改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用
【課題】高温条件下でも熱安定性に優れたホルムアルデヒド脱水素酵素を提供する。
【解決手段】野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、改変が、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じており、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している。
【解決手段】野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、改変が、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じており、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及び当該酵素を含むバイオセンサー、並びに酵素燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.46）（Formaldehyde dehydrogenase：ＦＤＨ）は、ホルムアルデヒドを酸化してギ酸を生成する反応を触媒する。ホルアルデヒド脱水素酵素の基質となるホルムアルデヒドは、シックハウス症候群等の慢性的なアレルギー症状を引き起こす原因物質の１つとして知られている。また、稀薄な溶液でも細胞原形質のタンパク質を不可逆的に凝固させ、全ての細胞機能を停止、死滅させる作用があるために、細胞毒としても知られている。そのため、食品中、大気中などのホルムアルデヒドを測定し、これを分解及び除去することが求められており、ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性の利用が検討されている。例えば、生体試料中のホルムアルデヒドの定量等のホルムアルデヒド測定技術や、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した空気浄化フィルター等のホルムアルデヒドの除去技術等、特に環境技術の分野における応用が期待されている。
【０００３】
例えば、ホルムアルデヒドをはじめとするアルデヒド化合物やアルコール化合物を簡易に検出測定できるバイオセンサー用酵素としての利用が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。詳細には、気相中や液相中のアルデヒド化合物及びアルコール化合物を簡易に検出測定できる酵素固定化バイオセンサーが開示されており、これは、過酸化水素電極の表面にアルコール酸化酵素が固定化されると共に最表面に高分子被覆が配設され、過酸化水素の酸化電流値、またはその変化よりアルデヒド化合物もしくはアルコール化合物の存在を検出するものである。
【０００４】
また、近年、クリーンエネルギー技術として、アルコールなどのバイオマスを燃料とした酵素燃料電池が考案されており、酸化還元酵素が電池の構成部材として利用されている。一例として、メタノールを燃料とした酵素燃料電池の場合、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ホルムアルデヒドに作用してギ酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してＣＯ2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼとを用いることにより構成することができる。これにより、メタノールはＣＯ2まで分解され、メタノール１分子につき３段階の酸化反応により合計６電子が生成されることとなる。
【０００５】
そして、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、細菌、酵母から哺乳類に至るまで広く存在していることが知られており、多様な生物由来のホルムアルデヒド脱水素酵素が報告されている。例えば、パン酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae)由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献１を参照）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献２を参照）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献３を参照）等が挙げられる。
【０００６】
ホルムアルデヒド脱水素酵素には、反応にグルタチオンを要求するグルタチオン依存性、及びグルタチオンを要求しない非依存性の２つの型がある。一般に広く存在するホルムアルデヒド脱水素酵素はグルタチオン依存性であるのに対して、シュードモナス・プチダ由来のホルムアルデヒド脱水素酵素は、グルタチオン非依存的にホルムアルデヒドの酸化還元反応を触媒する特徴的な酵素であることが知られている。そして、このホルムアルデヒド脱水素酵素は、各サブユニットが３７６アミノ酸残基からなるホモ４量体酵素であることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）と共に、Ｘ線結晶構造解析の結果をもが報告され活性中心をはじめとした高次構造が明らかとなっている（例えば、非特許文献４を参照）。
【０００７】
以上の従来文献については、すべて天然に存在する野生型のホルムアルデヒド脱水素酵素に関するものである。一方、分子進化工学的手法を使って酵素の構造を改変し、酵素活性の至適温度を低温化した報告もある（非特許文献５）。これは、Pseudomonas putida由来の野生型のホルムアルデヒド脱水素酵素にアミノ酸変異を導入し、３０℃程度の低い温度域において、野生型酵素より酵素活性を１．７倍向上させたものである。
【０００８】
ところが、ホルムアルデヒド脱水素酵素に限らず酵素は、触媒作用を選択する性質が非常に強いことが知られている。例えば、酵素は、生体が生存可能な緩和な条件下で最も酵素活性を発揮し、生体内で代謝される機構を有するものであることから、酵素を構成するタンパク質構造に変化を与えるような因子の存在により酵素の活性は影響を受ける。つまり、酵素活性は、温度等の物理的条件、及びｐＨ、塩濃度等の化学的条件の影響を受けることが知られており、これらに対する安定性が低いため用途が限定されるという問題点があった。そして、従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素は、何れも天然に存在する野生型の酵素であることから、熱に対する安定性が低かった。
【０００９】
しかしながら、バイオセンサーや燃料電池への適用に際しては、多様な環境において安定して活性を保持できる酵素が不可欠であり、特に、酵素寿命に対して相関があるといわれる熱安定性の向上が要求される。従来公知の天然に存在する野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素（非特許文献１〜４）は、何れも熱に対する安定性が低かった。また、野生型のホルムアルデヒド脱水素酵素を改変したホルムアルデヒド脱水素酵素（非特許文献５）についても、活性の至適温度を低温化しているために、高い温度域では野生型酵素より熱安定性が低下しており、酵素の熱失活が生じやすくなっている。
【００１０】
そのため、従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素をバイオセンサーや燃料電池への適用した場合は、酵素の保存安定性が低く、酵素の熱失活により酵素の使用量の増大及び精度の低下が生じることから、市場の要望に十分に対応できるものではなかった。従って、高温条件下でも安定的に作用できるホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１３９７２９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Steinman CR. Jakoby WB.著、“Yeast aldehyde dehydrogenase. II. Properties of the homogeneous enzyme preparations.(酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼII)” J Biol Chem.、1968年、第243巻、第730〜734頁
【非特許文献２】Ras J. Van Ophem PW. Reijnders WN. Van Spanning RJ. Duine JA. Stouthamer AH. Harms N.著、“Isolation, sequencing, and mutagenesis of the gene encoding NAD- and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GD-FALDH) from Paracoccus denitrificans, in which GD-FALDH is essential for methylotrophicgrowth.” J Bacteriol.、1995年、第177巻、第247〜251頁
【非特許文献３】Ito K. Takahashi M. Yoshimoto T. Tsuru D.著、“Cloning and high-level expression of the glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase gene from Pseudomonas putida. ”J Bacteriol. 1994年、第176巻、第2483〜2491頁
【非特許文献４】Tanaka N. Kusakabe Y. Ito K. Yoshimoto T. Nakamura KT.著、“Crystal structure of formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida: the structural origin of the tightly bound cofactor in nicotinoprotein dehydrogenases.”J. Mol. Biol.、2002年、第324巻、第519〜533頁
【非特許文献５】Fujii Y, Yamasaki Y, Matsumoto M, Nishida H, Hada M, Ohkubo K. 著、“The artificial evolution of an enzyme by random mutagenesis: the development of formaldehyde dehydrogenase.” Biosci Biotechnol Biochem. 2004, 68(8), 1722-1727.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、高温条件下でも熱安定性に優れたホルムアルデヒド脱水素酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素の特定のアミノ酸配列領域における少なくとも１つの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素と比較して熱安定性及び保存安定性を向上できることを見出した。更に、かかる酵素を利用することにより、従来の酵素の熱安定性に関する欠点を克服し、より実用面において有利なアルデヒド検出用バイオセンサー及び燃料電池を提供できることをも見出した。本発明者らはこれらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［１３］に示す発明を提供する。
［１］野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じており、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［２］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置で生じている上記［１］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［３］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換である上記［２］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［４］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置で生じている上記［１］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［５］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換である上記［４］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［６］前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する上記［１］〜［５］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［７］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
［８］上記［７］に記載の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
［９］上記［８］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１０］上記［９］に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【００１６】
上記［１］〜［１０］の構成の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列（具体的には配列番号２に示すアミノ酸配列）に置ける第７０位−第１５０位のアミノ酸の何れかに改変を施している。
この位置は、酵素の補欠分子であるＺｎの結合部位に近接しており、酵素サブユニット間の界面付近とは離れている。タンパク質の構造安定化には、Ｚｎなど補欠分子の結合安定性が大きく影響することが知られていて、一般的にはアミノ酸変異の導入を避けたほうがよいと考えられている。しかし、本願のようにＺｎの結合部位に近接した位置でアミノ酸に改変を施すことで、熱安定性を向上させた新規なホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が可能となる。
好ましくは、前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換、或いは、第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換とすれば、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて顕著な熱安定性および長期安定性を有するようになる。
従って、本発明によって提供されるホルムアルデヒド脱水素酵素は、医療・食品・環境分野等の様々な産業分野におけるホルムアルデヒドの脱水素反応を要する技術に適用できる。更に、熱安定性が向上した実用性の高い本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列、並びに塩基配列が明確になったことから、遺伝子工学的手法を利用して組換え体として当該酵素を低コストかつ工業的に大量生産することが可能となった。
【００１７】
［１１］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出する、アルデヒド化合物の検出方法。
【００１８】
上記［１１］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物の検出方法が提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００１９】
［１２］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【００２０】
上記［１２］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物検出用の酵素センサーが提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００２１】
［１３］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【００２２】
上記［１３］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用した燃料電池が提供できる。特に、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく持続的に発電を行なうことが可能となり、燃料電池の性能向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】変異遺伝子ライブラリーの作製概略を示す図である。
【図２】野生型ＦＤＨ遺伝子とその近傍領域において各プライマーが結合する位置を示す図である。
【図３】野生型ＦＤＨの構造解析を行なった結果を示した図である。
【図４】Ｄ１２８Ｇの構造解析を行なった結果を示した図である（（ａ）野生型ＦＤＨ、（ｂ）Ｄ１２８Ｇ）。
【図５】Ｇ１１０Ｄの構造解析を行なった結果を示した図である。
【図６】精製したＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨのアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した図である。
【図７】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨのｐＨ依存性を調べた結果を示した図である。
【図８】改変型ＦＤＨおよび野生型ＦＤＨの温度依存性を調べた結果を示した図である（（ａ）Ｄ１２８Ｇ，（ｂ）Ｇ１１０Ｄ）。
【図９】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの温度安定性を調べた結果を示した図である（（ａ）５５℃，（ｂ）６０℃，（ｃ）６５℃）。
【図１０】Ｇ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの温度安定性を調べた結果を示した図である（（ａ）５５℃，（ｂ）６０℃，（ｃ）６５℃）。
【図１１】改変型ＦＤＨおよび野生型ＦＤＨの安定性を調べた結果を示した図である（（ａ）Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較、（ｂ）Ｇ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較）。
【図１２】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨについて常温時（２５℃）の安定性を調べた結果を示した図である。
【図１３】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨについて常温時（３０℃）の安定性を調べた結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
