接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤
癌をはじめとする血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患を治療することが求められている。ＳＣＧＦを有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤を用いることにより、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんなどの血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などを治療することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、造血幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＳＣＧＦと称す）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤およびその用途に関する。
【背景技術】
ＳＣＧＦは慢性骨髄性白血病の患者から樹立された骨髄球系細胞株ＫＰＢ−Ｍ１５より分離同定された因子である（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ．，Ｏｈｋｕｂｏ Ｔ，Ｆｕｋｕｄａ Ｍ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８７；４７：５０２５−５０３０．）。ＳＣＧＦはＮ型糖鎖を持たない２９−ｋＤａの蛋白であり、Ｃ型レクチンのファミリーに属する（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ａ，Ｓｅｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７；９４：７５７７−７５８２．）。ＳＣＧＦ遺伝子はｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析から骨ならびに骨髄で発現していることが示されている（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ，Ｙａｎｏ Ｋ，Ｋａｇａｍｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｊ．２００１；２：３０７−３１５．）。ＳＣＧＦは単独では造血系細胞のコロニー形成促進活性を有していないが、エリスロポエチンあるいはＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ−ｆａｔｏｒ）と組み合わせると、赤芽球系や、顆粒球・マクロファージ系のコロニー形成促進活性が観察される（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ａ，Ｓｅｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７；９４：７５７７−７５８２．）。また、同様にＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）と組み合わせることで、ＡＣ１３３陽性の前駆細胞の血管内皮細胞への分化が促進される（Ｇｅｈｌｉｎｇ ＵＭ，Ｅｒｇｕｎ Ｓ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０００；９５：３１０６−３１１２．）。
一方、骨髄移植に伴う造血系の回復と並行して血清中のＳＣＧＦ量が増加することも観察されている（Ｉｔｏ Ｃ，Ｓａｔｏ Ｈ，Ａｎｄｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００３；３１：３９１−３９８．）。またＲＴ−ＰＣＲを用いた解析から骨髄中のＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ３４陰性かつＣＤ３３陽性の細胞ではＳＣＧＦが生産されているが、ストローマ細胞や末梢血の造血系細胞では生産されないことも見出されている（Ｉｔｏ Ｃ，Ｓａｔｏ Ｈ，Ａｎｄｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００３；３１：３９１−３９８．）。従って、血清中のＳＣＧＦの増加は造血幹細胞の増加に伴い誘導されると推定される。このようにＳＣＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性や発現部位に関してはある程度明らかにされているが、生体内での働きについては現在まで解明されていない。
近年、種々の成体内組織において、幹細胞、前駆細胞の存在が認められ、これら幹細胞、前駆細胞が病理学的／生理学的な組織・器官の再生を司っていると考えられるようになってきた。例えば、悪性腫瘍の発生に血管形成が関与していることや（Ｓｕｓｓｍａｎ ＬＫ，Ｕｐａｌａｋａｌｉｎ ＪＮ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＭＪ，Ｋｏｃｈｅｒ Ｏ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ ＬＥ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；２：２５５−６．）、動脈硬化における血管閉塞に骨髄幹細胞が関与していることが示されており（Ｓａｔａ Ｍ，Ｓａｉｕｒａ Ａ，Ｋｕｎｉｓａｔｏ Ａ，Ｔｏｊｏ Ａ，Ｏｋａｄａ Ｓ，Ｔｏｋｕｈｉｓａ Ｔ，Ｈｉｒａｉ Ｈ，Ｍａｋｕｕｃｈｉ Ｍ，Ｈｉｒａｔａ Ｙ，ａｎｄ Ｎａｇａｉ Ｒ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００２；８：４０３−９．）、このような幹細胞の末梢血中への動員を抑制することができれば動脈硬化等の疾患が治療できると考えられる。しかし、このような幹細胞の末梢血中への動員を阻害する因子は現時点では見出されていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ＳＣＧＦを有効成分として含有する骨髄幹細胞または前駆細胞などの接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤およびその用途を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤。
（２） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である上記（１）記載の薬剤。
（３） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有する上記（１）記載の薬剤。
（４） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、化学修飾された造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の薬剤。
（５） 化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、上記（４）記載の薬剤。
（６） 接着性を有する細胞が成体多能性幹細胞である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の薬剤。
（７） 接着性を有する細胞が骨髄中の接着性を有する多能性幹細胞または前駆細胞である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の薬剤。
