改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼの配列を提供することで、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下における酵素の自殺不活性化の速度が低下する。酵素は、グリセロールデヒドラターゼのα−サブユニットをコードするＤｈａＢ１遺伝子を標的にした、エラープローンＰＣＲおよびオリゴヌクレオチド−誘導変異誘発を使用して作り出される。改善された反応速度を有する変異株は、これもまたここで開示されるハイスループットアッセイを使用して迅速に同定される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−プロパンジオールを生成するための分子生物学分野およびＢ_１２依存性デヒドラターゼの使用に関する。より具体的には、酵素不活性化速度が低下するように反応速度が改善されたＢ_１２依存性デヒドラターゼを作り出し、選択する方法について述べる。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、いくつかの用途において、ポリエステル、ポリエーテル、およびポリウレタンを製造するための出発原料をはじめとする有用性を有する。１，３−プロパンジオールを製造するための方法としては、伝統的化学経路および生物学的経路の双方が挙げられる。１，３−プロパンジオールを製造するための生物学的方法については、最近述べられている（非特許文献１）。１，３−プロパンジオールを生物学的に製造するのには、二段階逐次反応の基質としてのグリセロールが必要である。まずデヒドラターゼ（典型的に補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ）が、グリセロールを中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）に変換する。次にＮＡＤＨ−（またはＮＡＤＰＨ）−依存酸化還元酵素（式１および２参照）によって、３−ＨＰが１，３−プロパンジオールに還元される。
グリセロール→３−ＨＰ＋Ｈ_２Ｏ（式１）
３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ^＋（式２）
【０００３】
１，３−プロパンジオールはさらに代謝されることなく、その結果、培養液中に高濃度で蓄積する。
【０００４】
典型的にグリセロールは、１，３−プロパンジオールを生物学的に生成するための出発原料として使用される。しかしグルコースおよびその他の炭水化物もまた、１，３−プロパンジオール生成のための適切な基質である。具体的にはラフェンド（Ｌａｆｆｅｎｄ）ら（特許文献１、特許文献２）は、デヒドラターゼ活性を含んでなる単一微生物を使用して、グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基質（特に、例えばグルコース）から１，３−プロパンジオールを製造する方法を開示する。エンプテイジ（Ｅｍｐｔａｇｅ）ら（特許文献３）は、３−ＨＰを１，３−プロパンジオールに変換する非特異的触媒活性（ｄｈａＴによってコードされる１，３−プロパンジオール酸化還元酵素とは区別される）によって得られる力価（リットル当たりの生成グラム数）の顕著な増大について述べる。ペイン（Ｐａｙｎｅ）ら（特許文献４）は、１，３−プロパンジオールを生物学的に生成するのに有用な特定のベクターおよびプラスミドを開示する。セレヴァン（Ｃｅｒｖｉｎ）ら（特許文献５）は、１，３−プロパンジオールの高収率生成のための改善された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を開示する。特許文献１、特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、参照によってその全体を本明細書に援用したものとする。
【０００５】
グリセロールを３−ＨＰに変換するのに関与する酵素は、主として補酵素Ｂ_１２依存性グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）および補酵素Ｂ_１２依存性ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）として知られる補酵素Ｂ_１２依存性酵素である。これらの異なるが関係のある補酵素Ｂ_１２依存性酵素は、それらの分子および生化学的特性に関しては十分に研究されている。補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの遺伝子は、例えば肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、およびラクトバシラス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）で同定されている（非特許文献２、非特許文献３、および非特許文献４）。
【０００６】
文献中で使用される遺伝子命名法には幅広いバリエーションがあるが、各例で補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼは、大型または「α」サブユニット、中型または「β」サブユニット、および小型または「γ」サブユニットの３個のサブユニットから構成される。これらのサブユニットは、α_２β_２γ_２構造体にアセンブルされてアポ酵素を形成する。補酵素Ｂ_１２（活性補助因子化学種）は、アポ酵素に結合して触媒的に活性のホロ酵素を形成する。補酵素Ｂ_１２は、それによって触媒作用が起きるラジカル機序に関与するので、触媒の活性のために必要とされる。
【０００７】
生化学的に、補酵素Ｂ_１２依存性グリセロールおよび補酵素Ｂ_１２依存性ジオールデヒドラターゼの双方が、グリセロールおよびその他の基質による機序ベースの自殺不活性化を被ることが知られている（非特許文献３、非特許文献５）。さらに不活性化は、ホロ酵素と高濃度の１，３−プロパンジオールとの相互作用を通じて起きる。不活性化は補酵素Ｂ_１２補助因子のコバルト−炭素（Ｃｏ−Ｃ）結合の開裂を伴い、５’−デオキシアデノシンの形成と不活性なコバラミン化学種をもたらす。不活性なコバラミン化学種はデヒドラターゼ密接に結合したままであり、補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ再活性化因子（「デヒドラターゼ再活性化因子」）の介入なしには解離が起きない。この不活性化は３−ＨＰ形成に結びついた反応速度を顕著に低下でき、それによって間接的に１，３−プロパンジオール生成を減少させる。
【０００８】
補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ不活性化の影響は、部分的に克服できる。例えば不活性化は、デヒドラターゼ活性を再活性化するのに関与するタンパク質に依存して克服できる。デヒドラターゼ再活性化因子については、特許文献６、特許文献７、非特許文献３、非特許文献６、および非特許文献７で述べられる。再活性化は多段階プロセスで起きる。最初にＡＴＰ−依存プロセスにおいて、不活性化された補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼとデヒドラターゼ再活性化因子との相互作用が、密接に結合した不活性なコバラミン化学種の放出を引き起こし、アポ酵素が生成する。引き続いてデヒドラターゼアポ酵素が補酵素Ｂ_１２と結合して、触媒的に活性なホロ酵素を再形成しても良く、（別のＡＴＰ−依存プロセスで酵素作用によって）不活性なコバラミン化学種が補酵素Ｂ_１２に再生されても良い。しかしデヒドラターゼ再活性化および補酵素Ｂ_１２再生プロセスの双方がＡＴＰを必要とするので、デヒドラターゼ活性復元のためにデヒドラターゼ再活性化因子だけに依存することは、本質的に限定される。これらのＡＴＰ−依存プロセスは、特に引き続く３−ＨＰから１，３−プロパンジオールへの反応が存在して、１，３−プロパンジオール濃度が高い場合、グリセロールを３−ＨＰに変換するプロセスに対する顕著なエネルギー負荷を意味する。
【０００９】
代案としては、１，３−プロパンジオール生成中に培地に添加する補酵素Ｂ_１２の量を増大させる、あるいは培養液に（生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）補酵素Ｂ_１２に変換される）ビタミンＢ_１２を補充する、のいずれかで微生物に追加的な補酵素Ｂ_１２を供給することが可能である。しかしどちらの場合もこれらの添加経費が、プロセスの経済性を顕著に妨げるかもしれない。
【００１０】
クロウ（Ｃｒｏｕｘ）ら（特許文献８）は、補酵素Ｂ_１２非依存性デヒドラターゼを発現する組み換え微生物を使用して１，３−プロパンジオールを製造するプロセスを開発することで、補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼに関する問題に対処した。しかしこの解決法の有用性は、特定の好ましいプロセス条件下でＢ_１２非依存性デヒドラターが機能する能力によって限定されるかもしれない（例えば好気性条件下で（非特許文献８））。
【００１１】
原理上は、自然発生微生物株から不活性化速度が低下した補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼを単離することが可能なはずである。低下した不活性化速度は、微生物宿主における補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの代謝回転率（生成物ｍｏｌ／ホロ酵素ｍｏｌ）を増大させ、これによりデヒドラターゼおよび補酵素Ｂ_１２の要求量が低下する。このアプローチはそのレベルのデヒドラターゼおよび補酵素Ｂ_１２を維持するのに必要なエネルギーも低下させるであろう。しかし実際には、補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの多様性は不活性化速度に関して限られていることが分かっている。
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９６／３５７９６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，６８６，２７６号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／０１２８３３号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願第６０／３７４９３１号明細書
【特許文献５】米国特許出願第６０／４１６１９２号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／２１３４１号パンフレット
【特許文献７】米国特許第６，０１３，４９４号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／０４３２４ Ａ１号パンフレット
【非特許文献１】ゼング（Ｚｅｎｇ）ら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４：２３９〜２５９（２００２）
【非特許文献２】トラヤ（Ｔｏｒａｙａ）Ｔ．、アミノ酸残基および関連ラジカルに関与する金属結合酵素（Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ−Ｒｅｓｉｄｕｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒａｄｉｃａｌｓ）、シーゲル（Ｓｉｇｅｌ）Ｈ．およびシーゲル（Ｓｉｇｅｌ）Ａ．編；生物学的システム中の金属イオン（Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；マーセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）：ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９４；第３０巻、ｐｐ２１７〜２５４
【非特許文献３】ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２２：５５３〜５６６（１９９９）
【非特許文献４】サウヴェージ（Ｓａｕｖａｇｅｏｔ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０９：６９〜７４（２００２）
【非特許文献５】サイフェルト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６８：２３６９〜２３７８（２００１）
【非特許文献６】トラヤ（Ｔｏｒａｙａ）およびモリ（Ｍｏｒｉ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：３３７２（１９９９）
【非特許文献７】トビマツ（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１：４１１０（１９９９）
【非特許文献８】ハートマニス（Ｈａｒｔｍａｎｉｓ）およびステードマン（Ｓｔａｄｍａｎ）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２４５：１４４〜５２（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって解決すべき問題は、現在入手できる補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ酵素が、工業化合物の生成のために工業用途で必要な反応速度を提供できないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
出願人らは、
（ａ）Ｂ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素と、グリセロールおよび少なくとも２５ｍＭの１，３−プロパンジオールを含んでなる混合物とを接触させ、
（ｂ）Ｂ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素をスクリーニングして、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの代謝回転率を推定する
ことを含んでなる、改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼのスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
方法のスクリーニングステップは、
（ａ）補酵素Ｂ_１２、デヒドラターゼ再活性化因子、または内在性Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの供給源を有さない細胞をグリセロールを含まない発酵性炭素基質上に生育させ、
（ｂ）細胞を透過化処理し、
（ｃ）補酵素Ｂ_１２、グリセロール、および少なくとも２５ｍＭの１，３−プロパンジオールの混合物をステップ（ｂ）の透過化処理された細胞添加し、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生産された３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを定量化する
ことをさらに含んでなり、
定量化は、Ｔ１、Ｔ２、およびＴ（６００）よりなる群から選択される測定である。
【００１６】
本発明は、配列番号：４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８２、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０８、２１２、２１５、２１８、２２１、２２５、２２９、２３３、２３７、２４１、２４５、２４９、２５３、２５７、２６１、２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７よりなる群から選択される、Ｂ_１２依存性変異株デヒドラターゼをコードする核酸配列をさらに含む。より好ましいＢ_１２依存性変異株デヒドラターゼは、配列番号：４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８２、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０８、２１２、２１５、２１８、２２１、２２５、２２９、２３３、２３７、２４１、２４５、２４９、２５３、２５７、２６１、２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７よりなる群から選択される核酸配列によってコードされる。Ｂ_１２依存性変異株デヒドラターゼをコードするより好ましい核酸配列は、配列番号：１４０、１７９、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２１２、２１５、２１８、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７よりなる群から選択されるα−βサブユニット融合を含んでなる。Ｂ_１２依存性変異株デヒドラターゼをコードする最も好ましい核酸配列は、配列番号３１３、３２２、および３２８よりなる群から選択されるα−βサブユニット融合を含んでなる。
【００１７】
本発明はまた、α−βサブユニット融合のαおよびβサブユニット間にリンカー配列さらに含んでなる核酸配列を含み、リンカー配列は、配列番号１８および配列番号１９よりなる群から選択される。
【００１８】
本発明はまた、
ａ）ホットスポット１またはホットスポット２を含んでなるＢ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素と変異原因物質とを接触させ、
ｂ）ステップＡ）で生産された変異株を改善されたｋｃａｔおよび／または安定性についてスクリーニングし、そして
ｃ）ステップａ）およびｂ）を反復する
ことを含んでなる、改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼ変異株作り出す方法を含む。
【００１９】
標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼを同定するための本発明のさらに別の方法は、
ａ）デヒドラターゼホロ酵素と５〜１０ｍＭのグリセロールおよび／または１０〜３００ｍＭの１，３−プロパンジオールとを接触させ、
ｂ）ハイスループットアッセイにおいて、ｋ_ｃａｔおよび総酵素代謝回転を推定するのに十分に隔たった少なくとも２個の時点で測定し、
ｃ）標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性変異株を選択する
ことを含んでなる。
【００２０】
標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼを同定するなおも別の本発明の方法は、
ａ）デヒドラターゼホロ酵素と５〜５０ｍＭグリセロールおよび＞３００ｍＭの１，３−プロパンジオールとを接触させ、
ｂ）ハイスループットアッセイにおいて、Ｔ０から十分に隔たった１つの時点で測定して、総酵素代謝回転数を推定し、そして
ｃ）標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性変異株を選択する
ことを含んでなる。
【００２１】
配列リスト
出願人らは、特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列開示を司る規則（ＥＰＯ通達ＯＪ １２／１９９２、追補Ｎｏ．２で公開されるＥＰＯ長官決定の付録ＩおよびＩＩ）、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５および付録ＡおよびＢ（ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む出願の開示に関する要件）で述べられる、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する３４６個の配列を提供した。配列説明は、参照によって本明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３：３０２１〜３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２１９（２）：３４５〜３７３（１９８４）で述べられるＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に準拠して定義される、ヌクレオチド配列性状のための１文字コードおよびアミノ酸のための３文字コードを含む。
【００２２】
配列番号１は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５（エンプテイジ（Ｅｍｐｔａｇｅ）ら、国際公開第０１／０１２８３３ Ａ２号パンフレット）から単離された野生型ＧＤＨを含有する１２．１ｋＢのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片である。野生型ＧＤＨは、α−サブユニット（ｂｐ ７０４４〜８７１１）、β−サブユニット（ｂｐ ８７２４〜９３０８）、およびγ−サブユニット（ｂｐ ９３１１〜９７３６）によってコードされる。ＧＤＨのα、β、およびγ−サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、および配列番号４として提供される。
【００２３】
配列番号５および６は、プラスミドｐＧＨ２０からのＧＤＨのクローニングのために使用されるプライマーＤＨＡ−Ｆ１およびＤＨＡ−Ｒ１をそれぞれコードする。
【００２４】
配列番号７は、ＧＤＨのα−サブユニット全体およびβ−サブユニットの一部のクローニングのために使用される逆転写プライマーＤＨＡ−Ｒ２をコードする。
【００２５】
配列番号８〜１４は、α−サブユニットの領域性無作為変異誘発のために使用されるプライマーｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ１、ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ１、ＴＢ４ＢＦ、ＴＢ４ＢＲ、ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ２、ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ２、およびＧＤ−Ｃをそれぞれコードする。
【００２６】
配列番号１５〜１７は、領域性無作為変異株ライブラリーの調製のために使用される変性プライマーｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３、ＴＢ４Ｂ−Ｒ１、およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４をそれぞれコードする。
【００２７】
配列番号１８は、融合タンパク質Ｓｍａ３００２のα−およびβ−サブユニット間のリンカーをコードする。配列番号１９は、融合タンパク質Ｘｂａ３００９のα−およびβ−サブユニット間のリンカーをコードする。
【００２８】
配列番号２０〜２５は、第二世代変異株ＧＤＨの合成のために使用されるプライマー２−Ｆ４−Ｆ１、２−Ｆ４−Ｒ１、１２−Ｂ１−Ｆ１、１２−Ｂ１−Ｒ１、１６−Ｈ５−Ｆ１、および１６−Ｈ５−Ｒ１をそれぞれコードする。
【００２９】
配列番号２６〜２９は、純粋融合変異株１−Ｅ１および２２−Ｇ７を作り出すために使用されるプライマー１−Ｅ１−Ｆ１、１−Ｅ１−Ｒ１、２２−Ｇ７−Ｆ１、および２２−Ｇ７−Ｒ１をそれぞれコードする。
【００３０】
配列番号３０〜３９は、Ｓｍａ３００２−由来変異株の合成のために使用されるプライマー７Ａ−Ｃ１−Ｆ１、７Ａ−Ｃ１−Ｒ１、７Ｃ−Ａ５−Ｆ１、７Ｃ−Ａ５−Ｒ１、８−Ｃ９−Ｆ１、８−Ｃ９−Ｒ１、９−Ｄ７−Ｆ１、９−Ｄ７−Ｒ１、１０−Ｇ６−Ｆ１、および１０−Ｇ６−Ｒ１をそれぞれコードする。
【００３１】
野生型ＧＤＨから誘導される変異酵素は、それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列に従って、以下のＳＥＱ識別番号を割り当てられる（表１）。
【００３２】
【表１】