近年、クリーンエネルギー技術として、アルコールなどのバイオマスを燃料とした酵素燃料電池が考案されており、そこでは本発明のホルムアルデヒド脱水素酵素のような酸化・還元を触媒する酵素が電池の電極触媒として利用されている。一例として、メタノールを燃料とした酵素燃料電池の場合、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ホルムアルデヒドに作用して蟻酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと、蟻酸に作用してＣＯ2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼとを用いることができる。これにより、メタノールはＣＯ2まで分解され、メタノール１分子につき３段階の酸化反応により合計６電子が生成される。
【００２５】
本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素（以下、「改変型ＦＤＨ」と略する）は、天然に存在する野生型ＦＤＨのアミノ酸配列において、少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変されており、そして、野生型ＦＤＨに比べて熱安定性が向上している。ここで「少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対して、公知のＤＮＡ組換え技術、及び点変異導入方法等によって、欠失、置換、付加或いは挿入することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、付加或いは挿入されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。したがって、改変型ＦＤＨは、これらの改変は１つ有するものであっても、また２つ以上が組み合わされたものであってもよい。このような改変は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。したがって、本発明における改変型ＦＤＨには、これら双方の改変型が含まれる。
【００２６】
野生型ＦＤＨとは、自然界より分離されたＦＤＨのアミノ酸配列、及び該酵素をコードする核酸分子の塩基配列が、意図的もしくは非意図的に改変が生じている改変部位を有していないことを意味する。
【００２７】
「ＦＤＨ」とは、ホルムアルデヒドを基質としてギ酸を生成する脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質であり、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を要求する。反応式を以下に示す。
ホルムアルデヒド＋ＮＡＤ+（酸化型） → ギ酸＋ＮＡＤＨ（還元型）＋Ｈ+
【００２８】
ＦＤＨには、グルタチオン依存性、非依存性の２つの型が存在する。本発明においては何れもが対象となるが、グルタチオン非依存性が好ましい。
【００２９】
改変型の基礎となる野生型ＦＤＨは、上記の性質を有する限り何れの生物由来のものであってよい。具体的には、シュードモナス（Pseudomonas）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）等の細菌由来、及びサッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母由来のＦＤＨ等が例示される。更には、ウシ（Equus caballus）やラット（Rattus norvergicus）等の哺乳動物由来のＦＤＨをも含む。好ましくは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のＦＤＨである。しかしながら、これらに限定するものではない。
【００３０】
「安定性が向上」とは、熱、及び保存に対する当該酵素の安定性が向上することであり、一定期間の熱処理及び保存に対して、当該酵素の触媒機能の失活や活性低下が抑制できることを意味する。具体的には、改変型ＦＤＨが、野生型ＦＤＨよりも、一定期間の熱処理又は保存に供した後に維持されている酵素の触媒機能の残存率が高いことを意味する。例えば、野生型ＦＤＨの活性が維持される２５℃での酵素の酵素活性値を１００％として、加温処理後の活性値を酵素活性の残存率として算出する。この残存率が、野生型ＦＤＨと比較して増大していた場合、当該酵素の熱安定性が向上したと判断できる。また、一定期間の保存に際しての残存率が、野生型ＦＤＨと比較して増大していた場合、当該酵素の保存安定性が向上したと判断できる。一例として、５０℃にて３０分間の加温により６０％以上、特には７５％以上の残存活性を維持できる熱安定性が好ましい。また、４５℃にて１０時間の保存で６０〜８０％、３０時間の保存であっても５０〜６０％程度の残存活性を維持できる保存安定性が好ましい。
【００３１】
本発明の改変型ＦＤＨはこれに限定されるものではないが、前記改変が、野生型ＦＤＨのアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じたものが、好ましく例示される。
【００３２】
野生型ＦＤＨのアミノ酸配列において、第７０位−第１５０位におけるアミノ酸の改変は、これらの位置における何れかの改変を有するもの全てが本発明に含まれる。また、かかる位置における１のアミノ酸が改変したものであっても、複数の位置における複数のアミノ酸が改変したものであってもよい。
【００３３】
配列番号２に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ由来の野生型ＦＤＨのアミノ酸配列であるが、他の生物由来の当該酵素のホモログについても同様の位置が改変されたものは本願発明の改変型ＦＤＨに含まれる。
【００３４】
ここで、改変としては、特に好ましくは、他のアミノ酸への置換である。そして、他のアミノ酸とは、置換前のアミノ酸以外の何れもが含まれる。しかしながら、タンパク質機能改変の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と異なる性質を有するアミノ酸であることが好ましい。
例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有するが、これら以外のアミノ酸への置換はタンパク質機能へ影響を与えることが考えられる。
非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。
これらの各グループ内の以外へのアミノ酸置換は、タンパク質の機能が改変されることが特に予想されるが、これに制限されるものではない。
【００３５】
好ましくは、野生型ＦＤＨのアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換であり、または、配列番号２におけるアミノ酸配列の第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換が例示される。
【００３６】
一例として、野生型ＦＤＨとしてシュードモナス・プチダとする場合、上述した第１２８位の置換を行なったアミノ酸配列を配列番号４に、第１１０位の置換を行なったアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００３７】
更に、前述の改変型ＦＤＨの性質を保持している限り、更に特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。当業者はアミノ酸配列の改変に際して本発明の改変型ＦＤＨの酵素活性を保持する改変を容易に予測することができる。具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。
また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にＨｉｓタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等を付加したものも好適に例示される。このようなタグペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、本発明の酵素活性の喪失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。
【００３８】
本発明の改変型ＦＤＨは公知の方法によって取得することができる。例えば、改変の基礎となる野生型ＦＤＨをコードする遺伝子に対して改変を施し、得られた改変型遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から上記活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３９】
改変の基礎となる野生型ＦＤＨをコードする遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースを検索することによって取得することができる遺伝子情報を基にしてプライマーを設計し、ＦＤＨを産生し得る生物体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得することができる。また公知の遺伝子情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト法等の核酸合成法により合成することによっても取得するができる。ここで、本発明の改変型の基礎として好適なＦＤＨの配列情報として、野生型のシュードモナス・プチダ由来のＦＤＨのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、当該ＦＤＨをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００４０】
野生型ＦＤＨをコードする遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。
【００４１】
特には、野生型ＦＤＨをコードするＤＮＡを鋳型として、所望の改変（欠失又は置換）を施した配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことによって取得することが、好ましく例示される。ここで、本発明の改変型ＦＤＨの調製において、ＰＣＲを利用する場合に用いられるプライマーは、野性型ＦＤＨをコードする核酸分子と相補的な配列を含み、かつ所望の改変が生じるように設計されたものであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては１０以上、好ましくは１５以上、更に好ましくは約２０〜５０の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４２】
また、目的とする改変型ＦＤＨのアミノ酸配列が定めることにより、それをコードする適当な塩基配列を決定でき、常法のホスホルアミダイト法等の核酸合成技術を利用して本発明の改変型ＦＤＨをコードするＤＮＡを化学的に合成することができる。
【００４３】
また、このような本発明の改変型ＦＤＨ改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から前述の理化学的性質を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。
【００４４】
（本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子）
本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子は、前述の理化学的性質を有するすべての改変型ＦＤＨをコードするものを包含する。例えば、配列番号４，６に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする全てのポリヌクレオチドであり、一具体例としては、配列番号３，５に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定するものではない。ここで、本発明におけるポリヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれ、ＤＮＡである場合には、１本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。
【００４５】
本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子は、本明細書においてその塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して化学的に合成することができる。また、改変の基礎となる野生型ＦＤＨをコードするＤＮＡに対して改変を施すことによっても製造することができる。なお、詳細については前述した。
【００４６】
（本発明の組換えベクター）
そして、本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子を組み込むことによって構築することができる。利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。従って、ベクターは、本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（ｐＥＸ系、ｐＵＣ系、及びｐＢＲ系等）、ファージベクター（λｇｔ１０、λｇｔ１１、及びλＺＡＰ等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。
【００４７】
本発明の組換えベクターは、本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子がその機能を発現できるように組み込まれている。従って、核酸分子の機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく既知のプロモータ配列を利用できる。
更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００４８】
ベクターへの本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法等、既知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００４９】
（本発明の形質転換体）
本発明の形質転換体は、適当な細胞を本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子を含む組換えベクターで形質転換することによって構築することができる。ここで、宿主となる細胞としては、本発明の改変型ＦＤＨを効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌E.coli（ＤＨ５α、ＢＬ２１、ＪＭ１０９等）を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。
【００５０】
（本発明の改変型ＦＤＨの製造方法）
本発明の改変型ＦＤＨの製造方法は、前述の本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質を採取することにより行なう。即ち、前述の本発明の形質転換体を培養する培養工程と、前記培養工程で発現した前記タンパク質を回収する回収工程とを備える。このように、適当な宿主で発現させることによって、低コストで本発明の改変型ＦＤＨの大量生産が可能となる。
【００５１】
培養工程は、本発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。従って、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。
【００５２】
例えば、炭素源として、ホルムアルデヒド、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００５３】
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００５４】
精製工程は、前述の培養工程において得られた形質転換体の培養物からの本発明の改変型ＦＤＨを回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。本発明の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本発明のＦＤＨが宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、既知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本発明の酵素を単離精製することができる。
【００５５】
例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の既知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィを利用する場合、本発明の酵素をＨｉｓ Ｔａｇ等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、本発明の改変型ＦＤＨが宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。
【００５６】
続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。ここで、本発明で得られる改変型ＦＤＨは、熱安定性が高いことから、前述の単離、精製工程において熱処理を併用することが有用かつ便利である。
培養物から得られた宿主細胞及び培養上清には、当該宿主細胞由来の様々なタンパク質を含有する。しかし、熱処理を行なうことにより、宿主細胞由来の夾雑タンパク質は変性し凝縮沈殿する。これに対して、本発明の酵素は、改変型を有するため変性を生じないことから、遠心分離等により宿主由来の夾雑タンパク質と容易に分離できる。また、培養液をそのまま、若しくは粗抽出液を使用する場合においても、熱処理を行なうことにより、他のタンパク質が失活することから、実質的に本発明の改変型ＦＤＨのみの酵素液として使用することができる。従って、本発明の改変型ＦＤＨを遺伝子工学的手法により製造する場合においても、宿主由来のその他のタンパク質を容易に除去することができる。従って、精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００５７】
そして、精製されたＦＤＨが所望の改変が生じている改変部位を有する本発明の改変型ＦＤＨであるか否かの確認は、その理化学的性質や配列の分析によって行うことができる。理化学的性質の分析による場合、一定期間、熱処理に付した後、酵素の酵素活性を公知の方法により測定し改変部位を有しない野生型ＦＤＨと比較して、活性の残存率が高いか否かを確認することによって行うことができる。従って、基質であるアルデヒド化合物に対してＮＡＤ+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。
【００５８】
酵素の活性は、ＮＡＤ+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法を何れをも利用して行うことができる。例えば、ＮＡＤ+の存在下で、本発明の酵素をアルデヒド化合物と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するＮＡＤＨ量の変化を３４０ｎｍの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができる。従って、ＦＤＨ活性は、ホルムアルデヒド及びＮＡＤ+から、ギ酸及びＮＡＤＨを生成する触媒反応において、生成したＮＡＤＨを直接定量することによって測定できる。つまり、酵素反応によりホルムアルデヒドが酸化されギ酸となり、このときＮＡＤが還元されＮＡＤＨが生成する（反応式：ＨＣＨＯ＋ＮＡＤ+＋Ｈ2Ｏ → ＨＣＯＯＨ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+）。このＮＡＤからＮＡＤＨの生成を３４０ｎｍの吸光度変化を測定して酵素活性とした。この配列分析による場合には、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法が利用できる。
