改善されたブタ肝臓エステラーゼ
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された１つ以上の欠失または置換を含まないポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異がないポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログに関する。本発明はまた、本発明によるポリペプチドをコードする核酸、およびポリペプチドの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エステラーゼ活性を有し、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在するポリペプチドの画分の濃度が、そのアミノ酸配列中に特定の突然変異がないポリペプチドと比べて増加した単離された突然変異体ポリペプチドに関する。本発明はまた、突然変異体ブタ肝臓エステラーゼをコードする単離された核酸配列および本発明による突然変異体ポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）は、非常に有用な部類の加水分解酵素として知られており、例えば、それらは、エステルのエナンチオ選択的加水分解において非常に有用である。ブタ肝臓から単離された粗ライセートのＰＬＥの使用には重大な欠点があったので、それらが有用であるとみなされている事実は、非常に驚くべきことである。（ｉ）異なる特性を有する様々なアイソザイムが存在するので、エナンチオ選択性がバッチ間で変化することがあり、また、操作上の安定性の違いのために、反応時間とともに変化することもある。（ｉｉ）粗ブタ肝臓抽出物のウイルスまたはプリオン汚染のリスクは、製薬業界にとっての大きな懸念である。（ｉｉｉ）さらに、ＰＬＥの助けを借りて生産された製品は、コーシャまたはハラールとみなされない可能性がある。
【０００３】
これらの制限のために、組換えでブタ肝臓アイソザイムを産生するための様々な努力が知られている。当初、メチルトローフ酵母のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）がブタ肝臓エステラーゼの優れた発現系であると思われたが、結局、正確な酵素フォールディングに寄与する特定の宿主、遺伝子および発現系が改善された後に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）がより優れた宿主であることが分かった。
【０００４】
国際特許出願国際公開第２００９／００４０９３号パンフレットには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるブタ肝臓エステラーゼの発現が記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
ＰＬＥはそのような有用な酵素であるので、この酵素で達成することができる活性レベルをさらに改善する必要が依然としてある。
【０００６】
驚くべきことに、現在、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたブタ肝臓エステラーゼアイソフォーム突然変異体および相同なエステラーゼの発現レベル、それゆえ、活性レベルは、そのアミノ酸配列中の１つまたは複数の残基、すなわち、ブタ肝臓エステラーゼの多量体形成に関与するアミノ酸の１つまたは複数を、多量体形成をもたらさないかまたは多量体形成の傾向を低下させるアミノ酸と置換し、それによりＰＬＥの四次構造を変化させることによって、顕著に改善できることが見出されている。
【０００７】
この発見は、配列番号１のヌクレオチド位置５５４１に対応する、ＡＰＬＥ（配列番号１）をコードするオープン・リーディング・フレームの位置７８８での突然変異の生成がきっかけであった。この置換はＴからＡへのものであり、ＡＰＬＥ酵素中の疎水性バリンの、負電荷を有するアスパラギン酸への置換（Ｖ２６３Ｄ）を生じさせた。コンピュータモデルにより、この突然変異は酵素の極めて外側のヘリックス表面に位置し、したがって、酵素の活性部位の空洞から離れた所にあることが示されたが、（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルに対するこの突然変異型酵素の総活性は、総可溶性タンパク質１ｍｇ当たり６．５から１１．６ユニットに増加することも分かった。ジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートの場合、活性は、総可溶性タンパク質１ｍｇ当たり３６から４２ｍＵに増加し、パラ−ニトロフェニルアセタートの場合、活性は、総可溶性タンパク質１ｍｇ当たり１５．４から２４．３Ｕに上昇した。当初は、ＡＰＬＥの外側領域の突然変異が様々な変換に対してなぜそのような強力な影響を有するのかという理由の説明はなかった。しかしながら、ヒトホモログｈＣＥ１の構造解析により、ＡＰＬＥの位置２６３のバリンが多量体化に重要である可能性があることが同定された。電荷を有するアスパラギン酸を代わりに導入することにより、２つのサブユニット間の相互作用を安定化する、もともと存在していた疎水性相互作用が損なわれる。負の電荷を有するアミノ酸は、疎水性相互作用を介して他のサブユニットに結合する代わりに、それと反発する可能性がある。
【０００８】
次に、多量体形成が、疎水性相互作用を妨げる位置２６３のアスパラギン酸によって導入される変化により妨げられ、そのために、単量体の形成がもたらされるという仮説を検証した。ＡＰＬＥのコンピュータモデルの分析から、ある単量体の位置２６３のバリンが、別の単量体の位置４３のロイシンと相互作用し得るという結論が得られた。三量体形成は、少なくとも一部は、合計３つのサブユニットの間でＬ４３とＶ２６３が交互に疎水性相互作用することにより起こると仮定された。したがって、どのアミノ酸がアスパラギン酸に置き換えられるにしても、相互作用は妨害されるはずである。仮説を検証するために、位置４３のロイシンをアスパラギン酸に置き換えると、単量体化がもたらされた。
【０００９】
この突然変異も単量体形成をもたらしたので、これにより、置換がなければ多量体を形成することができるＰＬＥ単量体の特定の位置にあるアミノ酸の置換によって、単量体形態で存在する酵素の量が増加することが証明され、Ｌ４３Ｄ変異体はＶ２６３Ｄ変異体よりも可溶性の低いタンパク質を生じさせたが、多量体形成に関与する位置で突然変異が導入され、かつ特定の変換のために用いられる酵素を含む一定量の透明化されたライセートに見出される活性が、同じ変換に用いられる突然変異がない酵素を含む同じ量の透明化されたライセートと比べて増大したことは明白である。同じ突然変異が配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによる全てのポリペプチドに導入され、同じ効果がもたらされた。
【００１０】
したがって、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された１つ以上の欠失または置換を含まないポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異がないポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログに関する。
【００１１】
１つ以上のアミノ酸を欠失させるのではなく、１つ以上のアミノ酸を置換することが好ましい。
【００１２】
本文書では、相対エステラーゼ活性は、野生型（すなわち、突然変異が導入されていない親酵素）の活性と、同じ量の可溶性タンパク質調製物（透明化されたライセート）を用いて同じ条件下で調製されたそれぞれの突然変異体酵素の活性を比較したものである（材料および方法の節の「発現および細胞回収」という見出しの下を参照されたい；そこには、透明化されたライセートの調製が記載されており、また、「ＰＬＥ活性の定量」の下には、活性を測定するための方法が記載されている）。相対活性（ｒ［％］）は、ｒ＝（［ｐ−ＮＰＡｍｕｔ］／［ｐ−ＮＰＡｗｔ］）×１００％という式に従って、１分間当たりの突然変異体ライセートのパラ−ニトロフェノールの放出（［ｐ−ＮＰＡｍｕｔ］）を、１分間当たりの対応する野生型ライセートのパラ−ニトロフェノール放出（［ｐ−ＮＰＡｗｔ］）で割ったものに、１００％を掛けて算出される。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、本発明による単離されたポリペプチドに関するものであり、このポリペプチドは、アミノ酸の欠失または置換がない対応する野生型ポリペプチドのエステラーゼ活性と比較して１０％のエステラーゼ活性の増加を示す。
【００１４】
酵素は、一次構造（アミノ酸配列）、二次構造（主にα−ヘリックスおよびβ−シート）ならびに三次構造（１ペプチド鎖の構造）を有する。さらに、いくつかの酵素は、同じ（ホモ）または異なる（ヘテロ）サブユニット（ペプチド鎖）の集合体（多量体）である四次構造を形成する。ブタ肝臓エステラーゼはホモ三量体である。この酵素および突然変異体の四次構造は、グリセロール密度勾配遠心分離（グリセロール密度勾配遠心分離の説明については、実施例３を参照されたい）およびネイティブゲル電気泳動（この方法の説明については、材料および方法の節の「ネイティブゲル電気泳動」という見出しの下を参照されたい）によって試験することができる。
【００１５】
多量体形成は、通常、異なるアミノ酸の複数の分子間引力、例えば、異なるサブユニット（単量体）の疎水性／疎水性またはイオン（陽／陰）相互作用によって起こる。そのような相互作用は、多くの場合、酵素を安定化し、それゆえ、酵素にとって有益であることが多い。本発明では、驚くべきことに、そのような引力のごく一部を破壊することによって、四次構造の変化と、透明化されたライセート中のＰＬＥおよび相同な酵素のより高い相対活性とがもたらされることが見出された。
【００１６】
したがって、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失が、単量体の相互作用点に、単量体が多量体を形成するときに位置し、かつ単量体間のその相互作用点を破壊するアミノ酸位置で起こっている、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された１つ以上の欠失または置換を含まないポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異がないポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログに関する。好ましくは、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチド、および配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに対して少なくとも９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有する単離されたポリペプチドに関するものであり、ここで、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失は、単量体の相互作用点に、単量体が多量体を形成するときに位置し、単量体間のその相互作用点を破壊するアミノ酸位置で起こっている。好ましくは、置換または欠失は、アミノ酸位置４３、２６０、２６３、２６６もしくは２７０の群から選択される１つ以上の位置、またはそれに対応する位置で行なわれる。好ましい置換は、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３ＤおよびＶ２６３Ｇまたはそれに対応する位置である。
【００１７】
特に、本発明は、位置４３、２６０、２６３またはそれに対応する位置の群から選択される１つ以上のアミノ酸置換、好ましくは、置換Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３Ｄ、Ｖ２６３Ｇまたはそれに対応する位置の群から選択される置換を含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしく１４のいずれか１つに対して９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る、より好ましくは９７％を上回る、最も好ましくは９８％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログに関する。
【００１８】
本発明の枠組みにおいて、同一性（または相同性）パーセントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉにある、以下の標準的なパラメータを用いて、Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ、Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ ２配列 − タンパク質配列とヌクレオチド配列を比較するための新しいツール（Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０に記載の通りに決定されたものであるか、またはそのように決定され得るものである。
−タンパク質配列の場合：
マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
オープンギャップ：５
伸長ギャップ：２
ペナルティギャップｘ＿ドロップオフ：１１
期待：１０
ワードサイズ：１１
−ヌクレオチドの場合：
一致に対する報酬：１
不一致に対するペナルティ：−２
オープンギャップ：１１
伸長ギャップ：１
ペナルティギャップｘ＿ドロップオフ：５０
期待：１０
ワードサイズ：３
【００１９】