【００３３】
【表２】

【００３４】
【表３】

【００３５】
配列番号３４０〜３４２は、プライマーＴ５３−ＳＭ、Ｌ５０９−ＳＭ、およびＶ２２４−ＳＭをそれぞれコードする。
【００３６】
配列番号３４３および３４４は、プライマーＧＤＨＭ−Ｆ１およびＧＤＨＭ−Ｒ１をそれぞれのコードする。
【００３７】
配列番号３４５および３４６は、プライマーＧＤＨＭ−Ｆ２およびＧＤＨＭ−Ｒをそれぞれのコードする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
出願人らは、工業用途で使用するための、具体的には３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドおよび１，３−プロパンジオールを製造するための改善された反応速度を有する（すなわちグリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で増大した総代謝回転数を提供する）人工的補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼを提供することで既述の問題を解決した。変異誘発技術によって作り出されたこれらのデヒドラターゼは、それらがそれから作り出された野生型酵素と比較して、増大したｋ_ｃａｔおよび／または低下した酵素不活性化速度のいずれかを有することで特徴づけられる。
【００３９】
本発明の人工的補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼは、触媒作用速度の不当な犠牲なしに不活性化速度を低下させる。デヒドラターゼ不活性化問題のこの解決法は、微生物宿主において補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの代謝回転率（生成物ｍｏｌ／ホロ酵素ｍｏｌ）を増大させるので好ましい。増大した代謝回転率の効果は、デヒドラターゼ要求量、補酵素Ｂ_１２要求量、およびエネルギー消費を低下させて、そのデヒドラターゼおよび補酵素Ｂ_１２レベルを維持する。さらに補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼは、工業プロセス条件下での１，３−プロパンジオール生成のために効率的に作動することが実証されている。
【００４０】
一連の変異株デヒドラターゼを提供するのに加えて、本発明は２個のハイスループットアッセイも提供して、変異株デヒドラターゼのスクリーニングを容易にする。どちらの方法も補酵素Ｂ_１２、デヒドラターゼ再活性化因子、またはＢ_１２依存性依存デヒドラターゼの供給源を有さない細胞における、アポ酵素形態のＢ_１２依存性デヒドラターゼの存在に依存する。したがって補酵素Ｂ_１２および基質グリセロールの添加に基づいて、デヒドラターゼ活性の開始を正確に制御することが可能である。
【００４１】
具体的には、変異補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ遺伝子の大きなライブラリーを作成して、遺伝子産物を発現させ、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール混合物存在下での不活性化低下についてハイスループット様式でスクリーニングした。スクリーニング方法は、低下した不活性化速度および改善されたグリセロール触媒作用速度を有するこれらの人工的補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの容易で迅速な同定を可能にする。引き続くデヒドラターゼエンジニアリングの工程は、なおさらに改善されたデヒドラターゼ変異体の生成および同定を可能にする。
【００４２】
ここでの教示に基づいて、本発明で述べられるように、グリセロールから３−ＨＰへの転換を触媒できるＢ_１２依存性デヒドラターゼ活性をコードする多様な遺伝子が、変異誘発およびスクリーニングのための標的として適することは、当業者には明らかである。したがって改善された反応速度（すなわちグリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下における増大した総代謝回転数）を有する多様な変異株デヒドラターゼが、この発明の手段によって同定できることが期待される。
【００４３】
定義
明細書および請求項の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００４４】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲという形に省略する。
【００４５】
「３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド」は、３−ＨＰという形に省略する。
【００４６】
「デヒドラターゼ」という用語は、グリセロール分子を生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに異性化または変換できるあらゆる酵素を指すために使用する。上述のようにいくつかのデヒドラターゼは、補助因子として補酵素Ｂ_１２を必要とする。「補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ」および「Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ」という用語は区別なく使用され、補酵素Ｂ_１２を必要とするデヒドラターゼを指す。補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼは、補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）および補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を含んでなる。代案としては、デヒドラターゼは補酵素Ｂ_１２非依存性であっても良い。これらの酵素は補助因子として補酵素Ｂ_１２を必要とせず、「Ｂ_１２非依存性デヒドラターゼ」という用語で呼ばれる。本発明の目的で、「グリセロールデヒドラターゼ」と言う用語は、特に補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）を指すために使用され、「ジオールデヒドラターゼ」と言う用語は、特に補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を指すために使用される（出願人らの命名法の意図的選択は、Ｂ_１２非依存性デヒドラターゼを「ジオールデヒドラターゼ」および「グリセロールデヒドラターゼ」とそれぞれ称したハートマニス（Ｈａｒｔｍａｎｉｓ）およびステードマン（Ｓｔａｄｍａｎ）、同上、およびクラウス（Ｃｒｏｕｘ）ら、同上、の選択と混同すべきでない）。
【００４７】
「アポ酵素」と言う用語は、タンパク質から構成される酵素の部分を指す。アポ酵素は、酵素が機能するために必要とするかもしれない非タンパク質構造を含まないので、アポ酵素は触媒的に不活性であっても良い。「補助因子」と言う用語は、アポ酵素によって触媒の活性のために必要とされる非タンパク質構造を指す。「ホロ酵素」と言う用語は、触媒的に活性なタンパク質−補助因子複合体を指す。補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼアポ酵素は、ホロ酵素を形成するために補助因子補酵素Ｂ_１２を必要とする。
【００４８】
「補酵素Ｂ_１２」および「アデノシルコバラミン」と言う用語は区別なく使用されて、５’−デオキシアデノシルコバラミンを意味する。
【００４９】
「ビタミンＢ_１２」および「シアノコバラミン」と言う用語は区別なく使用されて、上軸５’−デオキシ−５’−アデノシルリガンドが、シアノ部分にによって置換される補酵素Ｂ_１２の誘導体を指す。
【００５０】
「ヒドロキソコバラミン」は、上軸５’−デオキシアデノシルリガンドがヒドロキシ部分によって置換される補酵素Ｂ_１２の誘導体を指す。アクアコバラミンは、ヒドロキソコバラミンのプロトン化形態である。
【００５１】
グリセロールまたは１，３−プロパンジオールによるＢ_１２非依存性デヒドラターゼホロ酵素の不活性化は、上軸５’−デオキシ−５’−アデノシルリガンドを失った不活性なコバラミン化学種の形成をもたらす。「補酵素Ｂ_１２前駆物質」と言う用語は、上軸５’−デオキシアデノシルリガンドが置換されている補酵素Ｂ_１２の誘導体を指す。
【００５２】
ここでの用法では、「ＧＤＨ」と言う用語は、特に肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５から単離され、配列番号１のｂｐ ７０４４〜８７１１、ｂｐ ８７２４〜９３０８、およびｂｐ ９３１１〜９７３６によってコードされるＢ１２依存性グリセロールデヒドラターゼを指す。「ＧＤＨ」と言う用語は、α、β、およびγ−サブユニットのアセンブルされた複合体を指すのに使用され、アポ酵素またはホロ酵素を指しても良い。ＧＤＨの個々のサブユニットへの言及は、例えば「ＧＤＨのα−サブユニット」または「ＧＤＨα−サブユニット」などのサブユニットを特定する。同様にα−およびβ−およびγ−サブユニットを総称して、あるいはＧＤＨの個々のサブユニットに言及して、ＧＤＨのアミノ酸配列に言及しても良い。ＧＤＨのα、β、およびγ−サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、および配列番号４として提供される。
【００５３】
この発明の開示の目的では、ＧＤＨは、人工的（変異株）誘導体との比較でＤＮＡおよびアミノ酸配列の標準として使用される。ＧＤＨはまた、本発明を使用して作り出された人工的誘導体の反応速度がそれに対して測定される、野生型反応速度の標準として使用される。ここではＧＤＨが標準材料として使用されるが、あらゆる自然発生的補酵素Ｂ_１２−依存デヒドラターゼ（例えば表２に列挙されるもの）が本発明においてＧＤＨと区別なく使用でき、それに対して人工的誘導体の反応速度が測定される。
【００５４】
「遺伝的に変更される」と言う用語は、形質転換または変異によって遺伝的材料を変化させるプロセスを指す。
【００５５】
ここでの用法では、「変異株」と言う用語は、変異プロセスによって生成したＧＤＨ酵素またはＧＤＨ配列を含有する細菌クローン、プラスミド、ライブラリーまたはベクターを指す。代案としては、変異株と言う用語は、変異プロセスによって生じたＧＤＨ酵素、ＧＤＨアミノ酸配列、またはＧＤＨ ＤＮＡ配列を直接指す。したがって変異株ＧＤＨは（野生型）ＧＤＨとは異なる。
【００５６】
「改善された反応速度」と言う用語は、グリセロールおよび／または１，３−プロパンジオール存在下で、野生型酵素に対して低下したデヒドラターゼ不活性化速度を指す。したがって改善された反応速度は、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で、増大した総酵素代謝回転数に関係がある。これはｋ_ｃａｔの増大および／または酵素不活性化速度の低下のどちらかによって達成できる。
【００５７】
「触媒効率」と言う用語は、酵素のｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍとして定義される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を定量化するのに使用される。
【００５８】
「ｋ_ｃａｔ」、「Ｋ_Ｍ」、および「Ｋ_ｉ」と言う用語は当業者に知られており、（フェルスト（Ｆｅｒｓｔ）著、「酵素構造および機序（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」第二版、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８５、ｐｐ９８〜１２０）で述べられている。
【００５９】
「ｋ_ｃａｔ」と言う用語は、「代謝回転数」と呼ばれることが多い。「ｋ_ｃａｔ」と言う用語は、単位時間あたり活性部位あたりの生成物に変換される基質分子の最大数、または単位時間あたりに酵素が回転する数として定義される。ｋ_ｃａｔ＝Ｖ_最大／［Ｅ］、（式中、［Ｅ］は酵素濃度である）（フェルスト（Ｆｅｒｓｔ）著、「酵素構造および機序（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」第二版、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８５、ｐｐ９８〜１２０）。「総代謝回転」および「総代謝回転数」と言う用語は、ここでは反応開始（Ｔ_０）とホロ酵素の完全な不活性化が起きる間に、Ｂ１２依存性デヒドラターゼホロ酵素とグリセロールとの（場合により１，３−プロパンジオール存在下での）反応によって形成される生成物量を指すのに使用される。
【００６０】
「Ｋ_ｉ」と言う用語は、１，３−プロパンジオールの阻害定数を指す。
【００６１】
「ｋ_{観察された不活性}」と言う用語は、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素と過剰なグリセロールおよび／または過剰な１，３−プロパンジオールとの反応において観察される、不活性化の一次反応速度定数を指す。過剰なグリセロールのみの存在下で、ｋ_{観察された不活性}はｋ_{不活性グリセロール}に等しい。過剰な１，３−プロパンジオールのみの存在下で、ｋ_{観察された不活性}はｋ_{不活性１，３−プロパンジオール}に等しい。過剰なグリセロールおよび過剰な１，３−プロパンジオール単独双方存在下で、ｋ_{観察された不活性}は、ｋ_{不活性グリセロール}およびｋ_{不活性１，３−プロパンジオール}双方の関数に等しい。
【００６２】
「Ｔ１」と言う用語は、１０ｍＭのグリセロールおよび５０ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下で、反応開始３０秒後に測定されるＧＤＨ酵素反応によって作られる生成物量を指す。Ｔ１はｋ_ｃａｔに比例する。
【００６３】
「Ｔ２」と言う用語は、１０ｍＭのグリセロールおよび５０ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下で、反応開始４０分後に測定されるＧＤＨ酵素反応によって作られる生成物量を指す。Ｔ２はｋ_ｃａｔ／ｋ_{観察された不活性}に比例し、総酵素総代謝回転数を反映する。
【００６４】
「Ｔ２／Ｔ１比率」と言う用語は、Ｔ２とＴ１との比率を指す。Ｔ２／Ｔ１比率は、１／ｋ_{観察された不活性}に比例する。
【００６５】
「Ｔ２（６００）」と言う用語は、１０ｍＭのグリセロールおよび６００ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下で、反応開始４０分後に測定されるＧＤＨ酵素反応によって作られる生成物量を指す。Ｔ２（６００）はｋ_ｃａｔ／ｋ_{観察された不活性}に比例し、６００ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下における総酵素総代謝回転数を反映する。
【００６６】
「Ｔ（６００）」と言う用語は、１０ｍＭのグリセロールおよび６００ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下で、反応開始７０分後に測定されるＧＤＨ酵素反応によって作られる生成物量を指す。Ｔ（６００）はｋ_ｃａｔ／ｋ_{観察された不活性}に比例する。Ｔ（６００）値は、６００ｍＭ１，３−プロパンジオール存在下においてＴ２（６００）よりも正確な総酵素代謝回転数を与える。
【００６７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」と言う用語は、区別なく使用される。
【００６８】
「宿主細胞」または「宿主生物体」と言う用語は、外来性または非相同的遺伝子を受け入れてこれらの遺伝子を発現し、活性遺伝子産物を生成できる微生物を指す。
【００６９】
「単離された」と言う用語は、それが自然に関連する少なくとも１個の構成要素から取り除かれるタンパク質またはＤＮＡ配列を指す。
【００７０】
「単離された核酸分子」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸分子は、１個またはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなっても良い。
【００７１】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、場合によってはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでも良い。「天然遺伝子」および「野生型遺伝子」は、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなっても良い。「内因性の遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性の」遺伝子とは、宿主生物体において常態では見られないが、代わりに遺伝子移入によって宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来性の遺伝子は、非天然生物体中に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入される遺伝子である。
【００７２】
「コードする」および「コーディング」と言う用語は、それによって遺伝子が、転写および翻訳の機序を通じてアミノ酸配列を生成するプロセスを指す。特定のアミノ酸配列をコードするプロセスは、コードされるアミノ酸における変化を引き起こさない塩基置換を伴うかもしれないＤＮＡ配列を含み、あるいは１個またはそれ以上アミノ酸を変更するかもしれないが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の官能特性に影響しない塩基置換を伴うＤＮＡ配列を含むものと理解される。したがって本発明は、特定の例示的な配列以上のものを包含するものと理解される。
【００７３】
「アミノ酸」と言う用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。アミノ酸は、参照によって本明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３：３０２１〜３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２１９（２）：３４５〜３７３（１９８４）で述べられるＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に準拠して定義されるように、１文字コードまたはアミノ酸のための３文字コードのいずれかによって識別される。
【００７４】
特定のタンパク質では、ＤＮＡコード領域内の点置換変異、および得られるアミノ酸変化は、以下の表記法の１つを使用して、標準ＤＮＡおよびアミノ酸配列を参照して特定される。例えばＧＤＨにおける変異の場合、変異は下で述べる表記法の１つを使用して記述される。
１．詳細な表記法：最初に野生型コドンのヌクレオチド配列が提示され、続いて「α」、「β」または「γ」記号（ＧＤＨのα−、β−、またはγ−サブユニットの変異を区別するため）、３文字略語の特定の野生型アミノ酸、およびその位置が提示される。次に野生型情報の後に、参照される変異中に存在する特定のヌクレオチドおよびアミノ酸修飾が続く。この表記法の例はＧＧＧ（α−Ｇｌｙ６３）からＧＧＡ（Ｇｌｙ）であり、ここではα−サブユニットの６３番目のコドンが、変異株においてヌクレオチド配列が「ＧＧＧ」から「ＧＧＡ」に変更されるようにサイレント変異を被る。
２．「簡略」表記法：「α」、「β］、または「γ」の記号（ＧＤＨのα−、β−またはγ−サブユニットにおける変異と区別するため）に、野生型アミノ酸の１文字略語、コドン位置、および変異株アミノ酸の１文字略語が続く。この表記法の例はα−Ｖ２２４Ｌであり、変異株におけるα−サブユニット中のコドン２２４における野生型バリンからロイシンへの変異を表す。特定部位で化学的に同等のアミノ酸の生成をもたらす（しかしコードされるタンパク質官能特性に影響しない）遺伝子における変更が一般的であることは、技術分野で良く知られている。
【００７５】
「実質的に同様の」とは、１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、１個またはそれ以上アミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の官能特性に影響しない核酸分子を指す。「実質的に同様の」とはまた、１個またはそれ以上ヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたはコサプレッション技術によって、遺伝子発現の変更を媒介する核酸分子の能力に影響しない核酸分子を指す。「実質的に同様の」とはまた、アンチセンスまたはコサプレッション技術による遺伝子発現の変更を媒介する能力に対して、得られる転写物の官能特性、または得られるタンパク質分子の官能特性の変更に実質的に影響しない、本発明の核酸分子の修飾（１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの）を指す。本発明は特定の例示的な配列以上のものを包含する。
【００７６】
提案される各修飾は、十分に技術分野の日常的技術の範囲内であり、コードされる生成物の生物学的活性維持の判定も同様である。さらに当業者は、この発明によって実質的に包含される同様の配列が、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄とそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、ここで例示する配列とハイブリッドするそれらの能力によっても定義されることを認識する。本発明の好ましい実質的に同様の核酸断片は、そのＤＮＡ配列が、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、ここで報告する核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一である核酸断片である。
【００７７】
核酸断片は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリッド形成および洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第二版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８９）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される。
【００７８】
「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９３）、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照されたい）などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定が得られるのに十分な、そのポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる、アミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリッド形成）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成）において使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸分子を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸分子の特定の同定および／または単離ができるようにする十分な配列を含んでなる。本明細書は、１つまたは複数の特定タンパク質をコードする、部分的または完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の利益を享受して、開示された配列の全てまたはかなりの部分を当業者に知られている目的のために使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに上で定義されるようなこれらの配列のかなりの部分を含んでなる。
【００７９】
「相補的」と言う用語は、二本鎖ＤＮＡ間の関係について述べる。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に同様の核酸配列に相補的な単離された核酸分子も含む。
【００８０】
「パーセント同一性」と言う用語は、技術分野で知られているように、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野で「同一性」とは、場合によっては、このような配列のストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク（Ｌｅｓｋ）Ａ．Ｍ．編、オックスフォードユニバーシティ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８、２．）「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｗ．編、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９３、３．）「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第一部、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ、ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４、４．）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙ）」、フォン・ハインェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８７、５．）「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編、ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１で述べられるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最大の整合を与えるようにデザインされる。
【００８１】
同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。２個の配列間の同一性および類似性を判定する好ましいコンピュータプログラム法としては、それらの標準デフォルト値がｇａｐ形成ペナルティ＝１２およびｇａｐ延長ペナルティ＝４である、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用するＧＣＧプログラムパッケージにあるＧＣＧパイルアッププログラム（デュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４〜２４４８（１９８８））が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給元から一般に入手できる（「ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ Ｍｅｄ．（ＮＣＢＩＮＬＭ）ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））。同一性を判定する別の好ましい方法は、ヨッタン−ハイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）アルゴリズムを使用するＤＮＡＳＴＡＲタンパク質アライメントプロトコル法による（ハイン（Ｈｅｉｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６２６−６４５ （１９９０））。アラインメントのためのヨッタン−ハイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）法のデフォルト変数は、１．）複数アラインメントではｇａｐペナルティ＝１１、ｇａｐ長さペナルティ＝３、および２．）対合アラインメントではｋｔｕｐｌｅ＝６である。一例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチドあたり５点の変異を含んでも良いこと以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の５％までのヌクレオチドが、欠失しまたは別のヌクレオチドで置換されていても良く、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドの数が、参照配列中に挿入されていても良い。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端部位で生じても、あるいはこれの末端部位間のあらゆる位置で、参照配列中の、または参照配列中の１つまたは複数の隣接するグループ中のヌクレオチドに個別に挿入されて生じても良い。同じように参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が参照アミノ酸の各１００個のアミノ酸あたり５個までのアミノ酸の変化を含むこと以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意味する。換言すると参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中の５％までのアミノ酸残基が欠失しまたは別のアミノ酸で置換されていても良く、あるいは参照配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸の数が、参照配列中に挿入されていても良い。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端部位で生じても、あるいはこれらの末端部位間のあらゆる位置で参照配列中の、または参照配列中の１つまたは複数の隣接するグループ中の残基間に個別に挿入されて生じても良い。
【００８２】
「相同的」と言う用語は、特定の宿主細胞において天然または自然発生的なタンパク質またはポリペプチドを指す。本発明は組換えＤＮＡ技術を通じて、相同的タンパク質を生成する微生物を含む。
【００８３】
「パーセント相同性」と言う用語は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性の程度を指す。第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列と同一である場合、第１および第２のアミノ酸配列は１００％相同性を示す。あらゆる２個のポリペプチド間の相同性は、どちらかの配列の特定部位の整合アミノ酸総数の一次関数であり、例えば２個の配列のどちらかのアミノ酸総数の半分が同一ならば、２個の配列は５０％の相同性を示すと言われる。
【００８４】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コード中の分岐を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」について良く知っている。
【００８５】
結果として生じるタンパク質分子の機能特性に実質的に影響しない、沈黙変化を生じる配列中の欠失、挿入または置換などの配列の修飾も考察された。例えば遺伝子コードの縮重を反映する、あるいは特定部位で化学的に等価のアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列中の変化が考察された。場合によってはタンパク質の生物学的活性変化の効果を研究するために、配列の変異体を作り出すことが実際望ましいかもしれない。提案される各変更は、十分に技術分野のルーチン技術の範囲内であり、コードされる生成物中の生物学的活性保持の判定についても同様である。
【００８６】
「発現」と言う用語は、遺伝子産物配列の遺伝子コードから遺伝子産物への転写および翻訳を指す。
【００８７】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共に、プロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【００８８】
「遺伝子組み換え」と言う用語は、交差または非依存性組み合わせのプロセスによって、親テンプレート分子中に存在しない遺伝的組み合わせがそれによって形成されるプロセスを指す。したがって遺伝子組み換えは、親テンプレート分子から得ることができる遺伝的配列の全ての組み合わせを含み（それによって新たに生成された「遺伝子組み換え産生物」の各ヌクレオチド位置が、その特定のヌクレオチド位置のあらゆる親テンプレートから誘導できる）、さらに遺伝子組み換えは、新たな変異（すなわち、欠失、置換、挿入）の導入を含む。
【００８９】
「遺伝子組み換えされたポリペプチド」と言う用語は、遺伝子組み換えされた遺伝子またはＤＮＡによってコードされたポリペプチドを意味する。遺伝子組み換えされたポリペプチドは、変更または増強された特性を有することが多い。
【００９０】
ポリペプチドまたはタンパク質に適用される「変更された特性」と言う用語は、アッセイ法によって測定できる、ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に付随する特性を指し、その特性は、天然配列に付随するものと比較して増強されまたは減少する。変更されても良い酵素の好ましい特性の例としては、酵素の活性、基質特異性、阻害物質に対する安定性、熱安定性、プロテアーゼ安定性、溶剤安定性、洗浄剤安定性、および折りたたみ特性が挙げられる。「増強された生物学的特性」とは、天然配列に付随するものを超える変更された特性を指す。「減少した生物学的特性」とは、天然配列に付随するものに満たない変更された特性を指す。
【００９１】
「テンプレート」または「親テンプレート」と言う用語は、ワトソン−クリック塩基対形成規則に従って、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって複写されて、新しいＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を生成する核酸分子を指す。テンプレート分子から生成される第１のコピーは相補的配列を有するので、テンプレート（または「モデル」）中の配列情報は保存される。テンプレート分子は単一または二本鎖であっても良く、あらゆる供給源に由来しても良い。
【００９２】
「複製」は、「テンプレート核酸」の核酸鎖の相補的コピーが、ポリメラーゼ酵素によって合成されるプロセスである。「プライマー誘導」複製では、このプロセスは、複製を開始するために、「二重の」「オリゴヌクレオチド」の末端ヌクレオチドの（デオキシ）リボース部分の３’位置にヒドロキシル基（ＯＨ）を必要とする。
【００９３】
核酸の「５’領域」および「３’領域」は、遺伝子組み換えが起きることが望ましいヌクレオチド領域を参照して、相対的用語として使用される。これらの領域はテンプレート分子内またはテンプレート分子に付着する側方ＤＮＡ配列内であっても良い。不対プライマーが、これらの５’および３’領域の部分にアニールする。
【００９４】
「側方配列」または「側方ＤＮＡ断片」とは、それに不対プライマーがアニールしても良いユニークなヌクレオチド配列（テンプレート分子に対して）を提供するために、テンプレート分子の５’または３’領域のいずれかに付着するＤＮＡの短い断片を指す。
【００９５】
「完全長伸張生成物」とは、親テンプレートの５’および３’領域の間に含まれるのと非常によく似た長さ（約１００塩基以内）を有する、プライマー誘導複製によって生成されるヌクレオチド配列である。
【００９６】
「増幅」は、いくつかの「テンプレート核酸」のコピーが、線形または対数いずれかの様式で増加するように複製がサイクル様式で反復されるプロセスである。
【００９７】
「プライマー」と言う用語は、相補鎖の合成がポリメラーゼによって触媒される条件下に置くと、相補鎖に沿った核酸合成または複製の開始点として作用できる（合成または天然）オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、プライマーそれ自体と核酸の相補鎖との間の配列相補性に基づいて、相補鎖にアニールする能力を有さねばならないが、塩基のいくらかのミスマッチは許される。プライマーサイズ、塩基配列、相補性、および標的相互作用の要件については下でより詳細に考察する。「プライマー」と言う用語自体は、ここでは出願人によって一般的に使用され、核酸複製プロセスを開始するために機能する（すなわち合成をプライムできる）あらゆる配列−結合オリゴヌクレオチドを包含する。
【００９８】
「フォーワードプライマー」と言う用語は、二本鎖テンプレート分子のセンス鎖の５’領域で合成をプライムでき、または一本鎖テンプレート分子の５’領域で合成をプライムできるプライマーを指す。
【００９９】
「逆転写プライマー」と言う用語は、二本鎖テンプレート分子アンチセンス鎖の５’領域で合成をプライムでき、または二本鎖テンプレート分子のアンチセンス鎖である一本鎖テンプレート分子の５’領域で合成をプライムできるプライマーを指す。
【０１００】
「対合プライマー」と言う用語は、単一テンプレート分子にアニールして、プライマー誘導核酸増幅プロセスによってテンプレートの正確なコピーの合成を可能にするようにデザインされる、フォーワードおよび逆転写プライマーからなるプライマーのペアを指す。二本鎖テンプレート分子の場合、フォーワードプライマーがアンチセンス鎖（テンプレートとして使用されるセンス鎖の相補的コピー）の正確なコピーを生成し、逆転写プライマーがセンス鎖（テンプレートとして使用されるアンチセンス鎖の相補的コピー）の正確なコピーを生成するので、フォーワードおよび逆転写プライマーは、二本鎖テンプレートの正確なコピーの合成を可能にする。対照的にテンプレート分子が一本鎖である場合、そのテンプレートの正確なコピーは、プライマー誘導核酸増幅プロセスを使用して生成される。
【０１０１】
「不対プライマー」と言う用語は、単一テンプレート分子にアニールして、プライマー誘導核酸増幅プロセスによってそのテンプレートの正確なコピーの合成を可能にするようにデザインされていない、フォーワードおよび逆転写プライマーからなるプライマーの対を指す。その代わりフォーワードプライマーは第１のテンプレート分子にアニールするが、第２のテンプレート分子にアニールできない。逆転写プライマーは、第１のテンプレート分子と配列が異なる第２のテンプレート分子にアニールするが、第１のテンプレート分子にアニールできない。このユニークな不対プライマーのデザインは、テンプレート切り替えを通じた複製中に遺伝子組み換えが起きない限り、一本鎖または二本鎖テンプレート分子がプライマー誘導核酸増幅プロセスによって増幅できないことを確実にする。
【０１０２】
「プライマー誘導伸張」と言う用語は、プライマーが使用されて、核酸分子の線形または対数増幅において核酸配列の複製を援助する、技術分野で知られているあらゆる方法を指す。例えばプライマー誘導伸張は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）をはじめとするがこ、これに限定されるものではない、技術分野で知られているいくつかのスキームのいずれかによって実行しても良い。
【０１０３】
ＧＤＨおよびコード遺伝子
グリセロールから３−ＨＰへの転換について、この反応の触媒に関与するデヒドラターゼは、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼまたはＢ_１２非依存性デヒドラターゼであることができる。しかし本発明の目的では、デヒドラターゼはＢ_１２依存性デヒドラターゼである。このＢ_１２依存性デヒドラターゼは、ＧＤＨ、グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、またはジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）であることができる。これらの各酵素はα_２β_２γ_２構造を有する。文献で使用される遺伝子命名法には幅広いバリエーションがあるので、明瞭さのために、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ラクトバシラス・コリノイデ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅ）、およびクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）のデヒドラターゼ遺伝子の遺伝子名およびＧｅｎＢａｎｋ番号を示す比較チャートを表２に示し、同定を容易にする。また遺伝子については、例えばダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら、（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２２：５５３、（１９９９））およびトラヤ（Ｔｏｒａｙａ）およびモリ（Ｍｏｒｉ）（Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：３３７２、（１９９９））で述べられる。
【０１０４】
【表４】

