改善されたファージ耐性をもつ培養物
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に関する方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を用いる組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および利用に役立つ方法および組成物を提供する。付加的な実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化および／または同定する方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、細胞に対するファージの潜在的な毒性を決定するためにＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を利用する方法、およびファージの遺伝子配列を調節して毒性レベルを増加させるためにＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓを利用する方法を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア菌株を少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された前記バクテリオファージ耐性菌株から、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；および
（ｄ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株であって、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記菌株を単離するステップ
を備える方法。
【請求項２】
前記方法は、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップをさらに備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に同時に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に順次暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記親バクテリア菌株は、前記核酸配列を備える少なくとも１つのバクテリオファージによる感染を通じて、前記核酸配列に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、自然発生のバクテリオファージである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、バクテリオファージ耐性バクテリアを用いた選択圧を通じて得られる変異バクテリオファージである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記親バクテリア菌株は、核酸を取込む自然のメカニズムを通じて前記核酸に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核酸を取込む前記自然のメカニズムは、自然応答能を備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を取込む前記自然のメカニズムは、接合または形質転換による親バクテリア菌株、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バクテリオファージ耐性菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記親バクテリア菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記５’末端および／または前記３’末端が、前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも前記第１のＣＲＩＳＰＲリピートまたは少なくとも前記第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーの前記５’および／または前記３’末端が、前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記少なくとも一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を増幅し、増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列をつくることによって比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行なわれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記少なくとも一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を配列決定することによって比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および前記増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ配列遺伝子座を配列決定するステップをさらに備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記付加的な核酸フラグメントは、付加的なリピート−スペーサー・ユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも約４４ヌクレオチドを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、約４４から約１１９の間のヌクレオチドを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して少なくとも約９５％の同一性をもつ、少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも１つのバクテリオファージのゲノムにおけるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性をもつ、少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記親バクテリア菌株は、工業的に有用な菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記親バクテリア菌株は、少なくとも１つのバクテリオファージによる感染に対し感受性が高い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記親バクテリア菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される培養物から得られる菌株を備える、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記親バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、およびオエノコッカス属から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法を用いて得られる少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３３】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、工業的に有用な菌株である、請求項１に記載のバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３４】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される、請求項１に記載のバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法を用いてつくられたバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法を用いてつくられた少なくとも２つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の組成物を備える食品または飼料。
【請求項３８】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を食品または飼料に加えることを備える、食品または飼料を調製する方法。
【請求項３９】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を備える、スターター培養物、プロバイオティック培養物、またはダイエタリーサプリメント培養物。
【請求項４０】
請求項３５または３６に記載の前記組成物をスターター培養物に加えることを備える発酵方法。
【請求項４１】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を発酵培地に、前記発酵培地の前記成分の発酵が生じるような条件下で加えることを備える発酵方法。
【請求項４２】
前記発酵は、バクテリオファージの存在によって影響されない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記発酵培地は食料製品である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記食料製品は乳製品である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記乳製品は乳汁である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
２つまたはそれ以上のバクテリオファージ耐性変異菌株を備える少なくとも２つの異なった組成物が、前記発酵培地に順次暴露される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
発酵培地における前記有害なバクテリオファージの個体数を低減する方法であって、発酵培地を請求項１に記載の方法を用いてつくられた少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株に、前記バクテリオファージの個体数が低減される条件下で暴露することを備える方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア株を、少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異株菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップ；
（ｄ）前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｅ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを解析するステップ；および
（ｆ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を単離するステップ
を備える方法。
【請求項４９】
ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を生み出す方法であって、