様々な単量体の引力を破壊するために標的とすることができる位置は、ＰＬＥまたは相同な酵素（例えば、ヒト肝臓カルボキシルエステラーゼ１、ＰＤＢエントリー１ ＭＸ１もしくはウサギ肝臓カルボキシルエステラーゼ１、ＰＤＢエントリー１Ｋ４Ｙ）のＸ線構造の解析によるかまたはランダム突然変異導入実験によって同定することができる。置換の標的とするための好ましいアミノ酸位置は、位置４３、２６０および２６３、ならびにこれらのアミノ酸と相互作用する他のサブユニットのアミノ酸である。
【００２０】
既知の方法を用いて四次構造に寄与するアミノ酸位置を同定した後、引力を破壊するためにアミノ酸置換を選ぶ。好ましい置換は、疎水性残基、例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡと略す）、バリン（ＶａｌまたはＶと略す）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩと略す）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬと略す）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭと略す）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦと略す）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷと略す）、システイン（ＣｙｓまたはＣと略す）、プロリン（ＰｒｏまたはＰと略す）と、疎水性の低いアミノ酸または親水性アミノ酸、例えば、リジン（ＬｙｓまたはＫと略す）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲと略す）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤと略す）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥと略す）、セリン（ＳｅｒまたはＳと略す）、チロシン（ＴｙｒまたはＹと略す）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴと略す）、グリシン（ＧｌｙまたはＧと略す）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨと略す）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱと略す）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮと略す）との交換、および疎水性の低いアミノ酸または親水性アミノ酸と疎水性残基との交換である。他の好ましいアミノ酸置換は、正の電荷を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）を、負の電荷を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換すること、または負の電荷を有するアミノ酸を正の電荷を有するアミノ酸と置換することによって、イオン力の破壊を標的とする。
【００２１】
したがって、好ましい突然変異は、Ｌ４３とＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＱおよびＮの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。別の好ましい突然変異は、Ｔ２６０とＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＰの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。別の好ましい突然変異は、Ｈ２６６とＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＰおよびＤおよびＥの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。別の好ましい突然変異は、Ｑ２７０とＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＰの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。突然変異は全て、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４によるアミノ酸配列のいずれか１つと比べて記載されている。
【００２２】
特に好ましいのは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つのアミノ酸配列に基づく、以下の突然変異：Ｖ２６３Ｄ、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０ＰおよびＴ２６０Ａである。
【００２３】
突然変異が起こる前の多量体形成の量と比べて多量体形成を増大させるアミノ酸配列が置換によって生じない限り、記載された突然変異の１つ以上の組合せも可能であることが当業者に理解されるであろう。
【００２４】
知られているように、アミノ酸の付番は、タンパク質が由来している種に依存する。付番は、欠失または挿入により変化することもある。しかしながら、配列を整列させる方法は当業者に公知である。したがって、本文書では、「またはそれに対応する」という語句は、その数字を除いて、配列番号１の位置４３、２６０および２６３と同じであるアミノ酸位置を説明するために用いられる。
【００２５】
本発明の単離されたポリペプチドは、多量体形成を減少させる突然変異の他に、所望の基質に対する選択性および／または活性を改善する１つ以上のさらなる突然変異を含み得る。
【００２６】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、位置４３、２６０および２６３、もしくはそれに対応する位置での１つ以上のアミノ酸置換と、Ｆ２３４ＳおよびＬ２３８Ｖの群から選択される１つ以上のアミノ酸置換とを含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに対して少なくとも９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログに関する。アミノ酸置換が、位置４３、位置２６０および位置２６３を含む位置の群から選択される、またはより具体的には、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３ＤおよびＶ２６３Ｇの群から選択される１つ以上の位置での１つ以上の置換であることが、この実施例でさらにより好ましい。
【００２７】
Ｆ２３４Ｓ突然変異は、ＡＰＬＥをコードする遺伝子の位置７０１のＴをＣに置換した結果であった。Ｌ２３８Ｖ突然変異は、ＡＰＬＥをコードする遺伝子の位置７１２のＴをＡに置換した結果であった。多量体形成を妨げる突然変異とは独立に、これら２つの突然変異のうちの少なくとも１つを含む配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むポリペプチドのいずれか１つの突然変異体は、パラ−ニトロフェニルアセタート、および／もしくはジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートの変換に、ならびに／またはラセミ（４ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルの分割に極めて有用である。したがって、本発明はまた、そのようなポリペプチドに関する。
【００２８】
したがって、本発明はまた、Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓの群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは９７％、より好ましくは９８％の同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログに関する。好ましくは、Ｌ２３８Ｖおよび／またはＦ２３４Ｓ突然変異が存在することに加えて、以下の位置には、以下のアミノ酸残基がある。すなわち、位置１２９、１３３、１３４、１３８および１３９において、残基は、それぞれ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、ＬおよびＡである。本発明はまた、Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓから選ばれる少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるポリペプチドをコードする核酸に関する。また、酸、エステルもしくはアルコールの産生のための、またはより具体的には、パラ−ニトロフェニルアセタートの変換、もしくはラセミ（４ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルの分割もしくはジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートの変換のための、Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓから選ばれる少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるポリペプチドの使用は、本発明の一部である。
【００２９】
本発明はまた、本発明による単離されたポリペプチドをコードする核酸に関する。特に、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３におけるコード配列である核酸および配列番号１、３、５、７、９、１１または１３におけるコード配列である核酸に対して、好ましくは８０％を上回る同一性、より好ましくは９０％を上回る、さらにより好ましくは９５％を上回る、最も好ましくは９８％を上回る同一性を有するそのホモログに関する。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、本発明による単離されたペプチドが適用される、酸、エステルまたはアルコールを製造するための方法に関する。また、本発明は、α−アルキル化酸および／またはエステルが製造されるそのような方法、より具体的には、これらのα−アルキル化酸から選択される光学的に純粋なα−アルキル化酸がその対応するアルコールに還元される方法に関する。さらなる実施形態では、これらのアルコールは、天然のジペプチド合成コピーであるジペプチドミメティックのビルディングブロックとしてさらに適用される。さらに、本発明は、血圧降下剤におけるこれらのビルディングブロックの適用に関する。
【００３１】
本発明はさらに、本明細書に記載されたような本発明による単離されたペプチド、核酸配列、ポリペプチドの使用および方法による様々な実施形態および／または好ましい特色の全てのあり得る組合せに関する。
【００３２】
さらに、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３と組み合わせた全ての実施形態に関し、ここで、ポリペプチドは、これらの配列中に示されたオープン・リーディング・フレームによってコードされている。
【００３３】
材料および方法
ポリペプチドおよびその突然変異体を調製するための一般的技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）に見出し得る。
【００３４】
［ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５および対応する突然変異体を発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の調製］
合成遺伝子γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５（配列番号４、６、８、１０、１２または１４を参照されたい）をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているような標準的な分子生物学の手法を用いて、ＡＰＬＥ（配列番号２および図１参照）をコードするｐＣｍ４７０＿ＤｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８ＰのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングした。
【００３５】
ｐＣｍ４７０＿ＤｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８ＰおよびＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５をコードする上で得られたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。
【００３６】
ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５の突然変異体は、ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５をコードする上記のプラスミドを鋳型として用いて、提供された取扱説明書に従って、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７）のクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）（登録商標）部位特異的突然変異導入キット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（カタログ＃２００５１８）を用いて、部位飽和突然変異導入によって調製した。
【００３７】