【０１０５】
本発明の目的では、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（国際公開第０１／０１２８３３ Ａ２号パンフレット）のｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３（それぞれ配列番号１および配列番号２、３、および４）によってコードされるＧＤＨが、変異誘発の標的として使用される。この酵素、グリセロールデヒドラターゼは好ましい基質がグリセロールであり、２個の６３ｋＤａのαサブユニット、２個の２１ｋＤａのβサブユニット、および２個の１６ｋＤａのγサブユニットから構成されることが知られている。しかし当業者はここで述べる技術において、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、またはその他の肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株のグリセロールデヒドラターゼ、あるいはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカまたは肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のジオールデヒドラターゼもまた適切であることを認識するであろう。同様にその活性がグリセロールの３−ＨＰへの転換を触媒できるＢ_１２依存性デヒドラターゼ活性をコードするあらゆる遺伝子が、ＧＤＨ酵素の機能を変更しないアミノ酸置換、欠失または付加を包含するあらゆるアミノ酸配列をはじめとする本発明の標的として適切なはずである。したがって当業者はその他の供給源から単離されるＧＤＨをコードする遺伝子もまた、本発明で使用するのに適切であることを理解するであろう。
【０１０６】
グリセロールまたは１，３−プロパンジオール存在下におけるＢ_１２依存性デヒドラターゼ不活性化
Ｂ_１２依存性デヒドラターゼは、触媒作用中にグリセロールによって、または１，３−プロパンジオールとの相互作用によって可逆的不活性化を被る。不活性化は、補酵素Ｂ_１２補助因子のコバルト−炭素（Ｃｏ−Ｃ）結合の開裂を伴い、５’−デオキシアデノシンおよび不活性なコバラミン化学種の形成をもたらす。不活性なコバラミン化学種はデヒドラターゼとの密接な結合を保ち、補酵素Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ再活性化因子の介入なしには解離が起きない。
【０１０７】
図１は、ＧＤＨ不活性化に付随する典型的な経時変化を示す。これらの酵素活性アッセイは、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（国際公開第０１／０１２８３３ Ａ２号パンフレット）のｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３（それぞれ配列番号１および配列番号２、３、および４）によってコードされるＧＤＨを使用して、実施される。図１上方の曲線は、基質としての１０ｍＭのグリセロール（Ｋ_ｍ約０．５ｍＭ）とのＧＤＨの反応の経時変化を示す一方、下方の曲線は、アッセイに５０ｍＭの１，３−プロパンジオール（Ｋ_ｉ約１５ｍＭ）を含めることの影響を示す。明らかに３−ＨＰ生成物形成速度は、一次不活性化速度定数（ｋ_{観察された不活性}）に従って、不活性化が起きるに連れて時間と共に迅速に低下する。
【０１０８】
改善された活性を有する変異株ＧＤＨ
観察されたＧＤＨ不活性化に基づいて、野生型ＧＤＨと比較して低下した不活性化速度を有する一連の変異株ＧＤＨを作り出した。典型的にアプローチは、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で増大した総代謝回転数を有する変異酵素を作り出して、単離することを伴う。これは、ｋ_ｃａｔの増大および／または酵素不活性化速度の低下のいずれかによって達成できる。
【０１０９】
ＧＤＨ活性を改善するプロセスは、ＧＤＨ遺伝子を含んでなる発現ベクターの構築、ＧＤＨコード配列の変異誘発、そして最後に低下した不活性化速度を有する変異体の単離を伴う。引き続く変異誘発の工程によって、ＧＤＨコード配列の発達が可能になる。
【０１１０】
変異株Ｂ_１２依存性デヒドラターゼライブラリーは、変異誘発のための出発原料としてあらゆる野生型（または実質的に同様の）Ｂ_１２依存性デヒドラターゼを使用して調製できる。
【０１１１】
Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの変異誘発の伝統的方法
Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ変異誘発のために、多様なアプローチを使用しても良い。ここで使用される２つの適切なアプローチとしては、エラープローンＰＣＲ（ロング（Ｌｅｕｎｇ）ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１：１１〜５（１９８９）；ジョウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：６０５２〜６０５２（１９９１）；およびスピー（Ｓｐｅｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：７７７〜７７８（１９９３））、および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）変異誘発が挙げられる。
【０１１２】
エラープローンＰＣＲの主要な利点は、この方法によって導入された全ての変異がＢ_１２依存性デヒドラターゼ遺伝子内であり、ＰＣＲ条件を変化させることであらゆる変化が容易に制御できることである。代案としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｒｅｄ菌株、およびカリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのエピキュリアン・コリ（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｒｅｄミューテータ菌株（グリーナー（Ｇｒｅｅｎｅｒ）およびキャラハン（Ｃａｌｌａｈａｎ）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、７：３２〜３４（１９９４）も参照されたい）などの市販される材料を使用して、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）変異誘発を用いても良い。この菌株では、一次ＤＮＡ修復経路の３つ（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、およびｍｕｔＴ）が欠損しており、野生型よりも５０００倍高い変異速度がもたらされる。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）変異誘発は、（エラープローンＰＣＲのように）連結効率に依存しないが、変異はベクターのあらゆる領域で生じても良く、変異速度は一般にはるかに低い。
【０１１３】
代案としては、「遺伝子シャッフリング」法（米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書）、または核酸間での遺伝子組み換え発生の活性を促進するあらゆる同様の手段を使用して、低下した不活性化速度を有する変異株Ｂ_１２依存性デヒドラターゼを構築しても良いことが考察される。遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行と高速な変異誘発のために特に魅力的である。遺伝子シャッフリングのプロセスは、関心のある遺伝子と同様の（または異なる）追加的なＤＮＡ領域集団の存在下で、関心のある遺伝子を特定サイズの断片に限定することを伴う。次に断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更した活性についてスクリーニングする。
【０１１４】
野生型Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ配列を変異させて、この方法によって変更されまたは増強される活性についてスクリーニングしても良い。配列は二本鎖であるべきで、５０ｂｐ〜１０ｋＢ範囲の様々な長さであることができる。配列は技術分野で良く知られている制限エンドヌクレアーゼを使用して、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲の断片に無作為に消化されても良い（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、同上）。完全長配列に加えて、配列の全部（または部分）とハイブリッド形成可能な断片集団を添加しても良い。同様に、野生型配列とハイブリッド形成可能でない断片集団を添加しても良い。典型的にこれらの追加的断片集団は、総核酸と比較して重量で約１０倍〜２０倍過剰に添加される。一般にこのプロセスは、混合物中に約１００〜１０００個の異なる特定の核酸断片の生成を可能にする。無作為核酸断片の混合集団は、変性されて一本鎖核酸断片を形成し、次に再アニールされる。その他の一本鎖核酸断片との相同性領域を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。無作為核酸断片は、加熱によって変性されても良い。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を判定できる。好ましくは、温度は、約８０℃〜１００℃である。核酸断片を冷却によって再アニールしても良い。好ましくは、温度は約２０℃〜７５℃である。再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速できる。塩濃度は、好ましくは０ｍＭ〜２００ｍＭである。アニールされた核酸断片は、次に核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Ｔａｑポリメラーゼまたは技術分野で知られているあらゆるその他のＤＮＡポリメラーゼであっても良い。アニールに先だって、アニールと同時に、またはアニール後に、ポリメラーゼを無作為核酸断片に添加しても良い。変性、再生、およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは、所望の回数反復される。好ましくはサイクルは２〜５０回反復され、より好ましくは、手順は１０〜４０回反復される。得られる核酸は約５０ｂｐ〜約１００ｋＢのより大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準クローニングおよび発現プロトコルによって、発現および変更された活性についてスクリーニングしても良い（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、同上）。
【０１１５】
上で例証した方法（Ｂ_１２依存性デヒドラターゼをコードする遺伝子を直接に変異誘発するようにデザインされる）に加えて、変異株を作り出す伝統的方法をここで述べられる目的のために使用できる。例えばＢ_１２依存性デヒドラターゼ活性を有する野生型細胞を放射線または化学変異原などの多様な作用物質に暴露して、次に所望の表現型についてスクリーニングしても良い。放射線によって変異を作り出す場合、紫外線（ＵＶ）または電離放射線のどちらを使用しても良い。遺伝的変異に適した短波長ＵＶの波長は２００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内であり、２５４ｎｍが好ましい。この波長内のＵＶ放射線は、主にグアニジンおよびシトシンからアデニンおよびチミジンへの核酸配列内変化を引き起こす。全ての細胞は、ほとんどのＵＶ誘導される変異を修復するＤＮＡ修復機序を有するので、カフェインおよびその他の阻害物質などの作用物質を添加して修復プロセスを妨害し、いくつかの効果的な変異を最大化しても良い。３００ｎｍ〜４００ｎｍ範囲の光を使用する長波ＵＶ変異もまた可能であるが、この範囲は、一般に、ＤＮＡと相互作用する様々な賦活物質（ソラレン染料など）との組み合わせで使用しない限り、短波長ＵＶ光ほど効果的でない。同様に化学作用物質による変異誘発も変異株を生成するのに効果的であり、一般に使用される物質としては、複製しないＤＮＡに影響する化学物質（ＨＮＯ_２およびＮＨ_２ＯＨなど）、ならびに複製するＤＮＡに影響する作用物質（フレームシフト変異を引き起こすことで注目すべきアクリジン染料など）が挙げられる。放射線または化学作用物質を使用して変異株を作り出す特定の方法については、技術分野において文書で十分に立証されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、生物工学：工業微生物学テキスト（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ）、第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）（１９８９）、またはデシュパンデ・ムクンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７（１９９２）を参照されたい。
【０１１６】
変異誘発方法にかかわらず、酵素がグリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で増大した総代謝回転数を有するように、遺伝子を発達させても良い。これはｋ_ｃａｔの増大および／または酵素不活性化速度の低下のどちらかによって達成できる。
【０１１７】
不対プライマーを使用した遺伝子組み換え発生伸張法を使用したＢ_１２依存性デヒドラターゼの変異誘発
図５は、２個の遺伝子の遺伝子組み換えに基づく、不対プライマーを使用した遺伝子組み換え発生伸張法の原理を示す。この方法は、親遺伝子がそれらの５’および３’末端に異なるＤＮＡ配列を有することを必要とする。親遺伝子が、同一の５’および３’配列を有する場合、短い側方ＤＮＡ断片は、（図５のステップＡで示されるように）標準ＰＣＲによって遺伝子の５’または３’末端に付着されていなくてはならない。
【０１１８】
次に熱サイクルのための２個の不対プライマーのデザインに続いて、ＰＣＲ生成物を遺伝子組み換え発生伸張法のテンプレーとして使用できる。プライマー−１はテンプレート−１の５’末端とアニールするが、テンプレート−２の５’末端とは結合しない。プライマー−２はテンプレート−２の３’末端とアニールするが、テンプレート−１の３’末端とは結合しない（ステップＢ）。これによってどちらの親テンプレートも熱サイクル反応によって増幅されないことが確実になる。
【０１１９】
短いアニールおよび合成サイクルを実施することで、一連の短いＤＮＡ断片を作り出す（ステップＣ）。十分な相同性があれば、これらのＤＮＡ断片のいくつかは引き続くアニールサイクルで、異なるテンプレートとアニールする（すなわち「テンプレート切り替え」）（ステップＤ）。引き続いて図５で示されるように、組み換えＤＮＡ断片が作られる。最後にテンプレート−１の５’末端およびテンプレート−２の３’末端を有する組み換えＤＮＡ遺伝子が作り出される（ステップＥ）。
【０１２０】
この時点で、これまでの不対プライマー−１およびプライマー−２は、新たに作り出された組み換え遺伝子のための対合プライマーになる。さらなるアニールおよび合成サイクルによって、テンプレート−１の５’末端およびテンプレート−２の３’末端を有する組み換えＤＮＡ遺伝子のプールを増幅する（図５のステップＦ）。増幅ステップ中に、組み換えＤＮＡ遺伝子をさらに遺伝子組み換えすることができ、それによって組み換えＤＮＡ遺伝子の交差数が増加する。理論的には、全ての増幅された生成物が組み換えＤＮＡ生成物であるべきである。これらの組み換え生成物は親テンプレート分子から直接誘導でき、あるいは追加的変異（例えば挿入、欠失、および置換）が最終遺伝子組み換え産生物中に組み込まれても良い。最終反応混合物中への親テンプレートの混入はごくわずかである。
【０１２１】
この方法論についてさらに詳しくは、参照によって本明細書に援用する米国特許出願第０／３７４３６６号明細書で開示される。
【０１２２】
改善された速度性能を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼ変異体の同定
改善された速度性能を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼ変異体を（大集団から）同定するために、ハイスループットアッセイの開発は、スクリーニングを極めて容易にする。２回の測定に依存して、標準（例えば野生型ＧＤＨ）と比較したｋ_ｃａｔの改善および／またはデヒドラターゼ変異体の総代謝回転数の推定を提供する、単純なスクリーニング方法がここで開示される。具体的には、ＧＤＨ変異遺伝子ライブラリーを標準方法によってＧＤＨ発現について大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローン化し、単離株を得てレノックス・ブロス中で培養し、透過化処理して、次にＧＤＨ活性についてアッセイした。スクリーニング方法はホールセルに含有されるＧＤＨについて述べられるが、当業者は方法を容易に変更して、粗製または精製調製品中の酵素に適用できることを認識するであろう。
【０１２３】
ここで開発されたＧＤＨアッセイは、補酵素Ｂ_１２、デヒドラターゼ再活性化因子、またはＢ_１２依存性デヒドラターゼ供給源を有さない細胞における、アポ酵素形態のＧＤＨ酵素の存在に依存する。触媒的に活性のＧＤＨホロ酵素は、培養液への補酵素Ｂ_１２の添加によってのみ形成する。したがってＧＤＨの反応は、補酵素Ｂ_１２および基質グリセロールの添加によって、高精度で効果的にスイッチ「オン」できる。これによってＧＤＨ活性の持続時間（タイミング）の正確な制御が可能になり、したがって正確なＧＤＨ活性の測定が可能になる。反応は０時（時間＝ｔ_０）に開始され、反応の初期相中（ｔ_０の直後、および酵素不活性化が起きる前、時間＝ｔ_１）の生成物形成が測定される。さらに生成物形成が、さらにより長時間測定される（ｔ_０の直後、および酵素不活性化完了後、時間＝ｔ_２）。生成物（３−ＨＰ）形成の判定は、比色アルデヒド分析に基づく（ズーレック（Ｚｕｒｅｋ）Ｇ．、およびＵ．カルスト（Ｋａｒｓｔ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３５１：２４７〜２５７（１９９７））。
【０１２４】
飽和濃度の補酵素Ｂ_１２およびグリセロール存在下のＧＤＨでは、経時的に生成する３−ＨＰの量（ｙ）は、次によって推定される。
ｙ＝Ｔ_０＋ＡＭＰ（１-ｅｘｐ（−ｋ_{観察された不活性}^＊時間））
式中、Ｔ_０はｔ_０時の３−ＨＰの量（バックグラウンド）であり、ＡＭＰはｔ_０からＧＤＨが完全に不活性化されるまでの間に生成する３−ＨＰの量（総代謝回転数）であり、ｋ_{観察された不活性}は、観察された一次不活性化速度定数である。１，３−プロパンジオールが存在しないので、ｋ_{観察された不活性}は、全てｋ_{不活性グリセロール}（グリセロールに起因する一次不活性化速度定数）に起因する（図１上方の曲線を参照されたい）。ＡＭＰは、［ＧＤＨ］^＊ｋ_ｃａｔ／ｋ_{観察された不活性}に等しい。経時変化を使用して、固定濃度のＧＤＨ、補酵素Ｂ_１２、およびグリセロールのための適切な時間（ｔ_１およびｔ_２）を確立する。Ｔ_０について補正した後、ｔ_１で形成した生成物量（Ｔ１、酵素不活性化が起きる前）を使用して［ＧＤＨ］^＊ｋ_ｃａｔを推定し、ｔ_２で形成した生成物（Ｔ２、酵素不活性化の完了後）を使用して、総代謝回転数および［ＧＤＨ］^＊ｋ_ｃａｔ／ｋ_{観察された不活性}を推定する。したがってＴ１値はｋ_ｃａｔに正比例し、Ｔ２値はｋ_ｃａｔ／ｋ_{観察された不活性}に正比例し、Ｔ２／Ｔ１は１／ｋ_{観察された不活性}を与える。
【０１２５】
適切な時間（ｔ_１およびｔ_２）を（１，３−プロパンジオール不在下で）固定濃度の野生型ＧＤＨ、補酵素Ｂ_１２およびグリセロールについて判定した後、Ｔ１およびＴ２の値を同一アッセイ条件下で、しかし１，３−プロパンジオールを添加して再度測定した（図１下方の曲線）。グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下では競合的阻害が起き、ｋ_{観察された不活性}はｋ_ｇｌｙ（グリセロールに起因する一次不活性化速度定数）およびｋ_{１，３−プロパンジオール}（１，３−プロパンジオールに起因する一次不活性化速度定数）の双方の関数である。適切な１，３−プロパンジオール濃度において、Ｔ１値は１，３−プロパンジオール不在下での値（１，３−プロパンジオールおよびグリセロールの競合的阻害を反映する）から測定可能に低下し、Ｔ２値は１，３−プロパンジオール不在下での値（ｋ_{１，３−プロパンジオール}＞ｋ_ｇｌｙと言う事実を反映する）から大幅に低下した。二点アッセイでは、グリセロールは、５〜５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度で存在し、１，３−プロパンジオールは１０〜３００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭの濃度で存在する。
【０１２６】
出願人らは、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で、野生型ＧＤＨ−対−変異体株を調べる条件を確立した。顕微鏡的レベルでは、ＧＤＨへの変異の導入は、グリセロールおよび／または１，３−プロパンジオールに対する酵素親和力ｋ_ｃａｔ、ならびにそれぞれのｋ_不活性値に影響するかもしれない。最初は親和性および速度定数が互いに非依存に変動するという保証がなかったが、これらのパラメーターのバリエーションが、１０ｍＭのグリセロールおよび５０ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下で実施された二点アッセイ（Ｔ１およびＴ２）の結果にいかに影響できるかを考えることは有用であった。具体的には、緩慢な不活性化（ｋ_{観察された不活性}の低下）は、増大するＴ２／Ｔ１比率をもたらす。他方、Ｔ１またはＴ２いずれかのバリエーションは、酵素の固有の特性の変化に起因することができる。例えばグリセロールおよび１，３−プロパンジオールの相対親和性が一定で、ｋ_ｃａｔおよびｋ_不活性値を比例して低下させると、Ｔ２／Ｔ１は増大するがＴ１は低くなる。他方、グリセロールとの正常な相互作用を有するが、１，３−プロパンジオールへの低下した相対親和力、または１，３−プロパンジオール不活性化のより低い速度定数を有する変異株は、ほぼ正常なＴ１、上昇したＴ２、およびより高いＴ２／Ｔ１比率を示すべきである。正常なグリセロールおよび１，３−プロパンジオール親和性を有するが、どちらかの化合物に対する低下したｋ_不活性を有する変異株もまた、正常なＴ１を示し、増大するＴ２およびＴ２／Ｔ１比率を示すべきである。ｋ_不活性における、あるいは基質または１，３−プロパンジオール親和力における変化がないｋ_ｃａｔの増大は、Ｔ１およびＴ２を増大させるが、Ｔ２／Ｔ１比率は増大させない。上述の多数のバリエーションにもかかわらず、ここでの研究の目的は、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で、ＧＤＨ酵素の総代謝回転数を増大させることである。これはｋ_ｃａｔの増大および／または酵素不活性化速度の低下のどちらかによって達成できる。したがって野生型と比較して、より高いＴ１および／またはより高いＴ２および／またはより高いＴ２／Ｔ１値、またはこれらのパラメーターのあらゆる組み合わせより成る群から選択される少なくとも１つの改善を示す変異株は、改善された特性を有すると見なされる。
【０１２７】
１，３−プロパンジオール濃度と比べてグリセロール濃度が低い場合、（ｋ_ｃａｔの推定のための）Ｔ１の測定は可能でないので、１，３−プロパンジオールによる顕著な不活性化が起きる。１，３−プロパンジオール生成プロセスにおいては高い１，３−プロパンジオール濃度および低いグリセロール濃度が望ましいので、これらの条件は妥当である。問題のこの側面を認識して、グリセロールがｘｘ〜ｙｙｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度で存在し、１，３−プロパンジオールが３００ｍＭを超え、好ましくは６００ｍＭの濃度で存在すること以外は、上述のようにして一点アッセイが提供される。この一点アッセイでは、時間がｔ_終点によって示され、３−ＨＰの生成量がＴ（ＸＸＸ）によって示され、ＸＸＸは１，３−プロパンジオールの濃度（ｍＭ）である。
【０１２８】
補酵素Ｂ_１２不活性化に影響する重大なアミノ酸の同定
出願人らは、野生型遺伝子と比べて、低下した補酵素Ｂ_１２不活性化速度を有する多様な変異株ＧＤＨ酵素を開示する。これらの変異株は、上述の変異誘発およびスクリーニング方法を使用して同定された。変異株、変更アミノ酸残基、１／ｋ_{観察された不活性}活性（Ｔ２／Ｔ１として測定される）、およびＴ２を表１にまとめる。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０１２９】
【表５】

