改変型ヒト化抗インターロイキン−１８抗体
本発明は、ヒト化抗ＩＬ−１８抗体、製造方法、及び該抗体を用いた治療方法を開示する。さらに、例えば表面プラズモン共鳴を用いて、治療可能性のある抗体を同定するためのスクリーニング方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、一般的に、ヒトインターロイキン−１８により媒介される状態の治療及び診断に有用な、抗体（特にヒト化抗体）などの免疫グロブリンの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
ヒトインターロイキン−１８（ｈＩＬ−１８）は、生物学的に活性を有しない１９３アミノ酸の前駆体タンパク質として合成されるサイトカインである（Ushioら、J. Immunol. 156:4274, 1996）。前駆体タンパク質の切断、例えばカスパーゼ−１又はカスパーゼ−４による切断によって、１５６アミノ酸の成熟タンパク質が遊離し（Guら、Science 275:206, 1997；Ghayurら、Nature 386:619, 1997）、これが、Ｔ細胞増殖の共刺激、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生の誘導、並びにＴヘルパー１型（Ｔｈ１）分化の増強を含む生物学的活性を示す（Okamuraら、Nature 378:88, 1995；Ushioら、J. Immunol. 156:4274, 1996；Micallefら、Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996；Kohnoら、J. Immunol. 158:1541, 1997；Zhangら、Infect. Immunol. 65:3594, 1997；Robinsonら、Immunity 7:571, 1997）。さらに、ＩＬ−１８は、ヒト単球前炎症性伝達物質、例えばＩＬ−８、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの効果的な誘導因子である（Ushio, S.ら、J. Immunol. 156:4274-4279, 1996；Puren, A. J.ら、J. Clin. Invest. 10:711-721, 1997；Podolinら、J. Immunol. 提出済, 1999）。
【０００３】
以前にクローニングされたＩＬ−１受容体関連タンパク質（ＩＬ−１Ｒｒｐ）（Parnetら、J. Biol. Chem. 271:3967, 1996）は、ＩＬ−１８受容体（Ｋｄ＝１８ｎＭ）のサブユニットとして同定されている（Torigoeら、J. Biol. Chem. 272:25737, 1997）。ＩＬ−１８受容体の２つ目のサブユニットは、ＩＬ−１受容体付属タンパク質に対して相同性を示し、ＡｃＰＬ（付属タンパク質様のため）と称されている。ＩＬ−１ Ｒｒｐ及びＡｃＰＬの両方の発現が、ＩＬ−１８が誘導するＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化に必要である（Bornら、J. Biol. Chem. 273:29445, 1998）。ＮＦ−κＢ及びＪＮＫに加えて、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、ｐ５６ｌｃｋ（ＬＣＫ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を介してＩＬ−１８はシグナル伝達する（Micallefら、Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996；Matsumotoら、Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997；Tsuji-Takayamaら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:126, 1997）。
【０００４】
ＴＨ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−βなどの前炎症性サイトカインを産生するが（Mosmannら、J. Immunol. 136:2348, 1986）、これは多くの自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、１型すなわちインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及び乾癬などの媒介に関与しているとされている（Mosmann及びSad, Immunol. Today 17:138, 1996）。従って、ＴＨ１促進性サイトカイン（ＩＬ−１８など）のアンタゴニスト作用は、疾患の発症を抑制すると予想される。Ｉｌ−１８特異的ｍＡｂは、アンタゴニストとして用いることができるはずである。
【０００５】
自己免疫疾患の発症におけるＩＬ−１８の役割は証明されている。すなわち、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの膵臓及び脾臓において、その疾患発症直前にＩＬ−１８の発現が有意に増大することが示されている（Rotheら、J. Clin. Invest. 99:469, 1997）。同様に、関節リウマチ患者の滑液においてＩＬ−１８レベルが顕著に上昇することが示されている（Kawashimaら、Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996）。さらに、ＩＬ−１８投与によって、Ｔｈ１媒介自己免疫疾患であるマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（多発性硬化症のモデル）の臨床的重篤度が増すことが示されている。加えて、中和抗ラットＩＬ−１８抗血清によってＬｅｗｉｓ雌ラットにおけるＥＡＥの発症が予防されることが示されている（Wildbaumら、J. Immunol. 161:6368, 1998）。従って、ＩＬ−１８は、自己免疫のための新規な治療薬の開発のための望ましい標的である。
【０００６】
Taniguchiら（J. Immunol. Methods 206:107）は、４つの異なる抗原性部位に結合する７種のマウス及び６種のラット抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を記載している。マウスｍＡｂの１つ（＃１２５−２Ｈ）と、６つのラットｍＡｂは、ＫＧ−１細胞によるＩＬ−１８誘導性ＩＦＮ−γの産生を阻害し、ラットｍＡｂは＃１２５−２Ｈよりも１０倍低い中和活性を示す。ウエスタンブロット分析によって示されているように、マウスｍＡｂのうち３つ（ただしラットｍＡｂはなし）は、膜に結合したヒトＩＬ−１８と強く反応する。さらに、＃１２５−２Ｈ及びラットｍＡｂを用いてヒトＩＬ−１８を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が記載されている。このＥＬＩＳＡの検出限界は１０ｐｇ／ｍｌである。
【０００７】
欧州特許出願ＥＰ０ ７１２ ９３１号は、２種のマウス抗ヒトＩＬ−１８ ｍＡｂ、すなわちＨ１（ＩｇＧ１）及びＨ２（ＩｇＭ）を開示している。ウエスタンブロット分析によって示されているように、両方のｍＡｂは膜に結合したヒトＩＬ−１８と反応するが、膜に結合したヒトＩＬ−１２とは反応しない。ヒトＩＬ−１８を精製するためにイムノアフィニティークロマトグラフィープロトコールにおいてＨ１を使用し、そしてヒトＩＬ−１８を測定するためにＥＬＩＳＡにおいてＨ１を使用する。ヒトＩＬ−１８を測定するためにラジオイムノアッセイにおいてＨ２を使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
中和ＩＬ−１８抗体は、ヒトにおける自己免疫疾患及び関連する症候の緩和に有用である可能性がある。従って、当該技術分野においては、Ｔｈ１細胞分化及び増殖を低減し、それゆえ自己免疫疾患及び関連する症候を低減する、高親和性ＩＬ−１８アンタゴニスト、例えばヒトインターロイキン１８に対する中和モノクローナル抗体が必要とされている。
【０００９】
本明細書全体で言及する参照文献は全て、明示的かつ全体的に参照により本明細書に組み入れられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．発明の概要
本発明により、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１１】
本発明により、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖の位置７１の残基が、前記ＣＤＲが由来するドナー抗体中に存在するその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１２】
当業者には明らかなとおり、「由来する」という用語は、それが物質の物理的起源であるという意味で、起源を明らかにするのみならず、その物質と構造的に同一であるもののその基準起源から生じたのではない物質も明示することを意図するものである。したがって、「ＣＤＲが由来するドナー抗体フレームワーク中に存在する」対応する残基は、かならずしもドナー抗体フレームワークから精製されたものである必要はない。同様に、「ドナー抗体」由来ＣＤＲは、かならずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
【００１３】
ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）、並びにアミノ酸の番号付けは、特に指摘しない限り、Kabatら、"Sequences of immunological interest", NIHに記載されているＫａｂａｔ定義に従う。
【００１４】
本発明の別の態様において、ヒトアクセプターフレームワークに移植されたドナー抗体由来ＣＤＲを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、抗インターロイキン−１８抗体が配列番号１、２、３、４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含み、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体フレームワーク中のその対応する位置に存在する残基と同一である、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様においては、配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様において、配列番号１、２及び３に示されるＣＤＲを有する重鎖と配列番号４、５及び６に示されるＣＤＲを有する軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖ＣＤＲが、ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを有するドナー抗体に由来する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様において、ドナー抗体由来ＣＤＲ及びヒト化抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該ドナー抗体が、２Ｃ１０又はそのフレームワーク変異体である（すなわち、２Ｃ１０と同じＣＤＲであるが、異なるフレームワークを含む。米国特許第６，７０６，４８７号を参照されたい）、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、
（ａ）ヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを有する重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有する軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
前記ヒト軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に由来するフレームワークを含み、かつ配列番号３８の位置７１がチロシンである、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様では、
（ａ）ヒトＩＬ−１８との特異的結合を可能にするＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）アクセプターフレームワークを含み、かつ配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有し、そして位置７１にチロシン残基を有する軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２０】
軽鎖のＣＤＲは、好ましくは、配列番号３５に示される配列内の、配列番号４、５及び６に示される配列のそれぞれの位置に対応するアクセプターフレームワーク内の位置に位置する。軽鎖及び／又は重鎖は、好ましくはヒト患者において非免疫原性のものである。
【００２１】
本発明の別の態様において、
（ａ）配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該ヒト化抗インターロイキン−１８抗体の該軽鎖アクセプターフレームワークが、配列番号３８に示される配列の変異体に由来するフレームワーク領域を含み、該変異体が位置７１にチロシンを含み、かつ該変異体が配列番号３８に示される配列を有するフレームワークと７５％以上の同一性を有する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。該変異体は、配列番号３８に示されるフレームワークと、好ましくは８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、より好ましくは８５％以上、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、最も好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含む。
【００２２】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）ヒト軽鎖の位置７１にフェニルアラニンを含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体がその軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１に芳香族アミノ酸を含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）軽鎖アクセプターフレームワークの位置７１に、部分（ａ）の芳香族アミノ酸とは異なる種類の芳香族アミノ酸を含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体が、位置７１に部分（ａ）の抗体に由来する芳香族アミノ酸を有する軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様では、３７℃において表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、好ましくは以下の第７．４．１節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関して３００ｐＭ以下の平衡定数（ＫＤ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様では、配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、かつ３７℃において表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、好ましくは以下の第７．４．１節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関して３００ｐＭ以下の平衡定数（ＫＤ）を示す、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２６】
好ましくは、３７℃において表面プラスモン共鳴（好ましくは以下の第７．４．２節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関する抗体の平衡定数（ＫＤ）は、９０ｐＭ未満である。平衡定数は、より好ましくは７０ｐＭ以下、よりさらに好ましくは６５ｐＭ、６０ｐＭ、５５ｐＭ、又は５０ｐＭ以下である。
【００２７】
本発明の別の態様において、３７℃において表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、好ましくは以下の第７．４．２節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関して０．０００２（１／秒）以上の解離定数又は解離速度（ｋｄ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲが重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の一個若しくは複数の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、及び任意により位置４５、８３、８４、８５の一個若しくは複数の（例えば全ての）残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、３９、４０、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、３６、３９、４０、７１、８９、９１、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３２】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３４】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様において、重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の２５℃での解離速度（ｋｄ）と、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の３７℃での解離速度（ｋｄ）との比が、１：５（又は１：５未満）であり、該抗体がドナー抗体由来ＣＤＲとヒトアクセプターフレームワークを含み、かつヒトアクセプターフレームワークの軽鎖の位置７１の残基が、そのドナー抗体のその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。解離速度は、好ましくは、以下の第７．４．２節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００機器及び条件を用いて測定される。
【００３６】
本発明の別の態様において、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１からなる群から選択された重鎖と、配列番号１３、配列番号２９からなる群から選択された軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３７】
特に本発明は、配列番号９の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号９の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体を提供する。
【００３８】
本発明はまた、配列番号１７の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号１７の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体を提供する。
【００３９】
また本発明は、配列番号２１の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号２１の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体を提供する。
【００４０】
本発明の別の態様において、本明細書において上述した抗インターロイキン−１８抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００４１】
本発明の別の態様において、治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の親和性が（ｂ）の親和性を超える場合、好ましくは（ａ）の親和性がステップ（ｂ）の親和性の２倍以上、より好ましくは４倍以上である場合に、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様において、治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の解離速度が（ｂ）の解離速度よりも遅い場合、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法が提供される。
【００４３】
「抗インターロイキン−１８」という用語は、本発明の抗体を参照する場合、ヒトインターロイキン−１８の生物学的活性を中和することが可能な抗体を意味する。しかしながら、そのような抗体が非ヒト霊長類（例えばアカゲザル及び／又はカニクイザル）インターロイキン−１８の生物学的活性をさらに中和する可能性があることを排除するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
さらに図面を参照しながら本発明を説明する。
【００４５】
４．ヒト化抗体
インタクトな非ヒト抗体をヒトの疾患又は障害の治療に使用することは、特に抗体を反復投与した際に、現在十分に立証されている潜在的な免疫原性の問題を引き起こす。すなわち、患者の免疫系はインタクトな非ヒト抗体を非自己と認識して、中和応答を開始する可能性がある。こうした問題を克服するために、完全にヒトの抗体（上記参照）の開発に加えて、長年にわたってさまざまな技法が開発されてきたが、こうした技法は、一般に、免疫した動物、たとえばマウス、ラット又はウサギから非ヒト抗体を得ることの相対的な容易さを維持する一方で、インタクトな治療用抗体における非ヒトアミノ酸配列の構成割合を減らすことを必要とする。概して、これを達成するために２つの手法が用いられてきた。第１はキメラ抗体であって、これは一般に、ヒト定常領域に融合された非ヒト（たとえば、マウスなどの齧歯類）可変領域を含む（Morrison (1984), PNAS, 81, 6851参照）。抗体の抗原結合部位は可変領域内に位置するので、キメラ抗体は、抗原に対するその結合親和性を維持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得しているため、上記のようなエフェクター機能を果たすことができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて作製される。従来の方法を用いて（たとえば、本発明の抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子、例としては上記の配列番号１、２、３、４、５及び６をコードするＤＮＡと、特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、抗体をコードするＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）を単離し、配列を決定する。ハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの典型的な供給源となる。キメラ抗体を発現することが望まれる場合には、軽鎖及び重鎖の全長成熟可変領域をコードする単離ｃＤＮＡを適当な発現ベクターに読み取り枠を合わせて挿入する。該発現ベクターは、特に、適当な免疫グロブリン定常領域（通常はヒト起源のもの）と、シグナル配列、停止コドン、プロモーター、ターミネーター、及び抗体の発現を達成するために必要な他のエレメントを含む。かかるベクターを、次に本来免疫グロブリンを産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞又は三重ローマ細胞といった宿主細胞にトランスフェクトして、抗体を合成させる。ＤＮＡは、ヒトＬ鎖及びＨ鎖のコード配列を、対応する非ヒト（たとえばマウス）Ｈ及びＬ定常領域の代わりに用いることによって、改変することができる。たとえば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)を参照されたい。
【００４６】
第２の手法は、可変領域をヒト化することによって抗体の非ヒト含量を減少させる、ヒト化抗体の作製に関する。ヒト化について２つの技術が広く支持されている。第１は、ＣＤＲグラフティングによるヒト化である。ＣＤＲは抗体のＮ末端近くにループを作り、そこで、フレームワーク領域によってもたらされるスキャフォールドに嵌め込まれた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主として、そのＣＤＲ表面のトポグラフィー及び化学的性質によって決まる。次いで、これらの特徴は、個別のＣＤＲのコンフォメーションによって、ＣＤＲの相対的配置によって、並びにＣＤＲを構成する残基の側鎖の性質及び配置によって決定される。免疫原性の大幅な低下は、非ヒト（たとえばマウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみを、好適なヒトのフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）及び定常領域上にグラフティングすることによって達成することができる（Jonesら、 (1986) Nature 321,522-525、及びVerhoeyen Mら、(1988) Science 239, 1534-1536を参照されたい）。しかしながら、ＣＤＲグラフティングは本質的に、抗原結合特性の完全な保持をもたらさない可能性があり、有意な抗原結合親和性を回復したいならば、ドナー抗体のフレームワーク残基（「復帰突然変異」と呼ばれることもある）の一部をヒト化分子内に保持する必要があることが、多くの場合、明らかになっている（Queen C ら、(1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, Mら、(1991) Nature 351, 501-502を参照されたい）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を用意するために、非ヒトドナー抗体に対して最大の配列相同性（典型的には６０％以上）を示すヒトＶ領域をデータベースから選択する。ヒトＦＲは、ヒトコンセンサス又は個別のヒト抗体のどちらからも選択することができる。必要ならば、ドナー抗体由来の重要残基を、ヒトアクセプターフレームワーク内に置換して入れて、ＣＤＲコンフォメーションを保存する。抗体のコンピューターモデリングを用いることができるが、それは、このような構造的に重要な残基を同定するのに役立つ。国際公開ＷＯ９９／４８５２３号を参照されたい。
【００４７】
別法として、ヒト化は、「veneering」のプロセスによって行うことができる。特異なヒト及びマウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域の統計分析によって、露出した残基の正確なパターンがヒトとマウスの抗体で異なること、並びにほとんどの個々の表面位置は少数の異なる残基に強い選択性があることが明らかになった（Padlan E.A.ら、(1991) Mol.Immunol.28, 489-498、及びPedersen J.T.ら、(1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照されたい）。したがって、そのフレームワーク領域内の、ヒト抗体に通常存在するものとは異なる、露出した残基を置き換えることによって、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることができる。タンパク質の抗原性は表面への接近可能性と相関しうるので、表面残基を置き換えることは、マウス可変領域をヒトの免疫系に「見えない」ようにするのに十分であると考えられる（Mark G.E.ら、(1994)、実験薬理学ハンドブック（Handbook of Experimental Pharmacology）第113号より：モノクローナル抗体の薬理学（The pharmacology of モノクローナル 抗体）、Springer-Verlag、105-134ページも参照されたい）。こうしたヒト化の手順は、抗体の表面だけを変更し、支持する残基はそのままになっているので、「veneering」と呼ばれる。さらに別の手法としては、ＷＯ０４／００６９５５号に記載されている方法、及びHumaneeringTM（Kalobios）のプロセスが挙げられる。この方法は、細菌発現系を使用して、ヒト生殖系と配列が近縁の抗体を産生する（Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, January 2007, San Diego, California）。別の最近のヒト化手法は、ヒトアクセプターフレームワークを、フレームワーク領域などの抗体の他の領域間の相同性よりもむしろ、ドナーマウス抗体ＣＤＲ領域とのヒトＣＤＲ領域の構造類似性に基づいて選択することを含む。このプロセスは、SuperhumanisationTMとしても知られる（Evogenix Inc.; Hwang ら (2005) Methods 36:35-42）。
【００４８】
従って本発明は、上の第３節に記載したヒト化抗体に関する。このようなヒト化抗体は、好ましくはＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４など）のヒト定常領域を含む。
【００４９】
別の実施形態において、上の第３節で記載したヒト化可変領域は、非ヒト定常領域（「逆キメラ（reverse chimera）」）、例えば非ヒト霊長類、ラット、マウス又はウサギのものなどと融合しうる。
【００５０】
当業者には明らかなように、配列番号３７及び３８に示されるアクセプターフレームワークは、それぞれＶＨ遺伝子及びＶκ遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのアミノ酸を構成する。これらはそれ自体がアクセプター抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲを含む。アクセプター抗体のＣＤＲを配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるドナーＣＤＲと置換し、そして得られる配列を好適なフレームワークの４つの配列（配列番号３９及び配列番号４０に示される配列など）と結合させて、完全な免疫グロブリン可変領域（配列番号１１及び配列番号１５に示されるものなど）を生成することは当業者の能力の範囲内である。
【００５１】
４．１．他の改変
