改変間葉系幹細胞及びそれを使用した腫瘍の治療方法
本発明は、遺伝子修飾された間葉系幹細胞を使用して腫瘍に罹患した対象を治療する方法を提供し、各遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。本発明はさらに、この方法において使用される遺伝子修飾された間葉系幹細胞を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願全体を通じて様々な刊行物が引用される。それらの刊行物の開示は、本発明が関わる分野の技術水準をより十全に説明するため、本明細書によって本願に参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
新しいパラダイムが示唆するところによれば、悪性細胞は、悪性表現型の惹起及び維持に大きい影響を及ぼす複雑な細胞内及び細胞外微小環境に存在する1、2。固形腫瘍は、悪性細胞と、並びに線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、リンパ性細胞、及び概して単核球浸潤を含む間質を含む支持細胞とから構成されるものと見ることができる2〜6。こうした間質細胞は腫瘍の生存に不可欠であるため、化学療法的介入の重要な標的となっている。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は多能性前駆細胞であり、様々な組織の維持及び再生に寄与する7、8。ＭＳＣは多くの組織に認められ、そこでＭＳＣは、骨髄、血液などの局所的な幹細胞源又は種々の間葉組織源として働く。ＭＳＣは、外傷後又は慢性炎症の最中の組織リモデリングに寄与する。傷害された組織は特異的エンドクリンを放出すると考えられ、次にそのエンドクリンによって多能性ＭＳＣが可動化され、続いて外傷部位に動員される。ＭＳＣはまた、腫瘍間質に強く誘引される。実験動物で血液中に浸出したＭＳＣは悪性腫瘍に局在化する。そこではＭＳＣは、腫瘍脈管系及び間質線維芽細胞を含めた腫瘍間質を含む様々な細胞型に寄与し得る。
【０００４】
乳癌においては、腫瘍部位にあるＭＳＣが小タンパク質のケモカインＣＣＬ５を放出することが、最近になってＫａｒｎｏｕｂらにより示された。ＣＣＬ５は様々な間質細胞の化学誘引物質として作用することができ9、10、その発現は腫瘍の新血管新生の増加と関連付けられている。加えて、ＣＣＬ５は、多数の間質細胞型を原発腫瘍の増殖部位に動員することによって癌の増殖及び転移に寄与し得る9、11、12。
【０００５】
最近になって、ＭＳＣ前駆体のＣＤ３４-サブポピュレーションが増殖中の腫瘍に動員され、新しい血管内皮細胞（ＥＣ）又は周皮細胞へのその分化を介して腫瘍血管新生に寄与することが示されている13〜15。重要なことに、これらの及び関連する直接的な作用は、ＭＳＣを末梢循環に直接注入した後に観察することができる16。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血管新生を行う腫瘍組織との近接性に基づく細胞傷害性タンパク質発現ではなく、それ自体が細胞傷害性タンパク質を発現させる腫瘍間質組織との近接性に基づく細胞傷害性タンパク質発現を用いる幹細胞ベースの治療法が必要とされているが、いまだ対応されていない。これは特に、まだ血管新生を行っていない転移性腫瘍の治療に関して強く必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態は、腫瘍に罹患した対象の治療方法を提供し、これは、対象の血流中に治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞を導入するステップを含み、各遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
【０００８】
本発明の別の実施形態はまた、本特許出願に開示される腫瘍に罹患した対象の治療方法のいずれかにおいて使用される遺伝子修飾された間葉系幹細胞も提供する。
【０００９】
本発明はまた、膵腫瘍に罹患したヒト対象の治療方法も提供し、これは、約１×１０5〜約１×１０9細胞／ｋｇ体重の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞を対象の血流中に導入するステップを含み、ここで（ａ）各遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含み、（ｂ）対象は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法でガンシクロビルにより治療され、及び（ｃ）遺伝子修飾された間葉系幹細胞の導入は、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない。
【００１０】
本発明はさらに、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞を提供し、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
【００１１】
さらに本発明のさらなる実施形態は、
−（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
−間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞に関する。
【００１２】
さらに、レトロウイルスパッケージング細胞はまた、パッケージング細胞からシュードタイプビリオンを産生するための構造タンパク質及び酵素をコードする遺伝子も含む。
【００１３】
最後に、本発明は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾されたヒトＣＤ３４-幹細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）左側腹部を１ｃｍ切開して膵臓を露出させた。１ｍｌシリンジを使用して１５０，０００個のＰａｎｃ０２膵癌細胞を膵臓に注入した。（Ｂ）手技の２週間後、全てのマウスで触知可能な腫瘍が成長し、マウスをそれぞれの実験群に無作為に割り付けた。
【図２】変法ボイデンチャンバーアッセイを用いて、Ｐａｎｃ０２細胞から得た馴化培地に対するＣ５７Ｂｌ６ ＭＳＣの遊走応答を評価した。結果は、Ｐａｎｃ０２から得た増殖培地へのＭＳＣの遊走が用量依存的に誘導されることを示す。
【図３】ＭＳＣ（ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰを構成的に発現するよう改変したもの）の移植Ｐａｎｃ０２腫瘍への浸潤能力を調べた。１週間に３回、増殖中の膵腫瘍を有するマウスに５００，０００個の細胞を静脈内注入した。５週間後、マウスを屠殺し、腫瘍を摘出してＧＦＰの発現について分析した。（Ａ）結果は、腫瘍に関連する強力なＧＦＰ発現を示す。（Ｂ）ＭＳＣの養子移入により、実験を通して移植腫瘍の増殖の増加が認められた。
【図４】ＣＣＬ５プロモーターは、Ｐａｎｃ０２腫瘍を標的とするＭＳＣに対するレポーター遺伝子発現の選択性の増加を提供する。ＭＳＣを、ＣＣＬ５プロモーターの制御下でＲＦＰ又はｅＧＦＰのいずれかを発現するよう改変した。週１回５００，０００個の細胞を３週間にわたり注入した後、動物を屠殺し、蛍光顕微鏡法によって腫瘍をレポーター遺伝子発現について調べた。ＣＣＬ５プロモーターにより駆動したｅＧＦＰ（Ａ）及びＲＦＰ（Ｂ）の双方のレポーター遺伝子とも、腫瘍環境内で発現を示した。ＲＦＰ特異的ポリクローナル抗体を使用した固定化組織切片に対する免疫組織化学により、さらに正確な腫瘍形態を観察した（Ｃ及びＤ）。（Ｃ）結果は、腫瘍の間質領域におけるＲＦＰの限局的な発現を示す（１００×）。（Ｄ＋Ｅ）より高倍率の同様の腫瘍試料が（それぞれ２００×、５００×）、腫瘍環境におけるＲＦＰレポーター遺伝子の発現を示してＭＳＣの広範囲にわたる浸潤を示す。
【図５】膵癌に対する治療モダリティとしてのＧＶＣを併用した、ＣＣＬ５プロモーターの制御下でＨＳＶ−ＴＫを発現するよう改変されたＭＳＣの適用。（Ａ）ＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子を発現させるためのＭＳＣの改変に使用したコンストラクトの概要。（Ｂ）治療レジメンについて、５００，０００個のＣＣＬ５−ＴＫ改変ＭＳＣを静脈内注入した。細胞には３日間、増殖腫瘍への動員を行わせ、ＴＫ遺伝子の発現を活性化させた。マウスは１日１回の７．５ｍｇＧＶＣの静脈内注入を４日間にわたり受け、その後１日の休止をおいた。次にマウスに再び改変幹細胞を注入し、実験期間中このサイクルを繰り返した。３サイクル後（腫瘍誘導の３６日後又は初回ＭＳＣ注入の２１日後）、動物を屠殺して腫瘍増殖を評価した。（Ｃ）媒体対照、改変ＭＳＣ対照（ＲＦＰ、ｅＧＦＰ）及びＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ治療による処置動物から切除した腫瘍の例。（Ｄ）ＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ治療の結果、実験を通して腫瘍増殖が有意に減少した。
【図６】遺伝子エレメントのいくつかの例を含む導入遺伝子カセットの図式的概要である。誘導性プロモーター（ｐＩｎｄ）が細胞傷害性タンパク質コード領域に連結される。第２の構成的細胞又はウイルスプロモーター（ｐＣｏｎｓｔ）が選択マーカー遺伝子に連結される。２つのユニットはインシュレーター配列（＋／−インシュレーター）によって分離されてもよい。
【図７】図６に図示されるＭＳＣを遺伝子修飾するための導入遺伝子カセットを有するレトロウイルスベクターの概要。ベクター産生は、５’末端反復配列（ＬＴＲ）におけるＵ３領域のプロモーター活性により駆動され得る。５’Ｕ３領域は他のウイルスプロモーターに置き換えられてもよい。パッケージングシグナルΨは、ベクターゲノムのベクター粒子へのキャプシド化を促進する。レンチウイルス粒子の産生には、ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）及びセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）などのさらなるエレメントが必要である。ウッドチャック肝炎転写後制御エレメント（ｗＰＲＥ）を最適に付加すると、ベクター力価及び導入遺伝子発現の増加に役立ち得る。誘導性プロモーター（ｐＩｎｄ）が細胞傷害性タンパク質コード領域に連結される。第２の構成的細胞又はウイルスプロモーター（ｐＣｏｎｓｔ）が選択マーカー遺伝子に連結される。２つのユニットは、インシュレーター配列（＋／−インシュレーター）によって分離されてもよい。
【図８】ＲＡＮＴＥＳプロモーターの制御下でＨＳＶ ｔｋを発現するレンチウイルスベクターのプラスミドマップ。
【図９】ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）によるＭＳＣの誘導後のＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡ発現。相対的なＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡ量は、正規化値として０時間の非誘導試料を含むΔΔＣＴ法を用いて計算した。２つの生物学的試料による平均値を示す。
【図１０】ｈＭＳＣをガンシクロビルで処置すると、ＴＮＦα及びＩＦＮγによるＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導後、特異的な細胞死がもたらされる。ｈＭＳＣの代表的な顕微鏡写真であり、処置なし（Ａ）、ＴＮＦα及びＩＦＮγにより誘導（Ｂ）、ガンシクロビルのみによる処置（Ｃ）、又は初めにＴＮＦα及びＩＦＮγで誘導し、次にガンシクロビルで処置（Ｄ）であった。１００×倍率。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語
本願において使用する特定の用語は、以下に定める意味を有するものとする。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、細胞は、それが、又はその前駆体細胞のいずれかが同じ種の別の対象由来である場合、対象に対して「同種異系」である。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、細胞は、それが、又はその前駆体細胞が当該の同じ対象由来である場合、対象に対して「自家性」である。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ３４-幹細胞」は、その表面にＣＤ３４を欠く幹細胞を意味するものとする。ＣＤ３４-幹細胞、及びその単離方法は、例えば、Ｌａｎｇｅ Ｃ．ら、「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ ｓａｆｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」 Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７年４月２５日［印刷版に先立つ電子版］に記載される。
【００１９】
本明細書で使用されるとき「細胞傷害性タンパク質」は、細胞内に、細胞上に、及び／又は細胞に近接して存在するとき、直接的及び／又は間接的に当該細胞の死滅を引き起こすタンパク質を意味するものとする。細胞傷害性タンパク質としては、例えば、自殺タンパク質（例えばＨＳＶ−ｔｋ）及びアポトーシス誘導因子が挙げられる。細胞傷害性遺伝子としては、ヌル遺伝子、遺伝子ノックダウン用のｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ（例えばＣＣＲ５−／−）が挙げられる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子を含め、多数の自殺遺伝子系が同定されている。シトシンデアミナーゼ；シトクロムＰ４５０；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；カルボキシペプチダーゼＧ２；ニトロレダクターゼ。Ｙａｚａｗａ Ｋ、Ｆｉｓｈｅｒ ＷＥ、Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ ＦＣ：「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ」 Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ．２００２年７月；２６（７）：７８３〜９頁に詳述されるとおり。細胞傷害性因子としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）ケモカイン及びムチンケモカインＧＰＩ融合などのホーミング因子（ケモカイン由来の作用物質を使用して、改変幹細胞の特異的な動員を促進することができる。例えば、ＧＰＩアンカーが付加されるムチン融合に関してＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１５０８号明細書を参照のこと；（ｉｉ）細胞傷害性タンパク質としてのウイルス抗原（麻疹、水痘）；及び（ｉｉｉ）改変幹細胞の表面に提示され、その後ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体、及びＣＤ５２エピトープに特異的なＣａｍＰａｔｈ（登録商標）（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）の投与が続き得るＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、核酸は、ある細胞又はある細胞の前駆体細胞のいずれかに人為的に導入された場合、当該の細胞に対して「外因性」である。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、幹細胞は、それが、又はその前駆細胞のいずれかが、そこに人為的に導入された核酸を有している場合、「遺伝子修飾」されている。遺伝子修飾された幹細胞を作成する方法としては、ウイルス性又は非ウイルス性遺伝子導入（例えば、プラスミド導入、ファージインテグラーゼ、トランスポゾン、ＡｄＶ、ＡＡＶ及びレンチウイルス）の使用が挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、幹細胞を対象の血流中に「導入する」とは、限定なしに、かかる細胞を対象の静脈又は動脈の一方に注入によって導入することを含むものとする。かかる投与はまた、例えば、一回、複数回、及び／又は１つ又は複数の一定期間にわたり実施することができる。単回注入が好ましいものの、場合によっては経時的な反復注入（例えば、毎日、３日毎、毎週、隔週、毎月、四半期毎、半年毎又は毎年）が必要となることもある。かかる投与はまた、好ましくは幹細胞と薬学的に許容可能な担体との混合物を用いて実施される。薬学的に許容可能な担体は当業者に公知であり、限定はされないが、０．０１〜０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．８％の生理食塩水が挙げられる。加えて、かかる薬学的に許容可能な担体は水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒体を含め、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液、及び懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル及び固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、流体及び栄養補液、リンゲルデキストロースなどの電解質補液、リンゲルデキストロースをベースとしたものなどが挙げられる。静脈内投与に一般的に使用される流体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ（３４）に掲載されている。防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどもまた存在し得る。