【０１３０】
【表６】

【０１３１】
【表７】

【０１３２】
【表８】

【０１３３】
【表９】

【０１３４】
【表１０】

【０１３５】
上述の変異誘発およびスクリーニング方法を使用して同定された追加的な変異株を表４にまとめる。この表は各変異株、変更アミノ酸残基、およびＴ（６００）活性に関する情報を提示する。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０１３６】
【表１１】

【０１３７】
【表１２】

【０１３８】
低下した補酵素Ｂ_１２−不活性化速度を有する多様な変異株ＧＤＨ酵素が上で開示される。本発明の好ましい変異株としては、配列番号：４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８２、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０８、２１２、２１５、２１８、２２１、２２５、２２９、２３３、２３７、２４１、２４５、２４９、２５３、２５７、２６１、２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７が挙げられる。本発明のより好ましい変異株は配列番号：１４０、１７９、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２１２、２１５、２１８、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７である。本発明の最も好ましい変異株は、配列番号：３１３、３２２、および３２８である。
【０１３９】
上の変異株に加えて、それぞれが表２および３に列挙された変異のいくつかの組み合わせをさらに有する、改善された反応速度を有する変異株の大きなプールが合成できる。例えば複数点変異を有する変異株ＧＤＨにおける各変異を酵素の全体的反応速度の改善に向けた望ましい効果について評価できる。所望ならば、反応速度を高めなかったあらゆる変異は野生型配列に戻せる。同様に一点変異のみを有する上のリストのＧＤＨ変異株を上で開示される別の変異と組み合わせて、酵素の活性をさらに改善することができる。出願人らは、ＧＤＨ酵素における以下の有用な変異を開示し、これらは多様を組み合わせで使用して野生型遺伝子と比較し、低下した補酵素Ｂ_１２不活性化速度を有する代案の変異株ＧＤＨ酵素を生成しても良い。これらの変異としては、
１．α−サブユニット中：ＴＣＡ（α−Ｓｅｒ４１）からＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ４４）からＧＣＧ（Ａｌａ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ４４）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＧＴ（α−Ｇｌｙ４７）からＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＣＡＧ（α−Ｇｌｎ５９）からＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ６２）からＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ６２）からＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ６２）からＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＴＣ（α−Ｉｌｅ６３）からＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＧＧＧ（α−Ｇｌｙ６３）からＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＣＧＡ（α−Ａｒｇ６５）からＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＡＴＣ（α−Ｉｌｅ６７）からＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＴＡＣ（α−Ｔｙｒ７０）からＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＧＴＴ（α−Ｖａｌ７４）からＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＧＴＴ（α−Ｖａｌ７４）からＡＴＴ（Ｉｌｅ）、ＡＣＧ（α−Ｔｈｒ７７）からＧＣＧ（Ａｌａ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ８６）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＣＡＣ（α−Ｈｉｓ９６）からＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＡＴＣ（α−Ｉｌｅ１０２）からＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＡＴＣ（α−Ｉｌｅ１０２）からＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＡＴＣ（α−Ｉｌｅ１０５）からＡＴＴ（Ｉｌｅ）、ＧＴＣ（α−Ｖａｌ１１５）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＧＡＧ（α−Ｇｌｕ１１６）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＧＣＧ（α−Ａｌａ１１９）からＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ１２４）からＧＣＧ（Ａｌａ）、ＣＧＴ（α−Ａｒｇ１３４）からＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＧＧ（α−Ａｒｇ１３７）からＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＡＣ（α−Ａｓｎ１４１）からＡＴＣ（Ｉｌｅ）、ＴＧＣ（α−Ｃｙｓ１４３）からＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＣＴＣ（α−Ｌｅｕ１４８）からＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＡＡＡ（α−Ｌｙｓ１４９）からＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＡＡ（α−Ｌｙｓ１４９）からＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＧＡＴ（α−Ａｓｐ１５０）からＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＧＡＴ（α−Ａｓｐ１５０）からＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＡＡＴ（α−Ａｓｎ１５１）からＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＣＣＧ（α−Ｐｒｏ１５２）からＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＴＣＡ（α−Ｓｅｒ１６８）からＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＴＧＣ（α−Ｃｙｓ１９３）からＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＧＡＧ（α−Ｇｌｕ２０９）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ２１４）からＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＧＧＣ（α−Ｇｌｙ２１６）からＧＧＧ（Ｇｌｙ）、ＴＴＡ（α−Ｌｅｕ２１７）からＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＧＣ（α−Ｓｅｒ２１９）からＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ２２４）からＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ２２４）からＡＴＧ（Ｍｅｔ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ２２４）からＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＧＴＣ（α−Ｖａｌ２２６）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＧＣＧ（α−Ａｌａ２３１）からＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＴＴＴ（α−Ｐｈｅ２３３）からＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＧＧＣ（α−Ｇｌｙ２３６）からＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＧＡＧ（α−Ｇｌｕ２４０）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＣＡＧ（α−Ｇｌｎ２４２）からＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ２５７）からＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ２５７）からＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＣＴＧ（α−Ｌｅｕ２６８）からＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＡＴ（α−Ｔｙｒ２７１）からＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＡＣＴ（α−Ａｓｎ２８８）からＡＣＣ（Ａｓｎ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ３０１）からＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ３０６）からＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＴＧ（α−Ｍｅｔ３０６）からＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＧＣＴ（α−Ａｌａ３０９）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＡＴＴ（α−Ｉｌｅ３１４）からＧＴＴ（Ｖａｌ）、ＣＴＧ（α−Ｌｅｕ３１８）からＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＣＡＧ（α−Ｇｌｎ３３７）からＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＴＴＣ（α−Ｐｈｅ３３９）からＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＣＧＣ（α−Ａｒｇ３４６）からＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＣＣ（α−Ｔｈｒ３５０）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＧＣＣ（α−Ａｌａ３７６）からＧＣＴ（Ａｌａ）、ＧＴＴ（α−Ｖａｌ４２３）からＡＴＴ（Ｉｌｅ）、ＣＧＣ（α−Ａｒｇ４２５）からＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＣＣＧ（α−Ｐｒｏ４３０）からＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＡＡＣ（α−Ａｓｎ４４７）からＡＡＴ（Ａｓｎ）、ＣＣＧ（α−Ｐｒｏ４５０）からＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＧＣＧ（α−Ａｌａ４６０）からＧＣＡ（Ａｌａ）、ＧＴＧ（α−Ｖａｌ４６１）からＧＧＧ（Ｇｌｙ）、ＧＡＡ（α−Ｇｌｕ４６２）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＡＡＣ（α−Ａｓｎ４６８）からＡＡＴ（Ａｓｎ）、ＡＣＣ（α−Ｔｈｒ４７０）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＡＧＣ（α−Ｓｅｒ４８１）からＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＡＡＴ（α−Ａｓｎ４８９）からＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（α−Ｔｈｒ４９９）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＴＡＣ（α−Ｔｙｒ５０２）からＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＣＴＣ（α−Ｌｅｕ５０９）からＴＴＣ（Ｐｈｅ）、ＣＴＣ（α−Ｌｅｕ５０９）からＴＴＴ（Ｐｈｅ）、ＴＴＣ（α−Ｐｈｅ５１３）からＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＡＡＣ（α−Ａｓｎ５２０）からＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＣＧＣ（α−Ａｒｇ５３３）からＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＧＴＴ（α−Ｖａｌ５４９）からＧＣＴ（Ａｌａ）、ＡＣＣ（α−Ｔｈｒ５５３）からＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＴＡＡ（αの停止）からＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＴＡＡ（αの停止）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、
２．β−サブユニット中：ＣＡＡ（β−Ｇｌｎ２）からＣＧＡ（Ａｒｇ）；ＴＴＴ（β−Ｐｈｅ１１）からＴＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＴＴ（β−Ｐｈｅ１１）からＴＴＣ（Ｐｈｅ）、ＣＴＧ（β−Ｌｅｕ１３）からＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＡＡＡβ−Ｌｙｓ１４）からＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＧＧＧ（β−Ｇｌｙ１９）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＡＴ（β−Ａｓｐ２４からＧＧＴ（Ｇｌｙ）、ＧＡＴ（β−Ａｓｐ２４）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＧＡＡ（β−Ｇｌｕ２５）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＣＣ（β−Ａｌａ２７）からＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＧＡＡ（β−Ｇｌｕ２９）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＡＣＴ（β−Ｔｈｒ４５）からＧＣＴ（Ａｌａ）、ＧＣＧ（β−Ａｌａ５３）からＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＡＡ（β−Ｌｙｓ５６）からＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＴＧ（β−Ｌｅｕ５８）からＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＧＡＡ（β−Ｇｌｕ６４）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＣＴＴ（β−Ｌｅｕ６７）からＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＣＧＧ（β−Ａｒｇ７０）からＣＧＡ（Ａｒｇ）、ＧＣＣ（β−Ａｌａ８８）からＧＣＴ（Ａｌａ）、ＧＡＴ（β−Ａｓｐ１１１）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＣＴＧ（β−Ｌｅｕ１１３）からＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＴＣＴ（β−Ｓｅｒ１２２）からＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＧＡＧ（β−Ｇｌｕ１３０）からＧＧＧ（Ｇｌｙ）、ＣＣＧ（β−Ｐｒｏ１５２）からＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＣＣＧ（β−Ｐｒｏ１５２）からＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＡＡＣ（β−Ａｓｎ１５５）からＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＡＡＣ（β−Ａｓｎ１５５）からＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＡＡ（β−Ｌｙｓ１６６）からＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＡＡ（β−Ｌｙｓ１７３）からＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＧＡＣ（β−Ａｓｐ１８１）からＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＣＣＣ（β−Ｐｒｏ１８４）からＣＣＴ（Ｐｒｏ）、および
３．γ−サブユニット中：ＡＡＡ（γ−Ｌｙｓ４）からＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＴＣ（γ−Ｉｌｅ２１）からＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＡＡＡ（γ−Ｌｙｓ２７）からＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＧＡＧ（γ−Ｇｌｕ３５）からＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＴＣ（γ−Ｉｌｅ４９）からＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＡＣＣ（γ−Ｔｈｒ５３）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＡＣＣ（γ−Ｔｈｒ５３）からＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（γ−Ｔｈｒ５３）からＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＣＡＴ（γ−Ｈｉｓ６７）からＴＡＴ（Ｔｙｒ）、ＡＡＴ（γ−Ａｓｎ７２）からＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＣＡＧ（γ−Ｇｌｎ１０１）からＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＣＣ（γ−Ｔｈｒ１１４）からＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（γ−Ｔｈｒ１１４）からＧＣＣ（Ａｌａ）、ＧＣＣ（γ−Ａｌａ１２２）からＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＧＣＧ（γ−Ａｌａ１２８）からＧＴＧ（Ｖａｌ）、およびＣＴＧ（γ−Ｌｅｕ１３７）からＣＴＡ（Ｌｅｕ）が挙げられる。
【０１４０】
同様のヌクレオチドおよびアミノ酸変異は、野生型ＧＤＨ以外のその他のＢ_１２依存性デヒドラターゼ中で作ることができる。関心のあるＢ_１２依存性デヒドラターゼとＧＤＨを並べることで、変異を必要とする正確なヌクレオチド／塩基の位置が示される。
【０１４１】
本発明は、上述の特定の変異のみならず化学的に同等のアミノ酸の置換を許すものも包含する。したがって例えばアミノ酸が脂肪族非極性アミノ酸であるアラニンによって置換されると、同一部位が、化学的に同等のアミノ酸であるセリンによって置換されても良いことが期待される。
【０１４２】
デヒドラターゼのタンパク質工学技術
今や、遺伝的工学技術および分子グラフィックスの方法、すなわちタンパク質工学技術によって、三次元構造情報と古典的タンパク質化学を組み合わせることで、タンパク質の多くの特性の変性を試みることが可能である。変更された活性を有する酵素を得るこのアプローチは、最初にモデル分子の生成、または未知の構築と同様の配列を有する既知の構築の使用に依存する。
【０１４３】
ここでの目的では、基質フリー形態のＢ_１２依存性グリセロールデヒドラターゼの三次元結晶構造がＸ線結晶構造解析によってあらかじめ求められ（リャオ（Ｌｉａｏ）ら、Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（近刊））、さらに１，２−プロパンジオールとの複合体中の酵素の構造も報告されている（ヤマニシ（Ｙａｍａｎｉｓｈｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９：４４８４〜４４９４（２００２））。これらのＢ_１２依存性グリセロールデヒドラターゼの三次元モデル、および変異の「ホットスポット」が反応速度において改善された活性を示す（自殺不活性化速度が低下した）これらのデヒドラターゼ酵素内のどこに典型的に位置するのかという理解から、デヒドラターゼ構造内の領域を標的にすることができ、そこでは構造の代案の変更がタンパク質の特性に所望の変化をもたらすかもしれない。したがって例えば以下の野生型残基を標的とした領域的部位−誘導変異誘発からは、改善された触媒活性を有する追加的なデヒドラターゼ変異株が生じることが期待される。
１）残基６２〜７０（α−サブユニットのＮ−末端から２番目のαらせんを包含する）および／または
２）残基２１９〜２３６（活性部位近くの領域、ＴＩＭバレルの４番目のβ−鎖の部分と、続くα−サブユニットのループおよび短いらせんを包含する）。
【０１４４】
宿主細胞における組み換えデヒドラターゼの発現
デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現による３−ＨＰおよび１，３−プロパンジオールの組み換え生成のための適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物のどちらであっても良く、活性酵素を発現するそれらの能力によってのみ制限される。好ましい宿主は、典型的にシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの３−ＨＰまたは１，３−プロパンジオールの生成に有用なものである。本発明でより好ましいのは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｅ．ブラタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびアエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）である。
【０１４５】
宿主細胞中に適切なデヒドラターゼをコードする遺伝子のクローニング、形質転換および発現に適したベクター、形質転換方法、および発現カセットは、当業者には良く知られている。適切なベクターは、宿主細胞として用いられる細菌と適合性のものである。したがって適切なベクターは、例えば細菌、ウイルス（例えばバクテリオファージＴ７またはＭ−１３由来ファージなど）、コスミド、酵母または植物から誘導できる。このようなベクターを得て使用するプロトコルは、技術分野で知られている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、同上）。
【０１４６】
典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくて良いものと理解される。
【０１４７】
所望の宿主細胞中で本発明の当該遺伝子の発現を推進するのに有用なイニシエーション制御領域（またはプロモーター）は多数あり、当業者にはなじみが深い。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア中での発現に有用）、およびｌａｃ、ｔｒｐ、λＰ_Ｌ、λＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現に有用）をはじめとするが、これに限定されるものではない、これらの遺伝子を推進できる実質的にあらゆるプロモーターが本発明のために適切である。
【０１４８】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されても良い。場合により、終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１４９】
ひとたび適切なカセットが構築されると、それらは適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。変異株デヒドラターゼをコードする遺伝子を含有するカセットの宿主細胞内への導入は、形質転換（例えばカルシウム透過化処理細胞、電気穿孔法を使用する）によって、あるいは組換え型ファージウイルスを使用した形質移入などの既知の手順によって実行しても良い（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、同上）。
【０１５０】
発酵を通じた工業生産
本発明で使用するための発酵培養液は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質は発酵科学の当業者に良く知られている。好ましい炭素基質は、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質である。より好ましいのは、糖（例えばグルコース、フルクトース、スクロース）および一炭素基質（例えばメタノールおよび二酸化炭素）である。最も好ましいのはグルコースである。
【０１５１】
適切な炭素供給源に加えて、発酵培養液は、培養の生育と３−ＨＰおよび１，３−プロパンジオール生成に必要な酵素的経路の促進に適した、当業者に知られている適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、およびその他の構成要素を含有しなくてはならない。Ｃｏ（ＩＩ）塩および／またはビタミンＢ_１２またはそれらの前駆物質に特に注意が払われる。
【０１５２】
典型的に細胞は、３０℃において適切な培養液中で培養された。本発明の好ましい生育培養液は、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）ブロス、サブロー・デキストロース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）（ＳＤ）ブロス、またはイースト・モルト抽出物（ＹＭ）ブロスなどの一般的な商業的に調製された培養液である。その他の特定または合成培養液を使用しても良く、特定微生物の生育に適した培養液は、微生物または発酵科学の当業者には既知である。
【０１５３】
バッチ、流加バッチ、または連続プロセスを使用して本発明を実施すること、およびあらゆる既知の発酵様式が適することが考察された（ブロック（Ｂｒｏｃｋ）ら、同上によって多様な方法が詳述されている）。さらに細胞を基材上にホールセル触媒として固定し、３−ＨＰまたは１，３−プロパンジオール生産の発酵条件に曝すことが考察された。
【０１５４】
改善されたＢ_１２依存性デヒドラターゼ変異株は、使用する炭素基質とは無関係に、多様なプロセスにおいて３−ＨＰおよび１，３−プロパンジオールの生成のために有用であることが期待される（米国特許第５６８６２７６号明細書、グリセロールから３−ＨＰＡへ）。当該株の組み換えは、参照によって本明細書に援用する米国特許出願第１０／４２０５８７号明細書（デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）２００２）のプラスミドで述べられるデヒドラターゼからスワップアウトできる。
【０１５５】
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのために提供されるものと理解される。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特質を把握でき、その範囲と精神を逸脱することなく、本発明の様々な変化と修正を行って、様々な利用法および条件に適合させることができる。
【実施例】
【０１５６】
一般方法：
ＰＣＲ増幅、エンド−およびエキソヌクレアーゼによるＤＮＡ修飾（ＤＮＡクローニングおよび連結のための所望の末端を生成するため）、および細菌形質転換のために必要とされる手順は、技術分野で良く知られている。ここでは標準分子クローニング技術が使用され、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）、（１９８９）（以下マニアティス）；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．、遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、（コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリング（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ）、ニューヨーク（ＮＹ）、１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；１９８７）で述べられている。
【０１５７】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、下に述べられる。
１．）「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４）または
２．）ブロック（Ｂｒｏｃｋ）Ｔ．Ｄ．著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第二版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ）（１９８９）。
細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））またはウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から得た。ＰＣＲ反応は、特に断りのない限りカリフォルニア州フォスターシティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））からのＡｍｐｌｉｔａｑまたはＡｍｐｌｉｔａｑ金酵素を使用して、ＧｅｎｅＡＭＰ ＰＣＲシステム９７００上で実施した。サイクル条件および反応は、ここで特に断りのない限り、製造元の説明書に従って標準化した。
【０１５８】
ＤＮＡ配列決定反応は、特に断りのない限り、インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））からのエキスパンド高忠実度ＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのＡＢＩ ３７７自動化シーケンサーまたはマサチューセッツ州ウォルサムのＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））からのＰＴＣ−２００ ＤＮＡエンジン上で実施した。同様に、データはメリーランド州ベセズダのインフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ））からのベクターＮＴＩプログラム、またはウィスコンシン州マディソンのＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＤＮＡスタープログラムを使用して管理した。
【０１５９】
略語の意味は次のとおり。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｎＭ」はナノモルを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「Ｕ」は単位を意味する。
【０１６０】
菌株、ベクターおよび培養条件
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を酵素過剰発現のために使用した（シュスターＢ．（Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｂ．）およびレティＪ．（Ｒｅｔｅｙ，Ｊ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４９：２５２〜２５４（１９９４））。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞は、カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））から購入した。野生型大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）５Ｋは、最初にコネティカット州ニューヘーブンのイェール大学大腸菌遺伝子ストックセンター（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＳＣ＃４５１０；エール大学（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（コネティカット州ニューヘーブン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）））から得て、ラムダＤＥ３（５Ｋ（ＤＥ３））で溶原化した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から購入した。
【０１６１】
分子生物学的用途のための全てのキットは、特に断りのない限り製造元の説明書に従って使用した。
【０１６２】
実施例１
「Ｘｂａ−ライブラリー」の構築：ＧＤＨのα−、β−およびγ−サブユニットを標的とする無作為変異誘発
エラープローンＰＣＲ増幅を使用して、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３遺伝子を標的とする無作為変異株ライブラリーを作り出した。ライブラリーの代表的な配列分析は、ｋＢあたりほぼ４．２点の変異があることを実証し、酵素活性測定は、ライブラリー中の約１５〜２５％の変異株が活性であると判定した。
【０１６３】
エラープローンＰＣＲ増幅
エンプタージェ（Ｅｍｐｔａｇｅ）ら（国際公開第０１／１２８３３号パンフレット）は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３遺伝子（配列番号１）を含んでなるプラスミドｐＤＴ２の構築について述べる。プラスミドｐＧＤ２０は、ＧＤＨ遺伝子の発現をＴ７プロモーターの制御下におくｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に、ｐＤＴ２のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３を含有する）を挿入して構築された。
【０１６４】
ＧＤＨの３個の遺伝子全てを標的とする無作為に生成された変異株ライブラリーを作り出した。最初に以下のプライマーを使用して、エラープローンＰＣＲによって、ｄｈａＢ１（１６６８ｂｐ）、ｄｈａＢ２（５８５ｂｐ）およびｄｈａＢ３（４２６ｂｐ）を含んでなる配列をｐＧＤ２０から増幅した。ＤＨＡ−Ｆ１（配列番号５）およびＤＨＡ−Ｒ１（配列番号６）。カリフォルニア州パロアルトのクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））からのクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）変異誘発キットを使用して、エラープローンＰＣＲを実施した。反応混合物は以下から構成された。３８μＬのＰＣＲ等級水、５μＬの１０×アドバンタック・プラス（ＡｄｖａｎＴａｑ Ｐｌｕｓ）緩衝液、２μＬのＭｎＳＯ_４（８ｍＭ）、１μＬのｄＧＴＰ（２ｍＭ）、１μＬの５０×ダイバーシファイｄＮＴＰミックス（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ）、１μＬプライマー混合物、１μＬテンプレートＤＮＡ、および１μＬのアドバンタック・プラス（ＡｄｖａｎＴａｑ Ｐｌｕｓ）ポリメラーゼ。製造元の説明書に従って熱サイクル反応を実施した。２．７ｋＢのＰＣＲ生成物をＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ Ｉで消化して、ライゲーションの準備をした。
【０１６５】
変異株ライブラリー構築
Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉ消化を使用してｐＧＤ２０コンストラクトからＧＤＨの３個の全遺伝子を含有する全挿入断片を除去できるが、挿入断片サイズはほぼ２．７ｋＢであり、一方ベクターサイズは約２．９ｋＢである。アガロースゲル上でのこれらの２つの断片の分離を容易にするために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｘｂａ ＩおよびＰｓｔ Ｉを使用してｐＧＤ２０を消化した。Ｐｓｔ Ｉはベクターを切断せず、代わりに挿入断片を３カ所のみで切断し、挿入断片から４個の小さな断片を生じる。したがって消化されたベクターは、アガロースゲル上でその他のＤＮＡ断片からの混入なしに、２．９ｋＢ周辺で移動する。次にＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ Ｉ／Ｐｓｔ Ｉ消化されたベクターとＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ Ｉ−消化されたエラープローンＰＣＲ生成物をライゲートする。エタノール沈殿後、ライゲーション混合物を形質転換する準備が整った。
【０１６６】
ライゲーション混合物の形質転換
Ｔ７プロモーターが変異株ライブラリーのために使用されたので、ラムダＤＥ３で溶原化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を変異酵素発現のための宿主細胞として使用した。具体的には、５Ｋ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を変異株ライブラリー構築のために使用した。最初に電気穿孔適格性の５Ｋ（ＤＥ３）細胞を次のようにして作成した。２Ｌ滅菌フラスコ内の５００ｍＬのＬＢブロスに、一晩培養した２．５ｍＬの細胞を添加した。ＯＤ_６００が０．５〜０．８に達するまで、培養を振盪機上で３７℃でインキュベートした。次に細胞を氷の上で１０分間インキュベートし、続いて４℃で１０分間遠心分離した。細胞を５００ｍＬの氷冷水で１回洗浄した後、細胞を１〜２ｍＬの１０％氷冷グリセロールに再懸濁した。滅菌エッペンドルフ管内にアリコート（５０μＬ）を作成し、即座にドライアイス内で凍結した。コンピテントな細胞を−８０℃で保存した。
【０１６７】
形質転換のために、１μＬのライゲーション混合物を４０μＬのコンピテントな細胞に添加し、サンプルを０．１ｃｍのギャップを残して電気穿孔キュベット内に移した。１．７ｋｖ／ｃｍの電圧を電気穿孔のために使用した。アンピシリン存在下で細胞をＬＢプレート上にのせ、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１６８】
「Ｘｂａ」変異株ライブラリーのＤＮＡ配列分析
ＤＮＡ配列決定分析のために、９個の変異株コロニーを無作為にピックアップした。配列決定後、生じた変異数、変異位置、および観察された特定タイプの変異を各変異株について分析した。分析からは、変異株中に全タイプの塩基置換が存在することが明らかになり、特定の変異タイプに対するバイアスの欠如が示唆された。さらに分析された９個の変異株クローン中にただ１個の欠失変異が観察され、塩基挿入変異は同定されなかった。これは変異株ライブラリー中の欠失および挿入の頻度が非常に低いことを示唆した。平均変異速度はｋＢあたり４．２点の変異であった。ＧＤＨ活性測定は、ライブラリー中の約１５〜２５％の変異株が活性であることを示した。
【０１６９】
実施例２
「Ｓｍａ−ライブラリー」の構築：ＧＤＨのα−サブユニットと、β−サブユニットの一部を標的とする無作為変異誘発
主に肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｄｈａＢ１遺伝子を標的とする第２の無作為変異株ライブラリーを作成した。ライブラリーの代表的な配列分析は、ｋＢあたりほぼ４．５点の変異があることを実証した。酵素活性測定は、ライブラリー中の約１５〜２５％の変異株が活性であると判定した。
【０１７０】
エラープローンＰＣＲ増幅および変異株ライブラリー構築
以下のプライマーを使用し、ｐＧＤ２０をテンプレートとして使用したエラープローンＰＣＲによって、ｄｈａＢ１遺伝子全体およびｄｈａＢ２遺伝子のほぼ２００ｂｐの部分を増幅した。ＤＨＡ−Ｆ１（配列番号５）およびＤＨＡ−Ｒ２（配列番号７）。実施例１で述べたようにして、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）変異誘発キットを使用してエラープローンＰＣＲ反応を実施した。次に１．９ｋＢのＰＣＲ生成物をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｍａ Ｉで消化した。
【０１７１】
ベクターを調製するために、ｐＧＤ２０プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｍａ Ｉで消化して（野生型ｄｈａＢ１遺伝子と、ｄｈａＢ２遺伝子の一部を除去して）、次にアガロースゲルから精製した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｍａ Ｉ−消化されたエラープローンＰＣＲ生成物とＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｍａ Ｉ−消化したｐＧＤ２０ベクターをライゲートした。実施例１で変異株ライブラリーの作成について述べたのと同様にして、ライゲーション混合物を電気穿孔によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）５Ｋ（ＤＥ３）中に形質転換した。
【０１７２】
「Ｓｍａ」変異株ライブラリーのＤＮＡ配列分析
１０個の変異株コロニーをＤＮＡ配列決定分析のために無作為にピックアップし、ライブラリーの完全性を調べた。各変異株を生じた変異数、変異位置、および観察された特定タイプの変異について判定した。これらの結果に基づいて、Ｓｍａ−ライブラリー中の平均変異速度は、ｋＢあたり４．５点変異と判定された。あらゆる特定の変異タイプについての明らかなバイアスはなく、変異株ライブラリー中の欠失および挿入の頻度は非常に低かった。酵素測定は、ライブラリー中の約１５〜２５％の変異株が活性であることを明らかにした。
【０１７３】
実施例３
ＧＤＨのα−サブユニットのアミノ酸番号１４１〜１５２（「ＰｐｕＭＩ−ライブラリー」）、２１９〜２２６（「４ＢＲ１−ライブラリー」）および３３０〜３４２（「ＲｓｒＩＩ−ライブラリー」）を標的にした領域的無作為変異誘発
ＧＤＨの結晶構造（リャオ（Ｌｉａｏ）ら、Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９３（１−２）：８４〜９１（２００３）；ヤマニシ（Ｙａｍａｎｉｓｈｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４８４〜４４９４（２００２））に基づいて、ＧＤＨのα−サブユニットの以下の領域を領域性無作為変異誘発の標的とした。１）アミノ酸番号１４１〜１５２、２）アミノ酸番号２１９〜２２６、および３）アミノ酸番号３３０〜３４２。これらの各領域は長さがかなり短いので、オリゴ−誘導変異誘発アプローチを使用してこれらの３個の変異株ライブラリーを制作した。これは変異させる各領域の上流または下流のユニークな制限部位に対応するサイレント変異を最初に作り出して、クローニングを容易にする多段階プロセスを伴う。このようにして変性オリゴヌクレオチドプライマーを調製して、ＰＣＲ反応において使用しα−サブユニットの標的領域で変異誘発した。次にこれらの変異誘発されたＰＣＲ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローン化して、「ＰｐｕＭＩ−ライブラリー」、「４ＢＲ１−ライブラリー」、および「ＲｓｒＩＩ−ライブラリー」を作り出した。
【０１７４】
ｐＧＤ２０中へのサイレント変異の導入
プラスミドｐＧＤ２０中にユニークな制限部位を作成するために、各標的領域の上流または下流に１個のサイレント変異を生成した。各領域で点変異を作成するために、以下のプライマー対を使用した。各プライマー中の太字の大文字で示すヌクレオチドは、特定の変異が導入される位置を示す。
【０１７５】
【表１３】

