクルごとに０．８℃ずつ下げていった。
ステップ３（９サイクル）：９５℃−１分、５２℃−１分、７２℃−１分
ステップ４（１サイクル１）：７２℃−１０分
【００３３】
増幅したＰＣＲ産物を、変性剤（８Ｍの尿素を含むアクリルアミド１００％）を含むアクリルアミドゲル（変性剤濃度幅２０〜５０％）中で電気泳動した。このうちシグナルの強いバンドをアクリルアミドゲルから切り出し、２００μＬのＴＥバッファーでＤＮＡを抽出した。
抽出したＤＮＡを鋳型として、原核生物用プライマーセットを用い、上記と同様の組成のＰＣＲ反応液を作成し、ＰＣＲによって１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲの反応は以下のとおりであった。
反応条件：
ステップ１（１サイクル）：９５℃−１０分
ステップ２（２５サイクル）：９５℃−１分、５４℃−１分、７２℃−１分
ステップ３（サイクル１）：７２℃−１０分
【００３４】
工程２：シークエンス解析
増幅したＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサー（３１００−Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ， ＡＢＩ‐ＰＲＩＳＭ）にて解析した。解析した各ＤＮＡ塩基配列の結果を基にデータベースを利用して相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）検索を行い、活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれると推定される細菌の近縁種を調べた。相同性検索はＮＣＢＩ（国際塩基配列データベース）ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を利用した。
その結果、活性汚泥Ａ〜Ｅにはそれぞれ表３に示された細菌が含まれている可能性が高いことが示された。各細菌に対する相同性が確認されたものについては相同性を示した。また、各細菌の塩基配列を配列表配列番号３〜６に示した（配列番号３：βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属、配列番号４：アゾアーカス属、配列番号５：βプロテアバクテリア綱バークホルデリア目、配列番号６：βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目）。
【００３５】
【表３】
【００３６】
工程３：遺伝子診断用プライマーセットの作製
βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属（以下、デクロロモナス属と示す場合がある）、アゾアーカス属およびβプロテアバクテリア綱バークホルデリア目（以下、バークホルデリア目と示す場合がある）において、それぞれ１６Ｓリボゾーム遺伝子上に存在する共通の塩基配列を増幅対象とするプライマーセットを参考文献２，３、５、６より選択し、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託して作製した。作製した遺伝子診断用プライマーセットをそれぞれ表４に示した。
［参考文献５］
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｌｏｙ， ｅｔ． ａｌ．，
１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｇｅｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｏｒｄｅｒ “Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ” （２００５） Ｐ１３７３−１３８６
ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
［参考文献６］
Ｍａｒｉａ−Ｓｏｌｅｄａｄ Ｂｅｎｉｔｅｚ， ｅｔ． ａｌ．，
Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｉｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ： Ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ Ｓｏｉｌｂｏｒｎｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ （２００９） Ｐ９１５−９２４
ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
【００３７】
【表４】
【００３８】
２）活性汚泥の遺伝子診断
上記１．１）にて調製した活性汚泥Ａ〜ＥのＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（Ｕｌｔｒａ ＣｌｅａｎTM Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、活性汚泥からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、上記３．２）にて作製した遺伝子診断用プライマーセットを用いて、ＰＣＲによって活性汚泥Ａ〜Ｅに含まれると推定される細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をそれぞれ増幅させた。
ＰＣＲ反応液の組成は、１．２５ｕｎｉｔｓＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．） ｇｅｌａｔｉｎ、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌ プライマーおよび１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含むものであり、このＰＣＲ反応液を用いて以下の条件でＰＣＲの反応を行った。
反応条件：
ステップ１（１サイクル）：９４℃−１分
ステップ２（３０サイクル）：９４℃−１分、６０℃−２分、 ７２℃−２分
ステップ３（１サイクル）：７２℃−１０分
【００３９】
上記の条件でＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動により増幅の有無を確認した。
遺伝子診断用プライマーセットａで遺伝子が増幅されれば１１５０ｂｐ、同プライマーセットｂで増幅されれば４００ｂｐ、同プライマーセットｃで増幅されれば８００ｂｐ、同プライマーセットｄで増幅されれば４００ｂｐ、同プライマーセットｅで増幅されれば１３００ｂｐ、同プライマーセットｆで増幅されれば４００ｂｐまたは同プライマーセットｇで増幅されれば４００ｂｐのサイズの遺伝子断片がそれぞれ確認される。
