改変蛍光蛋白質
【課題】蛋白質に加えられる力を感知することができる改変蛋白質の提供。
【解決手段】蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質。
【解決手段】蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変蛍光蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光蛋白質、例えば緑色蛍光蛋白質は、基礎研究及び応用研究において、蛋白質を蛍光標識する材料として用いられる。蛍光蛋白質による蛍光標識は、光学顕微鏡下において、蛋白質の局在及び運動の観察を可能とする。しかしながら、蛋白質の局在及び運動は、生体内における機能を、必ずしも反映しているとは限らない。
【０００３】
非特許文献１によると、蛍光蛋白質の蛍光共鳴エネルギー転移を利用する事により、蛋白質の多量体化及び立体構造変化を視覚化することができる。蛍光共鳴エネルギー転移には、異なる吸収・蛍光波長を持つ２種の蛍光蛋白質を、連結させて使用する。特許文献１によると、同様の技術で、細胞内のカルシウム濃度を視覚化できる。蛍光共鳴エネルギー転移を用いた発明には、上記の他に、細胞分裂期を視覚化する蛍光蛋白質（非特許文献２）、アデノシン３リン酸の濃度を視覚化する蛍光蛋白質（非特許文献３）、及び、他蛋白質との相互作用を視覚化する蛍光蛋白質（非特許文献４）などがある。しかしながら、これらの方法では、二つの蛍光蛋白質が標識される蛋白質に融合される事が必須となる。そのため、二つの蛍光蛋白質の大きさが標識される蛋白質の機能への阻害効果が懸念される。蛋白質を蛍光標識するための物質は、可能な限り小さい方が好ましい。また、非特許文献５は、蛍光蛋白質の吸収及び蛍光波長が溶媒中のｐＨによって変化する特性を利用したｐＨ感受性の蛍光蛋白質を開示し、特許文献２は、蛋白質の酵素活性、より具体的には、ヒストンのアセチル化を検出する蛍光蛋白質を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１８４６９９号公報
【特許文献２】特開２００８−１６７６７８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tsien R.Y. and Miyawaki A. (1998) Science 280, 1954-1955.
【非特許文献２】Sunabori T., Tokunaga A., Nagai T., Sawamoto K., Okabe M., Miyawaki A., Matsuzaki Y., Miyata T. and Okano H. (2008) J Cell Sci. 121, 1204-1212.
【非特許文献３】Imamura H., Nhat K.P.H., Togawa H., Saito K., Iino R., Kato-Yamada Y., Nagai T. and Noji H. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 15651-15656.
【非特許文献４】Wang H., Nakata E. and Hamachi, I. (2009) ChemBioChem 00, 1-19.
【非特許文献５】Kneen M., Farinas J., Li Y. and Verkman A.S. (1998) Biophys J 74, 1591-1599.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、筋肉の収縮を担う蛋白質あるいは細胞環収縮を担う蛋白質あるいは細胞内小胞を輸送する蛋白質に挙げられるような、力を発する事を機能とする蛋白質の力発生を視覚化できる蛍光蛋白質の報告はない。
【０００７】
そこで、本発明は、二つの異なる蛍光蛋白質を繋げて得られたものではない改変蛋白質であって、蛋白質に加えられる力を感知することができる改変蛋白質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質（以下、「本発明の改変蛋白質」ともいう。）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の改変蛋白質によれば、二つの異なる蛍光蛋白質を繋げることによる蛍光共鳴エネルギー転移を用いずに、蛋白質に加えられる力を感知することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、円順列変異緑色蛍光蛋白質（ｃｐＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、円順列変異黄色蛍光蛋白質（ｃｐＹＦＰ）、ｃｐＹＦＰ−β１、ｃｐＹＦＰ−β２、及び、ｃｐＹＦＰ−β３の模式図である。
【図２】ＧＦＰ（黒線）とｃｐＧＦＰ（灰線）のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性（上）及び波長４８８ナノメートルのレーザーで励起した時の蛍光波長特性（下）を示すグラフである。
【図３】ＹＦＰ（黒線）とｃｐＹＦＰ（灰線）のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性（左）及び波長４８８ナノメートルのレーザーで励起した時の蛍光波長特性（右）を示すグラフである。
【図４】ｃｐＹＦＰ−β１のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性を示すグラフである。
【図５】ｃｐＹＦＰ−β２のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性を示すグラフである。
【図６】ｃｐＹＦＰ−β３のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
蛍光蛋白質は、ベータカン構造と呼ばれる円柱構造を持つ蛋白質である。ベータカン構造の内部に、３つのアミノ酸残基から構成される発光団があり、該発光団は、周囲のベータカン構造によるプロトン配置に対して、敏感に反応する。すなわち、上記ベータカン構造を変化させる事によって、当該蛍光蛋白質の吸収波長特性あるいは蛍光波長特性が変化すると予想される。しかしながら、ベータカン構造は、非常に安定な構造であり、その構造を変化させるためには１５０ピコニュートン以上の力が必要である。
【００１２】
本発明は、まず、リンカー配列の挿入を伴う蛍光蛋白質の円順列変異を行うことで、変異前の蛍光蛋白質と波長特性（例えば、吸収波長及び／又は蛍光波長）が異なる円順列変異体が得られるという知見に基く。この知見に関しては、文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）を参照できる。
【００１３】
次に、本発明は、波長特性が変化した前記円順列変異体の両端に、βヘアピン構造を形成できるペプチドを配置することで、変異により変化した波長特性を変異前の蛍光蛋白質のものと同様なものに戻すことができる、という知見に基く。
【００１４】
そして、本発明は、βヘアピン構造を形成できるペプチドが両端に配置された前記円順列変異体の波長特性が該変異体に加えられる力に応じて変化するため、該変異体が力感受性蛍光蛋白質及び力感受性蛍光プローブとして機能しうる、という知見に基く。
【００１５】