抗体のＦｃ領域とさまざまなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられるが、このエフェクター機能には、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体結合、食作用、及び抗体の半減期／クリアランスが含まれる。所望のエフェクター特性に応じて、本発明の抗体のＦｃ領域のさまざまな改変を行うことができる。たとえば、本来なら溶解性の抗体を非溶解性にするＦｃ領域内の特異的変異が、欧州特許第０６２９ ２４０Ｂ１号及び同第０３０７ ４３４Ｂ２号に詳述されており、あるいは、抗体にサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを組み込んで、血清半減期を延ばすことができる。米国特許第５，７３９，２７７号を参照されたい。現在知られているヒトＦｃγ受容体には５つあり、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃＲγＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び新生児ＦｃＲｎである。Shieldsら、(2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604は、共通のＩｇＧ１残基のセットがすべてのＦｃγＲとの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、この共通のセットの外側にある別個の部位を利用することを明らかにした。一群のＩｇＧ１残基は、Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７及びＰｒｏ−２３９をアラニンに変えると、すべてのＦｃγＲへの結合を低下させた。これらはいずれもＩｇＧ ＣＨ２ドメインに存在し、ＣＨ１及びＣＨ２をつなぐヒンジ部の近くでクラスターを形成している。ＦｃγＲＩは、結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットのみを用いるが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、共通セットに加えて、別個の残基とも相互作用する。一部の残基の変更は、ＦｃγＲＩＩとの結合のみを低下させ（たとえば、Ａｒｇ−２９２）、又はＦｃγＲＩＩＩとの結合のみを低下させた（たとえば、Ｇｌｕ−２９３）。ある変異体は、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、他の受容体との結合には影響を与えなかった（たとえば、Ｓｅｒ−２６７Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩに対する結合は強化したが、ＦｃγＲＩＩＩとの結合には影響しなかった）。また他の変異体は、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、他の受容体との結合は低下した（たとえば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩに対する結合を強化したが、ＦｃγＲＩＩとの結合は低下した）。ＦｃγＲＩＩＩａに関して、もっともよく結合するＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３及びＬｙｓ−３３４でのアラニン置換の組み合わせを有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランス及び組織にわたるトランスサイトーシスのどちらにも関与していると考えられる（Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 及びGhetieら、(2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると確定されたヒトＩｇＧ１残基には、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５がある。本発明は、半減期／クリアランス並びに／又はエフェクター機能（ＡＤＣＣ及び／若しくは補体溶解など）を改変するために、上述した残基の変化のいずれか１（又はそれ以上）を有する本発明の抗体にも関する。
【００５２】
他の改変には、本発明の抗体のグリコシル化変異体がある。抗体の定常領域内の保存された位置でのグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に重大な影響を及ぼすことが知られている。たとえば、Boydら、(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318を参照されたい。１又は複数の糖鎖を付加、置換、欠失又は修飾した、本発明の治療用抗体又はその抗原結合フラグメントのグリコシル化変異体が想定される。アスパラギン−Ｘ−セリン、又はアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの導入は、糖鎖を酵素的に連結することができる部位を作り出すので、それを用いて、抗体のグリコシル化を操作することができる。Rajuら、(2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いる再ガラクトシル化及び／又は再シアリル化により増加した。末端シアリル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を長くすると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、典型的には複数のグライコフォームの混合物として天然に産生される。こうした混合物は、抗体を真核生物、とりわけ哺乳動物細胞内で産生させたとき、特に明らかである。特定したグライコフォームを製造するために、さまざまな方法が開発されてきた。Zhangら、Science (2004), 303, 371、 Searsら、Science, (2001) 291, 2344、 Wackerら、(2002) Science, 298 1790、Davisら、(2002) Chem. Rev. 102, 579、Hangら、(2001) Acc. Chem. Res 34, 727を参照されたい。したがって、本発明は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの特定された数（たとえば７個以下、例として５個以下、たとえば２又は１個）のグライコフォームを含む、本明細書に記載の複数の治療用抗体（典型的にはモノクローナル抗体）（ＩｇＧ１アイソタイプ、たとえばＩｇＧ１とすることができる）に関する。
【００５３】
本発明のさらに他の実施形態には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンといった、非タンパク質性ポリマーと結合した本発明の治療用抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。タンパク質とＰＥＧとの結合は、タンパク質の半減期を長くするのと同時に、タンパク質の抗原性及び免疫原性を低下させるための確立された技術である。分子量及び形状（直鎖若しくは分枝）の異なるＰＥＧ付加の使用は、インタクト抗体、及びＦａｂ’フラグメントで検討されている。Koumenis I.L.ら、(2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95を参照されたい。
【００５４】
５．作製方法
本発明の抗体は、ヤギ（Pollockら、(1999), J. Immunol. Methods 231:147-157を参照されたい）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55を参照されたい）、マウス（Pollockら、前掲）、又は植物（Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204、Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606、Baez Jら、BioPharm (2000) 13: 50-54、Stoger Eら、(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590を参照されたい）といったトランスジェニック生物内で産生することができる。抗体はまた、化学合成によっても作製することができる。しかしながら、本発明の抗体は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて作製される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、その後の宿主細胞におけるクローニング（増幅）又は発現のために、複製可能なベクター（プラスミドなど）に挿入する。特に宿主細胞がＣＨＯ又はＮＳＯである場合（下記を参照されたい）、１つの有用な発現系は、グルタミン酸シンテターゼ系（Lonza Biologicsが販売しているものなど）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ）によって、容易に単離され、配列決定される。使用可能なベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体（プラスミドがその典型的な具体例である）がある。一般にこうしたベクターは、発現を促進するために、軽鎖及び／又は重鎖ポリヌクレオチドに機能的に連結された、シグナル配列、複製起点、１つ若しくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列をさらに含有する。軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター内に挿入し、（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション又は形質導入によって）同一の宿主細胞に同時に又は連続的に導入することができるし、あるいは所望であれば、そのような導入の前に重鎖及び軽鎖をともに同一ベクター内に挿入してもよい。
【００５５】
遺伝子コードの縮重のため、本発明のポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドの代わりとなるポリヌクレオチドも利用可能であることは、当業者にはすぐにわかることである。
【００５６】
５．１．シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的な切断部位を有する、異種シグナル配列を含む融合タンパク質として作製することができる。シグナル配列は、宿主細胞によって認識されて、プロセシングされる必要がある。原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーとすることができる。酵母分泌のためには、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、又は酸ホスファターゼリーダーとすることができる。例えばＷＯ９０／１３６４６号を参照されたい。哺乳動物細胞系では、ウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナル、並びに天然免疫グロブリンシグナル配列（ヒトＩｇ重鎖など）が利用できる。典型的には、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに、リーディングフレーム内で連結される。
【００５７】
５．２．複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、ｐＢＲ３２２がほとんどのグラム陰性細菌に適合し、２μプラスミドがほとんどの酵母に適合し、さらに、さまざまなウイルス由来のもの、たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ若しくはＢＰＶはほとんどの哺乳動物細胞に適している。一般に、複製起点の要素は、ベクターの増殖を大腸菌内で行う必要がない限り、組込み型哺乳動物発現ベクターには必要でない。しかしながら、ＳＶ４０ ｏｒｉは、初期プロモーターを含有しているので使用することができる。
【００５８】
５．３．選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素（たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート若しくはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、又は（ｂ）栄養要求性の欠乏を補完する、若しくは複合培地で利用できない栄養素を補充するタンパク質、あるいは（ｃ）その両方の組み合わせであるタンパク質をコードする。選択方式は、ベクターを含まない又はベクターを含む宿主細胞の増殖の停止を行いうる。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子による形質転換が成功した細胞は、たとえば共送達される選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために、生き残る。一つの例はＤＨＦＲ選択系であるが、この場合、形質転換体はＤＨＦＲ陰性宿主株において作出される（例えばPage and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68参照）。この系では、ＤＨＦＲ遺伝子が本発明の抗体ポリヌクレオチド配列と共送達されて、ヌクレオシド除去によりＤＨＦＲ陽性細胞が選択される。必要に応じて、ＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキサートも使用して、ＤＨＦＲ遺伝子増幅を示す形質転換体を選択する。ＤＨＦＲ遺伝子を本発明の抗体コード配列又はその機能的誘導体に機能的に連結することによって、ＤＨＦＲ遺伝子増幅が目的の所望抗体配列が同時に増幅されるようにする。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ／メトトレキサート選択に特に有用な細胞株であり、ＤＨＦＲ系を利用した宿主細胞の増幅及び選択方法は当技術分野で十分に確立されている（Kaufman R.J. ら、 J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621を参照のこと。概説については、Werner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M,”Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Augを参照のこと）。さらにもう一つの例は、グルタミン酸シンテターゼ発現系（Lonza Biologics）である。酵母での使用に適した選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcombら、Nature 282, 38, 1979を参照されたい。
【００５９】
５．４．プロモーター
本発明の抗体の発現に適したプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに、機能するように連結される。原核生物宿主のためのプロモーターには、ｐｒｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン及びハイブリッドプロモーター、たとえばＴａｃがある。酵母細胞での発現に適したプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ及びグルコキナーゼがある。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、及び窒素代謝又はマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。
【００６０】
哺乳動物細胞系における発現のためのプロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えばウイルスプロモーター、たとえば、ポリオーマ、鶏痘及びアデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及び初期若しくは後期シミアンウイルス４０、並びに非ウイルスプロモーター、例えばＥＦ−１α（Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322）が挙げられる。プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。
【００６１】
５．５．エンハンサーエレメント
必要に応じて、たとえば、高等真核生物での発現のために、さらなるエンハンサーエレメントを、上述したプロモーターの代わりに、又はそのプロモーター内に位置することが見出されているものと一緒に挿入することができる。適当な哺乳動物エンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオネイン、及びインスリン由来のエンハンサーエレメントが含まれる。あるいはまた、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー、又はマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座といった、真核細胞ウイルス起源のエンハンサーエレメントを使用してもよい（ＷＯ０４／００９８２３号を参照されたい）。このようなエンハンサーは典型的に、ベクター上で、プロモーターの上流の部位に位置するが、他の位置、例えば非翻訳領域内又はポリアデニル化シグナルの下流に位置してもよい。エンハンサーの選択及び位置決定は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。
【００６２】
５．６．ポリアデニル化／終止
真核細胞系では、ポリアデニル化シグナルが、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに、機能しうるように連結される。こうしたシグナルは典型的には、オープンリーシングフレームの３’側に置かれる。哺乳動物系で、限定的でない例として、シグナルとしては、成長ホルモン、伸長因子１α、並びにウイルス（たとえば、ＳＶ４０）遺伝子、又はレトロウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のものが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの限定的でない例として、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子由来のシグナルが挙げられる。原核細胞系では、ポリアデニル化シグナルは一般的には必要とされず、その代わりにもっと短く明確な転写終結配列を用いるのが通例である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。
【００６３】
５．７．収量改善のための他の方法／エレメント
上記に加えて、収量改善のために用いることができる他の特徴としては、クロマチン再構成エレメント、イントロン及び宿主細胞特異的コドン改変が挙げられる。宿主細胞のコドンの偏りに適合させるために本発明の抗体のコドン利用法を改変して、転写及び／又は生成物収率を高めることができる（例えば、Hoekema A ら、Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24）。コドンの選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。
【００６４】
５．８．宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングし、又は発現させるのに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、又は高等真核細胞である。適当な原核細胞には、真正細菌、例を挙げると、腸内細菌科、例えばエシェリキア属（Escherichia）（例として大腸菌（E. coli）（たとえば、ATCC 31,446; 31,537; 27,325））、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）（例としてネズミチフス菌（Salmonella typhimurium））、セラチア属（Serratia）（例としてSerratia marcescens）、及び赤痢菌属（Shigella）など、並びにバシラス属（Bacilli）の枯草菌（B. subtilis）及びB. licheniformis（DD 266 710を参照されたい）など、シュードモナス属（Pseudomonas）の緑膿菌（P. aeruginosa）など、さらにストレプトミセス属（Streptomyces）がある。酵母宿主細胞のうち、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）（たとえば、ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500）、ヤロウィア属（yarrowia）（欧州特許第４０２，２２６号）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（欧州特許第１８３，０７０号、Pengら、J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照されたい)、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderma reesia）（欧州特許第２４４，２３４号）、ペニシリン属（Penicillin）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）並びにアスペルギルス属（Aspergillus）宿主、たとえばアスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）及びクロコウジカビ（A. niger）も想定される。
【００６５】
原核生物及び酵母宿主細胞は、具体的に本発明で想定はされるが、しかしながら、本発明の宿主細胞は、典型的には脊椎動物細胞である。適当な脊椎動物宿主細胞には、哺乳動物細胞、たとえば、ＣＯＳ−１（ATCC番号 CRL 1650)、ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651)、ヒト胚性腎細胞系２９３、ＰｅｒＣ６（Crucell）、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ATCC CRL.1632)、ＢＨＫ５７０（ATCC番号: CRL 10314)、２９３（ATCC番号CRL 1573）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１、ATCC番号：ＣＣＬ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系、たとえばＤＧ４４など（Urlaubら、前掲を参照されたい））、特に懸濁培養に適したＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ATCC CRL-1587）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎細胞（ATCC CCL 34）、ヒト肺細胞（ATCC CCL 75）、ＨｅｐＧ２及びミエローマ若しくはリンパ腫細胞、たとえばＮＳ０（米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が含まれる。
【００６６】
したがって、本発明の一実施形態において、本明細書に記載の治療用抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換された宿主細胞が提供される。こうした宿主細胞は、典型的には、軽鎖をコードする第１のベクター、及び重鎖をコードする第２のベクターを含む。
【００６７】
このような宿主細胞はまた、本発明の抗体の質、機能及び／又は収率を改変するためにさらに操作してもよいし、又は適合させてもよい。非限定的な例としては、特定の修飾（例えばグリコシル化）酵素及びタンパク質折りたたみシャペロンの発現が挙げられる。
【００６８】
５．９．細胞培養法
本発明の治療用抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の方法によって培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、振とうフラスコ、ローラーボトル、又は中空糸の系で培養することができるが、大規模生産のためには、特に懸濁培養用に撹拌槽型リアクター又はバッグリアクター（例えば、Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA）を使用することが好ましい。撹拌槽は、典型的には、たとえば、スパージャー、バッフル又は低剪断インペラを用いて、通気に適合させる。気泡塔及びエアリフトリアクターには、空気又は酸素気泡による直接通気を用いることができる。宿主細胞を無血清培地中で培養する場合、通気プロセスの結果として細胞が損傷するのを防ぐのに役立つ、プルロニックＦ−６８のような細胞保護物質を添加することが好ましい。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアを、足場依存性細胞系の増殖基質として使用することができるし、あるいは細胞を懸濁培養に適応させることもできる（こちらが一般的である）。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養は、バッチ、流加培養、反復バッチ処理（Drapeauら、(1994) cytotechnology 15: 103-109を参照されたい）、延長バッチ法又は潅流培養といった、さまざまな運転モードを利用することができる。組換えによって形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地のような血清含有培地で培養することができるが、こうした宿主細胞は、Keenら、(1995) Cytotechnology 17:153-163に記載の合成無血清培地、又はＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭ若しくはＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（Cambrex NJ, USA）といった市販の培地中で、必要ならば、グルコースなどのエネルギー源及び組換えインスリンのような合成増殖因子を添加して、培養することが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、その細胞が無血清条件での増殖に適応していることを必要とすると考えられる。１つの適応法は、こうした宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主が無血清条件に適応するように、培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（たとえば、Scharfenberg Kら、(1995)「動物細胞工学」（Animal Cell technology）より: 21世紀に向けた開発（Developments towards the 21st century）（Beuvery E.C.ら、編）、619-623ページ, Kluwer Academic publishersを参照されたい）。
【００６９】
培地中に分泌された本発明の抗体は、さまざまな技法を用いて培地から回収及び精製され、目的の用途に適した精製度を与えることができる。たとえば、本発明の治療用抗体をヒト患者の治療に使用するには、一般に還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％、若しくは９９％の純度が要求される（治療用抗体を含む粗製の培地と比較した場合）。第１の例では、細胞片を培地から、一般には、遠心によって除去し、次に、たとえば、精密濾過、限外濾過及び／又は深層濾過を用いて、上清の清澄化ステップを行う。あるいは、前もって遠心分離を行わずに、精密濾過、限外濾過又は深層濾過により抗体を回収してもよい。さまざまな他の技法、たとえば、透析及びゲル電気泳動、並びにクロマトグラフ法、例としてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティクロマトグラフィー（状況に応じて、ポリヒスチジンのようなアフィニティタグ標識システムを含む）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６号を参照されたい）が利用できる。一実施形態において、本発明の抗体は、さまざまな清澄化ステップの後、プロテインＡ若しくはＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでさらに、イオン交換及び／又はＨＡクロマトグラフィー、陰イオン若しくは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーといったクロマトグラフィーステップや、硫安沈澱を行う。一般に、さまざまなウイルス除去ステップも行われる（たとえば、ＤＶ−２０フィルターなどを用いたナノ濾過）。こうしたさまざまなステップの後、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ以上、たとえば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体を含む、精製（典型的にはモノクローナル）調製物が得られ、したがってその調製物が本発明の実施形態を構成する。超遠心分離によって１００ｍｇ／ｍｌ以上への濃縮を行うことができる。適切なことに、この調製物は本発明の抗体の凝集体を実質的に含まない。
【００７０】
細菌系は、抗体フラグメントの発現に特に適している。こうしたフラグメントは、細胞内又はペリプラズム内に局在する。当業者に公知の方法にしたがって、不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出し、リフォールディングして活性タンパク質を形成することができる。Sanchezら、(1999) J. Biotechnol. 72, 13-20及びCupit PMら、(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277を参照されたい。
【００７１】
６．医薬組成物
上記の本発明の抗体の精製調製物（特にモノクローナル調製物）を、上で概説したヒトの疾患及び障害の治療に使用するための医薬組成物に組み入れることができる。典型的には、こうした組成物は、許容される医薬慣習で知られ、必要とされる、薬学的に許容される（すなわち不活性）担体をさらに含む。たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第16版、(1980), Mack Publishing Co.を参照されたい。このような担体の例としては、適当なバッファーでｐＨ５〜８の範囲内に緩衝化された、生理食塩水、リンガー溶液又はブドウ糖溶液のような滅菌担体がある。注射用（たとえば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内若しくは門脈内投与による）又は持続点滴用の医薬組成物は、好適には目に見える粒子状物質を含まず、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの抗体、典型的には５ｍｇ〜２５ｍｇの抗体を含有することができる。このような医薬組成物の製造方法は、当業者に周知である。一実施形態において、医薬組成物は、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの本発明の治療用抗体を、状況に応じて使用説明書と共に、単位投与剤形中に含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知の又は明白な方法にしたがって投与前に再構成するために凍結乾燥されていてもよい。本発明の実施形態がＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明の抗体を含む場合、クエン酸塩（たとえば、クエン酸ナトリウム）又はＥＤＴＡ又はヒスチジンといった銅のキレート剤を医薬組成物に添加して、このアイソタイプの抗体の、銅を介した分解の度合いを低下させることができる。欧州特許第０６１２２５１号を参照されたい。
【００７２】