【００４０】
その結果、表５に示したように、いずれの活性汚泥も遺伝子診断用プライマーセットｅ、ｆ、ｇによって増幅されることから、アゾアーカス属とβプロテアバクテリア綱バークホルデリア目の細菌が含まれていると推定された。また、処理後の排水のＤＯＣ分解率（％）を５０％以上とできる、排水処理性能が特に高い活性汚泥Ａ〜Ｃは、遺伝子診断用プライマーセットａまたはｂによっても増幅されることから、βプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目デクロロモナス属の細菌も含まれていると推定された。
また、この結果より、遺伝子診断用プライマーセットａ〜ｃのいずれか一種以上を用いるＰＣＲによって、増幅される遺伝子断片を有する細菌を含む活性汚泥は、ＤＯＣ分解率（％）を５０％以上とできる、特に高い排水処理性能を有する活性汚泥といえることが示唆された。
【００４１】
【表５】
【実施例２】
【００４２】
排水処理性能の向上
上記実施例１において高い排水処理性能を有することが確認された活性汚泥Ａ〜Ｃのいずれかと活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅを組み合わせることにより、活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅにおける排水処理性能の向上を試みた。
即ち、実施例１と同様に、各製紙工場から採取した汚泥懸濁液をそれぞれ表６に記載の組合せ、絶乾重量比率で混合した後、２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、残存する沈殿を活性汚泥の混合物とした。これにそれぞれ実施例１と同様の製紙工場排水を加えて汚泥懸濁液を得た。ここで得られた汚泥懸濁液のＭＬＳＳは、排水処理性能を向上させたい活性汚泥ＤおよびＥのＭＬＳＳ（即ち、製紙工場ＤおよびＥにおける曝気槽のＭＬＳＳ）に合わせた（表６）。
この汚泥懸濁液を実施例１と同様に曝気処理し、上澄み液（処理水）を採取して濾過したもののＤＯＣを調べ、ＤＯＣ分解率を算出した。
【００４３】
【表６】
【００４４】
その結果、表６に示したように、活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅに、排水処理性能の高い活性汚泥Ａ〜Ｃのいずれかを添加することによって、活性汚泥Ｄまたは活性汚泥Ｅの排水処理性能を活性汚泥Ａ〜Ｃと同等にすることができた。
従ってこの結果より、活性汚泥Ａ〜Ｃは、排水処理性能があまり高くない活性汚泥において、排水処理性能の向上させるものとしても使用できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の排水処理性能の高い新規活性汚泥は、製紙工場排水処理用活性汚泥として広く販売することができる。また、他の活性汚泥に混合し、他の活性汚泥の排水処理性能を高めるための活性汚泥として販売することもできる。さらに、本発明の新規活性汚泥の生物学的な特徴を指標として、他の活性汚泥の排水処理性能を診断することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のａ〜ｃから選択される少なくとも１組のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
【請求項２】
次のｂおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
【請求項３】
遺伝子断片がβプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目のデクロロモナス属に属する細菌の遺伝子またはアゾアーカス属に属する細菌の遺伝子である請求項１または２に記載の活性汚泥。
【請求項４】
製紙工場排水に請求項１〜３のいずれかに記載の活性汚泥を作用させる製紙工場排水の処理方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の活性汚泥を絶乾重量比率が５％以上となるように、他の活性汚泥に混合し、製紙工場排水に作用させる請求項４に記載の製紙工場排水の処理方法。
【請求項１】
次のａ〜ｃから選択される少なくとも１組のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ａ．配列表配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
【請求項２】
次のｂおよびｃのプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される遺伝子断片を有する活性汚泥。
ｂ．配列表配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
ｃ．配列表配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと配列表配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
【請求項３】
遺伝子断片がβプロテアバクテリア綱ロドサイクルス目のデクロロモナス属に属する細菌の遺伝子またはアゾアーカス属に属する細菌の遺伝子である請求項１または２に記載の活性汚泥。
【請求項４】
製紙工場排水に請求項１〜３のいずれかに記載の活性汚泥を作用させる製紙工場排水の処理方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の活性汚泥を絶乾重量比率が５％以上となるように、他の活性汚泥に混合し、製紙工場排水に作用させる請求項４に記載の製紙工場排水の処理方法。
【公開番号】特開２０１２−２１７３７７（Ｐ２０１２−２１７３７７Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８５４５７（Ｐ２０１１−８５４５７）
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（０００１５３２８１）株式会社日本紙パルプ研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（０００１５３２８１）株式会社日本紙パルプ研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
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