部位特異的突然変異導入のための突然変異導入プライマーの例を配列番号１５〜２４に記載する。得られたＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５の突然変異体プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。
配列番号１５：プライマーＬ４３Ｄ＿Ｆ
５’ＧＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＧＣ ３’
配列番号１６：プライマーＬ４３Ｄ＿Ｒ
５’ＧＣＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＧＡＣ ３’
配列番号１７：プライマーＴ２６０Ｐ＿Ｆ
５’ＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＧＣ ３’
配列番号１８：プライマーＴ２６０Ｐ＿Ｒ
５’ＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣ ３’
配列番号１９：プライマーＴ２６０Ａ＿Ｆ
５’ＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＧＣ ３’
配列番号２０：プライマーＴ２６０Ａ＿Ｒ
５’ＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣ ３’
配列番号２１：プライマーＶ２６３Ｄ＿Ｆ
５’ＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＧＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣ ３’
配列番号２２：プライマーＶ２６３Ｄ＿Ｒ
５’ＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＡＧ ３’
配列番号２３：プライマーＶ２６３Ｇ＿Ｆ
５’ＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＣ ３’
配列番号２４：プライマーＶ２６３Ｇ＿Ｒ
５’ＧＡＣＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧ ３’
【００３８】
［現および細胞回収］
培地成分および抗生物質は全て、ドイツ・カールスルーエのロート有限合資会社（Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。培養条件は以下の通りであった。すなわち、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む前培養（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ）培地のＬＢ培地（レノックス（Ｌｅｎｎｏｘ））２０ｍｌに、ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５および対応する突然変異体（調製については上を参照されたい）を発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを植菌し、１００ｍｌのエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコにて、２８℃および２００ｒｐｍで一晩（１８時間）インキュベートした。そのうちの１０ｍｌを用いて、２ｌのバッフル付き振盪フラスコにて、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）を含む主培養培地のＬＢ培地（レノックス（Ｌｅｎｎｏｘ））５００ｍｌに植菌した。主培養物を２８℃および１２０ｒｐｍでインキュベートし、ＯＤ６０００．６〜０．８で、０．１ｍＭのＩＰＴＧにより一晩（１８時間）誘導した。細胞を回収するために、培養物を４，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）２５ｍｌに再懸濁した。デューティーサイクルを８０％に、出力制御レベルを８にして、ブランソン・ソニファイアー（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｆｉｅｒ）（登録商標）２５０（ブランソン、ダンブリー、米国（Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＵＳＡ）を用いて、細胞を、氷水で冷やしたパルプ化（ｐｕｌｐｉｎｇ）ビーカー中で５分間超音波処理した。７５，６００×ｇおよび１０℃で１時間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む上清を滅菌濾過し（０．２μｍフィルター）、４℃で保存した。これらの透明化されたライセートを、パラ−ニトロフェニルアセタート（ｐ−ＮＰＡ）（シグマ・アルドリッチ・ラボルケミカリーン有限会社、ゼールツェ、ドイツ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌａｂｏｒｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＧｍｂＨ，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）アッセイを用いる活性測定に用いた。
【００３９】
［ネイティブゲル電気泳動］
ＡＰＬＥを含む細菌ライセートのブルーネイティブゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）を、以下の変更とともに、ＲｅｉｓｉｎｇｅｒおよびＥｉｃｈａｃｋｅｒ（２００６）、「ブルーネイティブゲル電気泳動による膜タンパク質複合体の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）」、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） ６ 補遺２、６−１５に記載された方法に従って行なった。２００μｇの可溶性タンパク質を含むアリコートを１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で最終容量９５μｌまで希釈した。５μｌのローディングバッファーをサンプルに添加した後、サンプルを８〜１６％の線形勾配ゲルに適用した。バイオラッド・グラジェント・フォーマー・モデル４８５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｆｏｒｍｅｒ ｍｏｄｅｌ ４８５）（バイオラッド・ラボラトリー、ウィーン、オーストリア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ））の助けを借りて、勾配ゲル（１６×２０ｃｍ）を作製した。ゲル１枚当たり２４ｍＡの定電流にて４℃で電気泳動を行なった。電気泳動後、ゲルを０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて室温で２０分間インキュベートした。エステラーゼ活性のゲル内検出のために、基質のフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）をアセトン［４ｍｇ／ｍｌ］に溶解させ、バイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）（登録商標）Ａメンブレン（０．４５ｍｍ、１６×２０ｃｍ）（ポール・ライフ・サイエンス、ミシガン、米国（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ））に適用した。アセトンの蒸発後、メンブレンをガラスプレート上に置かれたゲルと密に接触させた。ゲルとメンブレンのサンドイッチを３７℃で３０分間インキュベートした後、蛍光バンドを検出した。
【００４０】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット解析およびネイティブゲル電気泳動］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは標準的なプロトコルを基にした。ゲル（分離ゲル：１２．５％、積層ゲル：４％）に充填する前に、８０μｇの総タンパク質を含むサンプルをそれぞれの量の２×サンプルバッファーと混合し、４０℃で１５分間加熱した。ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−ＥＣＬ（商標）ニトロセルロースメンブレン（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））へのタンパク質のブロッティングには、ＴＥ ２２・マイティー・スモール・トランスフォア・タンク・トランスファー・ユニット（ＴＥ ２２ Ｍｉｇｈｔｙ Ｓｍａｌｌ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ）（アマシャム・バイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を用いた。一次抗体は、ブタ肝臓カルボキシルエステラーゼに対するポリクローナルウサギ抗体（アブカム、ケンブリッジ、英国（ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））であった。二次抗体は、ヒト血清タンパク質に対して吸着させたアルカリホスファターゼを結合させたポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体（レインコ・テクノロジーズ、セントルイス、米国（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ））であった。検出は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出（カルビオケム／ＥＭＤ、ラホーヤ、米国（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ／ＥＭＤ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））を用いてメンブレン上で直接行なわれた。使用したタンパク質標準は、ページ・ルーラー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ）（商標）プレステインド・タンパク質ラダー（フェルメンタス有限会社、セントレオン−ロット、ドイツ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））であった。
【００４１】
［ＰＬＥ活性の定量］
ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルおよびジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートに対する活性を自動滴定により測定した。滴定剤として、それぞれ、０．１Ｍおよび０．０１ＭのＮａＯＨ（ロート有限合資会社、カールスルーエ、ドイツ）を用いて、メトラー・トレド・ＤＬ５０・グラフィックス（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＬ５０ ＧｒａｐｈｉＸ）（メトラー・トレド有限会社；ギーセン、ドイツ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＧｍｂＨ；Ｇｉｅｓｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で測定を行なった。合計５０ｍｌの反応混合物は、トルエンに溶解させた５ｍｌの基質、すなわち、ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルまたはジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラート［１００ｍｇ／ｍｌ］、５ｍｌの１０％タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）ＮＰ−９（シグマ・アルドリッチ、ウィーン、オーストリア（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ））および１０〜４０ｍｇの可溶性タンパク質からなっていた。２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で、容量を５０ｍｌに調整した。
【００４２】
以下のｐ−ＮＰＡアッセイが使用されている：
２ｍＭのｐ−ＮＰＡを用いて、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中、室温で、透明化されたライセートを用いて、パラ−ニトロフェニルアセタート（ｐ−ＮＰＡ）（シグマ・アルドリッチ・ラボルケミカリーン有限会社、ゼールツェ、ドイツ）アッセイを行なった。パラ−ニトロフェノールの放出を、ベックマン・コールターＤＵ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＤＵ）（登録商標）８００分光光度計（ベックマン・コールター有限会社、クレーフェルト、ドイツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて、４０５ｎｍ（ε＝９．５９４６ｍｌ μｍｏｌ−１ ｃｍ−１）で定量した。１ユニットは、上記の反応条件下で１分間に１μｍｏｌのパラ−ニトロフェノールを放出する酵素の量として定義される。
【００４３】
［実施例］
本発明は、以下の実施例を参照して説明されるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１：ＰＬＥ活性の定量］
上記のようなｐ−ＮＰＡアッセイを、上記の反応条件下で１分間に１μｍｏｌのパラ−ニトロフェノールを放出する酵素の量として用いた。
【００４５】