すなわち、本発明は、蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質（以下、「本発明の改変蛋白質」といもいう。）に関する。本発明の改変蛋白質によれば、二つの異なる蛍光蛋白質を繋げることによる蛍光共鳴エネルギー転移を用いずに、蛋白質に加えられる力を感知することができる。
【００１６】
［蛍光蛋白質］
本発明において使用されうる蛍光蛋白質は、蛍光を発することができる円順列変異体の作製が可能なものであれば特に制限されず、例えば、クラゲ（オワンクラゲ）由来のＧＦＰ及び該ＧＦＰに由来するＹＦＰ、ＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰその他の変異体が挙げられ、市販のものであってもよい。さらに、蛍光を発することができる範囲で欠失、付加、又は置換が行われた変異体の蛍光蛋白質であってもよい。
【００１７】
［蛍光蛋白質の円順列変異体］
本明細書において、円順列変異（circular permutation）とは、ある蛋白質の内部に新たにＮ末とＣ末を作製し（すなわち、該蛋白質を内部で２分し）、オリジナルのＣ末とＮ末とを適当なリンカー配列により繋ぐ変異をいう。蛍光蛋白質における円順列変異は、従来から行われており、例えば、前述の文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）等を参照できる。本明細書において、円順列変異体とは、円順列変異により得られた変異体をいう。
【００１８】
本発明における蛍光蛋白質円順列変異体は、力を感知する観点から、蛍光蛋白質としての性質（励起され蛍光を発光する機能）を維持していることが好ましく、変異前の蛍光蛋白質と波長特性が変化していることがより好ましい。本明細書において、波長特性は、吸光波長及び又は蛍光波長を含む。
【００１９】
本発明における蛍光蛋白質円順列変異体の一例として、蛍光蛋白質の（１）Ｎ末端からｎ位までのアミノ酸配列及び（２）ｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸配列、並びに（３）グリシンを含む２〜２０残基長のリンカー配列が、Ｎ末端側から（２）（３）（１）の順で結合したアミノ酸配列の変異体が挙げられる。円順列変異において、オリジナルの蛍光蛋白質のｎ位が新たなＣ末端となり、ｎ＋１位が新たなＮ末端となる。蛍光蛋白質のアミノ酸配列の長さがＸとすると、ｎのとりうる範囲は、１〜Ｘ−１である。本発明における蛍光蛋白質円順列変異体は、当業者であれば、前述の文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．等を参照して作製することができる。
【００２０】
前記リンカー配列は、変異後に蛍光蛋白質としての機能を維持しつつ波長特性を変化させる点から、グリシンを含む２〜２０残基長の配列であって、好ましくは４〜１８残基長であり、より好ましくは５〜１４残基長である。前記リンカー配列の一実施形態としては、(ＧＧＸ)n、(ＧＸＧ)n、又は(ＸＧＧ)nで表されるアミノ酸配列、及びこれらから１又は２残基欠失したアミノ酸配列が挙げられる。前記アミノ酸配列において、Ｘはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表し、ｎは１〜３の整数を表す。
【００２１】
［βヘアピンペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）］
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、本発明の改変蛋白質において、それぞれ、本発明における蛍光蛋白質円順列変異体のＮ末及びＣ末に結合するペプチドである。ペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、この順で繋がった場合にβヘアピン構造を形成できる配列である。なお、本明細書において、βヘアピン構造は、基本的に、２つのβシートが逆平行に配列し、該βシートが２〜５アミノ酸残基のループで繋がったものをいう。したがって、本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、それぞれ、該２つのβシートの一方及び他方に該当する部分のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００２２】
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、本発明の改変蛋白質の両端において両者が強く結合する。この強い結合が、蛍光蛋白質円順列変異により構造が変化した蛍光蛋白質のベータカン構造を異なる構造（好ましくは、オリジナル蛍光蛋白質の構造）に近づけ、それとともに波長特性も異なるもの（好ましくは、オリジナル蛍光蛋白質のそれ）に近づけていると考えられる。したがって、本発明の改変蛋白質における（Ｎ−β）と（Ｃ−β）との結合に外力が加わると再び波長特性が変化する。その外力が大きいほど、好ましくは、波長特性の変化も大きくなる。このようなメカニズムにより、本発明の改変蛋白質は、該蛋白質に加えられる力を感知できるようになると考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００２３】
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、既存のβヘアピン構造を有する蛋白質の配列を参照して決定することができる。βヘアピン構造を有する蛋白質の例としては、ヘパリン、アミロイドβペプチド、グラミシジンＳなどが挙げられる。したがって、一実施形態として、これらのβヘアピン構造を有する蛋白質のβヘアピン構造の部位のアミノ酸配列を２分して一方を（Ｎ−β）、他方を（Ｃ−β）とすることができる。
【００２４】
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）の合計の長さは、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、１０〜３０アミノ酸残基であることが好ましく、１２〜２６がより好ましく、１４〜２２がさらに好ましく、１６〜２０がさらにより好ましい。（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）の長さは、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、同程度であることが好ましく、両者の差は３アミノ酸残基以内であることがより好ましく、１アミノ酸残基であることがさらに好ましく、同じ長さであることがさらにより好ましい。
【００２５】
本発明の改変蛋白質が力を感知する観点からとりわけ好ましい（Ｎ−β）の具体例として、Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala ：（配列番号１）が挙げられる。また、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点からとりわけ好ましい（Ｃ−β）の具体例として、Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu ：（配列番号２）が挙げられる。したがって、本発明はその他の態様において、円順列変異により波長特性が変化した蛍光蛋白質変異体のＮ末端に配列表の配列番号１で表されるペプチドが結合し、Ｃ末端に配列表の配列番号２で表されるペプチドが結合した改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質に関する。なお、本発明の全ての態様において、（Ｎ−β）と（Ｃ−β）の配列は入れ替えてもよい。
