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改変された亜鉛フィンガータンパク質を使用したCXCR4の修飾
説明

改変された亜鉛フィンガータンパク質を使用したCXCR4の修飾

例えば、亜鉛フィンガータンパク質、および開裂ドメインもしくは開裂ハーフドメインを含む亜鉛フィンガー転写因子(ZF−TF)または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を用いて、CXCR4遺伝子の活性を調整するための方法および組成物を本明細書に開示する。また、ZF−TFもしくはZFNをコードするポリヌクレオチド、ZF−TFもしくはZFNをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにZF−TFもしくはZFNをコードするポリヌクレオチドを含む細胞、および/またはZF−TFもしくはZFNを含む細胞も提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、2009年3月20日に出願された米国仮出願第61/210,636号、および2009年8月10日に出願された米国仮出願第61/273,861号の利益を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府支援の研究から創出された発明に対する権利の陳述
該当なし。
【0003】
本開示は、リンパ球および幹細胞を含む、ヒト細胞のゲノム修飾の分野に存する。
【背景技術】
【0004】
ゲノムDNAの標的開裂のための、さまざまな方法および組成物が説明されている。そのような標的開裂の事象は、例えば、標的突然変異誘発の誘発、細胞DNA配列の標的欠失の誘発、および所定の染色体座での標的組換えの促進に使用することができる。例えば、米国特許公開第20030232410号、同第20050208489号、同第20050026157号、同第20050064474号、同第20060188987号、同第2008015996号、および国際公開第WO2007/014275号を参照されたく、それらの開示は、すべての目的のために参照によりその全体が組み込まれる。また、Santiago et al.(2008)Proc Nat’l Aced Sic USA105:5809〜5814、Perez et al.(2008)Nat Biotechnol26:808〜816(2008)も参照されたい。
【0005】
HIVについて、インビボでの最も重要な共受容体は、7回膜貫通型ケモカイン受容体であるCCR5、およびCXCR4(CXCケモカイン受容体)である。例えば、Feng et al.(1996)Science272:872〜877、Deng et al.(1996)Nature381:661〜666、Schuitemaker et al.(1999)J.Virol.73:5373〜5380を参照されたい。CCR5(R5ウイルス)のみを用いるHIV1型(HIV−1)株が、感染の初期段階に優勢であり、伝染に重要な役割をもつ(Schuitemaker et al.(1992)J.Virol.66:1354〜1360、van’t Wout et al.(1994)J.Clin.Invest.94:2060〜2067)。R5ウイルスは、一般に、後期疾患において存続するが、CXCR4を用いることのできるウイルスは、単独で(X4ウイルス)、またはCCR5に加えて(R5X4ウイルス)のいずれかで、サブタイプBの感染者の約50%に現れる(Connor et al.(1997)J.Exp.Med.185:621〜628、Karlsson et al.(1994)J.Clin.Microbiol.32:364〜370)。この共受容体の切り替わりは、末梢血CD4+T細胞のより急激な低下、およびAIDSへのより急速な進行に関連する(Richman,D.et al.(1994)J.Infect.Dis.169:968〜974)。
【0006】
したがって、CXCR4指向性HIV感染症の治療および予防のための、CXCR4をノックアウトする組成物の必要性が残されている。
【発明の概要】
【0007】
CXCR4を、部分的または完全に不活性化するための組成物および方法を本明細書に開示する。特に、CXCR4を不活性化するために用いることのできるヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ)を、本明細書に説明する。本明細書に説明するCXCR4ヌクレアーゼは、細胞株(CXCR4細胞株)の生成に有用であり、この細胞株は、生理的条件下または病的条件下にあるCXCR4の機能(複数可)を研究するのに使用することができる。さらに、本明細書に説明するヌクレアーゼは、HIV−1感染を含む特定の疾患の治療のための治療用試薬として、エクスビボで、またはインビボで使用することもできる。
【0008】
一態様において、ヒトのCXCR4遺伝子内に標的部位を有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、これらのヌクレアーゼを用いるCXCR4遺伝子内の開裂は、CXCR4遺伝子の永久的な破壊(例えば、変異)をもたらす。ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガードメイン(複数可)は、CXCR4遺伝子のECL−2ドメイン内の標的部位に結合するように改変される。亜鉛フィンガータンパク質は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ以上の亜鉛フィンガーを含むことができ、各亜鉛フィンガーは、標的遺伝子内の標的サブサイトに結合する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質は、4つまたは5つのフィンガー(F1、F2、F3、F4、およびF5で示され、N末端からC末端にかけて、F1からF4、またはF1からF5の順に並ぶ)を含み、これらのフィンガーは、表1に示す認識領域のアミノ酸配列を含む。
【0009】
本明細書に説明するタンパク質のいずれも、開裂ドメインおよび/または開裂ハーフドメイン(例えば、野生型または改変されたFokI開裂ハーフドメイン)をさらに含んでもよい。したがって、本明細書に説明するZFNのいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼハーフドメイン(例えば、FokI開裂ハーフドメイン)を含む場合がある。他の実施形態では、ZFNは、例えば、偏性ヘテロ二量体を形成する改変されたFokI開裂ハーフドメイン等の、改変ヌクレアーゼドメインまたは改変ヌクレアーゼハーフドメインを含む。例えば、米国特許公開第20080131962号を参照されたい。
【0010】
別の態様において、本開示は、本明細書に説明するいずれのタンパク質もコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に説明するポリヌクレオチドのいずれも、CXCR4遺伝子内への標的挿入のための配列(ドナー配列またはパッチ配列)を含んでもよい。
【0011】
さらに別の態様では、本明細書に説明する任意のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター(例えば、Ad5/F35ベクター)である。したがって、少なくとも1つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードする配列、および/または標的遺伝子内への標的組み込みのためのドナー配列を含むアデノウイルス(Ad)ベクターも、本明細書に提供する。ある特定の実施形態では、Adベクターは、例えばAd5/F35ベクターである、キメラAdベクターである。追加の実施形態では、標的遺伝子は、ヒトのCXCR4遺伝子である。本明細書に説明するベクターはまた、ドナー配列を含む場合もある。ある特定の実施形態では、単一ベクターは、1つまたは複数のZFNをコードする配列と、ドナー配列(複数可)とを含む。他の実施形態では、ドナー配列(複数可)は第1のベクター内に含まれ、ZFNをコードする配列は第2のベクター内に存在する。
【0012】
さらなる別の態様において、本開示は、本明細書に説明するタンパク質、ポリヌクレオチド、および/またはベクターのうちのいずれかを含む単離細胞を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞、T細胞(例えば、CD4+T細胞)、マクロファージ、樹枝状細胞、および抗原提示細胞からなる群から選択される。細胞は、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)、マクロファージ、間葉幹細胞、ヒト胚性幹細胞(hES細胞)、造血幹細胞(例えば、CD34+細胞)、T細胞(例えば、CD4+T細胞)、樹枝状細胞もしくは抗原提示細胞を含み、または、K562(慢性骨髄性白血病)、HEK293(胚腎臓)、PM−1(CD4+T細胞)、Sup−T1(リンパ芽球性白血病)、THP−1(単球性白血病)、もしくはGHOST(骨肉腫)などの細胞株を含む。別の態様では、CXCR4が不活性化された細胞株を提供する。
【0013】
別の態様において、1つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチド、および/またはベクターを、本明細書に説明する細胞内に導入することによって、細胞内のCXCR4遺伝子を不活性化する方法を、本明細書に説明する。本明細書に説明する方法のいずれかにおいて、ZFNは、標的突然変異誘発、細胞DNA配列の標的欠失、および/または所定の染色体座での標的組換えの促進を誘発することができる。したがって、ある特定の実施形態では、ZFNは、標的遺伝子の1つまたは複数のヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態では、CXCR4遺伝子は、ZFN開裂に続く非相同末端連結の後で、不活性化される。他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列は、例えば、本明細書に説明するZFN(または前記ZFNをコードするベクター)、およびZFNを用いた標的開裂後の遺伝子内に挿入される「ドナー」配列を用いて置換される。ドナー配列は、ZFNベクター内に存在することができ、別個のベクター(例えば、Adベクター)内に存在することもでき、あるいは、異なる核酸送達機構を用いて、細胞内に導入することもできる。
【0014】
別の態様において、亜鉛フィンガータンパク質と、その融合物とを用いて、細胞内または細胞株内のCXCR4遺伝子を変異させる、および/またはCXCR4の機能を不活性化させるための方法を提供する。このように、ヒトの細胞内のCXCR4遺伝子を不活性化するための方法を提供し、方法は、本明細書に説明するタンパク質またはポリヌクレオチドのうちのいずれかを細胞に投与することを含む。
【0015】
さらに別の態様において、本開示は、被験者におけるHIV感染症の治療または予防のための方法を提供し、この方法は、(a)細胞内に、第1のポリペプチドをコードする第1の核酸を導入することを含み、第1のポリペプチドは、(i)CXCR4内の第1の標的部位に結合するように改変される、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインと、(ii)開裂ドメインとを含み、ポリペプチドが細胞内に発現されるような条件下で、ポリペプチドは標的部位に結合してCXCR4遺伝子を開裂し、さらに、(b)被験者に細胞を導入することを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞、T細胞、マクロファージ、樹枝状細胞または抗原提示細胞からなる群から選択される。核酸は、本明細書に説明されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含むことができる。方法のうちのいずれかにおいて、第1の核酸は、さらに第2のポリペプチドをコードすることができ、ここで、第2のポリペプチドは、(i)CXCR4遺伝子内の第2の標的部位に結合するように改変される、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインと、(ii)開裂ドメインとを含み、第2のポリペプチドが細胞内に発現され、それにより、第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれの標的部位に結合してCXCR4遺伝子を開裂する。同様に、これらの方法のうちのいずれかは、第2の核酸を細胞内に導入するステップをさらに含むことができ、ここで、第2の核酸は、CXCR4遺伝子に非相同性である配列を隣接する、CXCR4遺伝子に相同性である2つの領域を含む。これらの方法は、CXCR4をコードする遺伝子配列内に変化をもたらすために使用することができる。すなわち、CXCR4遺伝子内に組み込まれる第2の核酸内に、所望の変化を含むことによってなし得る。これらの方法を使用して、1ヌクレオチドへの修飾(変異または欠失)を含む、遺伝子配列内の大きなおよび小さな修飾。いくつかの態様において、本発明は、CCR5特異的ZFNSとの組み合わせでCXCR4特異的ZFNを使用する方法および組成物を提供する(例えば、米国特許出願第20080159996号を参照されたい)。CXCR4特異的ZFNおよびCCR5特異的ZFNは、単一の送達媒体(delivery vehicle)上に、ともに供給してもよく、個別に供給することもできる。同様に、CXCR4特異的ZFNおよびCCR5特異的ZFNは、連続的に同時に供給することができる。
【0016】
本明細書に説明する方法および組成物のうちのいずれかにおいて、細胞は、例えば、造血幹細胞(例えば、CD34+細胞)、T細胞(例えば、CD4+細胞)、マクロファージ、樹枝状細胞もしくは抗原提示細胞であり得、または、K562(慢性骨髄性白血病)、HEK293(胚腎臓)、PM−1(CD4+T細胞)、Sup−T1(リンパ芽球性白血病)、THP−1(単球性白血病)、もしくはGHOST(骨肉腫)などの細胞株であり得る。
【0017】
さらに、本明細書に説明する方法のうちのいずれかは、インビトロ、インビボおよび/またはエクスビボで実施することができる。ある特定の実施形態では、例えば、T細胞を、CXCR4の破壊によってHIV感染症に抵抗性をもたらせるなど、例えば、PBMCを修飾するには、方法はエクスビボで実施される。ある特定の実施形態では、例えば、CXCR4特異的ZFNを、HIVに苦しむ患者に投与することによって、方法はインビボで実施される。他の態様では、CXCR4特異的ZFNおよびCCR5特異的ZFNの両方を、HIVに苦しむ患者に投与することによって、方法はインビボで実施される。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】パネルA〜Cは、設計されたZFNを用いたCXCR4遺伝子の標的を示す。図1A〜1Cは、ZFN結合部位および認識ヘリックス配列を示す。各ZFNについて、主結合部位(下線)のDNA配列を含む、CXCR4遺伝子の切片を示す。−1から+6位の、各ZFNの認識ヘリックスのアミノ酸配列を、その標的DNA三重項の下に記載する。図1Dは、Surveyor(登録商標)ヌクレアーゼアッセイで測定された、設計されたZFNを用いた処理の後で、破壊されたCXCR4対立遺伝子が非相同末端連結(NHEJ)によって修飾された百分率を示す。100bp位のDNAラダー(Invitrogen)を、各ゲルの左に表す。開裂されたCXCR4PCRの産物は、矢印で示す。各列の下部の数字は、計算された、NHEJによる修飾の頻度(%)を示す。
【図2A】パネル2Aは、ZFNによるCXCR4の修飾を示す。図2Aは、ZFN濃縮細胞プール(X4−)および野生型(ZFN未処理)細胞(「WT」)から得られる、およびDNAミスマッチ感受性(mismatch−sensitive)Surveyorヌクレアーゼ酵素(Cel−1アッセイ)を用いて処理をした後の、ZFNによって標的とされるCXCR4遺伝子のPCR増幅された領域を表すゲルである。CXCR4遺伝子座で、ZFNによって修飾された対立遺伝子の百分率を最右2列の下に示す。
【図2B】パネル2Bは、ZFNによるCXCR4の修飾を示す。図2Bは、示される単一細胞クローンの、遺伝子型配列分析を示す。12273/12270ZFNのための、主結合部位(下線)のDNA配列を含むCXCR4遺伝子の切片は、整合のための参照配列として使用される。ダッシュ(「−」)は欠失を示し、太字は挿入を示す。
【図2C】パネル2Cは、ZFNによるCXCR4の修飾を示す。図2Cは、示される単一細胞クローンの、遺伝子型配列分析を示す。12273/12270ZFNのための、主結合部位(下線)のDNA配列を含むCXCR4遺伝子の切片は、整合のための参照配列として使用される。ダッシュ(「−」)は欠失を示し、太字は挿入を示す。
【図2D】パネル2Dは、ZFNによるCXCR4の修飾を示す。図2Dは、示される単一細胞クローンの、遺伝子型配列分析を示す。12273/12270ZFNのための、主結合部位(下線)のDNA配列を含むCXCR4遺伝子の切片は、整合のための参照配列として使用される。ダッシュ(「−」)は欠失を示し、太字は挿入を示す。