（ａ）少なくとも１つの親ファージ、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備えるファージ耐性バクテリア菌株を得ることであって、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記少なくとも１つの親ファージのゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して、少なくとも約９５％同一な核酸配列を備える、前記得ること；
（ｂ）少なくとも１つのファージ変異株がつくられる条件下で、前記少なくとも１つの親ファージを前記ファージ耐性バクテリア菌株に暴露すること；および
（ｃ）前記少なくとも１つのファージ変異株であって、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する能力を示し、かつＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体である前記少なくとも１つのファージ変異株を選択すること
を備える方法。
【請求項５０】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、請求項４８に記載の方法を用いて得られるバクテリオファージ耐性変異菌株である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ファージ変異株における前記少なくとも１つの原スペーサー配列の少なくとも一部分および前記少なくとも１つの原スペーサー配列の近くに位置するＣＲＩＳＰＲモチーフを、前記親ファージの前記少なくとも１つの原スペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲモチーフと比較するステップをさらに備える、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法は、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する前記変異株ファージを選択するステップをさらに備え、前記変異株ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備え、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記少なくとも１つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに、少なくとも１つの変異を備える、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える異なったＣＲＩＳＰＲファージ耐性バクテリア菌株を用いて、1回またはそれ以上反復して繰り返され、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体のゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して少なくとも約９５％同一な核酸配列を備える、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、次の通り、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属およびオエノコッカス属から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４９に記載の方法を用いて得られるＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５７】
少なくとも２つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに２つまたはそれ以上の変異が存在する、請求項５６に記載のＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５８】
前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記ゲノムは、少なくとも１つの原スペーサーおよび／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに変異を備えるために遺伝子操作されている、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５９】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが変異した、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項６０】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが削除された、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項６１】
請求項５６に記載の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物。
【請求項６２】
前記発酵培地は、望ましくないバクテリアの少なくとも１つの個体数を含む発酵培地に請求項６１に記載の前記組成物を、前記望ましくないバクテリアの前記個体数が低減される条件下で暴露することを備える、製品におけるバクテリアの個体数を制御する方法であって、前記発酵培地は、前記製品を生み出すために用いられる方法。
【請求項６３】
前記製品は、食品、飼料、化粧品、パーソナルケア製品、ヘルスケア製品、動物薬品、およびダイエタリーサプリメントから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法は、少なくとも1回繰り返され、請求項６１に記載の前記異なった組成物は、ローテーションして用いられる、請求項６２に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア菌株を少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された前記バクテリオファージ耐性菌株から、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；および
（ｄ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株であって、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記菌株を単離するステップ
を備える方法。
【請求項２】
前記方法は、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップをさらに備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に同時に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に順次暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記親バクテリア菌株は、前記核酸配列を備える少なくとも１つのバクテリオファージによる感染を通じて、前記核酸配列に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、自然発生のバクテリオファージである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、バクテリオファージ耐性バクテリアを用いた選択圧を通じて得られる変異バクテリオファージである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記親バクテリア菌株は、核酸を取込む自然のメカニズムを通じて前記核酸に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核酸を取込む前記自然のメカニズムは、自然応答能を備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を取込む前記自然のメカニズムは、接合または形質転換による親バクテリア菌株、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バクテリオファージ耐性菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記親バクテリア菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記５’末端および／または前記３’末端が、前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも前記第１のＣＲＩＳＰＲリピートまたは少なくとも前記第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーの前記５’および／または前記３’末端が、前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記少なくとも一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を増幅し、増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列をつくることによって比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行なわれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記少なくとも一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を配列決定することによって比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および前記増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ配列遺伝子座を配列決定するステップをさらに備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記付加的な核酸フラグメントは、付加的なリピート−スペーサー・ユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも約４４ヌクレオチドを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、約４４から約１１９の間のヌクレオチドを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して少なくとも約９５％の同一性をもつ、少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも１つのバクテリオファージのゲノムにおけるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性をもつ、少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記親バクテリア菌株は、工業的に有用な菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記親バクテリア菌株は、少なくとも１つのバクテリオファージによる感染に対し感受性が高い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記親バクテリア菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される培養物から得られる菌株を備える、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記親バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、およびオエノコッカス属から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法を用いて得られる少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３３】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、工業的に有用な菌株である、請求項１に記載のバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３４】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される、請求項１に記載のバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法を用いてつくられたバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法を用いてつくられた少なくとも２つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の組成物を備える食品または飼料。