【００２６】
本発明の改変蛋白質は、該蛋白質に加えられる力（好ましくは張力）を、波長特性の変化として感知することができる。したがって、本発明はその他の態様において、改変蛋白質の吸収波長及び／又は蛍光波長を検出することを含む、該改変蛋白質に加えられた力を検出する方法に関する。
【００２７】
また、本発明の改変蛋白質を、その他の蛋白質の内部に挿入すれば、当該蛋白質の立体構造変化を検出及び視覚化できる。また、本発明の改変蛋白質を、力を発する蛋白質に挿入すれば、当該蛋白質が力を発生した時に、本発明の改変蛋白質の構造に歪みが与えられるため、当該蛋白質の力発生を検出及び視覚化できる。また、本発明の改変蛋白質が内部に挿入された蛋白質に外力を加えると、外力により該蛋白質の構造が歪みを与えられるため、本発明の改変蛋白質の構造にも歪みが与えられ、その外力を検出及び視覚化できる。
【００２８】
したがって、本発明はその他の態様において、本発明の改変蛋白質がその他の蛋白質に挿入された組換え蛋白質であって、該その他の蛋白質の立体構造変化の検出及び視覚化、該その他の力発生の検出及び視覚化、並びに該その他の蛋白質に対する外力の検出及び視覚化の少なくとも１つを目的とする組換え蛋白質に関する。本発明はさらにその他の態様において、対象蛋白質の立体構造変化の検出及び視覚化、対象蛋白質の力発生の検出及び視覚化、並びに対象蛋白質に対する外力の検出及び視覚化の少なくとも１つを行う方法であって、該対象蛋白質に本発明の改変蛋白質を挿入する組換え蛋白質を作製すること、及び、組換え蛋白質における本発明の改変蛋白質の波長特性を検出することを含む方法に関する。
【００２９】
本発明の蛋白質を挿入する対象となる蛋白質は、特に制限されないが、キネシン及びミオシンのようなモーター蛋白質、カドヘリンのような細胞接着因子が挙げられる。
【００３０】
本発明はさらにその他の態様において、本発明の改変蛋白質をコードするベクター（以下、「本発明のベクター」ともいう。）に関する。本発明のベクターは、本発明の改変蛋白質を発現するための発現ベクターであっても良い。該発現ベクターにおいて、発現系は特に制限されず、原核生物、真核生物を問わない。さらに、本発明のベクターは前述の組換え蛋白質を作製するためのベクターであっても良く、本発明の改変蛋白質をコードする塩基配列の上流及び下流にマルチクローニングサイトを備えるベクターであってもよい。さらに、本発明は、前述の組換え蛋白質を作製するためのキットであって、本発明のベクターを含み、任意に必要な試薬、細胞、取扱説明書を含むキットに関しうる。
【００３１】
以下、本発明を実施例及び図面を参照しながら説明する。
【実施例】
【００３２】
［ＧＦＰの円順列変異］
図１に示す、緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰと表記）の円順列変異を行った。全２３８位のアミノ酸残基からなる蛍光蛋白質の１４５位から２３８位までのアミノ酸残基を新しい１位から９３位のアミノ酸残基として、新しい９４位から９９位のアミノ酸残基をセリン、グリシン、グリシン、スレオニン、グリシン、グリシンとし、蛍光蛋白質の１位から１４４位までのアミノ酸残基を新しい１００位から２４３位のアミノ酸残基とする（図１；ｃｐＧＦＰ）。上記のセリン、グリシン、グリシン、スレオニン、グリシン、グリシンから成るペプチドは、グリシンを含む事が重要であり、それ以外に制限はない。本実施例では、１位から１４４位及び１４５位から２３８位のアミノ酸残基による円順列変異を用いたが、上記の他にも、蛍光発光を保持できるアミノ酸の組み合わせが存在することが、文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）に記されている。上記の円順列変異を行ったＧＦＰを、以後、ｃｐＧＦＰと表記する。
【００３３】
［ＧＦＰとｃｐＧＦＰとの波長特性の比較］
図２に、ｐＨ８．０の溶媒中における、ＧＦＰ及びｃｐＧＦＰの、吸光波長と（上図）、波長４８８ナノメートル（以下、ｎｍと記述する）のレーザーで励起した時の蛍光波長（下図）を示す。ＧＦＰの吸光波長には、波長４８５ｎｍの位置に最大吸光が確認された。ｃｐＧＦＰの吸光波長には、波長４８５ｎｍの位置の最大吸光の他に、波長３９０ｎｍの位置にも最大吸光が確認された。上記した波長３９０ｎｍに位置する最大吸光の出現は、円順列変異を行うことで、蛍光蛋白質内にある発光団へのプロトンの配置が変化するためとされている。蛍光波長において、ＧＦＰとｃｐＧＦＰとには、差が見られなかった。すなわち、ＧＦＰにおいて、円順列変異による蛍光波長は、変化しない。
【００３４】
［ＹＦＰの円順列変異］
上記と同様に、黄色蛍光蛋白質（以下、ＹＦＰと表記する。アミノ酸配列は、配列表の配列番号３）の円順列変異を行った（図１）。得られた円順列変異体をｃｐＹＦＰと表記する。ｃｐＹＦＰのアミノ酸配列は、配列表の配列番号４である。図３に、ｃｐＹＦＰの吸光波長（上図）、及び、波長４８８ｎｍのレーザーで励起した時の蛍光波長を示す（下図）。ＹＦＰの吸光波長には、波長５１３ｎｍの位置に最大吸光が確認された。ｃｐＹＦＰの吸光波長には、５１３ｎｍの位置の最大吸光は確認できず、波長５０１ｎｍの位置及び４０７ｎｍの位置に、最大吸光が確認された。ＹＦＰの蛍光波長には、波長５２７ｎｍの位置に最大蛍光が確認された。ｃｐＹＦＰの蛍光波長には、波長５２１ｎｍの位置に最大蛍光が確認された。ＹＦＰにおいては、円順列変異を行うことにより、吸光波長と蛍光波長の両方ともにおいて、その特性が変化した。
【００３５】
上記したように、蛍光蛋白質は円順列変異を行うことにより、波長特性（吸光波長）が、大きく変化する。円順列変異による蛍光蛋白質の構造の歪みが、当該蛍光蛋白質の発光団へのプロトン配置に影響を与えている、と考えられる。
【００３６】
［βヘアピンペプチドの導入：ｃｐＹＦＰ−β１］
蛍光蛋白質に円順列変異を行うことにより変化した吸光波長特性を、βヘアピン構造を成すペプチドを当該円順列変異蛍光蛋白質に付加することによって、円順列変異を行う前の吸光波長特性に戻した。以下、ＹＦＰにおける実施例を用いて説明する。
【００３７】
図１に、ｃｐＹＦＰへのペプチド付加を説明する模式図を示す。βヘアピン構造は、２つのベータシートでヘアピン様の構造であり、一次構造上で隣り合った２つのベータシートが逆平行に配列し、２から５アミノ酸残基からなる短いループで繋がったペプチドから構成される。βヘアピン構造を許容するペプチドは、多数存在するが、本実施例では、第１位からグリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニン、グルタミン酸の順序で計１６残基から構成されるペプチドを用いた。ただし、上記ペプチドのアミノ酸配列は、一実施形態にすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００３８】
ｃｐＹＦＰのＮ末端に、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニンを付加し、当該ｃｐＹＦＰのＣ末端に、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニンを、付加した。上記ペプチドを付加したｃｐＹＦＰを、以下、ｃｐＹＦＰ−β１と記載する。ｃｐＹＦＰ−β１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５である。