【００５９】
（アルデヒド化合物の検出方法）
本発明の改変型ＦＤＨは、試料中のアルデヒド化合物の検出のために利用することができる。アルデヒド化合物の検出は、例えば、基質であるアルデヒド化合物に対してＮＡＤ+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。酵素の活性は、ＮＡＤ+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、ＮＡＤ+の存在下で、本発明の酵素を測定対象となる試料と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するＮＡＤＨ量の変化を３４０ｎｍの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができ、ひいてはＮＡＤＨ量の変化によりアルデヒド化合物の存在を検出することができる。したがって、ＦＤＨ活性は、その触媒反応において、生成したＮＡＤＨを直接定量することによって測定できる。
反応液としては、例えば、ホルムアルデヒド等のアルデヒド基質、２ｍＭのＮＡＤ+、２５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ＭのＮａＣｌ及び本発明の酵素溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．８）中にて混合して２００μＬとすることにより調製することができる。しかしながら、これは標準条件であり、適宜変更することができる。この反応液を、３７℃で波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行うことができ、吸光度の測定は、既知のマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いることができる。
そして、適当な試験条件が選択されていれば、この変化は、測定しようとする酵素活性に直線的に比例する。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた吸光度変化値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００６０】
ここで、試料としては、アルデヒド化合物等、ＦＤＨの基質となり得る化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。例えば、血液、尿、唾液等の生物体由来の生物試料、食品試料、環境試料等が例示されるがこれに限定されるものではない。また、必要に応じて、これらの試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。特に、本発明の改変型ＦＤＨは優れた熱安定性を示すことから、温度が高い試料の分析に際して好適に利用できる。そして、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００６１】
（アルデヒド化合物検出用のバイオセンサー）
本発明は、本発明の改変型ＦＤＨを利用するアルデヒド化合物検出用のバイオセンサーを提供する。当該検出センサーは、電極材上に本発明の改変型ＦＤＨが固定化した作用電極、及びその対極を設けて構成される。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。電極材上への酵素の固定化は既知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。そして、本発明のＦＤＨの酵素活性に際して要求される補酵素ＮＡＤ+、ＮＡＤ+の還元体であるＮＡＤＨを酸化する能力を有する酸化酵素（ジアホラーゼ等）、電子メディエーター（フェロセン、ジクロロインドフェノール等）も、必要に応じて電極材上に固定化して構成される。
【００６２】
アルデヒド化合物の測定は、例えば、測定対象となる試料を接触させると試料中のアルデヒド化合物が作用極上に固定された本発明の改変型ＦＤＨと反応し、続いて電子メディエーターが還元される。そして、電極系に電圧を印加して電子受容体の還元体を酸化し、得られる酸化電流値の変化により試料中のアルデヒド化合物を検出することができる。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた酸化電流値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００６３】
ここで、試料としては、本発明の改変型ＦＤＨの基質となり得るアルデヒド化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。詳細については前述した。特には、前述の通り、本発明の改変型ＦＤＨは、熱安定性が高いことからバイオセンサー製作時における劣化をも防止することができ、また、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００６４】
（本発明の燃料電池）
本発明は、本発明の改変型ＦＤＨを利用する燃料電池を提供する。本発明の燃料電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極と、還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアソードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。
アノード電極側では、本発明の改変型ＦＤＨがアルデヒド化合物を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。一方、カソード側では、アノード側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。アノード極側には本発明の改変型ＦＤＨが供給され、適当な緩衝液中に溶解させた形態で供給してもよいが、電極上に固定化されることが好ましい。このとき、改変型ＦＤＨは、好ましくはＮＡＤと共に固定化されることが好ましく、特にはＮＡＤと結合したホロ酵素の形態で固定化されることが好ましい。また、アポ酵素の形態で固定化し、ＮＡＤを適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。
カソード極側には、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素を必要に応じて供給してよい。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
【００６５】
以上のように構成することにより、燃料であるアルデヒド化合物を酸化する際に生じた電子がアノード極に電子を受け渡す。そして、アノード極に渡された電子は、外部回路を経てカソード極に到達することで電流が発生する。燃料となるアルデヒド化合物としては、本発明の改変型ＦＤＨの基質となり得るアルデヒド化合物であれば制限はない。
【００６６】
また、メタノールを燃料とした酵素燃料電池においても本発明の改変型ＦＤＨを利用できる。その場合には、触媒として、本発明の改変型ＦＤＨに加え、必要に応じてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してＣＯ2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼを併用することにより構成することができる。
【００６７】
本発明の燃料電池は、熱安定性が高い本発明の改変型ＦＤＨの触媒能力を利用することから、持続的に発電を行なうことができ、高性能の燃料電池として構築することができる。また、本発明の改変型ＦＤＨは、熱安定性が高いことから燃料電池製作時における劣化をも防止することができ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【実施例】
【００６８】
＜実施例１＞本発明の改変型ＦＤＨ遺伝子のクローニング
分子進化工学的手法と称される酵素改変手法を利用して、本発明の改変型ＦＤＨ遺伝子のクローニングを行った。
【００６９】
かかる分子進化工学的手法とは、生物進化の原理をタンパク質に応用する技術である。そのステップとしては、まずランダムに改変の基礎となる遺伝子に変異を導入し、可能な限り多様な改変型遺伝子を作り出す。そして、改変型遺伝子から改変型タンパク質を作製して、その中から所望の性質を保持するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。このようにして、設計原理が未知であっても所望の機能や性質を保持する高分子を取得することができ、取得した遺伝子の変異箇所及び変異様式を調べることによって、高分子設計原理の研究においても威力を発揮することができる。
【００７０】
Pseudomonas putida由来の野生型ＦＤＨの立体構造はＸ線解析により既に明らかにされており、各サブユニットが３９８アミノ酸残基からなる4量体構造を有する。野生型ＦＤＨの立体構造データは、日本蛋白質構造データバンクで公開されているものを利用した（http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1KOL）。この野生型ＦＤＨのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造を検討すると、4量体酵素のサブユニットの界面付近にループ領域（Ｋ７６−Ｄ７９）が存在し、この領域が高次構造におけるサブユニット間相互作に影響を及ぼし、熱安定性を支配していることが示唆される。
熱安定性向上効果が見込める部位を鋭意検討した結果、第７０位−第１５０位のアミノ酸領域（Ｔｈｒ７０−Ｌｅｕ１５０）が４量体酵素のサブユニットの界面のドメイン間の構造安定化に寄与するホットスポットである可能性が高いと考え、このホットスポット周辺へランダム変異を導入したライブラリーを作製し、スクリーニングを行うことより、構造が最適化し熱安定性が向上した変異体を取得できると考えた。なお、これら検討のための一連の酵素の立体構造解析は、アクセリス社製のInsight-II（酵素の分子構造を表示し、かつ構造エネルギー計算が可能なソフトウェア）を用いて行った。分子進化工学的手法を用いた酵素改変の具体的な手順を次に示す。
【００７１】
（ステップ１） 酵素遺伝子の取得
バクテリアPseudomonas putida株は、ＮＩＴＥ（独立行政法人製品評価技術基盤機構）から入手した（受託番号 NBRC No. NBRC3738）。そのゲノムＤＮＡは、添付資料に記載の培養液を使って菌体を培養し、ゲノムＤＮＡ抽出キット（プロメガ社製）を使って抽出と精製を行った。このゲノムＤＮＡを鋳型にして以下のプライマー１，２（配列番号７，８）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、鋳型として５０ｎｇゲノムＤＮＡおよび各０．２μＭのプライマーのそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の精製はＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。その結果、予想されるＤＮＡ増幅産物（約１．２ｋｂｐ）を得ることができた。
【００７２】
5'-GAGCA TATGT CTGGT AATCG TGGTG T-3'（プライマー１：配列番号７）
5'-CTAAA GCTTA GGCCG CGCTG AGGTC T-3'（プライマー２：配列番号８）
【００７３】
（ステップ２） 発現ベクターの構築
ＰＣＲ増幅で得られたＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ）を、制限酵素NdeIとHindIIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離しゲルから精製した。ＤＮＡ断片を、タンパク質発現用プラスミドのｐＥＴ２３ｂベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位NdeIとHindIIIにライゲーション反応より組み込んで酵素の発現ベクターを構築した。
また無細胞システムを使った酵素合成用の鋳型とする直鎖状ＤＮＡを調製するために、酵素遺伝子を組み込んだベクターを鋳型にして、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーター配列間をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を使用し、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマー３，４（配列番号９，１０、各０．２μＭ）を滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の精製には、ＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
【００７４】
5'- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC -3' （プライマー３：配列番号９）
5'- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG -3' （プライマー４：配列番号１０）
【００７５】
（ステップ３） 変異遺伝子ライブラリーの作製
ランダム変異を導入した変異遺伝子ライブラリーの作製は、変異導入のための手法にエラープローンＰＣＲを用いた。ライブラリー作成を行うために、酵素ＦＤＨ分子内に１〜２箇所の変異導入が得られる条件（エラー率０．５％前後となるエラープローンＰＣＲ条件）を検討した。ポリメラーゼの塩基取り込み間違いを促進させるために、マグネシウム濃度とマンガン濃度を［Ｍｇ，Ｍｎ］＝［５，０．５］ｍＭとした。
エラープローンＰＣＲ反応は、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、各０．５μＭのプライマー５，６（配列番号１１，１２）、１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．３）緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。
【００７６】
5'-CGGCCTGGTCCTGGGCCACGAAATC-3'（プライマー５：配列番号１１）
5'-TGGCCTTGTCGCGCTCAGGCAGCTT-3'（プライマー６：配列番号１２）
【００７７】
次に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入したＦＤＨ遺伝子断片と、変異を導入しないＦＤＨ遺伝子の残りの部分をコードするＤＮＡ断片を連結するために、オーバーラッピングＰＣＲを行った。
まず変異を導入しないＤＮＡ断片を得るために、ステップ２で作製した発現ベクターを鋳型にして、プライマー７，８（配列番号１３，１４）およびプライマー９，１０（配列番号１５，１６）をそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマー（各０．２μＭ）のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の精製はＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
【００７８】
5'- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC -3' （プライマー７：配列番号１３）
5'- GATTTCGTGGCCCAGGACCAGGCCG -3' （プライマー８：配列番号１４）
5'- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG -3' （プライマー９：配列番号１５）
5'- AAGCTGCCTGAGCGCGACAAGGCCA -3' （プライマー１０：配列番号１６）
【００７９】
得られた３つのＤＮＡ断片を鋳型にして、プライマー７，１０を用いてＰＣＲ増幅を行った後、さらに反応終了液に含まれるＰＣＲ産物を鋳型にしてプライマー１１，１２（配列番号１７，１８）を用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマー（各０．２μＭ）のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の精製には、ＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
次に、得られた酵素遺伝子をコードするＤＮＡ断片に、１分子ＰＣＲ用プライマー配列を付加するために、プライマー１３（配列番号１９）を用いたＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、プライマー（各０．３μＭ）のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒のサイクルを２０回繰り返した。ＰＣＲ産物の精製には、ＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。以上の実施した内容の模式図を図１，２に示す。
【００８０】
5'-GGAGCTAGGGTTTACGAGTGGAATG-ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3'（プライマー１１，配列番号１７）
5'-GGAGCTAGGGTTTACGAGTGGAATG-TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3'（プライマー１２，配列番号１８）
5'-GGAGCTAGGGTTTACGAGTGGAATG-3' （プライマー１３，配列番号１９）
【００８１】
以上により、ＦＤＨをコードする遺伝子のコーディング領域中のホットスポット（アミノ酸領域Ｔｈｒ７０−Ｌｅｕ１５０）に、変異を導入した変異遺伝子ライブラリーを作製した。変異遺伝子ライブラリーを、デキストランを含む希釈液で、１．５分子／μＬに希釈し、３８４プレートに分注した。その後、１μＬ希釈液／１反応ウェルでＰＣＲ増幅した。変異遺伝子ライブラリーの希釈倍率算出に使用した計算式を次に示す。
【００８２】
ＤＮＡの長さ：１４００ｂｐ
分子量：０．９２４×１０6
１μｇ ＤＮＡ：１．０８×１０-6μｍｏｌ＝１．０８×１０-12ｍｏｌ
１μｇ ＤＮＡ：６．０２×１０23×１．０８×１０-12＝６．５×１０11分子に相当
【００８３】
この計算から、変異遺伝子（ＤＮＡ）のゲル切り出し精製したＤＮＡ溶液は、９．１×１０9分子／μＬと算出でき、このＤＮＡ溶液を３×１０9希釈したものを、次のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡに使用した。ＰＣＲ反応温度条件は、９８℃で１０秒、６８℃で１分のサイクルを７０回繰り返した後、６８℃で１０分の伸長反応を行なった。
【００８４】
（ステップ４） 無細胞タンパク質合成システムを用いた酵素合成とスクリーニング
ラビットトランスレーションシステムRTS100,E.coli HYキット（ロシュ社製）を使って取扱説明書に従い、反応時間は４時間、反応温度は３０℃を基本条件として改変ＦＤＨを合成した。
変異遺伝子ライブラリーを鋳型にして、大腸菌の無細胞タンパク質合成系でタンパク質を合成し、上述の条件を用いてホルムアルデヒドに対する酵素活性についてスクリーニングし、熱処理後の残存活性が野生型ＦＤＨより向上した酵素活性を発現する改変ＦＤＨの候補遺伝子を選択した。
【００８５】