【図3】パネルA〜Cは、野生型SupT1およびCXCR4 SupT1修飾されたクローンB13およびA66の感染を示すグラフである。図3Aおよび3Bは、R5/X4指向性ウイルスHIV−1のR3A(図3A)およびSF2(図3B)は、Sup−T1細胞を生産的に感染させることができるが、Sup T1クローンB13またはA66には生産的に感染させることができないことを表している。図3Cは、厳密にX4指向性HIV−1のBK132ウイルスのための、同じ選択性を示す。
【図4】示す細胞の種類に対する、R3A(CCR5/CXCR4、また、R5/X4とも称する、指向性HIV−1ウイルス)の攻撃後の逆転写酵素(RT)活性を示すグラフである。最左の棒は、攻撃から6日後のRT活性を示し、中央の棒は、攻撃から13日後のRT活性を示し、また、右の棒は、攻撃から20日後のRT活性を示す。これは、B13細胞は、R5/X4指向性HIV株を使用する場合に、CCR5またはCXCR4のいずれかを再導入すると感染力は野生型のレベルまで修復されるため、CXCR4特異的ZFNによるCXCR4の破壊によってHIVに対する抵抗性を有することを表す。
【図5】Surveyor(登録商標)ヌクレアーゼアッセイによって測定された、CXCR4特異的ZFNで処理された主T細胞内における非相同末端連結(NHEJ)事象の頻度を表すゲルを示す。
【図6】パネルA〜Dは、CXCR4特異的ZFNを用いる主T細胞の処理によってもたらされる保護効果を表すグラフである。細胞は、CXCR4特異的ZFNまたはCCR5特異的ZFNで処理され、次いで、さまざまな度合いのCXCR4指向性をもつHIV株で感染させた。図6Aは、模擬HIV−1感染された細胞の増殖曲線を表す。図6B、6C、および6Dは、それぞれBK132細胞、HxB細胞およびR3A細胞の、示される形質導入後の時間での増殖曲線を表す。CXCR4特異的ZFNで処理された細胞は、CXCR4指向性HIV株の致死影響に対して、より抵抗性を示した。
【図7】パネルA〜Dは、CXCR4特異的ZFNを用いる主T細胞の処理によってもたらされる保護効果を表すグラフである。細胞は、CXCR4特異的ZFNまたはCCR5特異的ZFNで処理され、次いで、CXCR4指向性HIV株またはR5/X4指向性HIV株で感染させた。図7Aは、模擬HIV−1感染された細胞の増殖曲線を表す。図7B、7C、および7Dは、それぞれBK132細胞、HxB細胞およびR3A細胞の、示される形質導入後の時間での増殖曲線を表す。CXCR4特異的ZFNで処理された細胞は、CXCR4指向性HIV株またはR5/X4指向性HIV株の致死影響に対して、より抵抗性を示した。
【図8】HIV株へのインビトロ暴露後の、主T細胞内で測定可能なCXCR4遺伝子破壊の百分率を示すグラフである。HIV暴露(模擬)の不在下では、CXCR4遺伝子修飾の割合は、ほぼ一定に保たれる。細胞がCXCR4指向性HIV(天然CXCR4株、Bk132もしくは実験用に修飾されたCXCR4株、HxBのいずれか)に暴露されると、CXCR4修飾の割合は増加し、これは、CXCR4修飾が、CXCR4修飾された細胞に延命効果をもたらすことを表す。直接配列決定によって検出された破壊のレベルが、細胞集団におけるすべての対立遺伝子の75%を超えるようにすると、CXCR4破壊された両方のコピーをもつ細胞が選択され、かつHIVに対する最も強固な保護であると確定された。
【図9】パネルA〜Cは、逆転写酵素(RT)活性により測定された、CXCR4特異的ZFNまたはCCR5特異的ZFNのいずれかで処理されたサンプル内における、ウイルス量を示すグラフである。示される細胞は、ZFNで処理され、次いで、CXCR4指向性HIV株(図9Aに示されるBk132、図9Bに示されるHxB)またはCCR5およびCXCR4の両方について二重指向性を示すHIV株(図9Cに示されるR5X4)のうちのいずれかに暴露された。提示するすべてのデータにおいて、RT活性の量は、未処理のサンプル(NTD)内、またはCCR5特異的ZFNで処理されてからCXCR4指向性HIV株に暴露されたサンプル内のいずれにおいても、最も多かった。
【図10】パネルAおよびBは、NSGマウス内の、ZFNで処理されたヒトT細胞の生着、およびZFN処理細胞におけるCXCR4表面発現の割合を表すグラフである。図10Aは、マウス内のT細胞の生着を示し、CXCR4特異的ZFN処理細胞(X4ZFN)およびCCR5特異的ZFN処理細胞(R5ZFN)の両方が同等に良好に生着したことを表している。図10Bは、生着の前にCXCR4特異的ZFNまたはCCR5特異的ZFNのいずれかで処理された移植細胞の表面上のCXCR4発現の量を示す。予想通り、CXCR4特異的ZFN(X4ZFN)で処理された細胞は、CCR5特異的ZFN(R5ZFN)で処理された細胞よりも、より低いCXCR4発現の度合いを示した。
【図11】Surveyor(登録商標)ヌクレアーゼアッセイによって測定された、CXCR4特異的ZFNおよびCCR5特異的ZFNで共処理された主T細胞内における非相同末端連結(NHEJ)事象の頻度を表すゲルを示す。上のパネル(R5)は、CCR5修飾のために測定された細胞を示し、さらに下のパネル(X4)は、CXCR4修飾のために測定された細胞を示す。非相同末端連結(NHEJ)による修飾の割合は、各列の下部に示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
CXCR4遺伝子を標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(CXCR4−ZFN)を本明細書に開示する。これらのZFNは、例えば、CXCR4コード領域における所定の部位で、二本鎖切断(DSB)を効果的に生成する。部位は、例えば、CXCR4遺伝子(ヒト遺伝子など)のECL−2ドメイン内とすることができる。CXCR4における、部位特異的二本鎖切断(DSB)のZFN媒介導入は、ヒトリンパ細胞株内の標的CXCR4遺伝子の特異的かつ永久的な破壊をもたらす結果となった。
【0020】
概要
本明細書に開示する、方法の実践、ならびに組成物の調製および使用は、別段の指示がない限り、当該分野の技術範囲内である、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001、Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987および定期改訂、the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego、Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998、METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,「Chromatin」(P.M.Wassarman and A.P.Wolfee,eds.),Academic Press,San Diego,1999、およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,「Chromatin Protocols」(P.B.Becker,ed)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
【0021】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、線状または環状配座であり、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および/またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド(例えば、ホスホロチエート骨格)を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有する、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対合する。
【0022】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。用語はまた、1つもしくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
【0023】
「結合」は、高分子間(例えば、タンパク質と核酸との間)の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異性である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない(例えば、DNA主鎖のリン酸残基との接触)。そのような相互作用は、一般に、10-6-1またはそれ以下の解離定数(Kd)を特徴とする。「親和性」は、結合強度を指し、結合親和性の増加は、Kdの低下と相関する。
【0024】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子(DNA結合タンパク質)、RNA分子(RNA結合タンパク質)、および/またはタンパク質分子(タンパク質結合タンパク質)に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合では、それは、それ自身に結合することができる(ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するため)、および/または、それは、1つもしくは複数の分子の異なるタンパク質またはタンパク質群に結合することができる。結合タンパク質は、1種類以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、DNA結合活性、RNA結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。
【0025】
「亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質」(または結合ドメイン)は、亜鉛イオンの配位を介して安定化される構造を有する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、1つもしくは複数の亜鉛フィンガーを介する配列特異的方法でDNAを結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはZFPとして略記される。
【0026】
亜鉛フィンガー結合ドメイン(例えば、認識へリックス領域)は、所定のヌクレオチド配列に結合するように、「改変」することができる。亜鉛フィンガーの改変された領域は、典型的には認識へリックス、特に、アルファヘリックス領域の−1から+6と番号が付けられている部分である。改変された認識へリックスの骨格配列は、当該技術分野において知られている。例えば、Miller et al.(2007)Nat Biotechnol 25,778−785を参照されたい。亜鉛フィンガータンパク質を改変するための方法の非制限的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、その設計/組成が、主に、合理的基準によってもたらされる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のZFP設計および結合データの情報を記憶するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号、同第6,453,242号、および同第6,534,261号を参照し、また、国際公開第WO98/53058号、同第WO98/53059号、同第WO98/53060号、同第WO02/016536号、および同第WO03/016496号を参照されたい。
【0027】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、その産生が、主に、ファージ提示法、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスからもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第5,789,538号、同第5,925,523号、同第6,007,988号、同第6,013,453号、同第6,200,759号、国際公開第WO95/19431号、同第WO96/06166号、同第WO98/53057号、同第WO98/54311号、同第WO00/27878号、同第WO01/60970号、同第WO01/88197号、および同第WO02/099084号を参照されたい。
【0028】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、DNAまたはRNAである可能性があり、線状、環状、または分岐状である可能性があり、一本鎖または二本鎖のいずれかである可能性がある。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、2〜10,000ヌクレオチド長(または、その間もしくはそれ以上の任意の整数値)、好ましくは、約100〜1,000ヌクレオチド長(または、その間の任意の整数)、より好ましくは、約200〜500ヌクレオチド長である可能性がある。
【0029】
「相同非同一配列」は、第2の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は、第2の配列と同一ではない、第1の配列を指す。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列に対して相同的かつ非同一である。ある実施形態では、2つの配列の間の相同性の度合いは、通常の細胞機構を用いて、それらの間で相同組換えを可能にするために十分である。2つの相同非同一配列は、任意の長さである可能性があり、非相同性の度合いは、1ヌクレオチドほど小さいか(例えば、標的相同組換えによるゲノム点突然変異の補正のため)、または10キロベース以上ほど大きい(例えば、染色体内の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため)可能性がある。相同非同一配列を含む2つのポリヌクレオチドは、同一の長さである必要はない。例えば、20〜10,000ヌクレオチド、またはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド(すなわち、ドナーポリヌクレオチド)を使用することができる。
【0030】
核酸およびアミノ酸配列同一性を判定するための技術は、当該技術分野において知られている典型的には、そのような技術は、遺伝子のためのmRNAのヌクレオチド配列を判定すること、および/または、それによってコードされたアミノ酸配列を判定すること、ならびにそれらの配列を、第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列はまた、この方法で、判定し、比較することができる。一般に、同一性は、それぞれ、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対応する、完全なヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸を指す。2つもしくはそれ以上の配列(ポリヌクレオチドまたはアミノ酸)は、それらの同一性百分率を判定することによって比較することができる。核酸またはアミノ酸であれ、2つの配列の同一性百分率は、より短い配列の長さで割り、100を乗じた、2つの整合配列の間の厳密な合致数である。核酸配列の近似整合は、Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482−489(1981)の局所性相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff,Atlas of Protein Sequence and Structure,M.O.Dayhoff ed.,5 suppl.3:353−358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA、によって開発され、Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745−6763(1986)によって標準化されたスコアリングマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性百分率を判定するためのこのアルゴリズムの例示的実施は、「BestFit」実用用途において、Genetics Computer Group(Madison,WI)によって提供される。この方法のデフォルトパラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual,Version 8(1995)(Genetics Computer Group,Madison,WIから入手可能)に説明されている。本開示に関連して、同一性百分率を確立する好ましい方法は、University of Edinburghが著作権を有し、John F.CollinsおよびShane S.Sturrokによって開発され、IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)から販売される、MPSRCHプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、Smith−Watermanアルゴリズムを使用することができ、デフォルトパラメータは、スコアリング表に使用される(例えば、ギャップオープンペナルティー12、ギャップエクステンションペナルティー1、およびギャップ6)。生成されたデータからの「マッチ」値は、配列同一性を反映する。配列の間の同一性百分率または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、当該技術分野において一般に公知であり、例えば、別の整合プログラムは、デフォルトパラメータとともに使用されるBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを使用して、使用することができる:遺伝コード=標準、フィルター=なし、鎖=両方、カットオフ=60、期待数=10、マトリックス=BLOSUM62、表示=50配列、分類=高スコア、データベース=非重複、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS tranlsations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス:http://www.ncbi.nlm.gov/cgi‐bin/BLASTで確認することができる。本明細書に説明する配列に関して、望ましい配列同一性の度合いの範囲は、約80%〜100%、およびそれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列の間の同一性百分率は、少なくとも70〜75%、好ましくは、80〜82%、より好ましくは、85〜90%、さらに好ましくは、92%、より一層好ましくは、95%、最も好ましくは、98%の配列同一性である。