（８） 前駆細胞が、血管前駆細胞、単球・顆粒球共通前駆細胞および平滑筋前駆細胞からなる群から選ばれる細胞である、上記（７）記載の薬剤。
（９） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成阻害剤。
（１０） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする顆粒球・単球新生阻害剤。
（１１） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗腫瘍剤。
（１２） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗炎症剤。
（１３） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする動脈硬化治療剤。
（１４） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成の異常により病態が進行する疾患の治療剤。
（１５） 血管形成の異常により病態が進行する疾患が、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんからなる群から選ばれる疾患である、上配（１４）記載の治療剤。
（１６） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を投与することを特徴とする、接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する方法。
（１７） 接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤を製造するための造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）の使用。
本発明は造血幹細胞増殖因子（以下、ＳＣＧＦと称す）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤に関する。
ＳＣＧＦとしては、
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド
（４）配列番号１記載で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの自然に生ずるアレル変異体
などがあげられる。
本発明のポリペプチドは、造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドである。上記（２）〜（４）に記載のポリペプチドは、上記（１）記載のポリペプチドと実質的に同一の活性を有していればよく、性質的に同一であれば、活性の強度の程度、分子量などの量的要素は（１）記載のポリペプチドと異なっていてもよい。
配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドが造血幹細胞増殖活性を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、ＳＣＧＦが、配列番号１記載のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列からなるとは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）によって、ＳＣＧＦとのアミノ酸配列の相同性を検索した際に、６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質があげられる。ここで該タンパク質はＳＣＧＦのアミノ酸配列と比較して、その配列中のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入のいずれによって変化していてもよい。
また本発明に用いられるＳＣＧＦは、化学修飾されていてもよい。化学修飾の方法としては、例えばＷＯ００／５１６２６に記載の方法等があげられ、ＳＣＧＦをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等で修飾したものも本発明に用いられるＳＣＧＦに包含される。
本発明における接着性を有する細胞とは、骨髄、血管などの組織または細胞に対して接着する性質を有する細胞のことをいい、具体的には成体多能性幹細胞があげられる。成体多能性幹細胞とは、生体内の各組織に存在し、種々の成熟細胞になることが可能な幹細胞をいう。
また、骨髄中に存在する接着性の多能性幹細胞、前駆細胞なども本発明の接着性を有する細胞として包含される。前駆細胞としては、血管前駆細胞（以下、ＥＰＣとも称す）、単球・顆粒球共通前駆細胞、平滑筋前駆細胞などがあげられる。
接着性を有する細胞の末梢血への動員は、末梢血由来細胞を遠心分離により回収後、接着性細胞を培養するための培養皿を用いて接着細胞のみを選択的に培養することで同定することができる。
上述した接着性を有する細胞は組織の再生・修復に重要な役割を果たすとともに、悪性腫瘍での血管形成促進、血管の閉塞などの病理に関係している。したがって、本発明の薬剤は接着性を有する細胞を末梢血中への動員を阻害することにより、血管形成阻害剤、単球・顆粒球新生阻害剤、組織の炎症または腫瘍形成などを抑制する抗炎症剤または抗腫瘍剤、血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患の治療剤として用いることができる。血管形成の異常により病態が進行する疾患としては、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾せんなどがあげられる。
本発明の薬剤は、治療剤として単独で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、筋肉内、皮下、皮内もしくは静脈内等の非経口投与等があげられ、好ましくは筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与等があげられる。
投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、ドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等があげられる。
錠剤等の固形製剤の製造には、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与に適当な製剤としては、注射剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤の製造にあたっては、例えば水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤はＳＣＧＦそのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつＳＣＧＦを微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等があげられる。ＳＣＧＦおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
実施例１ マトリゲルの移植により誘発される血管形成に対するＳＣＧＦの効果
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア社製）の皮下に５００μｌのマトリゲルを移植し、毎日５μｇのヒトＳＣＧＦを７日間投与した。７日後、移植したマトリゲルを摘出し４％のパラホルムアルデヒドで固定した後に、血管内皮のマーカーである抗マウスＣＤ３１抗体で染色を行った。