【請求項３８】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を食品または飼料に加えることを備える、食品または飼料を調製する方法。
【請求項３９】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を備える、スターター培養物、プロバイオティック培養物、またはダイエタリーサプリメント培養物。
【請求項４０】
請求項３５または３６に記載の前記組成物をスターター培養物に加えることを備える発酵方法。
【請求項４１】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を発酵培地に、前記発酵培地の前記成分の発酵が生じるような条件下で加えることを備える発酵方法。
【請求項４２】
前記発酵は、バクテリオファージの存在によって影響されない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記発酵培地は食料製品である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記食料製品は乳製品である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記乳製品は乳汁である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
２つまたはそれ以上のバクテリオファージ耐性変異菌株を備える少なくとも２つの異なった組成物が、前記発酵培地に順次暴露される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
発酵培地における前記有害なバクテリオファージの個体数を低減する方法であって、発酵培地を請求項１に記載の方法を用いてつくられた少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株に、前記バクテリオファージの個体数が低減される条件下で暴露することを備える方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア株を、少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異株菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップ；
（ｄ）前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｅ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを解析するステップ；および
（ｆ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を単離するステップ
を備える方法。
【請求項４９】
ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を生み出す方法であって、
（ａ）少なくとも１つの親ファージ、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備えるファージ耐性バクテリア菌株を得ることであって、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記少なくとも１つの親ファージのゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して、少なくとも約９５％同一な核酸配列を備える、前記得ること；
（ｂ）少なくとも１つのファージ変異株がつくられる条件下で、前記少なくとも１つの親ファージを前記ファージ耐性バクテリア菌株に暴露すること；および
（ｃ）前記少なくとも１つのファージ変異株であって、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する能力を示し、かつＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体である前記少なくとも１つのファージ変異株を選択すること
を備える方法。
【請求項５０】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、請求項４８に記載の方法を用いて得られるバクテリオファージ耐性変異菌株である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ファージ変異株における前記少なくとも１つの原スペーサー配列の少なくとも一部分および前記少なくとも１つの原スペーサー配列の近くに位置するＣＲＩＳＰＲモチーフを、前記親ファージの前記少なくとも１つの原スペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲモチーフと比較するステップをさらに備える、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法は、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する前記変異株ファージを選択するステップをさらに備え、前記変異株ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備え、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記少なくとも１つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに、少なくとも１つの変異を備える、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える異なったＣＲＩＳＰＲファージ耐性バクテリア菌株を用いて、1回またはそれ以上反復して繰り返され、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体のゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して少なくとも約９５％同一な核酸配列を備える、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、次の通り、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属およびオエノコッカス属から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４９に記載の方法を用いて得られるＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５７】
少なくとも２つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに２つまたはそれ以上の変異が存在する、請求項５６に記載のＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５８】
前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記ゲノムは、少なくとも１つの原スペーサーおよび／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに変異を備えるために遺伝子操作されている、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５９】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが変異した、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項６０】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが削除された、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項６１】
請求項５６に記載の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物。
【請求項６２】
前記発酵培地は、望ましくないバクテリアの少なくとも１つの個体数を含む発酵培地に請求項６１に記載の前記組成物を、前記望ましくないバクテリアの前記個体数が低減される条件下で暴露することを備える、製品におけるバクテリアの個体数を制御する方法であって、前記発酵培地は、前記製品を生み出すために用いられる方法。
【請求項６３】
前記製品は、食品、飼料、化粧品、パーソナルケア製品、ヘルスケア製品、動物薬品、およびダイエタリーサプリメントから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法は、少なくとも1回繰り返され、請求項６１に記載の前記異なった組成物は、ローテーションして用いられる、請求項６２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２０１０−５１９９２９（Ｐ２０１０−５１９９２９Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２７０１（Ｐ２００９−５５２７０１）
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２７１４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０８９８９
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０９０９３９７８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２７１４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０８９８９
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０９０９３９７８）
【Ｆターム（参考）】
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