【0031】
代替的には、ポリヌクレオチドの間の配列類似性の度合いは、相同領域間で安定した二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化された断片の寸法決定によって判定することができる。2つの核酸または2つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して判定されるように、分子の定義された長さにわたって、少なくとも70%〜75%、好ましくは、80%〜82%、より好ましくは、85%〜90%、さらに好ましくは、92%、より一層好ましくは、95%、および最も好ましくは、98%の配列同一性を呈する時に、互いに実質的に相同的である。本明細書に使用するとき、実質的に相同的はまた、特異的DNAまたはポリペプチド配列に完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同的であるDNA配列は、例えば、サザンハイブリダイゼーション実験において、その特定のシステムのために定義される、緊縮条件下で、特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術範囲内である。例えば、Sambrook et al.,supra;Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach,editors B.D.Hames and S.J.Higgins,(1985) Oxford;Washington,DC;IRL Press)を参照されたい。
【0032】
2つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように判定することができる。2つの核酸分子の間の配列同一性の度合いは、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野において周知である、ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、サザン(DNA)ブロット、ノーザン(RNA)ブロット、溶液ハイブリダイゼーション、または同等物、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,(1989) Cold Spring Harbor,N.Y.を参照)を使用して評価することができる。そのようなアッセイは、異なる度合いの選択性を使用して、例えば、低ストリンジェンシーから高いストリンジェンシーまで異なる条件を使用して、実施することができる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合では、非特異性結合の不在は、非特異性結合事象の不在下で二次プローブが標的にハイブリダイズしないようにするように、部分的な配列同一性の度合いさえ持たない二次プローブ(例えば、標的分子との配列同一性が約30%未満であるプローブ)を使用して、評価することができる。
【0033】
ハイブリダイゼーションベースの検出システムを使用する時、参相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、プローブおよび参照配列が二重鎖分子を形成するように、互いに選択的にハイブリダイズする、または結合する。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズする能力を有する核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約70%の配列同一性を有する、少なくとも約10〜14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にするような条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約90〜95%を上回る配列同一性を有する、少なくとも約10〜14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が、特異的な配列同一性の度合いを有する、プローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知のとおり判定することができる(例えば、Nucleic Acid Hybridazation :A Practical Approach,editors B.D.Hames and S.J.Higgins,(1985)Oxford;Washington,DC;IRL Press参照)。
【0034】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う度合いを指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対する許容性の低さに相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、温度、pH、イオン強度、および、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度を含むが、それらに限定されない。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増大する。
【0035】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子:配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬(例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール)の存否、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに洗浄条件を変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために数々の等価条件を使用可能であることは、当該技術分野において周知である。特定の一連のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準方法に従い選択される(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.を参照)。
【0036】
「組換え」は、2つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。この開示に関して、「相同組換え(HR)」は、例えば、細胞内の二本鎖切断の修復中に行われる、そのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子(すなわち、二本鎖切断を経験するもの)のテンプレート修復に「ドナー」分子を使用し、かつ、それがドナーから標的への遺伝子情報の移動をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」としてさまざまな名称で公知である。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、そのような移動は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/または、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される、「合成依存性鎖アニーリング」、および/または関連プロセスを伴う可能性がある。そのような特殊なHRは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが、標的ポリヌクレオチド内に組み込まれるような、標的分子の配列の変化をもたらす。
【0037】
「開裂」は、DNA分子の共有結合主鎖の切断を指す。開裂は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、それらに限定されない、種々の方法によって開始される可能性がある。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が考えられ、二本鎖開裂は、2つの異なる一本鎖開裂事象の結果として生じる可能性がある。DNA開裂は、平滑末端または互い違いの末端のいずれかの産生をもたらす可能性がある。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的二本鎖DNA開裂に使用される。
【0038】
「開裂ハーフドメイン」は、第2のポリペプチド(同一または異なる)と共同して、開裂活性(好ましくは、二本鎖開裂活性)を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第1および第2の開裂ハーフドメイン」、「+および−開裂ハーフドメイン」、および「右および左開裂ハーフドメイン」という用語は、二量体化する開裂ハーフドメインの対を指すために、互換的に使用される。
【0039】
「改変開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン(例えば、別の改変開裂ハーフドメイン)を用いて偏性ヘテロ二量体を形成するように、修飾されている開裂ハーフドメインである。米国特許公開第20050064474号および同20060188987号、ならびに米国仮出願60/808,486号(2006年5月25日出願)もまた参照されたく、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0040】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主に、DNA、ならびにタンパク質(ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む)を含む。真核性細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、それぞれ2つのヒストンH2A、H2B、H3およびH4を含む八量体と会合した約150塩基対のDNAを含み、(有機体によって異なる長さの)リンカーDNAは、ヌクレオソームコアの間に延在する。1分子のヒストンH1は、一般に、リンカーDNAと会合している。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質、原核および真核の両方を含有することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【0041】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部分を含む、クロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含む染色体すべての集合であるその核型を特徴とする。細胞のゲノムは、1つもしくは複数の染色体を含むことができる。
【0042】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例は、プラスミドおよびあるウイルスゲノムを含む。
【0043】
「到達可能領域」は、核酸内に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン内の部位である。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされないものと考えられる。到達可能領域の独自の構造は、それ自体の、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼへの感受性によって、しばしば検出され得る。
【0044】
「標的部位」または「標的配列」は、結合するための十分な条件が存在する時に、結合分子が結合する核酸の一部分を画定する、核酸配列である。例えば、配列5′−GAATTC−3′は、Eco RI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【0045】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、1つもしくは複数の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって、細胞中に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して判定される。したがって、例えば、筋の胚発生中のみに存在する分子は、成体筋細胞については外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘発される分子は、非熱ショック細胞については外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。
【0046】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの等の小分子か、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または1つもしくは複数の上記の分子を含む任意の複合体等の高分子である可能性がある。核酸は、DNAおよびRNAを含み、一本鎖または二本鎖である可能性があり、線状、分岐状、または環状である可能性があり、任意の長さである可能性がある。核酸は、二重鎖を形成することが可能な核酸ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第5,176,996号、および同第5,422,251号を参照されたい。タンパク質は、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼを含むが、それらに限定されない。
【0047】
外因性分子は、内因性分子と同一の種類、例えば、外因性タンパク質または核酸である可能性がある。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞内への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介導入(すなわち、中性および陽イオン性脂肪を含む、リポソーム)、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、DEAE−デキストラン−媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、それらに限定されない。
【0048】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で、特定の発生段階にある特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸含むことができる。付加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
【0049】
「融合」分子は、2つもしくはそれ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同一の化学型分子である可能性がある、または異なる化学型分子である可能性がある。第1の種類の融合分子の例は、融合タンパク質(例えば、ZFP DNA結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合物)および融合核酸(例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸)を含むが、それらに限定されない。第2の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝統合剤と核酸との間の融合物を含むが、それらに限定されない。