【００２３】
「間葉系幹細胞」（「ＭＳＣ」とも称される）は、循環系及びリンパ系の結合組織、骨、軟骨、及び細胞を生じ得る。間葉系幹細胞は、ゆるく充填された紡錘状又は星状の未分化細胞からなる胚性中胚葉の一部である間葉に見られる。本明細書で使用されるとき、間葉系幹細胞は、限定なしにＣＤ３４-幹細胞を含む。
【００２４】
本発明の一実施形態において、ＭＳＣは、Ｈｏｒｗｉｔｚら49において多能性間葉系間質細胞として定義される線維芽細胞様のプラスチック付着細胞であり、またＣＤ３４-細胞も含む。誤解を避けるため、用語「多能性間葉系間質細胞」はまた、間葉系幹細胞及びその前駆体のサブポピュレーションも含み、このサブポピュレーションは、インビボで特定の複数の細胞型に分化可能な多分化能を有する自己複製細胞から構成される。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「骨髄破壊」は、例えば、高用量の化学療法又は高線量の放射線療法の投与によって引き起こされる骨髄細胞の重度の又は完全な減少を意味するものとする。骨髄破壊は標準的手順であり、例えばＤｅｅｇ（３３）に記載されている。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「核酸」は、限定なしに、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのハイブリッドを含めた任意の核酸分子を意味するものとする。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵ、並びにその誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は当該技術分野において公知であり、「ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ １９９６−１９９７、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．、米国）に例示される。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、細胞傷害性タンパク質をコードする核酸領域は、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに対して、かかるプロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが適切な状況下で細胞傷害性タンパク質の発現を生じさせる場合に、「作動可能に連結」されている。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを意味する。「ペプチド」は、典型的にはより短鎖のポリペプチド（例えば、１０アミノ酸残基）を指し、及び「タンパク質」は、典型的にはより長鎖のポリペプチド（例えば、２００アミノ酸残基）を指す。アミノ酸残基は天然に存在するものであっても、又はその化学的類似体であってもよい。ポリペプチドはまた、グリコシル化、リピド結合、硫酸化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化などの修飾も含み得る。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、組織「に近接している」とは、例えば、組織の１ｍｍ以内、組織の０．５ｍｍ以内及び組織の０．２５ｍｍ以内を含む。
【００３０】
用語「ＲＡＮＴＥＳ」プロモーターは、本明細書では用語「ＣＣＬ５」プロモーターと同義として使用される。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、細胞傷害性タンパク質は、それをコードする遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍間質組織に近接したとき、細胞傷害性タンパク質が当該環境内において、対象体内の任意の他の環境における発現と比べてより多く発現する場合に、「選択的に発現」する。好ましくは、細胞傷害性タンパク質は当該環境において、対象体内の任意の他の環境における発現と比べて少なくとも１０倍多く発現する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット又はウサギなどの任意の動物を意味するものとする。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、疾病に罹患した対象を「治療する」とは、疾病の進行を遅延させ、抑止し、又は逆転させることを意味するものとする。好ましい実施形態において、疾病に罹患した対象を治療するとは、理想的には疾病それ自体が消失する点まで疾病の進行を逆転させることを意味する。本明細書で使用されるとき、疾病を寛解させることと疾病を治療することとは同義である。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」は、限定なしに、前立腺腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫／平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴ及び悪性リンパ腫を含むものとする。これらには、原発腫瘍並びに転移性腫瘍（血管新生しているもの及び血管新生していないものの双方）が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、細胞は、それが、又はその前駆細胞のいずれかが異なる種の別の対象由来である場合、対象に対して「異種」である。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍の間質組織」は、腫瘍の周囲及び近傍の結合性構造組織を含み、線維芽細胞／筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、血管細胞、平滑筋細胞、及び免疫細胞などの様々な細胞を含む。腫瘍間質はまた、細胞外マトリックス及び細胞外分子も提供する53。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「炎症性メディエーター」は、組織傷害及び腫瘍増殖の部位で作用し、且つ組織傷害及び腫瘍増殖に対する炎症誘発反応及び抗炎症反応を仲介する免疫調節分子を含む。炎症性メディエーターの非限定的な例は、サイトカイン、及びエイコサノイドである。腫瘍細胞及び周囲の間質細胞は、炎症誘発性サイトカイン及び炎症反応と協調するプロテアーゼなどの数多くの炎症誘発性メディエーターを産生することが知られている。かかるメディエーターの例は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６である。加えて、腫瘍細胞及び間質細胞はまた、ＴＧＦ−β、ＩＬ−ｌ０及びＭ−ＣＳＦなどの、例えば樹状細胞の成熟を阻害する抗炎症性分子を分泌することにより免疫応答を抑制することも可能である54。
【００３８】
本発明の実施形態
本発明は、腫瘍に罹患した対象の治療方法を提供し、これは、対象の血流中に治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞を導入するステップを含み、ここで各遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
【００３９】
治療される対象は任意の動物であってよく、好ましくはヒトである。治療される腫瘍は原発性であっても、又は転移性であってもよく、及び血管新生していても、又は血管新生していなくともよい。好ましくは、腫瘍は転移性で、且つ血管新生していない。腫瘍は、例えば、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫／平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴ及び悪性リンパ腫であり得る。好ましくは、腫瘍は膵腫瘍である。別の好ましい実施形態において、治療される腫瘍の間質組織は線維芽細胞様細胞を含む。
【００４０】
間葉系幹細胞は、様々な供給源：例えば、骨髄、臍帯血、（動員された）末梢血及び脂肪組織から単離することができる49。さらに好ましい実施形態において、遺伝子修飾された間葉系幹細胞はＣＤ３４-幹細胞である。加えて、遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、対象に対して同種異系であっても、自家性であっても、又は異種性であってもよい。遺伝子修飾された幹細胞を用いる本方法では、幹細胞が（ｉ）標的組織内の適切な細胞に近接し、（ｉｉ）分化し、及び／又は（ｉｉｉ）標的組織内の適切な細胞と融合すると、外因性遺伝子が発現し、すなわち「オン」に切り換えられる。
【００４１】
本発明では、遺伝子修飾された間葉系幹細胞の導入は、好ましくはその前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、腫瘍に罹患した対象の治療方法のいずれかにおいて使用される間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞を提供する。特に間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞は、炎症性メディエーターによって誘導可能な、且つ細胞傷害性タンパク質コード領域の転写を制御するプロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むことができる。これらの炎症性メディエーターは腫瘍の間質組織により放出されることができ、従って幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、間葉系幹細胞において細胞傷害性タンパク質の発現が誘導される。炎症性メディエーターは、例えばＴＮＦα又はＩＦＮγなどのサイトカインであってもよい。特にプロモーターは、とりわけＴＮＦα又はＩＦＮγによって誘導され得るＲＡＮＴＥＳプロモーターであってもよい35。ＲＡＮＴＥＳプロモーターはまた、ＭＳＣの分化との関連における分化シグナルによって誘導されることもできる。炎症誘発性メディエーターによって誘導可能なプロモーターのさらなる例はＮＦ−ｋＢ応答エレメント36、及び一般にＩＬ１β又はＴＮＦαによって誘導され得るプロモーター37である。
【００４３】
加えて、抗炎症性メディエーター（例えばＴＧＦ−β）により活性化されるプロモーターを使用して、間葉系幹細胞における細胞傷害性タンパク質の標的発現を実現することができる。例は、Ｓｍａｄ結合エレメントを含むプロモーターである55。
【００４４】
炎症メディエーターによって誘導可能なプロモーターの使用により、まだ血管形成を行っていない腫瘍を選択的に治療することが可能となる。
【００４５】
本発明の治療法のいずれかにおいて使用される幹細胞は、さらに、（ｉｉｉ）（ｉｖ）に作動可能に連結された選択マーカー遺伝子、（ｉｖ）構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むことができる。選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン又はウアバインに対する耐性を付与する遺伝子を含むことができる38。抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質の存在下で遺伝子修飾された間葉系幹細胞を選択するために、及び発癌を促進する可能性があることから腫瘍治療において使用すべきでない未修飾の間葉系幹細胞を抑制するために使用することができる。抗生物質耐性遺伝子に加えて又は代えて、表面マーカータンパク質をコードする遺伝子を使用することができ、これは遺伝子修飾された間葉系幹細胞の表面上でのみ発現する。表面マーカータンパク質の非限定的な例は、ＣＤ３４及びＣＤ２４のスプライス変異体である39〜40。表面マーカータンパク質を認識する特異抗体を有する磁気ビーズを使用して、遺伝子修飾された間葉系幹細胞を選択してもよい41。
【００４６】
選択マーカー遺伝子の転写を制御する構成的プロモーターは、ｐＣＡＧ42、ＥＦ１α43、ＰＧＫ42、ＣＭＶ及びＳＦＦＶ42などの様々な異なるプロモーターであり得る。
【００４７】
加えて、本発明の様々な実施形態に係る幹細胞は、（ｖ）細胞傷害性タンパク質コード領域と選択マーカー遺伝子との間に位置するインシュレーター配列、を含み得る。インシュレーター配列は、いかなる炎症性メディエーターも存在しない場合に、選択マーカー遺伝子の構成的プロモーターが細胞傷害性タンパク質コード領域の転写に影響を及ぼして、それを「オン」に切り換えることが起こらないよう確実にし得る44。
【００４８】
好ましくは、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域は、及び構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子もまた、幹細胞ゲノムに組み込まれる。これにより、染色体外ベクターを有する遺伝子修飾された幹細胞と比べてより安定的な遺伝子修飾された間葉系幹細胞を産生することが可能となる。
【００４９】