図２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異がないＰＬＥ野生型酵素と比較した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異体ＰＬＥのｐ−ＮＰＡに対する総細胞活性の増加を示す。それぞれのＰＬＥ野生型変異体のレベルを各々のＰＬＥの１００％レベルとみなす。
【００４６】
本発明の枠組みでは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるポリペプチドの全ておよびそのホモログをＰＬＥと称する。したがって、ブタ腸カルボキシルエステラーゼ（ＰＩＣＥ）と呼ばれる酵素もまた、本発明の枠組みにおけるＰＬＥである。
【００４７】
Ｖ２６３Ｄ突然変異を挿入することにより、全てのＰＬＥが改善された活性を示したことが明白である。
【００４８】
［実施例２］
Ｖ２６３Ｄ突然変異を有するアイソザイムにおける多量体から単量体への四次構造の変化が、ネイティブタンパク質ゲル電気泳動でさらに見られた（図３）。
【００４９】
エステラーゼ活性は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）の加水分解から生じるフルオレセインでの染色によって本明細書で可視化された。７つの野生型酵素が全て、ネイティブゲル上でほぼ同じ高さの三量体であるのに対し、Ｖ２６３Ｄ突然変異体は、ゲルの下から３分の１にバンドを示している。複数のバンドを切り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解析した。複数のバンドは、約５８ｋＤａのサイズの１つの明白なバンドを生じさせる（データは示さない）。これらのバンドは、同じ単量体の異なる立体構造に起因すると考えられる。
【００５０】
［実施例３：四次構造の決定］
［グリセロール密度勾配遠心分離］
２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）中の５０％〜５％のグリセロール画分１ｍｌを、お互いの最上部に慎重に重ねて、ウルトラ−クリアー（Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ）（商標）遠心分離チューブ（１４×８９ｍｍ）（ベックマン、パロアルト、米国（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡ））中に入れた。その後、同じバッファー中に可溶性タンパク質を含有するライセート５００μｌを最上部に慎重に重ねた。約２００，０００×ｇの高速遠心分離をＳＷ ４１ローター（ベックマン、パロアルト、米国）にて４℃で２０時間行なった。画分、すなわち、５００μｌの０％グリセロールおよび１ｍｌの５〜５０％グリセロールを１．５ｍｌ反応チューブに慎重に回収し、４℃で保存した。
【００５１】
［フィルターアッセイ：］
ワットマン・クオリテイティブ・スタンダード・フィルター・サークルズ−スチューデント・グレード／グレード９３Φ８５ｍｍ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃｉｒｃｌｅｓ−Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｇｒａｄｅ／Ｇｒａｄｅ ９３Φ８５ｍｍ（ワットマン・インターナショナル社、メードストーン、イングランド（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ））を、２ｍｇ／ｍｌのフェノールレッド（ｐＨ７．５）、１％（ｖ／ｖ）のタージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）ＮＰ−９（シグマ・アルドリッチ・ラボルケミカリーン有限会社、ゼールツェ、ドイツ）および１０％（ｖ／ｖ）のラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステル（ＤＳＭ ファイン ケミカルズ オーストリア有限会社、リンツ、オーストリア（ＤＳＭ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａｕｓｔｒｉａ ＧｍｂＨ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ））を含有するアッセイ混合物に浸漬させた（補足図５〜１０の場合、基質は、１０％（ｖ／ｖ）のラセミジメチルメチルスクシナートであった）。アッセイ混合物のｐＨ値が低すぎる場合は、増加容量の１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を添加した。２μｌの無細胞抽出物をフィルター上にスポットした。エステルの加水分解およびそれぞれのカルボン酸の放出によって生じた、赤色から黄色への色の変化によって、酵素活性が示された。基質の品質、追加のバッファーの量および出発ｐＨから、色の変化に必要な時間が決定された。
【００５２】
この結果から、野生型ＡＰＬＥの主要画分は、２５％グリセロール濃度と３０％グリセロール濃度の間にあるが、突然変異体の単量体ＡＰＬＥの主要画分は、１５％グリセロールと２０％グリセロールの間にあることが示される。図４を参照されたい。
【００５３】
同様の実験を全ての天然のＰＬＥ変異体について行ない、それらは全て同じ効果を示した（補足図５〜１０を参照）。全ての補足実験で使用されたタンパク質標準は、ページ・ルーラー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ）（商標）プレステインド・タンパク質ラダーであった。
【００５４】
［実施例４］
パラ−ニトロフェニルアセタート（薄い灰色）およびジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラート（灰色）に対する活性、ならびにパラ−ニトロフェニルアセタート（薄い灰色）およびラセミ混合物（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステル（濃い灰色）に対する活性を、「材料および方法」の節の「ＰＬＥ活性の定量」において上で記載したように測定した。結果を図１１ａおよび１１ｂに示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＡＰＬＥをコードするｐＣｍ４７０＿ＤｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８Ｐを示す。
【図２】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異がないＰＬＥ野生型酵素と比較した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異体ＰＬＥのｐ−ＮＰＡに対する総細胞活性の増加を示す。
【図３】１ａ．ＡＰＬＥ。１ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＡＰＬＥ。２ａ：ＰＬＥ３。２ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ３。３ａ：ＰＬＥ４。３ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ４。４ａ：ＰＬＥ５。４ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ５。Ｎｅｇ．Ｃ：陰性対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ。５ａ：γ−ＰＬＥ。５ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むγ−ＰＬＥ。６ａ：ＰＬＥ２。６ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ２。７ａ：ＰＩＣＥ。７ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＩＣＥ。
【図４】ａ、ｂ：ＡＰＬＥ野生型。ｃ、ｄ：ＡＰＬＥ−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図５】ａ、ｂ：γＰＬＥ野生型。ｃ、ｄ：γＰＬＥ−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図６】ａ、ｂ：ＰＩＣＥ野生型。ｃ、ｄ：ＰＩＣＥ−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図７】ａ、ｂ：ＰＬＥ２野生型。ｃ、ｄ：ＰＬＥ２−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図８】ａ、ｂ：ＰＬＥ３野生型。ｃ、ｄ：ＰＬＥ３−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図９】ａ、ｂ ＰＬＥ４野生型。ｃ、ｄ ＰＬＥ４−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ ウェスタンブロッティング。
【図１０】ａ、ｂ ＰＬＥ５野生型。ｃ、ｄ ＰＬＥ５−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ ウェスタンブロッティング。
【図１１ａ】パラ−ニトロフェニルアセタートおよびジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートに対する活性を示す。
【図１１ｂ】パラ−ニトロフェニルアセタートおよびラセミ混合物（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルに対する活性を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エステラーゼ活性を有し、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在するポリペプチドの画分の濃度が、そのアミノ酸配列中に特定の突然変異がないポリペプチドと比べて増加した単離された突然変異体ポリペプチドに関する。本発明はまた、突然変異体ブタ肝臓エステラーゼをコードする単離された核酸配列および本発明による突然変異体ポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）は、非常に有用な部類の加水分解酵素として知られており、例えば、それらは、エステルのエナンチオ選択的加水分解において非常に有用である。ブタ肝臓から単離された粗ライセートのＰＬＥの使用には重大な欠点があったので、それらが有用であるとみなされている事実は、非常に驚くべきことである。（ｉ）異なる特性を有する様々なアイソザイムが存在するので、エナンチオ選択性がバッチ間で変化することがあり、また、操作上の安定性の違いのために、反応時間とともに変化することもある。（ｉｉ）粗ブタ肝臓抽出物のウイルスまたはプリオン汚染のリスクは、製薬業界にとっての大きな懸念である。（ｉｉｉ）さらに、ＰＬＥの助けを借りて生産された製品は、コーシャまたはハラールとみなされない可能性がある。
【０００３】
これらの制限のために、組換えでブタ肝臓アイソザイムを産生するための様々な努力が知られている。当初、メチルトローフ酵母のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）がブタ肝臓エステラーゼの優れた発現系であると思われたが、結局、正確な酵素フォールディングに寄与する特定の宿主、遺伝子および発現系が改善された後に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）がより優れた宿主であることが分かった。
【０００４】
国際特許出願国際公開第２００９／００４０９３号パンフレットには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるブタ肝臓エステラーゼの発現が記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
ＰＬＥはそのような有用な酵素であるので、この酵素で達成することができる活性レベルをさらに改善する必要が依然としてある。
【０００６】
驚くべきことに、現在、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたブタ肝臓エステラーゼアイソフォーム突然変異体および相同なエステラーゼの発現レベル、それゆえ、活性レベルは、そのアミノ酸配列中の１つまたは複数の残基、すなわち、ブタ肝臓エステラーゼの多量体形成に関与するアミノ酸の１つまたは複数を、多量体形成をもたらさないかまたは多量体形成の傾向を低下させるアミノ酸と置換し、それによりＰＬＥの四次構造を変化させることによって、顕著に改善できることが見出されている。
【０００７】
この発見は、配列番号１のヌクレオチド位置５５４１に対応する、ＡＰＬＥ（配列番号１）をコードするオープン・リーディング・フレームの位置７８８での突然変異の生成がきっかけであった。この置換はＴからＡへのものであり、ＡＰＬＥ酵素中の疎水性バリンの、負電荷を有するアスパラギン酸への置換（Ｖ２６３Ｄ）を生じさせた。コンピュータモデルにより、この突然変異は酵素の極めて外側のヘリックス表面に位置し、したがって、酵素の活性部位の空洞から離れた所にあることが示されたが、（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルに対するこの突然変異型酵素の総活性は、総可溶性タンパク質１ｍｇ当たり６．５から１１．６ユニットに増加することも分かった。ジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートの場合、活性は、総可溶性タンパク質１ｍｇ当たり３６から４２ｍＵに増加し、パラ−ニトロフェニルアセタートの場合、活性は、総可溶性タンパク質１ｍｇ当たり１５．４から２４．３Ｕに上昇した。当初は、ＡＰＬＥの外側領域の突然変異が様々な変換に対してなぜそのような強力な影響を有するのかという理由の説明はなかった。しかしながら、ヒトホモログｈＣＥ１の構造解析により、ＡＰＬＥの位置２６３のバリンが多量体化に重要である可能性があることが同定された。電荷を有するアスパラギン酸を代わりに導入することにより、２つのサブユニット間の相互作用を安定化する、もともと存在していた疎水性相互作用が損なわれる。負の電荷を有するアミノ酸は、疎水性相互作用を介して他のサブユニットに結合する代わりに、それと反発する可能性がある。