酵素の活性測定は、８μＬの酵素合成終了液に、３２μＬのリン酸緩衝液を混和して４０μＬとし、分注装置を使って１６μＬを新しい３８４ウェルプレート２枚に移した。２枚のプレートのうち、１枚を熱処理（１５分、５５℃）した後、氷中に１５分間放置し、その後、８０μＬの活性測定反応液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、４０ｍＭ ＮＡＤ、０．０６％ＨＣＨＯ）を加えて、ＮＡＤ+からＮＡＤＨ変化に伴う３４０ｎｍの吸光度変化をプレートリーダで測定した。
【００８６】
（ステップ５） スクリーニングで選択したクローンの解析
熱処理後も残存する酵素活性が認められた酵素の合成に使用した変異遺伝子ライブラリーについて、塩基配列を解析してアミノ酸変異を同定し、それらのタンパク質合成と酵素活性の有無も確認した。
タンパク質合成は、無細胞タンパク質合成系ラビットトランスレーションシステムRTS100,E.coli HYキット（ロシュ社製）を用いて、その取り扱い説明書に従って行なった。酵素の有無は、FluoroTect（登録商標） GreenLys in vitro Translation Labeling System（プロメガ社製）を用いて、その取り扱い説明書に従って合成酵素を蛍光標識して確認した。
【００８７】
酵素活性の測定は、ホルムアルデヒド脱水素酵素によるホルムアルデヒド分解活性を、ＮＡＤＨの３４０ｎｍの吸光を指標として行なった。８０μＬの活性測定反応液（５０ｍＭリン酸緩衝液Ｋ１Ｋ２ＰＯ4 ｐＨ７．４、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯ）に酵素溶液を加えて、ＮＡＤからＮＡＤＨ変化に伴う３４０ｎｍの吸光度変化を５分間（１０秒間隔）プレートリーダで測定した。結果を表１に示す。
【００８８】
【表１】
【００８９】
表中における「アミノ酸変異部位」において、例えば「Ｅ７６Ｖ」との表記は、野生型ＦＤＨのアミノ酸配列である配列番号２における第７６番目のグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）に置換されたことを表す。
本実施例でアミノ酸変異が認められた部位は、クローンＰ１６では第７６位、第８１位、第２１９位であり、クローンＦ１２では第１２７位、第１４２位であり、クローンＫ１１では第９７位、第１４８位であり、クローンＮ２０では第１２９位であり、クローンＰ１３では第１４９位であり、クローンＯ６，Ｐ４では第１２８位であり、クローンＨ１では第１１０位であり、クローンＫ３では第９４位であった。尚、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始コドンであるメチオニンを１として番号付けしている。
【００９０】
この中で、タンパク質合成と酵素活性が確認できたものは、クローンＯ６，Ｐ４（第１２８番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換されている）と、クローンＨ１（第１１０番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されている）であった。
【００９１】
表１の結果より、アミノ酸変異Ｄ１２８ＧおよびＧ１１０Ｄ以外では、変異が１個入っただけの改変で酵素活性が全くなくなるものと認められた。つまり、アミノ酸変異が１個ではタンパク質の構造学的には、１０Å程度の距離にしか構造変化の影響を与えないとされているが、このPseudomonas putida由来のＦＤＨは、その微小な構造変化でも酵素の構造的な安定性に影響を与えてしまうデリケートで複雑な構造をしている酵素であるといえる。
その中でも特に、Ｖ１２７ＤはＤ１２８Ｇの隣のアミノ酸変異であるが、当該Ｖ１２７Ｄでは酵素活性がなくなるのに対してＤ１２８Ｇでは酵素活性を有していることから、Ｄ１２８ＧがPseudomonas putida由来のＦＤＨの安定性に重要であると推察されると同時に、従来法での酵素改変は非常に困難であることが推測できる。
【００９２】
以下、第１２８番目のアスパラギン酸がグリシンに改変されたアミノ酸配列を有する改変ＦＤＨを「Ｄ１２８Ｇ」、第１１０番目のグリシンがアスパラギン酸に改変されたアミノ酸配列を有する改変ＦＤＨ「Ｇ１１０Ｄ」と称する。
【００９３】
＜実施例２＞改変型ＦＤＨの立体構造シミュレーションに基づく高次構造の解析
Ｄ１２８ＧおよびＧ１１０Ｄの立体構造モデルの構築を行なった。モデリングは、アクセルリス社製Discovery Studio21を用いて、Ｘ線結晶解析データ（ＰＤＢ；１ＫＯＬ）を参照構造として、ホモロジーモデリングにより実施した。
【００９４】
まず、野生型ＦＤＨ（ＰＤＢ；１ＫＯＬ）を用いて変異部位の解析を行なった（図３）。
触媒ドメインとコファクター結合ドメインは、Ｚｎ１近傍で上下に分かれる。ＮＡＤとＺｎ１の相互作用は、両ドメインの位置・構造の安定性に関係していると考えられる。Ｄ１２８（第１２８位のアスパラギン酸）およびＧ１１０（第１１０位のグリシン）は、両ドメインの界面に位置する。特に、Ｇ１１０はＺｎ２保持ループの根元付近に位置する。Ｚｎ２保持ループ周辺は両ドメインの分岐から遠く、パッキングが不十分もしくは安定性が低い可能性が考えられる。
【００９５】
Ｄ１２８Ｇの構造モデルの解析結果は以下の通りである（図４）。
図４（ａ）には野生型ＦＤＨ、図４（ｂ）にはＤ１２８Ｇの構造モデルを示した。モデルは分子内の原子に接触する溶媒の接触点によってトレースされるサーフェイス形状で表示した。図４（ａ）（ｉｉ），図４（ｂ）（ｉｉ）は、それぞれ図４（ａ）（ｉ），図４（ｂ）（ｉ）のモデルを９０℃回転させたモデルを示した。
野生型ＦＤＨではＤ１２８とＲ１１９（第１１９位のアルギニン）は静電作用で側鎖が並ぶように位置し、その内側のアミノ酸残基Ｙ１２６（第１２６位のチロシン）およびＭ１２９（第１２９位のメチオニン）の間には空間が存在していた。Ｄ１２８Ｇ変異体では、Ｄ１２８とＲ１１９の側鎖は野生型とは反対方向を向いており、その内側のアミノ酸残基（Ｙ１２６とＭ１２９）の側鎖が内部に向いたことにより、Ｄ１２８とＲ１１９も内側にコンパクトにパッキングされたと推測される。余分なキャビティが無くなったことが安定性向上に寄与しているのではないかと推測された。
【００９６】
Ｇ１１０Ｄの構造モデルの解析結果は以下の通りである（図５）。
野生型ＦＤＨとＧ１１０Ｄの主鎖の重ね合わせを行った。
Ｇ３３７（第３３７位のグリシン），Ｑ３３８（第３３８位のグルタミン），Ｔ３３９（第３３９位のトレオニン），Ｐ３４０（第３４０位のプロリン）は、ＮＡＤと相互作用するアミノ酸残基、Ｎ９３（第９３位のアスパラギン）はＮＡＤと相互作用するアミノ酸残基の隣の残基、Ｃ１１２（第１１２位のシステイン）はＺｎ２保持アミノ酸残基であったことから、側鎖の向きの変化により、酵素の安定性に何らかの寄与をしたと推測された。
【００９７】
＜実施例３＞組換え大腸菌によるタンパク質の発現と精製
タンパク質発現は、野生型または改変型ＦＤＨをコードする遺伝子を、大腸菌用の発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂ ＤＮＡのマルチクローニングサイトにＣ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現するように挿入し、構築されたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。大腸菌の培養は、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入りのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中を使って３７℃で行なった。形質転換した大腸菌は、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地で培養し、培養液の吸光度ＯＤ600＝０．６で０．５ｍＭ ＩＰＴＧ(isopropyl-s-D-thiogalactopyranoside)を添加してタンパク質の合成誘導を行ない、さらに４時間の培養を行なった。
【００９８】
発現させたＨｉｓタグ融合タンパク質は、アフィニティーカラムを用いて精製した。具体的には、遠心分離により回収した菌体を、リン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁した。菌体を超音波で破砕した。破砕は、超音波処理３０秒、氷冷３０秒のセットを１０回繰り返して行なった。遠心分離により得られた上清５０ｍＭ ＮａＣｌを加え、酵素液をＮｉ２+カラムクロマトグラフィー通液し、３００ｍＭイミダゾールを含む溶液で融合タンパク質を溶出して、活性画分をまとめ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を透析外液として一晩透析を行った。
得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．４）にて透析した。タンパク質の確認は、２０μＬの酵素溶液に２０μＬの可溶化液を加えて３分間９５℃で熱処理したサンプルを、１２．５％アクリルアミドゲルで電気泳動し、ＣＢＢ染色法で酵素を可視化することにより行った。その結果を図６に示す。レーン１は精製した改変型ＦＤＨ Ｄ１２８Ｇ、レーン２は精製した野生型ＦＤＨである。
【００９９】
この結果、Ｄ１２８Ｇは、野生型ＦＤＨと同様に約５０ｋＤａのバンドが認められたため、大腸菌用の発現ベクターで発現することが確認できた。
【０１００】
＜実施例４＞酵素の諸性質の確認（ｐＨ依存性）
酵素活性をｐＨ５．０〜１０．０の範囲で測定した。５０ｍＭ緩衝液、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に等量の酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、２５℃でｐＨ８．０の酵素活性の反応速度を１とし、各ｐＨにおける相対活性の変化を比較した結果を図７に示す。
この結果から、Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨは、ｐＨ５．０からｐＨ８．０までは同じｐＨ特性を示し、至適ｐＨはｐＨ８．０付近であることが判明した。一方、ｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０では、Ｄ１２８Ｇより野生型ＦＤＨの方が、活性低下が小さいことが判明した。また、Ｇ１１０Ｄについても、Ｄ１２８Ｇと同様のｐＨ依存性を示すことが判明した（結果は示さない）。尚、図７においてｐＨ領域Ａ（８以下）についてはリン酸緩衝液を使用し、ｐＨ領域Ｂ（８以上）についてはＴｒｉｓ緩衝液を使用した。
【０１０１】
＜実施例５＞酵素の諸性質の確認（温度依存性）
酵素活性を４５〜６０℃の温度範囲で測定した。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に等量の酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、４５℃での酵素活性の反応速度を１とし、各温度における相対活性の変化を比較した結果を図８に示す。
図８（ａ）はＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較を、また、図８（ｂ）はＧ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較を示す。この結果から、５０〜５５℃の温度域において、野生型ＦＤＨより改変型ＦＤＨの方が２倍程度高い活性を有することが判明した。また、Ｇ１１０ＤとＤ１２８Ｇは同様の温度依存性を示すことが判明した。
【０１０２】
＜実施例６＞酵素の諸性質の確認（温度安定性）
酵素の温度安定性を調べるために、５５〜６５℃の温度範囲で熱処理後の残存活性を調べた。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中に等量の酵素を加え、５５℃、６０℃、６５℃の各温度で０分〜１０分間熱処理し、氷中に３０分間置いた後の残存活性を測定した。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に熱処理した酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、各熱処理０分時の結果を１とし、各温度と各熱処理時間における相対活性の変化の比較を図９，１０に示す。図９はＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較を、図１０はＧ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較を示す。
【０１０３】
この結果、５５℃の熱処理では、６分間程度の熱処理において野生型ＦＤＨでは相対活性が１／１０程度になるのに対し、Ｄ１２８Ｇでは約５０％（図９（ａ））、Ｇ１１０Ｄでは約４０％（図１０（ａ））の相対活性を有することが判明した。
一方、６０℃以上の熱処理では、改変型ＦＤＨおよび野生型ＦＤＨの何れにおいても残存活性が５分程度で２０％以下になり（図９（ｂ），（ｃ）、図１０（ｂ），（ｃ））、熱変性により酵素活性を殆ど失うものと認められた。
これより、本発明の改変型ＦＤＨは、野生型ＦＤＨに比べて熱によって失活し難いものと認められた。
【０１０４】
＜実施例７＞酵素の諸性質の確認（安定性）
酵素の安定性を調べるために、５０℃と４５℃の温度下で３００分間までの残存活性を調べた。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中に等量の酵素液を加え、０分から３００分間置いた後、氷中に３０分間置いた後の残存活性を確認した。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に熱処理した酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、０分時の酵素活性の反応速度を１としたときの各時間（分）における相対活性の変化の比較を図１１に示す。図１１（ａ）は５０℃の温度下におけるＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較を、また、図１１（ｂ）は４５℃の温度下におけるＧ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較を示す。
この結果、５０℃での酵素活性の半減期は、野生型ＦＤＨでは３０分間以内であるのに対し、Ｄ１２８Ｇでは３００分以上であった。また、４５℃での酵素活性の半減期は、野生型ＦＤＨでは約２００分であるのに対し、Ｄ１２８Ｇでは３００分以上であった。
これより、本発明の改変型ＦＤＨは、野生型ＦＤＨに比べて熱安定性に優れているものと認められた。
【０１０５】
Ｄ１２８Ｇについて常温時（２５℃，３０℃）の安定性を調べた。
５０ｍＭ Ｐ１Ｐ２ＰＯ4、１ｍＭ ＨＣＨＯ、０．５ｍＭ ＮＡＤの組成を有する反応液を、Ｄ１２８Ｇを担持したNi-NTA His・Bind Resinカラム（タカラバイオ社製）、および、野生型ＦＤＨを担持したNi-NTA His・Bind Resinカラムにそれぞれ通液した。反応温度は２５℃とし、通液速度は０．１ｍＭ／分（線流速７．９ｃｍ／ｈ）とした。当該カラムを通過した反応済液の３４０ｎｍの吸光度変化を測定し、通液前の酵素活性の反応速度を１としたときの相対活性の変化の比較を図１２に示す。反応温度を３０℃とした場合も同様の実験を行なった。
この結果、反応温度を２５℃とした場合、野生型ＦＤＨの酵素活性の半減期は約５００時間程度であるのに対して、Ｄ１２８Ｇでは約８００時間程度であった（図１２）。また、反応温度を３０℃とした場合、野生型ＦＤＨの酵素活性が８０％になるのは約１７５時間程度であるのに対して、Ｄ１２８Ｇでは約４５０時間程度であった（図１３）。
これより、本発明の改変型ＦＤＨは、野生型ＦＤＨに比べて長期に亘って安定性に優れているものと認められた。
【０１０６】
＜実施例８＞酵素の諸性質の確認（反応速度論解析）
変異型酵素と野生型酵素について酵素反応速度論的な解析を行った。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、０〜４ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、酵素反応の初期速度のラインウェーバーバークプロットにより、酵素反応の速度定数（Kcat値及びKm値）を求めた。その結果を表２に示す。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
この結果、野生型ＦＤＨの２５℃、ｐＨ７．６におけるＨＣＨＯに対するＫｍ値は０．３５ｍＭ、Kcat値は３．２ｓ-1であり、Kcat/Kmは９．１Ｍ-1ｓ-1であった。また、Ｄ１２８Ｇの２５℃、ｐＨ７．６におけるＨＣＨＯに対するKm値は０．３５ｍＭ、Kcat値は３．２ｓ-1であり、Kcat/Kmは９．１Ｍ-1ｓ-1、Ｇ１１０Ｄの２５℃、ｐＨ７．６におけるＨＣＨＯに対するKm値は０．１８ｍＭ、Kcat値は２．５ｓ-1であり、Kcat/Kmは１３．９Ｍ-1ｓ-1であった。
以上より、Ｇ１１０ＤのKm値が小さく基質親和性が高いこと以外は、本発明の改変型ＦＤＨは野生型ＦＤＨとほぼ同様であることが判明した。
【０１０９】
＜実施例９＞酵素の諸性質の確認（基質選択性）
基質としてアルデヒド類とアルコール類の選択性について調べた。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ各基質を含む活性測定液中に等量の酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、各アルデヒド類とアルコール類を基質としたときの酵素活性の反応速度を１としたときの相対活性について、野生型ＦＤＨおよびＤ１２８Ｇを比較したものを表３に示す。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
この結果から、Ｄ１２８Ｇは野生型ＦＤＨと同様に、ホルムアルデヒドに対して基質特異性が高いものと認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用方法に関し、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野において利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及び当該酵素を含むバイオセンサー、並びに酵素燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.46）（Formaldehyde dehydrogenase：ＦＤＨ）は、ホルムアルデヒドを酸化してギ酸を生成する反応を触媒する。ホルアルデヒド脱水素酵素の基質となるホルムアルデヒドは、シックハウス症候群等の慢性的なアレルギー症状を引き起こす原因物質の１つとして知られている。また、稀薄な溶液でも細胞原形質のタンパク質を不可逆的に凝固させ、全ての細胞機能を停止、死滅させる作用があるために、細胞毒としても知られている。そのため、食品中、大気中などのホルムアルデヒドを測定し、これを分解及び除去することが求められており、ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性の利用が検討されている。例えば、生体試料中のホルムアルデヒドの定量等のホルムアルデヒド測定技術や、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した空気浄化フィルター等のホルムアルデヒドの除去技術等、特に環境技術の分野における応用が期待されている。
【０００３】
例えば、ホルムアルデヒドをはじめとするアルデヒド化合物やアルコール化合物を簡易に検出測定できるバイオセンサー用酵素としての利用が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。詳細には、気相中や液相中のアルデヒド化合物及びアルコール化合物を簡易に検出測定できる酵素固定化バイオセンサーが開示されており、これは、過酸化水素電極の表面にアルコール酸化酵素が固定化されると共に最表面に高分子被覆が配設され、過酸化水素の酸化電流値、またはその変化よりアルデヒド化合物もしくはアルコール化合物の存在を検出するものである。