本発明の抗体を投与するための有効量及び治療計画は、一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重及び健康状態、並びに治療すべき疾患又は障害といった要因に左右される。こうした要因は主治医の裁量の範囲内にある。適当な用量を選択する際の指針は、たとえばSmithら、(1977)「ヒトの診断及び治療における抗体」（Antibodies in human diagnosis and therapy）、Raven Press, New Yorkに見出すことができるが、概して１ｍｇ〜１０００ｍｇである。一実施形態において、ＲＡに罹患したヒト患者の治療用の投与計画は、おおよそ１００ｍｇ（すなわち５０ｍｇ〜２００ｍｇ）の本発明の抗体（又はその抗原結合フラグメント）を毎週又は２週間毎に皮下投与するものである。本発明の組成物はまた予防的に用いることもできる。
【００７３】
治療対象の疾患又は障害に応じて、治療上有効な量の本発明の抗体を含む医薬組成物を、有効量の別の薬剤、たとえば、抗炎症薬（たとえば、ＮＳＡＩＤ、メトトレキセート、、ブシラミン、チオリンゴ酸ナトリウム、又は１以上の抗ＴＮＦα治療、例えばＥｎｂｒｅｌＴＭ（エタネルセプト）、ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ（インフリキシマブ）、ＨｕｍｉｒａＴＭ（アダリムマブ）及び／若しくはＣＤＰ８７０）とともに、同時に、別々に、又は順次、使用することができる。本発明の抗体は、有効量の抗ＴＮＦ−α受容体抗体と組み合わせて用いることができる。Davis MWら、(2000) Ann Rheum Dis 59(Suppl 1): 41-43を参照されたい。他の実施形態において、本発明の抗体は、以下：ＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ（例えばＫｉｎｅｒｅｔＴＭ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＩＬ−６（Choyら、(2002) Ann.Rheum.Dis 61(suppl 1): 54参照）、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（Taylorら、(2001) Curr.Opin.Immunol.13: 611-616参照）、抗ＩＣＡＭ及び／又は抗ＣＤ４抗体に対して生起される薬剤、並びにＭＭＰファミリーのメンバー、例えばＭＭＰ−１、２、３及び／又は１３に対して生起される薬剤の有効量と組み合わせて用いることができる。本発明の抗体はまた、炎症性プロセスに関与することが知られる、細胞を剥離する薬剤と組み合わせて用いることができ、例えばＣＤ２０陽性Ｂ細胞について例えばＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（リツキシマブ）を用いる。本発明の抗体と組み合わせる他の治療法としては、抗血管新生療法、例えばインテグリンαｖβ３のアンタゴニスト、クリングル１〜５（Sumariwalla Pら、(2003), Arthritis Res Ther 5:R32-R39参照）、可溶性Ｆｌｔ−１（Miotlaら、(2000) Lab.Invest. 80:1195-1205参照）など；抗ＣＯＸ−２剤又は抗ＯＳＭ剤、例えば抗ＯＳＭ抗体（ＷＯ２００５／０９５４５７号参照。その全内容が本明細書中に具体的に組み入れられ、読者はそれを具体的に参照する）などが挙げられる。簡便には、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの部分の、そのような別の医薬の部分と一緒の、場合によっては使用説明書と一緒の、キット（キットオブパーツ）を含む医薬組成物もまた本発明は意図している。これらの組み合わせは、関節炎疾患／障害（関節リウマチなど）の治療に特に有用である。
【００７４】
７．臨床用途
本発明の抗体は、ＩＬ−１８が媒介する疾患、例えば自己免疫疾患などの治療的処置に用いることができる。具体的には、多発性硬化症、関節炎疾患（関節リウマチなど）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬が挙げられる。従って、本発明はさらに、ｈＩＬ−１８の中和に応答する疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、ＩＢＤ、乾癬など）に罹患したヒト患者の治療方法であって、本発明の抗体（特に配列番号９に示される配列を有する重鎖と配列番号１３に示される配列を有する軽鎖とを有する抗体）の治療有効量を該患者に投与することを含む方法を包含する。
【００７５】
また、上述した疾患／障害のいずれか１つ（又は複数）の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用も提供される。
【００７６】
【００７７】
７．例証
以下の実施例により、本発明の様々な態様を説明する。全ての一般的クローニング、ライゲーション、及び他の組換えＤＮＡ技術は、Maniatisら, Molecular cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory、又はSambrookら Molecular Cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratoryに一般的に教示されているように実施する。本明細書で使用するベクター系及び追加の分子生物学的方法は、その内容全体を参照により本明細書に組み込み、かつ読者が具体的に参照するＷＯ２００５／０９５４５７号に開示されている。
【００７８】
７．１．ハイブリドーマ可変領域のクローニング
親ラット抗体２Ｃ１０は、米国特許第６，７０６，４８７号に記載されている。読者は、具体的にはこの文書を参照されたい。上記公開されている、ヒトＩｇＧ１若しくはκＣ領域に結合しているラットＶ領域をベースとして、キメラ抗体２Ｃ１０ｃを設計した。重鎖及び軽鎖構築体に、一般的免疫グロブリンシグナル配列及び翻訳開始コドンＡＴＧを導入した。ＶＬドメインを形成し、既にヒトＣκ領域（配列番号３６）を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングできるように、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を設計した。ＶＨドメインを形成し、既にヒトγ１Ｃ領域（配列番号３４）を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングできるように、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を設計した。これにより、配列番号３３に示す公開済み配列から得た、２Ｃ１０のＶｈ領域のフレームワーク４に２個のアミノ酸変化がもたらされた（Ｋａｂａｔ残基１０７及び１０８）。
【００７９】
重複オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによってコード配列全体を構築し、上記発現ベクター中にクローニングした。配列を確認後、キメラ抗体をＣＨＯ細胞で発現させた。生成された抗体は、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースでのアフィニティクロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。その親ラット２Ｃ１０に匹敵する効力を実証するために、インビトロ結合アッセイで、２Ｃ１０キメラ抗体を評価した。これは、ＥＬＩＳＡでヒト若しくはアカゲザルＩＬ１８との結合のＥＣ５０値を測定することによって（図１６及び１７）、又はＫＧ−１バイオアッセイでＩＦＮ−γの放出を阻害することによって（図１５を参照されたい）行った。
【００８０】
７．２．ヒト化
７．２．１．軽鎖ヒト化手順
ラット２Ｃ１０可変軽鎖配列について、ラット２Ｃ１０可変軽鎖配列と６４％の同一性（ＣＤＲ含有）を有するヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した（Ｆ＿ＩＧＫＶ１Ｄ−１２−１、配列番号３８）。生殖系列Ｖ領域は、配列類似性（配列番号４０）に基づき、コンピューターで（in silico）好適なＦＲ４、この場合はＪ領域κ２ミニ遺伝子（Kabat Vol.II）と組み合わせた。３個のヒト化変異体は、配列比較、及び抗体機能への潜在的影響に基づき生成した。構築体Ｌ１は、上で選択したヒトアクセプターフレームワーク中にラットＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用）を線状に移植（straight graft）したものであった。構築体Ｌ２は、Ｌ１を基礎にして、残基７１に１個の追加の復帰突然変異を有した。構築体Ｌ３は、Ｌ２を基礎にして、残基４５、８３、８４及び８５に４個の追加の復帰突然変異を有した。表１を参照されたい。
【００８１】
【００８２】
７．２．２．重鎖のヒト化手順
ラット２Ｃ１０可変重鎖配列について、ラット２Ｃ１０可変重鎖と５９％の同一性（ＣＤＲ含有）を有する、ヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した（Ｆｐ＿ＩＧＨＶ１−ｆ＿２、配列番号３７）。生殖系列Ｖ領域は、配列類似性（配列番号３９）に基づき、コンピューターで好適なＦＲ４、この場合はＪＨ６ミニ遺伝子（Kabat Vol.II）と組み合わせた。このフレームワークに基づき、３個のヒト化可変重鎖変異体を設計した。Ｈ１は、残基２７、２８、２９及び９３に４個の追加の復帰突然変異を有するラットＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用）の移植体である。これにより、（Ｃｈｏｔｈｉａが定義するように）ＣＤＲの一部を構成しうる親（すなわちドナー）抗体のＣＤＲ１の直上流に、極めて珍しいアミノ酸配列を得ることができる。Ｈ２は、Ｈ１を基礎にして、残基３９及び４０に２個の追加の復帰突然変異を有した。次いで、Ｈ３は、Ｈ２を基礎にして、残基３６、７１、８９及び９１に別の４個の追加の復帰突然変異を有した。表２を参照されたい。
【００８３】
【００８４】
７．３．２Ｃ１０Ｃのヒト化
重複オリゴヌクレオチドの構築及びＰＣＲ増幅によって、ヒト化Ｖ領域を新規に合成した。哺乳動物発現ベクター中にクローニングするためにプライマーに制限部位を含め、分泌のためにヒト免疫グロブリンシグナル配列を含めた。ヒト化Ｖ領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩを使用し、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３として、ヒトγ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローン化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩを使用し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３として、ヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローン化した。これにより、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのヒト化重鎖変異体、及びヒトκアイソタイプのヒト化軽鎖変異体が得られた。
【００８５】
７．３．１．ヒト化重鎖抗体とヒト化軽鎖抗体の組合せの発現
四回の試験でＣＨＯＫ１細胞に一過性にトランスフェクトした。上清の抗体濃度をアッセイし、次いで２Ｃ１０ラット−ヒトキメラと比較することによって、その上清をインビトロ結合アッセイで使用した。
【００８６】
全９個の変異体の大規模な一過性発現は、各フラスコについて８ｍｌの培地（ＯｐｔｉＭＥＭ／ｇｌｕｔａｍａｘ／５％ＦＢＳ）中に含まれた、５１．４μｇの軽鎖プラスミド及び８．６μｇの重鎖プラスミドと、２４０μｇのトランスフェクション脂質（この脂質は、ＷＯ２００６／０５３７８３号、実施例１３に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に組み込む）とを混合し、２個のほぼコンフルエントなＣＨＯＫ１細胞のＴ１７５フラスコに、この混合物を通常の組織培養条件下、７２時間添加することによって実施した。シェーカーフラスコを使用して、ポリクローナルＣＨＯ細胞系でも抗体をｍｇ量で発現させ、ＦＰＬＣ及びプロテインＡを使用して精製した。
【００８７】
７．４．インビトロ結合アッセイ
７．４．１．Ｂｉａｃｏｒｅ分析
ヒト化２Ｃ１０抗体のＢｉａｃｏｒｅＴＭ動態分析は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機により、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）中でその抗体のプロテインＡ捕捉を使用し実施した。簡単に説明すると、製造業者が推奨するプロトコルを使用し、一級アミン結合によってＣＭ５チップにプロテインＡをおよそ２０００〜４０００共鳴単位（ＲＵ）の密度で固定した。次いで、プロテインＡ表面にヒト化抗体を流し、安定化期間後およそ２００〜５００ＲＵのレベルで捕捉させ、捕捉した抗体表面に（ヒト若しくはアカゲザルの）ＩＬ１８を所定の濃度で流し、結合センサーグラムを得た。酸性溶出条件を使用して再生することにより、捕捉した抗体はプロテインＡ表面から全て除去され、表面の結合能が著しく低減することはなかった。全ての曲線は、ＩＬ１８に代わる緩衝液の注入に対して二重に基準を取り、ＢｉａＥｖａｌ ４．１で全体適合パラメーターを使用してデータを１：１結合モデルに適合させた。同じプロテインＡ捕捉法を使用して解離速度ランキング実験を準備したが、１種類のＩＬ１８濃度（１０ｎＭ）のみを使用した。データは、動態分析の結合モデルと同じ結合モデルを使用し適合させたが、解離速度に１種類の検体濃度のみを使用したことが報告されているので、この値は、正確な動態測定を得るというよりはむしろランキングに有用であり、どの抗体をさらに調査するかの選択法として使用した。
【００８８】
最初の２５℃での結果では、構築体は全て、ラット２Ｃ１０親抗体としてヒトＩＬ１８と類似する結合親和性を有することが示された。しかし、３７℃で解離速度ランキング実験を実施したとき、Ｌ１構築体は解離速度に上昇が見られ、Ｌ２及びＬ３構築体と比較して不首尾な結果が示された（表３ａ及び３ｂ）。
【００８９】
【００９０】
Ｌ１構築体は、アカゲザルＩＬ１８との結合親和性の点で、３７℃で不首尾な結果を示したのと同様に、２５℃でも最低の結果を示した（表４ａ）。これらの観察に基づき、３７℃でのヒトＩＬ１８及びアカゲザルＩＬ１８との結合について、選択した抗体をより詳細に調査した。表４ｂに示すヒトＩＬ−１８のデータは、６回の別個の測定の平均（及び標準偏差）である。アカゲザルＩＬ−１８のデータは、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３については２回の実験の平均及び標準偏差を示し、Ｈ３Ｌ２及びＨ３Ｌ３のデータは１回の実験から得たものである。このデータの比較的高い標準偏差は、おそらく３７℃でこの実験を実施した結果である。
【００９１】
Ｌ１とＬ２構築体との差が、軽鎖の位置７１でのチロシンの復帰突然変異によるフェニルアラニンの置換であることを考慮すると、Ｌ１構築体が、相対的に劣る結果を示した事実は驚くべきことである。チロシンとフェニルアラニンはもちろん芳香族アミノ酸であり、従ってフレームワーク構造のそのような些細な変化によって、３７℃でＢｉａｃｏｒｅＴＭ系で観察された（結合親和性の点で）顕著な結果が生じたことは予想外であった（しかし、２５℃では観察されなかった）。
【００９２】
【００９３】
変異体Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、及びＨ１Ｌ３を選択して、以下第７．４．２節でさらに分析した。
【００９４】
７．４．２．Ｂｉａｃｏｒｅ分析Ｔ１００のデータ
Ｔ１００ ＢｉａｃｏｒｅＴＭ機を使用してさらにいくつかの変異体抗体の特性決定を実施した。この機器は、高温での緩衝効果を最小化する直列ガス抜き装置（inline degasser）を使用することによって、高温での感受性、温度制御性、及び基線安定性の点で、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００よりも優れている。また、自動データ分析など、高度なソフトウェアも提供する。
【００９５】
方法は、上の第７．４．１節で使用した方法と基本的に同じであり、一級アミン結合によってプロテインＡをＣＭ５チップに２０００〜６０００ＲＵの密度で固定した。ＨＢＳ−ＥＰ（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）で試験を実施した。抗ＩＬ１８抗体を１００〜５００ＲＵの密度で捕捉させ、ヒトＩＬ１８を１６〜０．０６２５ｎＭの濃度でこの捕捉した表面に流し、０ｎＭ濃度（すなわち、緩衝液は捕捉した抗体の注入のみ）を二重基準に使用した。各ＩＬ１８注入後の再生は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の注入を２回を使用する、穏やかな酸性溶出により行なった。この再生ステップにより、プロテインＡ表面から、捕捉された抗体を除去した（従ってそれに結合するいかなるＩＬ１８も除去した）。再生しても、続く抗体パルスと結合するプロテインＡ表面の能力は大きく変化することなく、次の捕捉事象を行うことができた。得られた結合曲線は、１：１結合モデルを使用するＴ１００機に本来備わる分析ソフトウェアを用いて分析した。示した温度で実験を実施した。
【００９６】
１５℃、２０℃、２５℃、３２℃及び３７℃でのＨ１Ｌ１及びＨ１Ｌ２の結合分析
様々な温度で上記方法を使用して実験を実施した。図１は、温度の結合速度（on-rate）（ｋａ）に対する影響を示し、図２は解離速度（ｋｄ）に対する影響、そして図３は平衡定数（ＫＤ）に対する影響を示す。表５は、これらの図を作成するために使用した動態値の詳細である。
【００９７】
【００９８】
データは、試験した２個の抗体の結合速度が、試験した温度範囲にわたり類似することを示し、Ｈ１Ｌ２の結合速度の方が速い場合は、３７℃での最終値まで、Ｈ１Ｌ２の結合速度の方が一般的に速い。しかし、解離速度に目を向けた場合、より大きな差異が見られ、１５℃、２０℃、２５℃では２個の抗体の解離速度は類似するが、３２℃及び３７℃で差異を見せ始め、Ｈ１Ｌ１の解離速度の方が速くなる。これらの変化は、全体的平衡定数（それはｋｄ／ｋａの関数である）に反映され、Ｈ１Ｌ１とＨ１Ｌ２との間の差異は、解離速度（ｋｄ）によって定義した、主として抗体／ＩＬ１８複合体の安定性であることを示している。
【００９９】
２５℃及び３７℃でのＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ３、及びキメラ２Ｃ１０の結合分析
上記のように実験を実施した。表６は、得られた動態パラメーターの詳細である。データから、２５℃及び３７℃の平衡定数ＫＤによって定義した結合という点で、Ｈ１Ｌ２はＨ１Ｌ１よりも良好な抗体であることが示されるが、動態パラメーターは、２５℃ではＨ１Ｌ２がＨ１Ｌ１よりも結合速度（ｋａ）が良好であることを示している。３７℃では、立場は逆転し、このことは、３７℃で見られるＨ１Ｌ２による優れた結合が、むしろ解離速度（ｋｄ）によることを示し、Ｌ２とＬ１を区別する変異によって、ＩＬ１８−抗体複合体の高温での安定性が増大することを示している。
【０１００】
【０１０１】
データは、いくつかの別々のデータセット（ｎ）の平均であり、平均及び標準偏差（括弧内に標準偏差）を示す。５つの異なる温度での分析から得られたＨ１Ｌ１及びＨ１Ｌ２の２５℃と３７℃での実験の値が、このデータセットに含まれている。
【０１０２】
７．４．３．ＩＬ１８結合ＥＬＩＳＡにおける２Ｃ１０ｃヒト化変異体の評価
精製抗体調製物の様々なバッチを使用して全９個のヒト化変異体のＥＬＩＳＡを少なくとも６回実施した。図４Ａ〜４Ｃには、表７に示すＥＣ５０値ランキングを作成した、１回の実験の代表的データを示す。２．５μｇ／ｍｌの１６Ｄ１０（非中和マウスモノクローナル抗体）を使用し、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートにヒトＩＬ−１８を固定して、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８を捕捉させた。様々な希釈率で抗ＩＬ−１８ヒト化抗体を加えた。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma A0170）を使用して、結合したヒト化抗体を検出した。
【０１０３】
【０１０４】
全ての変異体の効力は、２Ｃ１０キメラに非常に近似しているように見え、このことは、ヒト化による効力の損失はほとんどないことを示している。これらのアッセイを数回反復して得られたＥＣ５０値では、変異体ランキングは得られなかったが、ＥＬＩＳＡ単独ではこれらの変異体を明確に区別することはできなかった（表７及び図４Ａ〜４Ｃを参照）。ＢｉａｃｏｒｅＴＭを使用して、変異体をある程度区別することができ（第７．４．１節及び第７．４．２節）、それによってわずか４個の変異体がもたらされ、それらをヒトＩＬ１８及びアカゲザルＩＬ１８を使用する数回の独立した反復実験でより詳しく試験した（表８、図５［ヒト］及び図６［アカゲザル］）。
【０１０５】
【０１０６】
７．４．４．ＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡにおける２Ｃ１０ヒト化Ｈ１変異体の評価
Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３という３個のヒト化Ｈ１変異体を用いてＥＬＩＳＡを実施し、室温及び３７℃において、ヒト血清及びブロッキング溶液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ０．０５％ＴＷＥＥＮ（ｗ／ｖ））中でのヒトＩＬ−１８結合を評価した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートにヒト化抗体変異体を２．５μｇ／ｍｌで固定した。５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８の捕捉は、室温又は３７℃で、ヒト血清又はブロック溶液中で実施した。抗ＩＬ−１８マウスモノクローナル抗体１６Ｄ１０を加えた。結合したマウス抗体は、抗マウスκペルオキシダーゼコンジュゲート（Serotec MCA 1291P）を使用して検出した。研究データから得られた代表的ＥＣ５０値を表９に示す。
【０１０７】
【０１０８】
このアッセイでは、ヒトＩＬ−１８結合ステップを実施する温度を室温から３７℃へ変化させても、３個のヒト化Ｈ１変異体の効力は影響を受けない。ヒト血清中に抗体が存在すると、低い結合シグナルが観察される。
【０１０９】
７．４．５．３７℃でのヒト化Ｈ１変異体抗体の安定性評価
Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３という３個のヒト化Ｈ１変異体の保存安定性は、ヒト血清及びリン酸緩衝食塩水中、３７℃で１４日間にわたって評価した。抗体を５０μｇ／ｍｌに希釈し、安定性は、３７℃で０、１、４、６、８及び１４日間というインキュベーション時間後に、ＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡによって評価した。ＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡについては、１６Ｄ１０（非中和マウスモノクローナル抗体）をＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定して、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８を捕捉した。３７℃での経時インキュベーションの種々の時点でサンプリングした抗ＩＬ−１８ヒト化抗体を加えた。結合したヒト化抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して検出した。
【０１１０】
このアッセイ型式では、３７℃という温度に、０、１、４、６、８及び１４日間という長時間曝露を行なっても、ヒトＩＬ−１８に結合するその能力に基づく、ヒト化Ｈ１抗体変異体の結合効力に影響はなかった。
【０１１１】
７．５．滑液存在下でのＨ１Ｌ２とヒトＩＬ１８との結合
５０％ヒト滑液に５００ｎｇ／ｍｌ〜０ｎｇ／ｍｌの範囲の組換えヒトＩＬ１８を添加しＥＬＩＳＡを実施した。次いで、Ｈ１Ｌ２抗体をコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc）のウェルに、ＩＬ−１８を含むこの溶液をアプライした。次いで、ビオチン化した抗ＩＬ−１８抗体（Ｄ０４５−６, MBL）及びストレプトアビジン−ＨＲＰにより、結合したＩＬ−１８を検出した。組換えヒトＩＬ１８を含む５０％滑液（ＳＦ）を滴定すると、最大半値のほんのわずかなシフトが見られただけで、ヒト組換えＩＬ−１８を含む緩衝液を滴定したものと、ほぼ同じ曲線が生成された。図７を参照されたい。これにより、抗体が治療設定で遭遇する結合環境により類似性が高い５０％ヒトＳＦの存在下でさえ、ｈＩＬ−１８に結合する抗体能力が実証されている。
７．５．１．ＩＬ１８結合タンパク質（ＩＬ１８ｂｐ）存在下でのＩＬ１８に対する結合
ＢｉａｃｏｒｅＴＭ技術（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００）及びＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＩＬ１８ｂｐの存在下でもＨ１Ｌ２が依然としてヒトＩＬ１８と結合できるかどうかを判定した。ＩＬ１８ｂｐは、ＩＬ１８に対して高親和性を有し、ＩＬ−１８機能の天然阻害薬として働く（図８、図９Ａ及び図９Ｂ、表１０及び表１１）。
【０１１２】
Ｂｉａｃｏｒｅによる分析
簡単に説明すると、一級アミン結合によってＣＭ５チップにプロテインＡを表面がおよそ４０００共鳴単位（ＲＵ）の密度になるように固定した。次いで、組換えＦｃ−ＩＬ１８結合タンパク質（R&D Systems）を濃度３μｇ／ｍｌ、流速１０μｌ／分で１分間流し、これにより、およそ１４００ＲＵのＩＬ１８結合タンパク質が捕捉された。次いで、捕捉したＩＬ１８結合タンパク質表面に、ＩＬ１８を濃度３０ｎＭ、流速１０μｌ／分で５分間流した。この後、ＩＬ１８結合タンパク質／ＩＬ１８表面に、濃度１０ｎＭのラット２Ｃ１０親抗体を流速３０μｌ／分で３分間流した。２Ｃ１０抗体によって認識されるＩＬ１８上のエピトープが、ＩＬ１８結合タンパク質との相互作用部位に干渉するならば、いかなる結合シグナルも見られないはずである。図１０は、２Ｃ１０がｈＩＬ−１８と結合すること、続いてこのｈＩＬ−１８がｈＩＬ−１８ＢＰによって捕捉されたことを実証し、このことは、２Ｃ１０とｈＩＬ−１８ＢＰの結合部位が重複しないことを示している。
【０１１３】
【０１１４】
ＥＬＩＳＡによる分析
ヒト化Ｈ１Ｌ２若しくはラット２Ｃ１０ ＭＡｂと、ヒトＩＬ１８が結合した捕捉ＩＬ１８ｂｐとの結合を、直接結合ＥＬＩＳＡで試験したが、その際、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに、組換えヒトＩＬ１８ｂｐ−Ｆｃ融合タンパク質（R&D Systems #119-BP）を０．５μｇ／ｍｌでコーティングした。組換えヒトＩＬ１８（社内試薬）を１００ｎｇ／ｍｌでブロッキング緩衝液（１％ｗ／ｖＢＳＡ含有ＰＢＳ）に加えた。精製した抗体を０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの濃度範囲で加えた。抗ヒトκ軽鎖特異的ＨＲＰコンジュゲート（Sigma）若しくは抗ラットＩｇＧ ＨＲＰにより結合した抗体を検出した。図１８Ａ及び１８Ｂに、得られた結果を示す。
【０１１５】
７．６．インビトロバイオアッセイ
７．６．１．ＫＧ−１細胞系における、ＩＬ１８の刺激によるＩＦＮ−γの放出を中和する、ヒト化構築体の活性
このアッセイでは、ＩＬ−１８特異的抗体の中和活性を計測するが、アッセイはＫＧ−１細胞におけるＩＬ−１８を媒介するＩＦＮγの誘導に基づく。ＫＧ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４６）は、機能性ＩＬ−１８受容体を構成的に発現し、従って外来性ＩＬ−１８刺激に応答するヒト骨髄単球細胞系である。
【０１１６】
全９個のヒト化変異体について、ＫＧ−１細胞におおけるヒトＩＬ１８に刺激されたＩＦＮ−γの放出を阻害するその能力を評価した（表１２及び図１１）。
【０１１７】
【０１１８】
ＢｉａｃｏｒｅＴＭ分析に基づき、組換えヒトＩＬ１８及びアカゲザルＩＬ１８に最も高い親和性示した、４個の好ましいヒト化変異体で、少なくともさらに６回の反復実験を実施した。図８に、４個の好ましいヒト化変異体及びＨ１Ｌ１の代表的結果を示し、表１３に、ＣＨＯｅ１ａ細胞由来の同じタンパク質バッチ物質によって全て実施した、これらのアッセイの結果の概要を示す。
【０１１９】
【０１２０】
Ｈ１Ｌ１を他のヒト化変異体と比較した事例では、試験し、かつ２Ｃ１０親ＭＡｂとも比較した、その他の４個のヒト化構築体と比べて、Ｈ１Ｌ１は低い効力を示した。
【０１２１】
４個の好ましいモノクローナル抗体を用いてさらなる分析を実施したが、ＫＧ−１細胞：２Ｃ１０、並びに２Ｃ１０から得られたヒト化変異体（Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３）により、ＩＬ−１８に刺激されたＩＮＦγの放出を阻害する能力について、それらのモノクローナル抗体を比較した。９６ウェルプレートで、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８、及びＩＬ１８に特異的な種々の濃度の抗体（２μｇ／ｍｌ〜７．８ｎｇ／ｍｌの範囲、二倍希釈）、又は陰性アイソタイプ対照（Ｓｙｎａｇｉｓ、抗ＲＳＶ抗体）を３７℃及び５％ＣＯ２下で１時間インキュベートし、続いてウェル当たり３．１０５個のＫＧ−１細胞を添加することによって、ＫＧ−１バイオアッセイを実施した。最後に、それらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で２０〜２４時間インキュベートした。上清を回収し、市販のヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡキット（Biosource AHC4432；AHC4539）を使用してＩＦＮγの産生を定量した。
【０１２２】
３回の実験を実施した。ＩＬ−１８に刺激されたＩＦＮγの産生の阻害結果を陰性対照に対して正規化した。統計分析は、あらゆるＳｙｎａｇｉｓ応答の調整後、各実験について各ｍＡｂのＩＣ５０推定値を得ることを目的とした。次いで、ＩＣ５０推定値を統計学的に分析して、９５％信頼区間（すなわち統計学的に信頼できる範囲）で各ｍＡｂの全体的ＩＣ５０推定値を生成した。最後に、ダネット検定を使用して２Ｃ１０に戻って各ヒト化変異体を比較した。
【０１２３】
図１２に、代表的実験を示す。表１４及び図１３に、９５％信頼区間での各モノクローナル抗体の全体的ＩＣ５０推定値、及びｐ値と信頼区間と共にラット２Ｃ１０の変化率（％）を示す。
【０１２４】
【０１２５】
Ｈ１Ｌ１は、２Ｃ１０よりも統計上有意に効力が低い（ｐ＜０．００１）。
【０１２６】
その他のヒト化変異体は、２Ｃ１０と有意には異ならないが、Ｈ１Ｌ３対２Ｃ１０の比較が境界線である。
【０１２７】
７．６．２．刺激したヒトＰＢＭＣ中のＩＦＮ−γ放出の中和におけるＨ１Ｌ２の活性
３ドナー由来のヒトＰＢＭＣは、組換えヒトＩＬ１８及び抗ＣＤ３抗体で刺激し、４個の選択したヒト化抗体変異体の希釈系列を加えた作用を研究した。比較するために、それぞれにドナー親２Ｃ１０抗体及びＩＬ１８ｂｐを含めた。３ドナーのうち２ドナーでは、ＩＬ１８及び抗ＣＤ３刺激は失敗し、ＩＦＮ−γは検出されなかった。残りのドナーについては、結果は低濃度では非常に変化したが、ＩＬ１８が誘発するＩＦＮ−γの産生の完全阻害は、ヒト化変異体を含む様々な抗ＩＬ１８抗体を添加することによって達成することができた。図１４を参照されたい。