【００３９】
図４にｃｐＹＦＰ−β１の吸光波長を示す。ｃｐＹＦＰにおいて確認できた波長４０７ｎｍに位置する最大吸光は、ｃｐＹＦＰ−β１の吸光波長において確認できなかった。ｃｐＹＦＰ−β１の吸光波長では、波長５００ｎｍの位置にのみ、最大吸光が確認された。従って、上記βヘアピン構造を成すペプチドのｃｐＹＦＰへの付加は、円順列変異により変化された吸光波長特性を、ＹＦＰの光波長特性に近づける効果があることが、証明された。
【００４０】
［ｃｐＹＦＰ−β２］
上記の証明をさらに強固にするために、以下に記す実験を行った。ｃｐＹＦＰ−β１にて、ｃｐＹＦＰのＮ末端に付加したアミノ酸のうち、ｃｐＹＦＰに最も接近して位置するアラニンの隣にグリシンを挿入し、当該ｃｐＹＦＰのＣ末端に付加したアミノ酸のうち最もｃｐＹＦＰに接近して位置するスレオニンの隣にグリシンを挿入した（図１参照）。上記の変異は、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニン、グルタミン酸から構成されるβヘアピン構造と当該ｃｐＹＦＰの構造の間を柔らかい構造で結合させる。従って、上記の置換は、当該βヘアピンに係る微弱な外力、あるいは、微小な立体構造の変化を模倣する。上記の置換を行ったｃｐＹＦＰ−β１を、以下、ｃｐＹＦＰ−β２と記載する。図５にｃｐＹＦＰ−β２の吸光波長を示す。ｃｐＹＦＰ−β１において確認できなかった波長４０７ｎｍに位置する最大吸光が、ｃｐＹＦＰ−β２の吸光波長のグラフにおいて確認できた。従って、ｃｐＹＦＰ−β１のβヘアピン構造に微弱な外力が係る、あるいは、βヘアピン構造に歪みが与えられたら、ｃｐＹＦＰ−β１の吸収波長には、波長４０７ｎｍに位置する最大吸光が出現すると示唆される。
【００４１】
［ｃｐＹＦＰ−β３］
ｃｐＹＦＰ−β１にてｃｐＹＦＰのＮ末端に付加したアミノ酸のうち、ｃｐＹＦＰに最も接近して位置するアスパラギン酸、アラニンを、それぞれ、プロリン、トリプトファンに置換し、当該ｃｐＹＦＰのＣ末端に付加したアミノ酸のうち最もｃｐＹＦＰに接近して位置するスレオニン、リジンを、それぞれ、ロイシン、グルタミン酸に置換した（図１参照）。上記の置換を行ったｃｐＹＦＰ−β１を、以下、ｃｐＹＦＰ−β３と記載する。アミノ酸のプロリンへの置換は、置換された蛋白質の立体構造を大きく歪ませる効果があり、ｃｐＹＦＰ−β３は、ｃｐＹＦＰ−β２と比べて、さらに、該βヘアピン構造に歪みを与える。図６にｃｐＹＦＰ−β３の吸光波長を示す。ｃｐＹＦＰ−β１において確認できなかった波長４０７ｎｍに位置する最大吸光が、ｃｐＹＦＰ−β３の吸光波長のグラフにおいて確認できた。ｃｐＹＦＰ−β３における波長４０７ｎｍに位置する最大吸光の強度は、ｃｐＹＦＰ−β２の波長４０７ｎｍに位置する最大吸光の強度に比べて、大きい。また、ｃｐＹＦＰ−β１において確認された波長５０１ｎｍに位置する最大吸光の強度が、ｃｐＹＦＰ−β３において、減少した。ｃｐＹＦＰ−β３のβヘアピン構造とｃｐＹＦＰとの結合は、ｃｐＹＦＰ−β２のβヘアピン構造とｃｐＹＦＰとの結合よりも、大きく歪みが与えられており、上記の歪みの大きさが、吸収波長の特性に影響を与えている。上記の実験結果は、ｃｐＹＦＰ−β１の吸収波長特性は、ｃｐＹＦＰとβヘアピン構造の結合の歪みによって、変化することを示している。さらに詳しくは、ｃｐＹＦＰ−β１のβヘアピン構造に微弱な外力が係る、あるいは、βヘアピン構造に歪みが与えられたら、その歪みの大きさに依存して、ｃｐＹＦＰ−β１の吸収波長には、波長４０７ｎｍに位置する最大吸光の強度が増加し、波長５０１ｎｍに位置する最大吸光の強度が減少することを示している。
【００４２】
上述の事から、ｃｐＹＦＰ−β１の波長４０７ｎｍにおける吸光度、かつ、波長５０１ｎｍにおける吸光度を計測すれば、上記ｃｐＹＦＰ−β１に係る微弱な力、あるいは、構造変化を検出することが可能であり、また、光学顕微鏡下で視覚化できる。
【００４３】
したがって、ｃｐＹＦＰ−β１を蛋白質の内部に挿入すれば、当該蛋白質の立体構造変化を検出及び視覚化できる。また、ｃｐＹＦＰ−β１を力を発する蛋白質に挿入すれば、該蛋白質が力を発生した時に、当該ｃｐＹＦＰ−β１の構造に歪みが与えられるため、当該蛋白質の力発生を検出及び視覚化できる。また、ｃｐＹＦＰ−β１が内部に挿入された蛋白質に、外力を加えると、外力により該蛋白質の構造が歪みを与えられるため、ｃｐＹＦＰ−β１の構造にも歪みが与えられ、その外力を検出及び視覚化できる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、例えば、分子イメージング分野、分子ナノメトリー分野、及び蛋白質の構造解析分野などにおいて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１： βヘアピンのＮ末端側のペプチド。配列番号２のペプチドとともにβヘアピン構造を形成しうる。
配列番号２： βヘアピンのＣ末端側のペプチド。配列番号１のペプチドとともにβヘアピン構造を形成しうる。
配列番号３： ＹＦＰ（黄色蛍光蛋白質）
配列番号４： ＹＦＰの円順列変異体の一例
配列番号５： 本発明の改変蛋白質の一例
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変蛍光蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光蛋白質、例えば緑色蛍光蛋白質は、基礎研究及び応用研究において、蛋白質を蛍光標識する材料として用いられる。蛍光蛋白質による蛍光標識は、光学顕微鏡下において、蛋白質の局在及び運動の観察を可能とする。しかしながら、蛋白質の局在及び運動は、生体内における機能を、必ずしも反映しているとは限らない。
【０００３】
非特許文献１によると、蛍光蛋白質の蛍光共鳴エネルギー転移を利用する事により、蛋白質の多量体化及び立体構造変化を視覚化することができる。蛍光共鳴エネルギー転移には、異なる吸収・蛍光波長を持つ２種の蛍光蛋白質を、連結させて使用する。特許文献１によると、同様の技術で、細胞内のカルシウム濃度を視覚化できる。蛍光共鳴エネルギー転移を用いた発明には、上記の他に、細胞分裂期を視覚化する蛍光蛋白質（非特許文献２）、アデノシン３リン酸の濃度を視覚化する蛍光蛋白質（非特許文献３）、及び、他蛋白質との相互作用を視覚化する蛍光蛋白質（非特許文献４）などがある。しかしながら、これらの方法では、二つの蛍光蛋白質が標識される蛋白質に融合される事が必須となる。そのため、二つの蛍光蛋白質の大きさが標識される蛋白質の機能への阻害効果が懸念される。蛋白質を蛍光標識するための物質は、可能な限り小さい方が好ましい。また、非特許文献５は、蛍光蛋白質の吸収及び蛍光波長が溶媒中のｐＨによって変化する特性を利用したｐＨ感受性の蛍光蛋白質を開示し、特許文献２は、蛋白質の酵素活性、より具体的には、ヒストンのアセチル化を検出する蛍光蛋白質を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１８４６９９号公報
【特許文献２】特開２００８−１６７６７８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tsien R.Y. and Miyawaki A. (1998) Science 280, 1954-1955.