【0050】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞内への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって、生じる可能性があり、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質を生成するために、転写され、転写物が翻訳される。トランススプライシングポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションはまた、細胞内のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達の方法については、本開示の他所に提示する。
【0051】
本開示に関して、「遺伝子」は、そのような調節配列がコード配列および/または転写配列に隣接するか否かに関わらず、遺伝子産物(以下を参照)をコードするDNA領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのDNA領域を含む。故に、遺伝子は、プロモータ配列、ターミネータ、翻訳調節配列(リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等)、エンハンサ、サイレンサ、絶縁体、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもそれらに限定されない。
【0052】
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の、遺伝子産物内への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボソーム、構造RNA、または任意の他の種類のRNA)、またはmRNAの翻訳によって産生されるタンパク質である可能性がある。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたRNA、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質を含む。
【0053】
遺伝子発現の「調整」は、遺伝子活性の変化を指す。発現の調整は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、それらに限定されない。
【0054】
「真核性」細胞は、真菌細胞(酵母など)、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞(例えば、T細胞)を含むが、それらに限定されない。
【0055】
「対象領域」は、例えば、その中で外因性分子を結合することが望まれる、遺伝子または遺伝子内の、またはそれに隣接する非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域である。結合の目的は、標的DNA開裂および/または標的組換えである。対象領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム(例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト)、または感染ウイルスゲノム内に存在することができる。対象領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロン等の転写された非コード領域内、またはコード領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内である可能性がある。対象領域は、1ヌクレオチド対ほど小さいか、または最大2,000ヌクレオチド長、またはヌクレオチド対の任意の整数値である可能性がある。
【0056】
「動作的に連結(operative linkage)」および「動作的に連結(operatively linked)」(または「動作可能に連結(operably linked)」という用語は、構成要素が、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも1つが他の構成要素のうちの少なくとも1つの上に発揮される機能を媒介することが可能な状態を許すような形で配置される、2つもしくはそれ以上の構成要素(配列要素等)の並列を指し、互換的に使用される。例証として、プロモータ等の転写調節配列は、転写調節配列が、1つもしくは複数の転写調節因子の存在または不在に応じて、コード配列の転写レベルを制御する場合に、コード配列に動作的に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列で、シスに、直接動作的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサは、それらが連続していなくても、コード配列に動作的に連結される転写調節配列である。
【0057】
融合ポリペプチドに関して言えば、「動作的に連結」という用語は、構成要素のそれぞれが、動作的に連結されていない場合に果たすであろう機能と同一の機能を、他の構成要素に連動して実行するという事実を指すことができる。例えば、ZFP DNA結合ドメインが開裂ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して言えば、ZFP DNA結合ドメインおよび開裂ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ZFP DNA結合ドメイン部分が、その標的部位および/またはその結合部位に結合することが可能であり、開裂ドメインが、標的部位の近傍でDNAを開裂することが可能である場合に、動作的連結状態にある。
【0058】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同数の残基を有することができ、および/または1つもしくは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能(例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力)を判定するための方法は、当該技術において周知である。同様に、タンパク質の機能を判定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度のシフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって判定することができる。DNA開裂は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のAusubel et al.,を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、2ハイブリッドアッセイまたは相補性(遺伝子的または生化学的の両方)によって判定することができる。例えば、Fields et al.(1989)Nature 340:245〜246、米国特許第5,585,245号、およびPCT国際公開第WO98/44350号を参照されたい。
【0059】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび亜鉛フィンガー転写因子
CXCR4遺伝子の発現の不活性化および/または調製のために使用することのできる、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および亜鉛フィンガー転写因子(ZF−TF)を、本明細書に説明する。ZFNは、亜鉛フィンガータンパク質(ZFP)およびヌクレアーゼ(開裂)ドメインを含む。ZF−TFは、亜鉛フィンガータンパク質(ZFP)および機能的な転写制御ドメインを含む。
【0060】
A.亜鉛フィンガータンパク質
亜鉛フィンガー結合ドメインは、選択される配列に結合するように改変することができる。例えば、Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135〜141、Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313〜340、Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656〜660、Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632〜637、Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411〜416を参照されたい。改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有することができる。改変方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、それらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重項(または四重項)ヌクレオチド配列、および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列を結合する、亜鉛フィンガーの1つもしくは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、参照することによってその全体が組み込まれる、共同所有の米国特許第6,453,242号および6,534,261号を参照されたい。
【0061】
ファージ提示法および2ハイブリッドシステムを含む、例示的選択方法は、米国特許第5,789,538号、同第5,925,523号、同第6,007,988号、同第6,013,453号、同第6,410,248号、同第6,140,466号、同第6,200,759号、および同第6,242,568号、ならびに、国際公開第WO98/37186号、同第WO98/53057号、同第WO00/27878号、同第WO01/88197号、および英国特許第2,338,237号に開示されている。
【0062】
亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の向上は、例えば、共同所有の国際公開第02/077227号に説明されている。
【0063】
標的部位の選択、融合タンパク質の設計と構成(およびポリヌクレオチドによるコード)のためのZFPおよび方法は、当業者には公知であり、米国特許第20030232410号、同第20050208489号、同第2005064474号、同第20050026157号、同第20060188987号、国際公開第WO07/014275号、米国特許出願第10/587,723号(2006年7月27日出願)、同第11/493,423号(2006年7月26日出願)に関連して詳細に記載されており、それらの開示は、すべての目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
【0064】
本明細書に説明する亜鉛フィンガータンパク質は、CXCR4遺伝子内の標的部位に結合する。ヒトCXCR4遺伝子内のヌクレオチド配列に結合するために改変された、複数の亜鉛フィンガー結合ドメインを、表1(実施例1参照)に記載する。1列目に、それぞれのドメインのためのDNA標的配列を示し(DNA標的配列を大文字で示し、未接触のヌクレオチドを小文字で示す)、2列目から5列目に、タンパク質内の各亜鉛フィンガー(F1からF4またはF5)の認識領域のアミノ酸配列(ヘリックスの開始に関して、アミノ酸−1から+6)を示す。1列目には、各タンパク質について、認識番号も提供する。
【0065】
下記に説明するように、ある特定の実施形態では、表1に示される4、5フィンガー結合ドメインは、機能ドメインに融合される。機能ドメインは、例えば、活性化ドメイン、または、例えば、FokI等のII型制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメイン等の開裂ハーフドメインである。そのような亜鉛フィンガー/ヌクレアーゼハーフドメイン融合の対は、例えば、米国特許公開第20050064474号(出願番号第10/912,932号)に開示される、標的開裂のために使用される。
【0066】
ZFNを使用する標的開裂では、結合部位の近傍端は、5もしくはそれ以上のヌクレオチド対によって分離することができ、融合タンパク質のそれぞれは、DNA標的の反対側の鎖に結合することができる。
【0067】
本明細書に説明するCXCR4−ZFPは、いずれのCXCR4ゲノム配列中のいずれの配列も標的とすることができる。
【0068】
B.開裂ドメイン
ある実施形態では、ZFPおよびZFNは、ヌクレアーゼ(開裂ドメイン、開裂ハーフドメイン)を含む。本明細書に開示する、融合タンパク質の開裂ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得することができる。開裂ドメインがそこから得ることができる例示的エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、それらに限定されない。例えば、2002−2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA、およびBelfort et al.(1997)Nucleic Acids.Res.25:3379〜3388を参照されたい。DNAを開裂する付加的な酵素は、公知である(例えば、S1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵DNase I、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母菌HOエンドヌクレアーゼ、Linn et al.(eds)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照)。これらの酵素(またはその機能的断片)のうちの1つもしくは複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの源として使用することができる。
【0069】
同様に、上記に説明するように、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体化を必要とする、任意のヌクレアーゼまたはその部分から得ることができる。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合には、2つの融合タンパク質が開裂に必要とされる。代替的には、2つの開裂ハーフドメインを含む、単一のタンパク質を使用することができる。2つの開裂ハーフドメインは、同一のエンドヌクレアーゼ(またはその機能的断片)から得ることができるか、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ(またはその機能的断片)から得ることができる。加えて、2つの融合タンパク質のための標的部位は、それらの各標的部位への2つの融合タンパク質の結合が、互いに対して空間的配向に開裂ハーフドメインを定置し、例えば、二量体化することによって、開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させるように、互いに対して、好ましくは配置される。したがって、ある実施形態では、標的部位の近傍端は、5〜8個のヌクレオチドによって、または15〜18個のヌクレオチドによって分離される。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、2つの標的部位(例えば、2〜50対もしくは複数のヌクレオチド)の間に介入することができる。一般に、開裂部位は、標的部位の間に位置する。
【0070】
制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)は、多くの種に存在し、(認識部位において)DNAへの配列特異性結合、および結合部位において、またはその近傍でDNAの開裂が可能である。ある制限酵素(例えば、IIS型)は、認識部位から除去された部位でDNAを開裂し、別個の結合および開裂ドメインを有する。例えば、IIS型酵素FokIは、一方の鎖上のその認識部位から9番目のヌクレオチド、および他方上のその認識部位から13番目のヌクレオチドにおいて、DNAの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号、同第5,436,150号、および同第5,487,994号、ならびに、Li et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275〜4279、Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764〜2768、 Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883〜887、Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978〜31,982を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、改変されてもよく、または改変されなくてもよい、少なくとも1つのIIS型制限酵素および1つもしくは複数の亜鉛フィンガー結合ドメインからの開裂ドメイン(または開裂ハーフドメイン)を含む。
【0071】