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子修飾された幹細胞は、幹細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルス配列をさらに含み、ここでプロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、及び構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子は、プロウイルス配列の一部である。特にレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）由来のウイルスを使用して間葉系幹細胞を安定的に遺伝子修飾することができる。レトロウイルスの例は、レンチウイルス、α−レトロウイルス又はγ−レトロウイルスである。
【００５０】
以下に、２つの機能ユニットを有する導入遺伝子カセットを含むレトロウイルスベクターについて記載する（図６）。２つの機能ユニットは、
１．インビトロ選択：抗生物質耐性遺伝子（例えばピューロマイシン耐性遺伝子）などの選択マーカー遺伝子又は磁気ビーズ分離に好適な表面マーカー遺伝子（例えばＣＤ３４）に連結された細胞由来又はウイルス由来の構成的プロモーター（例えばＣＡＧプロモーター）
２．バイスタンダー死：細胞傷害性タンパク質コード領域（例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼをコードする）に連結された細胞由来又はウイルス由来の誘導性腫瘍特異的プロモーター（例えばＲＡＮＴＥＳプロモーター）
である。
【００５１】
場合により、２個のプロモーター間のプロモーター干渉を防ぐため、機能ユニットをインシュレーター配列によって分離してもよい。
【００５２】
上述の導入遺伝子カセットは、ＭＳＣに送達し、そこでの発現を安定させるため、レトロウイルスに由来するウイルスベクター系などの様々なウイルス及び非ウイルスベクター系に組み込まれ得る。
【００５３】
ＭＳＣを遺伝子修飾するためのレトロウイルスベクターは、α−、γ−レトロウイルス又は（ヒト及び非ヒト）レンチウイルスに由来し得る。レトロウイルスベクター系は、目的とする導入遺伝子、すなわち細胞傷害性タンパク質コード領域を有する導入ベクター骨格と、ベクターＤＮＡの逆転写及び組み込みに必要なあらゆる配列エレメントとを含むが、しかしｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子などのほとんど又は全てのウイルス遺伝子は欠いている。最も新しい次世代レトロウイルスベクターは、特別な安全性の修飾を含み得る：これらのいわゆる自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターでは、３’Ｕ３領域が部分的又は完全に取り除かれ、それによりウイルスのプロモーター活性が停止し、宿主細胞ゲノムにおける隣接遺伝子の転写活性化が防がれる50。
【００５４】
ベクター粒子の産生には、トランスで構造タンパク質、酵素及びエンベロープタンパク質を提供する様々な数のヘルパープラスミドが必要となる50。外来エンベロープ糖タンパク質を有するウイルス粒子を産生することができる。このプロセスはシュードタイピングと呼ばれる。これにより、ベクター粒子の向性を変化させることが可能となり、場合によってはベクター力価が亢進する。
【００５５】
上述の導入遺伝子カセットは、標準的な分子生物学的方法を用いてＳＩＮ−レトロウイルスベクター骨格に挿入され、標準方法に従いウイルス粒子を産生し得る50。
【００５６】
図７は、α−及びγ−レトロウイルス及びレンチウイルスベクターコンストラクトの例示的概要を示し、これらは図６に図示される上述の導入遺伝子を有し得る。
【００５７】
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ ＧＰ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ｇ）、ＲＤ１１４−ＴＲ又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ ｅｎｖ）の糖タンパク質によるベクター粒子のシュードタイピングが企図される。
【００５８】
間葉系幹細胞を遺伝子修飾するための別の代替的方法は、化学的（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）又は物理的（例えば電気穿孔）トランスフェクションによるものである。その後、トランスフェクト細胞を上記に記載したとおり選択することで、導入遺伝子カセットが偶然に間葉系幹細胞ゲノムに組み込まれた、安定的にトランスフェクトされたＭＳＣを選択することができる。
【００５９】
ＭＳＣを遺伝子修飾するためのさらに別の代替例は、トランスポゾンに由来する非ウイルスベクター系の使用によるものである。上述の発現カセットを末端逆方向反復配列に隣接して配置した後、コンストラクトをトランスフェクションによってＭＳＣに導入することができる。トランスフェクションの間にスリーピング・ビューティー51又はピギーバック52などのトランスポザーゼがトランスで発現する場合、発現カセットはＭＳＣのゲノムに安定的に組み込まれ得る。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態に係る遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、シュードタイプビリオンを天然間葉系幹細胞に形質導入することにより調製することができ、その表面上で外来糖タンパク質が発現し、それによって向性及び多くの場合にビリオンの力価が変化する。
【００６１】
シュードタイプビリオンは、
− （ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
− 間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞を用いて生成することができる。
【００６２】
さらに、レトロウイルスパッケージング細胞はまた、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子などの、パッケージング細胞からシュードタイプビリオンを産生するための構造タンパク質及び酵素をコードする遺伝子も含み、それによりシュードタイプビリオンの構築が可能となる。
【００６３】
好ましくは、構造タンパク質及び酵素をコードするこれらの遺伝子は、感染性であるが複製能を有しないビリオンを産生するため、間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質のコード遺伝子とは異なるベクターに位置する。これらのシュードタイプビリオンは、（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを有し、ウイルス表面タンパク質を発現する。通常、間葉系幹細胞の形質導入には、シュードタイプビリオンを含むレトロウイルスパッケージング細胞の上清が用いられ得る。
【００６４】
間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子（シュードタイピング）は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ ＧＰ）45、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ｇ）45、ＲＤ１１４−ＴＲ46又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ ｅｎｖ）47などの広範な宿主向性を付与する多種多様な糖タンパク質であり得る。
【００６５】
既に上述したとおり、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせは、サイトカイン又は他の炎症性メディエーターにより誘導可能であり得る。好ましい実施形態において、プロモーターはＲＡＮＴＥＳプロモーターである。レトロウイルスパッケージング細胞はまた、さらなる遺伝子及びプロモーターも誘導することができる。
【００６６】
本発明の別の特定の実施形態において、細胞傷害性タンパク質は理想的には単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、対象は理想的には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法でガンシクロビルにより治療される。ガンシクロビル及びその使用方法は、当該技術分野において公知である。別の可能性は、細胞傷害性タンパク質としてシトシンデアミナーゼを使用することであり、これは５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロウラシルに変換する48。
【００６７】
本発明において、治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞としては、限定なしに以下の量及び量の範囲が挙げられる：（ｉ）約１×１０5〜約１×１０9細胞／ｋｇ体重；（ｉｉ）約１×１０6〜約１×１０8細胞／ｋｇ体重；（ｉｉｉ）約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｉｖ）約５×１０6〜約１×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｖ）約１×１０7〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｖｉ）約７×１０6〜約９×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｖｉｉ）約１×１０5細胞／ｋｇ体重；（ｖｉｉｉ）約１×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｉｘ）約５×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｘ）約１×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｘｉ）約６×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｘｉｉ）約７×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｘｉｉｉ）約８×１０6細胞／ｋｇ体重；及び（ｉｘ）約９×１０6細胞／ｋｇ体重。想定されるヒトの体重としては、限定なしに、約５０ｋｇ、約６０ｋｇ；約７０ｋｇ；約８０ｋｇ、約９０ｋｇ；及び約１００ｋｇが挙げられる。これらの数値は、ＭＳＣの移植からの前臨床動物実験及び標準プロトコルに基づく。
【００６８】
本発明はまた、膵腫瘍に罹患したヒト対象の治療方法も提供し、これは、約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞を対象の血流中に導入するステップを含み、ここで（ａ）各遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含み、（ｂ）対象は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法でガンシクロビルにより治療され、及び（ｃ）遺伝子修飾された間葉系幹細胞の導入は、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない。この方法において、腫瘍は好ましくは転移性であり、血管新生していても、又はしていなくともよい。加えて、遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、対象に対して同種異系であっても、自家性であっても、又は異種性であってもよい。
【００６９】
本発明は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞をさらに提供し、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。好ましくは、間葉系幹細胞はヒトＣＤ３４-幹細胞である。また、ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸も好ましく、ここで細胞傷害性タンパク質は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼである。
【００７０】
最後に、本発明は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾されたヒトＣＤ３４-幹細胞を提供する。
【００７１】
本発明で用いられる様々なタンパク質及び調節配列は、当業者によって容易に入手され得る。例えば、ＲＡＮＴＥＳプロモーターは（２２）に開示され、通常の技能を用いて入手することができる。チミジンキナーゼ（ＡＴＰ：チミジン５’ホスホトランスフェラーゼ、ｅ．ｃ． ２．７．１．２１）（１型ＣＬ１０１株）についてはＨＳＶ ＴＫ−Ｖ００４６７ヘルペス遺伝子を使用することができる。
【００７２】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってさらに理解されようが、当業者は、詳述される特定の実験が、その後に続く特許請求の範囲にさらに十全に記載されるとおりの本発明の例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。
【実施例】
【００７３】
実験の詳細
概要
目的：膵腫瘍間質を対象とした改変間葉系幹細胞に基づく治療法の効力を分析すること。
【００７４】
要約基礎データ：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は腫瘍間質に能動的に動員され、そこで腫瘍の増殖及び転移を亢進させる。腫瘍間質内のＭＳＣによる走化性サイトカインＣＣＬ５の上方制御が、この過程で中心的役割を果たすことが示されている。マウスＭＳＣを改変してＣＣＬ５プロモーターの制御下にレポーター遺伝子又は治療遺伝子を発現させ、増殖中の膵腫瘍を有するマウスに養子導入した。次に腫瘍の増殖及び転移に対する効果を評価した。
【００７５】
方法：Ｃ５７／Ｂｌ６ ｐ５３（−／−）マウスの骨髄から単離したＭＳＣに、ＲＡＮＴＥＳプロモーターにより駆動される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を安定的にトランスフェクトした。同所性同系膵Ｐａｎｃ０２腫瘍を有するマウスにＭＳＣを１週間に１回、３週間にわたり静脈内適用した。
【００７６】
結果：処置した膵腫瘍試料において、ＣＣＬ５プロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ及びＲＦＰシグナルを蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により検出した。幹細胞適用後５〜７日目にプロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）により腹腔内処置したＨＳＶ−ｔｋ治療群は、原発膵腫瘍の増殖が５０％低下し（ｐ＜０，０００３、スチューデントｔ検定）、肝転移が低下する（３０％対１００％）結果となる。
【００７７】
結論：ｅＧＦＰ−及びＲＦＰ−レポーター遺伝子を使用して、ＭＳＣの原発膵腫瘍間質への能動的なホーミング及びＲＡＮＴＥＳプロモーターの活性化を確認した。ガンシクロビルの存在下では、ＨＳＶ−ｔｋをトランスフェクトしたＭＳＣは原発膵腫瘍の増殖及び転移の発生の有意な低下をもたらした。
【００７８】
材料及び方法
間葉系幹細胞
記載されるとおりのｐ５３標的欠失ホモ接合体のＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から間葉系幹細胞を単離した15。細胞を細胞培養において付着性で且つ連続的に増殖させた。サブクローニング後、単細胞クローンを選択し、特性決定した15。細胞に、ＣＣＬ５プロモーターと連結した赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）又はＨＳＶチミジンキナーゼをトランスフェクトした。プロモーターの配列は、上流領域の−９７２及び全５’非翻訳領域を使用した18。加えて、全てのベクターが、ＣＭＶにより制御されるＢｓｒ２ブラストサイジン耐性遺伝子を含んだ。ブラストサイジンは、５μｇ／ｍｌの濃度でトランスフェクト細胞を選択するために使用した。マウスに注入する前に、細胞は培養フラスコから剥離し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【００７９】