【非特許文献２】Sunabori T., Tokunaga A., Nagai T., Sawamoto K., Okabe M., Miyawaki A., Matsuzaki Y., Miyata T. and Okano H. (2008) J Cell Sci. 121, 1204-1212.
【非特許文献３】Imamura H., Nhat K.P.H., Togawa H., Saito K., Iino R., Kato-Yamada Y., Nagai T. and Noji H. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 15651-15656.
【非特許文献４】Wang H., Nakata E. and Hamachi, I. (2009) ChemBioChem 00, 1-19.
【非特許文献５】Kneen M., Farinas J., Li Y. and Verkman A.S. (1998) Biophys J 74, 1591-1599.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、筋肉の収縮を担う蛋白質あるいは細胞環収縮を担う蛋白質あるいは細胞内小胞を輸送する蛋白質に挙げられるような、力を発する事を機能とする蛋白質の力発生を視覚化できる蛍光蛋白質の報告はない。
【０００７】
そこで、本発明は、二つの異なる蛍光蛋白質を繋げて得られたものではない改変蛋白質であって、蛋白質に加えられる力を感知することができる改変蛋白質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質（以下、「本発明の改変蛋白質」ともいう。）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の改変蛋白質によれば、二つの異なる蛍光蛋白質を繋げることによる蛍光共鳴エネルギー転移を用いずに、蛋白質に加えられる力を感知することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、円順列変異緑色蛍光蛋白質（ｃｐＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、円順列変異黄色蛍光蛋白質（ｃｐＹＦＰ）、ｃｐＹＦＰ−β１、ｃｐＹＦＰ−β２、及び、ｃｐＹＦＰ−β３の模式図である。
【図２】ＧＦＰ（黒線）とｃｐＧＦＰ（灰線）のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性（上）及び波長４８８ナノメートルのレーザーで励起した時の蛍光波長特性（下）を示すグラフである。
【図３】ＹＦＰ（黒線）とｃｐＹＦＰ（灰線）のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性（左）及び波長４８８ナノメートルのレーザーで励起した時の蛍光波長特性（右）を示すグラフである。
【図４】ｃｐＹＦＰ−β１のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性を示すグラフである。
【図５】ｃｐＹＦＰ−β２のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性を示すグラフである。
【図６】ｃｐＹＦＰ−β３のｐＨ８．０の溶媒中における吸光波長特性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
蛍光蛋白質は、ベータカン構造と呼ばれる円柱構造を持つ蛋白質である。ベータカン構造の内部に、３つのアミノ酸残基から構成される発光団があり、該発光団は、周囲のベータカン構造によるプロトン配置に対して、敏感に反応する。すなわち、上記ベータカン構造を変化させる事によって、当該蛍光蛋白質の吸収波長特性あるいは蛍光波長特性が変化すると予想される。しかしながら、ベータカン構造は、非常に安定な構造であり、その構造を変化させるためには１５０ピコニュートン以上の力が必要である。
【００１２】
本発明は、まず、リンカー配列の挿入を伴う蛍光蛋白質の円順列変異を行うことで、変異前の蛍光蛋白質と波長特性（例えば、吸収波長及び／又は蛍光波長）が異なる円順列変異体が得られるという知見に基く。この知見に関しては、文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）を参照できる。
【００１３】
次に、本発明は、波長特性が変化した前記円順列変異体の両端に、βヘアピン構造を形成できるペプチドを配置することで、変異により変化した波長特性を変異前の蛍光蛋白質のものと同様なものに戻すことができる、という知見に基く。
【００１４】
そして、本発明は、βヘアピン構造を形成できるペプチドが両端に配置された前記円順列変異体の波長特性が該変異体に加えられる力に応じて変化するため、該変異体が力感受性蛍光蛋白質及び力感受性蛍光プローブとして機能しうる、という知見に基く。
【００１５】
すなわち、本発明は、蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質（以下、「本発明の改変蛋白質」といもいう。）に関する。本発明の改変蛋白質によれば、二つの異なる蛍光蛋白質を繋げることによる蛍光共鳴エネルギー転移を用いずに、蛋白質に加えられる力を感知することができる。
【００１６】
［蛍光蛋白質］
本発明において使用されうる蛍光蛋白質は、蛍光を発することができる円順列変異体の作製が可能なものであれば特に制限されず、例えば、クラゲ（オワンクラゲ）由来のＧＦＰ及び該ＧＦＰに由来するＹＦＰ、ＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰその他の変異体が挙げられ、市販のものであってもよい。さらに、蛍光を発することができる範囲で欠失、付加、又は置換が行われた変異体の蛍光蛋白質であってもよい。
【００１７】
［蛍光蛋白質の円順列変異体］
本明細書において、円順列変異（circular permutation）とは、ある蛋白質の内部に新たにＮ末とＣ末を作製し（すなわち、該蛋白質を内部で２分し）、オリジナルのＣ末とＮ末とを適当なリンカー配列により繋ぐ変異をいう。蛍光蛋白質における円順列変異は、従来から行われており、例えば、前述の文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）等を参照できる。本明細書において、円順列変異体とは、円順列変異により得られた変異体をいう。
【００１８】
本発明における蛍光蛋白質円順列変異体は、力を感知する観点から、蛍光蛋白質としての性質（励起され蛍光を発光する機能）を維持していることが好ましく、変異前の蛍光蛋白質と波長特性が変化していることがより好ましい。本明細書において、波長特性は、吸光波長及び又は蛍光波長を含む。
【００１９】
本発明における蛍光蛋白質円順列変異体の一例として、蛍光蛋白質の（１）Ｎ末端からｎ位までのアミノ酸配列及び（２）ｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸配列、並びに（３）グリシンを含む２〜２０残基長のリンカー配列が、Ｎ末端側から（２）（３）（１）の順で結合したアミノ酸配列の変異体が挙げられる。円順列変異において、オリジナルの蛍光蛋白質のｎ位が新たなＣ末端となり、ｎ＋１位が新たなＮ末端となる。蛍光蛋白質のアミノ酸配列の長さがＸとすると、ｎのとりうる範囲は、１〜Ｘ−１である。本発明における蛍光蛋白質円順列変異体は、当業者であれば、前述の文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．等を参照して作製することができる。