その開裂ドメインが結合ドメインから分離される、例示的IIS型制限酵素は、FokIである。この特定の酵素は、二量体として活性である(Bitinaite et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570〜10,575)。故に、本開示については、開示した融合タンパク質に使用するFokI酵素の部分は、開裂ハーフドメインと見なされる。したがって、亜鉛フィンガーとFokIの融合物を使用する細胞配列の標的二本鎖開裂および/または標的置換では、FokI開裂ハーフドメインをそれぞれ含む2つの融合タンパク質を、触媒的に活性開裂ドメインを再構成するために使用することができる。代替的には、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび2つのFokI開裂ハーフドメインを含む、単一のポリペプチド分子もまた、使用することができる。亜鉛フィンガーとFokIの融合物を使用する標的開裂および標的配列変異のためのパラメータを、本開示の他所において提供する。
【0072】
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、開裂活性を保持する、または機能的開裂ドメインを形成するために多量体化(例えば、二量体化)する能力を保持するタンパク質の任意の部分である可能性がある。
【0073】
例示的IIS型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO07/014275号に説明されている。付加的な制限酵素はまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって検討される。例えば、Robert et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418〜420を参照されたい。
【0074】
ある実施形態では、開裂ドメインは、例えば、米国特許公開第20050064474号、同第20060188987号、同第20080131962号に説明されるように、ホモ二量体化を最小限化する、または防止する1つもしくは複数の改変開裂ハーフドメイン(二量体ドメイン変異体とも称される)を含み、それらのすべての開示は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。FokIの446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、および538位におけるアミノ酸残基はすべて、FokI開裂ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【0075】
偏性ヘテロ二量体を形成するFokIの例示的改変開裂ハーフドメインは、一対(第1の開裂ハーフドメインが、FokIの490および538位でアミノ酸残基において突然変異を含み、第2の開裂ハーフドメインが、486および499位でアミノ酸残基において突然変異を含む)を含む。
【0076】
したがって、ある実施形態では、490における突然変異は、Glu(E)をLys(K)で置換し、538における突然変異は、Iso(I)をLys(K)で置換し、486における突然変異は、Gln(Q)をGlu(E)で置換し、499位における突然変異は、Iso(I)をLys(K)で置換する。具体的には、本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、「E490K:I538K」と指定される改変開裂ハーフドメインを産生するために、1つの開裂ハーフドメイン内の490位(E→K)および538位(I→K)を変異させることによって、および「Q486E:I499L」と指定される改変開裂ハーフドメインを産生するために、別の開裂ハーフドメイン内の486位(Q→E)および499位(I→L)を変異させることによって調製された。一実施形態では、490における突然変異は、Glu(E)をLys(K)で置換し、538における突然変異は、Ile(I)をLys(K)で置換し、537位における突然変異は、His(H)をLys(K)またはArg(R)で置換し、486における突然変異は、Gln(Q)がGlu(E)で置換され、499位における突然変異は、Ile(I)をロイシン(L)で置換し、ならびに496における突然変異は、Asn(N)をAsp(D)またはGlu(E)で置換する。具体的には、本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、「E490K:I538K:H537K」(KKK)または「E490K:I538K:H537R」(KKR)指定の改変開裂ハーフドメインを産生するために、1つの開裂ハーフドメイン内の490位(E→K)、538位(I→K)、ならびに537位(H→KまたはH→R)を変異させることによって、および「Q486E:I499L:N496E」(ELE)または「Q486E:I499L:N496D」(ELD)指定の別の改変開裂ハーフドメインを産生するために、別の開裂ハーフドメイン内の486位(Q→E)、499位(I→L)、ならびに496位(N→DまたはN→E)を変位させることによって調製された。本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小限化されるか、または廃止される、偏性へテロ二量体突然変異体である。例えば、米国特許公開第2008/0131962号の実施例1を参照されたく、その開示は、すべての目的のために参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。また、米国特許仮出願第61/337,769号も参照されたい。また、Szczepek et al.(2007)Nat Biotechnol 25:786−793も参照されたい。
【0077】
本明細書に説明する改変開裂ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公開第20050064474号および同第20080131962号に説明する、野生型開裂ハーフドメイン(FokI)の部位特異的突然変異誘発法によって調製することができる。
【0078】
他の実施形態では、開裂ドメインは、天然に存在する、または改変されたメガヌクレアーゼ開裂ドメインを含む。例えば、適合DNA結合特異性への、ホーミングエンドヌクレアーゼの改変は、説明されており、Chames et al.(2005)Nucleic Acids Res33(20):e178、Arnould et al.(2006)J.Mol.Biol.355:443〜458、およびGrizot et al(2009)Nucleic Acids Res July 7e publicationを参照されたい。さらに、ZFPの改変も説明されている。例えば、米国特許第6,534,261号、同第6,607,882号、同第6,824,978号、同第6,979,539号、同第6,933,113号、同第7,163,824号、および同第7,013,219号を参照されたい。
【0079】
天然に存在するメガヌクレアーゼは、15〜40塩基対の開裂部位を認識し、一般に、LAGLIDADGファミリー、GIY−YIGファミリー、His−Cystボックスファミリー、およびHNHファミリーの、4つのファミリーに分類される。例示的ホーミングエンドヌクレアーゼは、I−SceI、I−CeuI、PI−PspI、PI−Sce、I−SceIV、I−CsmI、I−PanI、I−SceII、I−PpoI、I−SceIII、I−CreI、I−TevI、I−TevII、およびI−TevIIIを含む。それらの認識配列は、公知である。また、米国特許第5,420,032号、米国特許第6,833,252号、Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388、Dujon et al.(1989)Gene 82:115-118、Perler et al.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127、Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228、Gimble et al.(1996)J.Mol.Biol.263:163-180、Argast et al.(1998)J.Mol.Biol.280:345-353、およびNew England Biolabsカタログも参照されたい。
【0080】
主に、LAGLIDADGファミリーの、天然に存在するメガヌクレアーゼからのDNA結合ドメインは、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞、およびマウスの部位特異的ゲノム修飾を促進するために使用されてきたが、この手法は、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子(Monet et al.(1999),Biochem.Biophysics.Res.Common.255:88〜93)、または、認識配列が導入された、あらかじめ改変されたゲノム(Route et al.(1994),Mol.Cell.Biol.14:8096〜106、Chilton et al.(2003),Plant Physiology.133:956〜65、Puchta et al.(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5055〜60、Rong et al.(2002),Genes Dev.16:1568〜81、Gouble et al.(2006),J.Gene Med.8(5):616〜622)のいずれかの修飾に限られている。故に、医学的または生物学的に関連する場において、メガヌクレアーゼを改変して、新規な結合の特異性を呈する試みがなされてきた(Porteus et al.(2005)、Nat.Biotechnol.23:967〜73、Sussman et al.(2004),J.Mol.Biol.342:31〜41、Epinat et al.(2003),Nucleic Acids Res.31: 2952〜62、Chevalier et al.(2002)Molec.Cell10:895〜905、Epinat et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:2952〜2962、Ashworth et al.(2006)Nature 441:656〜659、Paques et al.(2007)Current Gene Therapy 7:49〜66、米国特許公開第20070117128号、同第20060206949号、同第20060153826号、同第20060078552号、および同第20040002092号)。さらに、メガヌクレアーゼからの、天然に存在する、または改変されたDNA結合ドメインはまた、非相同のヌクレアーゼ(例えば、FokI)からの開裂ドメインに、動作可能に結合されている。
【0081】
C.付加的亜鉛フィンガー融合タンパク質
別の実施形態において、本明細書に説明するDNA結合タンパク質(例えば、ZFP)および非相同の調整(機能)ドメイン(または、その機能的断片)を含む融合タンパク質も提供する。共通ドメインは、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、補リプレッサー)、サイレンサ、癌遺伝子(例えば、myc、un、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバー等)、DNA修復酵素およびそれらに関連した因子と修飾因子、クロマチン結合タンパク質およびそれらの修飾因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ)、ならびにDNA修飾酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)およびそれらの関連した因子と修飾因子を含む。DNA結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインの融合についての詳細は、米国特許出願公開第20050064474号、同第0060188987号、および同第2007/0218528号を参照されたく、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0082】
活性化を達成するための好適なドメインは、HSV VP16活性化ドメイン(例えば、Hagmann et al.,J.Virol.71,5952〜5962(1997)参照)、核ホルモン受容体(例えば、Torchia et al.,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373〜383(1998)参照)、核因子カッパBのp65サブユニット(Bitko& Barik,J.Virol.72:5610〜5618(1998)およびDoyle&Hunt,Neuroreport 8:2937〜2942(1997))、Liu et al.,Cancer Gene Ther.5:3〜28(1998))、またはVP64(Beerli et al.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623〜33)等の人工キメラの機能ドメイン、およびデグロン(Molinari et al.,(1999)EMBO J.18,6439〜6447)を含む。付加的な例示的活性化ドメインは、Oct1、Oct−2A、Sp1、AP−2、およびCTF1(Seipel et al.,EMBO J.11,4961〜4968(1992)ならびにp300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A、およびERF−2を含む。例えば、Robyr et al.(2000)Mol.Endocrinol.14:329〜347、Collingwood et al.(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255〜275、Leo et al.(2000)Gene 245:1〜11、Manteuffel−Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77〜89、McKenna et al.(1999)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.69:3〜12、Malik et al.(2000)Trends Biochem.Sci.25:277〜283、およびLemon et al.(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499〜504を参照されたい。付加的な例示的活性化ドメインは、OsGAI、HALF−1、C1、AP1、ARF−5、−6、−7、および−8,CPRF1、CPRF4、MYC−RP/GP、ならびにTRAB1を含むが、それらに限定されない。例えば、Ogawa et al.(2000)Gene 245:21〜29、Okanami et al.(1996)Genes Cells 1:87〜99、Goff et al.(1991)Genes Dev.5:298〜309、Cho et al.(1999)Plant Mol.Biol.40:419〜429、Ulmason et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844〜5849、Sprenger−Haussels et al.(2000)Plant J.22:1〜8、Gong et al.(1999)Plant Mol.Biol.41:33〜44、およびHobo et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348〜15,353を参照されたい。
【0083】
DNA結合ドメイン(ZFP)と機能ドメインとの間の、融合タンパク質(または、上述の融合タンパク質をコードする核酸)の形成では、活性化ドメイン、または活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが、機能ドメインとして好適であることが、当業者には明らかとなるであろう。実質的に、標的遺伝子に、活性化複合体および/または活性化作用(例えば、ヒストンのアセチル化等)を採用することのできる任意の分子は、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。絶縁ドメイン(insulator domain)、局在化ドメイン、ならびに、融合分子の機能ドメインとして使用するのに好適である、ISWI含有ドメインおよび/またはメチル結合ドメインタンパク質等のクロマチン再構築タンパク質は、例えば、共同所有の米国特許出願第2002/0115215号および同第2003/0082552号、ならびに共同所有の国際公開第WO02/44376号に記載されている。
【0084】
例示的な抑制ドメインは、KRAB A/B、KOX、TGFβ誘導初期遺伝子(TIEG)、v−erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMTファミリーのメンバー(例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、およびMeCP2を含むが、それらに限定されない。例えば、Bird et al.(1999)Cell 99:451〜454、Tyler et al.(1999)Cell 99:443〜446、Knoepfler et al.(1999)Cell 99:447〜450、およびRobertson et al.(2000)Nature Genet.25:338〜342を参照されたい。付加的な、例示的な抑制ドメインは、ROM2およびAtHD2Aを含むが、それらに限定されない。例えば、Chem et al.(1996)Plant Cell8:305〜321、およびWu et al.(2000)Plant J.22:19〜27を参照されたい。