変法ボイデンチャンバーアッセイ
変法ボイデンチャンバーアッセイを用いてインビトロでの特異的ＭＳＣ遊走を実施した15。幹細胞は、Ｐａｎｃ０２同系膵癌細胞の上清濃度の減少に対して遊走させた。
【００８０】
同所性膵癌モデル
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所からＣ５７ＢＬ６マウスを入手した。全ての動物実験は、バイエルン州の動物の権利に関する委員会から然るべき許可を得て行った。平均体重約２０ｇの２ヶ月齢〜３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをＰａｎｃ０２（Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系の）膵腫瘍の移植に使用した19。ケタミン（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）、キシラジン（体重１ｋｇ当たり５ｍｇ）及びアトロピンを使用してマウスを麻酔した。マウスの左側腹部における手術部位を無菌の方法で剃毛して準備した。左側腹部を１ｃｍ切開し、膵臓を露出させた。目盛り付き押しボタンデバイス（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）及び３０Ｇ針の１ｍｌシリンジ（双方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スペイン）を使用して、４０μｌのＰＢＳ溶液中の１５０，０００個のＰａｎｃ０２膵癌細胞を膵臓に注入した。膵癌細胞が腹膜内に播種されないことを確実にするよう注意を払った。そのため、膵臓から針を抜いた後、Ｑ−ｔｉｐを注入部位に１分間軽く押し当てた。腫瘍細胞の注入後、４−０ ｐｒｏｌｅｎｅ（Ｂｒａｕｎ ＡＧ、独国）の結節縫合により腹膜及び皮膚を閉じた。この手技の２週間後、全てのマウスで触知可能な腫瘍が成長し、マウスをそれぞれの実験群に無作為に割り付けた。Ａ群は幹細胞又はガンシクロビルの注入を受けず、Ｂ群は未修飾の幹細胞を投与され、Ｃ群はＣ５７ＢＬ／６ ｐ５３−／− ＣＣＬ５／ＨＳＶ−ｔｋ＋間葉系幹細胞及びＧＣＶ注入を受け、Ｄ群はＣ５７ＢＬ／６ ｐ５３−／− ＣＣＬ５／ＲＦＰ＋間葉系幹細胞を投与され、及びＥ群はＣ５７ＢＬ／６ ｐ５３−／− ＣＣＬ５／ｅＧＦＰ間葉系幹細胞を投与された。全ての幹細胞注入は０．５×１０6細胞／週の用量とし、尾静脈から投与した。Ｃ群のＧＣＶ（Ｃｙｍｅｖｅｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、独国）の注入は、幹細胞注入後５〜７日目に１．５ｍｇの用量で腹腔内に適用した。３サイクルの処置を経た後に全てのマウスを屠殺し、腫瘍を単離して計量した。統計的有意性の検定は、独立した試料に対する独立両側ｔ検定により達成した。
【００８１】
蛍光顕微鏡法
膵腫瘍の組織試料をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．米国）に包埋し、液体窒素でスナップ凍結した。５μｍ厚の低温切片を得た。ＤＡＰＩ核染色溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ「Ｈａｒｄ ｓｅｔ Ｄａｐｉ封入剤」、米国）を切片に加え、ＧＦＰ又はＲＦＰ蛍光シグナルについて直ちに評価した。ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲ顕微鏡カメラを使用して写真を撮り、ソフトウェアＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）（Ａｄｏｂｅ、米国）を使用して種々の蛍光チャネルの画像を重ね合わせた。
【００８２】
ＭＳＣ注入及びガンシクロビル処置
注入前、細胞を計数し、１×１０6細胞／ｍｌＰＢＳの最終濃度に希釈した。ガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｃｙｍｅｖｅｎ；Ｒｏｃｈｅ）をＨ2Ｏ（注射用水（ａｑｕａ ａｄ ｉｎｉｅｃｔａｂｉｌｉａ））中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。細胞懸濁液を２６Ｇ針で尾静脈から投与し、薬物を腹腔内注入により投与した。処置は、１日目に０．５ｍｌ細胞（５００，０００個の細胞）を注入して開始した。５〜７日目、ガンシクロビルを６０μｇ／ｇ体重の１日用量で、例えば体重２５ｇのマウスについて１５０μｌを適用した。７日目より後は、解剖まで処置サイクルを反復した。処置中は腫瘍の進行及び挙動を記録した。
【００８３】
組織及び腫瘍の調製
解剖後、全ての腫瘍を個別に調製した。各腫瘍の３分の１をホルムアルデヒド固定してパラフィンワックスに包埋し、一方、別の３分の１をフラッシュ凍結した。残りの３分の１は、後にＲＮＡ単離及び目的とするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行うため、製造者の指示に従いＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存した。
【００８４】
免疫組織化学
５μｍ切片に対し、先述のとおり免疫組織化学を実施した20。一次抗体としては、ポリクローナルウサギ抗ＲＦＰ抗体（株式会社医学生物学研究所、日本）をブロッキング溶液（乳＋ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）中に１：５０希釈した。二次抗体としては、ポリクローナルビオチン化ヤギ抗ウサギ（Ｌｉｎａｒｉｓ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｂｅｔｔｉｎｇｅｎ、独国）抗体を乳中に１：３００希釈した。
【００８５】
結果
ＭＳＣの膵腫瘍への動員
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのバックグラウンドにおいて同系同所性マウス膵腫瘍を予め確立した31、32。膵被膜下に移植した腫瘍細胞は成長し、深在性腫瘍血管系（図１）を示した。Ｐ５３（−／−）の骨髄から単離したＣＤ３４- ＭＳＣを使用して、改変ＭＳＣの腫瘍間質を標的化する効力を評価した15、16、2l。
【００８６】
初めにＭＳＣのＰａｎｃ０２腫瘍に対する一般的な向性を評価するため、変法ボイデンチャンバーアッセイを用いてＣ５７Ｂｌ６ ＭＳＣの腫瘍由来因子に対する誘導遊走を試験した。結果は、馴化腫瘍増殖培地の濃度増加に応じたＭＳＣの用量依存的な遊走を示す（図２）。
【００８７】
次にＣＭＶプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドにより細胞を改変した。１週間に１回、増殖中の膵腫瘍を有するマウスに５００，０００個の細胞を静脈内注入した。５週間後、マウスを屠殺し、腫瘍を摘出してＧＦＰの発現について分析した。結果は、腫瘍に関連した強力なＧＦＰ発現を示す（図３Ａ）。細胞はまた、二次的な脾臓、リンパ節、胸腺、皮膚及び腸にも遊走が認められた（データは図示せず、及び（１５））。これは、全身注入された幹細胞の増殖腫瘍へのホーミングを実証する。増殖中の膵腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ６マウスへのＭＳＣの静脈内注入もまた、腫瘍増殖の有意な増加をもたらした（図３Ｂ）。
【００８８】
静脈内適用されたＭＳＣの肝臓、脾臓、及び腹膜への転移の影響についても評価した。ＭＳＣの適用により、腹膜への転移が有意に増加することが認められた（表１）。
【００８９】
ＣＣＬ５プロモーターは腫瘍間質におけるレポーター遺伝子発現を駆動する
本発明者らは、次に、ＣＣＬ５プロモーターを使用した腫瘍間質へのＭＳＣ動員との関連において、レポーター遺伝子のさらに制御された発現を駆動する可能性について調査した。これを目的として、Ｐ５３（−／−）ＭＳＣ Ｃ５７／Ｂｌ６細胞系をＣＣＬ５プロモーターの制御下でＲＦＰ及びｅＧＦＰレポーター遺伝子により改変した18、22。ＣＣＬ５プロモーターは、概して組織ストレス又は傷害との関連における種々の組織型で活性である23〜27。翻訳開始点に対する直近の−９７２上流のヌクレオチド及び完全５’非翻訳領域を、ベクターにおけるｅＧＦＰ又はＲＦＰの上流にクローニングした。
【００９０】
得られたＣＣＬ５−ｅＧＦＰ又はＲＦＰにより安定的に改変されたＭＳＣは、ＦＡＣＳにおいて弱いながらも検出可能なレベルのレポーター発現を示した（データは図示せず）。次に、増殖中の膵腫瘍を有するマウスの末梢循環中に細胞（５００，０００個）を８日毎に２１日間にわたり注入した。
【００９１】
３週間後、マウスを屠殺し、ＲＦＰ及びｅＧＦＰレポーター遺伝子発現について腫瘍及び周囲組織を蛍光顕微鏡法（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）及び免疫組織化学により分析した。結果は、増殖中の腫瘍におけるＲＦＰ及びＧＦＰ蛍光の発現を示した（図４Ａ及び図４Ｂ）。より優れた形態学により組織試料中のＲＦＰの発現を調べるため、ＲＦＰタンパク質発現についてホルムアルデヒド固定試料を免疫組織化学により試験した。腫瘍間質全体にわたりＲＦＰ発現ＭＳＣが検出された（図４Ｃ、図４Ｄ及び図４Ｅ）。
【００９２】
改変ＭＳＣにおける治療モダリティとしてのＨＳＶ−ｔｋの使用
次の実験フェーズにおいて、ＣＣＬ５プロモーターを使用した治療遺伝子の送達を調べた。これを目的として、単純ヘルペスチミジンキナーゼの遺伝子（ＨＳＶ−Ｔｋ）28をＣＣＬ５プロモーターの後ろにクローニングした（図５Ａ）。
【００９３】
０．５×１０6個のＣＣＬ５−ｔｋ改変ＭＳＣを注入した後、細胞に３日間の間、増殖中の腫瘍間質への動員を行わせ、分化及びそれに続くｔｋ遺伝子の発現を行わせた。次にマウスが、３日間にわたる１．５ｍｇＧＶＣの１日１回の腹腔内注入からなる処置コースを受けた。マウスに再び改変幹細胞を注入し、実験期間中このサイクルを繰り返した（図５Ｂ）。３６日後、動物を屠殺して腫瘍増殖を評価した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。結果は、ＧＣＶと共に治療的ＣＣＬ５／ＨＳＶ−Ｔｋ幹細胞コンストラクトを投与されたマウス群において、処置を受けていない、又は対照ＭＳＣ（ＣＣＬ５−ＲＦＰ ＭＳＣ及びＣＣＬ５−ｅＧＦＰ ＭＳＣ）を投与された腫瘍を有する対照動物と比較して、腫瘍容積が有意に減少したことを示した。図５Ｃは、実験の完了後に切除した代表的な腫瘍を示す。腫瘍の重量は、処置を受けていない動物又は処置を受けた対照動物と比較したときの腫瘍重量の統計的に有意な減少を示す。
【００９４】
追加のパラメータとして、処置との関連における転移について肝臓、脾臓、及び腹膜を分析した。ＭＳＣの投与により腹膜における転移数が増加した一方、ＧＣＶによる処置の結果、脾臓及び肝臓における転移の有意な減少が生じた（両側のフィッシャー直接確率検定）（表２）。転移は、脾臓、肝臓、及び腹膜の原位置での観察及びそれぞれの臓器の触診により評価した。
【００９５】
考察
間葉系幹細胞は腫瘍間質に能動的に動員され、そこで腫瘍増殖の種々の側面に寄与する。ＭＳＣは腫瘍血管の前駆細胞として機能し得るとともに、間質線維芽細胞様細胞の生成にも寄与するものと思われる。腫瘍関連間質細胞の腫瘍増殖に対する及び転移可能性に対する固有の影響は、最近の研究の課題である。乳癌モデルの前臨床試験では、腫瘍間質内の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が高レベルのサイトカインＣＣＬ５を産生することが示された。ＣＣＬ５の分泌は、肺転移の発生率上昇をもたらす。
【００９６】
ＣＣＬ５分泌はまた、膵腺房周囲筋線維芽細胞において異なる形で調節され、これらの細胞についての膵臓における炎症細胞の浸潤及び蓄積の媒介における役割が示唆される29。膵癌患者の間では、膵炎がＣＣＬ５プロモーターにおける多型と有意に関連付けられている30。本明細書の研究では、原発腫瘍の増殖並びに転移に対する腫瘍間質との関連において、自殺遺伝子を選択的に送達するための治療媒体としての改変ＭＳＣの使用を評価する。
【００９７】
組織特異的に発現させるため、ＣＣＬ５プロモーターの制御下に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）を発現するようＭＳＣを改変した。さらに組織特異的に遺伝子発現させるため、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）を使用し、且つＣＣＬ５プロモーターの制御下にＭＳＣをトランスフェクトした。ｔｋはガンシクロビル（ＧＣＶ）をリン酸化し、それにより生成される毒素がトランスフェクト細胞を死滅させ、及びバイスタンダー効果により近傍の腫瘍細胞を死滅させる。ガンシクロビルを伴うＨＳＶ−ＴＫ遺伝子治療は、自殺遺伝子治療に広く用いられる戦略の基礎をなす17。
【００９８】
固形腫瘍は循環する前駆体に対して強力なホーミング駆動力を発揮するため、この手法を用いることで腫瘍環境が効率的に標的化される。自殺遺伝子のＣＣＬ５プロモーターにより駆動される組織特異的遺伝子発現に加え、媒体幹細胞のこの標的化は、高い効力及び低い副作用プロファイルの双方をもたらす。さらに、骨髄由来ＭＳＣは癌患者自身から得ることが可能である。これにより、骨髄破壊及び骨髄移植を必要とすることなく、簡易な静脈内投与によって自殺遺伝子を特異的に送達することが可能となり得る。
【００９９】
前臨床研究に基づく膵癌治療戦略は、患者生存期間を有意に延長させることには奏功していない。診断時、膵癌に罹患している患者のうち、手術可能な限局性の疾患を呈する者はわずか２０％に過ぎない。患者の４０％は局所進行性の（従って切除不能な）疾患を呈し、別の４０％は既に遠隔転移をきたしている。膵腫瘍モデルから、膵癌においてＭＳＣが重要な役割を果たすことが実証された。遊走アッセイ並びにＣＣＬ５／ＲＦＰ ＭＳＣの全身注入により示されるとおり、細胞は腫瘍を能動的に探す。全身注入された幹細胞は、腫瘍内にのみ認められた。続く腫瘍サイズの低下及び腹膜癌腫症の軽減は、個別の患者に適合させた幹細胞／自殺遺伝子の組み合わせによる治療の臨床応用に有望である。
【０１００】
他の組織ニッチに動員される改変幹細胞は同じ分化プログラムを受けず、従って治療遺伝子を発現しない。この手法により、決められた微小環境内での治療遺伝子の選択的発現を高度に制御することが可能となる。
【０１０１】
幹細胞治療を選択的遺伝子治療と連係させることにより、病変細胞又は欠損細胞の再生又は置換に対する、並びに腫瘍破壊に対する治療オプションが増強される。ここでは、遺伝子修飾された幹細胞が組織特異的遺伝子治療を腫瘍に届けるための媒体として機能し得るとともに、ＣＣＬ５プロモーターにより改変されたＭＳＣがｔｋ発現を駆動し得ることが示される。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
転移の発生に対するＭＳＣ治療の効果。媒体対照と未改変ＭＳＣで処置した動物との比較（ＭＳＣは週１回５００，０００細胞で３週間にわたり投与した）。試験は腫瘍増殖の３６日後に観察及び触診により行った。数値は転移を有した動物を表す。両側のフィッシャー直接確率検定により有意性を検定した。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
表２．腫瘍転移の分布。媒体対照動物並びにＧＦＰ及びＲＦＰレポーター遺伝子をトランスフェクトした対照ＭＳＣを、自殺遺伝子治療で処置した動物と比較した。試験は腫瘍増殖の３６日後に観察及び触診により行った。数値は転移を有した動物を表す。両側のフィッシャー直接確率検定により有意性を検定した。全てのＭＳＣが、週１回５００，０００細胞で３週間にわたり投与された。
