改善されたファージ耐性をもつ培養物

【課題】標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に関する方法および組成物を提供する。
【解決手段】１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を用いる組成物および方法。菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および利用に役立つ方法および組成物。バクテリアを標識化および／または同定する方法。細胞に対するファージの潜在的な毒性を決定するためにＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を利用、およびファージの遺伝子配列を調節して毒性レベルを増加させるためにＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓを利用する方法。生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を生み出す方法であって、
（ａ）少なくとも１つの親ファージ、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備えるファージ耐性バクテリア菌株を得るステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記少なくとも１つの親ファージのゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して、少なくとも９５％同一な核酸配列を備えることを特徴とするステップ；
（ｂ）少なくとも１つのファージ変異株がつくられる条件下で、前記少なくとも１つの親ファージを前記ファージ耐性バクテリア菌株に暴露するステップ；および
（ｃ）前記少なくとも１つのファージ変異株であって、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する能力を示し、かつＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体である前記少なくとも１つのファージ変異株を選択するステップ
を備える方法。
【請求項２】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア株を、少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異株菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップ；
（ｄ）前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｅ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを解析するステップ；および
（ｆ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を単離するステップからなる方法を用いて得られるバクテリオファージ耐性変異菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ファージ変異株における前記少なくとも１つの原スペーサー配列の少なくとも一部分および前記少なくとも１つの原スペーサー配列の近くに位置するＣＲＩＳＰＲモチーフを、前記親ファージの前記少なくとも１つの原スペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲモチーフと比較するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する前記変異株ファージを選択するステップをさらに備え、前記変異株ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備え、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記少なくとも１つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに、少なくとも１つの変異を備える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える異なったＣＲＩＳＰＲファージ耐性バクテリア菌株を用いて、1回またはそれ以上反復して繰り返され、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体のゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して少なくとも９５％同一な核酸配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、次の通り、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属およびオエノコッカス属から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法を用いて得られるＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項９】
少なくとも２つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに２つまたはそれ以上の変異が存在する、請求項８に記載のＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記ゲノムは、少なくとも１つの原スペーサーおよび／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに変異を備えるために遺伝子操作されている、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項１１】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが変異した、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項１２】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが削除された、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項１３】
請求項８乃至１２に記載の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物。
【請求項１４】
前記発酵培地は、望ましくないバクテリアの少なくとも１つの個体数を含む発酵培地に請求項１３に記載の前記組成物を、前記望ましくないバクテリアの前記個体数が低減される条件下で暴露することを備える、製品におけるバクテリアの個体数を制御する方法であって、前記発酵培地は、前記製品を生み出すために用いられる方法。
【請求項１５】
前記製品は、食品、飼料、化粧品、パーソナルケア製品、ヘルスケア製品、動物薬品、およびダイエタリーサプリメントから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、少なくとも１回繰り返され、請求項１３に記載の前記異なった組成物は、ローテーションして用いられる、請求項１４に記載の方法。

【図１】