【０１７６】
カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、製造元の説明書に従って変異誘発実験を実施した。変異誘発に続いて、各変異株クローンからプラスミドを精製した。制限酵素消化と、それに続く直接的ＤＮＡ配列分析から点変異を確認した。
【０１７７】
オリゴ−誘導変異誘発
領域性無作為変異株ライブラリーを製造するために、３個の変性オリゴヌクレオチドを合成した（下に示すｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３、ＴＢ４Ｂ−Ｒ１、およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４）。大文字で示すヌクレオチドのためのオリゴヌクレオチド合成のために、標準条件を使用した。対照的に太字の小文字で示すヌクレオチドは、合成中に各プライマーの下に示す変性ヌクレオチド混合物を使用した。したがって１〜２点変異は、プライマーの各「変性領域」をもたらすことが予測された。
【０１７８】
ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３（ａ．ａ．１４１〜ａ．ａ．１５２領域のため−「ＰｐｕＭＩライブラリー」）：
５’−ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ａａｃ ｃａｇ ｔｇｃ ｃａｃ ｇｔｃ ａｃｃ ａａｔ ｃｔｃ ａａａ ｇａｔ ａａｔ ｃｃｇ ＧＴＧ ＣＡＧ ＡＴＴ−３’（配列番号１５）
ａ＝２％Ｇ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合される９４％Ａ、
ｇ＝２％Ａ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合される９４％Ｇ、
ｃ＝２％Ｇ、２％Ａ、および２％Ｔと混合される９４％Ｃ、
ｔ＝２％Ｇ、２％Ｃ、および２％Ａと混合される９４％Ｔ。
【０１７９】
ＴＢ４Ｂ−Ｒ１（ａ．ａ．２１９〜ａ．ａ．２２６領域のため−「４ＢＲ１ライブラリー」）：
５’−ＧＣＧ ＴＧＧ ＧＴＴ ＡＡＣ ｃａｇ ｃｔａ ｃｇｃ ｃｇａ ｇａｃ ｇｇｔ ｇｔｃ ｇｇｔ ｃｔａ ｃＧＧ ＣＡＣ ＣＧＡ ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＡＣ Ｃ−３’（配列番号１６）
ａ＝２％Ｇ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合される９４％Ａ、
ｇ＝２％Ａ、２％Ｃ、および２％Ｔと混合される９４％Ｇ、
ｃ＝２％Ａ、２％Ｔ、および２％Ｇと混合される９４％Ｃ、
ｔ＝２％Ａ、２％Ｇ、および２％Ｃと混合される９４％Ｔ。
【０１８０】
ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４（ａ．ａ．３３０〜ａ．ａ．３４２領域のため−「ＲｓｒＩＩライブラリー」）：
５’−ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＧＴ ＧＣＧ ＧＣＧ ＡＡＴ ＡＴＣ ｃｇａ ｇｔｇ ｇｇａ ｇａａ ａｇｔ ｃｔｇ ｇｔｃ ｇｔｔ ｇｇｃ ｇｇａ ｃｇｃ ｃａｃ ｔｔｃ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＧ−３’（配列番号１７）
ａ＝１．６６％Ｇ、１．６６％Ｃ、および１．６６％Ｔと混合される９５％Ａ、
ｇ＝１．６６％Ａ、１．６６％Ｃ、および１．６６％Ｔと混合される９５％Ｇ、
ｃ＝１．６６％Ｇ、１．６６％Ａ、および１．６６％Ｔと混合される９５％Ｃ、
ｔ＝１．６６％Ｇ、１．６６％Ｃ、および１．６６％Ａと混合される９５％Ｔ。
【０１８１】
次に高忠実度ＰＣＲ反応を実施し、以下のプライマー対を使用して変異原性ＰＣＲ断片を生成する。
●ＰｐｕＭＩ−ライブラリー：ｐＧＤ２０ＲＭ−Ｆ３およびＤＨＡ−Ｒ２（配列番号１５および７）、
●４ＢＲ−１ライブラリー：ＴＢ４Ｂ−Ｒ１およびＧＤ−Ｃ（配列番号１６および１４）、
●ＲｓｒＩＩ−ライブラリー：ＤＨＡ−Ｆ１およびｐＧＤ２０ＲＭ−Ｒ４（配列番号５および１７）。
【０１８２】
ＰＣＲ断片をアガロースゲルから精製し、次にＰｐｕＭ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ（ＰｐｕＭＩ−ライブラリーのため）、Ｈｐａ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ（４ＢＲ−１ライブラリーのため）、およびＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｒｓｒ ＩＩ（ＲｓｒＩＩ−ライブラリーのため）でそれぞれ消化した。
【０１８３】
変異株ライブラリー構築
（部位−誘導変異誘発によって、ＰｐｕＭ Ｉ、Ｈｐａ ＩまたはＲｓｒ ＩＩのユニークな制限酵素消化部位が導入されている）変異ｐＧＤ２０コンストラクトをＰｐｕＭ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ、Ｈｐａ Ｉ／Ｘｂａ ＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｒｓｒ ＩＩでそれぞれ消化した。直線化ベクターをアガロースゲルから精製し、次に制限酵素−消化したＰＣＲ生成物にライゲートした。実施例１で述べたようにして、ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株５Ｋ（ＤＥ３）中に電気穿孔し、変異株ライブラリーを調製した。
【０１８４】
領域性ライブラリーのための配列決定分析
各領域性ライブラリーからのＤＮＡ配列決定分析のために、９〜１０個の変異株コロニーを無作為にピックアップした。ＰｐｕＭＩ−ライブラリーでは、変異株あたりの平均変異速度は２．８個の変異（ｎ＝９）であった。４ＢＲ１−ライブラリー（ｎ＝８）では、変異株あたりの平均変異速度は２．０個の変異であった。最後にＲｓｒ ＩＩライブラリー（ｎ＝１０）からの配列決定データからは、変異株あたり２．２個の変異の平均変異速度が明らかになった。３個のライブラリーのいずれにおいても、挿入または欠失のいずれも観察されなかった。全てのタイプの塩基置換が検出されたが、あらゆる特定の変異タイプに対するバイアスの欠如が示唆された。
【０１８５】
実施例４
スクリーニング・アッセイ開発
Ｂ_１２補酵素および基質（グリセロール）の添加によって、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ反応が手動で「開始」できるスクリーニング・アッセイを開発した。比色分析アルデヒドアッセイによって、デヒドラターゼ反応生成物３−ＨＰを検出する。このアッセイを使用して、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下での典型的なＢ_１２依存性デヒドラターゼ反応の経時変化に関わる予備的な分析により、反応初期速度ｖ、および観察された酵素不活性化速度ｋ_{観察された不活性}を推定する迅速な理論的技術の開発が可能になった。
【０１８６】
スクリーニング・アッセイ原理
酵素の補助因子である補酵素Ｂ_１２の供給源を有さなければ、野生型Ｂ_１２依存性デヒドラターゼまたは変異株Ｂ_１２依存性デヒドラターゼのどちらかを発現する培養は、アポ−Ｂ_１２依存性デヒドラターゼを生成する。対照的にホロ酵素は、トルエン−および洗剤−透過化処理されたホールセルに補酵素が添加されれば自然発生的に形成する。したがってこのような細胞に補酵素と基質を添加することで、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼ反応を「開始する」ことが可能である。反応生成物である３−ＨＰは、試薬３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン（ＭＢＴＨ）および酸化剤である塩化第二鉄を使用して、比色分析アルデヒドアッセイにより検出できる（ズーレック（Ｚｕｒｅｋ）Ｇ．、およびカルスト（Ｋａｒｓｔ）Ｕ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３５１：２４７〜２５７（１９９７））。
【０１８７】
（１，３−プロパンジオール有りまたは無しで）典型的なＧＤＨ反応の経時変化を調べる予備的アッセイ
野生型ＧＤＨを生成する細胞を、１５％レノックス・ブロス（メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））からの１５容積のレノックス・ブロスを８５容積の０．５％ＮａＣｌで希釈し、続いて滅菌して作成した）中で、ニュージャージー州ニュー・ブランズウィックのニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ））からのイノヴァ（Ｉｎｎｏｖａ）４３００恒温器内で振盪（２５０ｒｐｍ）して、３７℃で一晩生育させた。細胞を次のようにして透過化処理した。培養（０．３ｍＬ）のアリコートをカリフォルニア州フラートンのベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ））からのポリプロピレン深型ウェルプレートの方形ウェル内に分配し、２．５％（ｖ／ｖ）のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００洗浄剤を含有する１０μＬのトルエンを各ウェルに入れた。次にプレートをドイツ国シュタウフェンのＩＫＡ−ヴェルク（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ Ｇｍｂｈ．（Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））からのＩＫＡ ＭＴＳ４振盪機上で１０分間、最大速度で振盪した。補酵素Ｂ_１２を保護するため赤色光の下で作業して、５容積の基質溶液を１容積の透過化処理した細胞懸濁液に添加して反応を開始した。基質溶液は、０．１ＭのＫ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８）中に、１２ｍＭのグリセロールおよび２４μＭの補酵素Ｂ_１２を含有した。定刻のインターバルに、反応の１２．５μｌのアリコートを１２．５μｌの０．４Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）中の３ｍｇ／ｍＬ ＭＢＴＨを含有する９６−ウェルプレートのウェルに入れた。標本採取の少なくとも２０分後に、１２５μＬの１０ｍＭ ＨＣｌ中の５．５ｍＭ ＦｅＣｌ_３をＭＢＴＨ−含有サンプルのそれぞれに添加した。さらに２０分以上してから、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ））からのスペクトラマックス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）１６０プレートリーダーを使用して、ＧＤＨ活性に伴う青色を６７０ｎｍでの吸光度として定量化した。基質溶液を５０ｍＭの１，３−プロパンジオールで補って、同様の実験を行った。
【０１８８】
アッセイ結果の理論的な分析
図１で示されるように経時変化反応からのデータを時間−対−ＯＤ_６７０でプロットした。具体的には、図１上方の曲線が、基質とした１０ｍＭのグリセロール（Ｋ_ｍ約０．５ｍＭ）とのＧＤＨ（室温、０．１Ｍ Ｋ−ＨＥＰＥＳ中、ｐＨ８）の反応の経時変化を示す。時間と共に不活性化が起きるので、生成物形成速度は迅速に低下する。３個のパラメーターを以下の式に当てはめて、点を通過する理論的曲線が描かれる。
ｙ＝Ｔ_０＋ａｍｐ（１−ｅｘｐ（−ｋ_{観察された不活性}^＊時間））
これらのパラメーターは、
１．）バックグラウンド（アッセイのｔ＝０（Ｔ_０））値）、
２．）アッセイ中に生じる制限総吸光度の振幅値（ａｍｐ）、および
３．）曲率を制御する一次不活性化速度定数（ｋ_{観察された不活性}）である。
フィッティングパラメーターは次のように反応の速度特性に関連する。振幅は観察された酵素不活性化速度（ｋ_{観察された不活性}）によって除された反応初期速度（ｖ）に等しい。初期速度は［ＧＤＨ］［ｇｌｙ］ｋ_ｃａｔ／（Ｋ_ｍ＋［ｇｌｙ］）である。アッセイバックグラウンドを差し引くと、さらなる分析は以下を明らかにする。
１．反応中に採取された、ｖの推定のための初期点（Ｔ１）、および振幅のための末期点（Ｔ２）の２個のサンプルのみからｖおよびｋ_{観察された不活性}の双方が推定でき、
２．１／ｋ_{観察された不活性}はＴ２／Ｔ１として推定できる。
【０１８９】
図１下方の曲線は、５０ｍＭの１，３−プロパンジオール（Ｋ_ｉ約１５ｍＭ）をアッセイに含めることの影響を示す。反応初期速度は約２０％だけ低下したが、不活性化は約３時間早かった。これは、競合的阻害が比較的小さいが、酵素−１，３−プロパンジオール複合体の不活性化の速度定数（ｋ_{不活性１，３−プロパンジオール}）が、酵素−グリセロール複合体のそれ（ｋ_{不活性グリセロール}）を超えるためである。
【０１９０】
双方の不活性化プロセスを組み込んだ速度スキームを下に示す。
【０１９１】
【化１】

【０１９２】
実施例５
二点ハイスループット・スクリーニング・アッセイ
実施例４で述べた方法論に基づいて、ハイスループット・スクリーニング・アッセイ・プロトコルを使用して、実施例１、２、および３で調製した変異株コロニーを調べた。このアッセイでは、アッセイ中に２つの時点で特にＧＤＨ反応生成物を測定した。Ｔ１はＴ_０の３０秒後に測定し、Ｔ２はＴ_０の４０分後に測定した。
【０１９３】
０．１５ｍＬ／ウェルで１５％レノックス・ブロスを含有する標準９６−ウェルマイクロタイタープレートの９４個のウェル内に、プレート培養したライブラリーからのコロニーをピックアップして入れた。残る２個のウェルには、野生型ＧＤＨを生成する細胞を接種し、細胞を静止恒温器内で４〜６時間３７℃で培養した。代案としては、ピックアップした細胞をスクリーニング前に−８０℃で保存することが望ましい場合、保存する前に、グリセロール（１０％ｖ／ｖ）を含む培地およびピックアップした細胞を一晩培養した。スクリーニング前に、カリフォルニア州サンディエゴのＶ＆Ｐサイエンティフィック（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））からの９６−ピン接種器によって、あらかじめ凍結した細胞をグリセロールなしで１５％レノックス・ブロスを含有する新鮮な９６−ウェルプレートに移し、６〜１６時間３７℃で振盪せずに培養した。
【０１９４】
ＧＤＨ変異株スクリーニングでは、細胞培養プロトコルは次のとおりであった。カリフォルニア州フラートンのベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ））からのポリプロピレン深型ウェル９６−プレートのウェル内に、１５％レノックス・ブロス培地を分配した（０．３ｍＬ／ウェル）。９６ピン−長ピン接種機（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用して、浅型９６−ウェルプレートから深型ウェルへ細胞を接種して、ミネソタ州セントポールの３Ｍヘルスケア（３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ））からの３インチ幅のミクロポア外科手術用テープによってプレートを覆った。アッセイが完了するまで浅型９６−ウェルプレートを４℃で保存し、潜在的に改善されたと同定される系統をさらに調べるために、生細胞の供給源としてそれらを使用した。深型ウェルプレート中の細胞は、３７℃で一晩（２５０ｒｐｍ）振盪しながら培養した。ニュージャージー州ニュー・ブランズウィックのニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ））からのイノヴァ（Ｉｎｎｏｖａ）４３００恒温器内の空気は、プラスチックトレー内の湿ったスポンジによって加湿した。
【０１９５】
２．５％（ｖ／ｖ）のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００洗浄剤を含有する１０μＬのトルエンを各ウェルに添加して、９６−ウェルプレート内で細胞を透過化処理した。次にプレートをドイツ国シュタウフェンのＩＫＡ−ヴェルク（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ Ｇｍｂｈ．（Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））からのＩＫＡ ＭＴＳ４振盪機上で１０分間、最大速度で振盪した。赤色プラスチックフィルムで覆って白色室内光から基質混合物を保護した、ペンシルベニア州フィラデルフィアのローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ））からのプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）（登録商標）閉鎖容器内にあるバイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）２０００ロボット（ベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、アリコート（８μＬ）の透過化処理された細胞を９６−ウェル反応プレートに移した。０．１Ｍカリウム−ＨＥＰＥＳ緩衝液中（ｐＨ８）に２４μＭ補酵素Ｂ_１２、１２ｍＭグリセロール、および５０ｍＭ １，３−プロパンジオールを含有する４０μＬの基質混合物（赤色光の下で調製されて、必要になるまでホイルを巻いた容器内に−２０℃で保存）をロボットによって細胞に添加して、室温での反応を開始した。基質添加の３０秒後、１２．５μＬの反応のアリコート（Ｔ１サンプル）を０．４Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）中の１２．５μＬ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン（ＭＢＴＨ）をウェルが含有する第２のプレートに移した。基質添加のほぼ４０分後、ＭＢＴＨを含有する第３のプレートに、同様の反応のアリコート（Ｔ２サンプル）を移した。この移動の少なくとも２０分後、１２５μＬの１０ｍＭ ＨＣｌ中の５．５ｍＭ ＦｅＣｌ_３溶液を第２および第３のプレート（ＭＢＴＨを含有する）の各ウェルに添加した。さらに２０〜６０分後、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ））からのスペクトラマックス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）１６０プレートリーダーを使用して、ＧＤＨ活性に伴う青色を６７０ｎｍでの吸光度として定量化した。
【０１９６】
プレートリーダーからのデータをワシントン州レドモンドのマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（登録商標）（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）からの修正したエクセルコンピュータープログラムに移した。このプログラムは、各反応プレートからの第１（Ｔ１）および第２（Ｔ２）のサンプルをマッチさせ、アウトプットをプレート、プレート内の位置、および各反応におけるＴ１、Ｔ２、およびＴ２／Ｔ１比率を示す結果の表にするように組まれている。Ｔ１、Ｔ２、またはＴ２／Ｔ１比率において非常に高い値を示すサンプルについてデータを調べた。これは、これらのあらゆるパラメーターでデータをソートするプログラムの能力によって容易になった。最も有望な候補をさらに詳しく調べるために、保留した浅型９６−ウェルプレートから画線培養した。
【０１９７】
実施例６
ＧＤＨ変異株ライブラリーのスクリーニングおよびポジティブヒットの同定
実施例５で述べた自動化されたハイスループットアッセイを使用して、５個の変異株ライブラリーからのほぼ１００，０００個の変異株コロニーをスクリーニングした。これらのライブラリーは次を含んだ。
１．）実施例１で述べたように、α−、β−、およびγ−サブユニット（ＤｈａＢ１、ＤｈａＢ２、およびＤｈａＢ３）を標的にしたＸｂａライブラリー、
２．）実施例２で述べたように、α−と、β−サブユニットの小さな部分を標的にしたＳｍａライブラリー、
３．）実施例３で述べたように、α−サブユニットのａ．ａ．１４１〜ａ．ａ．１５２を標的にしたＰｐｕＭＩライブラリー、
４．）実施例３で述べたように、α−サブユニットのａ．ａ．２１９〜ａ．ａ．２２６を標的にした４ＢＲ１ライブラリー、および
５．）実施例３で述べたように、α−サブユニットのａ．ａ．３３０〜ａ．ａ．３４２を標的にしたＲｓｒＩＩライブラリー。
【０１９８】
あらゆる個々の単離株は、上述の５個のライブラリーの１つから誘導された。ほとんどの個々の単離株は、ライブラリー供給源を示すラベルとそれに続く数（例えば「Ｘｂａ３０１０」）によって一義的に同定された。第１のスクリーニングからの全ての推定上の「ヒット」は、フォローアップアッセイ中で確認した。ほとんどの変異効果は、下で述べるような速度パラメーターに基づいて、４個の大まかなカテゴリーに従って分類された。変異遺伝子の配列分析とそれに続く野生型遺伝子との比較によって、各変異株遺伝子中に存在する特定の点変異の同定が可能になった。
【０１９９】
変異株ライブラリーのスクリーニングおよびヒットの確認
ほぼ１００，０００個の変異株の一次スクリーニングに続いて、フォローアップ確認アッセイによって推定上のヒットが確認された。簡単に述べると、各推定上のヒットを８個のウェル中で再アッセイした。それぞれの個々のクローンからの結果を統計学的に分析して、Ｔ１（３０秒で測定されるアルデヒド量）およびＴ２（４０分で測定されるアルデヒド量）の平均値および標準偏差を得た。これらの結果を野生型酵素と比較した。
【０２００】
図２は、ｙ−軸上のＯＤ_{６７０ｎｍ}に対してｘ−軸上にアッセイ数をプロットする典型的なフォローアップアッセイ結果を示す。Ｘｂａ３０１０および野生型クローンに関するＴ１およびＴ２でのそれぞれの個々のアッセイ（ｎ＝８）からの結果が提示される。平均値は横線として図示され、数的には括弧±標準偏差で提示される。一般に、標準偏差は約１０〜１５％であった。
【０２０１】
スクリーニング結果
表６は野生型を超えるＴ２／Ｔ１比率、または野生型を超えるＴ２のいずれか、またはその双方を有するヒットのフォローアップアッセイ結果をまとめる。Ｔ２／Ｔ１比率は、１，３−プロパンジオールおよびグリセロール存在下で起きる４０分の反応での酵素安定性の指標を提供する。Ｔ２は、完全に不活性化される前の酵素の総代謝回転数を示唆する。Ｔ２／Ｔ１比率が高いほど酵素の安定性が良くなる。したがって改善された安定性を有する変異酵素は、野生型酵素と比較して、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下で低下した不活性化速度を有する。
【０２０２】
表６では、野生型の結果への標準化に続く、フォローアップアッセイからのＴ１およびＴ２の平均値が報告される。ほとんどの変異酵素は以下の定義に基づいて、タイプ−１、−２、−３、または-４変異株に分類される。
●タイプ１変異株：野生型と比べてＴ２／Ｔ１比率が改善されている一方、Ｔ２値の絶対値が減少している。
●タイプ−２変異株：Ｔ２／Ｔ１比率およびＴ２の双方が野生型よりも改善されている一方、Ｔ２改善の程度はＴ２／Ｔ１比率の改善に満たない。
●タイプ−３変異株：Ｔ２／Ｔ１比率およびＴ２の双方が野生型よりも改善されており、双方の改善程度が同様である。
●タイプ−４変異株：Ｔ２／Ｔ１比率が野生型に対して同等または低下しているが、Ｔ２が改善されている。
【０２０３】
表６はまた、各変異株において同定された特定の点変異をまとめる。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０２０４】
【表１４】