【００２０】
前記リンカー配列は、変異後に蛍光蛋白質としての機能を維持しつつ波長特性を変化させる点から、グリシンを含む２〜２０残基長の配列であって、好ましくは４〜１８残基長であり、より好ましくは５〜１４残基長である。前記リンカー配列の一実施形態としては、(ＧＧＸ)n、(ＧＸＧ)n、又は(ＸＧＧ)nで表されるアミノ酸配列、及びこれらから１又は２残基欠失したアミノ酸配列が挙げられる。前記アミノ酸配列において、Ｘはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表し、ｎは１〜３の整数を表す。
【００２１】
［βヘアピンペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）］
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、本発明の改変蛋白質において、それぞれ、本発明における蛍光蛋白質円順列変異体のＮ末及びＣ末に結合するペプチドである。ペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、この順で繋がった場合にβヘアピン構造を形成できる配列である。なお、本明細書において、βヘアピン構造は、基本的に、２つのβシートが逆平行に配列し、該βシートが２〜５アミノ酸残基のループで繋がったものをいう。したがって、本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、それぞれ、該２つのβシートの一方及び他方に該当する部分のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００２２】
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、本発明の改変蛋白質の両端において両者が強く結合する。この強い結合が、蛍光蛋白質円順列変異により構造が変化した蛍光蛋白質のベータカン構造を異なる構造（好ましくは、オリジナル蛍光蛋白質の構造）に近づけ、それとともに波長特性も異なるもの（好ましくは、オリジナル蛍光蛋白質のそれ）に近づけていると考えられる。したがって、本発明の改変蛋白質における（Ｎ−β）と（Ｃ−β）との結合に外力が加わると再び波長特性が変化する。その外力が大きいほど、好ましくは、波長特性の変化も大きくなる。このようなメカニズムにより、本発明の改変蛋白質は、該蛋白質に加えられる力を感知できるようになると考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００２３】
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）は、既存のβヘアピン構造を有する蛋白質の配列を参照して決定することができる。βヘアピン構造を有する蛋白質の例としては、ヘパリン、アミロイドβペプチド、グラミシジンＳなどが挙げられる。したがって、一実施形態として、これらのβヘアピン構造を有する蛋白質のβヘアピン構造の部位のアミノ酸配列を２分して一方を（Ｎ−β）、他方を（Ｃ−β）とすることができる。
【００２４】
本発明におけるペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）の合計の長さは、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、１０〜３０アミノ酸残基であることが好ましく、１２〜２６がより好ましく、１４〜２２がさらに好ましく、１６〜２０がさらにより好ましい。（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）の長さは、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、同程度であることが好ましく、両者の差は３アミノ酸残基以内であることがより好ましく、１アミノ酸残基であることがさらに好ましく、同じ長さであることがさらにより好ましい。
【００２５】
本発明の改変蛋白質が力を感知する観点からとりわけ好ましい（Ｎ−β）の具体例として、Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala ：（配列番号１）が挙げられる。また、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点からとりわけ好ましい（Ｃ−β）の具体例として、Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu ：（配列番号２）が挙げられる。したがって、本発明はその他の態様において、円順列変異により波長特性が変化した蛍光蛋白質変異体のＮ末端に配列表の配列番号１で表されるペプチドが結合し、Ｃ末端に配列表の配列番号２で表されるペプチドが結合した改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質に関する。なお、本発明の全ての態様において、（Ｎ−β）と（Ｃ−β）の配列は入れ替えてもよい。
【００２６】
本発明の改変蛋白質は、該蛋白質に加えられる力（好ましくは張力）を、波長特性の変化として感知することができる。したがって、本発明はその他の態様において、改変蛋白質の吸収波長及び／又は蛍光波長を検出することを含む、該改変蛋白質に加えられた力を検出する方法に関する。
【００２７】
また、本発明の改変蛋白質を、その他の蛋白質の内部に挿入すれば、当該蛋白質の立体構造変化を検出及び視覚化できる。また、本発明の改変蛋白質を、力を発する蛋白質に挿入すれば、当該蛋白質が力を発生した時に、本発明の改変蛋白質の構造に歪みが与えられるため、当該蛋白質の力発生を検出及び視覚化できる。また、本発明の改変蛋白質が内部に挿入された蛋白質に外力を加えると、外力により該蛋白質の構造が歪みを与えられるため、本発明の改変蛋白質の構造にも歪みが与えられ、その外力を検出及び視覚化できる。
【００２８】
したがって、本発明はその他の態様において、本発明の改変蛋白質がその他の蛋白質に挿入された組換え蛋白質であって、該その他の蛋白質の立体構造変化の検出及び視覚化、該その他の力発生の検出及び視覚化、並びに該その他の蛋白質に対する外力の検出及び視覚化の少なくとも１つを目的とする組換え蛋白質に関する。本発明はさらにその他の態様において、対象蛋白質の立体構造変化の検出及び視覚化、対象蛋白質の力発生の検出及び視覚化、並びに対象蛋白質に対する外力の検出及び視覚化の少なくとも１つを行う方法であって、該対象蛋白質に本発明の改変蛋白質を挿入する組換え蛋白質を作製すること、及び、組換え蛋白質における本発明の改変蛋白質の波長特性を検出することを含む方法に関する。
【００２９】
本発明の蛋白質を挿入する対象となる蛋白質は、特に制限されないが、キネシン及びミオシンのようなモーター蛋白質、カドヘリンのような細胞接着因子が挙げられる。
【００３０】
本発明はさらにその他の態様において、本発明の改変蛋白質をコードするベクター（以下、「本発明のベクター」ともいう。）に関する。本発明のベクターは、本発明の改変蛋白質を発現するための発現ベクターであっても良い。該発現ベクターにおいて、発現系は特に制限されず、原核生物、真核生物を問わない。さらに、本発明のベクターは前述の組換え蛋白質を作製するためのベクターであっても良く、本発明の改変蛋白質をコードする塩基配列の上流及び下流にマルチクローニングサイトを備えるベクターであってもよい。さらに、本発明は、前述の組換え蛋白質を作製するためのキットであって、本発明のベクターを含み、任意に必要な試薬、細胞、取扱説明書を含むキットに関しうる。
【００３１】