【０００８】
次に、多量体形成が、疎水性相互作用を妨げる位置２６３のアスパラギン酸によって導入される変化により妨げられ、そのために、単量体の形成がもたらされるという仮説を検証した。ＡＰＬＥのコンピュータモデルの分析から、ある単量体の位置２６３のバリンが、別の単量体の位置４３のロイシンと相互作用し得るという結論が得られた。三量体形成は、少なくとも一部は、合計３つのサブユニットの間でＬ４３とＶ２６３が交互に疎水性相互作用することにより起こると仮定された。したがって、どのアミノ酸がアスパラギン酸に置き換えられるにしても、相互作用は妨害されるはずである。仮説を検証するために、位置４３のロイシンをアスパラギン酸に置き換えると、単量体化がもたらされた。
【０００９】
この突然変異も単量体形成をもたらしたので、これにより、置換がなければ多量体を形成することができるＰＬＥ単量体の特定の位置にあるアミノ酸の置換によって、単量体形態で存在する酵素の量が増加することが証明され、Ｌ４３Ｄ変異体はＶ２６３Ｄ変異体よりも可溶性の低いタンパク質を生じさせたが、多量体形成に関与する位置で突然変異が導入され、かつ特定の変換のために用いられる酵素を含む一定量の透明化されたライセートに見出される活性が、同じ変換に用いられる突然変異がない酵素を含む同じ量の透明化されたライセートと比べて増大したことは明白である。同じ突然変異が配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによる全てのポリペプチドに導入され、同じ効果がもたらされた。
【００１０】
したがって、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された１つ以上の欠失または置換を含まないポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異がないポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログに関する。
【００１１】
１つ以上のアミノ酸を欠失させるのではなく、１つ以上のアミノ酸を置換することが好ましい。
【００１２】
本文書では、相対エステラーゼ活性は、野生型（すなわち、突然変異が導入されていない親酵素）の活性と、同じ量の可溶性タンパク質調製物（透明化されたライセート）を用いて同じ条件下で調製されたそれぞれの突然変異体酵素の活性を比較したものである（材料および方法の節の「発現および細胞回収」という見出しの下を参照されたい；そこには、透明化されたライセートの調製が記載されており、また、「ＰＬＥ活性の定量」の下には、活性を測定するための方法が記載されている）。相対活性（ｒ［％］）は、ｒ＝（［ｐ−ＮＰＡｍｕｔ］／［ｐ−ＮＰＡｗｔ］）×１００％という式に従って、１分間当たりの突然変異体ライセートのパラ−ニトロフェノールの放出（［ｐ−ＮＰＡｍｕｔ］）を、１分間当たりの対応する野生型ライセートのパラ−ニトロフェノール放出（［ｐ−ＮＰＡｗｔ］）で割ったものに、１００％を掛けて算出される。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、本発明による単離されたポリペプチドに関するものであり、このポリペプチドは、アミノ酸の欠失または置換がない対応する野生型ポリペプチドのエステラーゼ活性と比較して１０％のエステラーゼ活性の増加を示す。
【００１４】
酵素は、一次構造（アミノ酸配列）、二次構造（主にα−ヘリックスおよびβ−シート）ならびに三次構造（１ペプチド鎖の構造）を有する。さらに、いくつかの酵素は、同じ（ホモ）または異なる（ヘテロ）サブユニット（ペプチド鎖）の集合体（多量体）である四次構造を形成する。ブタ肝臓エステラーゼはホモ三量体である。この酵素および突然変異体の四次構造は、グリセロール密度勾配遠心分離（グリセロール密度勾配遠心分離の説明については、実施例３を参照されたい）およびネイティブゲル電気泳動（この方法の説明については、材料および方法の節の「ネイティブゲル電気泳動」という見出しの下を参照されたい）によって試験することができる。
【００１５】
多量体形成は、通常、異なるアミノ酸の複数の分子間引力、例えば、異なるサブユニット（単量体）の疎水性／疎水性またはイオン（陽／陰）相互作用によって起こる。そのような相互作用は、多くの場合、酵素を安定化し、それゆえ、酵素にとって有益であることが多い。本発明では、驚くべきことに、そのような引力のごく一部を破壊することによって、四次構造の変化と、透明化されたライセート中のＰＬＥおよび相同な酵素のより高い相対活性とがもたらされることが見出された。
【００１６】
したがって、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失が、単量体の相互作用点に、単量体が多量体を形成するときに位置し、かつ単量体間のその相互作用点を破壊するアミノ酸位置で起こっている、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された１つ以上の欠失または置換を含まないポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する突然変異がないポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログに関する。好ましくは、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチド、および配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに対して少なくとも９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有する単離されたポリペプチドに関するものであり、ここで、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失は、単量体の相互作用点に、単量体が多量体を形成するときに位置し、単量体間のその相互作用点を破壊するアミノ酸位置で起こっている。好ましくは、置換または欠失は、アミノ酸位置４３、２６０、２６３、２６６もしくは２７０の群から選択される１つ以上の位置、またはそれに対応する位置で行なわれる。好ましい置換は、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３ＤおよびＶ２６３Ｇまたはそれに対応する位置である。
【００１７】
特に、本発明は、位置４３、２６０、２６３またはそれに対応する位置の群から選択される１つ以上のアミノ酸置換、好ましくは、置換Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３Ｄ、Ｖ２６３Ｇまたはそれに対応する位置の群から選択される置換を含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしく１４のいずれか１つに対して９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る、より好ましくは９７％を上回る、最も好ましくは９８％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログに関する。
【００１８】
本発明の枠組みにおいて、同一性（または相同性）パーセントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉにある、以下の標準的なパラメータを用いて、Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ、Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ ２配列 − タンパク質配列とヌクレオチド配列を比較するための新しいツール（Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０に記載の通りに決定されたものであるか、またはそのように決定され得るものである。
−タンパク質配列の場合：
マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
オープンギャップ：５
伸長ギャップ：２
ペナルティギャップｘ＿ドロップオフ：１１
期待：１０
ワードサイズ：１１
−ヌクレオチドの場合：
一致に対する報酬：１
不一致に対するペナルティ：−２
オープンギャップ：１１
伸長ギャップ：１
ペナルティギャップｘ＿ドロップオフ：５０
期待：１０
ワードサイズ：３
【００１９】
様々な単量体の引力を破壊するために標的とすることができる位置は、ＰＬＥまたは相同な酵素（例えば、ヒト肝臓カルボキシルエステラーゼ１、ＰＤＢエントリー１ ＭＸ１もしくはウサギ肝臓カルボキシルエステラーゼ１、ＰＤＢエントリー１Ｋ４Ｙ）のＸ線構造の解析によるかまたはランダム突然変異導入実験によって同定することができる。置換の標的とするための好ましいアミノ酸位置は、位置４３、２６０および２６３、ならびにこれらのアミノ酸と相互作用する他のサブユニットのアミノ酸である。
【００２０】
既知の方法を用いて四次構造に寄与するアミノ酸位置を同定した後、引力を破壊するためにアミノ酸置換を選ぶ。好ましい置換は、疎水性残基、例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡと略す）、バリン（ＶａｌまたはＶと略す）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩと略す）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬと略す）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭと略す）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦと略す）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷと略す）、システイン（ＣｙｓまたはＣと略す）、プロリン（ＰｒｏまたはＰと略す）と、疎水性の低いアミノ酸または親水性アミノ酸、例えば、リジン（ＬｙｓまたはＫと略す）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲと略す）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤと略す）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥと略す）、セリン（ＳｅｒまたはＳと略す）、チロシン（ＴｙｒまたはＹと略す）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴと略す）、グリシン（ＧｌｙまたはＧと略す）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨと略す）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱと略す）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮと略す）との交換、および疎水性の低いアミノ酸または親水性アミノ酸と疎水性残基との交換である。他の好ましいアミノ酸置換は、正の電荷を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）を、負の電荷を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換すること、または負の電荷を有するアミノ酸を正の電荷を有するアミノ酸と置換することによって、イオン力の破壊を標的とする。
【００２１】
したがって、好ましい突然変異は、Ｌ４３とＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＱおよびＮの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。別の好ましい突然変異は、Ｔ２６０とＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＰの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。別の好ましい突然変異は、Ｈ２６６とＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＰおよびＤおよびＥの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。別の好ましい突然変異は、Ｑ２７０とＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＰの群から選ばれる任意のアミノ酸との置換である。突然変異は全て、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４によるアミノ酸配列のいずれか１つと比べて記載されている。
【００２２】
特に好ましいのは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つのアミノ酸配列に基づく、以下の突然変異：Ｖ２６３Ｄ、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０ＰおよびＴ２６０Ａである。
【００２３】