【０２０５】
【表１５】

【０２０６】
【表１６】

【０２０７】
【表１７】

【０２０８】
配列決定結果に見られるように、ほとんどの変異はアミノ酸置換として同定される（サイレント変異を除く）。しかし変異株の２つ（Ｓｍａ３００２［配列番号１４０］およびＸｂａ３００９［配列番号１７９］）は、融合タンパク質である。具体的には、α−サブユニット（ｄｈａＢ１）をコードする遺伝子の停止コドン（ＴＡＡ）は、Ｓｍａ３００２およびＸｂａ３００９中でそれぞれＣＡＡ（Ｇｌｎ）またはＧＡＡ（Ｇｌｕ）に変化する。この停止コドンと、β−サブユニット（ｄｈａＢ２）をコードする遺伝子の最初のコドンの間には１５ ｂｐがあるので、これらの融合タンパク質のどちらもβ−サブユニット中にフレームシフトを引き起こさなかった。これにより、双方の変異酵素は活性を維持できるようになった。β−サブユニットの最初のコドン（ＧＴＧ）は、通常ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡによって認識される。しかし融合変異株では、このコドンがＶａｌ−ｔＲＮＡによって認識されなくてはならない。Ｓｍａ３００２融合タンパク質は、６個のアミノ酸残基Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号１８）からなるリンカーを含有した。Ｘｂａ３００９融合タンパク質では、リンカーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号１９）であった。
【０２０９】
実施例７
精製酵素を使用した変異株の生化学分析
各酵素の過剰発現および精製に続いて、５個の変異株および野生型ＧＤＨのより詳しい性質決定を実施した。
【０２１０】
過剰発現および精製
野生型酵素と共にさらに生化学分析するため、Ｘｂａ３００７（タイプ−１、配列番号４０）、Ｓｍａ３００２（タイプ−２、配列番号１４０）、Ｘｂａ３０１０（タイプ−３、配列番号１７５）、Ｘｂａ３００９（タイプ−４、配列番号１７９）および４ＢＲ１００１（タイプ−２、配列番号１７１））を選択した。最初に５Ｋ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株からプラスミドを精製して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。１．０ｍＭのＩＰＴＧを添加する前に、細胞をアンピシリン含有ＬＢ培地中で０．６〜１．０のＯＤ_６００に培養した。３７℃で３時間の誘導後、遠心分離によって細胞を採集し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）で１回洗浄した。細胞ペレットを−８０℃で保存した。
【０２１１】
酵素精製のため、細胞ペレットを最初にカリフォルニア州パロアルトのロシュ（Ｒｏｃｈｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からの完全なミニプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤および０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し（ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）モデル４５０；２０％出力、５０％パルス、氷浴中４分間）、続いて遠心分離した（４０，０００×ｇ、３０分間、４℃）。透明な上清を遠沈し（１１０，０００×ｇ、４℃、１時間）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を氷上の上清中に緩慢に添加して、溶液を５０％飽和とした。溶液を氷上で２５分間撹拌し、続いて遠心分離した（４０，０００×ｇ、３０分間、４℃）。ペレットを２ｍＬの泳動用緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭの１，２−プロパンジオールおよび１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁し、次に泳動用緩衝液で平衡化したニュージャージー州ピスカタウェイのファーマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からの１６／６０高負荷スーパーデックス（Ｈｉｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００粒径排除カラムに入れた。
【０２１２】
流速０．２５ｍＬ／分の緩衝液によって酵素を溶出し、画分コレクター（３ｍＬ／画分）を使用して溶出液を収集した。実施例５で述べたアッセイを使用して画分を酵素活性についてアッセイし、次に活性画分をプールして、マサチューセッツベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ））からのセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ１００を使用して濃縮した。１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．２）および１ｍＭのＤＴＴからなる新鮮な泳動用緩衝液を使用して、濃縮された酵素を同一カラムにもう一度通過させた。精製した酵素は、１０〜２０％の勾配ゲルおよびクマシー・ブルー染色を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による評定で、純度７５〜９５％であった。
【０２１３】
変異株ＧＤＨ酵素の生化学的性質決定：
精製した野生型および変異株ＧＤＨ酵素を使用した詳細な酵素速度分析を実施した。ＭＢＴＨ−比色分析アルデヒドアッセイ（ズーレック（Ｚｕｒｅｋ）Ｇ．、およびカルスト（Ｋａｒｓｔ）Ｕ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３５１：２４７〜２５７（１９９７））を使用して生成物形成を測定し、酵素活性を求めて、Ｋ_ＭおよびＶ_最大はラインウェーバー−バーク・プロットから求めた。ｋ_ｃａｔをＶ_最大から計算した。求めた酵素のＫ_Ｍおよびｋ_ｃａｔを表７に示す。
【０２１４】
【表１８】

【０２１５】
最後に、各変異酵素の不活性化特性の詳細な分析を実施した。実施例４で述べたようにして、グリセロール不活性化速度定数を測定した。空気不活性化速度定数のために、２１μＭの補酵素Ｂ_１２を含有する０．１Ｍ Ｋ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）で酵素を２７μｇ／ｍＬに希釈し、次に空気中において室温でインキュベートした。総代謝回転数をインキュベーションの０．２５、０．５、１、２、５、１０、１５、２０および３０分後に測定した。総代謝回転数を測定するために、２００ｍＭのグリセロール、２４ｍＭの補酵素Ｂ_１２、および０．１ＭのＫ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）を含有する１９０μＬの反応溶液に１０μＬの酵素溶液を添加して、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。ＭＢＴＨ−比色分析アルデヒドアッセイ（ズーレック（Ｚｕｒｅｋ）Ｇ．、およびＵ．（カルスト（Ｋａｒｓｔ）Ｕ．、同上）を使用して３−ＨＰ濃度を測定することで、総代謝回転数を推定した。時間−対−総代謝回転数でデータをプロットし、Ａ＝Ａ_０ｅｘｐ（−ｋ_空気ｔ）（式中、「Ａ」は総代謝回転数、「Ａ_０」は０時の総代謝回転数、「ｋ_空気」は空気不活性化速度定数、および「ｔ」は時間である）を使用して、曲線のあてはめにより総代謝回転数を推定した。
【０２１６】
１，３−プロパンジオール不活性化を測定するために、２１μＭの補酵素Ｂ_１２および様々な濃度の１，３−プロパンジオール（すなわち、１、２０、１００および３００ｍＭ）を含有する０．１Ｍ Ｋ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中で、酵素を２７μｇ／ｍＬに希釈した。空気不活性化速度定数の測定のために使用した方法により、各１，３−プロパンジオール濃度について不活性化速度定数を推定した。不活性化速度定数を１，３−プロパンジオール濃度に対してプロットし、曲線から１，３−プロパンジオールによる最大不活性化速度定数を推定した。１，３−プロパンジオールの解離定数は、不活性化速度定数が最大不活性化速度定数の半分になる１，３−プロパンジオール濃度であった。
【０２１７】
この不活性化特性の分析結果を下の表８に示す。グリセロールまたは１，３−プロパンジオールまたは光いずれかの不在下、しかし空気（酸素）存在下では、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素の不活性化が二相速度で起きる。ｋ_ｇｌｙは、１，３−プロパンジオールなしに１０ｍＭのグリセロール存在下で測定される不活性化速度定数である。全ての変異株および野生型デヒドラターゼは二相の空気不活性化を示したので、ｋ_空気、Ｆは急速相のための空気不活性化速度定数であり、ｋ_空気、Ｓは緩慢相の空気不活性化速度定数であり、ｋ_{１，３−プロパンジオール}は１，３−プロパンジオールによる最大不活性化速度定数である。Ｋ_ｄは１，３−プロパンジオールの解離定数である。
【０２１８】
【表１９】

【０２１９】
実施例８
選択した第一世代変異株の組み合わせによる２回目の変異誘発
１回目の変異誘発から得られた変異株をさらに改善するために、２回目の変異誘発を実施して、いくつかの第一世代変異株からの変異を組み合わせた。
【０２２０】
第２世代変異株を製造するために、最初に、複数の変異を含有するいくつかの第一世代変異株からのプラスミド（例えばＳｍａ３００２またはＸｂａ３００９）を宿主細胞から精製した。次にこれらのプラスミドに、Ｘｂａ３００７、Ｘｂａ３０２９または４ＢＲ１００１で見つかった一点変異を導入して、第二世代変異株２−Ｆ４、１２−Ｂ１、１３−Ｂ７、および１６−Ｈ５を生成した。表９はこれらの各変異株、およびそれらを生成するのに使用したプライマーに関する詳細をまとめる。各プライマー中の太字の大文字で示すヌクレオチドは、特定の変異が導入される位置を示す。
【０２２１】
【表２０】

【０２２２】
カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、実施例３で述べたようにして変異誘発実験を実施した。
【０２２３】
実施例５で述べたようにして、各第二世代変異株のＴ２／Ｔ１比率およびＴ２値を求めた。これらの結果を下の表１０に示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０２２４】
【表２１】

【０２２５】
実施例９
純粋融合変異株の構築および分析
２個の融合変異株であるＸｂａ３００９（配列番号１７９）およびＳｍａ３００２（配列番号１４０）については、実施例６で述べた。どちらも融合それ自体に加えてその他の変異を含有した。α−およびβ−融合の効果を調査するために、２個の純粋融合変異株（１Ｅ１および２０Ｇ７）を構築した。
【０２２６】
純粋融合変異株の構築
α−サブユニット（ＴＡＡ）の停止コドンをＣＡＡ（１Ｅ１）またはＧＡＡ（２２−Ｇ７）に変化させた。この修飾は、野生型ＧＤＨプラスミド中に一点変異を導入することで達成した。点変異を作成するために、以下の２対のプライマーを使用した。
１−Ｅ１変異株のため：
１−Ｅ１−Ｆ１：５’−ｇａｃ ａｃｃ ａｔｔ ｇａａ Ｃａａ ｇｇｃ ｇｇｔ ａｔｔ ｃｃｔ−３’（配列番号２６）
１−Ｅ１−Ｒ１：５’−ａｇｇ ａａｔ ａｃｃ ｇｃｃ ｔｔＧ ｔｔｃ ａａｔ ｇｇｔ ｇｔｃ−３’（配列番号２７）
２２−Ｇ７変異株のため：
２２−Ｇ７−Ｆ１：
５’−ｃｃｃ ｇａｃ ａｃｃ ａｔｔ ｇａａ Ｇａａ ｇｇｃ ｇｇｔ ａｔｔ ｃｃｔ ｇｔｇ−３’（配列番号２８）
２２−Ｇ７−Ｒ１：
５’−ｃａｃ ａｇｇ ａａｔ ａｃｃ ｇｃｃ ｔｔＣ ｔｔｃ ａａｔ ｇｇｔ ｇｔｃ ｇｇｇ−３’（配列番号２９）
【０２２７】
各プライマー中の太字の大文字で示すヌクレオチドは、特定の変異が導入される位置を示す。
【０２２８】
カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、実施例３で述べたようにして変異誘発実験を実施した。実施例５で述べたようにして、これらの第二世代変異株のＴ２／Ｔ１比率およびＴ２値を求めた。これらの結果を下の表１１に示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０２２９】
【表２２】

【０２３０】
実施例１０
変異株Ｓｍａ３００２に見つかった変異の分析
実施例６で同定された第一世代変異株であるＳｍａ３００２（配列番号１４０）は、Ｔ２／Ｔ１比率およびＴ２値の双方に顕著な改善を示した。それは４個の点変異を含有し、その１つは実施例９で詳細に探求した融合変異を含んだ。これらの変異の影響を個別に調査するため、さらに２個の変異株（α−Ｙ２７１Ｃおよびβ−Ｑ２Ｒ）を構築した。
【０２３１】
前に従った方法論を使用して、下に示すようなユニークにデザインされたプライマーを使用して、野生型プラスミドに単一点変異を導入した。前の実施例と同じく、各プライマー中の太字の大文字で示すヌクレオチドは、特定の変異が導入される位置を示す。
【０２３２】
【表２３】

【０２３３】
カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、実施例３で述べたようにして変異誘発実験を実施した。実施例５で述べたようにして、これらの変異株のＴ２／Ｔ１比率およびＴ２値を測定した。表１３に結果を示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０２３４】
【表２４】

【０２３５】
α−Ｙ２７１Ｃ変異はＴ２値を低下させるが、Ｔ２／Ｔ１比率を変化させることができなかった。したがってこの変異は、酵素のｋ_ｃａｔを低下させる。別の変異β−Ｑ２Ｒは、Ｔ２またはＴ２／Ｔ１比率のいずれにも顕著に影響しないようである。
【０２３６】
Ｓｍａ３００２（配列番号１４０）における３個の非融合変異のいずれかが協力して作用し、１，３−プロパンジオールおよびグリセロール存在下での酵素の安定性を増大させるかどうかを判定するために、３個の追加的な変異株を作成した。これらの各変異株では、野生型ＤＮＡ配列を単一点変異として導入することで、Ｓｍａ３００２における３個の非融合変異（α−Ｙ２７１Ｃ、α−Ｙ５０２Ｈ、またはβ−Ｑ２Ｒ）の１つを除去した。これからＳｍａ３００２中に存在した元の非融合変異の内２つをそれぞれ含有する、３個のＳｍａ３００２−由来変異株が得られた。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、実施例３で述べたようにして、Ｓｍａ３００２プラスミド中に単一点変異を導入し、プライマーを下の表１４に示す。
【０２３７】
【表２５】

【０２３８】
実施例５で述べたようにして、これらの変異株のＴ２／Ｔ１比率およびＴ２値を測定した。表１５はこの分析の結果を示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０２３９】
【表２６】

【０２４０】
実施例１１
いくつかの第一世代変異の第二世代変異株への添加による３回目の変異誘発
ここでＴ２として報告する値で測定されるＧＤＨ酵素の総代謝回転の改善に向けて、先行する実施例でかなりの改善がなされたが、３回目の変異誘発を施した。これらの反応では、Ｔ２値の最大の改善を示す２個の第二世代変異株（すなわち１−Ｅ１および８−Ｃ９）に、第一世代変異株から選択される点変異を導入した。これは最初に、宿主細胞から１−Ｅ１および８−Ｃ９変異株プラスミドを精製することで達成した。次に下の表１６に示すプライマーと、カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、実施例３で述べたようにして、これらのプラスミドにＸｂａ３００７、Ｘｂａ３０２９、または４ＢＲ１００１に見つかった単一アミノ酸置換変異を導入した。
【０２４１】
【表２７】

【０２４２】
これらの第三世代変異株のＴ２／Ｔ１比率およびＴ２値は、実施例５で述べたようにして測定した。表１７は結果を示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に掲載する。
【０２４３】
【表２８】

【０２４４】
全体的に第三世代変異株では、酵素安定性にかなりの改善があった。全ての変異株は、最良の第一世代変異株（すなわち、Ｓｍａ３００２（配列番号１４０））と比較して改善された安定性（Ｔ２／Ｔ１比率）および総代謝回転数（Ｔ２）を有した。実際、変異株２０−Ｂ９および２１−Ｄ１０は、これまでに作成した全変異株を超えるＴ２値を有した。
【０２４５】
実施例１２
いくつかの第二および第三世代変異株の生化学的性質決定
選択された第二世および第三世代変異株をさらに詳しく性質決定するために、実施例４で述べる方法を使用して、１０ｍＭのグリセロールおよび５０ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下でこれらの変異株の不活性化速度定数を求めた。これらの結果を下に示す表１８にまとめる。
【０２４６】
【表２９】

【０２４７】
期待されたように、結果はＴ２／Ｔ１比率の測定と一致した。
【０２４８】
改善されたＧＤＨの一用途は、１，３−プロパンジオール生物生産であるので、高濃度の１，３−プロパンジオール存在下における変異株の総代謝回転数を求めることが重要である。上述のアッセイは、わずか５０ｍＭ存在下で実施した。１，３−プロパンジオール生物生産のための発酵の後期では、１，３−プロパンジオール濃度が１Ｍに達することができる。したがって第２の二点アッセイを実施した。具体的には、いくつかの有望な変異株について、１０ｍＭのグリセロールおよび６００ｍＭの１，３−プロパンジオール存在下で、Ｔ２値も測定した。表１９に結果をまとめる。
【０２４９】
【表３０】

【０２５０】
結果は、Ｔ２_{（５０ｍＭ）}について得られたものと幾分同様であったが、数個の変異株は、予期された以上に良好に機能した。Ｓｍａ３００２のＴ２_{（６００ｍＭ）}は野生型酵素のそれよりも３．３倍高かった。各第三世代変異株（１５−Ｅ４、１８−Ｄ７、２０−Ｂ９、および２１−Ｄ１０）は、Ｓｍａ３００２と比較してＴ２_{（６００ｍＭ）}にさらなる改善を示した。結果は、より高いＴ２_{（６００ｍＭ）}を有するこれらの第三世代変異株が、より高濃度の１，３−プロパンジオール中でより耐性があることを示唆した。これらの変異株は、１，３−プロパンジオール生物生産のために非常に有用であることが期待される。
【０２５１】
実施例１３
高濃度の１，３−プロパンジオール存在下で総酵素代謝回転数を測定するための一点ハイスループット・スクリーニング・アッセイ
１，３−プロパンジオール濃度が約３００ｍＭよりも高い場合、反応開始後ほとんど即座にＧＤＨの不活性化が起きる。これらの条下ではＴ１が正確に測定できないので、実施例４および５で述べたハイスループット・スクリーニング・アッセイを使用して、変異株をスクリーニングすることができない。高濃度の１，３−プロパンジオール存在下での総酵素代謝回転数は、ここで改善することが望ましい重要な酵素速度パラメーターの１つである。この総酵素代謝回転数は、不活性化速度の低下またはｋ_ｃａｔの増大のいずれかによって改善できる。高濃度の１，３−プロパンジオール存在下で、改善された総酵素代謝回転数を有する変異株についてスクリーニングするために、修正したハイスループット・スクリーニング・アッセイを開発した。
【０２５２】
簡単に述べると、実施例５で述べたようにして、変異株細胞を９６−ウェルプレート内で培養し透過化処理した。カリフォルニア州フラートンのベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ））からのバイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）２０００ロボットを使用して、アリコート（８μＬ）の透過化処理された細胞を９６−ウェル反応プレートに移した。英国ハンプシャー州ニューミルトンのジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｔｏｎ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＫ））からのＱｆｉｌｌ２を使用して、０．１Ｍカリウム−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中の２４μＭ補酵素Ｂ_１２、１２ｍＭグリセロール、および７２０ｍＭの１，３−プロパンジオールを含有する４０μＬの基質を細胞に添加して、室温での反応を開始した。プレートを室温でほぼ７０分間培養した後、バイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）２０００ロボット（ベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ウェルが１２．５μＬの０．４Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）中の３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン（ＭＢＴＨ）を含有する第２のプレートに、反応の１２．５μＬのアリコートを移した。７０分の反応時間によって総代謝回転数の正確な測定ができるようになる。実施例５で述べたようにして、生成物である３−ＨＰの濃度を求めた。カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ））からのスペクトラマックス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）１６０プレートリーダーを使用して６７０ｎｍでの吸光度を測定し、総酵素代謝回転数（Ｔ（６００））を推定した。
【０２５３】
Ｑｆｉｌｌ２は、基質を１５秒以内に１枚の９６−ウェルプレートに添加できるので、この一点比色分析アッセイは実行するのがが簡単である。さらにアッセイは実施例４および５で述べたアッセイと比較して、より高いスループット能力を提供できる。野生型ＧＤＨおよび異なる酵素速度パラメーターを有するいくつかの変異株について、実施例５および本実施例で実施されたアッセイの比較結果を表２０に示す。
【０２５４】
【表３１】