【０００４】
また、近年、クリーンエネルギー技術として、アルコールなどのバイオマスを燃料とした酵素燃料電池が考案されており、酸化還元酵素が電池の構成部材として利用されている。一例として、メタノールを燃料とした酵素燃料電池の場合、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ホルムアルデヒドに作用してギ酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してＣＯ2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼとを用いることにより構成することができる。これにより、メタノールはＣＯ2まで分解され、メタノール１分子につき３段階の酸化反応により合計６電子が生成されることとなる。
【０００５】
そして、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、細菌、酵母から哺乳類に至るまで広く存在していることが知られており、多様な生物由来のホルムアルデヒド脱水素酵素が報告されている。例えば、パン酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae)由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献１を参照）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献２を参照）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献３を参照）等が挙げられる。
【０００６】
ホルムアルデヒド脱水素酵素には、反応にグルタチオンを要求するグルタチオン依存性、及びグルタチオンを要求しない非依存性の２つの型がある。一般に広く存在するホルムアルデヒド脱水素酵素はグルタチオン依存性であるのに対して、シュードモナス・プチダ由来のホルムアルデヒド脱水素酵素は、グルタチオン非依存的にホルムアルデヒドの酸化還元反応を触媒する特徴的な酵素であることが知られている。そして、このホルムアルデヒド脱水素酵素は、各サブユニットが３７６アミノ酸残基からなるホモ４量体酵素であることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）と共に、Ｘ線結晶構造解析の結果をもが報告され活性中心をはじめとした高次構造が明らかとなっている（例えば、非特許文献４を参照）。
【０００７】
以上の従来文献については、すべて天然に存在する野生型のホルムアルデヒド脱水素酵素に関するものである。一方、分子進化工学的手法を使って酵素の構造を改変し、酵素活性の至適温度を低温化した報告もある（非特許文献５）。これは、Pseudomonas putida由来の野生型のホルムアルデヒド脱水素酵素にアミノ酸変異を導入し、３０℃程度の低い温度域において、野生型酵素より酵素活性を１．７倍向上させたものである。
【０００８】
ところが、ホルムアルデヒド脱水素酵素に限らず酵素は、触媒作用を選択する性質が非常に強いことが知られている。例えば、酵素は、生体が生存可能な緩和な条件下で最も酵素活性を発揮し、生体内で代謝される機構を有するものであることから、酵素を構成するタンパク質構造に変化を与えるような因子の存在により酵素の活性は影響を受ける。つまり、酵素活性は、温度等の物理的条件、及びｐＨ、塩濃度等の化学的条件の影響を受けることが知られており、これらに対する安定性が低いため用途が限定されるという問題点があった。そして、従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素は、何れも天然に存在する野生型の酵素であることから、熱に対する安定性が低かった。
【０００９】
しかしながら、バイオセンサーや燃料電池への適用に際しては、多様な環境において安定して活性を保持できる酵素が不可欠であり、特に、酵素寿命に対して相関があるといわれる熱安定性の向上が要求される。従来公知の天然に存在する野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素（非特許文献１〜４）は、何れも熱に対する安定性が低かった。また、野生型のホルムアルデヒド脱水素酵素を改変したホルムアルデヒド脱水素酵素（非特許文献５）についても、活性の至適温度を低温化しているために、高い温度域では野生型酵素より熱安定性が低下しており、酵素の熱失活が生じやすくなっている。
【００１０】
そのため、従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素をバイオセンサーや燃料電池への適用した場合は、酵素の保存安定性が低く、酵素の熱失活により酵素の使用量の増大及び精度の低下が生じることから、市場の要望に十分に対応できるものではなかった。従って、高温条件下でも安定的に作用できるホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１３９７２９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Steinman CR. Jakoby WB.著、“Yeast aldehyde dehydrogenase. II. Properties of the homogeneous enzyme preparations.(酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼII)” J Biol Chem.、1968年、第243巻、第730〜734頁
【非特許文献２】Ras J. Van Ophem PW. Reijnders WN. Van Spanning RJ. Duine JA. Stouthamer AH. Harms N.著、“Isolation, sequencing, and mutagenesis of the gene encoding NAD- and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GD-FALDH) from Paracoccus denitrificans, in which GD-FALDH is essential for methylotrophicgrowth.” J Bacteriol.、1995年、第177巻、第247〜251頁
【非特許文献３】Ito K. Takahashi M. Yoshimoto T. Tsuru D.著、“Cloning and high-level expression of the glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase gene from Pseudomonas putida. ”J Bacteriol. 1994年、第176巻、第2483〜2491頁
【非特許文献４】Tanaka N. Kusakabe Y. Ito K. Yoshimoto T. Nakamura KT.著、“Crystal structure of formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida: the structural origin of the tightly bound cofactor in nicotinoprotein dehydrogenases.”J. Mol. Biol.、2002年、第324巻、第519〜533頁
【非特許文献５】Fujii Y, Yamasaki Y, Matsumoto M, Nishida H, Hada M, Ohkubo K. 著、“The artificial evolution of an enzyme by random mutagenesis: the development of formaldehyde dehydrogenase.” Biosci Biotechnol Biochem. 2004, 68(8), 1722-1727.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、高温条件下でも熱安定性に優れたホルムアルデヒド脱水素酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素の特定のアミノ酸配列領域における少なくとも１つの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素と比較して熱安定性及び保存安定性を向上できることを見出した。更に、かかる酵素を利用することにより、従来の酵素の熱安定性に関する欠点を克服し、より実用面において有利なアルデヒド検出用バイオセンサー及び燃料電池を提供できることをも見出した。本発明者らはこれらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［１３］に示す発明を提供する。
［１］野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じており、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［２］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置で生じている上記［１］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［３］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換である上記［２］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［４］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置で生じている上記［１］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［５］前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換である上記［４］に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［６］前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する上記［１］〜［５］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［７］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
［８］上記［７］に記載の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
［９］上記［８］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１０］上記［９］に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【００１６】
上記［１］〜［１０］の構成の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列（具体的には配列番号２に示すアミノ酸配列）に置ける第７０位−第１５０位のアミノ酸の何れかに改変を施している。
この位置は、酵素の補欠分子であるＺｎの結合部位に近接しており、酵素サブユニット間の界面付近とは離れている。タンパク質の構造安定化には、Ｚｎなど補欠分子の結合安定性が大きく影響することが知られていて、一般的にはアミノ酸変異の導入を避けたほうがよいと考えられている。しかし、本願のようにＺｎの結合部位に近接した位置でアミノ酸に改変を施すことで、熱安定性を向上させた新規なホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が可能となる。
好ましくは、前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換、或いは、第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換とすれば、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて顕著な熱安定性および長期安定性を有するようになる。
従って、本発明によって提供されるホルムアルデヒド脱水素酵素は、医療・食品・環境分野等の様々な産業分野におけるホルムアルデヒドの脱水素反応を要する技術に適用できる。更に、熱安定性が向上した実用性の高い本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列、並びに塩基配列が明確になったことから、遺伝子工学的手法を利用して組換え体として当該酵素を低コストかつ工業的に大量生産することが可能となった。
【００１７】
［１１］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出する、アルデヒド化合物の検出方法。
【００１８】
上記［１１］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物の検出方法が提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００１９】
［１２］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【００２０】
上記［１２］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物検出用の酵素センサーが提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００２１】
［１３］上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【００２２】
上記［１３］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用した燃料電池が提供できる。特に、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく持続的に発電を行なうことが可能となり、燃料電池の性能向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】変異遺伝子ライブラリーの作製概略を示す図である。
【図２】野生型ＦＤＨ遺伝子とその近傍領域において各プライマーが結合する位置を示す図である。
【図３】野生型ＦＤＨの構造解析を行なった結果を示した図である。
【図４】Ｄ１２８Ｇの構造解析を行なった結果を示した図である（（ａ）野生型ＦＤＨ、（ｂ）Ｄ１２８Ｇ）。
【図５】Ｇ１１０Ｄの構造解析を行なった結果を示した図である。
【図６】精製したＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨのアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した図である。
【図７】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨのｐＨ依存性を調べた結果を示した図である。
【図８】改変型ＦＤＨおよび野生型ＦＤＨの温度依存性を調べた結果を示した図である（（ａ）Ｄ１２８Ｇ，（ｂ）Ｇ１１０Ｄ）。
【図９】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの温度安定性を調べた結果を示した図である（（ａ）５５℃，（ｂ）６０℃，（ｃ）６５℃）。
【図１０】Ｇ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの温度安定性を調べた結果を示した図である（（ａ）５５℃，（ｂ）６０℃，（ｃ）６５℃）。
【図１１】改変型ＦＤＨおよび野生型ＦＤＨの安定性を調べた結果を示した図である（（ａ）Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較、（ｂ）Ｇ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較）。
【図１２】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨについて常温時（２５℃）の安定性を調べた結果を示した図である。
【図１３】Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨについて常温時（３０℃）の安定性を調べた結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
近年、クリーンエネルギー技術として、アルコールなどのバイオマスを燃料とした酵素燃料電池が考案されており、そこでは本発明のホルムアルデヒド脱水素酵素のような酸化・還元を触媒する酵素が電池の電極触媒として利用されている。一例として、メタノールを燃料とした酵素燃料電池の場合、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ホルムアルデヒドに作用して蟻酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと、蟻酸に作用してＣＯ2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼとを用いることができる。これにより、メタノールはＣＯ2まで分解され、メタノール１分子につき３段階の酸化反応により合計６電子が生成される。
【００２５】
本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素（以下、「改変型ＦＤＨ」と略する）は、天然に存在する野生型ＦＤＨのアミノ酸配列において、少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変されており、そして、野生型ＦＤＨに比べて熱安定性が向上している。ここで「少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対して、公知のＤＮＡ組換え技術、及び点変異導入方法等によって、欠失、置換、付加或いは挿入することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、付加或いは挿入されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。したがって、改変型ＦＤＨは、これらの改変は１つ有するものであっても、また２つ以上が組み合わされたものであってもよい。このような改変は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。したがって、本発明における改変型ＦＤＨには、これら双方の改変型が含まれる。
【００２６】
野生型ＦＤＨとは、自然界より分離されたＦＤＨのアミノ酸配列、及び該酵素をコードする核酸分子の塩基配列が、意図的もしくは非意図的に改変が生じている改変部位を有していないことを意味する。
【００２７】
「ＦＤＨ」とは、ホルムアルデヒドを基質としてギ酸を生成する脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質であり、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を要求する。反応式を以下に示す。
ホルムアルデヒド＋ＮＡＤ+（酸化型） → ギ酸＋ＮＡＤＨ（還元型）＋Ｈ+
【００２８】
ＦＤＨには、グルタチオン依存性、非依存性の２つの型が存在する。本発明においては何れもが対象となるが、グルタチオン非依存性が好ましい。
【００２９】