【０１２８】
さらにＬＰＳが刺激するヒトＰＢＭＣにより実施した実験では、ＩＬ１８を産生し、付随するＩＦＮγの放出が生じた。濃度依存的にＬＰＳによってＩＦＮγの産生が誘発され、１μｇ／ｍｌの一定濃度で２Ｃ１０親モノクローナル抗体を添加すると、この刺激が完全に阻害され、このことは、その効果にはＩＬ１８が介在するということ、及び内在性ＩＬ１８は中和できるということ（データ非掲示）を示している。これは、全血でも実証できたが、２Ｃ１０による阻害効果は、用量依存性ではあったが、あまり明白ではなかった（データ非掲示）。図９に、３個の独立したドナーによる実験、並びに親ラットモノクローナル２Ｃ１０、Ｈ１Ｌ２、及びＩＬ１８ｂｐによる阻害の結果を示す。ドナー１及び３は同様の結果を示したが、ドナー２はＬＰＳによる刺激でＩＦＮγを放出しなかった（図示せず）。ＩＬ１８が媒介するＩＦＮγ放出は、１０％若しくは２５％のヒト血清の存在下、１μｇ／ｍｌを超える抗体若しくはＩＬ１８ｂｐを加えることによって、完全に阻害することができる。阻害は、１０ｎｇ／ｍｌ以上で既に観察可能であり、１０％若しくは２５％のヒト血清の存在下でのこの阻害のＩＣ５０値を表１１に示す。
【０１２９】
【０１３０】
７．６．３．ＩＬ１８オルソログとの結合の概要
ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ、そしてさらにＫＧ−１細胞バイオアッセイを使用し、抗体と他の種由来のＩＬ１８との結合を検査した。これは、当初、アカゲザル／カニクイザルＩＬ１８について親２Ｃ１０及びキメラ２Ｃ１０ｃを使用し実施したが、いくつかのヒト化変異体で繰り返した。Ｂｉａｃｏｒｅ及びＥＬＩＳＡを使用し、ブタ、マウス及びラットＩＬ１８との結合について親２Ｃ１０を試験し、４個の最も優れたヒト化変異体をアカゲザル／カニクイザル、及びイヌのＩＬ１８との結合について試験した。ＫＧ−１バイオアッセイは、アカゲザル／カニクイザルのＩＬ１８、並びに３個のモノクローナル抗体、２Ｃ１０キメラ、及びヒト化変異体の代表であるＨ３Ｌ３で実施した。全てのヒト化変異体の類似性を考慮すると、これは、Ｈ１Ｌ２を含めて生成された他の変異体の代表である可能性が高い（表１５、図８を参照）。
【０１３１】
【０１３２】
７．７．ＩＬ１８抗体の円二色性及び熱変性試験
円二色性（ＣＤ）試験を使用して、温度、特に２５℃〜３７℃の関数として、ＩＬ１８抗体の二次構造変化を試験した。これら同じ抗体の熱変性試験を行って、それらの熱安定性と融解温度（Ｔｍ）を測定した。
【０１３３】
ＣＤ方法：ＣＤスペクトルは、０．５ｎｍステップ及びバンド幅１ｎｍで１８０ｎｍ〜２８０ｎｍの走査を行なうApplied Photophysics Chirascan分光計で取得した。各点ごとの取得時間は５秒であった。サンプルをＰＢＳで約０．２ｍｇ／ｍｌ希釈し、１ｍｍ光路長（pathlength）セルに入れた。各タンパク質のスペクトルは、４℃、２５℃及び３７℃に設定した恒温槽で取得した。サンプルの実際の温度は、セル内の液体中に置いたプローブによって測定したが、設定温度の約３℃以内であった。
【０１３４】
Ｔｍ方法：Sypro orangeを１：１０００で入れたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で、全てのタンパク質を０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。Bioneer Exicycler機器を使用し、０．５℃間隔毎に、６２０ｎｍ（励起４９０ｎｍ）における蛍光発光を測定したが、サンプル温度は各温度点で１０秒待機して１０℃〜９５℃に勾配をつけた。変性曲線は、Ｇｒａｆｉｔを使用して標準的融解等温線に適合させた。
【０１３５】
予想通り、全４個の抗体のＣＤスペクトルの形状比較から、それらの構造が高度にβシート状であり、本質的に同じ構造であることが示された。４℃〜３７℃の温度範囲では、３個の抗体：
Ｈ１Ｌ１
Ｈ１Ｌ２
Ｈ１Ｌ３
は、ＣＤによって判明した通り、その二次構造において有意な変化は示さなかった。しかし、２Ｃ１０抗体キメラは、この温度範囲で構造にわずかな減少が見られた。これは、下表１６に示す熱安定性傾向に一致する。
【０１３６】
【０１３７】
Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３は、体温ではいかなる変性の徴候も見せず、３７℃をはるかに超えても明らかに安定している。従って、熱安定性のその差異が、正常な身体及び周囲温度で、何らかの示差的利点を付与する可能性は低い。
【０１３８】
配列
配列番号1
GYYFH
配列番号2
RIDPEDDSTKYAERFKD
配列番号3
WRIYRDSSGRPFYVMDA
配列番号4
LASEDIYTYLT
配列番号5
GANKLQD
配列番号6
LQGSKFPLT
配列番号7
MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
配列番号8
ATGGCTGCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTATCAGTCATAAGAAATTTGAATGACCAAGTTCTCTTCATTGACCAAGGAAATCGGCCTCTATTTGAAGATATGACTGATTCTGACTGTAGAGATAATGCACCCCGGACCATATTTATTATAAGTATGTATAAAGATAGCCAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGAAGTGTGAGAAAATTTCAACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATCAAGGATACAAAAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTCCCAGGACATGATAATAAGATGCAATTTGAATCTTCATCATACGAAGGATACTTTCTAGCTTGTGAAAAAGAGAGAGACCTTTTTAAACTCATTTTGAAAAAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTCAAAACGAAGACTAG
配列番号9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号10
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGTGTCCGGCGAGATCAGCACCGGCTACTACTTCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGACAGCACCAAGTACGCCGAGCGGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTACCACCTGGCGGATCTACAGAGACAGCAGCGGCAGACCCTTCTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号11
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSS
配列番号12
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGTGTCCGGCGAGATCAGCACCGGCTACTACTTCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGACAGCACCAAGTACGCCGAGCGGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTACCACCTGGCGGATCTACAGAGACAGCAGCGGCAGACCCTTCTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
配列番号13
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号14
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCGAGGACATCTACACCTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAACAAGCTGCAGGACGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCAGCAAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号15
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIK
配列番号16
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCGAGGACATCTACACCTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAACAAGCTGCAGGACGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCAGCAAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
配列番号17
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号18
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTGGGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
配列番号19
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSS
配列番号20
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTGGGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号21
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号22
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTTTGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGCAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
配列番号23
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSS
配列番号24
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTTTGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGCAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号25
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号26
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列番号27
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIK
配列番号28
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号29
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEGDYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号30
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGAAGGGGATTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号31
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEGDYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIK
配列番号32
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGAAGGGGATTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号33
EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGQGLEWIGRIDPEDDSTKYAERFKDRATLTAQTSSNTAYLNLSSLTSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号34
GAGGTCCAGCTACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGACCTGGGACCTCTGTGAAGTTATCTTGCAAAGTTTCTGGCGAAATAAGTACAGGATACTATTTCCACTTTGTGAGGCGAAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATAGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGGGCGACGCTCACTGCACAAACATCCTCCAACACAGCCTACCTGAACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACACTGCAACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
配列番号35
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEDIYTYLTWYQQKPGKSPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKISGIQPEDEGDYFCLQGSKFPLTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号36
GACATTCAAATGACCCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCTCCATCGAATGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGCACACAGTATTCTCTCAAGATCAGCGGCATACAACCTGAAGATGAAGGGGATTATTTCTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列番号37
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
配列番号38
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP
配列番号39
WGQGTLVTVSS
配列番号40
FGQGTKLEIK
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】Ｈ１Ｌ１及びＨ１Ｌ２の結合速度（ｋａ）に対する温度の影響を示す。
【図２】解離速度（ｋｄ）に対する温度の影響を示す。
【図３】平衡定数（ＫＤ）に対する温度の影響を示す。
【図４】Ａ〜Ｃは、表７に示したＥＣ５０値を作成した１回の実験の代表的データを示す。
【図５】ヒトＩＬ１８に結合する４個の選択したヒト化変異体のＥＣ５０値を示す。
【図６】アカゲザルＩＬ１８に結合する４個の選択したヒト化変異体のＥＣ５０値を示す。
【図７】５０％滑液の存在下におけるヒトＩＬ１８に対するＨ１Ｌ２の結合を示す。
【図８】ＫＧ１アッセイにおけるＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図９】Ａ及びＢはそれぞれヒトＰＢＭＣＳドナーの１０％及び２５％自己血清における、ＬＰＳが刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１０】ｈＩＬ１８ＢＰにより捕捉されたｈＩＬ１８に対する２Ｃ１０の結合を示す。
【図１１】ＫＧ１細胞におけるヒトＩＬ１８が刺激するＩＦＮ−γ放出を阻害する９個のヒト化変異体の能力を示す。
【図１２】ＫＧ１細胞におけるＨ１変異体及び２Ｃ１０によるＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１３】Ｈ１変異体のＩＣ５０データを９５％信頼区間と共に示す。
【図１４】ＫＧ１細胞におけるヒトＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１５】ＫＧ１細胞におけるアカゲザルＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１６】キメラ２Ｃ１０を用いたヒトＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１７】キメラ２Ｃ１０を用いたアカゲザルＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１８】Ａ及びＢはそれぞれヒトＩＬ−１８が結合したＩＬ−１８ＢＰに対して結合するＨ１Ｌ２及び２Ｃ１０を用いた結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、一般的に、ヒトインターロイキン−１８により媒介される状態の治療及び診断に有用な、抗体（特にヒト化抗体）などの免疫グロブリンの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
ヒトインターロイキン−１８（ｈＩＬ−１８）は、生物学的に活性を有しない１９３アミノ酸の前駆体タンパク質として合成されるサイトカインである（Ushioら、J. Immunol. 156:4274, 1996）。前駆体タンパク質の切断、例えばカスパーゼ−１又はカスパーゼ−４による切断によって、１５６アミノ酸の成熟タンパク質が遊離し（Guら、Science 275:206, 1997；Ghayurら、Nature 386:619, 1997）、これが、Ｔ細胞増殖の共刺激、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生の誘導、並びにＴヘルパー１型（Ｔｈ１）分化の増強を含む生物学的活性を示す（Okamuraら、Nature 378:88, 1995；Ushioら、J. Immunol. 156:4274, 1996；Micallefら、Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996；Kohnoら、J. Immunol. 158:1541, 1997；Zhangら、Infect. Immunol. 65:3594, 1997；Robinsonら、Immunity 7:571, 1997）。さらに、ＩＬ−１８は、ヒト単球前炎症性伝達物質、例えばＩＬ−８、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの効果的な誘導因子である（Ushio, S.ら、J. Immunol. 156:4274-4279, 1996；Puren, A. J.ら、J. Clin. Invest. 10:711-721, 1997；Podolinら、J. Immunol. 提出済, 1999）。
【０００３】
以前にクローニングされたＩＬ−１受容体関連タンパク質（ＩＬ−１Ｒｒｐ）（Parnetら、J. Biol. Chem. 271:3967, 1996）は、ＩＬ−１８受容体（Ｋｄ＝１８ｎＭ）のサブユニットとして同定されている（Torigoeら、J. Biol. Chem. 272:25737, 1997）。ＩＬ−１８受容体の２つ目のサブユニットは、ＩＬ−１受容体付属タンパク質に対して相同性を示し、ＡｃＰＬ（付属タンパク質様のため）と称されている。ＩＬ−１ Ｒｒｐ及びＡｃＰＬの両方の発現が、ＩＬ−１８が誘導するＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化に必要である（Bornら、J. Biol. Chem. 273:29445, 1998）。ＮＦ−κＢ及びＪＮＫに加えて、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、ｐ５６ｌｃｋ（ＬＣＫ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を介してＩＬ−１８はシグナル伝達する（Micallefら、Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996；Matsumotoら、Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997；Tsuji-Takayamaら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:126, 1997）。
【０００４】
ＴＨ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−βなどの前炎症性サイトカインを産生するが（Mosmannら、J. Immunol. 136:2348, 1986）、これは多くの自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、１型すなわちインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及び乾癬などの媒介に関与しているとされている（Mosmann及びSad, Immunol. Today 17:138, 1996）。従って、ＴＨ１促進性サイトカイン（ＩＬ−１８など）のアンタゴニスト作用は、疾患の発症を抑制すると予想される。Ｉｌ−１８特異的ｍＡｂは、アンタゴニストとして用いることができるはずである。
【０００５】
自己免疫疾患の発症におけるＩＬ−１８の役割は証明されている。すなわち、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの膵臓及び脾臓において、その疾患発症直前にＩＬ−１８の発現が有意に増大することが示されている（Rotheら、J. Clin. Invest. 99:469, 1997）。同様に、関節リウマチ患者の滑液においてＩＬ−１８レベルが顕著に上昇することが示されている（Kawashimaら、Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996）。さらに、ＩＬ−１８投与によって、Ｔｈ１媒介自己免疫疾患であるマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（多発性硬化症のモデル）の臨床的重篤度が増すことが示されている。加えて、中和抗ラットＩＬ−１８抗血清によってＬｅｗｉｓ雌ラットにおけるＥＡＥの発症が予防されることが示されている（Wildbaumら、J. Immunol. 161:6368, 1998）。従って、ＩＬ−１８は、自己免疫のための新規な治療薬の開発のための望ましい標的である。
【０００６】
Taniguchiら（J. Immunol. Methods 206:107）は、４つの異なる抗原性部位に結合する７種のマウス及び６種のラット抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を記載している。マウスｍＡｂの１つ（＃１２５−２Ｈ）と、６つのラットｍＡｂは、ＫＧ−１細胞によるＩＬ−１８誘導性ＩＦＮ−γの産生を阻害し、ラットｍＡｂは＃１２５−２Ｈよりも１０倍低い中和活性を示す。ウエスタンブロット分析によって示されているように、マウスｍＡｂのうち３つ（ただしラットｍＡｂはなし）は、膜に結合したヒトＩＬ−１８と強く反応する。さらに、＃１２５−２Ｈ及びラットｍＡｂを用いてヒトＩＬ−１８を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が記載されている。このＥＬＩＳＡの検出限界は１０ｐｇ／ｍｌである。
【０００７】
欧州特許出願ＥＰ０ ７１２ ９３１号は、２種のマウス抗ヒトＩＬ−１８ ｍＡｂ、すなわちＨ１（ＩｇＧ１）及びＨ２（ＩｇＭ）を開示している。ウエスタンブロット分析によって示されているように、両方のｍＡｂは膜に結合したヒトＩＬ−１８と反応するが、膜に結合したヒトＩＬ−１２とは反応しない。ヒトＩＬ−１８を精製するためにイムノアフィニティークロマトグラフィープロトコールにおいてＨ１を使用し、そしてヒトＩＬ−１８を測定するためにＥＬＩＳＡにおいてＨ１を使用する。ヒトＩＬ−１８を測定するためにラジオイムノアッセイにおいてＨ２を使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
中和ＩＬ−１８抗体は、ヒトにおける自己免疫疾患及び関連する症候の緩和に有用である可能性がある。従って、当該技術分野においては、Ｔｈ１細胞分化及び増殖を低減し、それゆえ自己免疫疾患及び関連する症候を低減する、高親和性ＩＬ−１８アンタゴニスト、例えばヒトインターロイキン１８に対する中和モノクローナル抗体が必要とされている。
【０００９】
本明細書全体で言及する参照文献は全て、明示的かつ全体的に参照により本明細書に組み入れられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．発明の概要
本発明により、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１１】
本発明により、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖の位置７１の残基が、前記ＣＤＲが由来するドナー抗体中に存在するその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１２】
当業者には明らかなとおり、「由来する」という用語は、それが物質の物理的起源であるという意味で、起源を明らかにするのみならず、その物質と構造的に同一であるもののその基準起源から生じたのではない物質も明示することを意図するものである。したがって、「ＣＤＲが由来するドナー抗体フレームワーク中に存在する」対応する残基は、かならずしもドナー抗体フレームワークから精製されたものである必要はない。同様に、「ドナー抗体」由来ＣＤＲは、かならずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
【００１３】
ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）、並びにアミノ酸の番号付けは、特に指摘しない限り、Kabatら、"Sequences of immunological interest", NIHに記載されているＫａｂａｔ定義に従う。
【００１４】
本発明の別の態様において、ヒトアクセプターフレームワークに移植されたドナー抗体由来ＣＤＲを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、抗インターロイキン−１８抗体が配列番号１、２、３、４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含み、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体フレームワーク中のその対応する位置に存在する残基と同一である、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様においては、配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様において、配列番号１、２及び３に示されるＣＤＲを有する重鎖と配列番号４、５及び６に示されるＣＤＲを有する軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖ＣＤＲが、ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを有するドナー抗体に由来する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様において、ドナー抗体由来ＣＤＲ及びヒト化抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該ドナー抗体が、２Ｃ１０又はそのフレームワーク変異体である（すなわち、２Ｃ１０と同じＣＤＲであるが、異なるフレームワークを含む。米国特許第６，７０６，４８７号を参照されたい）、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、
（ａ）ヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを有する重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有する軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
前記ヒト軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に由来するフレームワークを含み、かつ配列番号３８の位置７１がチロシンである、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様では、
（ａ）ヒトＩＬ−１８との特異的結合を可能にするＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）アクセプターフレームワークを含み、かつ配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有し、そして位置７１にチロシン残基を有する軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２０】
軽鎖のＣＤＲは、好ましくは、配列番号３５に示される配列内の、配列番号４、５及び６に示される配列のそれぞれの位置に対応するアクセプターフレームワーク内の位置に位置する。軽鎖及び／又は重鎖は、好ましくはヒト患者において非免疫原性のものである。
【００２１】
本発明の別の態様において、
（ａ）配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該ヒト化抗インターロイキン−１８抗体の該軽鎖アクセプターフレームワークが、配列番号３８に示される配列の変異体に由来するフレームワーク領域を含み、該変異体が位置７１にチロシンを含み、かつ該変異体が配列番号３８に示される配列を有するフレームワークと７５％以上の同一性を有する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。該変異体は、配列番号３８に示されるフレームワークと、好ましくは８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、より好ましくは８５％以上、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、最も好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含む。