【０２５５】
これらの結果は、各アッセイが異なる速度パラメーターについてスクリーニングすることを実証する。本実施例で述べられるスクリーニング・アッセイによって同定される変異株は、より高濃度の１，３−プロパンジオールに対してより抵抗性であり、一般に改善された安定性と妥当なｋ_ｃａｔ値を有する。
【０２５６】
実施例１４
酵素構造と変異の間の相互関係
この実施例では、野生型ＧＤＨと比較して増大したＴ２または増大したＴ２／Ｔ１比率を有する変異の位置をＧＤＨの三次元結晶構築に関して調べた。これによって変異が、改善された反応速度（不活性化速度が低下する）をもたらすことが多い変異「ホットスポット」と見なすことができるデヒドラターゼ内の領域の同定が可能になる。これらの領域における代案の配列変更は、おそらく反応速度に改善を有する追加的な変異株をもたらす。
【０２５７】
三次元構造に相関する変異位置
基質フリー形態のデヒドラターゼの三次元結晶構造は、Ｘ線結晶構造解析によって求められており（リャオ（Ｌｉａｏ）ら、Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ．９３（１−２）：８４〜９１（２００３））、さらに１，２−プロパンジオール複合体中の酵素の構造も報告されている（ヤマニシ（Ｙａｍａｎｉｓｈｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４８４〜４４９４（２００２））。これらの構造に基づいて、各ＧＤＨサブユニットの模式図上に、Ｔ２／Ｔ１比率またはＴ２のいずれかに改善をもたらす変異（実施例６〜１２からの）をマッピングした。より具体的には、図３はα−サブユニット上に単一点変異（野生型ＧＤＨと比較して）を含有する変異株の分布を示す（全ての単一点変異の８８％に相当）。対照的に、図４はα−サブユニッ上に複数点変異（野生型ＧＤＨと比較して）を含有する変異株の分布を示す。このサブユニットは全ての複数点変異の５８％を含有し、残りの変異は、β−（３１％）およびγ−（１１％）サブユニットにそれぞれ分布した。
【０２５８】
ポジティブヒットから同定されたホットスポット
単一点および複数点変異株の双方における変異は、ＧＤＨの全ての３個のサブユニットに位置して大型α−サブユニット全体に分布するが、単一点変異を含有する変異株および複数点変異を含有する変異株は、α−サブユニット中に２個の共通のホットスポットを示す。
【０２５９】
１つの変異ホットスポットは、α−サブユニットのＮ−末端から２番目のαらせん（残基６２〜７０）上に位置する。この領域では５個の単一点変異株が見つかり、内３つは残基６２に異なるアミノ酸置換の変異を有し、１つは残基６５に変異を有し、１つは残基７０に変異を有する（図３）。複数点変異株からの６個の変異部位はこのらせん上にも位置し、残基６２に３つ、残基６３、６７および７０にそれぞれ１つある（図４）。
【０２６０】
第２のホットスポットは、４番目のβ−鎖の部分、ＴＩＭバレルとそれに続くα−サブユニットのループおよび短いらせん（残基２２４〜２３６）を含む領域である。このホットスポットは活性部位の近辺にある。この領域では５個の単一部位変異が見つかっている。残基２２４は２個の変異株において異なるアミノ酸置換を有した。残基２２６は、２個の同一変異株の変異部位である。１個の変異株は、残基２３３上にある。さらに複数部位変異株の３個の変異部位は、この領域（残基２２６、２３１、および２３６）に位置する。
【０２６１】
実施例１５
ＧＤＨ変異株の部位飽和変異誘発
実施例９で特徴づけられる変異株中に存在する３個の変異部位に、部位飽和変異誘発を実施した。具体的には、これらの部位はγ−Ｔｈｒ５３（変異株Ｘｂａ３００９に見られる）、α−Ｌｅｕ５０９（変異株Ｘｂａ３０２９に見られる）およびα−Ｖａｌ２２４（変異株４ＢＲ１００１に見られる）であった。飽和変異誘発ライブラリーを調製するために、１−Ｅ１および８−Ｃ９変異株（それぞれ実施例９および１０）をそれらの宿主細胞から精製し、表２１に示す変性プライマーと共にテンプレートとして使用した。
【０２６２】
【表３２】

【０２６３】
カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））からのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位−誘導変異誘発キットを使用して、製造元の説明書に従って、ＧＤＨ−ＳＭ１、ＧＤＨ−ＳＭ２、ＧＤＨ−ＳＭ３、およびＧＤＨ−ＳＭ４ライブラリーを調製した。プラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株５Ｋ（ＤＥ３）への電気穿孔に続いて（実施例１で述べたように）、一点ＧＤＨアッセイを使用して各ライブラリーからの８８個の変異株コロニーをスクリーニングして、高濃度１，３−プロパンジオール存在下での総酵素代謝回転数を推定した。次に各スクリーニングからの最良のヒットをＤＮＡ配列分析にかけた。以下の表に結果を示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に提供する。
【０２６４】
【表３３】

【０２６５】
全ての４個の飽和変異株（ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１、ＧＳＨ−ＳＭ２−Ｂ１１、ＧＤＨ−ＳＭ３−Ｄ２、およびＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２［太字で示す］）は、それらが由来した親変異遺伝子との比較で、Ｔ（６００）のさらなる改善を示した。興味深いことに、変異株ＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２では、３個の塩基変化が同定された（すなわち、ＡＣＣ（γ−Ｔｈｒ５３）からＴＧＴ（Ｃｙｓ））。このタイプの変異は、エラープローンＰＣＲを使用して生成することが極めて困難である。
【０２６６】
実施例１６
不対プライマーを使用してＧＤＨ変異株を生成する遺伝子組み換え発生伸張法
無作為変異誘発、合理的デザインの変異誘発、および飽和変異誘発（実施例６、８−１１、および１５）を使用したグリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下でのＧＤＨ不活性化速度の顕著な改善にも関わらず、工業用途のためにはさらなる改善が望ましかった。したがって実施例６、９、１０、および１５からの２４個のグリセロールデヒドラターゼ変異株を不対プライマー法を使用した単一遺伝子組み換え発生伸張反応の親テンプレートとして使用した（米国特許出願第６０／３６０２７９号明細書）。
【０２６７】
短い側方ＤＮＡ断片の親遺伝子５’または３’末端への付着
ＰＣＲによって短い側方ＤＮＡ断片を親遺伝子の５’または３’末端に付着し、引き続いてそれを不対プライマーを使用した遺伝子組み換え発生伸張法のための結合部位として使用した。ＧＤＨを含有するプラスミドを宿主細胞から精製し、テンプレートとして使用した。
【０２６８】
具体的には、インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））からのエキスパンド高忠実度ＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した標準高忠実度ＰＣＲ反応において、フォーワードプライマーＧＤＨＭ−Ｆ１（配列番号３４３）および逆転写プライマーＧＤＨＭ−Ｒ１（配列番号３４４）を使用して、以下のテンプレート遺伝子を増幅した。１−Ｅ１（配列番号１９８）、野生型ＧＤＨ（配列番号１）、Ｘｂａ３０２３（配列番号１８２）、Ｘｂａ３０１０（配列番号１７５）、８−Ｃ９（配列番号２１２）、４ＢＲ１００１（配列番号１７１）、Ｘｂａ３０１５（配列番号１４７）、Ｘｂａ３００８（配列番号１５１）、Ｓｍａ３００３（配列番号１４３）、Ｘｂａ３０１６（配列番号１５５）、およびＸｂａ３０２０（配列番号１５９）。次に得られたＰＣＲ生成物を当モル比で共に混合し、「混合物−１」と称した。
【０２６９】
フォーワードプライマーＧＤＨＭ−Ｆ２（配列番号３４５）および逆転写プライマーＧＤＨＭ−Ｒ２（配列番号３４６）を使用して、以下の遺伝子を同様にして増幅した。Ｘｂａ３００７（配列番号４０）、Ｘｂａ３０２９（配列番号４４）、Ｘｂａ３０２５（配列番号５２）、Ｓｍａ３００９（配列番号１７９）、Ｓｍａ３０１０（配列番号１７５）、Ｓｍａ３００８（配列番号１５１）、ＲｓｒＩＩ００１（配列番号１３６）、ＰｐｕＭＩ００２（配列番号１２８）、ＫＧ００５（配列番号２５３）、ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１（配列番号３０１）、ＧＤＨ−ＳＭ２−Ｂ１１（配列番号３０４）、ＧＤＨ−ＳＭ３−Ｄ２（配列番号３０７）、およびＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２（配列番号３１０）。次に得られたＰＣＲ生成物を当モル比で共に混合し、「混合物−２」と称した。
【０２７０】
カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮＡ抽出キットを使用して、増幅された生成物をアガロースゲルから精製し、次に不対プライマーによる遺伝子組み換え発生伸張法のための親テンプレートとして使用した。
【０２７１】
不対プライマー法を使用した遺伝子組み換え発生変異生成物の作成
２個のプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１（配列番号２９）およびＴ７Ｔ（配列番号３０）を使用して、上述の２４個の親テンプレートから遺伝子組み換え産生物（すなわちＧＤＨ変異遺伝子）を作成した。配列番号３４３によって生成される短い５’ＤＮＡ断片の添加により、ＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、「混合物−１」（すなわち、１−Ｅ１、野生型ＧＤＨ、Ｘｂａ３０２３、Ｘｂａ３０１０、８−Ｃ９、４ＢＲ１００１、Ｘｂａ３０１５、Ｘｂａ３００８、Ｓｍａ３００３、Ｘｂａ３０１６、およびＸｂａ３０２０）中のテンプレートの５’末端とアニールする。しかしプライマーＰＡＤＨ３１６Ｆ１は、「混合物−２」テンプレートの５’末端に結合しない。同様にプライマーＴ７Ｔは、「混合物−２」テンプレート（すなわち、Ｘｂａ３００７、Ｘｂａ３０２９、Ｘｂａ３０２５、Ｓｍａ３００９、Ｓｍａ３０１０、Ｓｍａ３００８、ＲｓｒＩＩ００１、ＰｐｕＭＩ００２、ＫＧ００５、ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１、ＧＤＨ−ＳＭ２−Ｂ１１、ＧＤＨ−ＳＭ３−Ｄ２、およびＧＤＨ−ＳＭ４−Ｈ２）の３’末端にアニールするが、「混合物−１」テンプレートの３’末端には結合しない。
【０２７２】
反応のために以下の反応混合物をアセンブルした。１０ｎｇ「混合物−１」、１０ｎｇ「混合物−２」、各２００μＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（最終濃度、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２８６ｎＭのｐＡＤＨ３１６Ｆ１、２８６ｎＭのＴ７Ｔ、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からの０．６２５Ｕのホット・スター・タック（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ）、ｄＨ_２Ｏで２５μＬに調節。熱サイクル条件は次のとおりであった。９５℃で２分間変性、続いて９５℃で３０秒の６０回のサイクル、１秒＋６３〜６９℃の間の勾配でサイクルあたり１秒、７２℃で７分間の最終伸張、および４℃での保持。ニューヨーク州ウェストベリーのエッペンドルフ・サイエンティフィック（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ））からのエッペンドルフ・マスターサイクラー・グラジェント（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）５３３１を熱サイクル反応のために使用した。
【０２７３】
反応で使用した２個のプライマーは、いかなるテンプレートの５’および３’末端とも同時にマッチしないので、いずれの親テンプレートも反応中に増幅できない。しかし５’および３’末端の双方を有するあらゆる組み換えＤＮＡ生成物が、引き続く熱サイクル中で増幅される。不対プライマー反応に続いて、反応混合物をアガロースゲルにロードした。約６６〜６７℃において、不対プライマー反応から大量の２．７ｋＢのＰＣＲ生成物が得られた。テンプレートとして使用したオリジナルの親分子それ自身が約２．７ｋＢだったので、このサイズの生成物は予期された。
【０２７４】
遺伝子組み換え発生ＧＤＨ変異株ライブラリーの作成およびスクリーニング
組み換えＧＤＨ ＤＮＡ生成物（ほぼ２．７ｋＢ）をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＤＮＡ抽出キットを使用してゲルから精製し、Ｘｂａ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化して、次にＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−消化したｐＧＤ２０ベクターとリゲートした（実施例１）。実施例１で述べたように、電気穿孔によるライゲーション混合物の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株５Ｋ（ＤＥ３）への形質転換によって、変異株ライブラリーを得た。ライブラリーサイズはライゲーション反応あたり３０万個のコロニーを超えた。
【０２７５】
６，０００〜７，０００個の変異株コロニーをアガロースプレートからピックアップし、実施例１３で述べたように一点ハイスループット・スクリーニング・アッセイを使用してスクリーニングした。一次スクリーニングに続いて、フォローアップ確認アッセイにより推定上のヒットが確認された。簡単に述べると、各推定上のヒットを８個のウェル内で再アッセイした。個々の各クローンからの結果を統計学的に分析して、Ｔ（６００）の平均値および標準偏差を得た。これらの結果を野生型ＧＤＨ酵素と比較した。
【０２７６】
さらに二点アッセイを使用していくつかのヒットをさらに詳しく調査し（実施例５）、これらのヒットの初期反応速度および不活性化の変化を大まかに推定した。
【０２７７】
表２３はいくつかの遺伝子組み換え発生ＧＤＨ変異株について、これらの様々なアッセイの結果をまとめる。
【０２７８】
【表３４】

【０２７９】
異なる組み換えＧＤＨ変異株は（同様のＴ（６００）値を有するにもかかわらず）異なる酵素速度を示したが、これは単に各アッセイ手段のパラメーターの違いを反映するだけである。例えば変異株ＳＨＧＤＨ２４およびＳＨＧＤＨ４３は同一のＴ（６００）値を有したが、ＳＨＧＤＨ２４が野生型と比較して軽度に改善されたＴ１値のみを有したのに対し、ＳＨＧＤＨ４３は大幅に低下したＴ１を有した。ＳＨＧＤＨ２４では酵素のｋ_ｃａｔは低下しなかったが、対照的にＳＨＧＤＨ４３は大幅に低下したｋ_ｃａｔを有した。どちらの場合もＳＨＧＤＨ２４およびＳＨＧＤＨ４３双方のＧＤＨ酵素安定性が増大することで、総酵素代謝回転数の改善が可能になった。
【０２８０】
ＳＨＧＤＨ５１はこれらの変異株中で安定性について最大の改善を示したが、そのｋ_ｃａｔは大幅に低下したので、この変異株は最高の総酵素代謝回転数を有さなかった。ＳＨＧＤＨ３７はこれらの変異株中でＴ（６００）について最大の改善を示したが、そのＴ２値はＳＨＧＤＨ１２のそれよりも低く、ＳＨＧＤＨ３７が高濃度の１，３−プロパンジオールに対して、ＳＨＧＤＨ１２よりも抵抗性であることが示唆された。
【０２８１】
しかしいずれにせよ結果は明らかに、不対プライマー法を使用した新しい変異株の作成により、ＧＤＨ安定性におけるかなりの改善があったことを実証した。具体的には、無作為変異誘発を通じて得られた最良の変異株（すなわち変異株Ｓｍａ３００２；配列番号１４０）は３．３のＴ（６００）を有した。無作為変異誘発およびスクリーニングを通じて同定された変異株の合理的な組み合わせ、または部位飽和変異誘発を使用したこれらの変異の半無作為組み合わせからは、Ｔ（６００）が最大の４．３である変異株（すなわち変異株ＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１；配列番号３０１）が得られた。したがって不対プライマーを使用した遺伝子組み換え発生伸張法アプローチを使用した無作為遺伝子組み換えは、前述の合理的かつ半無作為アプローチよりも強力な技術であると結論される。
【０２８２】
変異遺伝子の配列分析
表２３に列挙される組み換えＧＤＨ変異株からプラスミドＤＮＡを精製し、それぞれのＧＤＨ遺伝子全体を配列分析した。変異株の分析と、それに続くオリジナル野生型ＧＤＨ遺伝子配列との比較は、これらの組み換え変異遺伝子が表２４に示す単一塩基置換変異（点変異）を含有することを示す。酵素のＤＮＡ配列のＳＥＱ識別番号は、表の一番目の欄に提供する。
【０２８３】
【表３５】

【０２８４】
【表３６】

【０２８５】
興味深いことに、全ての変異株（配列番号３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、３３７）はα−β融合変異を含有し（元来Ｓｍａ３００２およびＸｂａ３００９変異株に見られたように［実施例６］）、この変異がＴ（６００）値の改善にとって非常に重要であることが示唆された。ＳＨＧＤＨ４３は、４個の新たに作り出された変異に加えて、４個の異なる親遺伝子（すなわち４ＢＲ１００１、１−Ｅ１、Ｘｂａ３００８、およびＧＤＨ−ＳＭ１−Ｇ１１）からの変異を含有した。これは遺伝子組み換え発生ＰＣＲ中に、４個の異なる親遺伝子間で少なくとも４つの交差が起きたことを示唆した。ＳＨＧＤＨ２５およびＳＨＧＤＨ５１はいくつかの新たに作り出された変異に加えて、３個の親遺伝子（すなわち、ＳＨＧＤＨ２５ではＳｍａ３００３、４ＢＲ１００１、および１−Ｅ１；ＳＨＧＤＨ５１ではＲｓｒＩＩ００１、１−Ｅ１、およびＸｂａ３００７）からの変異を含有した。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】グリセロール存在下で、またはグリセロールおよび１，３−プロパンジオール存在下のどちらかで実施された、典型的なＧＤＨ反応の経時変化を示す。
【図２】実施例６で述べられるような典型的なフォローアップアッセイの図示される結果である。
【図３】（野生型ＧＤＨと比較して）α−サブユニット上に一点変異を含有する変異株の分布を示す。
【図４】（野生型のＧＤＨと比較して）α−サブユニット上に複数点変異を含有する変異株の分布を示す。
【図５】不対プライマーを使用した遺伝子組み換え発生伸張法の原理を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｃ）Ｂ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素と、グリセロールおよび少なくとも２５ｍＭの１，３−プロパンジオールを含んでなる混合物とを接触させ、
（ｄ）Ｂ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素をスクリーニングして、Ｂ_１２依存性デヒドラターゼの代謝回転率を推定する
ことを含んでなる、改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼのスクリーニング方法。
【請求項２】
（ｂ）のスクリーニングステップが、
ｅ）補酵素Ｂ_１２、デヒドラターゼ再活性化因子、または内因性のＢ_１２依存性デヒドラターゼの供給源を有さない細胞をグリセロールを含まない発酵性炭素基質上に生育させ、
ｆ）細胞を透過化処理し、
ｇ）補酵素Ｂ_１２、グリセロール、および少なくとも２５ｍＭの１，３−プロパンジオールの混合物をステップ（ｂ）の透過化処理された細胞に添加し、
ｈ）ステップ（ｃ）で生産された３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを定量化する
ことを含んでなり、
定量化が、Ｔ１、Ｔ２、およびＴ（６００）よりなる群から選択される測定である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号：４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８２、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０８、２１２、２１５、２１８、２２１、２２５、２２９、２３３、２３７、２４１、２４５、２４９、２５３、２５７、２６１、２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７よりなる群から選択される、Ｂ_１２依存性変異株デヒドラターゼをコードする核酸配列。
【請求項４】
配列番号：４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８２、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０８、２１２、２１５、２１８、２２１、２２５、２２９、２３３、２３７、２４１、２４５、２４９、２５３、２５７、２６１、２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７よりなる群から選択される核酸配列によってコードされるＢ_１２依存性変異株デヒドラターゼ。
【請求項５】
配列番号：１４０、１７９、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２１２、２１５、２１８、３０１、３０４、３０７、３１０、３１３、３１６、３１９、３２２、３２５、３２８、３３１、３３４、および３３７よりなる群から選択されるα−βサブユニット融合を含んでなる、Ｂ_１２依存性変異株デヒドラターゼをコードする核酸配列。
【請求項６】
配列番号３１３、３２２、および３２８よりなる群から選択されるα−βサブユニット融合を含んでなる、Ｂ_１２依存性変異株デヒドラターゼをコードする核酸配列。
【請求項７】
α−βサブユニット融合のαおよびβサブユニット間のリンカー配列をさらに含んでなり、リンカー配列が、配列番号１８および配列番号１９よりなる群から選択される請求項５に記載の核酸配列。
【請求項８】
ｄ）ホットスポット１またはホットスポット２を含んでなるＢ_１２依存性デヒドラターゼホロ酵素と変異原因物質とを接触させ、
ｅ）ステップＡ）で生産された変異株を改善されたｋｃａｔおよび／または安定性についてスクリーニングし、そして
ｆ）ステップａ）およびｂ）を反復する
ことを含んでなる、改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼ変異株を作り出す方法。
【請求項９】
ｄ）デヒドラターゼホロ酵素と５〜１０ｍＭのグリセロールおよび／または１０〜３００ｍＭの１，３−プロパンジオールとを接触させ、
ｅ）ハイスループットアッセイにおいて、ｋ_ｃａｔおよび総酵素代謝回転を推定するのに十分に隔たった少なくとも２つの時点で測定し、
ｆ）標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性変異株を選択する
ことを含んでなる、標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼを同定する方法。
【請求項１０】
ｄ）デヒドラターゼホロ酵素と５〜５０ｍＭのグリセロールおよび＞３００ｍＭの１，３−プロパンジオールとを接触させ、
ｅ）ハイスループットアッセイにおいて、Ｔ０から十分に隔たった１つの時点で測定して、総酵素代謝回転数を推定し、そして
ｆ）標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性変異株を選択する
ことを含んでなる、標準デヒドラターゼと比較して改善された反応速度を有するＢ_１２依存性デヒドラターゼを同定する方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【公表番号】特表２００７−５２４３４２（Ｐ２００７−５２４３４２Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６２２５８（Ｐ２００４−５６２２５８）
【出願日】平成１５年１２月１６日（２００３．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０３９７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５６９６３
【国際公開日】平成１６年７月８日（２００４．７．８）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】