【０１０６】
ヒトＭＳＣの安定形質導入についてのインビトロ実験及びＨＳＶ ｔｋ発現の誘導についてのインビトロアッセイ
遺伝子修飾されたヒトＭＳＣの生成
ヒトＭＳＣを、ＲＡＮＴＥＳプロモーターの制御下にあるＨＳＶ ｔｋ遺伝子及びＳＶ４０プロモーターの制御下にあるブラストサイジン耐性遺伝子を含むベクターｐＬｅｎｔｉ６ ＴＫ ＲＡＮＴＥＳを有する複製欠損レンチウイルスと共に一晩インキュベートした（感染多重度（ＭＯＩ）：１０）（図８を参照のこと）。
【０１０７】
一晩インキュベートした後、ウイルス含有培地を取り除き、新鮮培地に交換した。翌日、細胞にブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）を添加して遺伝子修飾されたＭＳＣを選択した。ブラストサイジンを含む培養培地は、最小限６日間にわたり３〜４日毎に交換した。
【０１０８】
ＲＡＮＴＥＳプロモーターのインビトロ誘導
サイトカインＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせがヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）においてＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導をもたらすことが実証された35。
【０１０９】
本発明者らの実験では、同じ組み合わせのサイトカインがＭＳＣにおいて内因性ＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導ももたらすことを実証しようとした。本発明者らは、インビトロでの外因性ＨＳＶ ｔｋの発現を誘導可能とするためにこのアッセイの使用を試みた。遺伝子修飾されたＭＳＣを最大４８時間にわたりＴＮＦα及びＩＦＮγと共に、又はサイトカインなしで培養し、０時間後、２４時間後及び４８時間後に全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ（６００ｎｇ）をｃＤＮＡに逆転写し、次にそれをｑＲＴ−ＰＣＲ反応で用いて、ＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ、プライマー：フォワード：ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＴ；リバース：ＧＧＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡ；ユニバーサルプローブ１６）で内因性ＲＡＮＴＥＳの発現を定量化した。異なる試料から同量のＲＮＡを使用したことを確かめるため、ハウスキーピング遺伝子（アクチン）を参照遺伝子として使用し（ユニバーサルプローブライブラリ ヒトＡＣＴＢ遺伝子アッセイ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ｈｕｍａｎ ＡＣＴＢ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ）、Ｒｏｃｈｅ）、ΔΔＣＴ法を用いて相対量を計算した。
【０１１０】
図９に示すとおり、本発明者らは、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）によるＭＳＣの誘導後２４時間及び４８時間において、内因性ＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡの顕著な増加を検出することができた。これらの結果は、ＲＡＮＴＥＳの発現が、ＨＵＶＥＣにおいてのみならず、ヒトＭＳＣにおいてもＴＮＦα及びＩＦＮγにより誘導されることを実証する。
【０１１１】
ガンシクロビル処置後の誘導された遺伝子修飾ＭＳＣの特異的細胞死
本発明者らは、内因性ＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導能を実証することができた後、続いて外因性ＲＡＮＴＥＳプロモーターの制御下にあるＨＳＶ ｔｋの発現を誘導することが可能かどうか、及び結果として、誘導された細胞をガンシクロビルで処置した後に細胞死を促進することが可能かどうかを調査した。上記のとおり生成した遺伝子修飾細胞（６ウェル当たり５００００個の細胞）を、３日毎に新鮮なサイトカインを添加しながら９日間にわたりＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置した。続いて細胞を１００μＭガンシクロビルと共に３日間インキュベートした。
【０１１２】
結果から、ＴＮＦα及びＩＦＮγにより誘導し、続いてガンシクロビルで処置した遺伝子修飾ＭＳＣが生存しなかったことが明らかに実証された（図１０Ｄ）。ＴＮＦα及びＩＦＮγによる誘導のみ（図１０Ｂ）又はガンシクロビルによる処置のみ（図１０Ｃ）の細胞とは対照的であった。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本願全体を通じて様々な刊行物が引用される。それらの刊行物の開示は、本発明が関わる分野の技術水準をより十全に説明するため、本明細書によって本願に参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
新しいパラダイムが示唆するところによれば、悪性細胞は、悪性表現型の惹起及び維持に大きい影響を及ぼす複雑な細胞内及び細胞外微小環境に存在する1、2。固形腫瘍は、悪性細胞と、並びに線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、リンパ性細胞、及び概して単核球浸潤を含む間質を含む支持細胞とから構成されるものと見ることができる2〜6。こうした間質細胞は腫瘍の生存に不可欠であるため、化学療法的介入の重要な標的となっている。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は多能性前駆細胞であり、様々な組織の維持及び再生に寄与する7、8。ＭＳＣは多くの組織に認められ、そこでＭＳＣは、骨髄、血液などの局所的な幹細胞源又は種々の間葉組織源として働く。ＭＳＣは、外傷後又は慢性炎症の最中の組織リモデリングに寄与する。傷害された組織は特異的エンドクリンを放出すると考えられ、次にそのエンドクリンによって多能性ＭＳＣが可動化され、続いて外傷部位に動員される。ＭＳＣはまた、腫瘍間質に強く誘引される。実験動物で血液中に浸出したＭＳＣは悪性腫瘍に局在化する。そこではＭＳＣは、腫瘍脈管系及び間質線維芽細胞を含めた腫瘍間質を含む様々な細胞型に寄与し得る。
【０００４】
乳癌においては、腫瘍部位にあるＭＳＣが小タンパク質のケモカインＣＣＬ５を放出することが、最近になってＫａｒｎｏｕｂらにより示された。ＣＣＬ５は様々な間質細胞の化学誘引物質として作用することができ9、10、その発現は腫瘍の新血管新生の増加と関連付けられている。加えて、ＣＣＬ５は、多数の間質細胞型を原発腫瘍の増殖部位に動員することによって癌の増殖及び転移に寄与し得る9、11、12。
【０００５】
最近になって、ＭＳＣ前駆体のＣＤ３４-サブポピュレーションが増殖中の腫瘍に動員され、新しい血管内皮細胞（ＥＣ）又は周皮細胞へのその分化を介して腫瘍血管新生に寄与することが示されている13〜15。重要なことに、これらの及び関連する直接的な作用は、ＭＳＣを末梢循環に直接注入した後に観察することができる16。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血管新生を行う腫瘍組織との近接性に基づく細胞傷害性タンパク質発現ではなく、それ自体が細胞傷害性タンパク質を発現させる腫瘍間質組織との近接性に基づく細胞傷害性タンパク質発現を用いる幹細胞ベースの治療法が必要とされているが、いまだ対応されていない。これは特に、まだ血管新生を行っていない転移性腫瘍の治療に関して強く必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態は、腫瘍に罹患した対象の治療方法を提供し、これは、対象の血流中に治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞を導入するステップを含み、各遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
【０００８】
本発明の別の実施形態はまた、本特許出願に開示される腫瘍に罹患した対象の治療方法のいずれかにおいて使用される遺伝子修飾された間葉系幹細胞も提供する。
【０００９】
本発明はまた、膵腫瘍に罹患したヒト対象の治療方法も提供し、これは、約１×１０5〜約１×１０9細胞／ｋｇ体重の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞を対象の血流中に導入するステップを含み、ここで（ａ）各遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含み、（ｂ）対象は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法でガンシクロビルにより治療され、及び（ｃ）遺伝子修飾された間葉系幹細胞の導入は、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない。
【００１０】
本発明はさらに、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞を提供し、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
【００１１】
さらに本発明のさらなる実施形態は、
−（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
−間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞に関する。
【００１２】
さらに、レトロウイルスパッケージング細胞はまた、パッケージング細胞からシュードタイプビリオンを産生するための構造タンパク質及び酵素をコードする遺伝子も含む。
【００１３】
最後に、本発明は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾されたヒトＣＤ３４-幹細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）左側腹部を１ｃｍ切開して膵臓を露出させた。１ｍｌシリンジを使用して１５０，０００個のＰａｎｃ０２膵癌細胞を膵臓に注入した。（Ｂ）手技の２週間後、全てのマウスで触知可能な腫瘍が成長し、マウスをそれぞれの実験群に無作為に割り付けた。
【図２】変法ボイデンチャンバーアッセイを用いて、Ｐａｎｃ０２細胞から得た馴化培地に対するＣ５７Ｂｌ６ ＭＳＣの遊走応答を評価した。結果は、Ｐａｎｃ０２から得た増殖培地へのＭＳＣの遊走が用量依存的に誘導されることを示す。
【図３】ＭＳＣ（ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰを構成的に発現するよう改変したもの）の移植Ｐａｎｃ０２腫瘍への浸潤能力を調べた。１週間に３回、増殖中の膵腫瘍を有するマウスに５００，０００個の細胞を静脈内注入した。５週間後、マウスを屠殺し、腫瘍を摘出してＧＦＰの発現について分析した。（Ａ）結果は、腫瘍に関連する強力なＧＦＰ発現を示す。（Ｂ）ＭＳＣの養子移入により、実験を通して移植腫瘍の増殖の増加が認められた。
【図４】ＣＣＬ５プロモーターは、Ｐａｎｃ０２腫瘍を標的とするＭＳＣに対するレポーター遺伝子発現の選択性の増加を提供する。ＭＳＣを、ＣＣＬ５プロモーターの制御下でＲＦＰ又はｅＧＦＰのいずれかを発現するよう改変した。週１回５００，０００個の細胞を３週間にわたり注入した後、動物を屠殺し、蛍光顕微鏡法によって腫瘍をレポーター遺伝子発現について調べた。ＣＣＬ５プロモーターにより駆動したｅＧＦＰ（Ａ）及びＲＦＰ（Ｂ）の双方のレポーター遺伝子とも、腫瘍環境内で発現を示した。ＲＦＰ特異的ポリクローナル抗体を使用した固定化組織切片に対する免疫組織化学により、さらに正確な腫瘍形態を観察した（Ｃ及びＤ）。（Ｃ）結果は、腫瘍の間質領域におけるＲＦＰの限局的な発現を示す（１００×）。（Ｄ＋Ｅ）より高倍率の同様の腫瘍試料が（それぞれ２００×、５００×）、腫瘍環境におけるＲＦＰレポーター遺伝子の発現を示してＭＳＣの広範囲にわたる浸潤を示す。
【図５】膵癌に対する治療モダリティとしてのＧＶＣを併用した、ＣＣＬ５プロモーターの制御下でＨＳＶ−ＴＫを発現するよう改変されたＭＳＣの適用。（Ａ）ＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子を発現させるためのＭＳＣの改変に使用したコンストラクトの概要。（Ｂ）治療レジメンについて、５００，０００個のＣＣＬ５−ＴＫ改変ＭＳＣを静脈内注入した。細胞には３日間、増殖腫瘍への動員を行わせ、ＴＫ遺伝子の発現を活性化させた。マウスは１日１回の７．５ｍｇＧＶＣの静脈内注入を４日間にわたり受け、その後１日の休止をおいた。次にマウスに再び改変幹細胞を注入し、実験期間中このサイクルを繰り返した。３サイクル後（腫瘍誘導の３６日後又は初回ＭＳＣ注入の２１日後）、動物を屠殺して腫瘍増殖を評価した。（Ｃ）媒体対照、改変ＭＳＣ対照（ＲＦＰ、ｅＧＦＰ）及びＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ治療による処置動物から切除した腫瘍の例。（Ｄ）ＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ治療の結果、実験を通して腫瘍増殖が有意に減少した。
【図６】遺伝子エレメントのいくつかの例を含む導入遺伝子カセットの図式的概要である。誘導性プロモーター（ｐＩｎｄ）が細胞傷害性タンパク質コード領域に連結される。第２の構成的細胞又はウイルスプロモーター（ｐＣｏｎｓｔ）が選択マーカー遺伝子に連結される。２つのユニットはインシュレーター配列（＋／−インシュレーター）によって分離されてもよい。
【図７】図６に図示されるＭＳＣを遺伝子修飾するための導入遺伝子カセットを有するレトロウイルスベクターの概要。ベクター産生は、５’末端反復配列（ＬＴＲ）におけるＵ３領域のプロモーター活性により駆動され得る。５’Ｕ３領域は他のウイルスプロモーターに置き換えられてもよい。パッケージングシグナルΨは、ベクターゲノムのベクター粒子へのキャプシド化を促進する。レンチウイルス粒子の産生には、ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）及びセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）などのさらなるエレメントが必要である。ウッドチャック肝炎転写後制御エレメント（ｗＰＲＥ）を最適に付加すると、ベクター力価及び導入遺伝子発現の増加に役立ち得る。誘導性プロモーター（ｐＩｎｄ）が細胞傷害性タンパク質コード領域に連結される。第２の構成的細胞又はウイルスプロモーター（ｐＣｏｎｓｔ）が選択マーカー遺伝子に連結される。２つのユニットは、インシュレーター配列（＋／−インシュレーター）によって分離されてもよい。
【図８】ＲＡＮＴＥＳプロモーターの制御下でＨＳＶ ｔｋを発現するレンチウイルスベクターのプラスミドマップ。
【図９】ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）によるＭＳＣの誘導後のＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡ発現。相対的なＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡ量は、正規化値として０時間の非誘導試料を含むΔΔＣＴ法を用いて計算した。２つの生物学的試料による平均値を示す。