【0085】
融合分子は、当業者には周知の、クローン化および生化学的な複合化の方法によって構築される。融合分子は、DNA結合ドメインおよび機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメインまたは抑制ドメイン)を含む。融合分子はまた、核局在化シグナル(例えば、SV40中型T抗原からのもの等)およびエピトープ標識(例えば、FLAGおよび血球凝集素等)を任意に含む場合もある。融合タンパク質(および上述の融合タンパク質をコードする核酸)は、翻訳リーディングフレームが融合物の構成要素の中に保たれるように設計される。
【0086】
一方に、機能ドメイン(または、その機能断片)を含み、かつ他方に、非タンパク質DNA結合ドメイン(例えば、抗生剤、挿入剤、小溝結合剤、核酸)を含むポリペプチド成分の間の融合物は、当業者に知られている生化学的な複合化の方法で構築される。例えば、the Pierce Chemical Company(Rockford,IL)Catalogueを参照されたい。小溝結合剤とポリペプチドとの間の融合物を作製するための方法および組成物は、Mapp et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930〜3935に説明される。
【0087】
ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質に結合される標的部位は、クロマチン細胞の到達可能領域に存在する。到達可能領域は、例えば、共同所有の国際公開第WO01/83732号に記載されているようにして判定することができる。クロマチン細胞の到達可能領域内に標的部位が存在しない場合は、共同所有の国際公開第WO01/83793に記載されているようにして、1つまたは複数の到達可能領域を生成することができる。付加的な実施形態では、融合分子のDNA結合ドメインは、その標的部位が到達可能領域内にあるか否かにかかわらず、クロマチン細胞に結合することができる。例えば、そのようなDNA結合ドメインは、リンカーDNAおよび/またはヌクレオソームDNAに結合することができる。このタイプの「パイオニア(pioneer)」DNA結合ドメインの例は、特定のステロイド受容体内および幹細胞核因子3(HNF3)内に見られる。Cordingley et al.(1987)Cell 48:261〜270、Pina et al.(1990)Cell 60:719〜731、およびCirillo et al.(1998)EMBO J.17:244〜254。
【0088】
融合分子は、当業者には知られているとおり、薬学的に許容されるキャリアで配合することができる。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1985、および共同所有の国際公開第WO00/42219号を参照されたい。
【0089】
融合分子の機能構成要素/ドメインは、融合分子が遺伝子のDNA結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことのできる、任意のさまざまな異なる構成要素から選択することができる。したがって、機能構成要素は、活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、補リプレッサー、およびサイレンサ等の、さまざまな転写因子ドメインを含むが、それらに限定されない。
【0090】
付加的な、例示的機能ドメインは、例えば、共同所有の米国特許第6,534,261号および米国特許出願公開第2002/0160940号に開示されている。
【0091】
外因性小分子またはリガンドによって調節される機能ドメインも、選択することができる。例えば、機能ドメインが、外部RheoChem(登録商標)リガンドの存在下のみ、活性立体配座をとるRheoSwitch(登録商標)技術を採用することができる(例えば、米国特許第20090136465号参照)。そのようにして、ZFPは、調節可能な機能ドメインに動作可能に連結することができ、ZF−TFの、結果として得られる活性は、外部リガンドによって制御される。
【0092】
D.CXCR4の標的修飾のための付加的方法
本明細書に開示する方法では、任意のヌクレアーゼを使用することができる。例えば、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、そのいくつかは、統計的基礎において、ヒトサイズのゲノム内に一度存在する可能性が高い。例示的ホーミングエンドヌクレアーゼは、I−SceI、I−CeuI、PI−PspI、PI−Sce、I−SceIV、I−CsmI、I−PanI、I−SceII、I−PpoI、I−SceIII、I−CreI、I−TevI、I−TevII、およびI−TevIIIを含む。それらの認識配列は、公知である。また、米国特許第5,420,032号、米国特許第6,833,252号、Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379〜3388、Dujon et al.(1989)Gene 82:115〜118、Perler et al.(1994)Nucleic Acids Res.22, 1125〜1127、Jasin(1996)Trends Genet.12:224〜228、Gimble et al.(1996)J.Mol.Biol.263:163〜180、Argast et al.(1998)J.Mol.Biol.280:345〜353、およびthe New England Biolabs catalogueも参照されたい。
【0093】
ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は、天然に存在しない標的部位に結合するように改変することができることも報告されている。例えば、Chevalier et al.(2002)Molec.Cell 10:895〜905、Epinat et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:2952〜2962、Ashworth et al.(2006)Nature 441:656〜659、Paques et al.(2007)Current Gene Therapy 7:49〜66を参照されたい。
【0094】
いくつかの実施形態では、DNA結合ドメインは、植物病原菌のキサントモナスから得られるTALエフェクタからの改変ドメインである(Boch et al,Science.2009 Dec 11;326(5959):1509〜12.およびMoscou and Bogdanove,Science.2009 Dec 11;326(5959):1501を参照)。
【0095】
したがって、一意の標的部位を有する、任意の、天然に存在するヌクレアーゼまたは改変ヌクレアーゼは、系統特異的レポーターを肝細胞内へ、等の配列の標的組み込みのための亜鉛フィンガーヌクレアーゼの代わりとして、または、亜鉛フィンガーヌクレアーゼに追加して使用することができる。さらに、これらの天然に存在するヌクレアーゼまたは改変ヌクレアーゼのドメインは、単離してさまざまな組み合わせで使用することもできる。例えば、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼ、天然に存在するメガヌクレアーゼ、改変ホーミングエンドヌクレアーゼ、または改変メガヌクレアーゼからのDNA結合ドメインは、非相同の開裂ドメインまたはハーフドメイン(例えば、別のホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはIIS型エンドヌクレアーゼからの)に融合することができる。これらの融合タンパク質は、上述の亜鉛フィンガーヌクレアーゼとの組み合わせで使用することもできる。
【0096】
送達
本明細書に説明するZFNは、任意の好適な手段によって、CXCR4遺伝子を含む標的細胞に送達することができる。亜鉛フィンガーを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第6,453,242号、同第6,503,717号、同第6,534,261号、同第6,599,692号、同第6,607,882号、同第6,689,558号、同第6,824,978号、同第6,933,113号、同第6,979,539号、同第7,013,219号、および同第7,163,824号に記載されており、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0097】
本明細書に説明するZFNはまた、1つまたは複数のZFNをコードする配列を含むベクターを使用して送達することもできる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、それらに限定されない、任意のベクター系を使用することができる。また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,534,261号、同第6,607,882号、同第6,824,978号、同第6,933,113号、同第6,979,539号、同第7,013,219号、および同第7,163,824号も参照されたい。
【0098】
ある特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。本出願で使用することのできる、Adベクターの非制限的な例は、組換え(E1欠失等)、選択的に増殖する成分(腫瘍溶解性等)および/またはヒトもしくはヒト以外の血清型由来の増殖コンピテントAdベクター(例えば、Ad5、Ad11、Ad35、または豚アデノウイルス−3)、および/またはキメラAdベクター(Ad5/F35等)もしくは改変ファイバー(ノブまたはシャフト等)タンパク質の指向性変異Adベクター(ノブタンパク質のHIループ内へのペプチド挿入)を含む。同様に有用なのは、免疫原性を低減し、かつDNAペイロードの大きさを増大させるために、すべてのアデノウイルス遺伝子が除去された「ガッドレス(gutless)」Adベクターである。これは、例えば、ZFNおよびドナー配列をコードする配列を同時に送達することを可能にする。そのようなガットレスベクターは、ドナー配列が標的組み込みを介して組み込まれる大きなトランス遺伝子を含む場合に、特に有用である。
【0099】
複製欠損組換えアデノウイルス(Ad)は、高力価で産生し得、これらは、多数の異なる細胞型に容易に感染する。大半のアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子がAd E1a、E1b、および/またはE3遺伝子を置換するように改変され、次いで、複製欠損ベクターは、1つまたは複数の除去された遺伝子機能をトランス内にもたらす細胞内で増殖する。例えば、ヒト293細胞は、E1機能を供給する。Adベクターは、肝臓内、腎臓内、および筋肉内に見られるような、分化した非分裂細胞を含む、インビボの複数の種類の組織を形質導入することができる。従来のAdベクターは、高い運搬能力を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療に関連した(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083〜1089(1998))。
【0100】
臨床試験における遺伝子導入のための、アデノウイルスベクターの使用の付加的な例は、Rosenecker et al.,Infection 24:1 5〜10(1996)、Welsh et al.,Hum.Gene Ther.2:205〜18(1995)、Alvarez et al.,Hum.Gene Ther.5:597〜613(1997)、Topf et al.,Gene Ther.5:507〜513(1998)を含む。
【0101】
ある特定の実施形態では、Adベクターは、2つ以上の異なるアデノウイルスゲノムからの配列を含む、キメラアデノウイルスベクターである。例えば、Adベクターは、Ad5/F35ベクターである可能性がある。Ad5/F35は、Ad5の1つまたは複数のファイバータンパク質(ノブ、シャフト、テール、ペントン)を、例えば、Ad35等のBグループアデノウイルスからの、対応するファイバータンパク質に置換することによって作製される。Ad5/F35ベクターおよびこのベクターの特性は、例えば、Ni et al.(2005)Hum Gene Ther 16:664〜677、Nilsson et al.(2004)Mol Ther 9:377〜388、Nilsson et al.(2004)J Gene Med 6:631〜641、Schroers et al.(2004)Exp Hematol 32:536〜546、Seshidhar et al.(2003)Virology 311:384〜393、Shayakhmetov et al.(2000)J Virol 74:2567〜2583、およびSova et al.(2004),Mol Ther 9:496〜509に説明されている。
【0102】
上記に記載するように、ZFNおよびこれらのZFNをコードするポリヌクレオチドは、任意の標的細胞に送達することができる。一般に、遺伝子の不活性化のための細胞は、例えば、リンパ球(B細胞、ヘルパーT細胞(TH)ならびに細胞傷害性T細胞(TC)等のT細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞等のヌル細胞)、単核細胞(単球、マクロファージ)、顆粒球細胞(顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球)、マスト細胞、および/または樹枝状細胞(ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、指状嵌入樹状細胞、環状樹状細胞)である。マクロファージ、Bリンパ球、および樹枝状細胞は、TH細胞活性に関与する例示的な抗原提示細胞である。ある特定の実施形態では、標的細胞はTH細胞であり、表面上のCD4の発現を特徴とする。標的細胞は、任意の免疫細胞を生じさせ得る、造血幹細胞であってもよい。
【0103】
用途
開示した方法および組成物は、CXCR4ゲノム配列の不活性化のために使用することができる。上記に記載するように、不活性化は細胞内でのCXCR4遺伝子発現の、部分的または完全な抑制を含む。CXCR4遺伝子の不活性化は、例えば、単一の開裂事象によって、開裂後の非相同末端連結によって、2つの開裂部位の間の配列を削除するように、2つの部位における開裂後の連結によって、コード領域内へのミスセンスまたはノンセンスコドンの標的組換えによって遺伝子または調節領域を妨害するように、遺伝子またはその調整領域内への不適切な配列(すなわち、「スタッファー」配列)の標的組換えによって、または、転写物のミススプライシングをもたらすために、イントロン内へのスプライス受容体配列の標的組換えによって、達成することができる。
【0104】
CXCR4のZFN媒介不活性化(ノックアウトまたはノックダウン)には、さまざまな用途がある。例えば、本明細書に説明する方法および組成物は、細胞株(治療上の使用または治療以外の使用のための)の生成および/または修飾を可能にする。通常、ヒト細胞の表面上に発現するCXCR4遺伝子をノックアウトする能力は、共受容体機能およびHIV相互作用の研究のための機会を提供する。さらに、将来の研究は、免疫不全マウスでの研究において、主T細胞機能におけるCXCR4遺伝子ノックアウトの結果、および、インビボのHIV−1感染に対する感受性を評価できるようになった。また、本明細書に記載する方法および組成物は、宿主のHIV感染症の治療および/または予防のために使用することができる(例えば、CXCR4の発現をブロックすることによって、それにより、宿主生物内における感染症および/または蔓延を予防する)。例えば、HIV感染症の治療および/または予防のために、本発明のCXCR4特異的ZFNにCCR5特異的ZFNを供給して、CXCR4およびCCR5HIV共受容体の両方の発現を同時に遮断する方法および組成物も、本発明によって構想される。これらの一連のZFNは、個別に供給し得、または1つの送達媒体内に組み込まれてもよい。CXCR4特異的ZFNおよびCCR5特異的ZFNは、同時に、または個別に供給することができる。さらに、CXCR4は、腫瘍学および転移過程にも関係があるとされている(例えば、Vandercappellen et al,Cancer Lett.2008 Aug 28;267(2):226〜44を参照)。したがって、本明細書に記載する方法および組成物は、癌および癌に関連した転移の治療においても有用である可能性がある。
【0105】