その結果、対照群と比較してヒトＳＣＧＦを投与したマウスでは顕著に血管形成が抑制されることが観察された。この結果はＳＣＧＦに血管形成を阻害する活性があることを示している。
実施例２ ＳＣＧＦによるガンの生着阻害
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に１．５×１０６のＢ１６メラノーマ細胞を移植し、毎日５μｇのヒトＳＣＧＦを２１日間投与し続けた。
その結果、ＳＣＧＦを投与しない対照群と比較してヒトＳＣＧＦを投与したマウスでは顕著に腫瘍の形成が阻害された。この結果はＳＣＧＦが血管形成阻害を介して、ガン細胞の生着を阻害する活性があることを示している。
実施例３ ＳＣＧＦによる骨髄単核細胞の遊走
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをペントバルビタールで麻酔後、大腿骨から骨髄細胞を抽出した。次に、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０３８ｓ（シグマ社製）を用いた密度勾配遠心分離により、骨髄単核細胞を取得した。骨髄単核細胞のＳＣＧＦに対する走化性を、ＢｏｙｄｅｎチャンバーおよびＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー（ともにＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔｅｒ社製）を用いて解析した。
上部のチャンバーには、１００μｌの培養液にけん濁した１×１０６の骨髄単核細胞を注入し、下部チャンバーには、ＳＣＧＦを含む培養液６００μｌを注入した。境界部位には直径３μｍの穴を持つ膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａ社製）で仕切った。骨髄単核細胞の走化性は３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした後に、下部に遊走した骨髄単核細胞の数を血球測定板により測定した。結果を表１に示す。
その結果、ＳＣＧＦは濃度依存的に顕著に骨髄単核細胞を遊走させることが示された。
実施例４ ＥＰＣの末梢血中への動員に及ぼすＳＣＧＦの影響（１）
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに毎日５μｇのヒトＳＣＧＦをそれぞれ１日間、４日間、７日間投与した。投与終了後、対象のマウスをペントバルビタールで麻酔し、１０００Ｕ／ｍｌのヘパリンでコートした注射針で心臓より全血を採取した。同時に、ヒトＳＣＧＦを投与しないマウスの血液も採取した。取得した血液の一部は溶血後、実施例５に示すＦＡＣＳ解析に使用し、残りの血液は以下のＥＰＣの培養による解析に用いた。
培養による解析は、以下のように行った。
血液にＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０８３（シグマ社製）を用いて単核細胞を取得した。マウス１匹中の全末梢血由来単核細胞を５００μｌの体積になるように濃縮した後、ラット由来のビトロネクチン（シグマ社製）でコートしたＬａｂ Ｔｅｋ ４ウエルのスライド・ガラス（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社）上に投入して７日間３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで培養を行った。得られた細胞をアセチルＬＤＬ−ＤｉＩ標識（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）およびｉｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社製）で染色し、ＥＰＣを蛍光顕微鏡下で同定した。結果を表２に示す。
その結果、ＳＣＧＦの投与日数に比例して末梢血中のＥＰＣの数が減少していることが明らかとなった。
実施例５ ＥＰＣの末梢血中への動員に及ぼすＳＣＧＦの影響（２）
マウス・ラットｆｌｋ１およびマウスＣＤ３４はともにＥＰＣの代表的な表面マーカーである。抗マウス・ラットｆｌｋ１モノクローナル抗体および抗マウスＣＤ３４抗体を用いてＥＰＣのＦＡＣＳによる解析を行なった。
実施例７で取得した血液を溶血後、１％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、０．０１％ ＮａＮ３を含むＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で洗浄し、マウス血清中で３０分間氷冷した。該細胞をｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）で標識した抗マウス・ラットｆｌｋ１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）またはビオチン標識した抗マウスＣＤ３４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて染色した。
該抗体で染色した細胞はＦａｃｓｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて解析を行った。結果を表３に示す。
その結果、ＥＰＣを含むＣＤ３４陽性細胞およびＦｌｋ１陽性細胞がＳＣＧＦの投与により顕著に減少することが明らかとなった。
実施例６ 血管内皮系細胞の増殖に及ぼすＳＣＧＦの効果
ヒト微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；以下、ＨＭＶＥＣｓと称す）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；以下、ＨＵＶＥＣｓと称す）に比べて未熟な血管前駆細胞を多く含んでいると考えられている。
ＨＵＶＥＣｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）およびＨＭＶＥＣｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を、それぞれフィブロネクチンでコートした培養皿上でＥＧＭＭＶ２増殖因子カクテル（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）、ヒトＳＣＧＦおよび５％ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を含むＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を用い、３７℃７日間５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、ＭＴＳアッセイにより細胞密度を測定した。結果を表４に示す。
その結果、ＨＭＶＥＣｓではＳＣＧＦ濃度に依存して細胞の増殖が促進されたが、ＨＵＶＥＣｓではＳＣＧＦは細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。
この結果は、ＳＣＧＦによる血管形成阻害が血管内皮細胞の増殖を阻害することによらないことを示している。
実施例７ ＳＣＧＦの末梢血単核細胞の増殖に及ぼす影響
単核細胞は以下の方法で取得した。なお、単核細胞には、骨髄幹細胞、ＥＰＣなどが含まれている。