改変型の基礎となる野生型ＦＤＨは、上記の性質を有する限り何れの生物由来のものであってよい。具体的には、シュードモナス（Pseudomonas）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）等の細菌由来、及びサッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母由来のＦＤＨ等が例示される。更には、ウシ（Equus caballus）やラット（Rattus norvergicus）等の哺乳動物由来のＦＤＨをも含む。好ましくは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のＦＤＨである。しかしながら、これらに限定するものではない。
【００３０】
「安定性が向上」とは、熱、及び保存に対する当該酵素の安定性が向上することであり、一定期間の熱処理及び保存に対して、当該酵素の触媒機能の失活や活性低下が抑制できることを意味する。具体的には、改変型ＦＤＨが、野生型ＦＤＨよりも、一定期間の熱処理又は保存に供した後に維持されている酵素の触媒機能の残存率が高いことを意味する。例えば、野生型ＦＤＨの活性が維持される２５℃での酵素の酵素活性値を１００％として、加温処理後の活性値を酵素活性の残存率として算出する。この残存率が、野生型ＦＤＨと比較して増大していた場合、当該酵素の熱安定性が向上したと判断できる。また、一定期間の保存に際しての残存率が、野生型ＦＤＨと比較して増大していた場合、当該酵素の保存安定性が向上したと判断できる。一例として、５０℃にて３０分間の加温により６０％以上、特には７５％以上の残存活性を維持できる熱安定性が好ましい。また、４５℃にて１０時間の保存で６０〜８０％、３０時間の保存であっても５０〜６０％程度の残存活性を維持できる保存安定性が好ましい。
【００３１】
本発明の改変型ＦＤＨはこれに限定されるものではないが、前記改変が、野生型ＦＤＨのアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じたものが、好ましく例示される。
【００３２】
野生型ＦＤＨのアミノ酸配列において、第７０位−第１５０位におけるアミノ酸の改変は、これらの位置における何れかの改変を有するもの全てが本発明に含まれる。また、かかる位置における１のアミノ酸が改変したものであっても、複数の位置における複数のアミノ酸が改変したものであってもよい。
【００３３】
配列番号２に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ由来の野生型ＦＤＨのアミノ酸配列であるが、他の生物由来の当該酵素のホモログについても同様の位置が改変されたものは本願発明の改変型ＦＤＨに含まれる。
【００３４】
ここで、改変としては、特に好ましくは、他のアミノ酸への置換である。そして、他のアミノ酸とは、置換前のアミノ酸以外の何れもが含まれる。しかしながら、タンパク質機能改変の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と異なる性質を有するアミノ酸であることが好ましい。
例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有するが、これら以外のアミノ酸への置換はタンパク質機能へ影響を与えることが考えられる。
非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。
これらの各グループ内の以外へのアミノ酸置換は、タンパク質の機能が改変されることが特に予想されるが、これに制限されるものではない。
【００３５】
好ましくは、野生型ＦＤＨのアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換であり、または、配列番号２におけるアミノ酸配列の第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換が例示される。
【００３６】
一例として、野生型ＦＤＨとしてシュードモナス・プチダとする場合、上述した第１２８位の置換を行なったアミノ酸配列を配列番号４に、第１１０位の置換を行なったアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００３７】
更に、前述の改変型ＦＤＨの性質を保持している限り、更に特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。当業者はアミノ酸配列の改変に際して本発明の改変型ＦＤＨの酵素活性を保持する改変を容易に予測することができる。具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。
また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にＨｉｓタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等を付加したものも好適に例示される。このようなタグペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、本発明の酵素活性の喪失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。
【００３８】
本発明の改変型ＦＤＨは公知の方法によって取得することができる。例えば、改変の基礎となる野生型ＦＤＨをコードする遺伝子に対して改変を施し、得られた改変型遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から上記活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３９】
改変の基礎となる野生型ＦＤＨをコードする遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースを検索することによって取得することができる遺伝子情報を基にしてプライマーを設計し、ＦＤＨを産生し得る生物体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得することができる。また公知の遺伝子情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト法等の核酸合成法により合成することによっても取得するができる。ここで、本発明の改変型の基礎として好適なＦＤＨの配列情報として、野生型のシュードモナス・プチダ由来のＦＤＨのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、当該ＦＤＨをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００４０】
野生型ＦＤＨをコードする遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。
【００４１】
特には、野生型ＦＤＨをコードするＤＮＡを鋳型として、所望の改変（欠失又は置換）を施した配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことによって取得することが、好ましく例示される。ここで、本発明の改変型ＦＤＨの調製において、ＰＣＲを利用する場合に用いられるプライマーは、野性型ＦＤＨをコードする核酸分子と相補的な配列を含み、かつ所望の改変が生じるように設計されたものであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては１０以上、好ましくは１５以上、更に好ましくは約２０〜５０の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４２】
また、目的とする改変型ＦＤＨのアミノ酸配列が定めることにより、それをコードする適当な塩基配列を決定でき、常法のホスホルアミダイト法等の核酸合成技術を利用して本発明の改変型ＦＤＨをコードするＤＮＡを化学的に合成することができる。
【００４３】
また、このような本発明の改変型ＦＤＨ改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から前述の理化学的性質を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。
【００４４】
（本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子）
本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子は、前述の理化学的性質を有するすべての改変型ＦＤＨをコードするものを包含する。例えば、配列番号４，６に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする全てのポリヌクレオチドであり、一具体例としては、配列番号３，５に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定するものではない。ここで、本発明におけるポリヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれ、ＤＮＡである場合には、１本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。
【００４５】
本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子は、本明細書においてその塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して化学的に合成することができる。また、改変の基礎となる野生型ＦＤＨをコードするＤＮＡに対して改変を施すことによっても製造することができる。なお、詳細については前述した。
【００４６】
（本発明の組換えベクター）
そして、本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子を組み込むことによって構築することができる。利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。従って、ベクターは、本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（ｐＥＸ系、ｐＵＣ系、及びｐＢＲ系等）、ファージベクター（λｇｔ１０、λｇｔ１１、及びλＺＡＰ等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。
【００４７】
本発明の組換えベクターは、本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子がその機能を発現できるように組み込まれている。従って、核酸分子の機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく既知のプロモータ配列を利用できる。
更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００４８】
ベクターへの本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法等、既知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００４９】
（本発明の形質転換体）
本発明の形質転換体は、適当な細胞を本発明の改変型ＦＤＨをコードする核酸分子を含む組換えベクターで形質転換することによって構築することができる。ここで、宿主となる細胞としては、本発明の改変型ＦＤＨを効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌E.coli（ＤＨ５α、ＢＬ２１、ＪＭ１０９等）を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。
【００５０】
（本発明の改変型ＦＤＨの製造方法）
本発明の改変型ＦＤＨの製造方法は、前述の本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質を採取することにより行なう。即ち、前述の本発明の形質転換体を培養する培養工程と、前記培養工程で発現した前記タンパク質を回収する回収工程とを備える。このように、適当な宿主で発現させることによって、低コストで本発明の改変型ＦＤＨの大量生産が可能となる。
【００５１】
培養工程は、本発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。従って、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。
【００５２】
例えば、炭素源として、ホルムアルデヒド、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００５３】
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００５４】
精製工程は、前述の培養工程において得られた形質転換体の培養物からの本発明の改変型ＦＤＨを回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。本発明の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本発明のＦＤＨが宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、既知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本発明の酵素を単離精製することができる。
【００５５】
例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の既知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィを利用する場合、本発明の酵素をＨｉｓ Ｔａｇ等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、本発明の改変型ＦＤＨが宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。
【００５６】
続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。ここで、本発明で得られる改変型ＦＤＨは、熱安定性が高いことから、前述の単離、精製工程において熱処理を併用することが有用かつ便利である。
培養物から得られた宿主細胞及び培養上清には、当該宿主細胞由来の様々なタンパク質を含有する。しかし、熱処理を行なうことにより、宿主細胞由来の夾雑タンパク質は変性し凝縮沈殿する。これに対して、本発明の酵素は、改変型を有するため変性を生じないことから、遠心分離等により宿主由来の夾雑タンパク質と容易に分離できる。また、培養液をそのまま、若しくは粗抽出液を使用する場合においても、熱処理を行なうことにより、他のタンパク質が失活することから、実質的に本発明の改変型ＦＤＨのみの酵素液として使用することができる。従って、本発明の改変型ＦＤＨを遺伝子工学的手法により製造する場合においても、宿主由来のその他のタンパク質を容易に除去することができる。従って、精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００５７】
そして、精製されたＦＤＨが所望の改変が生じている改変部位を有する本発明の改変型ＦＤＨであるか否かの確認は、その理化学的性質や配列の分析によって行うことができる。理化学的性質の分析による場合、一定期間、熱処理に付した後、酵素の酵素活性を公知の方法により測定し改変部位を有しない野生型ＦＤＨと比較して、活性の残存率が高いか否かを確認することによって行うことができる。従って、基質であるアルデヒド化合物に対してＮＡＤ+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。
【００５８】
酵素の活性は、ＮＡＤ+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法を何れをも利用して行うことができる。例えば、ＮＡＤ+の存在下で、本発明の酵素をアルデヒド化合物と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するＮＡＤＨ量の変化を３４０ｎｍの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができる。従って、ＦＤＨ活性は、ホルムアルデヒド及びＮＡＤ+から、ギ酸及びＮＡＤＨを生成する触媒反応において、生成したＮＡＤＨを直接定量することによって測定できる。つまり、酵素反応によりホルムアルデヒドが酸化されギ酸となり、このときＮＡＤが還元されＮＡＤＨが生成する（反応式：ＨＣＨＯ＋ＮＡＤ+＋Ｈ2Ｏ → ＨＣＯＯＨ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+）。このＮＡＤからＮＡＤＨの生成を３４０ｎｍの吸光度変化を測定して酵素活性とした。この配列分析による場合には、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法が利用できる。
【００５９】
（アルデヒド化合物の検出方法）
本発明の改変型ＦＤＨは、試料中のアルデヒド化合物の検出のために利用することができる。アルデヒド化合物の検出は、例えば、基質であるアルデヒド化合物に対してＮＡＤ+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。酵素の活性は、ＮＡＤ+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、ＮＡＤ+の存在下で、本発明の酵素を測定対象となる試料と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するＮＡＤＨ量の変化を３４０ｎｍの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができ、ひいてはＮＡＤＨ量の変化によりアルデヒド化合物の存在を検出することができる。したがって、ＦＤＨ活性は、その触媒反応において、生成したＮＡＤＨを直接定量することによって測定できる。
反応液としては、例えば、ホルムアルデヒド等のアルデヒド基質、２ｍＭのＮＡＤ+、２５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ＭのＮａＣｌ及び本発明の酵素溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．８）中にて混合して２００μＬとすることにより調製することができる。しかしながら、これは標準条件であり、適宜変更することができる。この反応液を、３７℃で波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行うことができ、吸光度の測定は、既知のマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いることができる。
そして、適当な試験条件が選択されていれば、この変化は、測定しようとする酵素活性に直線的に比例する。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた吸光度変化値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００６０】
ここで、試料としては、アルデヒド化合物等、ＦＤＨの基質となり得る化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。例えば、血液、尿、唾液等の生物体由来の生物試料、食品試料、環境試料等が例示されるがこれに限定されるものではない。また、必要に応じて、これらの試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。特に、本発明の改変型ＦＤＨは優れた熱安定性を示すことから、温度が高い試料の分析に際して好適に利用できる。そして、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００６１】