CXCR4は、骨髄内に、造血幹細胞を保持する役割を有することもでき、CXCR4の遮断は、末梢での幹細胞動員の増加に導き得ることが示されている(Flomenberg et al,Acta Haematol.2005;114(4):198〜205を参照)。したがって、本発明の方法(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたは阻害転写因子を含む融合タンパク質)は、幹細胞の、血流内に動員する能力を増加させて、体の末梢での組織損傷を修復するために使用することができる。さらに、CXCR4軸の遮断は、骨髄移植後に前駆細胞および成熟骨髄細胞が放出される速度を増加し得ることが示されており(Abraham et al,Leukemia.2009 Aug;23(8):1378〜88を参照)、本発明の方法もまた同様に、亜鉛フィンガータンパク質を使用してCXCR4の発現を調整することによって、骨髄移植の成功を増加するために使用することができる。また、本発明の方法(例えば、亜鉛フィンガー刺激転写因子を含む融合タンパク質)を使用する、CXCR4発現の一過性のアップレギュレーションは、幹細胞の、骨髄へのホーミングを生じさせるために使用することができ、骨髄移植の初期の生着を向上させ得る。
【0106】
本明細書に言及したすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0107】
より明確な理解を目的として、例証および実施例によって開示を一部詳細に提供するが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正を実施することができることは、当業者には明らかであろう。故に、前述の説明および以下の実施例は、制限するものと解釈されてはならない。
【実施例1】
【0108】
CXCR4標的ZFNの調製
ヒト第2染色体に位置するCXCR4遺伝子は、2つのスプライス変異をコードする、2つのエクソン、アイソフォームaおよびアイソフォームbを有する。CXCR4は、主にアイソフォームbとして細胞上に発現する。CXCR4遺伝子のエクソン1の長さが、わずか15bpであるため、CXCR4のエクソン2を標的としたZFNを、実質的に、Urnov et al.(2005)Nature 435(7042):646〜651、Perez et al(2008)Nature Biotechnology 26(7):808〜816、および米国特許公開第2008/0131962号に説明されるように設計し、プラスミド内またはアデノウイルスベクター内に組み込んだ。
【0109】
代表的なCXCR4亜鉛フィンガー設計のための認識ヘリックスを、以下の表1に示す。例示的ZFNは、例えば、ヒト第2染色体のCXCR4対立遺伝子のプロリン−191である、ヒトCXCR4遺伝子のエクソン2を標的とした。CXCR4亜鉛フィンガー設計の標的部位を1列目に示す。ZFP認識ヘリックスによって接触させられる標的部位内のヌクレオチドを大文字で示し、未接触のヌクレオチドを小文字で示す。各ZFNのための主結合部位のDNA配列、ならびに各ZFNの認識ヘリックス配列を示す図1A〜Cも参照されたい。
【0110】
【表1】

【0111】
K562細胞は、GFP、または、示される2A−ZFNコンストラクトのいずれかに、Amaxa nucleofector(Lonza)を用いて野生型FokIをトランスフェクトして、3日間培養した。次いで、細胞をゲノムDNA調製のために収集し、修飾されたCXCR4対立遺伝子(プール内に存在するNHEJの量によって判定される)および10%TBEポリアクリルアミドゲルで分析された産物の百分率を測定するためにsurveyorヌクレアーゼアッセイにかけた。3対のZFN(野生型FokIをもつ2A−ZFN)のすべてが、相対的に高効率で(>20%NHEJ)ヒトCXCR4遺伝子を修飾することができる(図1D)。
【実施例2】
【0112】
CXCR4のZFN媒介修飾
実施例1に説明する、CXCR4を標的とする改変された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、新規なCXCR4-SupT1細胞株(SupX4-)を生成するために使用された。上記に記載するように、ZFNは、ヒトリンパ球内のCCR5を含む、哺乳類細胞の内因性遺伝子を安定的に破壊して、R5HIV−1単離体による感染に抵抗性である状態にするために使用される(Miller et al.(2007)Nat.Biotechnol.25:778〜785、Perez et al.(2008)Nat.Biotechnol.26:808〜816および米国特許公開第20080131962号)。
【0113】
CXCR4標的ZFNの対(12273/12270対、改変されたFokI開裂ハーフドメインをもつ2A−ZFN)をコードするコンストラクトを、Sup−T1内に電気穿孔して2週間培養した。表面のCXCR4発現を伴わずに細胞を濃縮するために、最初に抗CXCR4mAb(12G5)を用いて培養して、洗浄し、その後、CELLection Pan mouse IgG kit(Invitrogen)に含まれる磁気ビーズと抱合したヤギ抗マウスIgGを用いて培養し、次いで磁場を通した。濃縮されたCXCR4Sup−T1プールは、RPMI完全培地に維持し、細胞の一部分は、後のゲノムDNA調製のために採取した。ゲノムDNAを、例えば、米国特許公開第20080015164号、同第20080131962号、および同第20080159996号に説明されるように、Surveyor(登録商標)ヌクレアーゼにかけると、プールはCXCR4対立遺伝子内の34.6%の破壊を示した(図2A)。
【0114】
次いで、濃縮されたCXCR4Sup−T1プールを、限界希釈法による単一細胞由来のクローンの生成に使用した。PCRに基づいたスクリーニングを用いて、いくつかの単一細胞由来クローンがCXCR4ノックアウト細胞株であると特定され、後にフローサイトメトリー分析によって、CXCR4表面発現の欠如が確認された。フローサイトメトリーは、次のように実施した。最初に細胞を、望ましい抗体を用いて培養して、洗浄し、次いでフローサイトメトリー分析の前にRフィコエリスリン(PE)結合抗マウスIgGで培養した。
【0115】
下の表2に示されるように、CXCR4 ZFN修飾されたクローンは、CXCR4細胞表面発現が除去されたSup−T1すなわち親系統と同様のプロフィールを示した。X4細胞外ループ2(ECL2)に対する抗体すなわち12G5、またはX4アミノ末端基(NT)抗体すなわち4G10のいずれも反応性を示さない。
【0116】
【表2】

【0117】
このように、A66、B4、およびB13で示すSupT1単一細胞由来のクローンは、CXCR4の細胞表面発現の欠如に基づいて、CXCR4(−)であると特定された。
【0118】
さらに、PCR増幅およびゲノムDNAの配列決定によって判定されるように、得られた細胞(クローン)は、図2Bおよび下の表3に示されるように、すべてのCXCR4対立遺伝子がNHIJによって破壊されたことが確認された。示されるように、クローンA66のうち一方の対立遺伝子は7bpの欠失および2bpの挿入(正味5bpの欠失)を有し、他方の対立遺伝子は8bpの欠失を有する。クローンB4のうち一方の対立遺伝子は12bpの欠失を有し、他方の対立遺伝子は19bpの欠失を有する。B13クローンは、異なる種類の配列、9bpの欠失、29bpの欠失、および54bpの欠失を有する。
【0119】
【表3】

【0120】
それぞれのクローンの遺伝子型に基づく、SupT1細胞/クローン上に発現したCXCR4の予測アミノ酸配列を下に示す(野生型からの変化は太字で示す)。
【0121】
【表4−1】

【表4−2】

【0122】
SupT1細胞の染色体の数は4本であるが、一般には、第2および第9染色体コピーの2本のみを有する。したがって、クローンB13における3つの異なる配列の存在は、クローンB13が3つのCXCR4対立遺伝子を有するか、クローンB13が混合クローンであるかのいずれかであることを示唆する。いずれの場合においても、CXCR4表面染色および配列分析の両方が、クローンB13はCXCR4ノックアウトクローンであることを示した。
【実施例3】
【0123】
CXCR4のZFN媒介修飾は、CXCR4指向性および二重指向性HIV株の感染を予防する
ウイルス攻撃に対する反応を評価するために、SupT1、B13、およびA66を1.0×106細胞/mlで播種し、1,500rpmで1時間スピン感染させた。HIV−1逆転写酵素(RT)活性を測定するために、3週間にわたって細胞培養上清を収集した。
【0124】
図3A〜3Cに示すように、CCR5/CXCR4(R5/X4)二重向性ウイルスHIV−1のR3AおよびSF2は、親SupT1細胞を生産的に感染させることができたが、SupT1のクローンB13またはA66を感染させることはできなかった(図3Aおよび3B)。SupT1細胞は、通常CCR5を発現しないため、CCR5を利用して侵入するR5指向性HIV株またはR5/X4指向性ウイルスの影響を受けにくい。図3Cは、厳密にX4指向性HIV−1のBK132ウイルスのための、同じ選択性を示す。
【0125】
したがって、B13クローンおよびA66クローンにおけるCXCR4遺伝子のZFN破壊は、CXCR4指向性ウイルス感染に対して抵抗性を有する状態にする。
【0126】
さらに、上記のフローサイトメトリー分析が示すように(表2)、クローンA66およびクローンB13のHIV−1感染症に対する抵抗性は、内因性CXCR4遺伝子のZFN媒介修飾によるものである。表2に示すように、クローンA66およびクローンB13の、CD4およびHLAクラスIの細胞表面発現を調べたところ、クローンA66およびクローンB13において、わずかに高いレベルのCD4およびHLA発現が検出された。これは、クローンA66およびクローンB13の、HIV−1感染症に対する抵抗性は、これらの細胞上のCD4およびHLAクラスI発現に関係しないことを示す。
【0127】
Richardson et al.(2008)J.Virol.82:11117〜11128)にすでに記載されるように生成したCXCR4またはCCR5含有pELNS複製欠如レンチウイルスベクターで、クローンB13およびクローンA66を形質導入することによって、HIV−1感染症に対するSup1クローンの抵抗性がCXCR4遺伝子座でのZFN媒介ゲノム修飾によるものだという、さらなる確認が得られた。これらの形質導入された細胞集団を、安定した細胞株を生成するために使用し、次いで、これらの細胞の、HIV−1感染症に対する感受性が復元され得るか否かを検証するためにHIV−1で攻撃した。示される抗体で細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して分析した。表5に示されるように、示される数字は、状態ごとの平均蛍光強度(MFI)である。
【0128】
【表5】

【0129】
このように、CCR5発現ベクターを用いる形質導入は、B13細胞株およびA66細胞株の表面にCCR5の発現を生じさせ得る(B13R5およびA66R5のそれぞれを参照)。
【0130】
さらに、CCR5を安定的に発現させるSupT1(SupT1−R5)、B13、B13−X4は、1×106細胞/mlで播種し、1,500rpmで、R5/X4二重指向性HIV−1株R3Aに1時間スピン感染させた。培地におけるHIV−1逆転写酵素(RT)活性の度合いを測定することによって、培養中のHIV−1複製の相対量を測定するために、3週間にわたって細胞培養上清を収集した。
【0131】
図4に示されるように、二重指向性(R5/X4)HIV−1のR3Aは、両方のB13トランスフェクタント上にCXCR4(B13−X4)またはCCR5(B13−R5)のいずれかを安定的に発現させたが、親B13クローンには発現しなかった。したがって、ウイルス複製の不在は、もっぱら細胞表面上のCXCR4の不在によるものであって、SupT1のB13クローン内の一般的欠損によるものではない。
【実施例4】
【0132】
主T細胞のCXCR4特異的修飾
CXCR4特異的ZFNが、主T細胞にも同様の保護効果を有するか否かを調査するために、以下の実験がなされた。
【0133】
University of PennsylvaniaのHuman Immunology Coreから、ヒトドナーからの新鮮CD4+T細胞を得た。2,500万個のCD4+T細胞を、10%のウシ胎仔血清、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、および100U/mlのインターロイキン−2を含むRPMIに0.8×106の密度で播種した。細胞を、抗CD3/抗CD28で被覆した磁気ビーズ(例えば、Dynal)を用いて、ビーズと細胞の比率3:1で刺激した。刺激から約18時間後、実施例2に記載するようにCXCR4特異的ZFN対を、またはCCR5特異的ZFN対を(米国特許公開第20080159996号を参照)、それぞれコードするAd5/F35ベクターを用いて、感染多重度(moi)600で、細胞を形質導入させた。対照として、未形質導入の培養物は、終始維持された。
【0134】
刺激から72時間後に開始して、48時間ごとに、細胞の数をCoulter Counter Multisizer3 を用いて数え、100U/mlのIL−2を含む新鮮な培地で0.8×106に分割した。CXCR4−ZFN処理プールをSurveyor(登録商標)ヌクレアーゼアッセイで、例えば、米国特許公開第20080015164号、同第20080131962号、および同第20080159996号に記載されるように分析した。得られたデータを図5に提示する(模擬感染サンプル)。これらのデータは、CXCR4特異的ZFNがCXCR4遺伝子座を、40パーセント超の効率で明確に修飾し得たのに対して、予測通り、CCR5特異的ZFNで処理された細胞は、CXCR4遺伝子座における修飾を見せなかったことを示す。
【0135】
刺激から5日後、3つの培養物(NTD、AdX4−ZFN、およびAdR5−ZFN)のそれぞれから、抗CD3/抗CD28被覆磁気ビーズを除去し、2,500万個の細胞を4つの培地のそれぞれに播種し、次いでこれらの培地に種々のHIV株を感染させた。使用した株は、それぞれBk132(主CXCR4指向性単離株)、HxB2(実験室適合(lab−adapted)CXCR4指向性単離株)、およびR3A(CCR5/CXCR4二重指向性単離株)である。また、模擬感染培養も維持された。100万個の細胞につき、100ng p24のHIVの投与量を使用した。データを図6に提示する。このデータは、CXCR4指向性HIV株が、CXCR4特異的ZFNで処理された細胞に対して非致命的であることを顕著に表す。培養物を追加の15日間監視し、合計で30日間監視した。これらのデータを図7に提示する。
【0136】
異なるHIV株での感染から8日後、細胞を採取し、FACSによってCXCR4の発現を分析した。簡潔に、1500rpmで5分間の遠心分離によって細胞を採取して、FACSバッファー(FB:1LのPBS、25mLのFCS(GIBCO)、2mLの0.5M EDTA)で洗浄した。次いで細胞を、100万個の細胞につき、100uLのFB中で、5uLの抗CXCR4−APCモノクローナル抗体(Becton Dickinson)を使用して、室温で20分間染色した。細胞をFBで洗浄し、次いで、100uLのCaltag A(登録商標)(Invitrogen)を用いて、室温で透過処理した。細胞をFBで再度洗浄した。次いで細胞を、100uLのCaltag B(登録商標)中で、2uL/100万個の細胞のKC57−RD1(Beckman Coulter)を用いて、室温でHIV Gagで30分間染色した。細胞を洗浄し、250uLのFB内で再懸濁した。すべてのサンプルにLSRII(BD)を行い、FlowJo 8.0.1ソフトウェアで分析した。CXCR4特異的ZFNで処理された細胞は、CXCR4指向性HIV株に対してかなりの耐性があった。さらに、CXCR4特異的ZFN修飾細胞の強化(生存率および/または増殖の増加)は、BK132およびR3Aを感染させたAd−X4ZFN処理サンプルにおいて、図5に示されるように、未感染の対照サンプル(模擬)と比較すると、これらのサンプル内のNHEJによって修飾されたCXCR4対立遺伝子の頻度の百分率がさらに高いことに基づいて、すでに顕著であった。
【0137】
さらに、これらの細胞について、HIV暴露の存在下または不在下で、454の大規模シーケンスによる分析をした。ゲノムDNAを、QIAamp DNA MicroKit(Qiagen)を使用して、CD4+T細胞から単離した。次いで、それぞれの条件のために、Platinum Taq High Fidelity(Invitrogen)を使用して、200ngのゲノムDNAをPCR増幅した。次のプライマーに454アダプター配列および8文字のDNAバーコードを足したものを使用した。CAACCTCTACAGCAGTGTCCTCATC(順方向)(配列番号36)およびGGAGTGTGACAGCTTGGAGATG(逆方向)(配列番号*37)95℃で5分、次いで、95℃で30秒を30サイクル、55℃で3秒、68℃で30秒、続いて、68℃で2分。
【0138】
PCR増幅に続いて、PCRの産生物を2%のアガロースゲルで分析し、次いで抽出して、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System (Promega)を使用してゲル精製した。次いで、Quant−iT dsDNA High−Sensitivity Assay Kit(Invitrogen)を使用して、それぞれのバーコード化されたアンプリコンの濃度を測定した。次いで、DNAサンプルは等モル比でプールさせ、University of PennsylvaniaのDNA Sequencing Facilityで、標準的な化学を用いてRoche/454 GS FLX DNAにかけた。得られた結果を、最初に配列リードをバーコードによって分離し、次いでそれぞれの配列リードを、期待される野生型ゲノム配列に整合することによって分析した。ZFN誘発NHEJ事象と一致する挿入または欠失は、自動的にフラグが付けられ、手動の検査で確認された。