突然変異が起こる前の多量体形成の量と比べて多量体形成を増大させるアミノ酸配列が置換によって生じない限り、記載された突然変異の１つ以上の組合せも可能であることが当業者に理解されるであろう。
【００２４】
知られているように、アミノ酸の付番は、タンパク質が由来している種に依存する。付番は、欠失または挿入により変化することもある。しかしながら、配列を整列させる方法は当業者に公知である。したがって、本文書では、「またはそれに対応する」という語句は、その数字を除いて、配列番号１の位置４３、２６０および２６３と同じであるアミノ酸位置を説明するために用いられる。
【００２５】
本発明の単離されたポリペプチドは、多量体形成を減少させる突然変異の他に、所望の基質に対する選択性および／または活性を改善する１つ以上のさらなる突然変異を含み得る。
【００２６】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、位置４３、２６０および２６３、もしくはそれに対応する位置での１つ以上のアミノ酸置換と、Ｆ２３４ＳおよびＬ２３８Ｖの群から選択される１つ以上のアミノ酸置換とを含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに対して少なくとも９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログに関する。アミノ酸置換が、位置４３、位置２６０および位置２６３を含む位置の群から選択される、またはより具体的には、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３ＤおよびＶ２６３Ｇの群から選択される１つ以上の位置での１つ以上の置換であることが、この実施例でさらにより好ましい。
【００２７】
Ｆ２３４Ｓ突然変異は、ＡＰＬＥをコードする遺伝子の位置７０１のＴをＣに置換した結果であった。Ｌ２３８Ｖ突然変異は、ＡＰＬＥをコードする遺伝子の位置７１２のＴをＡに置換した結果であった。多量体形成を妨げる突然変異とは独立に、これら２つの突然変異のうちの少なくとも１つを含む配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むポリペプチドのいずれか１つの突然変異体は、パラ−ニトロフェニルアセタート、および／もしくはジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートの変換に、ならびに／またはラセミ（４ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルの分割に極めて有用である。したがって、本発明はまた、そのようなポリペプチドに関する。
【００２８】
したがって、本発明はまた、Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓの群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは９７％、より好ましくは９８％の同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログに関する。好ましくは、Ｌ２３８Ｖおよび／またはＦ２３４Ｓ突然変異が存在することに加えて、以下の位置には、以下のアミノ酸残基がある。すなわち、位置１２９、１３３、１３４、１３８および１３９において、残基は、それぞれ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、ＬおよびＡである。本発明はまた、Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓから選ばれる少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるポリペプチドをコードする核酸に関する。また、酸、エステルもしくはアルコールの産生のための、またはより具体的には、パラ−ニトロフェニルアセタートの変換、もしくはラセミ（４ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルの分割もしくはジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートの変換のための、Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓから選ばれる少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるポリペプチドの使用は、本発明の一部である。
【００２９】
本発明はまた、本発明による単離されたポリペプチドをコードする核酸に関する。特に、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３におけるコード配列である核酸および配列番号１、３、５、７、９、１１または１３におけるコード配列である核酸に対して、好ましくは８０％を上回る同一性、より好ましくは９０％を上回る、さらにより好ましくは９５％を上回る、最も好ましくは９８％を上回る同一性を有するそのホモログに関する。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、本発明による単離されたペプチドが適用される、酸、エステルまたはアルコールを製造するための方法に関する。また、本発明は、α−アルキル化酸および／またはエステルが製造されるそのような方法、より具体的には、これらのα−アルキル化酸から選択される光学的に純粋なα−アルキル化酸がその対応するアルコールに還元される方法に関する。さらなる実施形態では、これらのアルコールは、天然のジペプチド合成コピーであるジペプチドミメティックのビルディングブロックとしてさらに適用される。さらに、本発明は、血圧降下剤におけるこれらのビルディングブロックの適用に関する。
【００３１】
本発明はさらに、本明細書に記載されたような本発明による単離されたペプチド、核酸配列、ポリペプチドの使用および方法による様々な実施形態および／または好ましい特色の全てのあり得る組合せに関する。
【００３２】
さらに、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３と組み合わせた全ての実施形態に関し、ここで、ポリペプチドは、これらの配列中に示されたオープン・リーディング・フレームによってコードされている。
【００３３】
材料および方法
ポリペプチドおよびその突然変異体を調製するための一般的技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）に見出し得る。
【００３４】
［ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５および対応する突然変異体を発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の調製］
合成遺伝子γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５（配列番号４、６、８、１０、１２または１４を参照されたい）をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているような標準的な分子生物学の手法を用いて、ＡＰＬＥ（配列番号２および図１参照）をコードするｐＣｍ４７０＿ＤｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８ＰのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングした。
【００３５】
ｐＣｍ４７０＿ＤｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８ＰおよびＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５をコードする上で得られたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。
【００３６】
ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５の突然変異体は、ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５をコードする上記のプラスミドを鋳型として用いて、提供された取扱説明書に従って、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７）のクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）（登録商標）部位特異的突然変異導入キット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（カタログ＃２００５１８）を用いて、部位飽和突然変異導入によって調製した。
【００３７】
部位特異的突然変異導入のための突然変異導入プライマーの例を配列番号１５〜２４に記載する。得られたＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５の突然変異体プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。
配列番号１５：プライマーＬ４３Ｄ＿Ｆ
５’ＧＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＴＡＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＧＣ ３’
配列番号１６：プライマーＬ４３Ｄ＿Ｒ
５’ＧＣＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＧＡＣ ３’
配列番号１７：プライマーＴ２６０Ｐ＿Ｆ
５’ＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＧＣ ３’
配列番号１８：プライマーＴ２６０Ｐ＿Ｒ
５’ＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣ ３’
配列番号１９：プライマーＴ２６０Ａ＿Ｆ
５’ＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＧＣ ３’
配列番号２０：プライマーＴ２６０Ａ＿Ｒ
５’ＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣ ３’
配列番号２１：プライマーＶ２６３Ｄ＿Ｆ
５’ＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＧＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣ ３’
配列番号２２：プライマーＶ２６３Ｄ＿Ｒ
５’ＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＡＧ ３’
配列番号２３：プライマーＶ２６３Ｇ＿Ｆ
５’ＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＣ ３’
配列番号２４：プライマーＶ２６３Ｇ＿Ｒ
５’ＧＡＣＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧ ３’
【００３８】
［現および細胞回収］
培地成分および抗生物質は全て、ドイツ・カールスルーエのロート有限合資会社（Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。培養条件は以下の通りであった。すなわち、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む前培養（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ）培地のＬＢ培地（レノックス（Ｌｅｎｎｏｘ））２０ｍｌに、ＡＰＬＥ、γＰＬＥ、ＰＩＣＥ、ＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５および対応する突然変異体（調製については上を参照されたい）を発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを植菌し、１００ｍｌのエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコにて、２８℃および２００ｒｐｍで一晩（１８時間）インキュベートした。そのうちの１０ｍｌを用いて、２ｌのバッフル付き振盪フラスコにて、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）を含む主培養培地のＬＢ培地（レノックス（Ｌｅｎｎｏｘ））５００ｍｌに植菌した。主培養物を２８℃および１２０ｒｐｍでインキュベートし、ＯＤ６０００．６〜０．８で、０．１ｍＭのＩＰＴＧにより一晩（１８時間）誘導した。細胞を回収するために、培養物を４，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）２５ｍｌに再懸濁した。デューティーサイクルを８０％に、出力制御レベルを８にして、ブランソン・ソニファイアー（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｆｉｅｒ）（登録商標）２５０（ブランソン、ダンブリー、米国（Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＵＳＡ）を用いて、細胞を、氷水で冷やしたパルプ化（ｐｕｌｐｉｎｇ）ビーカー中で５分間超音波処理した。７５，６００×ｇおよび１０℃で１時間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む上清を滅菌濾過し（０．２μｍフィルター）、４℃で保存した。これらの透明化されたライセートを、パラ−ニトロフェニルアセタート（ｐ−ＮＰＡ）（シグマ・アルドリッチ・ラボルケミカリーン有限会社、ゼールツェ、ドイツ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌａｂｏｒｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＧｍｂＨ，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）アッセイを用いる活性測定に用いた。