採取したヒト末梢血から、シグマ社のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７を用いた密度勾配遠心法により単核細胞を１×１０７個取得した。得られた単核細胞を、フィブロネクチンでコートした培養皿上でＥＧＭＭＶ２増殖因子カクテル（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）およびヒトＳＣＧＦおよび５％ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を含むＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）で３７℃４日間培養した後、ＭＴＳアッセイにより細胞密度を測定した。結果を表５に示す。
その結果、ＳＣＧＦは単核細胞に対しては顕著な細胞増殖促進または抑制活性を持たないことが示された。
このことから、ＳＣＧＦの血管形成阻害作用は、幹細胞や血管前駆細胞の増殖を阻害することに起因するのではなく、実施例４および５に示すように幹細胞や血管前駆細胞の末梢血への動員を阻害することに起因することが示唆された。
実施例８ 血管内皮系細胞の遊走に及ぼすＳＣＧＦの効果
ＨＭＶＥＣｓ、ＨＵＶＥＣｓおよび７日間培養したヒトＥＰＣを、ＢｏｙｄｅｎチャンバーおよびＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを用いて解析を行なった。二つのチャンバーとの間を仕切る膜としては、ポリカーボネート製の膜に、０．１％のゼラチンおよび５μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチンを一晩コートした後に乾燥を行なったものを用いた。
各細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、細胞密度が１×１０５／１００μｌになるように０．１％のＢＳＡを含むＥＢＭ−２培地にけん濁し、チャンバーの上部に注入した。下部のチャンバーには０，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌの濃度のヒトＳＣＧＦをそれぞれ投入して６時間３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで静置した。遊走能は、ポリカーボネート膜を１００％メタノールで固定した後、水で洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．社製のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント・メデイアで処理してスライド・ガラス上に乗せ、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で画像を取得し、フォトショップで細胞数を解析することにより測定した。結果を表６に示す。
その結果、ＳＣＧＦはＨＭＶＥＣに対しては遊走を促進したが、ＨＵＶＥＣに対しては影響を与えず、逆に７日間培養したＥＰＣに対しては遊走を阻害した。
実施例９ ＨＭＶＥＣｓおよびＨＵＶＥＣｓの管腔形成に対するＳＣＧＦの影響
１×１０５個のＨＵＶＥＣｓまたはＨＭＶＥＣｓを、ＳＣＧＦを含む５０μｌのＥＢＭ−２培地にけん濁後、５０μｌのマトリゲルと混合して９６ウェルの培養皿にそれぞれまいた。１３時間３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで培養後、顕微鏡下で１ウェルあたりに形成された血管様チューブ数を数えた。血管様チューブの存在は管腔形成を示している。結果を表７に示す。
その結果、ＳＣＧＦはＨＭＶＥＣｓおよびＨＵＶＥＣｓの管腔形成に影響を及ぼさなかった。
したがって、実施例３〜９の結果から、ＳＣＧＦによる血管形成阻害は、血管内皮細胞等が関与するＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（血管新生）ではなく、幹細胞や血管前駆細胞等が関与するＶａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ（脈管新生）の特異的阻害に起因することが明らかになった。
実施例１０ ＳＣＧＦ長期投与による末梢血への影響
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５μｇのヒトＳＣＧＦを１日１回、２１日間投与した。投与終了翌日、心臓より全血を採取し、血球算定および血液像解析を行った。血球算定の結果を表８に示す。
その結果、ＳＣＧＦ投与による白血球数の減少が確認された。
血液像解析の結果を表９に示す。
その結果、白血球のうち顆粒球の一種である好中球および単球数の減少が確認された。
以上の結果は、ＳＣＧＦ長期間投与により、単球・顆粒球前駆細胞（ＧＭＰ）の末梢血への動員が阻害されることを示している。
【産業上の利用可能性】
本発明のＳＣＧＦを有効成分として含有する骨髄幹細胞または前駆細胞などの接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤を用いることにより、癌をはじめとする血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患を治療することが可能となる。
【配列表】
【技術分野】
本発明は、造血幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＳＣＧＦと称す）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤およびその用途に関する。
【背景技術】
ＳＣＧＦは慢性骨髄性白血病の患者から樹立された骨髄球系細胞株ＫＰＢ−Ｍ１５より分離同定された因子である（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ．，Ｏｈｋｕｂｏ Ｔ，Ｆｕｋｕｄａ Ｍ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８７；４７：５０２５−５０３０．）。ＳＣＧＦはＮ型糖鎖を持たない２９−ｋＤａの蛋白であり、Ｃ型レクチンのファミリーに属する（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ａ，Ｓｅｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７；９４：７５７７−７５８２．）。ＳＣＧＦ遺伝子はｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの解析から骨ならびに骨髄で発現していることが示されている（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ，Ｙａｎｏ Ｋ，Ｋａｇａｍｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｊ．２００１；２：３０７−３１５．）。ＳＣＧＦは単独では造血系細胞のコロニー形成促進活性を有していないが、エリスロポエチンあるいはＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ−ｆａｔｏｒ）と組み合わせると、赤芽球系や、顆粒球・マクロファージ系のコロニー形成促進活性が観察される（Ｈｉｒａｏｋａ Ａ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ａ，Ｓｅｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７；９４：７５７７−７５８２．）。また、同様にＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）と組み合わせることで、ＡＣ１３３陽性の前駆細胞の血管内皮細胞への分化が促進される（Ｇｅｈｌｉｎｇ ＵＭ，Ｅｒｇｕｎ Ｓ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０００；９５：３１０６−３１１２．）。