【0139】
図8に示されるように、HIV暴露(図8では「模擬」と表示される)の不在下では、破壊CXCR4対立遺伝子の百分率は、経時的に安定している。それに対して、天然CXCR4指向性HIV株(Bk132)または、実験室適合CXCR4指向性HIV株(HxB)のいずれかの存在下では、集団におけるCXCR4遺伝子破壊の割合は増加しており、これは恐らく、CXCR4の破壊によって、X4指向性ウイルスがこれらの細胞に感染するのを阻害して、CXCR4特異的ZFNによって修飾された細胞集団に延命効果をもたらすためである。
【0140】
また、CXCR4特異的ZFNまたはCCR5特異的ZFNのそれぞれで処理された後の培養物における、経時的に存在するウイルス量も判定するために、これらの主T細胞を分析した。University of PennsylvaniaのHuman Immunology Coreから、生きているヒトドナーからの、負の選択によって精製した新鮮CD4+T細胞を得た。2,500万個のCD4+T細胞を、10%のウシ胎仔血清、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、および100U/mlのインターロイキン−2を含むRPMIに0.8×106の密度で播種した。細胞を、抗CD3/抗CD28で被覆した磁気ビーズを用いて、ビーズと細胞の比率3:1で刺激した。
【0141】
刺激から約18時間後、上記の実施例4に記載するようにCXCR4−ZFNまたはR5−ZFNのそれぞれをコードするAd5/F35ベクターを用いて、感染多重度(moi)600で、細胞を形質導入させた。未形質導入の培養物は、終始維持された。刺激から72時間後に開始して、48時間ごとに、細胞の数を自動血球計(Countess、Invitrogen)上でトリパンブルー色素排除試験法を用いて数え、100U/mLのIL−2を含む新鮮な培地で0.8×106に分割した。
【0142】
刺激から5日後、3つの培養物(NTD、AdX4−ZFN、およびAdR5−ZFN)のそれぞれから、抗CD3/抗CD28被覆磁気ビーズを除去し、2,500万個の細胞を4つの培地のそれぞれに播種し、次いでこれらの培地にBk132(主X4単離株)、HxB2(実験室適合X4単離株)、R3A(R5/X4主単離株)を感染させ、または、培養液のみとした(模擬)。100万個の細胞につき、100ng p24のHIVの投与量を使用した。その後、細胞を、増殖が停滞するまで増大させ、次いで抗CD3/抗CD28ビーズで追加の3日間再刺激した。次いで、培養物は再度増殖が停滞するまで、最初の刺激後およそ26日間維持された。
【0143】
それぞれの培養物について、HIV感染後約2日おきに逆転写酵素活性を測定した。それぞれの細胞培養の1.25mLのアリコットを、滅菌FACS管内で、1500rpmで5分間スピンさせた。次いで、1mLの無細胞の上清を1.5mL超遠心分離機管に移し、45,000rpmで、30分間、4度でペレット状にした。上清を吸引して、ウイルスペレットを50uLの0.25Mのトリス、pH8.0で再懸濁した。50uLの可溶化バッファー(0.8MのNaCl、0.5%のTriton X−100、20%のグリセロール、0.05Mのトリス、pH7.9、1mMのDTT)を加え、次いで10分間培養した。20uLを2つのガラス管のそれぞれに分割し、79.2uLのRTカクテル(67.5mMのトリス、pH7.5、1.35mMのDTT、1.08mMのATP、13.5mMのMgCl2)、5uLのポリr(A)(10単位/mL)、0.3uLの3HdTTP(1mCi)、および0.125uLのcold dTTPを、それぞれの管に加えた。次いで、37度でゆっくりと震盪して1時間培養した。管を氷の上に置き、20uLのtRNA(11.3mg/mL)および2mLのピロリン酸塩を用いるcold 10%TCAを加えた。次いで、それぞれのサンプルを、真空マニホールドを通してガラスフィルターに注いだ。その後フィルターを、5%のTCで3回洗浄し、100%のエタノールで1回洗浄した。次いでフィルターを、シンチレーションバイアル内に3mLのシンチレーションカクテルと共に入れた。シンチレーションカウンターで活性を測定した。次いで、逆転写酵素活性を、それぞれの時点で生細胞数へと正常化させた。
【0144】
図9に示されるように、CXCR4特異的ZFNで処理され(図9、「X4ZFN」を参照)、かつ天然CXCR4指向性HIV(Bk132)もしくは実験室適合CXCR4指向性HIV株(HxB)にさらされた主T細胞は、CCR5特異的ZFNで処理された細胞または模擬感染細胞と比較して、少ない数のウイルス量を有した。
【実施例5】
【0145】
ヒトCD4+T細胞を移植したマウスのインビボの攻撃
インビボでの、CXCR4指向性HIV株に対する、ZFN処理されたT細胞の抵抗性を測定するために、ヒトCD4+T細胞をNSGマウスに移植した。2,500万個のヒトCD4+T細胞を上記に説明するように刺激し、次いでAdR5−ZFNまたはAdX4−ZFNを用いて(実施例4に説明するように)感染多重度(moi)600で、形質導入させた。細胞を、インビトロでの増殖の10日間にわたって、上記に説明するように維持した。注入の当日、細胞を1500rpmで5分間ペレット状にして、次いでPBS中10^8細胞/mLで再懸濁した。
【0146】
次いで、100uLの細胞(マウスごとに106)を、尾静脈を介してそれぞれのNSGマウスに注入した。23匹のマウスがX4−ZFN処理細胞の注入を受け、22匹のマウスがR5−ZFN細胞の注入を受けた。注入後27日目に、診断的眼窩採血(retroorbital bleeds)を、それぞれのマウスに実施した。次いで、CD4の総数を判定するために、全血の50uLをTrucount tube(BD)内で、2.5uLの抗CD45 FITC(BD)、0.5uLの抗CD3 Qdot655(Invitrogen)、2.5uLの抗CD4 alexa fluor 700(BD)、1uLの抗CD8 pacific blue(Biolegend)、および5uLの抗CXCR4 PE(BD)で、室温で20分間染色した。次いで赤血球を溶解して、サンプルを1x FACS溶解溶液(BD)で固着させた。次いで細胞を、LSRIIフローサイトメーターにかけた。次いでデータを、FlowJo 8.0.1ソフトウェアで分析した。CXCR4通門を、ヒト全血上の1対照除外蛍光(Fluorescence minus one control)を用いて判定した。次いで、生着およびCXCR4発現を集団間で比較するために、独立スチューデントのt検定を実施した。すべての統計的分析に、プリズムを使用した(GraphPad Software,Inc.)。
【0147】
図10に示されるように、移植後27日目の測定において、それぞれ、CXCR4特異的ZFN、またはCCR5特異的ZFNで処理された細胞の生着に差異はなかった(図10Aを参照)。さらに、生着した細胞における、CXCR4発現の度合いをFACS分析(上記に説明される)によって測定し、予測通り、CXCR4特異的ZFNで処理された細胞を受け取ったマウスにおけるCXCR4発現の量は、より少なかった(図10B)。
【0148】
マウスにHIV感染させるために、105の自己HIV感染CD4+T細胞を、総体積が100uLである、それぞれのマウスの尾静脈内に注入した。細胞は、予め抗CD3/抗CD28ビーズを用いて5日間刺激し、次いで4日間にわたって100万個につき100ng p24 Bk132でHIV感染、または模擬感染させた。あるいは、HIV感染させたPBMCをマウスに注入することによって、マウス内にHIV感染症を起こさせた。HIV感染の4日後に、細胞を凍結させ、注入の4時間前に解凍するまで、液体窒素内に保存した。R5−ZFNおよびX4−ZFNの両方の群について、11匹のマウスはHIV感染された細胞を受け、11匹のマウスは模擬感染された細胞を受けた。注目すべきことに、X4−ZFN修飾された細胞を注入された1匹のマウスは、生着>平均からの4標準偏差を有し、したがって実験のHIV攻撃の段階に含まれなかった。
【0149】
HIV感染後、診断的採血を7日おきに導入して、CD4数、ウイルス量、およびCXCR4発現を分析した。脾臓組織および骨髄組織を、CXCR4の分析のために採取した。さらに、CXCR4遺伝子修飾の百分率は、Surveyor(登録商標)アッセイを上記に説明するように使用して、Cel−1分析によって分析され、予備データは下の表6に提示する。表内の、数匹のマウスにおいて見られるように、HIV感染症の存在は、組織内におけるCXCR4修飾の百分率の増加をもたらし得る(例えば、マウス6073をマウス6069と比較されたい)。
【0150】
【表6】

【0151】
要するに、すべてのZFN修飾された細胞株におけるCXCR4の配列決定は、フレームシフト、未完熟終了、およびアミノ酸突然変異をもたらす、種々の欠失または挿入を特徴とする、ZFN標的部位でのDNAの破壊を明示した。対照SupT1細胞株は、CXCR4指向性およびR5X4指向性HIVに対して高い感受性を保ったが、その一方で、ZFN修飾された株は、RT活性、PCR、および免疫蛍光顕微鏡検査法によって判定されたように、HXBおよびR3Aを含む、いくつかのHIV−1単離体による感染に対して完全に抵抗性であった。さらに、ZFN処理された細胞および対照SupT1細胞の、1:1000のように低い比率の混合物を含む培養物において、ZFN処理された細胞は、細胞変性X4ウイルス感染の状況において、優先的な生存を示した。ZFN修飾された細胞は、増殖速度論において差異を呈さず、安定的にCCR5を発現するように再改変されると、R5指向性HIV感染症に対して完全に許容状態となった。さらに、データは、CXCR4特異的ZFNが、主T細胞内にCXCR4指向性HIV株に対する保護をもたらし得ることを、明示する。
【0152】
これらのデータは、CXCR4を破壊するように、ZFNを首尾よく設計することができ、CXCR4依存性HIV感染症に対する抵抗性をもたらすことを明示する。
【実施例6】
【0153】
主T細胞におけるCXCR4およびCCR5のZFN修飾
負の選択によって単離された、新鮮ヒトCD4+T細胞を、Ad5/F35 X4およびAd5/F35 R5ZFNを使用した(moi 600)ことを除いて、上記の実施例4に説明するように処理した。上記に説明した、Surveyor(登録商標)を使用した形質導入後14日目に、CXCR4遺伝子配列およびCCR5配列の両方の修飾のために、細胞を分析した。図11に示される、得られた結果は、両方の配列が二重処置によって修飾されたことを示す。いくつかの条件下において、両方の標的遺伝子は修飾された(行6および7参照)。
【0154】
攻撃後の、細胞増殖、共受容体破壊、およびHIV転写酵素活性を評価するために、新鮮ヒトCD4+T細胞を負の選択によって単離し、それらをおよそ0.8×106細胞/mLの密度で播種し、10%のFCS、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、および100単位/mLのIL−2を含むRPMIにおいて、3:1の比率の抗CD3−抗CD28被覆磁気ビーズで刺激した。細胞を18時間培養し、次いでAd5/F35 X4ZFNを用いて形質導入させ(moi 600)、媒体容量は倍になるであろう。5日後、ビーズを除去し、細胞は、Ad5/F35 CCR5−ZFN(MOI 600)を用いて形質導入される。好適なCCR5ZFNは、例えば米国特許出願第20080159996号に記載される。およそ6日後に、抗CD3/抗CD28被覆磁気ビーズを用いて細胞を再刺激し、HIV株YU2、BK132、HxB、およびR3A(100ng p24)に感染させた。細胞増殖、共受容体破壊、およびHIV逆転写酵素活性を、HIV感染後から2日おきに評価した。
【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
CXCR4遺伝子内の表1に示される標的部位に結合する、亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン。
【請求項2】
請求項1に記載の亜鉛フィンガーDNA結合ドメインと、少なくとも1つの開裂ドメインまたは少なくとも1つの開裂ハーフドメインとを含む、融合タンパク質。
【請求項3】
前記開裂ハーフドメインは、野生型または改変されたFokI開裂ハーフドメインである、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
請求項1から3のいずれか1項に記載の亜鉛フィンガーDNA結合ドメインをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子送達ベクター。
【請求項6】
前記ベクターは、アデノウイルスベクターを含む、請求項5に記載の遺伝子送達ベクター。
【請求項7】
請求項1から3のいずれか1項に記載のタンパク質、請求項4に記載のポリヌクレオチド、または請求項5もしくは請求項6に記載の遺伝子送達ベクターを含む、単離細胞。
【請求項8】
細胞内の内因性細胞CXCR4遺伝子を不活性化する方法であって、 (a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸を、細胞内に導入すること、
を含み、前記第1のポリペプチドは、
(i)内因性CXCR4遺伝子内の第1の標的部位に結合するように改変される、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインと、 (ii)開裂ドメイン、
とを含み、前記ポリペプチドが前記細胞内で発現され、それにより、前記ポリペプチドが前記標的部位に結合して前記CXCR4遺伝子を開裂するようにする、方法。
【請求項9】
第2のポリペプチドをコードする核酸を導入することをさらに含み、前記第2のポリペプチドは、
(i)前記CXCR4遺伝子内の第2の標的部位に結合するように改変される、亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、と、 (ii)開裂ドメイン、
とを含み、前記第2のポリペプチドが前記細胞内で発現され、それにより、前記第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれの標的部位に結合して前記CXCR4遺伝子を開裂する、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
前記第1および第2のポリペプチドは、同じ核酸によって、または異なる核酸によってコードされる、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
ポリヌクレオチドを前記細胞内に導入することをさらに含み、前記ポリヌクレオチドは、二本鎖切断の上流の配列と相同性のある第1の領域と、二本鎖切断の下流の配列と相同性のある第2の領域とを含む、請求項8から10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項12】
前記核酸は、遺伝子送達ベクター上に担持される、請求項8から11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
前記遺伝子送達ベクターは、アデノウイルスベクター、任意選択でAd5/F35ベクターである、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞は、造血幹細胞、T細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、および抗原提示細胞から成る群から選択される、請求項8から13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項15】
被験者におけるHIV感染症を治療または予防する方法であって、 (a)請求項8から14のいずれか1項に記載の方法によって、単離細胞内の内因性細胞CXCR4遺伝子を不活性化すること、と、 (b)前記被験者に前記細胞を導入すること、
とを含み、前記被験者に前記細胞を導入する前に、ヌクレアーゼをコードする配列を用いて前記細胞内の内因性CCR5遺伝子を不活性化することを任意選択で含む、方法。

【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図2D】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【公表番号】特表2012−520675(P2012−520675A)
【公表日】平成24年9月10日(2012.9.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−500787(P2012−500787)
【出願日】平成22年3月18日(2010.3.18)
【国際出願番号】PCT/US2010/000807
【国際公開番号】WO2010/107493
【国際公開日】平成22年9月23日(2010.9.23)
【出願人】(508241200)サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド (28)
【Fターム(参考)】