（アルデヒド化合物検出用のバイオセンサー）
本発明は、本発明の改変型ＦＤＨを利用するアルデヒド化合物検出用のバイオセンサーを提供する。当該検出センサーは、電極材上に本発明の改変型ＦＤＨが固定化した作用電極、及びその対極を設けて構成される。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。電極材上への酵素の固定化は既知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。そして、本発明のＦＤＨの酵素活性に際して要求される補酵素ＮＡＤ+、ＮＡＤ+の還元体であるＮＡＤＨを酸化する能力を有する酸化酵素（ジアホラーゼ等）、電子メディエーター（フェロセン、ジクロロインドフェノール等）も、必要に応じて電極材上に固定化して構成される。
【００６２】
アルデヒド化合物の測定は、例えば、測定対象となる試料を接触させると試料中のアルデヒド化合物が作用極上に固定された本発明の改変型ＦＤＨと反応し、続いて電子メディエーターが還元される。そして、電極系に電圧を印加して電子受容体の還元体を酸化し、得られる酸化電流値の変化により試料中のアルデヒド化合物を検出することができる。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた酸化電流値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００６３】
ここで、試料としては、本発明の改変型ＦＤＨの基質となり得るアルデヒド化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。詳細については前述した。特には、前述の通り、本発明の改変型ＦＤＨは、熱安定性が高いことからバイオセンサー製作時における劣化をも防止することができ、また、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００６４】
（本発明の燃料電池）
本発明は、本発明の改変型ＦＤＨを利用する燃料電池を提供する。本発明の燃料電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極と、還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアソードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。
アノード電極側では、本発明の改変型ＦＤＨがアルデヒド化合物を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。一方、カソード側では、アノード側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。アノード極側には本発明の改変型ＦＤＨが供給され、適当な緩衝液中に溶解させた形態で供給してもよいが、電極上に固定化されることが好ましい。このとき、改変型ＦＤＨは、好ましくはＮＡＤと共に固定化されることが好ましく、特にはＮＡＤと結合したホロ酵素の形態で固定化されることが好ましい。また、アポ酵素の形態で固定化し、ＮＡＤを適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。
カソード極側には、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素を必要に応じて供給してよい。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
【００６５】
以上のように構成することにより、燃料であるアルデヒド化合物を酸化する際に生じた電子がアノード極に電子を受け渡す。そして、アノード極に渡された電子は、外部回路を経てカソード極に到達することで電流が発生する。燃料となるアルデヒド化合物としては、本発明の改変型ＦＤＨの基質となり得るアルデヒド化合物であれば制限はない。
【００６６】
また、メタノールを燃料とした酵素燃料電池においても本発明の改変型ＦＤＨを利用できる。その場合には、触媒として、本発明の改変型ＦＤＨに加え、必要に応じてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してＣＯ2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼを併用することにより構成することができる。
【００６７】
本発明の燃料電池は、熱安定性が高い本発明の改変型ＦＤＨの触媒能力を利用することから、持続的に発電を行なうことができ、高性能の燃料電池として構築することができる。また、本発明の改変型ＦＤＨは、熱安定性が高いことから燃料電池製作時における劣化をも防止することができ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【実施例】
【００６８】
＜実施例１＞本発明の改変型ＦＤＨ遺伝子のクローニング
分子進化工学的手法と称される酵素改変手法を利用して、本発明の改変型ＦＤＨ遺伝子のクローニングを行った。
【００６９】
かかる分子進化工学的手法とは、生物進化の原理をタンパク質に応用する技術である。そのステップとしては、まずランダムに改変の基礎となる遺伝子に変異を導入し、可能な限り多様な改変型遺伝子を作り出す。そして、改変型遺伝子から改変型タンパク質を作製して、その中から所望の性質を保持するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。このようにして、設計原理が未知であっても所望の機能や性質を保持する高分子を取得することができ、取得した遺伝子の変異箇所及び変異様式を調べることによって、高分子設計原理の研究においても威力を発揮することができる。
【００７０】
Pseudomonas putida由来の野生型ＦＤＨの立体構造はＸ線解析により既に明らかにされており、各サブユニットが３９８アミノ酸残基からなる4量体構造を有する。野生型ＦＤＨの立体構造データは、日本蛋白質構造データバンクで公開されているものを利用した（http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1KOL）。この野生型ＦＤＨのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造を検討すると、4量体酵素のサブユニットの界面付近にループ領域（Ｋ７６−Ｄ７９）が存在し、この領域が高次構造におけるサブユニット間相互作に影響を及ぼし、熱安定性を支配していることが示唆される。
熱安定性向上効果が見込める部位を鋭意検討した結果、第７０位−第１５０位のアミノ酸領域（Ｔｈｒ７０−Ｌｅｕ１５０）が４量体酵素のサブユニットの界面のドメイン間の構造安定化に寄与するホットスポットである可能性が高いと考え、このホットスポット周辺へランダム変異を導入したライブラリーを作製し、スクリーニングを行うことより、構造が最適化し熱安定性が向上した変異体を取得できると考えた。なお、これら検討のための一連の酵素の立体構造解析は、アクセリス社製のInsight-II（酵素の分子構造を表示し、かつ構造エネルギー計算が可能なソフトウェア）を用いて行った。分子進化工学的手法を用いた酵素改変の具体的な手順を次に示す。
【００７１】
（ステップ１） 酵素遺伝子の取得
バクテリアPseudomonas putida株は、ＮＩＴＥ（独立行政法人製品評価技術基盤機構）から入手した（受託番号 NBRC No. NBRC3738）。そのゲノムＤＮＡは、添付資料に記載の培養液を使って菌体を培養し、ゲノムＤＮＡ抽出キット（プロメガ社製）を使って抽出と精製を行った。このゲノムＤＮＡを鋳型にして以下のプライマー１，２（配列番号７，８）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、鋳型として５０ｎｇゲノムＤＮＡおよび各０．２μＭのプライマーのそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の精製はＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。その結果、予想されるＤＮＡ増幅産物（約１．２ｋｂｐ）を得ることができた。
【００７２】
5'-GAGCA TATGT CTGGT AATCG TGGTG T-3'（プライマー１：配列番号７）
5'-CTAAA GCTTA GGCCG CGCTG AGGTC T-3'（プライマー２：配列番号８）
【００７３】
（ステップ２） 発現ベクターの構築
ＰＣＲ増幅で得られたＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ）を、制限酵素NdeIとHindIIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離しゲルから精製した。ＤＮＡ断片を、タンパク質発現用プラスミドのｐＥＴ２３ｂベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位NdeIとHindIIIにライゲーション反応より組み込んで酵素の発現ベクターを構築した。
また無細胞システムを使った酵素合成用の鋳型とする直鎖状ＤＮＡを調製するために、酵素遺伝子を組み込んだベクターを鋳型にして、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーター配列間をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を使用し、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマー３，４（配列番号９，１０、各０．２μＭ）を滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の精製には、ＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
【００７４】
5'- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC -3' （プライマー３：配列番号９）
5'- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG -3' （プライマー４：配列番号１０）
【００７５】
（ステップ３） 変異遺伝子ライブラリーの作製
ランダム変異を導入した変異遺伝子ライブラリーの作製は、変異導入のための手法にエラープローンＰＣＲを用いた。ライブラリー作成を行うために、酵素ＦＤＨ分子内に１〜２箇所の変異導入が得られる条件（エラー率０．５％前後となるエラープローンＰＣＲ条件）を検討した。ポリメラーゼの塩基取り込み間違いを促進させるために、マグネシウム濃度とマンガン濃度を［Ｍｇ，Ｍｎ］＝［５，０．５］ｍＭとした。
エラープローンＰＣＲ反応は、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、各０．５μＭのプライマー５，６（配列番号１１，１２）、１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．３）緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。
【００７６】
5'-CGGCCTGGTCCTGGGCCACGAAATC-3'（プライマー５：配列番号１１）
5'-TGGCCTTGTCGCGCTCAGGCAGCTT-3'（プライマー６：配列番号１２）
【００７７】
次に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入したＦＤＨ遺伝子断片と、変異を導入しないＦＤＨ遺伝子の残りの部分をコードするＤＮＡ断片を連結するために、オーバーラッピングＰＣＲを行った。
まず変異を導入しないＤＮＡ断片を得るために、ステップ２で作製した発現ベクターを鋳型にして、プライマー７，８（配列番号１３，１４）およびプライマー９，１０（配列番号１５，１６）をそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマー（各０．２μＭ）のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の精製はＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
【００７８】
5'- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC -3' （プライマー７：配列番号１３）
5'- GATTTCGTGGCCCAGGACCAGGCCG -3' （プライマー８：配列番号１４）
5'- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG -3' （プライマー９：配列番号１５）
5'- AAGCTGCCTGAGCGCGACAAGGCCA -3' （プライマー１０：配列番号１６）
【００７９】
得られた３つのＤＮＡ断片を鋳型にして、プライマー７，１０を用いてＰＣＲ増幅を行った後、さらに反応終了液に含まれるＰＣＲ産物を鋳型にしてプライマー１１，１２（配列番号１７，１８）を用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、プライマー（各０．２μＭ）のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒、６８℃で６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の精製には、ＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
次に、得られた酵素遺伝子をコードするＤＮＡ断片に、１分子ＰＣＲ用プライマー配列を付加するために、プライマー１３（配列番号１９）を用いたＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）、プライマー（各０．３μＭ）のそれぞれを混合して滅菌蒸留水で５０μＬにメスアップすることにより反応液を調製し、製造業者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒のサイクルを２０回繰り返した。ＰＣＲ産物の精製には、ＤＮＡ精製キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。以上の実施した内容の模式図を図１，２に示す。
【００８０】
5'-GGAGCTAGGGTTTACGAGTGGAATG-ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3'（プライマー１１，配列番号１７）
5'-GGAGCTAGGGTTTACGAGTGGAATG-TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3'（プライマー１２，配列番号１８）
5'-GGAGCTAGGGTTTACGAGTGGAATG-3' （プライマー１３，配列番号１９）
【００８１】
以上により、ＦＤＨをコードする遺伝子のコーディング領域中のホットスポット（アミノ酸領域Ｔｈｒ７０−Ｌｅｕ１５０）に、変異を導入した変異遺伝子ライブラリーを作製した。変異遺伝子ライブラリーを、デキストランを含む希釈液で、１．５分子／μＬに希釈し、３８４プレートに分注した。その後、１μＬ希釈液／１反応ウェルでＰＣＲ増幅した。変異遺伝子ライブラリーの希釈倍率算出に使用した計算式を次に示す。
【００８２】
ＤＮＡの長さ：１４００ｂｐ
分子量：０．９２４×１０6
１μｇ ＤＮＡ：１．０８×１０-6μｍｏｌ＝１．０８×１０-12ｍｏｌ
１μｇ ＤＮＡ：６．０２×１０23×１．０８×１０-12＝６．５×１０11分子に相当
【００８３】
この計算から、変異遺伝子（ＤＮＡ）のゲル切り出し精製したＤＮＡ溶液は、９．１×１０9分子／μＬと算出でき、このＤＮＡ溶液を３×１０9希釈したものを、次のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡに使用した。ＰＣＲ反応温度条件は、９８℃で１０秒、６８℃で１分のサイクルを７０回繰り返した後、６８℃で１０分の伸長反応を行なった。
【００８４】
（ステップ４） 無細胞タンパク質合成システムを用いた酵素合成とスクリーニング
ラビットトランスレーションシステムRTS100,E.coli HYキット（ロシュ社製）を使って取扱説明書に従い、反応時間は４時間、反応温度は３０℃を基本条件として改変ＦＤＨを合成した。
変異遺伝子ライブラリーを鋳型にして、大腸菌の無細胞タンパク質合成系でタンパク質を合成し、上述の条件を用いてホルムアルデヒドに対する酵素活性についてスクリーニングし、熱処理後の残存活性が野生型ＦＤＨより向上した酵素活性を発現する改変ＦＤＨの候補遺伝子を選択した。
【００８５】
酵素の活性測定は、８μＬの酵素合成終了液に、３２μＬのリン酸緩衝液を混和して４０μＬとし、分注装置を使って１６μＬを新しい３８４ウェルプレート２枚に移した。２枚のプレートのうち、１枚を熱処理（１５分、５５℃）した後、氷中に１５分間放置し、その後、８０μＬの活性測定反応液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、４０ｍＭ ＮＡＤ、０．０６％ＨＣＨＯ）を加えて、ＮＡＤ+からＮＡＤＨ変化に伴う３４０ｎｍの吸光度変化をプレートリーダで測定した。
【００８６】
（ステップ５） スクリーニングで選択したクローンの解析
熱処理後も残存する酵素活性が認められた酵素の合成に使用した変異遺伝子ライブラリーについて、塩基配列を解析してアミノ酸変異を同定し、それらのタンパク質合成と酵素活性の有無も確認した。
タンパク質合成は、無細胞タンパク質合成系ラビットトランスレーションシステムRTS100,E.coli HYキット（ロシュ社製）を用いて、その取り扱い説明書に従って行なった。酵素の有無は、FluoroTect（登録商標） GreenLys in vitro Translation Labeling System（プロメガ社製）を用いて、その取り扱い説明書に従って合成酵素を蛍光標識して確認した。
【００８７】
酵素活性の測定は、ホルムアルデヒド脱水素酵素によるホルムアルデヒド分解活性を、ＮＡＤＨの３４０ｎｍの吸光を指標として行なった。８０μＬの活性測定反応液（５０ｍＭリン酸緩衝液Ｋ１Ｋ２ＰＯ4 ｐＨ７．４、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯ）に酵素溶液を加えて、ＮＡＤからＮＡＤＨ変化に伴う３４０ｎｍの吸光度変化を５分間（１０秒間隔）プレートリーダで測定した。結果を表１に示す。
【００８８】
【表１】
【００８９】
表中における「アミノ酸変異部位」において、例えば「Ｅ７６Ｖ」との表記は、野生型ＦＤＨのアミノ酸配列である配列番号２における第７６番目のグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）に置換されたことを表す。
本実施例でアミノ酸変異が認められた部位は、クローンＰ１６では第７６位、第８１位、第２１９位であり、クローンＦ１２では第１２７位、第１４２位であり、クローンＫ１１では第９７位、第１４８位であり、クローンＮ２０では第１２９位であり、クローンＰ１３では第１４９位であり、クローンＯ６，Ｐ４では第１２８位であり、クローンＨ１では第１１０位であり、クローンＫ３では第９４位であった。尚、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始コドンであるメチオニンを１として番号付けしている。
【００９０】