【００２２】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）ヒト軽鎖の位置７１にフェニルアラニンを含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体がその軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１に芳香族アミノ酸を含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）軽鎖アクセプターフレームワークの位置７１に、部分（ａ）の芳香族アミノ酸とは異なる種類の芳香族アミノ酸を含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体が、位置７１に部分（ａ）の抗体に由来する芳香族アミノ酸を有する軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様では、３７℃において表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、好ましくは以下の第７．４．１節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関して３００ｐＭ以下の平衡定数（ＫＤ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様では、配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、かつ３７℃において表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、好ましくは以下の第７．４．１節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関して３００ｐＭ以下の平衡定数（ＫＤ）を示す、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２６】
好ましくは、３７℃において表面プラスモン共鳴（好ましくは以下の第７．４．２節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関する抗体の平衡定数（ＫＤ）は、９０ｐＭ未満である。平衡定数は、より好ましくは７０ｐＭ以下、よりさらに好ましくは６５ｐＭ、６０ｐＭ、５５ｐＭ、又は５０ｐＭ以下である。
【００２７】
本発明の別の態様において、３７℃において表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ、好ましくは以下の第７．４．２節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００機器及び条件を用いて）によって測定した場合のヒトＩＬ−１８の結合に関して０．０００２（１／秒）以上の解離定数又は解離速度（ｋｄ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲが重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の一個若しくは複数の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、及び任意により位置４５、８３、８４、８５の一個若しくは複数の（例えば全ての）残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、３９、４０、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、３６、３９、４０、７１、８９、９１、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３２】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３４】
本発明の別の態様において、
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様において、重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の２５℃での解離速度（ｋｄ）と、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の３７℃での解離速度（ｋｄ）との比が、１：５（又は１：５未満）であり、該抗体がドナー抗体由来ＣＤＲとヒトアクセプターフレームワークを含み、かつヒトアクセプターフレームワークの軽鎖の位置７１の残基が、そのドナー抗体のその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。解離速度は、好ましくは、以下の第７．４．２節に記載するＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００機器及び条件を用いて測定される。
【００３６】
本発明の別の態様において、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１からなる群から選択された重鎖と、配列番号１３、配列番号２９からなる群から選択された軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体が提供される。
【００３７】
特に本発明は、配列番号９の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号９の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体を提供する。
【００３８】
本発明はまた、配列番号１７の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号１７の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体を提供する。
【００３９】
また本発明は、配列番号２１の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号２１の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体を提供する。
【００４０】
本発明の別の態様において、本明細書において上述した抗インターロイキン−１８抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００４１】
本発明の別の態様において、治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の親和性が（ｂ）の親和性を超える場合、好ましくは（ａ）の親和性がステップ（ｂ）の親和性の２倍以上、より好ましくは４倍以上である場合に、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様において、治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の解離速度が（ｂ）の解離速度よりも遅い場合、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法が提供される。
【００４３】
「抗インターロイキン−１８」という用語は、本発明の抗体を参照する場合、ヒトインターロイキン−１８の生物学的活性を中和することが可能な抗体を意味する。しかしながら、そのような抗体が非ヒト霊長類（例えばアカゲザル及び／又はカニクイザル）インターロイキン−１８の生物学的活性をさらに中和する可能性があることを排除するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
さらに図面を参照しながら本発明を説明する。
【００４５】
４．ヒト化抗体
インタクトな非ヒト抗体をヒトの疾患又は障害の治療に使用することは、特に抗体を反復投与した際に、現在十分に立証されている潜在的な免疫原性の問題を引き起こす。すなわち、患者の免疫系はインタクトな非ヒト抗体を非自己と認識して、中和応答を開始する可能性がある。こうした問題を克服するために、完全にヒトの抗体（上記参照）の開発に加えて、長年にわたってさまざまな技法が開発されてきたが、こうした技法は、一般に、免疫した動物、たとえばマウス、ラット又はウサギから非ヒト抗体を得ることの相対的な容易さを維持する一方で、インタクトな治療用抗体における非ヒトアミノ酸配列の構成割合を減らすことを必要とする。概して、これを達成するために２つの手法が用いられてきた。第１はキメラ抗体であって、これは一般に、ヒト定常領域に融合された非ヒト（たとえば、マウスなどの齧歯類）可変領域を含む（Morrison (1984), PNAS, 81, 6851参照）。抗体の抗原結合部位は可変領域内に位置するので、キメラ抗体は、抗原に対するその結合親和性を維持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得しているため、上記のようなエフェクター機能を果たすことができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて作製される。従来の方法を用いて（たとえば、本発明の抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子、例としては上記の配列番号１、２、３、４、５及び６をコードするＤＮＡと、特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、抗体をコードするＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）を単離し、配列を決定する。ハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの典型的な供給源となる。キメラ抗体を発現することが望まれる場合には、軽鎖及び重鎖の全長成熟可変領域をコードする単離ｃＤＮＡを適当な発現ベクターに読み取り枠を合わせて挿入する。該発現ベクターは、特に、適当な免疫グロブリン定常領域（通常はヒト起源のもの）と、シグナル配列、停止コドン、プロモーター、ターミネーター、及び抗体の発現を達成するために必要な他のエレメントを含む。かかるベクターを、次に本来免疫グロブリンを産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞又は三重ローマ細胞といった宿主細胞にトランスフェクトして、抗体を合成させる。ＤＮＡは、ヒトＬ鎖及びＨ鎖のコード配列を、対応する非ヒト（たとえばマウス）Ｈ及びＬ定常領域の代わりに用いることによって、改変することができる。たとえば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)を参照されたい。
【００４６】
第２の手法は、可変領域をヒト化することによって抗体の非ヒト含量を減少させる、ヒト化抗体の作製に関する。ヒト化について２つの技術が広く支持されている。第１は、ＣＤＲグラフティングによるヒト化である。ＣＤＲは抗体のＮ末端近くにループを作り、そこで、フレームワーク領域によってもたらされるスキャフォールドに嵌め込まれた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主として、そのＣＤＲ表面のトポグラフィー及び化学的性質によって決まる。次いで、これらの特徴は、個別のＣＤＲのコンフォメーションによって、ＣＤＲの相対的配置によって、並びにＣＤＲを構成する残基の側鎖の性質及び配置によって決定される。免疫原性の大幅な低下は、非ヒト（たとえばマウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみを、好適なヒトのフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）及び定常領域上にグラフティングすることによって達成することができる（Jonesら、 (1986) Nature 321,522-525、及びVerhoeyen Mら、(1988) Science 239, 1534-1536を参照されたい）。しかしながら、ＣＤＲグラフティングは本質的に、抗原結合特性の完全な保持をもたらさない可能性があり、有意な抗原結合親和性を回復したいならば、ドナー抗体のフレームワーク残基（「復帰突然変異」と呼ばれることもある）の一部をヒト化分子内に保持する必要があることが、多くの場合、明らかになっている（Queen C ら、(1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, Mら、(1991) Nature 351, 501-502を参照されたい）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を用意するために、非ヒトドナー抗体に対して最大の配列相同性（典型的には６０％以上）を示すヒトＶ領域をデータベースから選択する。ヒトＦＲは、ヒトコンセンサス又は個別のヒト抗体のどちらからも選択することができる。必要ならば、ドナー抗体由来の重要残基を、ヒトアクセプターフレームワーク内に置換して入れて、ＣＤＲコンフォメーションを保存する。抗体のコンピューターモデリングを用いることができるが、それは、このような構造的に重要な残基を同定するのに役立つ。国際公開ＷＯ９９／４８５２３号を参照されたい。
【００４７】
別法として、ヒト化は、「veneering」のプロセスによって行うことができる。特異なヒト及びマウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域の統計分析によって、露出した残基の正確なパターンがヒトとマウスの抗体で異なること、並びにほとんどの個々の表面位置は少数の異なる残基に強い選択性があることが明らかになった（Padlan E.A.ら、(1991) Mol.Immunol.28, 489-498、及びPedersen J.T.ら、(1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照されたい）。したがって、そのフレームワーク領域内の、ヒト抗体に通常存在するものとは異なる、露出した残基を置き換えることによって、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることができる。タンパク質の抗原性は表面への接近可能性と相関しうるので、表面残基を置き換えることは、マウス可変領域をヒトの免疫系に「見えない」ようにするのに十分であると考えられる（Mark G.E.ら、(1994)、実験薬理学ハンドブック（Handbook of Experimental Pharmacology）第113号より：モノクローナル抗体の薬理学（The pharmacology of モノクローナル 抗体）、Springer-Verlag、105-134ページも参照されたい）。こうしたヒト化の手順は、抗体の表面だけを変更し、支持する残基はそのままになっているので、「veneering」と呼ばれる。さらに別の手法としては、ＷＯ０４／００６９５５号に記載されている方法、及びHumaneeringTM（Kalobios）のプロセスが挙げられる。この方法は、細菌発現系を使用して、ヒト生殖系と配列が近縁の抗体を産生する（Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, January 2007, San Diego, California）。別の最近のヒト化手法は、ヒトアクセプターフレームワークを、フレームワーク領域などの抗体の他の領域間の相同性よりもむしろ、ドナーマウス抗体ＣＤＲ領域とのヒトＣＤＲ領域の構造類似性に基づいて選択することを含む。このプロセスは、SuperhumanisationTMとしても知られる（Evogenix Inc.; Hwang ら (2005) Methods 36:35-42）。
【００４８】
従って本発明は、上の第３節に記載したヒト化抗体に関する。このようなヒト化抗体は、好ましくはＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４など）のヒト定常領域を含む。
【００４９】
別の実施形態において、上の第３節で記載したヒト化可変領域は、非ヒト定常領域（「逆キメラ（reverse chimera）」）、例えば非ヒト霊長類、ラット、マウス又はウサギのものなどと融合しうる。
【００５０】
当業者には明らかなように、配列番号３７及び３８に示されるアクセプターフレームワークは、それぞれＶＨ遺伝子及びＶκ遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのアミノ酸を構成する。これらはそれ自体がアクセプター抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲを含む。アクセプター抗体のＣＤＲを配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるドナーＣＤＲと置換し、そして得られる配列を好適なフレームワークの４つの配列（配列番号３９及び配列番号４０に示される配列など）と結合させて、完全な免疫グロブリン可変領域（配列番号１１及び配列番号１５に示されるものなど）を生成することは当業者の能力の範囲内である。
【００５１】
４．１．他の改変
抗体のＦｃ領域とさまざまなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用は、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられるが、このエフェクター機能には、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体結合、食作用、及び抗体の半減期／クリアランスが含まれる。所望のエフェクター特性に応じて、本発明の抗体のＦｃ領域のさまざまな改変を行うことができる。たとえば、本来なら溶解性の抗体を非溶解性にするＦｃ領域内の特異的変異が、欧州特許第０６２９ ２４０Ｂ１号及び同第０３０７ ４３４Ｂ２号に詳述されており、あるいは、抗体にサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを組み込んで、血清半減期を延ばすことができる。米国特許第５，７３９，２７７号を参照されたい。現在知られているヒトＦｃγ受容体には５つあり、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃＲγＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び新生児ＦｃＲｎである。Shieldsら、(2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604は、共通のＩｇＧ１残基のセットがすべてのＦｃγＲとの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、この共通のセットの外側にある別個の部位を利用することを明らかにした。一群のＩｇＧ１残基は、Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７及びＰｒｏ−２３９をアラニンに変えると、すべてのＦｃγＲへの結合を低下させた。これらはいずれもＩｇＧ ＣＨ２ドメインに存在し、ＣＨ１及びＣＨ２をつなぐヒンジ部の近くでクラスターを形成している。ＦｃγＲＩは、結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットのみを用いるが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、共通セットに加えて、別個の残基とも相互作用する。一部の残基の変更は、ＦｃγＲＩＩとの結合のみを低下させ（たとえば、Ａｒｇ−２９２）、又はＦｃγＲＩＩＩとの結合のみを低下させた（たとえば、Ｇｌｕ−２９３）。ある変異体は、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、他の受容体との結合には影響を与えなかった（たとえば、Ｓｅｒ−２６７Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩに対する結合は強化したが、ＦｃγＲＩＩＩとの結合には影響しなかった）。また他の変異体は、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩに対する結合の強化を示したが、他の受容体との結合は低下した（たとえば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩに対する結合を強化したが、ＦｃγＲＩＩとの結合は低下した）。ＦｃγＲＩＩＩａに関して、もっともよく結合するＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３及びＬｙｓ−３３４でのアラニン置換の組み合わせを有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランス及び組織にわたるトランスサイトーシスのどちらにも関与していると考えられる（Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 及びGhetieら、(2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると確定されたヒトＩｇＧ１残基には、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５がある。本発明は、半減期／クリアランス並びに／又はエフェクター機能（ＡＤＣＣ及び／若しくは補体溶解など）を改変するために、上述した残基の変化のいずれか１（又はそれ以上）を有する本発明の抗体にも関する。
【００５２】
他の改変には、本発明の抗体のグリコシル化変異体がある。抗体の定常領域内の保存された位置でのグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に重大な影響を及ぼすことが知られている。たとえば、Boydら、(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318を参照されたい。１又は複数の糖鎖を付加、置換、欠失又は修飾した、本発明の治療用抗体又はその抗原結合フラグメントのグリコシル化変異体が想定される。アスパラギン−Ｘ−セリン、又はアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの導入は、糖鎖を酵素的に連結することができる部位を作り出すので、それを用いて、抗体のグリコシル化を操作することができる。Rajuら、(2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いる再ガラクトシル化及び／又は再シアリル化により増加した。末端シアリル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を長くすると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、典型的には複数のグライコフォームの混合物として天然に産生される。こうした混合物は、抗体を真核生物、とりわけ哺乳動物細胞内で産生させたとき、特に明らかである。特定したグライコフォームを製造するために、さまざまな方法が開発されてきた。Zhangら、Science (2004), 303, 371、 Searsら、Science, (2001) 291, 2344、 Wackerら、(2002) Science, 298 1790、Davisら、(2002) Chem. Rev. 102, 579、Hangら、(2001) Acc. Chem. Res 34, 727を参照されたい。したがって、本発明は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの特定された数（たとえば７個以下、例として５個以下、たとえば２又は１個）のグライコフォームを含む、本明細書に記載の複数の治療用抗体（典型的にはモノクローナル抗体）（ＩｇＧ１アイソタイプ、たとえばＩｇＧ１とすることができる）に関する。
【００５３】
本発明のさらに他の実施形態には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンといった、非タンパク質性ポリマーと結合した本発明の治療用抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。タンパク質とＰＥＧとの結合は、タンパク質の半減期を長くするのと同時に、タンパク質の抗原性及び免疫原性を低下させるための確立された技術である。分子量及び形状（直鎖若しくは分枝）の異なるＰＥＧ付加の使用は、インタクト抗体、及びＦａｂ’フラグメントで検討されている。Koumenis I.L.ら、(2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95を参照されたい。
【００５４】
５．作製方法
本発明の抗体は、ヤギ（Pollockら、(1999), J. Immunol. Methods 231:147-157を参照されたい）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55を参照されたい）、マウス（Pollockら、前掲）、又は植物（Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204、Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606、Baez Jら、BioPharm (2000) 13: 50-54、Stoger Eら、(2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590を参照されたい）といったトランスジェニック生物内で産生することができる。抗体はまた、化学合成によっても作製することができる。しかしながら、本発明の抗体は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて作製される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、その後の宿主細胞におけるクローニング（増幅）又は発現のために、複製可能なベクター（プラスミドなど）に挿入する。特に宿主細胞がＣＨＯ又はＮＳＯである場合（下記を参照されたい）、１つの有用な発現系は、グルタミン酸シンテターゼ系（Lonza Biologicsが販売しているものなど）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ）によって、容易に単離され、配列決定される。使用可能なベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体（プラスミドがその典型的な具体例である）がある。一般にこうしたベクターは、発現を促進するために、軽鎖及び／又は重鎖ポリヌクレオチドに機能的に連結された、シグナル配列、複製起点、１つ若しくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列をさらに含有する。軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター内に挿入し、（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション又は形質導入によって）同一の宿主細胞に同時に又は連続的に導入することができるし、あるいは所望であれば、そのような導入の前に重鎖及び軽鎖をともに同一ベクター内に挿入してもよい。
【００５５】
遺伝子コードの縮重のため、本発明のポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドの代わりとなるポリヌクレオチドも利用可能であることは、当業者にはすぐにわかることである。
【００５６】
５．１．シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的な切断部位を有する、異種シグナル配列を含む融合タンパク質として作製することができる。シグナル配列は、宿主細胞によって認識されて、プロセシングされる必要がある。原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーとすることができる。酵母分泌のためには、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、又は酸ホスファターゼリーダーとすることができる。例えばＷＯ９０／１３６４６号を参照されたい。哺乳動物細胞系では、ウイルス分泌リーダー、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナル、並びに天然免疫グロブリンシグナル配列（ヒトＩｇ重鎖など）が利用できる。典型的には、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに、リーディングフレーム内で連結される。
【００５７】
５．２．複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、ｐＢＲ３２２がほとんどのグラム陰性細菌に適合し、２μプラスミドがほとんどの酵母に適合し、さらに、さまざまなウイルス由来のもの、たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ若しくはＢＰＶはほとんどの哺乳動物細胞に適している。一般に、複製起点の要素は、ベクターの増殖を大腸菌内で行う必要がない限り、組込み型哺乳動物発現ベクターには必要でない。しかしながら、ＳＶ４０ ｏｒｉは、初期プロモーターを含有しているので使用することができる。
【００５８】
５．３．選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素（たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート若しくはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、又は（ｂ）栄養要求性の欠乏を補完する、若しくは複合培地で利用できない栄養素を補充するタンパク質、あるいは（ｃ）その両方の組み合わせであるタンパク質をコードする。選択方式は、ベクターを含まない又はベクターを含む宿主細胞の増殖の停止を行いうる。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子による形質転換が成功した細胞は、たとえば共送達される選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために、生き残る。一つの例はＤＨＦＲ選択系であるが、この場合、形質転換体はＤＨＦＲ陰性宿主株において作出される（例えばPage and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68参照）。この系では、ＤＨＦＲ遺伝子が本発明の抗体ポリヌクレオチド配列と共送達されて、ヌクレオシド除去によりＤＨＦＲ陽性細胞が選択される。必要に応じて、ＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキサートも使用して、ＤＨＦＲ遺伝子増幅を示す形質転換体を選択する。ＤＨＦＲ遺伝子を本発明の抗体コード配列又はその機能的誘導体に機能的に連結することによって、ＤＨＦＲ遺伝子増幅が目的の所望抗体配列が同時に増幅されるようにする。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ／メトトレキサート選択に特に有用な細胞株であり、ＤＨＦＲ系を利用した宿主細胞の増幅及び選択方法は当技術分野で十分に確立されている（Kaufman R.J. ら、 J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621を参照のこと。概説については、Werner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M,”Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Augを参照のこと）。さらにもう一つの例は、グルタミン酸シンテターゼ発現系（Lonza Biologics）である。酵母での使用に適した選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcombら、Nature 282, 38, 1979を参照されたい。
【００５９】
５．４．プロモーター