一方、骨髄移植に伴う造血系の回復と並行して血清中のＳＣＧＦ量が増加することも観察されている（Ｉｔｏ Ｃ，Ｓａｔｏ Ｈ，Ａｎｄｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００３；３１：３９１−３９８．）。またＲＴ−ＰＣＲを用いた解析から骨髄中のＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ３４陰性かつＣＤ３３陽性の細胞ではＳＣＧＦが生産されているが、ストローマ細胞や末梢血の造血系細胞では生産されないことも見出されている（Ｉｔｏ Ｃ，Ｓａｔｏ Ｈ，Ａｎｄｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００３；３１：３９１−３９８．）。従って、血清中のＳＣＧＦの増加は造血幹細胞の増加に伴い誘導されると推定される。このようにＳＣＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性や発現部位に関してはある程度明らかにされているが、生体内での働きについては現在まで解明されていない。
近年、種々の成体内組織において、幹細胞、前駆細胞の存在が認められ、これら幹細胞、前駆細胞が病理学的／生理学的な組織・器官の再生を司っていると考えられるようになってきた。例えば、悪性腫瘍の発生に血管形成が関与していることや（Ｓｕｓｓｍａｎ ＬＫ，Ｕｐａｌａｋａｌｉｎ ＪＮ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＭＪ，Ｋｏｃｈｅｒ Ｏ，ａｎｄ Ｂｅｎｊａｍｉｎ ＬＥ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；２：２５５−６．）、動脈硬化における血管閉塞に骨髄幹細胞が関与していることが示されており（Ｓａｔａ Ｍ，Ｓａｉｕｒａ Ａ，Ｋｕｎｉｓａｔｏ Ａ，Ｔｏｊｏ Ａ，Ｏｋａｄａ Ｓ，Ｔｏｋｕｈｉｓａ Ｔ，Ｈｉｒａｉ Ｈ，Ｍａｋｕｕｃｈｉ Ｍ，Ｈｉｒａｔａ Ｙ，ａｎｄ Ｎａｇａｉ Ｒ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００２；８：４０３−９．）、このような幹細胞の末梢血中への動員を抑制することができれば動脈硬化等の疾患が治療できると考えられる。しかし、このような幹細胞の末梢血中への動員を阻害する因子は現時点では見出されていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ＳＣＧＦを有効成分として含有する骨髄幹細胞または前駆細胞などの接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤およびその用途を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤。
（２） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である上記（１）記載の薬剤。
（３） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有する上記（１）記載の薬剤。
（４） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、化学修飾された造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の薬剤。
（５） 化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、上記（４）記載の薬剤。
（６） 接着性を有する細胞が成体多能性幹細胞である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の薬剤。
（７） 接着性を有する細胞が骨髄中の接着性を有する多能性幹細胞または前駆細胞である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の薬剤。
（８） 前駆細胞が、血管前駆細胞、単球・顆粒球共通前駆細胞および平滑筋前駆細胞からなる群から選ばれる細胞である、上記（７）記載の薬剤。
（９） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成阻害剤。
（１０） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする顆粒球・単球新生阻害剤。
（１１） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗腫瘍剤。
（１２） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗炎症剤。
（１３） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする動脈硬化治療剤。
（１４） 上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成の異常により病態が進行する疾患の治療剤。
（１５） 血管形成の異常により病態が進行する疾患が、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんからなる群から選ばれる疾患である、上配（１４）記載の治療剤。
（１６） 造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を投与することを特徴とする、接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する方法。
（１７） 接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤を製造するための造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）の使用。
本発明は造血幹細胞増殖因子（以下、ＳＣＧＦと称す）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤に関する。
ＳＣＧＦとしては、
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド
（４）配列番号１記載で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの自然に生ずるアレル変異体
などがあげられる。
本発明のポリペプチドは、造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドである。上記（２）〜（４）に記載のポリペプチドは、上記（１）記載のポリペプチドと実質的に同一の活性を有していればよく、性質的に同一であれば、活性の強度の程度、分子量などの量的要素は（１）記載のポリペプチドと異なっていてもよい。