【００３９】
［ネイティブゲル電気泳動］
ＡＰＬＥを含む細菌ライセートのブルーネイティブゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）を、以下の変更とともに、ＲｅｉｓｉｎｇｅｒおよびＥｉｃｈａｃｋｅｒ（２００６）、「ブルーネイティブゲル電気泳動による膜タンパク質複合体の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）」、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） ６ 補遺２、６−１５に記載された方法に従って行なった。２００μｇの可溶性タンパク質を含むアリコートを１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で最終容量９５μｌまで希釈した。５μｌのローディングバッファーをサンプルに添加した後、サンプルを８〜１６％の線形勾配ゲルに適用した。バイオラッド・グラジェント・フォーマー・モデル４８５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｆｏｒｍｅｒ ｍｏｄｅｌ ４８５）（バイオラッド・ラボラトリー、ウィーン、オーストリア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ））の助けを借りて、勾配ゲル（１６×２０ｃｍ）を作製した。ゲル１枚当たり２４ｍＡの定電流にて４℃で電気泳動を行なった。電気泳動後、ゲルを０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて室温で２０分間インキュベートした。エステラーゼ活性のゲル内検出のために、基質のフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）をアセトン［４ｍｇ／ｍｌ］に溶解させ、バイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）（登録商標）Ａメンブレン（０．４５ｍｍ、１６×２０ｃｍ）（ポール・ライフ・サイエンス、ミシガン、米国（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ））に適用した。アセトンの蒸発後、メンブレンをガラスプレート上に置かれたゲルと密に接触させた。ゲルとメンブレンのサンドイッチを３７℃で３０分間インキュベートした後、蛍光バンドを検出した。
【００４０】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット解析およびネイティブゲル電気泳動］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは標準的なプロトコルを基にした。ゲル（分離ゲル：１２．５％、積層ゲル：４％）に充填する前に、８０μｇの総タンパク質を含むサンプルをそれぞれの量の２×サンプルバッファーと混合し、４０℃で１５分間加熱した。ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−ＥＣＬ（商標）ニトロセルロースメンブレン（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））へのタンパク質のブロッティングには、ＴＥ ２２・マイティー・スモール・トランスフォア・タンク・トランスファー・ユニット（ＴＥ ２２ Ｍｉｇｈｔｙ Ｓｍａｌｌ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ Ｔａｎｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｎｉｔ）（アマシャム・バイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を用いた。一次抗体は、ブタ肝臓カルボキシルエステラーゼに対するポリクローナルウサギ抗体（アブカム、ケンブリッジ、英国（ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））であった。二次抗体は、ヒト血清タンパク質に対して吸着させたアルカリホスファターゼを結合させたポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体（レインコ・テクノロジーズ、セントルイス、米国（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ））であった。検出は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出（カルビオケム／ＥＭＤ、ラホーヤ、米国（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ／ＥＭＤ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））を用いてメンブレン上で直接行なわれた。使用したタンパク質標準は、ページ・ルーラー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ）（商標）プレステインド・タンパク質ラダー（フェルメンタス有限会社、セントレオン−ロット、ドイツ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））であった。
【００４１】
［ＰＬＥ活性の定量］
ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルおよびジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートに対する活性を自動滴定により測定した。滴定剤として、それぞれ、０．１Ｍおよび０．０１ＭのＮａＯＨ（ロート有限合資会社、カールスルーエ、ドイツ）を用いて、メトラー・トレド・ＤＬ５０・グラフィックス（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＬ５０ ＧｒａｐｈｉＸ）（メトラー・トレド有限会社；ギーセン、ドイツ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＧｍｂＨ；Ｇｉｅｓｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で測定を行なった。合計５０ｍｌの反応混合物は、トルエンに溶解させた５ｍｌの基質、すなわち、ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルまたはジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラート［１００ｍｇ／ｍｌ］、５ｍｌの１０％タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）ＮＰ−９（シグマ・アルドリッチ、ウィーン、オーストリア（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ））および１０〜４０ｍｇの可溶性タンパク質からなっていた。２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で、容量を５０ｍｌに調整した。
【００４２】
以下のｐ−ＮＰＡアッセイが使用されている：
２ｍＭのｐ−ＮＰＡを用いて、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中、室温で、透明化されたライセートを用いて、パラ−ニトロフェニルアセタート（ｐ−ＮＰＡ）（シグマ・アルドリッチ・ラボルケミカリーン有限会社、ゼールツェ、ドイツ）アッセイを行なった。パラ−ニトロフェノールの放出を、ベックマン・コールターＤＵ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＤＵ）（登録商標）８００分光光度計（ベックマン・コールター有限会社、クレーフェルト、ドイツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて、４０５ｎｍ（ε＝９．５９４６ｍｌ μｍｏｌ−１ ｃｍ−１）で定量した。１ユニットは、上記の反応条件下で１分間に１μｍｏｌのパラ−ニトロフェノールを放出する酵素の量として定義される。
【００４３】
［実施例］
本発明は、以下の実施例を参照して説明されるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１：ＰＬＥ活性の定量］
上記のようなｐ−ＮＰＡアッセイを、上記の反応条件下で１分間に１μｍｏｌのパラ−ニトロフェノールを放出する酵素の量として用いた。
【００４５】
図２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異がないＰＬＥ野生型酵素と比較した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異体ＰＬＥのｐ−ＮＰＡに対する総細胞活性の増加を示す。それぞれのＰＬＥ野生型変異体のレベルを各々のＰＬＥの１００％レベルとみなす。
【００４６】
本発明の枠組みでは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つによるポリペプチドの全ておよびそのホモログをＰＬＥと称する。したがって、ブタ腸カルボキシルエステラーゼ（ＰＩＣＥ）と呼ばれる酵素もまた、本発明の枠組みにおけるＰＬＥである。
【００４７】
Ｖ２６３Ｄ突然変異を挿入することにより、全てのＰＬＥが改善された活性を示したことが明白である。
【００４８】
［実施例２］
Ｖ２６３Ｄ突然変異を有するアイソザイムにおける多量体から単量体への四次構造の変化が、ネイティブタンパク質ゲル電気泳動でさらに見られた（図３）。
【００４９】
エステラーゼ活性は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）の加水分解から生じるフルオレセインでの染色によって本明細書で可視化された。７つの野生型酵素が全て、ネイティブゲル上でほぼ同じ高さの三量体であるのに対し、Ｖ２６３Ｄ突然変異体は、ゲルの下から３分の１にバンドを示している。複数のバンドを切り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解析した。複数のバンドは、約５８ｋＤａのサイズの１つの明白なバンドを生じさせる（データは示さない）。これらのバンドは、同じ単量体の異なる立体構造に起因すると考えられる。
【００５０】
［実施例３：四次構造の決定］
［グリセロール密度勾配遠心分離］
２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）中の５０％〜５％のグリセロール画分１ｍｌを、お互いの最上部に慎重に重ねて、ウルトラ−クリアー（Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ）（商標）遠心分離チューブ（１４×８９ｍｍ）（ベックマン、パロアルト、米国（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡ））中に入れた。その後、同じバッファー中に可溶性タンパク質を含有するライセート５００μｌを最上部に慎重に重ねた。約２００，０００×ｇの高速遠心分離をＳＷ ４１ローター（ベックマン、パロアルト、米国）にて４℃で２０時間行なった。画分、すなわち、５００μｌの０％グリセロールおよび１ｍｌの５〜５０％グリセロールを１．５ｍｌ反応チューブに慎重に回収し、４℃で保存した。
【００５１】
［フィルターアッセイ：］
ワットマン・クオリテイティブ・スタンダード・フィルター・サークルズ−スチューデント・グレード／グレード９３Φ８５ｍｍ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃｉｒｃｌｅｓ−Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｇｒａｄｅ／Ｇｒａｄｅ ９３Φ８５ｍｍ（ワットマン・インターナショナル社、メードストーン、イングランド（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ））を、２ｍｇ／ｍｌのフェノールレッド（ｐＨ７．５）、１％（ｖ／ｖ）のタージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）ＮＰ−９（シグマ・アルドリッチ・ラボルケミカリーン有限会社、ゼールツェ、ドイツ）および１０％（ｖ／ｖ）のラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステル（ＤＳＭ ファイン ケミカルズ オーストリア有限会社、リンツ、オーストリア（ＤＳＭ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａｕｓｔｒｉａ ＧｍｂＨ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ））を含有するアッセイ混合物に浸漬させた（補足図５〜１０の場合、基質は、１０％（ｖ／ｖ）のラセミジメチルメチルスクシナートであった）。アッセイ混合物のｐＨ値が低すぎる場合は、増加容量の１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を添加した。２μｌの無細胞抽出物をフィルター上にスポットした。エステルの加水分解およびそれぞれのカルボン酸の放出によって生じた、赤色から黄色への色の変化によって、酵素活性が示された。基質の品質、追加のバッファーの量および出発ｐＨから、色の変化に必要な時間が決定された。