本発明の抗体の発現に適したプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに、機能するように連結される。原核生物宿主のためのプロモーターには、ｐｒｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン及びハイブリッドプロモーター、たとえばＴａｃがある。酵母細胞での発現に適したプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ及びグルコキナーゼがある。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、及び窒素代謝又はマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。
【００６０】
哺乳動物細胞系における発現のためのプロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えばウイルスプロモーター、たとえば、ポリオーマ、鶏痘及びアデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及び初期若しくは後期シミアンウイルス４０、並びに非ウイルスプロモーター、例えばＥＦ−１α（Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322）が挙げられる。プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。
【００６１】
５．５．エンハンサーエレメント
必要に応じて、たとえば、高等真核生物での発現のために、さらなるエンハンサーエレメントを、上述したプロモーターの代わりに、又はそのプロモーター内に位置することが見出されているものと一緒に挿入することができる。適当な哺乳動物エンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオネイン、及びインスリン由来のエンハンサーエレメントが含まれる。あるいはまた、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー、又はマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座といった、真核細胞ウイルス起源のエンハンサーエレメントを使用してもよい（ＷＯ０４／００９８２３号を参照されたい）。このようなエンハンサーは典型的に、ベクター上で、プロモーターの上流の部位に位置するが、他の位置、例えば非翻訳領域内又はポリアデニル化シグナルの下流に位置してもよい。エンハンサーの選択及び位置決定は、発現に使用される宿主細胞との適切な適合性に基づく。
【００６２】
５．６．ポリアデニル化／終止
真核細胞系では、ポリアデニル化シグナルが、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに、機能しうるように連結される。こうしたシグナルは典型的には、オープンリーシングフレームの３’側に置かれる。哺乳動物系で、限定的でない例として、シグナルとしては、成長ホルモン、伸長因子１α、並びにウイルス（たとえば、ＳＶ４０）遺伝子、又はレトロウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のものが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの限定的でない例として、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子由来のシグナルが挙げられる。原核細胞系では、ポリアデニル化シグナルは一般的には必要とされず、その代わりにもっと短く明確な転写終結配列を用いるのが通例である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。
【００６３】
５．７．収量改善のための他の方法／エレメント
上記に加えて、収量改善のために用いることができる他の特徴としては、クロマチン再構成エレメント、イントロン及び宿主細胞特異的コドン改変が挙げられる。宿主細胞のコドンの偏りに適合させるために本発明の抗体のコドン利用法を改変して、転写及び／又は生成物収率を高めることができる（例えば、Hoekema A ら、Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24）。コドンの選択は、発現に使用される宿主との適切な適合性に基づいて行われる。
【００６４】
５．８．宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングし、又は発現させるのに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、又は高等真核細胞である。適当な原核細胞には、真正細菌、例を挙げると、腸内細菌科、例えばエシェリキア属（Escherichia）（例として大腸菌（E. coli）（たとえば、ATCC 31,446; 31,537; 27,325））、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）（例としてネズミチフス菌（Salmonella typhimurium））、セラチア属（Serratia）（例としてSerratia marcescens）、及び赤痢菌属（Shigella）など、並びにバシラス属（Bacilli）の枯草菌（B. subtilis）及びB. licheniformis（DD 266 710を参照されたい）など、シュードモナス属（Pseudomonas）の緑膿菌（P. aeruginosa）など、さらにストレプトミセス属（Streptomyces）がある。酵母宿主細胞のうち、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）（たとえば、ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500）、ヤロウィア属（yarrowia）（欧州特許第４０２，２２６号）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（欧州特許第１８３，０７０号、Pengら、J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照されたい)、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderma reesia）（欧州特許第２４４，２３４号）、ペニシリン属（Penicillin）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）並びにアスペルギルス属（Aspergillus）宿主、たとえばアスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）及びクロコウジカビ（A. niger）も想定される。
【００６５】
原核生物及び酵母宿主細胞は、具体的に本発明で想定はされるが、しかしながら、本発明の宿主細胞は、典型的には脊椎動物細胞である。適当な脊椎動物宿主細胞には、哺乳動物細胞、たとえば、ＣＯＳ−１（ATCC番号 CRL 1650)、ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651)、ヒト胚性腎細胞系２９３、ＰｅｒＣ６（Crucell）、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ATCC CRL.1632)、ＢＨＫ５７０（ATCC番号: CRL 10314)、２９３（ATCC番号CRL 1573）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１、ATCC番号：ＣＣＬ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系、たとえばＤＧ４４など（Urlaubら、前掲を参照されたい））、特に懸濁培養に適したＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ATCC CRL-1587）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎細胞（ATCC CCL 34）、ヒト肺細胞（ATCC CCL 75）、ＨｅｐＧ２及びミエローマ若しくはリンパ腫細胞、たとえばＮＳ０（米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が含まれる。
【００６６】
したがって、本発明の一実施形態において、本明細書に記載の治療用抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換された宿主細胞が提供される。こうした宿主細胞は、典型的には、軽鎖をコードする第１のベクター、及び重鎖をコードする第２のベクターを含む。
【００６７】
このような宿主細胞はまた、本発明の抗体の質、機能及び／又は収率を改変するためにさらに操作してもよいし、又は適合させてもよい。非限定的な例としては、特定の修飾（例えばグリコシル化）酵素及びタンパク質折りたたみシャペロンの発現が挙げられる。
【００６８】
５．９．細胞培養法
本発明の治療用抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の方法によって培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、振とうフラスコ、ローラーボトル、又は中空糸の系で培養することができるが、大規模生産のためには、特に懸濁培養用に撹拌槽型リアクター又はバッグリアクター（例えば、Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA）を使用することが好ましい。撹拌槽は、典型的には、たとえば、スパージャー、バッフル又は低剪断インペラを用いて、通気に適合させる。気泡塔及びエアリフトリアクターには、空気又は酸素気泡による直接通気を用いることができる。宿主細胞を無血清培地中で培養する場合、通気プロセスの結果として細胞が損傷するのを防ぐのに役立つ、プルロニックＦ−６８のような細胞保護物質を添加することが好ましい。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアを、足場依存性細胞系の増殖基質として使用することができるし、あるいは細胞を懸濁培養に適応させることもできる（こちらが一般的である）。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養は、バッチ、流加培養、反復バッチ処理（Drapeauら、(1994) cytotechnology 15: 103-109を参照されたい）、延長バッチ法又は潅流培養といった、さまざまな運転モードを利用することができる。組換えによって形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地のような血清含有培地で培養することができるが、こうした宿主細胞は、Keenら、(1995) Cytotechnology 17:153-163に記載の合成無血清培地、又はＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭ若しくはＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（Cambrex NJ, USA）といった市販の培地中で、必要ならば、グルコースなどのエネルギー源及び組換えインスリンのような合成増殖因子を添加して、培養することが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、その細胞が無血清条件での増殖に適応していることを必要とすると考えられる。１つの適応法は、こうした宿主細胞を血清含有培地で培養し、宿主が無血清条件に適応するように、培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（たとえば、Scharfenberg Kら、(1995)「動物細胞工学」（Animal Cell technology）より: 21世紀に向けた開発（Developments towards the 21st century）（Beuvery E.C.ら、編）、619-623ページ, Kluwer Academic publishersを参照されたい）。
【００６９】
培地中に分泌された本発明の抗体は、さまざまな技法を用いて培地から回収及び精製され、目的の用途に適した精製度を与えることができる。たとえば、本発明の治療用抗体をヒト患者の治療に使用するには、一般に還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％、若しくは９９％の純度が要求される（治療用抗体を含む粗製の培地と比較した場合）。第１の例では、細胞片を培地から、一般には、遠心によって除去し、次に、たとえば、精密濾過、限外濾過及び／又は深層濾過を用いて、上清の清澄化ステップを行う。あるいは、前もって遠心分離を行わずに、精密濾過、限外濾過又は深層濾過により抗体を回収してもよい。さまざまな他の技法、たとえば、透析及びゲル電気泳動、並びにクロマトグラフ法、例としてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティクロマトグラフィー（状況に応じて、ポリヒスチジンのようなアフィニティタグ標識システムを含む）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６号を参照されたい）が利用できる。一実施形態において、本発明の抗体は、さまざまな清澄化ステップの後、プロテインＡ若しくはＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでさらに、イオン交換及び／又はＨＡクロマトグラフィー、陰イオン若しくは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーといったクロマトグラフィーステップや、硫安沈澱を行う。一般に、さまざまなウイルス除去ステップも行われる（たとえば、ＤＶ−２０フィルターなどを用いたナノ濾過）。こうしたさまざまなステップの後、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ以上、たとえば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体を含む、精製（典型的にはモノクローナル）調製物が得られ、したがってその調製物が本発明の実施形態を構成する。超遠心分離によって１００ｍｇ／ｍｌ以上への濃縮を行うことができる。適切なことに、この調製物は本発明の抗体の凝集体を実質的に含まない。
【００７０】
細菌系は、抗体フラグメントの発現に特に適している。こうしたフラグメントは、細胞内又はペリプラズム内に局在する。当業者に公知の方法にしたがって、不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出し、リフォールディングして活性タンパク質を形成することができる。Sanchezら、(1999) J. Biotechnol. 72, 13-20及びCupit PMら、(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277を参照されたい。
【００７１】
６．医薬組成物
上記の本発明の抗体の精製調製物（特にモノクローナル調製物）を、上で概説したヒトの疾患及び障害の治療に使用するための医薬組成物に組み入れることができる。典型的には、こうした組成物は、許容される医薬慣習で知られ、必要とされる、薬学的に許容される（すなわち不活性）担体をさらに含む。たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 第16版、(1980), Mack Publishing Co.を参照されたい。このような担体の例としては、適当なバッファーでｐＨ５〜８の範囲内に緩衝化された、生理食塩水、リンガー溶液又はブドウ糖溶液のような滅菌担体がある。注射用（たとえば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内若しくは門脈内投与による）又は持続点滴用の医薬組成物は、好適には目に見える粒子状物質を含まず、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの抗体、典型的には５ｍｇ〜２５ｍｇの抗体を含有することができる。このような医薬組成物の製造方法は、当業者に周知である。一実施形態において、医薬組成物は、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの本発明の治療用抗体を、状況に応じて使用説明書と共に、単位投与剤形中に含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知の又は明白な方法にしたがって投与前に再構成するために凍結乾燥されていてもよい。本発明の実施形態がＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明の抗体を含む場合、クエン酸塩（たとえば、クエン酸ナトリウム）又はＥＤＴＡ又はヒスチジンといった銅のキレート剤を医薬組成物に添加して、このアイソタイプの抗体の、銅を介した分解の度合いを低下させることができる。欧州特許第０６１２２５１号を参照されたい。
【００７２】
本発明の抗体を投与するための有効量及び治療計画は、一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重及び健康状態、並びに治療すべき疾患又は障害といった要因に左右される。こうした要因は主治医の裁量の範囲内にある。適当な用量を選択する際の指針は、たとえばSmithら、(1977)「ヒトの診断及び治療における抗体」（Antibodies in human diagnosis and therapy）、Raven Press, New Yorkに見出すことができるが、概して１ｍｇ〜１０００ｍｇである。一実施形態において、ＲＡに罹患したヒト患者の治療用の投与計画は、おおよそ１００ｍｇ（すなわち５０ｍｇ〜２００ｍｇ）の本発明の抗体（又はその抗原結合フラグメント）を毎週又は２週間毎に皮下投与するものである。本発明の組成物はまた予防的に用いることもできる。
【００７３】
治療対象の疾患又は障害に応じて、治療上有効な量の本発明の抗体を含む医薬組成物を、有効量の別の薬剤、たとえば、抗炎症薬（たとえば、ＮＳＡＩＤ、メトトレキセート、、ブシラミン、チオリンゴ酸ナトリウム、又は１以上の抗ＴＮＦα治療、例えばＥｎｂｒｅｌＴＭ（エタネルセプト）、ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ（インフリキシマブ）、ＨｕｍｉｒａＴＭ（アダリムマブ）及び／若しくはＣＤＰ８７０）とともに、同時に、別々に、又は順次、使用することができる。本発明の抗体は、有効量の抗ＴＮＦ−α受容体抗体と組み合わせて用いることができる。Davis MWら、(2000) Ann Rheum Dis 59(Suppl 1): 41-43を参照されたい。他の実施形態において、本発明の抗体は、以下：ＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ（例えばＫｉｎｅｒｅｔＴＭ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＩＬ−６（Choyら、(2002) Ann.Rheum.Dis 61(suppl 1): 54参照）、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（Taylorら、(2001) Curr.Opin.Immunol.13: 611-616参照）、抗ＩＣＡＭ及び／又は抗ＣＤ４抗体に対して生起される薬剤、並びにＭＭＰファミリーのメンバー、例えばＭＭＰ−１、２、３及び／又は１３に対して生起される薬剤の有効量と組み合わせて用いることができる。本発明の抗体はまた、炎症性プロセスに関与することが知られる、細胞を剥離する薬剤と組み合わせて用いることができ、例えばＣＤ２０陽性Ｂ細胞について例えばＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（リツキシマブ）を用いる。本発明の抗体と組み合わせる他の治療法としては、抗血管新生療法、例えばインテグリンαｖβ３のアンタゴニスト、クリングル１〜５（Sumariwalla Pら、(2003), Arthritis Res Ther 5:R32-R39参照）、可溶性Ｆｌｔ−１（Miotlaら、(2000) Lab.Invest. 80:1195-1205参照）など；抗ＣＯＸ−２剤又は抗ＯＳＭ剤、例えば抗ＯＳＭ抗体（ＷＯ２００５／０９５４５７号参照。その全内容が本明細書中に具体的に組み入れられ、読者はそれを具体的に参照する）などが挙げられる。簡便には、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの部分の、そのような別の医薬の部分と一緒の、場合によっては使用説明書と一緒の、キット（キットオブパーツ）を含む医薬組成物もまた本発明は意図している。これらの組み合わせは、関節炎疾患／障害（関節リウマチなど）の治療に特に有用である。
【００７４】
７．臨床用途
本発明の抗体は、ＩＬ−１８が媒介する疾患、例えば自己免疫疾患などの治療的処置に用いることができる。具体的には、多発性硬化症、関節炎疾患（関節リウマチなど）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬が挙げられる。従って、本発明はさらに、ｈＩＬ−１８の中和に応答する疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、ＩＢＤ、乾癬など）に罹患したヒト患者の治療方法であって、本発明の抗体（特に配列番号９に示される配列を有する重鎖と配列番号１３に示される配列を有する軽鎖とを有する抗体）の治療有効量を該患者に投与することを含む方法を包含する。
【００７５】
また、上述した疾患／障害のいずれか１つ（又は複数）の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用も提供される。
【００７６】
【００７７】
７．例証
以下の実施例により、本発明の様々な態様を説明する。全ての一般的クローニング、ライゲーション、及び他の組換えＤＮＡ技術は、Maniatisら, Molecular cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory、又はSambrookら Molecular Cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratoryに一般的に教示されているように実施する。本明細書で使用するベクター系及び追加の分子生物学的方法は、その内容全体を参照により本明細書に組み込み、かつ読者が具体的に参照するＷＯ２００５／０９５４５７号に開示されている。
【００７８】
７．１．ハイブリドーマ可変領域のクローニング
親ラット抗体２Ｃ１０は、米国特許第６，７０６，４８７号に記載されている。読者は、具体的にはこの文書を参照されたい。上記公開されている、ヒトＩｇＧ１若しくはκＣ領域に結合しているラットＶ領域をベースとして、キメラ抗体２Ｃ１０ｃを設計した。重鎖及び軽鎖構築体に、一般的免疫グロブリンシグナル配列及び翻訳開始コドンＡＴＧを導入した。ＶＬドメインを形成し、既にヒトＣκ領域（配列番号３６）を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングできるように、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を設計した。ＶＨドメインを形成し、既にヒトγ１Ｃ領域（配列番号３４）を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングできるように、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を設計した。これにより、配列番号３３に示す公開済み配列から得た、２Ｃ１０のＶｈ領域のフレームワーク４に２個のアミノ酸変化がもたらされた（Ｋａｂａｔ残基１０７及び１０８）。
【００７９】
重複オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによってコード配列全体を構築し、上記発現ベクター中にクローニングした。配列を確認後、キメラ抗体をＣＨＯ細胞で発現させた。生成された抗体は、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースでのアフィニティクロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。その親ラット２Ｃ１０に匹敵する効力を実証するために、インビトロ結合アッセイで、２Ｃ１０キメラ抗体を評価した。これは、ＥＬＩＳＡでヒト若しくはアカゲザルＩＬ１８との結合のＥＣ５０値を測定することによって（図１６及び１７）、又はＫＧ−１バイオアッセイでＩＦＮ−γの放出を阻害することによって（図１５を参照されたい）行った。
【００８０】
７．２．ヒト化
７．２．１．軽鎖ヒト化手順
ラット２Ｃ１０可変軽鎖配列について、ラット２Ｃ１０可変軽鎖配列と６４％の同一性（ＣＤＲ含有）を有するヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した（Ｆ＿ＩＧＫＶ１Ｄ−１２−１、配列番号３８）。生殖系列Ｖ領域は、配列類似性（配列番号４０）に基づき、コンピューターで（in silico）好適なＦＲ４、この場合はＪ領域κ２ミニ遺伝子（Kabat Vol.II）と組み合わせた。３個のヒト化変異体は、配列比較、及び抗体機能への潜在的影響に基づき生成した。構築体Ｌ１は、上で選択したヒトアクセプターフレームワーク中にラットＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用）を線状に移植（straight graft）したものであった。構築体Ｌ２は、Ｌ１を基礎にして、残基７１に１個の追加の復帰突然変異を有した。構築体Ｌ３は、Ｌ２を基礎にして、残基４５、８３、８４及び８５に４個の追加の復帰突然変異を有した。表１を参照されたい。
【００８１】
【００８２】
７．２．２．重鎖のヒト化手順
ラット２Ｃ１０可変重鎖配列について、ラット２Ｃ１０可変重鎖と５９％の同一性（ＣＤＲ含有）を有する、ヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した（Ｆｐ＿ＩＧＨＶ１−ｆ＿２、配列番号３７）。生殖系列Ｖ領域は、配列類似性（配列番号３９）に基づき、コンピューターで好適なＦＲ４、この場合はＪＨ６ミニ遺伝子（Kabat Vol.II）と組み合わせた。このフレームワークに基づき、３個のヒト化可変重鎖変異体を設計した。Ｈ１は、残基２７、２８、２９及び９３に４個の追加の復帰突然変異を有するラットＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を使用）の移植体である。これにより、（Ｃｈｏｔｈｉａが定義するように）ＣＤＲの一部を構成しうる親（すなわちドナー）抗体のＣＤＲ１の直上流に、極めて珍しいアミノ酸配列を得ることができる。Ｈ２は、Ｈ１を基礎にして、残基３９及び４０に２個の追加の復帰突然変異を有した。次いで、Ｈ３は、Ｈ２を基礎にして、残基３６、７１、８９及び９１に別の４個の追加の復帰突然変異を有した。表２を参照されたい。
【００８３】
【００８４】
７．３．２Ｃ１０Ｃのヒト化
重複オリゴヌクレオチドの構築及びＰＣＲ増幅によって、ヒト化Ｖ領域を新規に合成した。哺乳動物発現ベクター中にクローニングするためにプライマーに制限部位を含め、分泌のためにヒト免疫グロブリンシグナル配列を含めた。ヒト化Ｖ領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩを使用し、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３として、ヒトγ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローン化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩを使用し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３として、ヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローン化した。これにより、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのヒト化重鎖変異体、及びヒトκアイソタイプのヒト化軽鎖変異体が得られた。
【００８５】
７．３．１．ヒト化重鎖抗体とヒト化軽鎖抗体の組合せの発現
四回の試験でＣＨＯＫ１細胞に一過性にトランスフェクトした。上清の抗体濃度をアッセイし、次いで２Ｃ１０ラット−ヒトキメラと比較することによって、その上清をインビトロ結合アッセイで使用した。
【００８６】
全９個の変異体の大規模な一過性発現は、各フラスコについて８ｍｌの培地（ＯｐｔｉＭＥＭ／ｇｌｕｔａｍａｘ／５％ＦＢＳ）中に含まれた、５１．４μｇの軽鎖プラスミド及び８．６μｇの重鎖プラスミドと、２４０μｇのトランスフェクション脂質（この脂質は、ＷＯ２００６／０５３７８３号、実施例１３に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に組み込む）とを混合し、２個のほぼコンフルエントなＣＨＯＫ１細胞のＴ１７５フラスコに、この混合物を通常の組織培養条件下、７２時間添加することによって実施した。シェーカーフラスコを使用して、ポリクローナルＣＨＯ細胞系でも抗体をｍｇ量で発現させ、ＦＰＬＣ及びプロテインＡを使用して精製した。
【００８７】
７．４．インビトロ結合アッセイ
７．４．１．Ｂｉａｃｏｒｅ分析
ヒト化２Ｃ１０抗体のＢｉａｃｏｒｅＴＭ動態分析は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機により、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）中でその抗体のプロテインＡ捕捉を使用し実施した。簡単に説明すると、製造業者が推奨するプロトコルを使用し、一級アミン結合によってＣＭ５チップにプロテインＡをおよそ２０００〜４０００共鳴単位（ＲＵ）の密度で固定した。次いで、プロテインＡ表面にヒト化抗体を流し、安定化期間後およそ２００〜５００ＲＵのレベルで捕捉させ、捕捉した抗体表面に（ヒト若しくはアカゲザルの）ＩＬ１８を所定の濃度で流し、結合センサーグラムを得た。酸性溶出条件を使用して再生することにより、捕捉した抗体はプロテインＡ表面から全て除去され、表面の結合能が著しく低減することはなかった。全ての曲線は、ＩＬ１８に代わる緩衝液の注入に対して二重に基準を取り、ＢｉａＥｖａｌ ４．１で全体適合パラメーターを使用してデータを１：１結合モデルに適合させた。同じプロテインＡ捕捉法を使用して解離速度ランキング実験を準備したが、１種類のＩＬ１８濃度（１０ｎＭ）のみを使用した。データは、動態分析の結合モデルと同じ結合モデルを使用し適合させたが、解離速度に１種類の検体濃度のみを使用したことが報告されているので、この値は、正確な動態測定を得るというよりはむしろランキングに有用であり、どの抗体をさらに調査するかの選択法として使用した。
【００８８】
最初の２５℃での結果では、構築体は全て、ラット２Ｃ１０親抗体としてヒトＩＬ１８と類似する結合親和性を有することが示された。しかし、３７℃で解離速度ランキング実験を実施したとき、Ｌ１構築体は解離速度に上昇が見られ、Ｌ２及びＬ３構築体と比較して不首尾な結果が示された（表３ａ及び３ｂ）。
【００８９】
【００９０】