配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドが造血幹細胞増殖活性を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、ＳＣＧＦが、配列番号１記載のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列からなるとは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）によって、ＳＣＧＦとのアミノ酸配列の相同性を検索した際に、６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質があげられる。ここで該タンパク質はＳＣＧＦのアミノ酸配列と比較して、その配列中のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入のいずれによって変化していてもよい。
また本発明に用いられるＳＣＧＦは、化学修飾されていてもよい。化学修飾の方法としては、例えばＷＯ００／５１６２６に記載の方法等があげられ、ＳＣＧＦをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等で修飾したものも本発明に用いられるＳＣＧＦに包含される。
本発明における接着性を有する細胞とは、骨髄、血管などの組織または細胞に対して接着する性質を有する細胞のことをいい、具体的には成体多能性幹細胞があげられる。成体多能性幹細胞とは、生体内の各組織に存在し、種々の成熟細胞になることが可能な幹細胞をいう。
また、骨髄中に存在する接着性の多能性幹細胞、前駆細胞なども本発明の接着性を有する細胞として包含される。前駆細胞としては、血管前駆細胞（以下、ＥＰＣとも称す）、単球・顆粒球共通前駆細胞、平滑筋前駆細胞などがあげられる。
接着性を有する細胞の末梢血への動員は、末梢血由来細胞を遠心分離により回収後、接着性細胞を培養するための培養皿を用いて接着細胞のみを選択的に培養することで同定することができる。
上述した接着性を有する細胞は組織の再生・修復に重要な役割を果たすとともに、悪性腫瘍での血管形成促進、血管の閉塞などの病理に関係している。したがって、本発明の薬剤は接着性を有する細胞を末梢血中への動員を阻害することにより、血管形成阻害剤、単球・顆粒球新生阻害剤、組織の炎症または腫瘍形成などを抑制する抗炎症剤または抗腫瘍剤、血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患の治療剤として用いることができる。血管形成の異常により病態が進行する疾患としては、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾せんなどがあげられる。
本発明の薬剤は、治療剤として単独で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、筋肉内、皮下、皮内もしくは静脈内等の非経口投与等があげられ、好ましくは筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与等があげられる。
投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、ドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等があげられる。
錠剤等の固形製剤の製造には、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与に適当な製剤としては、注射剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤の製造にあたっては、例えば水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤はＳＣＧＦそのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつＳＣＧＦを微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等があげられる。ＳＣＧＦおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
実施例１ マトリゲルの移植により誘発される血管形成に対するＳＣＧＦの効果
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア社製）の皮下に５００μｌのマトリゲルを移植し、毎日５μｇのヒトＳＣＧＦを７日間投与した。７日後、移植したマトリゲルを摘出し４％のパラホルムアルデヒドで固定した後に、血管内皮のマーカーである抗マウスＣＤ３１抗体で染色を行った。
その結果、対照群と比較してヒトＳＣＧＦを投与したマウスでは顕著に血管形成が抑制されることが観察された。この結果はＳＣＧＦに血管形成を阻害する活性があることを示している。
実施例２ ＳＣＧＦによるガンの生着阻害
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に１．５×１０６のＢ１６メラノーマ細胞を移植し、毎日５μｇのヒトＳＣＧＦを２１日間投与し続けた。
その結果、ＳＣＧＦを投与しない対照群と比較してヒトＳＣＧＦを投与したマウスでは顕著に腫瘍の形成が阻害された。この結果はＳＣＧＦが血管形成阻害を介して、ガン細胞の生着を阻害する活性があることを示している。
実施例３ ＳＣＧＦによる骨髄単核細胞の遊走
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをペントバルビタールで麻酔後、大腿骨から骨髄細胞を抽出した。次に、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０３８ｓ（シグマ社製）を用いた密度勾配遠心分離により、骨髄単核細胞を取得した。骨髄単核細胞のＳＣＧＦに対する走化性を、ＢｏｙｄｅｎチャンバーおよびＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー（ともにＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔｅｒ社製）を用いて解析した。
上部のチャンバーには、１００μｌの培養液にけん濁した１×１０６の骨髄単核細胞を注入し、下部チャンバーには、ＳＣＧＦを含む培養液６００μｌを注入した。境界部位には直径３μｍの穴を持つ膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａ社製）で仕切った。骨髄単核細胞の走化性は３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした後に、下部に遊走した骨髄単核細胞の数を血球測定板により測定した。結果を表１に示す。
その結果、ＳＣＧＦは濃度依存的に顕著に骨髄単核細胞を遊走させることが示された。
実施例４ ＥＰＣの末梢血中への動員に及ぼすＳＣＧＦの影響（１）
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに毎日５μｇのヒトＳＣＧＦをそれぞれ１日間、４日間、７日間投与した。投与終了後、対象のマウスをペントバルビタールで麻酔し、１０００Ｕ／ｍｌのヘパリンでコートした注射針で心臓より全血を採取した。同時に、ヒトＳＣＧＦを投与しないマウスの血液も採取した。取得した血液の一部は溶血後、実施例５に示すＦＡＣＳ解析に使用し、残りの血液は以下のＥＰＣの培養による解析に用いた。
培養による解析は、以下のように行った。