【図１０】ｈＭＳＣをガンシクロビルで処置すると、ＴＮＦα及びＩＦＮγによるＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導後、特異的な細胞死がもたらされる。ｈＭＳＣの代表的な顕微鏡写真であり、処置なし（Ａ）、ＴＮＦα及びＩＦＮγにより誘導（Ｂ）、ガンシクロビルのみによる処置（Ｃ）、又は初めにＴＮＦα及びＩＦＮγで誘導し、次にガンシクロビルで処置（Ｄ）であった。１００×倍率。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語
本願において使用する特定の用語は、以下に定める意味を有するものとする。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、細胞は、それが、又はその前駆体細胞のいずれかが同じ種の別の対象由来である場合、対象に対して「同種異系」である。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、細胞は、それが、又はその前駆体細胞が当該の同じ対象由来である場合、対象に対して「自家性」である。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ３４-幹細胞」は、その表面にＣＤ３４を欠く幹細胞を意味するものとする。ＣＤ３４-幹細胞、及びその単離方法は、例えば、Ｌａｎｇｅ Ｃ．ら、「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ ｓａｆｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」 Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７年４月２５日［印刷版に先立つ電子版］に記載される。
【００１９】
本明細書で使用されるとき「細胞傷害性タンパク質」は、細胞内に、細胞上に、及び／又は細胞に近接して存在するとき、直接的及び／又は間接的に当該細胞の死滅を引き起こすタンパク質を意味するものとする。細胞傷害性タンパク質としては、例えば、自殺タンパク質（例えばＨＳＶ−ｔｋ）及びアポトーシス誘導因子が挙げられる。細胞傷害性遺伝子としては、ヌル遺伝子、遺伝子ノックダウン用のｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ（例えばＣＣＲ５−／−）が挙げられる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子を含め、多数の自殺遺伝子系が同定されている。シトシンデアミナーゼ；シトクロムＰ４５０；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；カルボキシペプチダーゼＧ２；ニトロレダクターゼ。Ｙａｚａｗａ Ｋ、Ｆｉｓｈｅｒ ＷＥ、Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ ＦＣ：「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ」 Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ．２００２年７月；２６（７）：７８３〜９頁に詳述されるとおり。細胞傷害性因子としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）ケモカイン及びムチンケモカインＧＰＩ融合などのホーミング因子（ケモカイン由来の作用物質を使用して、改変幹細胞の特異的な動員を促進することができる。例えば、ＧＰＩアンカーが付加されるムチン融合に関してＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１５０８号明細書を参照のこと；（ｉｉ）細胞傷害性タンパク質としてのウイルス抗原（麻疹、水痘）；及び（ｉｉｉ）改変幹細胞の表面に提示され、その後ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体、及びＣＤ５２エピトープに特異的なＣａｍＰａｔｈ（登録商標）（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）の投与が続き得るＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、核酸は、ある細胞又はある細胞の前駆体細胞のいずれかに人為的に導入された場合、当該の細胞に対して「外因性」である。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、幹細胞は、それが、又はその前駆細胞のいずれかが、そこに人為的に導入された核酸を有している場合、「遺伝子修飾」されている。遺伝子修飾された幹細胞を作成する方法としては、ウイルス性又は非ウイルス性遺伝子導入（例えば、プラスミド導入、ファージインテグラーゼ、トランスポゾン、ＡｄＶ、ＡＡＶ及びレンチウイルス）の使用が挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、幹細胞を対象の血流中に「導入する」とは、限定なしに、かかる細胞を対象の静脈又は動脈の一方に注入によって導入することを含むものとする。かかる投与はまた、例えば、一回、複数回、及び／又は１つ又は複数の一定期間にわたり実施することができる。単回注入が好ましいものの、場合によっては経時的な反復注入（例えば、毎日、３日毎、毎週、隔週、毎月、四半期毎、半年毎又は毎年）が必要となることもある。かかる投与はまた、好ましくは幹細胞と薬学的に許容可能な担体との混合物を用いて実施される。薬学的に許容可能な担体は当業者に公知であり、限定はされないが、０．０１〜０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．８％の生理食塩水が挙げられる。加えて、かかる薬学的に許容可能な担体は水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒体を含め、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液、及び懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル及び固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、流体及び栄養補液、リンゲルデキストロースなどの電解質補液、リンゲルデキストロースをベースとしたものなどが挙げられる。静脈内投与に一般的に使用される流体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ（３４）に掲載されている。防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどもまた存在し得る。
【００２３】
「間葉系幹細胞」（「ＭＳＣ」とも称される）は、循環系及びリンパ系の結合組織、骨、軟骨、及び細胞を生じ得る。間葉系幹細胞は、ゆるく充填された紡錘状又は星状の未分化細胞からなる胚性中胚葉の一部である間葉に見られる。本明細書で使用されるとき、間葉系幹細胞は、限定なしにＣＤ３４-幹細胞を含む。
【００２４】
本発明の一実施形態において、ＭＳＣは、Ｈｏｒｗｉｔｚら49において多能性間葉系間質細胞として定義される線維芽細胞様のプラスチック付着細胞であり、またＣＤ３４-細胞も含む。誤解を避けるため、用語「多能性間葉系間質細胞」はまた、間葉系幹細胞及びその前駆体のサブポピュレーションも含み、このサブポピュレーションは、インビボで特定の複数の細胞型に分化可能な多分化能を有する自己複製細胞から構成される。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「骨髄破壊」は、例えば、高用量の化学療法又は高線量の放射線療法の投与によって引き起こされる骨髄細胞の重度の又は完全な減少を意味するものとする。骨髄破壊は標準的手順であり、例えばＤｅｅｇ（３３）に記載されている。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「核酸」は、限定なしに、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのハイブリッドを含めた任意の核酸分子を意味するものとする。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵ、並びにその誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は当該技術分野において公知であり、「ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ １９９６−１９９７、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．、米国）に例示される。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、細胞傷害性タンパク質をコードする核酸領域は、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに対して、かかるプロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが適切な状況下で細胞傷害性タンパク質の発現を生じさせる場合に、「作動可能に連結」されている。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを意味する。「ペプチド」は、典型的にはより短鎖のポリペプチド（例えば、１０アミノ酸残基）を指し、及び「タンパク質」は、典型的にはより長鎖のポリペプチド（例えば、２００アミノ酸残基）を指す。アミノ酸残基は天然に存在するものであっても、又はその化学的類似体であってもよい。ポリペプチドはまた、グリコシル化、リピド結合、硫酸化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化などの修飾も含み得る。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、組織「に近接している」とは、例えば、組織の１ｍｍ以内、組織の０．５ｍｍ以内及び組織の０．２５ｍｍ以内を含む。
【００３０】
用語「ＲＡＮＴＥＳ」プロモーターは、本明細書では用語「ＣＣＬ５」プロモーターと同義として使用される。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、細胞傷害性タンパク質は、それをコードする遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍間質組織に近接したとき、細胞傷害性タンパク質が当該環境内において、対象体内の任意の他の環境における発現と比べてより多く発現する場合に、「選択的に発現」する。好ましくは、細胞傷害性タンパク質は当該環境において、対象体内の任意の他の環境における発現と比べて少なくとも１０倍多く発現する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット又はウサギなどの任意の動物を意味するものとする。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、疾病に罹患した対象を「治療する」とは、疾病の進行を遅延させ、抑止し、又は逆転させることを意味するものとする。好ましい実施形態において、疾病に罹患した対象を治療するとは、理想的には疾病それ自体が消失する点まで疾病の進行を逆転させることを意味する。本明細書で使用されるとき、疾病を寛解させることと疾病を治療することとは同義である。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」は、限定なしに、前立腺腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫／平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴ及び悪性リンパ腫を含むものとする。これらには、原発腫瘍並びに転移性腫瘍（血管新生しているもの及び血管新生していないものの双方）が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、細胞は、それが、又はその前駆細胞のいずれかが異なる種の別の対象由来である場合、対象に対して「異種」である。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍の間質組織」は、腫瘍の周囲及び近傍の結合性構造組織を含み、線維芽細胞／筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、血管細胞、平滑筋細胞、及び免疫細胞などの様々な細胞を含む。腫瘍間質はまた、細胞外マトリックス及び細胞外分子も提供する53。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「炎症性メディエーター」は、組織傷害及び腫瘍増殖の部位で作用し、且つ組織傷害及び腫瘍増殖に対する炎症誘発反応及び抗炎症反応を仲介する免疫調節分子を含む。炎症性メディエーターの非限定的な例は、サイトカイン、及びエイコサノイドである。腫瘍細胞及び周囲の間質細胞は、炎症誘発性サイトカイン及び炎症反応と協調するプロテアーゼなどの数多くの炎症誘発性メディエーターを産生することが知られている。かかるメディエーターの例は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６である。加えて、腫瘍細胞及び間質細胞はまた、ＴＧＦ−β、ＩＬ−ｌ０及びＭ−ＣＳＦなどの、例えば樹状細胞の成熟を阻害する抗炎症性分子を分泌することにより免疫応答を抑制することも可能である54。
【００３８】
本発明の実施形態
本発明は、腫瘍に罹患した対象の治療方法を提供し、これは、対象の血流中に治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞を導入するステップを含み、ここで各遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。
【００３９】
治療される対象は任意の動物であってよく、好ましくはヒトである。治療される腫瘍は原発性であっても、又は転移性であってもよく、及び血管新生していても、又は血管新生していなくともよい。好ましくは、腫瘍は転移性で、且つ血管新生していない。腫瘍は、例えば、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫／平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴ及び悪性リンパ腫であり得る。好ましくは、腫瘍は膵腫瘍である。別の好ましい実施形態において、治療される腫瘍の間質組織は線維芽細胞様細胞を含む。
【００４０】
間葉系幹細胞は、様々な供給源：例えば、骨髄、臍帯血、（動員された）末梢血及び脂肪組織から単離することができる49。さらに好ましい実施形態において、遺伝子修飾された間葉系幹細胞はＣＤ３４-幹細胞である。加えて、遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、対象に対して同種異系であっても、自家性であっても、又は異種性であってもよい。遺伝子修飾された幹細胞を用いる本方法では、幹細胞が（ｉ）標的組織内の適切な細胞に近接し、（ｉｉ）分化し、及び／又は（ｉｉｉ）標的組織内の適切な細胞と融合すると、外因性遺伝子が発現し、すなわち「オン」に切り換えられる。
【００４１】