この中で、タンパク質合成と酵素活性が確認できたものは、クローンＯ６，Ｐ４（第１２８番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換されている）と、クローンＨ１（第１１０番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換されている）であった。
【００９１】
表１の結果より、アミノ酸変異Ｄ１２８ＧおよびＧ１１０Ｄ以外では、変異が１個入っただけの改変で酵素活性が全くなくなるものと認められた。つまり、アミノ酸変異が１個ではタンパク質の構造学的には、１０Å程度の距離にしか構造変化の影響を与えないとされているが、このPseudomonas putida由来のＦＤＨは、その微小な構造変化でも酵素の構造的な安定性に影響を与えてしまうデリケートで複雑な構造をしている酵素であるといえる。
その中でも特に、Ｖ１２７ＤはＤ１２８Ｇの隣のアミノ酸変異であるが、当該Ｖ１２７Ｄでは酵素活性がなくなるのに対してＤ１２８Ｇでは酵素活性を有していることから、Ｄ１２８ＧがPseudomonas putida由来のＦＤＨの安定性に重要であると推察されると同時に、従来法での酵素改変は非常に困難であることが推測できる。
【００９２】
以下、第１２８番目のアスパラギン酸がグリシンに改変されたアミノ酸配列を有する改変ＦＤＨを「Ｄ１２８Ｇ」、第１１０番目のグリシンがアスパラギン酸に改変されたアミノ酸配列を有する改変ＦＤＨ「Ｇ１１０Ｄ」と称する。
【００９３】
＜実施例２＞改変型ＦＤＨの立体構造シミュレーションに基づく高次構造の解析
Ｄ１２８ＧおよびＧ１１０Ｄの立体構造モデルの構築を行なった。モデリングは、アクセルリス社製Discovery Studio21を用いて、Ｘ線結晶解析データ（ＰＤＢ；１ＫＯＬ）を参照構造として、ホモロジーモデリングにより実施した。
【００９４】
まず、野生型ＦＤＨ（ＰＤＢ；１ＫＯＬ）を用いて変異部位の解析を行なった（図３）。
触媒ドメインとコファクター結合ドメインは、Ｚｎ１近傍で上下に分かれる。ＮＡＤとＺｎ１の相互作用は、両ドメインの位置・構造の安定性に関係していると考えられる。Ｄ１２８（第１２８位のアスパラギン酸）およびＧ１１０（第１１０位のグリシン）は、両ドメインの界面に位置する。特に、Ｇ１１０はＺｎ２保持ループの根元付近に位置する。Ｚｎ２保持ループ周辺は両ドメインの分岐から遠く、パッキングが不十分もしくは安定性が低い可能性が考えられる。
【００９５】
Ｄ１２８Ｇの構造モデルの解析結果は以下の通りである（図４）。
図４（ａ）には野生型ＦＤＨ、図４（ｂ）にはＤ１２８Ｇの構造モデルを示した。モデルは分子内の原子に接触する溶媒の接触点によってトレースされるサーフェイス形状で表示した。図４（ａ）（ｉｉ），図４（ｂ）（ｉｉ）は、それぞれ図４（ａ）（ｉ），図４（ｂ）（ｉ）のモデルを９０℃回転させたモデルを示した。
野生型ＦＤＨではＤ１２８とＲ１１９（第１１９位のアルギニン）は静電作用で側鎖が並ぶように位置し、その内側のアミノ酸残基Ｙ１２６（第１２６位のチロシン）およびＭ１２９（第１２９位のメチオニン）の間には空間が存在していた。Ｄ１２８Ｇ変異体では、Ｄ１２８とＲ１１９の側鎖は野生型とは反対方向を向いており、その内側のアミノ酸残基（Ｙ１２６とＭ１２９）の側鎖が内部に向いたことにより、Ｄ１２８とＲ１１９も内側にコンパクトにパッキングされたと推測される。余分なキャビティが無くなったことが安定性向上に寄与しているのではないかと推測された。
【００９６】
Ｇ１１０Ｄの構造モデルの解析結果は以下の通りである（図５）。
野生型ＦＤＨとＧ１１０Ｄの主鎖の重ね合わせを行った。
Ｇ３３７（第３３７位のグリシン），Ｑ３３８（第３３８位のグルタミン），Ｔ３３９（第３３９位のトレオニン），Ｐ３４０（第３４０位のプロリン）は、ＮＡＤと相互作用するアミノ酸残基、Ｎ９３（第９３位のアスパラギン）はＮＡＤと相互作用するアミノ酸残基の隣の残基、Ｃ１１２（第１１２位のシステイン）はＺｎ２保持アミノ酸残基であったことから、側鎖の向きの変化により、酵素の安定性に何らかの寄与をしたと推測された。
【００９７】
＜実施例３＞組換え大腸菌によるタンパク質の発現と精製
タンパク質発現は、野生型または改変型ＦＤＨをコードする遺伝子を、大腸菌用の発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂ ＤＮＡのマルチクローニングサイトにＣ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現するように挿入し、構築されたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。大腸菌の培養は、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入りのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中を使って３７℃で行なった。形質転換した大腸菌は、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地で培養し、培養液の吸光度ＯＤ600＝０．６で０．５ｍＭ ＩＰＴＧ(isopropyl-s-D-thiogalactopyranoside)を添加してタンパク質の合成誘導を行ない、さらに４時間の培養を行なった。
【００９８】
発現させたＨｉｓタグ融合タンパク質は、アフィニティーカラムを用いて精製した。具体的には、遠心分離により回収した菌体を、リン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁した。菌体を超音波で破砕した。破砕は、超音波処理３０秒、氷冷３０秒のセットを１０回繰り返して行なった。遠心分離により得られた上清５０ｍＭ ＮａＣｌを加え、酵素液をＮｉ２+カラムクロマトグラフィー通液し、３００ｍＭイミダゾールを含む溶液で融合タンパク質を溶出して、活性画分をまとめ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を透析外液として一晩透析を行った。
得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．４）にて透析した。タンパク質の確認は、２０μＬの酵素溶液に２０μＬの可溶化液を加えて３分間９５℃で熱処理したサンプルを、１２．５％アクリルアミドゲルで電気泳動し、ＣＢＢ染色法で酵素を可視化することにより行った。その結果を図６に示す。レーン１は精製した改変型ＦＤＨ Ｄ１２８Ｇ、レーン２は精製した野生型ＦＤＨである。
【００９９】
この結果、Ｄ１２８Ｇは、野生型ＦＤＨと同様に約５０ｋＤａのバンドが認められたため、大腸菌用の発現ベクターで発現することが確認できた。
【０１００】
＜実施例４＞酵素の諸性質の確認（ｐＨ依存性）
酵素活性をｐＨ５．０〜１０．０の範囲で測定した。５０ｍＭ緩衝液、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に等量の酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、２５℃でｐＨ８．０の酵素活性の反応速度を１とし、各ｐＨにおける相対活性の変化を比較した結果を図７に示す。
この結果から、Ｄ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨは、ｐＨ５．０からｐＨ８．０までは同じｐＨ特性を示し、至適ｐＨはｐＨ８．０付近であることが判明した。一方、ｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０では、Ｄ１２８Ｇより野生型ＦＤＨの方が、活性低下が小さいことが判明した。また、Ｇ１１０Ｄについても、Ｄ１２８Ｇと同様のｐＨ依存性を示すことが判明した（結果は示さない）。尚、図７においてｐＨ領域Ａ（８以下）についてはリン酸緩衝液を使用し、ｐＨ領域Ｂ（８以上）についてはＴｒｉｓ緩衝液を使用した。
【０１０１】
＜実施例５＞酵素の諸性質の確認（温度依存性）
酵素活性を４５〜６０℃の温度範囲で測定した。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に等量の酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、４５℃での酵素活性の反応速度を１とし、各温度における相対活性の変化を比較した結果を図８に示す。
図８（ａ）はＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較を、また、図８（ｂ）はＧ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較を示す。この結果から、５０〜５５℃の温度域において、野生型ＦＤＨより改変型ＦＤＨの方が２倍程度高い活性を有することが判明した。また、Ｇ１１０ＤとＤ１２８Ｇは同様の温度依存性を示すことが判明した。
【０１０２】
＜実施例６＞酵素の諸性質の確認（温度安定性）
酵素の温度安定性を調べるために、５５〜６５℃の温度範囲で熱処理後の残存活性を調べた。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中に等量の酵素を加え、５５℃、６０℃、６５℃の各温度で０分〜１０分間熱処理し、氷中に３０分間置いた後の残存活性を測定した。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に熱処理した酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、各熱処理０分時の結果を１とし、各温度と各熱処理時間における相対活性の変化の比較を図９，１０に示す。図９はＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較を、図１０はＧ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較を示す。
【０１０３】
この結果、５５℃の熱処理では、６分間程度の熱処理において野生型ＦＤＨでは相対活性が１／１０程度になるのに対し、Ｄ１２８Ｇでは約５０％（図９（ａ））、Ｇ１１０Ｄでは約４０％（図１０（ａ））の相対活性を有することが判明した。
一方、６０℃以上の熱処理では、改変型ＦＤＨおよび野生型ＦＤＨの何れにおいても残存活性が５分程度で２０％以下になり（図９（ｂ），（ｃ）、図１０（ｂ），（ｃ））、熱変性により酵素活性を殆ど失うものと認められた。
これより、本発明の改変型ＦＤＨは、野生型ＦＤＨに比べて熱によって失活し難いものと認められた。
【０１０４】
＜実施例７＞酵素の諸性質の確認（安定性）
酵素の安定性を調べるために、５０℃と４５℃の温度下で３００分間までの残存活性を調べた。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中に等量の酵素液を加え、０分から３００分間置いた後、氷中に３０分間置いた後の残存活性を確認した。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に熱処理した酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、０分時の酵素活性の反応速度を１としたときの各時間（分）における相対活性の変化の比較を図１１に示す。図１１（ａ）は５０℃の温度下におけるＤ１２８Ｇおよび野生型ＦＤＨの比較を、また、図１１（ｂ）は４５℃の温度下におけるＧ１１０Ｄおよび野生型ＦＤＨの比較を示す。
この結果、５０℃での酵素活性の半減期は、野生型ＦＤＨでは３０分間以内であるのに対し、Ｄ１２８Ｇでは３００分以上であった。また、４５℃での酵素活性の半減期は、野生型ＦＤＨでは約２００分であるのに対し、Ｄ１２８Ｇでは３００分以上であった。
これより、本発明の改変型ＦＤＨは、野生型ＦＤＨに比べて熱安定性に優れているものと認められた。
【０１０５】
Ｄ１２８Ｇについて常温時（２５℃，３０℃）の安定性を調べた。
５０ｍＭ Ｐ１Ｐ２ＰＯ4、１ｍＭ ＨＣＨＯ、０．５ｍＭ ＮＡＤの組成を有する反応液を、Ｄ１２８Ｇを担持したNi-NTA His・Bind Resinカラム（タカラバイオ社製）、および、野生型ＦＤＨを担持したNi-NTA His・Bind Resinカラムにそれぞれ通液した。反応温度は２５℃とし、通液速度は０．１ｍＭ／分（線流速７．９ｃｍ／ｈ）とした。当該カラムを通過した反応済液の３４０ｎｍの吸光度変化を測定し、通液前の酵素活性の反応速度を１としたときの相対活性の変化の比較を図１２に示す。反応温度を３０℃とした場合も同様の実験を行なった。
この結果、反応温度を２５℃とした場合、野生型ＦＤＨの酵素活性の半減期は約５００時間程度であるのに対して、Ｄ１２８Ｇでは約８００時間程度であった（図１２）。また、反応温度を３０℃とした場合、野生型ＦＤＨの酵素活性が８０％になるのは約１７５時間程度であるのに対して、Ｄ１２８Ｇでは約４５０時間程度であった（図１３）。
これより、本発明の改変型ＦＤＨは、野生型ＦＤＨに比べて長期に亘って安定性に優れているものと認められた。
【０１０６】
＜実施例８＞酵素の諸性質の確認（反応速度論解析）
変異型酵素と野生型酵素について酵素反応速度論的な解析を行った。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、０〜４ｍＭ ＨＣＨＯを含む活性測定液中に酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、酵素反応の初期速度のラインウェーバーバークプロットにより、酵素反応の速度定数（Kcat値及びKm値）を求めた。その結果を表２に示す。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
この結果、野生型ＦＤＨの２５℃、ｐＨ７．６におけるＨＣＨＯに対するＫｍ値は０．３５ｍＭ、Kcat値は３．２ｓ-1であり、Kcat/Kmは９．１Ｍ-1ｓ-1であった。また、Ｄ１２８Ｇの２５℃、ｐＨ７．６におけるＨＣＨＯに対するKm値は０．３５ｍＭ、Kcat値は３．２ｓ-1であり、Kcat/Kmは９．１Ｍ-1ｓ-1、Ｇ１１０Ｄの２５℃、ｐＨ７．６におけるＨＣＨＯに対するKm値は０．１８ｍＭ、Kcat値は２．５ｓ-1であり、Kcat/Kmは１３．９Ｍ-1ｓ-1であった。
以上より、Ｇ１１０ＤのKm値が小さく基質親和性が高いこと以外は、本発明の改変型ＦＤＨは野生型ＦＤＨとほぼ同様であることが判明した。
【０１０９】
＜実施例９＞酵素の諸性質の確認（基質選択性）
基質としてアルデヒド類とアルコール類の選択性について調べた。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＮＡＤ+、２ｍＭ各基質を含む活性測定液中に等量の酵素液（０．５ｍｇ/ｍＬ）を加え、各アルデヒド類とアルコール類を基質としたときの酵素活性の反応速度を１としたときの相対活性について、野生型ＦＤＨおよびＤ１２８Ｇを比較したものを表３に示す。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
この結果から、Ｄ１２８Ｇは野生型ＦＤＨと同様に、ホルムアルデヒドに対して基質特異性が高いものと認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用方法に関し、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野において利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じており、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項２】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置で生じている請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項３】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換である請求項２に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項４】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置で生じている請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項５】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換である請求項４に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項６】
前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１〜５の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出するアルデヒド化合物の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【請求項１３】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【請求項１】
野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列における第７０位−第１５０位で生じており、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項２】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置で生じている請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項３】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１２８位に対応する位置におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換である請求項２に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項４】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置で生じている請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項５】
前記改変が、前記アミノ酸配列の第１１０位に対応する位置におけるグリシンのアスパラギン酸への置換である請求項４に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項６】
前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１〜５の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出するアルデヒド化合物の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【請求項１３】
請求項１〜６の何れか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−６７１３７（Ｐ２０１１−６７１３７Ａ）
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２０９７０（Ｐ２００９−２２０９７０）
【出願日】平成２１年９月２５日（２００９．９．２５）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２５日（２００９．９．２５）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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