血液にＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０８３（シグマ社製）を用いて単核細胞を取得した。マウス１匹中の全末梢血由来単核細胞を５００μｌの体積になるように濃縮した後、ラット由来のビトロネクチン（シグマ社製）でコートしたＬａｂ Ｔｅｋ ４ウエルのスライド・ガラス（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社）上に投入して７日間３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで培養を行った。得られた細胞をアセチルＬＤＬ−ＤｉＩ標識（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）およびｉｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社製）で染色し、ＥＰＣを蛍光顕微鏡下で同定した。結果を表２に示す。
その結果、ＳＣＧＦの投与日数に比例して末梢血中のＥＰＣの数が減少していることが明らかとなった。
実施例５ ＥＰＣの末梢血中への動員に及ぼすＳＣＧＦの影響（２）
マウス・ラットｆｌｋ１およびマウスＣＤ３４はともにＥＰＣの代表的な表面マーカーである。抗マウス・ラットｆｌｋ１モノクローナル抗体および抗マウスＣＤ３４抗体を用いてＥＰＣのＦＡＣＳによる解析を行なった。
実施例７で取得した血液を溶血後、１％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、０．０１％ ＮａＮ３を含むＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で洗浄し、マウス血清中で３０分間氷冷した。該細胞をｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）で標識した抗マウス・ラットｆｌｋ１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）またはビオチン標識した抗マウスＣＤ３４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて染色した。
該抗体で染色した細胞はＦａｃｓｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて解析を行った。結果を表３に示す。
その結果、ＥＰＣを含むＣＤ３４陽性細胞およびＦｌｋ１陽性細胞がＳＣＧＦの投与により顕著に減少することが明らかとなった。
実施例６ 血管内皮系細胞の増殖に及ぼすＳＣＧＦの効果
ヒト微小血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；以下、ＨＭＶＥＣｓと称す）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；以下、ＨＵＶＥＣｓと称す）に比べて未熟な血管前駆細胞を多く含んでいると考えられている。
ＨＵＶＥＣｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）およびＨＭＶＥＣｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を、それぞれフィブロネクチンでコートした培養皿上でＥＧＭＭＶ２増殖因子カクテル（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）、ヒトＳＣＧＦおよび５％ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を含むＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を用い、３７℃７日間５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、ＭＴＳアッセイにより細胞密度を測定した。結果を表４に示す。
その結果、ＨＭＶＥＣｓではＳＣＧＦ濃度に依存して細胞の増殖が促進されたが、ＨＵＶＥＣｓではＳＣＧＦは細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。
この結果は、ＳＣＧＦによる血管形成阻害が血管内皮細胞の増殖を阻害することによらないことを示している。
実施例７ ＳＣＧＦの末梢血単核細胞の増殖に及ぼす影響
単核細胞は以下の方法で取得した。なお、単核細胞には、骨髄幹細胞、ＥＰＣなどが含まれている。
採取したヒト末梢血から、シグマ社のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７を用いた密度勾配遠心法により単核細胞を１×１０７個取得した。得られた単核細胞を、フィブロネクチンでコートした培養皿上でＥＧＭＭＶ２増殖因子カクテル（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）およびヒトＳＣＧＦおよび５％ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を含むＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）で３７℃４日間培養した後、ＭＴＳアッセイにより細胞密度を測定した。結果を表５に示す。
その結果、ＳＣＧＦは単核細胞に対しては顕著な細胞増殖促進または抑制活性を持たないことが示された。
このことから、ＳＣＧＦの血管形成阻害作用は、幹細胞や血管前駆細胞の増殖を阻害することに起因するのではなく、実施例４および５に示すように幹細胞や血管前駆細胞の末梢血への動員を阻害することに起因することが示唆された。
実施例８ 血管内皮系細胞の遊走に及ぼすＳＣＧＦの効果
ＨＭＶＥＣｓ、ＨＵＶＥＣｓおよび７日間培養したヒトＥＰＣを、ＢｏｙｄｅｎチャンバーおよびＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを用いて解析を行なった。二つのチャンバーとの間を仕切る膜としては、ポリカーボネート製の膜に、０．１％のゼラチンおよび５μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチンを一晩コートした後に乾燥を行なったものを用いた。
各細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、細胞密度が１×１０５／１００μｌになるように０．１％のＢＳＡを含むＥＢＭ−２培地にけん濁し、チャンバーの上部に注入した。下部のチャンバーには０，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌの濃度のヒトＳＣＧＦをそれぞれ投入して６時間３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで静置した。遊走能は、ポリカーボネート膜を１００％メタノールで固定した後、水で洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．社製のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント・メデイアで処理してスライド・ガラス上に乗せ、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で画像を取得し、フォトショップで細胞数を解析することにより測定した。結果を表６に示す。
その結果、ＳＣＧＦはＨＭＶＥＣに対しては遊走を促進したが、ＨＵＶＥＣに対しては影響を与えず、逆に７日間培養したＥＰＣに対しては遊走を阻害した。
実施例９ ＨＭＶＥＣｓおよびＨＵＶＥＣｓの管腔形成に対するＳＣＧＦの影響