本発明では、遺伝子修飾された間葉系幹細胞の導入は、好ましくはその前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、腫瘍に罹患した対象の治療方法のいずれかにおいて使用される間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞を提供する。特に間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞は、炎症性メディエーターによって誘導可能な、且つ細胞傷害性タンパク質コード領域の転写を制御するプロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むことができる。これらの炎症性メディエーターは腫瘍の間質組織により放出されることができ、従って幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、間葉系幹細胞において細胞傷害性タンパク質の発現が誘導される。炎症性メディエーターは、例えばＴＮＦα又はＩＦＮγなどのサイトカインであってもよい。特にプロモーターは、とりわけＴＮＦα又はＩＦＮγによって誘導され得るＲＡＮＴＥＳプロモーターであってもよい35。ＲＡＮＴＥＳプロモーターはまた、ＭＳＣの分化との関連における分化シグナルによって誘導されることもできる。炎症誘発性メディエーターによって誘導可能なプロモーターのさらなる例はＮＦ−ｋＢ応答エレメント36、及び一般にＩＬ１β又はＴＮＦαによって誘導され得るプロモーター37である。
【００４３】
加えて、抗炎症性メディエーター（例えばＴＧＦ−β）により活性化されるプロモーターを使用して、間葉系幹細胞における細胞傷害性タンパク質の標的発現を実現することができる。例は、Ｓｍａｄ結合エレメントを含むプロモーターである55。
【００４４】
炎症メディエーターによって誘導可能なプロモーターの使用により、まだ血管形成を行っていない腫瘍を選択的に治療することが可能となる。
【００４５】
本発明の治療法のいずれかにおいて使用される幹細胞は、さらに、（ｉｉｉ）（ｉｖ）に作動可能に連結された選択マーカー遺伝子、（ｉｖ）構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むことができる。選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン又はウアバインに対する耐性を付与する遺伝子を含むことができる38。抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質の存在下で遺伝子修飾された間葉系幹細胞を選択するために、及び発癌を促進する可能性があることから腫瘍治療において使用すべきでない未修飾の間葉系幹細胞を抑制するために使用することができる。抗生物質耐性遺伝子に加えて又は代えて、表面マーカータンパク質をコードする遺伝子を使用することができ、これは遺伝子修飾された間葉系幹細胞の表面上でのみ発現する。表面マーカータンパク質の非限定的な例は、ＣＤ３４及びＣＤ２４のスプライス変異体である39〜40。表面マーカータンパク質を認識する特異抗体を有する磁気ビーズを使用して、遺伝子修飾された間葉系幹細胞を選択してもよい41。
【００４６】
選択マーカー遺伝子の転写を制御する構成的プロモーターは、ｐＣＡＧ42、ＥＦ１α43、ＰＧＫ42、ＣＭＶ及びＳＦＦＶ42などの様々な異なるプロモーターであり得る。
【００４７】
加えて、本発明の様々な実施形態に係る幹細胞は、（ｖ）細胞傷害性タンパク質コード領域と選択マーカー遺伝子との間に位置するインシュレーター配列、を含み得る。インシュレーター配列は、いかなる炎症性メディエーターも存在しない場合に、選択マーカー遺伝子の構成的プロモーターが細胞傷害性タンパク質コード領域の転写に影響を及ぼして、それを「オン」に切り換えることが起こらないよう確実にし得る44。
【００４８】
好ましくは、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域は、及び構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子もまた、幹細胞ゲノムに組み込まれる。これにより、染色体外ベクターを有する遺伝子修飾された幹細胞と比べてより安定的な遺伝子修飾された間葉系幹細胞を産生することが可能となる。
【００４９】
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子修飾された幹細胞は、幹細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルス配列をさらに含み、ここでプロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、及び構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子は、プロウイルス配列の一部である。特にレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）由来のウイルスを使用して間葉系幹細胞を安定的に遺伝子修飾することができる。レトロウイルスの例は、レンチウイルス、α−レトロウイルス又はγ−レトロウイルスである。
【００５０】
以下に、２つの機能ユニットを有する導入遺伝子カセットを含むレトロウイルスベクターについて記載する（図６）。２つの機能ユニットは、
１．インビトロ選択：抗生物質耐性遺伝子（例えばピューロマイシン耐性遺伝子）などの選択マーカー遺伝子又は磁気ビーズ分離に好適な表面マーカー遺伝子（例えばＣＤ３４）に連結された細胞由来又はウイルス由来の構成的プロモーター（例えばＣＡＧプロモーター）
２．バイスタンダー死：細胞傷害性タンパク質コード領域（例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼをコードする）に連結された細胞由来又はウイルス由来の誘導性腫瘍特異的プロモーター（例えばＲＡＮＴＥＳプロモーター）
である。
【００５１】
場合により、２個のプロモーター間のプロモーター干渉を防ぐため、機能ユニットをインシュレーター配列によって分離してもよい。
【００５２】
上述の導入遺伝子カセットは、ＭＳＣに送達し、そこでの発現を安定させるため、レトロウイルスに由来するウイルスベクター系などの様々なウイルス及び非ウイルスベクター系に組み込まれ得る。
【００５３】
ＭＳＣを遺伝子修飾するためのレトロウイルスベクターは、α−、γ−レトロウイルス又は（ヒト及び非ヒト）レンチウイルスに由来し得る。レトロウイルスベクター系は、目的とする導入遺伝子、すなわち細胞傷害性タンパク質コード領域を有する導入ベクター骨格と、ベクターＤＮＡの逆転写及び組み込みに必要なあらゆる配列エレメントとを含むが、しかしｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子などのほとんど又は全てのウイルス遺伝子は欠いている。最も新しい次世代レトロウイルスベクターは、特別な安全性の修飾を含み得る：これらのいわゆる自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターでは、３’Ｕ３領域が部分的又は完全に取り除かれ、それによりウイルスのプロモーター活性が停止し、宿主細胞ゲノムにおける隣接遺伝子の転写活性化が防がれる50。
【００５４】
ベクター粒子の産生には、トランスで構造タンパク質、酵素及びエンベロープタンパク質を提供する様々な数のヘルパープラスミドが必要となる50。外来エンベロープ糖タンパク質を有するウイルス粒子を産生することができる。このプロセスはシュードタイピングと呼ばれる。これにより、ベクター粒子の向性を変化させることが可能となり、場合によってはベクター力価が亢進する。
【００５５】
上述の導入遺伝子カセットは、標準的な分子生物学的方法を用いてＳＩＮ−レトロウイルスベクター骨格に挿入され、標準方法に従いウイルス粒子を産生し得る50。
【００５６】
図７は、α−及びγ−レトロウイルス及びレンチウイルスベクターコンストラクトの例示的概要を示し、これらは図６に図示される上述の導入遺伝子を有し得る。
【００５７】
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ ＧＰ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ｇ）、ＲＤ１１４−ＴＲ又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ ｅｎｖ）の糖タンパク質によるベクター粒子のシュードタイピングが企図される。
【００５８】
間葉系幹細胞を遺伝子修飾するための別の代替的方法は、化学的（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）又は物理的（例えば電気穿孔）トランスフェクションによるものである。その後、トランスフェクト細胞を上記に記載したとおり選択することで、導入遺伝子カセットが偶然に間葉系幹細胞ゲノムに組み込まれた、安定的にトランスフェクトされたＭＳＣを選択することができる。
【００５９】
ＭＳＣを遺伝子修飾するためのさらに別の代替例は、トランスポゾンに由来する非ウイルスベクター系の使用によるものである。上述の発現カセットを末端逆方向反復配列に隣接して配置した後、コンストラクトをトランスフェクションによってＭＳＣに導入することができる。トランスフェクションの間にスリーピング・ビューティー51又はピギーバック52などのトランスポザーゼがトランスで発現する場合、発現カセットはＭＳＣのゲノムに安定的に組み込まれ得る。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態に係る遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、シュードタイプビリオンを天然間葉系幹細胞に形質導入することにより調製することができ、その表面上で外来糖タンパク質が発現し、それによって向性及び多くの場合にビリオンの力価が変化する。
【００６１】
シュードタイプビリオンは、
− （ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
− 間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞を用いて生成することができる。
【００６２】
さらに、レトロウイルスパッケージング細胞はまた、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子などの、パッケージング細胞からシュードタイプビリオンを産生するための構造タンパク質及び酵素をコードする遺伝子も含み、それによりシュードタイプビリオンの構築が可能となる。
【００６３】
好ましくは、構造タンパク質及び酵素をコードするこれらの遺伝子は、感染性であるが複製能を有しないビリオンを産生するため、間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質のコード遺伝子とは異なるベクターに位置する。これらのシュードタイプビリオンは、（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを有し、ウイルス表面タンパク質を発現する。通常、間葉系幹細胞の形質導入には、シュードタイプビリオンを含むレトロウイルスパッケージング細胞の上清が用いられ得る。
【００６４】
間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子（シュードタイピング）は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ ＧＰ）45、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ｇ）45、ＲＤ１１４−ＴＲ46又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ ｅｎｖ）47などの広範な宿主向性を付与する多種多様な糖タンパク質であり得る。
【００６５】
既に上述したとおり、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせは、サイトカイン又は他の炎症性メディエーターにより誘導可能であり得る。好ましい実施形態において、プロモーターはＲＡＮＴＥＳプロモーターである。レトロウイルスパッケージング細胞はまた、さらなる遺伝子及びプロモーターも誘導することができる。
【００６６】
本発明の別の特定の実施形態において、細胞傷害性タンパク質は理想的には単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、対象は理想的には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法でガンシクロビルにより治療される。ガンシクロビル及びその使用方法は、当該技術分野において公知である。別の可能性は、細胞傷害性タンパク質としてシトシンデアミナーゼを使用することであり、これは５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロウラシルに変換する48。
【００６７】
本発明において、治療上有効な数の遺伝子修飾された間葉系幹細胞としては、限定なしに以下の量及び量の範囲が挙げられる：（ｉ）約１×１０5〜約１×１０9細胞／ｋｇ体重；（ｉｉ）約１×１０6〜約１×１０8細胞／ｋｇ体重；（ｉｉｉ）約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｉｖ）約５×１０6〜約１×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｖ）約１×１０7〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｖｉ）約７×１０6〜約９×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｖｉｉ）約１×１０5細胞／ｋｇ体重；（ｖｉｉｉ）約１×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｉｘ）約５×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｘ）約１×１０7細胞／ｋｇ体重；（ｘｉ）約６×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｘｉｉ）約７×１０6細胞／ｋｇ体重；（ｘｉｉｉ）約８×１０6細胞／ｋｇ体重；及び（ｉｘ）約９×１０6細胞／ｋｇ体重。想定されるヒトの体重としては、限定なしに、約５０ｋｇ、約６０ｋｇ；約７０ｋｇ；約８０ｋｇ、約９０ｋｇ；及び約１００ｋｇが挙げられる。これらの数値は、ＭＳＣの移植からの前臨床動物実験及び標準プロトコルに基づく。
【００６８】
本発明はまた、膵腫瘍に罹患したヒト対象の治療方法も提供し、これは、約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞を対象の血流中に導入するステップを含み、ここで（ａ）各遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含み、（ｂ）対象は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法でガンシクロビルにより治療され、及び（ｃ）遺伝子修飾された間葉系幹細胞の導入は、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない。この方法において、腫瘍は好ましくは転移性であり、血管新生していても、又はしていなくともよい。加えて、遺伝子修飾された間葉系幹細胞は、対象に対して同種異系であっても、自家性であっても、又は異種性であってもよい。
【００６９】