以下、本発明を実施例及び図面を参照しながら説明する。
【実施例】
【００３２】
［ＧＦＰの円順列変異］
図１に示す、緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰと表記）の円順列変異を行った。全２３８位のアミノ酸残基からなる蛍光蛋白質の１４５位から２３８位までのアミノ酸残基を新しい１位から９３位のアミノ酸残基として、新しい９４位から９９位のアミノ酸残基をセリン、グリシン、グリシン、スレオニン、グリシン、グリシンとし、蛍光蛋白質の１位から１４４位までのアミノ酸残基を新しい１００位から２４３位のアミノ酸残基とする（図１；ｃｐＧＦＰ）。上記のセリン、グリシン、グリシン、スレオニン、グリシン、グリシンから成るペプチドは、グリシンを含む事が重要であり、それ以外に制限はない。本実施例では、１位から１４４位及び１４５位から２３８位のアミノ酸残基による円順列変異を用いたが、上記の他にも、蛍光発光を保持できるアミノ酸の組み合わせが存在することが、文献Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）に記されている。上記の円順列変異を行ったＧＦＰを、以後、ｃｐＧＦＰと表記する。
【００３３】
［ＧＦＰとｃｐＧＦＰとの波長特性の比較］
図２に、ｐＨ８．０の溶媒中における、ＧＦＰ及びｃｐＧＦＰの、吸光波長と（上図）、波長４８８ナノメートル（以下、ｎｍと記述する）のレーザーで励起した時の蛍光波長（下図）を示す。ＧＦＰの吸光波長には、波長４８５ｎｍの位置に最大吸光が確認された。ｃｐＧＦＰの吸光波長には、波長４８５ｎｍの位置の最大吸光の他に、波長３９０ｎｍの位置にも最大吸光が確認された。上記した波長３９０ｎｍに位置する最大吸光の出現は、円順列変異を行うことで、蛍光蛋白質内にある発光団へのプロトンの配置が変化するためとされている。蛍光波長において、ＧＦＰとｃｐＧＦＰとには、差が見られなかった。すなわち、ＧＦＰにおいて、円順列変異による蛍光波長は、変化しない。
【００３４】
［ＹＦＰの円順列変異］
上記と同様に、黄色蛍光蛋白質（以下、ＹＦＰと表記する。アミノ酸配列は、配列表の配列番号３）の円順列変異を行った（図１）。得られた円順列変異体をｃｐＹＦＰと表記する。ｃｐＹＦＰのアミノ酸配列は、配列表の配列番号４である。図３に、ｃｐＹＦＰの吸光波長（上図）、及び、波長４８８ｎｍのレーザーで励起した時の蛍光波長を示す（下図）。ＹＦＰの吸光波長には、波長５１３ｎｍの位置に最大吸光が確認された。ｃｐＹＦＰの吸光波長には、５１３ｎｍの位置の最大吸光は確認できず、波長５０１ｎｍの位置及び４０７ｎｍの位置に、最大吸光が確認された。ＹＦＰの蛍光波長には、波長５２７ｎｍの位置に最大蛍光が確認された。ｃｐＹＦＰの蛍光波長には、波長５２１ｎｍの位置に最大蛍光が確認された。ＹＦＰにおいては、円順列変異を行うことにより、吸光波長と蛍光波長の両方ともにおいて、その特性が変化した。
【００３５】
上記したように、蛍光蛋白質は円順列変異を行うことにより、波長特性（吸光波長）が、大きく変化する。円順列変異による蛍光蛋白質の構造の歪みが、当該蛍光蛋白質の発光団へのプロトン配置に影響を与えている、と考えられる。
【００３６】
［βヘアピンペプチドの導入：ｃｐＹＦＰ−β１］
蛍光蛋白質に円順列変異を行うことにより変化した吸光波長特性を、βヘアピン構造を成すペプチドを当該円順列変異蛍光蛋白質に付加することによって、円順列変異を行う前の吸光波長特性に戻した。以下、ＹＦＰにおける実施例を用いて説明する。
【００３７】
図１に、ｃｐＹＦＰへのペプチド付加を説明する模式図を示す。βヘアピン構造は、２つのベータシートでヘアピン様の構造であり、一次構造上で隣り合った２つのベータシートが逆平行に配列し、２から５アミノ酸残基からなる短いループで繋がったペプチドから構成される。βヘアピン構造を許容するペプチドは、多数存在するが、本実施例では、第１位からグリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニン、グルタミン酸の順序で計１６残基から構成されるペプチドを用いた。ただし、上記ペプチドのアミノ酸配列は、一実施形態にすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００３８】
ｃｐＹＦＰのＮ末端に、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニンを付加し、当該ｃｐＹＦＰのＣ末端に、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニンを、付加した。上記ペプチドを付加したｃｐＹＦＰを、以下、ｃｐＹＦＰ−β１と記載する。ｃｐＹＦＰ−β１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５である。
【００３９】
図４にｃｐＹＦＰ−β１の吸光波長を示す。ｃｐＹＦＰにおいて確認できた波長４０７ｎｍに位置する最大吸光は、ｃｐＹＦＰ−β１の吸光波長において確認できなかった。ｃｐＹＦＰ−β１の吸光波長では、波長５００ｎｍの位置にのみ、最大吸光が確認された。従って、上記βヘアピン構造を成すペプチドのｃｐＹＦＰへの付加は、円順列変異により変化された吸光波長特性を、ＹＦＰの光波長特性に近づける効果があることが、証明された。
【００４０】
［ｃｐＹＦＰ−β２］
上記の証明をさらに強固にするために、以下に記す実験を行った。ｃｐＹＦＰ−β１にて、ｃｐＹＦＰのＮ末端に付加したアミノ酸のうち、ｃｐＹＦＰに最も接近して位置するアラニンの隣にグリシンを挿入し、当該ｃｐＹＦＰのＣ末端に付加したアミノ酸のうち最もｃｐＹＦＰに接近して位置するスレオニンの隣にグリシンを挿入した（図１参照）。上記の変異は、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニン、グルタミン酸から構成されるβヘアピン構造と当該ｃｐＹＦＰの構造の間を柔らかい構造で結合させる。従って、上記の置換は、当該βヘアピンに係る微弱な外力、あるいは、微小な立体構造の変化を模倣する。上記の置換を行ったｃｐＹＦＰ−β１を、以下、ｃｐＹＦＰ−β２と記載する。図５にｃｐＹＦＰ−β２の吸光波長を示す。ｃｐＹＦＰ−β１において確認できなかった波長４０７ｎｍに位置する最大吸光が、ｃｐＹＦＰ−β２の吸光波長のグラフにおいて確認できた。従って、ｃｐＹＦＰ−β１のβヘアピン構造に微弱な外力が係る、あるいは、βヘアピン構造に歪みが与えられたら、ｃｐＹＦＰ−β１の吸収波長には、波長４０７ｎｍに位置する最大吸光が出現すると示唆される。
【００４１】
［ｃｐＹＦＰ−β３］
ｃｐＹＦＰ−β１にてｃｐＹＦＰのＮ末端に付加したアミノ酸のうち、ｃｐＹＦＰに最も接近して位置するアスパラギン酸、アラニンを、それぞれ、プロリン、トリプトファンに置換し、当該ｃｐＹＦＰのＣ末端に付加したアミノ酸のうち最もｃｐＹＦＰに接近して位置するスレオニン、リジンを、それぞれ、ロイシン、グルタミン酸に置換した（図１参照）。上記の置換を行ったｃｐＹＦＰ−β１を、以下、ｃｐＹＦＰ−β３と記載する。アミノ酸のプロリンへの置換は、置換された蛋白質の立体構造を大きく歪ませる効果があり、ｃｐＹＦＰ−β３は、ｃｐＹＦＰ−β２と比べて、さらに、該βヘアピン構造に歪みを与える。図６にｃｐＹＦＰ−β３の吸光波長を示す。ｃｐＹＦＰ−β１において確認できなかった波長４０７ｎｍに位置する最大吸光が、ｃｐＹＦＰ−β３の吸光波長のグラフにおいて確認できた。ｃｐＹＦＰ−β３における波長４０７ｎｍに位置する最大吸光の強度は、ｃｐＹＦＰ−β２の波長４０７ｎｍに位置する最大吸光の強度に比べて、大きい。また、ｃｐＹＦＰ−β１において確認された波長５０１ｎｍに位置する最大吸光の強度が、ｃｐＹＦＰ−β３において、減少した。ｃｐＹＦＰ−β３のβヘアピン構造とｃｐＹＦＰとの結合は、ｃｐＹＦＰ−β２のβヘアピン構造とｃｐＹＦＰとの結合よりも、大きく歪みが与えられており、上記の歪みの大きさが、吸収波長の特性に影響を与えている。上記の実験結果は、ｃｐＹＦＰ−β１の吸収波長特性は、ｃｐＹＦＰとβヘアピン構造の結合の歪みによって、変化することを示している。さらに詳しくは、ｃｐＹＦＰ−β１のβヘアピン構造に微弱な外力が係る、あるいは、βヘアピン構造に歪みが与えられたら、その歪みの大きさに依存して、ｃｐＹＦＰ−β１の吸収波長には、波長４０７ｎｍに位置する最大吸光の強度が増加し、波長５０１ｎｍに位置する最大吸光の強度が減少することを示している。