１×１０５個のＨＵＶＥＣｓまたはＨＭＶＥＣｓを、ＳＣＧＦを含む５０μｌのＥＢＭ−２培地にけん濁後、５０μｌのマトリゲルと混合して９６ウェルの培養皿にそれぞれまいた。１３時間３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで培養後、顕微鏡下で１ウェルあたりに形成された血管様チューブ数を数えた。血管様チューブの存在は管腔形成を示している。結果を表７に示す。
その結果、ＳＣＧＦはＨＭＶＥＣｓおよびＨＵＶＥＣｓの管腔形成に影響を及ぼさなかった。
したがって、実施例３〜９の結果から、ＳＣＧＦによる血管形成阻害は、血管内皮細胞等が関与するＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（血管新生）ではなく、幹細胞や血管前駆細胞等が関与するＶａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ（脈管新生）の特異的阻害に起因することが明らかになった。
実施例１０ ＳＣＧＦ長期投与による末梢血への影響
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５μｇのヒトＳＣＧＦを１日１回、２１日間投与した。投与終了翌日、心臓より全血を採取し、血球算定および血液像解析を行った。血球算定の結果を表８に示す。
その結果、ＳＣＧＦ投与による白血球数の減少が確認された。
血液像解析の結果を表９に示す。
その結果、白血球のうち顆粒球の一種である好中球および単球数の減少が確認された。
以上の結果は、ＳＣＧＦ長期間投与により、単球・顆粒球前駆細胞（ＧＭＰ）の末梢血への動員が阻害されることを示している。
【産業上の利用可能性】
本発明のＳＣＧＦを有効成分として含有する骨髄幹細胞または前駆細胞などの接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤を用いることにより、癌をはじめとする血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患を治療することが可能となる。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤。
【請求項２】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有する請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、化学修飾された造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項１記載の薬剤。
【請求項６】
接着性を有する細胞が成体多能性幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
接着性を有する細胞が骨髄中の接着性を有する多能性幹細胞または前駆細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
前駆細胞が、血管前駆細胞、単球・顆粒球共通前駆細胞および平滑筋前駆細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする顆粒球・単球新生阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする動脈硬化治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成の異常により病態が進行する疾患の治療剤。
【請求項１５】
血管形成の異常により病態が進行する疾患が、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんからなる群から選ばれる疾患である、請求項１４記載の治療剤。
【請求項１６】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を投与することを特徴とする、接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する方法。
【請求項１７】
接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤を製造するための造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）の使用。
【請求項１】
幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤。
【請求項２】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有する請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）が、化学修飾された造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項１記載の薬剤。
【請求項６】
接着性を有する細胞が成体多能性幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
接着性を有する細胞が骨髄中の接着性を有する多能性幹細胞または前駆細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
前駆細胞が、血管前駆細胞、単球・顆粒球共通前駆細胞および平滑筋前駆細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする顆粒球・単球新生阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする動脈硬化治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成の異常により病態が進行する疾患の治療剤。
【請求項１５】
血管形成の異常により病態が進行する疾患が、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんからなる群から選ばれる疾患である、請求項１４記載の治療剤。
【請求項１６】
造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）を投与することを特徴とする、接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する方法。
【請求項１７】
接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤を製造するための造血幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）の使用。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５６００
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【発行日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３９７５（Ｐ２００５−５１３９７５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３５９３
【国際出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【発行日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３５９３
【国際出願日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]