【００５２】
この結果から、野生型ＡＰＬＥの主要画分は、２５％グリセロール濃度と３０％グリセロール濃度の間にあるが、突然変異体の単量体ＡＰＬＥの主要画分は、１５％グリセロールと２０％グリセロールの間にあることが示される。図４を参照されたい。
【００５３】
同様の実験を全ての天然のＰＬＥ変異体について行ない、それらは全て同じ効果を示した（補足図５〜１０を参照）。全ての補足実験で使用されたタンパク質標準は、ページ・ルーラー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ）（商標）プレステインド・タンパク質ラダーであった。
【００５４】
［実施例４］
パラ−ニトロフェニルアセタート（薄い灰色）およびジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラート（灰色）に対する活性、ならびにパラ−ニトロフェニルアセタート（薄い灰色）およびラセミ混合物（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステル（濃い灰色）に対する活性を、「材料および方法」の節の「ＰＬＥ活性の定量」において上で記載したように測定した。結果を図１１ａおよび１１ｂに示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＡＰＬＥをコードするｐＣｍ４７０＿ＤｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８Ｐを示す。
【図２】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異がないＰＬＥ野生型酵素と比較した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶ２６３Ｄ突然変異体ＰＬＥのｐ−ＮＰＡに対する総細胞活性の増加を示す。
【図３】１ａ．ＡＰＬＥ。１ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＡＰＬＥ。２ａ：ＰＬＥ３。２ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ３。３ａ：ＰＬＥ４。３ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ４。４ａ：ＰＬＥ５。４ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ５。Ｎｅｇ．Ｃ：陰性対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ。５ａ：γ−ＰＬＥ。５ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むγ−ＰＬＥ。６ａ：ＰＬＥ２。６ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＬＥ２。７ａ：ＰＩＣＥ。７ｂ：Ｖ２６３Ｄ突然変異を含むＰＩＣＥ。
【図４】ａ、ｂ：ＡＰＬＥ野生型。ｃ、ｄ：ＡＰＬＥ−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図５】ａ、ｂ：γＰＬＥ野生型。ｃ、ｄ：γＰＬＥ−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図６】ａ、ｂ：ＰＩＣＥ野生型。ｃ、ｄ：ＰＩＣＥ−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図７】ａ、ｂ：ＰＬＥ２野生型。ｃ、ｄ：ＰＬＥ２−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図８】ａ、ｂ：ＰＬＥ３野生型。ｃ、ｄ：ＰＬＥ３−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ：ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ：ウェスタンブロッティング。
【図９】ａ、ｂ ＰＬＥ４野生型。ｃ、ｄ ＰＬＥ４−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ ウェスタンブロッティング。
【図１０】ａ、ｂ ＰＬＥ５野生型。ｃ、ｄ ＰＬＥ５−Ｖ２６３Ｄ。ａ、ｃ ｐＨシフトアッセイ。ｂ、ｄ ウェスタンブロッティング。
【図１１ａ】パラ−ニトロフェニルアセタートおよびジメチル−３−（３，４−ジクロルフェニル）−グルタラートに対する活性を示す。
【図１１ｂ】パラ−ニトロフェニルアセタートおよびラセミ混合物（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エノン酸メチルエステルに対する活性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、少なくとも１つのアミノ酸置換が、単量体の相互作用点に、前記単量体が多量体を形成するときに位置し、かつ前記単量体間のその相互作用点を破壊するアミノ酸位置で起こっている、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された前記突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する前記突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された前記１つ以上の欠失または置換を含まない前記ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する前記突然変異がない前記ポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログ。
【請求項２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに対して９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、アミノ酸の欠失または置換がない対応する野生型ポリペプチドのエステラーゼ活性と比較して、少なくとも１０％のエステラーゼ活性の増加を示す、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記置換または欠失が、アミノ酸位置４３、２６０、２６３、２６６もしくは２７０、またはそれに対応する位置の群から選択される１つ以上の位置で行なわれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
位置４３、２６０および／または２６３またはそれに対応する位置での１つ以上のアミノ酸置換を含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに対して９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る、より好ましくは９８％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログ。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３Ｄ、Ｖ２６３Ｇまたはそれに対応する位置の群から選択される、請求項４または５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓの群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項９】
酸、エステルまたはアルコールを産生するための請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドが適用される、酸、エステルまたはアルコールの製造方法。
【請求項１１】
α−アルキル化酸および／またはエステルが製造される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光学的に純粋なα−アルキル化酸がその対応するアルコールに還元される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルコールが、ジペプチドミメティックのビルディングブロックとしてさらに適用される、請求項１０または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビルディングブロックが血圧降下剤に適用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたはそのホモログであって、少なくとも１つのアミノ酸置換が、単量体の相互作用点に、前記単量体が多量体を形成するときに位置し、かつ前記単量体間のその相互作用点を破壊するアミノ酸位置で起こっている、前記配列番号に示すような１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換または欠失を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された前記突然変異体ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する前記突然変異体ポリペプチドの画分の濃度が、同じ条件下において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された前記１つ以上の欠失または置換を含まない前記ポリペプチドの透明化されたライセート中に活性型でかつ可溶性のタンパク質として存在する前記突然変異がない前記ポリペプチドの画分の濃度と比べて増加した突然変異体ポリペプチドが得られる、単離されたポリペプチドまたはそのホモログ。
【請求項２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のいずれか１つに対して９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、アミノ酸の欠失または置換がない対応する野生型ポリペプチドのエステラーゼ活性と比較して、少なくとも１０％のエステラーゼ活性の増加を示す、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記置換または欠失が、アミノ酸位置４３、２６０、２６３、２６６もしくは２７０、またはそれに対応する位置の群から選択される１つ以上の位置で行なわれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
位置４３、２６０および／または２６３またはそれに対応する位置での１つ以上のアミノ酸置換を含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、エステラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のいずれか１つに対して９０％を上回る、好ましくは９５％を上回る、より好ましくは９８％を上回る同一性のアミノ酸同一性を有するそのホモログ。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、Ｌ４３Ｄ、Ｔ２６０Ｐ、Ｔ２６０Ａ、Ｖ２６３Ｄ、Ｖ２６３Ｇまたはそれに対応する位置の群から選択される、請求項４または５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
Ｌ２３８ＶおよびＦ２３４Ｓの群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項９】
酸、エステルまたはアルコールを産生するための請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドが適用される、酸、エステルまたはアルコールの製造方法。
【請求項１１】
α−アルキル化酸および／またはエステルが製造される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光学的に純粋なα−アルキル化酸がその対応するアルコールに還元される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルコールが、ジペプチドミメティックのビルディングブロックとしてさらに適用される、請求項１０または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビルディングブロックが血圧降下剤に適用される、請求項１３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２４５３５（Ｐ２０１２−５２４５３５Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６５３１（Ｐ２０１２−５０６５３１）
【出願日】平成２２年４月２６日（２０１０．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５５６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２１７５
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２６日（２０１０．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５５６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２１７５
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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