【００４２】
上述の事から、ｃｐＹＦＰ−β１の波長４０７ｎｍにおける吸光度、かつ、波長５０１ｎｍにおける吸光度を計測すれば、上記ｃｐＹＦＰ−β１に係る微弱な力、あるいは、構造変化を検出することが可能であり、また、光学顕微鏡下で視覚化できる。
【００４３】
したがって、ｃｐＹＦＰ−β１を蛋白質の内部に挿入すれば、当該蛋白質の立体構造変化を検出及び視覚化できる。また、ｃｐＹＦＰ−β１を力を発する蛋白質に挿入すれば、該蛋白質が力を発生した時に、当該ｃｐＹＦＰ−β１の構造に歪みが与えられるため、当該蛋白質の力発生を検出及び視覚化できる。また、ｃｐＹＦＰ−β１が内部に挿入された蛋白質に、外力を加えると、外力により該蛋白質の構造が歪みを与えられるため、ｃｐＹＦＰ−β１の構造にも歪みが与えられ、その外力を検出及び視覚化できる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、例えば、分子イメージング分野、分子ナノメトリー分野、及び蛋白質の構造解析分野などにおいて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１： βヘアピンのＮ末端側のペプチド。配列番号２のペプチドとともにβヘアピン構造を形成しうる。
配列番号２： βヘアピンのＣ末端側のペプチド。配列番号１のペプチドとともにβヘアピン構造を形成しうる。
配列番号３： ＹＦＰ（黄色蛍光蛋白質）
配列番号４： ＹＦＰの円順列変異体の一例
配列番号５： 本発明の改変蛋白質の一例
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる、改変蛋白質。
【請求項２】
前記蛍光蛋白質円順列変異体は、前記蛍光蛋白質の（１）Ｎ末端からｎ位までのアミノ酸配列及び（２）ｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸配列、並びに（３）グリシンを含む２〜２０残基長のリンカー配列を含み、Ｎ末端側から（２）（３）（１）の順で結合したアミノ酸配列の変異体である、請求項１記載の改変蛋白質。
【請求項３】
前記２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）の合計のアミノ酸配列が、１０〜３０残基長である、請求項１又は２に記載の改変蛋白質。
【請求項４】
前記（Ｎ−β）が、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドであり、前記（Ｃ−β）が、配列表の配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドである、請求項１から３のいずれかに記載の改変蛋白質。
【請求項５】
前記円順列変異体が、前記蛍光蛋白質とは異なる吸収波長及び／又は蛍光波長を示す、請求項１から４のいずれかに記載の改変蛋白質。
【請求項６】
前記円順列変異体が、配列表の配列番号３のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項１から５のいずれかに記載の改変蛋白質。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の改変蛋白質をコードするベクター。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の改変蛋白質の吸収波長及び／又は蛍光波長を検出することを含む、前記改変蛋白質に加えられた力を検出する方法。
【請求項１】
蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）とが、Ｎ末端側から（Ｎ−β）−（円順列変異体）−（Ｃ−β）の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる、改変蛋白質。
【請求項２】
前記蛍光蛋白質円順列変異体は、前記蛍光蛋白質の（１）Ｎ末端からｎ位までのアミノ酸配列及び（２）ｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸配列、並びに（３）グリシンを含む２〜２０残基長のリンカー配列を含み、Ｎ末端側から（２）（３）（１）の順で結合したアミノ酸配列の変異体である、請求項１記載の改変蛋白質。
【請求項３】
前記２つのペプチド（Ｎ−β）及び（Ｃ−β）の合計のアミノ酸配列が、１０〜３０残基長である、請求項１又は２に記載の改変蛋白質。
【請求項４】
前記（Ｎ−β）が、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドであり、前記（Ｃ−β）が、配列表の配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドである、請求項１から３のいずれかに記載の改変蛋白質。
【請求項５】
前記円順列変異体が、前記蛍光蛋白質とは異なる吸収波長及び／又は蛍光波長を示す、請求項１から４のいずれかに記載の改変蛋白質。
【請求項６】
前記円順列変異体が、配列表の配列番号３のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項１から５のいずれかに記載の改変蛋白質。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の改変蛋白質をコードするベクター。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の改変蛋白質の吸収波長及び／又は蛍光波長を検出することを含む、前記改変蛋白質に加えられた力を検出する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１８８８２１（Ｐ２０１１−１８８８２１Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５８１２０（Ｐ２０１０−５８１２０）
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本生物物理学会 「生物物理 ｖｏｌ．４９ 第４７回年会講演予稿集」 平成２１年（２００９年）９月２０日 独立行政法人 科学技術振興機構 「生命現象解明のための計測分析 さきがけ・ＣＲＥＳＴ研究報告会 講演要旨集」 平成２２年（２０１０年）１月１２日
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本生物物理学会 「生物物理 ｖｏｌ．４９ 第４７回年会講演予稿集」 平成２１年（２００９年）９月２０日 独立行政法人 科学技術振興機構 「生命現象解明のための計測分析 さきがけ・ＣＲＥＳＴ研究報告会 講演要旨集」 平成２２年（２０１０年）１月１２日
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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