Ｌ１構築体は、アカゲザルＩＬ１８との結合親和性の点で、３７℃で不首尾な結果を示したのと同様に、２５℃でも最低の結果を示した（表４ａ）。これらの観察に基づき、３７℃でのヒトＩＬ１８及びアカゲザルＩＬ１８との結合について、選択した抗体をより詳細に調査した。表４ｂに示すヒトＩＬ−１８のデータは、６回の別個の測定の平均（及び標準偏差）である。アカゲザルＩＬ−１８のデータは、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３については２回の実験の平均及び標準偏差を示し、Ｈ３Ｌ２及びＨ３Ｌ３のデータは１回の実験から得たものである。このデータの比較的高い標準偏差は、おそらく３７℃でこの実験を実施した結果である。
【００９１】
Ｌ１とＬ２構築体との差が、軽鎖の位置７１でのチロシンの復帰突然変異によるフェニルアラニンの置換であることを考慮すると、Ｌ１構築体が、相対的に劣る結果を示した事実は驚くべきことである。チロシンとフェニルアラニンはもちろん芳香族アミノ酸であり、従ってフレームワーク構造のそのような些細な変化によって、３７℃でＢｉａｃｏｒｅＴＭ系で観察された（結合親和性の点で）顕著な結果が生じたことは予想外であった（しかし、２５℃では観察されなかった）。
【００９２】
【００９３】
変異体Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、及びＨ１Ｌ３を選択して、以下第７．４．２節でさらに分析した。
【００９４】
７．４．２．Ｂｉａｃｏｒｅ分析Ｔ１００のデータ
Ｔ１００ ＢｉａｃｏｒｅＴＭ機を使用してさらにいくつかの変異体抗体の特性決定を実施した。この機器は、高温での緩衝効果を最小化する直列ガス抜き装置（inline degasser）を使用することによって、高温での感受性、温度制御性、及び基線安定性の点で、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００よりも優れている。また、自動データ分析など、高度なソフトウェアも提供する。
【００９５】
方法は、上の第７．４．１節で使用した方法と基本的に同じであり、一級アミン結合によってプロテインＡをＣＭ５チップに２０００〜６０００ＲＵの密度で固定した。ＨＢＳ−ＥＰ（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）で試験を実施した。抗ＩＬ１８抗体を１００〜５００ＲＵの密度で捕捉させ、ヒトＩＬ１８を１６〜０．０６２５ｎＭの濃度でこの捕捉した表面に流し、０ｎＭ濃度（すなわち、緩衝液は捕捉した抗体の注入のみ）を二重基準に使用した。各ＩＬ１８注入後の再生は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の注入を２回を使用する、穏やかな酸性溶出により行なった。この再生ステップにより、プロテインＡ表面から、捕捉された抗体を除去した（従ってそれに結合するいかなるＩＬ１８も除去した）。再生しても、続く抗体パルスと結合するプロテインＡ表面の能力は大きく変化することなく、次の捕捉事象を行うことができた。得られた結合曲線は、１：１結合モデルを使用するＴ１００機に本来備わる分析ソフトウェアを用いて分析した。示した温度で実験を実施した。
【００９６】
１５℃、２０℃、２５℃、３２℃及び３７℃でのＨ１Ｌ１及びＨ１Ｌ２の結合分析
様々な温度で上記方法を使用して実験を実施した。図１は、温度の結合速度（on-rate）（ｋａ）に対する影響を示し、図２は解離速度（ｋｄ）に対する影響、そして図３は平衡定数（ＫＤ）に対する影響を示す。表５は、これらの図を作成するために使用した動態値の詳細である。
【００９７】
【００９８】
データは、試験した２個の抗体の結合速度が、試験した温度範囲にわたり類似することを示し、Ｈ１Ｌ２の結合速度の方が速い場合は、３７℃での最終値まで、Ｈ１Ｌ２の結合速度の方が一般的に速い。しかし、解離速度に目を向けた場合、より大きな差異が見られ、１５℃、２０℃、２５℃では２個の抗体の解離速度は類似するが、３２℃及び３７℃で差異を見せ始め、Ｈ１Ｌ１の解離速度の方が速くなる。これらの変化は、全体的平衡定数（それはｋｄ／ｋａの関数である）に反映され、Ｈ１Ｌ１とＨ１Ｌ２との間の差異は、解離速度（ｋｄ）によって定義した、主として抗体／ＩＬ１８複合体の安定性であることを示している。
【００９９】
２５℃及び３７℃でのＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ３、及びキメラ２Ｃ１０の結合分析
上記のように実験を実施した。表６は、得られた動態パラメーターの詳細である。データから、２５℃及び３７℃の平衡定数ＫＤによって定義した結合という点で、Ｈ１Ｌ２はＨ１Ｌ１よりも良好な抗体であることが示されるが、動態パラメーターは、２５℃ではＨ１Ｌ２がＨ１Ｌ１よりも結合速度（ｋａ）が良好であることを示している。３７℃では、立場は逆転し、このことは、３７℃で見られるＨ１Ｌ２による優れた結合が、むしろ解離速度（ｋｄ）によることを示し、Ｌ２とＬ１を区別する変異によって、ＩＬ１８−抗体複合体の高温での安定性が増大することを示している。
【０１００】
【０１０１】
データは、いくつかの別々のデータセット（ｎ）の平均であり、平均及び標準偏差（括弧内に標準偏差）を示す。５つの異なる温度での分析から得られたＨ１Ｌ１及びＨ１Ｌ２の２５℃と３７℃での実験の値が、このデータセットに含まれている。
【０１０２】
７．４．３．ＩＬ１８結合ＥＬＩＳＡにおける２Ｃ１０ｃヒト化変異体の評価
精製抗体調製物の様々なバッチを使用して全９個のヒト化変異体のＥＬＩＳＡを少なくとも６回実施した。図４Ａ〜４Ｃには、表７に示すＥＣ５０値ランキングを作成した、１回の実験の代表的データを示す。２．５μｇ／ｍｌの１６Ｄ１０（非中和マウスモノクローナル抗体）を使用し、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートにヒトＩＬ−１８を固定して、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８を捕捉させた。様々な希釈率で抗ＩＬ−１８ヒト化抗体を加えた。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma A0170）を使用して、結合したヒト化抗体を検出した。
【０１０３】
【０１０４】
全ての変異体の効力は、２Ｃ１０キメラに非常に近似しているように見え、このことは、ヒト化による効力の損失はほとんどないことを示している。これらのアッセイを数回反復して得られたＥＣ５０値では、変異体ランキングは得られなかったが、ＥＬＩＳＡ単独ではこれらの変異体を明確に区別することはできなかった（表７及び図４Ａ〜４Ｃを参照）。ＢｉａｃｏｒｅＴＭを使用して、変異体をある程度区別することができ（第７．４．１節及び第７．４．２節）、それによってわずか４個の変異体がもたらされ、それらをヒトＩＬ１８及びアカゲザルＩＬ１８を使用する数回の独立した反復実験でより詳しく試験した（表８、図５［ヒト］及び図６［アカゲザル］）。
【０１０５】
【０１０６】
７．４．４．ＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡにおける２Ｃ１０ヒト化Ｈ１変異体の評価
Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３という３個のヒト化Ｈ１変異体を用いてＥＬＩＳＡを実施し、室温及び３７℃において、ヒト血清及びブロッキング溶液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ０．０５％ＴＷＥＥＮ（ｗ／ｖ））中でのヒトＩＬ−１８結合を評価した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートにヒト化抗体変異体を２．５μｇ／ｍｌで固定した。５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８の捕捉は、室温又は３７℃で、ヒト血清又はブロック溶液中で実施した。抗ＩＬ−１８マウスモノクローナル抗体１６Ｄ１０を加えた。結合したマウス抗体は、抗マウスκペルオキシダーゼコンジュゲート（Serotec MCA 1291P）を使用して検出した。研究データから得られた代表的ＥＣ５０値を表９に示す。
【０１０７】
【０１０８】
このアッセイでは、ヒトＩＬ−１８結合ステップを実施する温度を室温から３７℃へ変化させても、３個のヒト化Ｈ１変異体の効力は影響を受けない。ヒト血清中に抗体が存在すると、低い結合シグナルが観察される。
【０１０９】
７．４．５．３７℃でのヒト化Ｈ１変異体抗体の安定性評価
Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３という３個のヒト化Ｈ１変異体の保存安定性は、ヒト血清及びリン酸緩衝食塩水中、３７℃で１４日間にわたって評価した。抗体を５０μｇ／ｍｌに希釈し、安定性は、３７℃で０、１、４、６、８及び１４日間というインキュベーション時間後に、ＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡによって評価した。ＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡについては、１６Ｄ１０（非中和マウスモノクローナル抗体）をＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定して、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８を捕捉した。３７℃での経時インキュベーションの種々の時点でサンプリングした抗ＩＬ−１８ヒト化抗体を加えた。結合したヒト化抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して検出した。
【０１１０】
このアッセイ型式では、３７℃という温度に、０、１、４、６、８及び１４日間という長時間曝露を行なっても、ヒトＩＬ−１８に結合するその能力に基づく、ヒト化Ｈ１抗体変異体の結合効力に影響はなかった。
【０１１１】
７．５．滑液存在下でのＨ１Ｌ２とヒトＩＬ１８との結合
５０％ヒト滑液に５００ｎｇ／ｍｌ〜０ｎｇ／ｍｌの範囲の組換えヒトＩＬ１８を添加しＥＬＩＳＡを実施した。次いで、Ｈ１Ｌ２抗体をコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc）のウェルに、ＩＬ−１８を含むこの溶液をアプライした。次いで、ビオチン化した抗ＩＬ−１８抗体（Ｄ０４５−６, MBL）及びストレプトアビジン−ＨＲＰにより、結合したＩＬ−１８を検出した。組換えヒトＩＬ１８を含む５０％滑液（ＳＦ）を滴定すると、最大半値のほんのわずかなシフトが見られただけで、ヒト組換えＩＬ−１８を含む緩衝液を滴定したものと、ほぼ同じ曲線が生成された。図７を参照されたい。これにより、抗体が治療設定で遭遇する結合環境により類似性が高い５０％ヒトＳＦの存在下でさえ、ｈＩＬ−１８に結合する抗体能力が実証されている。
７．５．１．ＩＬ１８結合タンパク質（ＩＬ１８ｂｐ）存在下でのＩＬ１８に対する結合
ＢｉａｃｏｒｅＴＭ技術（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００）及びＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＩＬ１８ｂｐの存在下でもＨ１Ｌ２が依然としてヒトＩＬ１８と結合できるかどうかを判定した。ＩＬ１８ｂｐは、ＩＬ１８に対して高親和性を有し、ＩＬ−１８機能の天然阻害薬として働く（図８、図９Ａ及び図９Ｂ、表１０及び表１１）。
【０１１２】
Ｂｉａｃｏｒｅによる分析
簡単に説明すると、一級アミン結合によってＣＭ５チップにプロテインＡを表面がおよそ４０００共鳴単位（ＲＵ）の密度になるように固定した。次いで、組換えＦｃ−ＩＬ１８結合タンパク質（R&D Systems）を濃度３μｇ／ｍｌ、流速１０μｌ／分で１分間流し、これにより、およそ１４００ＲＵのＩＬ１８結合タンパク質が捕捉された。次いで、捕捉したＩＬ１８結合タンパク質表面に、ＩＬ１８を濃度３０ｎＭ、流速１０μｌ／分で５分間流した。この後、ＩＬ１８結合タンパク質／ＩＬ１８表面に、濃度１０ｎＭのラット２Ｃ１０親抗体を流速３０μｌ／分で３分間流した。２Ｃ１０抗体によって認識されるＩＬ１８上のエピトープが、ＩＬ１８結合タンパク質との相互作用部位に干渉するならば、いかなる結合シグナルも見られないはずである。図１０は、２Ｃ１０がｈＩＬ−１８と結合すること、続いてこのｈＩＬ−１８がｈＩＬ−１８ＢＰによって捕捉されたことを実証し、このことは、２Ｃ１０とｈＩＬ−１８ＢＰの結合部位が重複しないことを示している。
【０１１３】
【０１１４】
ＥＬＩＳＡによる分析
ヒト化Ｈ１Ｌ２若しくはラット２Ｃ１０ ＭＡｂと、ヒトＩＬ１８が結合した捕捉ＩＬ１８ｂｐとの結合を、直接結合ＥＬＩＳＡで試験したが、その際、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに、組換えヒトＩＬ１８ｂｐ−Ｆｃ融合タンパク質（R&D Systems #119-BP）を０．５μｇ／ｍｌでコーティングした。組換えヒトＩＬ１８（社内試薬）を１００ｎｇ／ｍｌでブロッキング緩衝液（１％ｗ／ｖＢＳＡ含有ＰＢＳ）に加えた。精製した抗体を０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの濃度範囲で加えた。抗ヒトκ軽鎖特異的ＨＲＰコンジュゲート（Sigma）若しくは抗ラットＩｇＧ ＨＲＰにより結合した抗体を検出した。図１８Ａ及び１８Ｂに、得られた結果を示す。
【０１１５】
７．６．インビトロバイオアッセイ
７．６．１．ＫＧ−１細胞系における、ＩＬ１８の刺激によるＩＦＮ−γの放出を中和する、ヒト化構築体の活性
このアッセイでは、ＩＬ−１８特異的抗体の中和活性を計測するが、アッセイはＫＧ−１細胞におけるＩＬ−１８を媒介するＩＦＮγの誘導に基づく。ＫＧ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４６）は、機能性ＩＬ−１８受容体を構成的に発現し、従って外来性ＩＬ−１８刺激に応答するヒト骨髄単球細胞系である。
【０１１６】
全９個のヒト化変異体について、ＫＧ−１細胞におおけるヒトＩＬ１８に刺激されたＩＦＮ−γの放出を阻害するその能力を評価した（表１２及び図１１）。
【０１１７】
【０１１８】
ＢｉａｃｏｒｅＴＭ分析に基づき、組換えヒトＩＬ１８及びアカゲザルＩＬ１８に最も高い親和性示した、４個の好ましいヒト化変異体で、少なくともさらに６回の反復実験を実施した。図８に、４個の好ましいヒト化変異体及びＨ１Ｌ１の代表的結果を示し、表１３に、ＣＨＯｅ１ａ細胞由来の同じタンパク質バッチ物質によって全て実施した、これらのアッセイの結果の概要を示す。
【０１１９】
【０１２０】
Ｈ１Ｌ１を他のヒト化変異体と比較した事例では、試験し、かつ２Ｃ１０親ＭＡｂとも比較した、その他の４個のヒト化構築体と比べて、Ｈ１Ｌ１は低い効力を示した。
【０１２１】
４個の好ましいモノクローナル抗体を用いてさらなる分析を実施したが、ＫＧ−１細胞：２Ｃ１０、並びに２Ｃ１０から得られたヒト化変異体（Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３）により、ＩＬ−１８に刺激されたＩＮＦγの放出を阻害する能力について、それらのモノクローナル抗体を比較した。９６ウェルプレートで、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１８、及びＩＬ１８に特異的な種々の濃度の抗体（２μｇ／ｍｌ〜７．８ｎｇ／ｍｌの範囲、二倍希釈）、又は陰性アイソタイプ対照（Ｓｙｎａｇｉｓ、抗ＲＳＶ抗体）を３７℃及び５％ＣＯ２下で１時間インキュベートし、続いてウェル当たり３．１０５個のＫＧ−１細胞を添加することによって、ＫＧ−１バイオアッセイを実施した。最後に、それらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で２０〜２４時間インキュベートした。上清を回収し、市販のヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡキット（Biosource AHC4432；AHC4539）を使用してＩＦＮγの産生を定量した。
【０１２２】
３回の実験を実施した。ＩＬ−１８に刺激されたＩＦＮγの産生の阻害結果を陰性対照に対して正規化した。統計分析は、あらゆるＳｙｎａｇｉｓ応答の調整後、各実験について各ｍＡｂのＩＣ５０推定値を得ることを目的とした。次いで、ＩＣ５０推定値を統計学的に分析して、９５％信頼区間（すなわち統計学的に信頼できる範囲）で各ｍＡｂの全体的ＩＣ５０推定値を生成した。最後に、ダネット検定を使用して２Ｃ１０に戻って各ヒト化変異体を比較した。
【０１２３】
図１２に、代表的実験を示す。表１４及び図１３に、９５％信頼区間での各モノクローナル抗体の全体的ＩＣ５０推定値、及びｐ値と信頼区間と共にラット２Ｃ１０の変化率（％）を示す。
【０１２４】
【０１２５】
Ｈ１Ｌ１は、２Ｃ１０よりも統計上有意に効力が低い（ｐ＜０．００１）。
【０１２６】
その他のヒト化変異体は、２Ｃ１０と有意には異ならないが、Ｈ１Ｌ３対２Ｃ１０の比較が境界線である。
【０１２７】
７．６．２．刺激したヒトＰＢＭＣ中のＩＦＮ−γ放出の中和におけるＨ１Ｌ２の活性
３ドナー由来のヒトＰＢＭＣは、組換えヒトＩＬ１８及び抗ＣＤ３抗体で刺激し、４個の選択したヒト化抗体変異体の希釈系列を加えた作用を研究した。比較するために、それぞれにドナー親２Ｃ１０抗体及びＩＬ１８ｂｐを含めた。３ドナーのうち２ドナーでは、ＩＬ１８及び抗ＣＤ３刺激は失敗し、ＩＦＮ−γは検出されなかった。残りのドナーについては、結果は低濃度では非常に変化したが、ＩＬ１８が誘発するＩＦＮ−γの産生の完全阻害は、ヒト化変異体を含む様々な抗ＩＬ１８抗体を添加することによって達成することができた。図１４を参照されたい。
【０１２８】
さらにＬＰＳが刺激するヒトＰＢＭＣにより実施した実験では、ＩＬ１８を産生し、付随するＩＦＮγの放出が生じた。濃度依存的にＬＰＳによってＩＦＮγの産生が誘発され、１μｇ／ｍｌの一定濃度で２Ｃ１０親モノクローナル抗体を添加すると、この刺激が完全に阻害され、このことは、その効果にはＩＬ１８が介在するということ、及び内在性ＩＬ１８は中和できるということ（データ非掲示）を示している。これは、全血でも実証できたが、２Ｃ１０による阻害効果は、用量依存性ではあったが、あまり明白ではなかった（データ非掲示）。図９に、３個の独立したドナーによる実験、並びに親ラットモノクローナル２Ｃ１０、Ｈ１Ｌ２、及びＩＬ１８ｂｐによる阻害の結果を示す。ドナー１及び３は同様の結果を示したが、ドナー２はＬＰＳによる刺激でＩＦＮγを放出しなかった（図示せず）。ＩＬ１８が媒介するＩＦＮγ放出は、１０％若しくは２５％のヒト血清の存在下、１μｇ／ｍｌを超える抗体若しくはＩＬ１８ｂｐを加えることによって、完全に阻害することができる。阻害は、１０ｎｇ／ｍｌ以上で既に観察可能であり、１０％若しくは２５％のヒト血清の存在下でのこの阻害のＩＣ５０値を表１１に示す。
【０１２９】
【０１３０】
７．６．３．ＩＬ１８オルソログとの結合の概要
ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ、そしてさらにＫＧ−１細胞バイオアッセイを使用し、抗体と他の種由来のＩＬ１８との結合を検査した。これは、当初、アカゲザル／カニクイザルＩＬ１８について親２Ｃ１０及びキメラ２Ｃ１０ｃを使用し実施したが、いくつかのヒト化変異体で繰り返した。Ｂｉａｃｏｒｅ及びＥＬＩＳＡを使用し、ブタ、マウス及びラットＩＬ１８との結合について親２Ｃ１０を試験し、４個の最も優れたヒト化変異体をアカゲザル／カニクイザル、及びイヌのＩＬ１８との結合について試験した。ＫＧ−１バイオアッセイは、アカゲザル／カニクイザルのＩＬ１８、並びに３個のモノクローナル抗体、２Ｃ１０キメラ、及びヒト化変異体の代表であるＨ３Ｌ３で実施した。全てのヒト化変異体の類似性を考慮すると、これは、Ｈ１Ｌ２を含めて生成された他の変異体の代表である可能性が高い（表１５、図８を参照）。
【０１３１】
【０１３２】
７．７．ＩＬ１８抗体の円二色性及び熱変性試験
円二色性（ＣＤ）試験を使用して、温度、特に２５℃〜３７℃の関数として、ＩＬ１８抗体の二次構造変化を試験した。これら同じ抗体の熱変性試験を行って、それらの熱安定性と融解温度（Ｔｍ）を測定した。
【０１３３】
ＣＤ方法：ＣＤスペクトルは、０．５ｎｍステップ及びバンド幅１ｎｍで１８０ｎｍ〜２８０ｎｍの走査を行なうApplied Photophysics Chirascan分光計で取得した。各点ごとの取得時間は５秒であった。サンプルをＰＢＳで約０．２ｍｇ／ｍｌ希釈し、１ｍｍ光路長（pathlength）セルに入れた。各タンパク質のスペクトルは、４℃、２５℃及び３７℃に設定した恒温槽で取得した。サンプルの実際の温度は、セル内の液体中に置いたプローブによって測定したが、設定温度の約３℃以内であった。
【０１３４】
Ｔｍ方法：Sypro orangeを１：１０００で入れたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で、全てのタンパク質を０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。Bioneer Exicycler機器を使用し、０．５℃間隔毎に、６２０ｎｍ（励起４９０ｎｍ）における蛍光発光を測定したが、サンプル温度は各温度点で１０秒待機して１０℃〜９５℃に勾配をつけた。変性曲線は、Ｇｒａｆｉｔを使用して標準的融解等温線に適合させた。
【０１３５】
予想通り、全４個の抗体のＣＤスペクトルの形状比較から、それらの構造が高度にβシート状であり、本質的に同じ構造であることが示された。４℃〜３７℃の温度範囲では、３個の抗体：
Ｈ１Ｌ１
Ｈ１Ｌ２
Ｈ１Ｌ３
は、ＣＤによって判明した通り、その二次構造において有意な変化は示さなかった。しかし、２Ｃ１０抗体キメラは、この温度範囲で構造にわずかな減少が見られた。これは、下表１６に示す熱安定性傾向に一致する。
【０１３６】
【０１３７】
Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２及びＨ１Ｌ３は、体温ではいかなる変性の徴候も見せず、３７℃をはるかに超えても明らかに安定している。従って、熱安定性のその差異が、正常な身体及び周囲温度で、何らかの示差的利点を付与する可能性は低い。
【０１３８】
配列
配列番号1
GYYFH
配列番号2
RIDPEDDSTKYAERFKD
配列番号3
WRIYRDSSGRPFYVMDA
配列番号4
LASEDIYTYLT
配列番号5
GANKLQD
配列番号6
LQGSKFPLT
配列番号7
MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
配列番号8
ATGGCTGCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTATCAGTCATAAGAAATTTGAATGACCAAGTTCTCTTCATTGACCAAGGAAATCGGCCTCTATTTGAAGATATGACTGATTCTGACTGTAGAGATAATGCACCCCGGACCATATTTATTATAAGTATGTATAAAGATAGCCAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGAAGTGTGAGAAAATTTCAACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATCAAGGATACAAAAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTCCCAGGACATGATAATAAGATGCAATTTGAATCTTCATCATACGAAGGATACTTTCTAGCTTGTGAAAAAGAGAGAGACCTTTTTAAACTCATTTTGAAAAAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTCAAAACGAAGACTAG
配列番号9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号10
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGTGTCCGGCGAGATCAGCACCGGCTACTACTTCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGACAGCACCAAGTACGCCGAGCGGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTACCACCTGGCGGATCTACAGAGACAGCAGCGGCAGACCCTTCTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA
配列番号11
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSS
配列番号12
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGTGTCCGGCGAGATCAGCACCGGCTACTACTTCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGACAGCACCAAGTACGCCGAGCGGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTACCACCTGGCGGATCTACAGAGACAGCAGCGGCAGACCCTTCTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
配列番号13
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号14
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCGAGGACATCTACACCTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAACAAGCTGCAGGACGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCAGCAAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
配列番号15
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIK
配列番号16
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCGAGGACATCTACACCTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAACAAGCTGCAGGACGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCAGCAAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
配列番号17
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号18
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTGGGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
配列番号19
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSS
配列番号20
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTGGGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号21
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号22
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTTTGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGCAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
配列番号23
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSS
配列番号24
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTTTGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGCAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号25
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号26
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列番号27
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIK
配列番号28
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号29
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEGDYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号30
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGAAGGGGATTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号31
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEGDYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIK
配列番号32
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGAAGGGGATTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号33
EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGQGLEWIGRIDPEDDSTKYAERFKDRATLTAQTSSNTAYLNLSSLTSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号34
GAGGTCCAGCTACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGACCTGGGACCTCTGTGAAGTTATCTTGCAAAGTTTCTGGCGAAATAAGTACAGGATACTATTTCCACTTTGTGAGGCGAAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATAGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGGGCGACGCTCACTGCACAAACATCCTCCAACACAGCCTACCTGAACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACACTGCAACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
配列番号35
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEDIYTYLTWYQQKPGKSPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKISGIQPEDEGDYFCLQGSKFPLTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号36
GACATTCAAATGACCCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCTCCATCGAATGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGCACACAGTATTCTCTCAAGATCAGCGGCATACAACCTGAAGATGAAGGGGATTATTTCTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列番号37
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
配列番号38
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP
配列番号39
WGQGTLVTVSS
配列番号40
FGQGTKLEIK
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】Ｈ１Ｌ１及びＨ１Ｌ２の結合速度（ｋａ）に対する温度の影響を示す。
【図２】解離速度（ｋｄ）に対する温度の影響を示す。
【図３】平衡定数（ＫＤ）に対する温度の影響を示す。
【図４】Ａ〜Ｃは、表７に示したＥＣ５０値を作成した１回の実験の代表的データを示す。
【図５】ヒトＩＬ１８に結合する４個の選択したヒト化変異体のＥＣ５０値を示す。
【図６】アカゲザルＩＬ１８に結合する４個の選択したヒト化変異体のＥＣ５０値を示す。
【図７】５０％滑液の存在下におけるヒトＩＬ１８に対するＨ１Ｌ２の結合を示す。
【図８】ＫＧ１アッセイにおけるＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図９】Ａ及びＢはそれぞれヒトＰＢＭＣＳドナーの１０％及び２５％自己血清における、ＬＰＳが刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１０】ｈＩＬ１８ＢＰにより捕捉されたｈＩＬ１８に対する２Ｃ１０の結合を示す。
【図１１】ＫＧ１細胞におけるヒトＩＬ１８が刺激するＩＦＮ−γ放出を阻害する９個のヒト化変異体の能力を示す。
【図１２】ＫＧ１細胞におけるＨ１変異体及び２Ｃ１０によるＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１３】Ｈ１変異体のＩＣ５０データを９５％信頼区間と共に示す。
【図１４】ＫＧ１細胞におけるヒトＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１５】ＫＧ１細胞におけるアカゲザルＩＬ−１８が刺激するＩＦＮ−γ産生の阻害を示す。
【図１６】キメラ２Ｃ１０を用いたヒトＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１７】キメラ２Ｃ１０を用いたアカゲザルＩＬ−１８結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１８】Ａ及びＢはそれぞれヒトＩＬ−１８が結合したＩＬ−１８ＢＰに対して結合するＨ１Ｌ２及び２Ｃ１０を用いた結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２】
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖の位置７１の残基が、前記ＣＤＲが由来するドナー抗体中に存在するその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項３】
ヒトアクセプターフレームワークに移植されたドナー抗体由来ＣＤＲを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、抗インターロイキン−１８抗体が配列番号１、２、３、４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含み、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体フレームワーク中のその対応する位置に存在する残基と同一である、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項４】
配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項５】
配列番号１、２及び３に示されるＣＤＲを有する重鎖と配列番号４、５及び６に示されるＣＤＲを有する軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖ＣＤＲが、ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを有するドナー抗体に由来する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項６】
ドナー抗体由来ＣＤＲ及びヒト化抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該ドナー抗体が、２Ｃ１０又はそのフレームワーク変異体である（すなわち、２Ｃ１０と同じＣＤＲであるが、異なるフレームワークを含む。米国特許第６，７０６，４８７号を参照されたい）、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項７】
（ａ）ヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを有する重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有する軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
前記ヒト軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８を含み、かつ軽鎖の位置７１がチロシンである、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項８】
（ａ）配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該ヒト化抗インターロイキン−１８抗体の該軽鎖アクセプターフレームワークが、配列番号３８に示される配列の変異体であり、該変異体が位置７１にチロシンを含み、かつ該変異体が配列番号３８に示される配列を有するフレームワークと７５％以上の同一性を有する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項９】
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）ヒト軽鎖の位置７１にフェニルアラニンを含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体がその軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１０】
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１に芳香族アミノ酸を含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）軽鎖のアクセプターフレームワークの位置７１に、部分（ａ）の芳香族アミノ酸とは異なる種類の芳香族アミノ酸を含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体が、位置７１に部分（ａ）の抗体に由来する芳香族アミノ酸を有する軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１１】
３７℃で表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００）によって測定したとき、ヒトＩＬ−１８に関して９０ｐＭ以上の結合親和性（ＫＤ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１２】
配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、かつ３７℃で表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００）によって測定したとき、ヒトＩＬ−１８に関して９０ｐＭ以上の結合親和性（ＫＤ）を示す、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１３】
３７℃で表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００）によって測定したとき、ヒトＩＬ−１８の結合に関して０．０００２（１／秒）以下の解離速度（ｋｄ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１４】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲが重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の一個若しくは複数の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、及び任意により位置４５、８３、８４、８５の一個若しくは複数の（例えば全ての）残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１５】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１６】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、３９、４０、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１７】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、３６、３９、４０、７１、８９、９１、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１８】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１９】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２０】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２１】
配列番号９、配列番号１７、配列番号２１からなる群から選択された重鎖、及び配列番号１３、配列番号２９からなる群から選択された軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２２】
配列番号９の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号９の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２３】
配列番号１７の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号１７の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２４】
配列番号２１の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号２１の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２５】
（ａ）ヒトＩＬ−１８との特異的結合を可能にするＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有し、かつ位置７１にチロシン残基を有するアクセプターフレームワークを含む軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２６】
重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の２５℃での解離速度（ｋｄ）と、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の３７℃での解離速度（ｋｄ）との比が、１：５（又は１：５未満）であり、該抗体がドナー抗体由来ＣＤＲとヒトアクセプターフレームワークを含み、かつヒトアクセプターフレームワークの軽鎖の位置７１の残基が、そのドナー抗体のその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２７】
前記ＣＤＲが配列番号１、２、３、４、５及び６に示される配列を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体。
【請求項２８】
前記ヒトアクセプターフレームワークの軽鎖の位置７１の残基が芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンであり、かつ前記ドナー抗体中のその対応する残基が、異なる種類の芳香族アミノ酸、好ましくはチロシンである、請求項２６又は２７に記載のヒト化抗体。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗インターロイキン−１８抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
多発性硬化症、関節リウマチなどの関節炎疾患、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬などの自己免疫疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗インターロイキン−１８抗体の使用
【請求項３１】
関節リウマチの治療のための医薬の製造における、請求項３１に記載の使用。
【請求項３２】
多発性硬化症、関節リウマチなどの関節炎疾患、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬などの自己免疫疾患の治療のための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
多発性硬化症、関節リウマチなどの関節炎疾患、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬などの自己免疫疾患を患うヒト患者を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項３４】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法であって、前記抗体の発現を可能にする条件下で、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項３５】
前記条件が、血清不含培地で前記宿主細胞を培養するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞がＣＨＯ又はＮＳ０である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＨＯ細胞が、前記ポリヌクレオチドでトランスフェクト若しくは形質転換する前の、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、本明細書に開示する抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の親和性が（ｂ）の親和性を超える場合、好ましくは（ａ）の親和性がステップ（ｂ）の親和性の２倍以上、より好ましくは４倍以上である場合に、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法。
【請求項４０】
治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、本明細書に開示する抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の解離速度が（ｂ）の解離速度よりも遅い場合、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２】
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を有する重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖の位置７１の残基が、前記ＣＤＲが由来するドナー抗体中に存在するその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項３】
ヒトアクセプターフレームワークに移植されたドナー抗体由来ＣＤＲを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、抗インターロイキン−１８抗体が配列番号１、２、３、４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含み、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体フレームワーク中のその対応する位置に存在する残基と同一である、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項４】
配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項５】
配列番号１、２及び３に示されるＣＤＲを有する重鎖と配列番号４、５及び６に示されるＣＤＲを有する軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該軽鎖ＣＤＲが、ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを有するドナー抗体に由来する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項６】
ドナー抗体由来ＣＤＲ及びヒト化抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、該ドナー抗体が、２Ｃ１０又はそのフレームワーク変異体である（すなわち、２Ｃ１０と同じＣＤＲであるが、異なるフレームワークを含む。米国特許第６，７０６，４８７号を参照されたい）、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項７】
（ａ）ヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを有する重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有する軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
前記ヒト軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８を含み、かつ軽鎖の位置７１がチロシンである、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項８】
（ａ）配列番号１、２及び３に示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、並びに
（ｂ）ヒト軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該ヒト化抗インターロイキン−１８抗体の該軽鎖アクセプターフレームワークが、配列番号３８に示される配列の変異体であり、該変異体が位置７１にチロシンを含み、かつ該変異体が配列番号３８に示される配列を有するフレームワークと７５％以上の同一性を有する、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項９】
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１にチロシンを含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）ヒト軽鎖の位置７１にフェニルアラニンを含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体がその軽鎖の位置７１にチロシンを含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１０】
（ａ）ドナー抗体軽鎖の位置７１に芳香族アミノ酸を含むドナー抗体に由来する配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲ、
（ｂ）軽鎖のアクセプターフレームワークの位置７１に、部分（ａ）の芳香族アミノ酸とは異なる種類の芳香族アミノ酸を含むヒトアクセプターフレームワーク
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、
該抗インターロイキン−１８抗体が、位置７１に部分（ａ）の抗体に由来する芳香族アミノ酸を有する軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１１】
３７℃で表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００）によって測定したとき、ヒトＩＬ−１８に関して９０ｐＭ以上の結合親和性（ＫＤ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１２】
配列番号１、２、３、４、５及び６に示されるＣＤＲを含み、かつ３７℃で表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００）によって測定したとき、ヒトＩＬ−１８に関して９０ｐＭ以上の結合親和性（ＫＤ）を示す、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１３】
３７℃で表面プラスモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＴ１００）によって測定したとき、ヒトＩＬ−１８の結合に関して０．０００２（１／秒）以下の解離速度（ｋｄ）を示すヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１４】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲが重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の一個若しくは複数の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、及び任意により位置４５、８３、８４、８５の一個若しくは複数の（例えば全ての）残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１５】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該抗インターロイキン−１８抗体の軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１６】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、３９、４０、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１７】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列に由来するフレームワーク領域を含み、該重鎖の位置２７、２８、２９、３６、３９、４０、７１、８９、９１、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１８】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項１９】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２０】
（ａ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む重鎖であって、ＣＤＲがヒト重鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号１、２及び３に示される配列を有し、該重鎖アクセプターフレームワークが配列番号３７に示される配列を有し、該重鎖の位置２７、２８、２９、９３、３９、４０、３６、７１、８９、９１の残基が、該ドナー抗体重鎖中のその対応する残基と同一である重鎖、
（ｂ）ドナー抗体由来ＣＤＲを含む軽鎖であって、ＣＤＲが軽鎖アクセプターフレームワークに移植された配列番号４、５及び６に示される配列を有し、該軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号３８に示される配列を有し、該軽鎖の位置７１、４５、８３、８４、８５の残基が、該ドナー抗体軽鎖中のその対応する残基と同一である軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２１】
配列番号９、配列番号１７、配列番号２１からなる群から選択された重鎖、及び配列番号１３、配列番号２９からなる群から選択された軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２２】
配列番号９の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号９の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２３】
配列番号１７の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号１７の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２４】
配列番号２１の重鎖と配列番号１３の軽鎖、又は配列番号２１の重鎖と配列番号２９の軽鎖を含む、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２５】
（ａ）ヒトＩＬ−１８との特異的結合を可能にするＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号４、５及び６に示される配列を有するＣＤＲを有し、かつ位置７１にチロシン残基を有するアクセプターフレームワークを含む軽鎖
を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２６】
重鎖と軽鎖を含むヒト化抗インターロイキン−１８抗体であって、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の２５℃での解離速度（ｋｄ）と、ヒトＩＬ−１８と前記抗体との結合の３７℃での解離速度（ｋｄ）との比が、１：５（又は１：５未満）であり、該抗体がドナー抗体由来ＣＤＲとヒトアクセプターフレームワークを含み、かつヒトアクセプターフレームワークの軽鎖の位置７１の残基が、そのドナー抗体のその対応する残基によって置換されている、ヒト化抗インターロイキン−１８抗体。
【請求項２７】
前記ＣＤＲが配列番号１、２、３、４、５及び６に示される配列を有する、請求項２６に記載のヒト化抗体。
【請求項２８】
前記ヒトアクセプターフレームワークの軽鎖の位置７１の残基が芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンであり、かつ前記ドナー抗体中のその対応する残基が、異なる種類の芳香族アミノ酸、好ましくはチロシンである、請求項２６又は２７に記載のヒト化抗体。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗インターロイキン−１８抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
多発性硬化症、関節リウマチなどの関節炎疾患、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬などの自己免疫疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗インターロイキン−１８抗体の使用
【請求項３１】
関節リウマチの治療のための医薬の製造における、請求項３１に記載の使用。
【請求項３２】
多発性硬化症、関節リウマチなどの関節炎疾患、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬などの自己免疫疾患の治療のための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
多発性硬化症、関節リウマチなどの関節炎疾患、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び乾癬などの自己免疫疾患を患うヒト患者を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項３４】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法であって、前記抗体の発現を可能にする条件下で、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項３５】
前記条件が、血清不含培地で前記宿主細胞を培養するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞がＣＨＯ又はＮＳ０である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＨＯ細胞が、前記ポリヌクレオチドでトランスフェクト若しくは形質転換する前の、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、本明細書に開示する抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原に対する前記抗体の結合親和性を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の親和性が（ｂ）の親和性を超える場合、好ましくは（ａ）の親和性がステップ（ｂ）の親和性の２倍以上、より好ましくは４倍以上である場合に、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法。
【請求項４０】
治療に使用する抗体（特に、リガンドと受容体との相互作用を阻害する抗体、本明細書に開示する抗インターロイキン−１８抗体など）を選択する方法であって、
（ａ）３０〜４５℃（好ましくは３７℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｂ）２０〜２５℃（好ましくは２５℃）の温度において前記抗体が特異的に結合する抗原からの前記抗体の解離速度を測定するステップ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭなどの表面プラズモン共鳴を使用）、
（ｃ）（ａ）の解離速度が（ｂ）の解離速度よりも遅い場合、治療に使用する前記抗体を選択するステップ
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００９−５３７６０８（Ｐ２００９−５３７６０８Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１５２４（Ｐ２００９−５１１５２４）
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５０２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７９８４
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５０２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７９８４
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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