本発明は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞をさらに提供し、それにより遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する。好ましくは、間葉系幹細胞はヒトＣＤ３４-幹細胞である。また、ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸も好ましく、ここで細胞傷害性タンパク質は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼである。
【００７０】
最後に、本発明は、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾されたヒトＣＤ３４-幹細胞を提供する。
【００７１】
本発明で用いられる様々なタンパク質及び調節配列は、当業者によって容易に入手され得る。例えば、ＲＡＮＴＥＳプロモーターは（２２）に開示され、通常の技能を用いて入手することができる。チミジンキナーゼ（ＡＴＰ：チミジン５’ホスホトランスフェラーゼ、ｅ．ｃ． ２．７．１．２１）（１型ＣＬ１０１株）についてはＨＳＶ ＴＫ−Ｖ００４６７ヘルペス遺伝子を使用することができる。
【００７２】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってさらに理解されようが、当業者は、詳述される特定の実験が、その後に続く特許請求の範囲にさらに十全に記載されるとおりの本発明の例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。
【実施例】
【００７３】
実験の詳細
概要
目的：膵腫瘍間質を対象とした改変間葉系幹細胞に基づく治療法の効力を分析すること。
【００７４】
要約基礎データ：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は腫瘍間質に能動的に動員され、そこで腫瘍の増殖及び転移を亢進させる。腫瘍間質内のＭＳＣによる走化性サイトカインＣＣＬ５の上方制御が、この過程で中心的役割を果たすことが示されている。マウスＭＳＣを改変してＣＣＬ５プロモーターの制御下にレポーター遺伝子又は治療遺伝子を発現させ、増殖中の膵腫瘍を有するマウスに養子導入した。次に腫瘍の増殖及び転移に対する効果を評価した。
【００７５】
方法：Ｃ５７／Ｂｌ６ ｐ５３（−／−）マウスの骨髄から単離したＭＳＣに、ＲＡＮＴＥＳプロモーターにより駆動される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を安定的にトランスフェクトした。同所性同系膵Ｐａｎｃ０２腫瘍を有するマウスにＭＳＣを１週間に１回、３週間にわたり静脈内適用した。
【００７６】
結果：処置した膵腫瘍試料において、ＣＣＬ５プロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ及びＲＦＰシグナルを蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により検出した。幹細胞適用後５〜７日目にプロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）により腹腔内処置したＨＳＶ−ｔｋ治療群は、原発膵腫瘍の増殖が５０％低下し（ｐ＜０，０００３、スチューデントｔ検定）、肝転移が低下する（３０％対１００％）結果となる。
【００７７】
結論：ｅＧＦＰ−及びＲＦＰ−レポーター遺伝子を使用して、ＭＳＣの原発膵腫瘍間質への能動的なホーミング及びＲＡＮＴＥＳプロモーターの活性化を確認した。ガンシクロビルの存在下では、ＨＳＶ−ｔｋをトランスフェクトしたＭＳＣは原発膵腫瘍の増殖及び転移の発生の有意な低下をもたらした。
【００７８】
材料及び方法
間葉系幹細胞
記載されるとおりのｐ５３標的欠失ホモ接合体のＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から間葉系幹細胞を単離した15。細胞を細胞培養において付着性で且つ連続的に増殖させた。サブクローニング後、単細胞クローンを選択し、特性決定した15。細胞に、ＣＣＬ５プロモーターと連結した赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）又はＨＳＶチミジンキナーゼをトランスフェクトした。プロモーターの配列は、上流領域の−９７２及び全５’非翻訳領域を使用した18。加えて、全てのベクターが、ＣＭＶにより制御されるＢｓｒ２ブラストサイジン耐性遺伝子を含んだ。ブラストサイジンは、５μｇ／ｍｌの濃度でトランスフェクト細胞を選択するために使用した。マウスに注入する前に、細胞は培養フラスコから剥離し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【００７９】
変法ボイデンチャンバーアッセイ
変法ボイデンチャンバーアッセイを用いてインビトロでの特異的ＭＳＣ遊走を実施した15。幹細胞は、Ｐａｎｃ０２同系膵癌細胞の上清濃度の減少に対して遊走させた。
【００８０】
同所性膵癌モデル
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所からＣ５７ＢＬ６マウスを入手した。全ての動物実験は、バイエルン州の動物の権利に関する委員会から然るべき許可を得て行った。平均体重約２０ｇの２ヶ月齢〜３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをＰａｎｃ０２（Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系の）膵腫瘍の移植に使用した19。ケタミン（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）、キシラジン（体重１ｋｇ当たり５ｍｇ）及びアトロピンを使用してマウスを麻酔した。マウスの左側腹部における手術部位を無菌の方法で剃毛して準備した。左側腹部を１ｃｍ切開し、膵臓を露出させた。目盛り付き押しボタンデバイス（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）及び３０Ｇ針の１ｍｌシリンジ（双方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スペイン）を使用して、４０μｌのＰＢＳ溶液中の１５０，０００個のＰａｎｃ０２膵癌細胞を膵臓に注入した。膵癌細胞が腹膜内に播種されないことを確実にするよう注意を払った。そのため、膵臓から針を抜いた後、Ｑ−ｔｉｐを注入部位に１分間軽く押し当てた。腫瘍細胞の注入後、４−０ ｐｒｏｌｅｎｅ（Ｂｒａｕｎ ＡＧ、独国）の結節縫合により腹膜及び皮膚を閉じた。この手技の２週間後、全てのマウスで触知可能な腫瘍が成長し、マウスをそれぞれの実験群に無作為に割り付けた。Ａ群は幹細胞又はガンシクロビルの注入を受けず、Ｂ群は未修飾の幹細胞を投与され、Ｃ群はＣ５７ＢＬ／６ ｐ５３−／− ＣＣＬ５／ＨＳＶ−ｔｋ＋間葉系幹細胞及びＧＣＶ注入を受け、Ｄ群はＣ５７ＢＬ／６ ｐ５３−／− ＣＣＬ５／ＲＦＰ＋間葉系幹細胞を投与され、及びＥ群はＣ５７ＢＬ／６ ｐ５３−／− ＣＣＬ５／ｅＧＦＰ間葉系幹細胞を投与された。全ての幹細胞注入は０．５×１０6細胞／週の用量とし、尾静脈から投与した。Ｃ群のＧＣＶ（Ｃｙｍｅｖｅｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、独国）の注入は、幹細胞注入後５〜７日目に１．５ｍｇの用量で腹腔内に適用した。３サイクルの処置を経た後に全てのマウスを屠殺し、腫瘍を単離して計量した。統計的有意性の検定は、独立した試料に対する独立両側ｔ検定により達成した。
【００８１】
蛍光顕微鏡法
膵腫瘍の組織試料をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．米国）に包埋し、液体窒素でスナップ凍結した。５μｍ厚の低温切片を得た。ＤＡＰＩ核染色溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ「Ｈａｒｄ ｓｅｔ Ｄａｐｉ封入剤」、米国）を切片に加え、ＧＦＰ又はＲＦＰ蛍光シグナルについて直ちに評価した。ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲ顕微鏡カメラを使用して写真を撮り、ソフトウェアＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）（Ａｄｏｂｅ、米国）を使用して種々の蛍光チャネルの画像を重ね合わせた。
【００８２】
ＭＳＣ注入及びガンシクロビル処置
注入前、細胞を計数し、１×１０6細胞／ｍｌＰＢＳの最終濃度に希釈した。ガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｃｙｍｅｖｅｎ；Ｒｏｃｈｅ）をＨ2Ｏ（注射用水（ａｑｕａ ａｄ ｉｎｉｅｃｔａｂｉｌｉａ））中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。細胞懸濁液を２６Ｇ針で尾静脈から投与し、薬物を腹腔内注入により投与した。処置は、１日目に０．５ｍｌ細胞（５００，０００個の細胞）を注入して開始した。５〜７日目、ガンシクロビルを６０μｇ／ｇ体重の１日用量で、例えば体重２５ｇのマウスについて１５０μｌを適用した。７日目より後は、解剖まで処置サイクルを反復した。処置中は腫瘍の進行及び挙動を記録した。
【００８３】
組織及び腫瘍の調製
解剖後、全ての腫瘍を個別に調製した。各腫瘍の３分の１をホルムアルデヒド固定してパラフィンワックスに包埋し、一方、別の３分の１をフラッシュ凍結した。残りの３分の１は、後にＲＮＡ単離及び目的とするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行うため、製造者の指示に従いＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存した。
【００８４】
免疫組織化学
５μｍ切片に対し、先述のとおり免疫組織化学を実施した20。一次抗体としては、ポリクローナルウサギ抗ＲＦＰ抗体（株式会社医学生物学研究所、日本）をブロッキング溶液（乳＋ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）中に１：５０希釈した。二次抗体としては、ポリクローナルビオチン化ヤギ抗ウサギ（Ｌｉｎａｒｉｓ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｂｅｔｔｉｎｇｅｎ、独国）抗体を乳中に１：３００希釈した。
【００８５】
結果
ＭＳＣの膵腫瘍への動員
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのバックグラウンドにおいて同系同所性マウス膵腫瘍を予め確立した31、32。膵被膜下に移植した腫瘍細胞は成長し、深在性腫瘍血管系（図１）を示した。Ｐ５３（−／−）の骨髄から単離したＣＤ３４- ＭＳＣを使用して、改変ＭＳＣの腫瘍間質を標的化する効力を評価した15、16、2l。
【００８６】
初めにＭＳＣのＰａｎｃ０２腫瘍に対する一般的な向性を評価するため、変法ボイデンチャンバーアッセイを用いてＣ５７Ｂｌ６ ＭＳＣの腫瘍由来因子に対する誘導遊走を試験した。結果は、馴化腫瘍増殖培地の濃度増加に応じたＭＳＣの用量依存的な遊走を示す（図２）。
【００８７】
次にＣＭＶプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドにより細胞を改変した。１週間に１回、増殖中の膵腫瘍を有するマウスに５００，０００個の細胞を静脈内注入した。５週間後、マウスを屠殺し、腫瘍を摘出してＧＦＰの発現について分析した。結果は、腫瘍に関連した強力なＧＦＰ発現を示す（図３Ａ）。細胞はまた、二次的な脾臓、リンパ節、胸腺、皮膚及び腸にも遊走が認められた（データは図示せず、及び（１５））。これは、全身注入された幹細胞の増殖腫瘍へのホーミングを実証する。増殖中の膵腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ６マウスへのＭＳＣの静脈内注入もまた、腫瘍増殖の有意な増加をもたらした（図３Ｂ）。
【００８８】
静脈内適用されたＭＳＣの肝臓、脾臓、及び腹膜への転移の影響についても評価した。ＭＳＣの適用により、腹膜への転移が有意に増加することが認められた（表１）。
【００８９】
ＣＣＬ５プロモーターは腫瘍間質におけるレポーター遺伝子発現を駆動する
本発明者らは、次に、ＣＣＬ５プロモーターを使用した腫瘍間質へのＭＳＣ動員との関連において、レポーター遺伝子のさらに制御された発現を駆動する可能性について調査した。これを目的として、Ｐ５３（−／−）ＭＳＣ Ｃ５７／Ｂｌ６細胞系をＣＣＬ５プロモーターの制御下でＲＦＰ及びｅＧＦＰレポーター遺伝子により改変した18、22。ＣＣＬ５プロモーターは、概して組織ストレス又は傷害との関連における種々の組織型で活性である23〜27。翻訳開始点に対する直近の−９７２上流のヌクレオチド及び完全５’非翻訳領域を、ベクターにおけるｅＧＦＰ又はＲＦＰの上流にクローニングした。
【００９０】
得られたＣＣＬ５−ｅＧＦＰ又はＲＦＰにより安定的に改変されたＭＳＣは、ＦＡＣＳにおいて弱いながらも検出可能なレベルのレポーター発現を示した（データは図示せず）。次に、増殖中の膵腫瘍を有するマウスの末梢循環中に細胞（５００，０００個）を８日毎に２１日間にわたり注入した。
【００９１】
３週間後、マウスを屠殺し、ＲＦＰ及びｅＧＦＰレポーター遺伝子発現について腫瘍及び周囲組織を蛍光顕微鏡法（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）及び免疫組織化学により分析した。結果は、増殖中の腫瘍におけるＲＦＰ及びＧＦＰ蛍光の発現を示した（図４Ａ及び図４Ｂ）。より優れた形態学により組織試料中のＲＦＰの発現を調べるため、ＲＦＰタンパク質発現についてホルムアルデヒド固定試料を免疫組織化学により試験した。腫瘍間質全体にわたりＲＦＰ発現ＭＳＣが検出された（図４Ｃ、図４Ｄ及び図４Ｅ）。
【００９２】
改変ＭＳＣにおける治療モダリティとしてのＨＳＶ−ｔｋの使用
次の実験フェーズにおいて、ＣＣＬ５プロモーターを使用した治療遺伝子の送達を調べた。これを目的として、単純ヘルペスチミジンキナーゼの遺伝子（ＨＳＶ−Ｔｋ）28をＣＣＬ５プロモーターの後ろにクローニングした（図５Ａ）。
【００９３】
０．５×１０6個のＣＣＬ５−ｔｋ改変ＭＳＣを注入した後、細胞に３日間の間、増殖中の腫瘍間質への動員を行わせ、分化及びそれに続くｔｋ遺伝子の発現を行わせた。次にマウスが、３日間にわたる１．５ｍｇＧＶＣの１日１回の腹腔内注入からなる処置コースを受けた。マウスに再び改変幹細胞を注入し、実験期間中このサイクルを繰り返した（図５Ｂ）。３６日後、動物を屠殺して腫瘍増殖を評価した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。結果は、ＧＣＶと共に治療的ＣＣＬ５／ＨＳＶ−Ｔｋ幹細胞コンストラクトを投与されたマウス群において、処置を受けていない、又は対照ＭＳＣ（ＣＣＬ５−ＲＦＰ ＭＳＣ及びＣＣＬ５−ｅＧＦＰ ＭＳＣ）を投与された腫瘍を有する対照動物と比較して、腫瘍容積が有意に減少したことを示した。図５Ｃは、実験の完了後に切除した代表的な腫瘍を示す。腫瘍の重量は、処置を受けていない動物又は処置を受けた対照動物と比較したときの腫瘍重量の統計的に有意な減少を示す。
【００９４】
追加のパラメータとして、処置との関連における転移について肝臓、脾臓、及び腹膜を分析した。ＭＳＣの投与により腹膜における転移数が増加した一方、ＧＣＶによる処置の結果、脾臓及び肝臓における転移の有意な減少が生じた（両側のフィッシャー直接確率検定）（表２）。転移は、脾臓、肝臓、及び腹膜の原位置での観察及びそれぞれの臓器の触診により評価した。
【００９５】
考察
間葉系幹細胞は腫瘍間質に能動的に動員され、そこで腫瘍増殖の種々の側面に寄与する。ＭＳＣは腫瘍血管の前駆細胞として機能し得るとともに、間質線維芽細胞様細胞の生成にも寄与するものと思われる。腫瘍関連間質細胞の腫瘍増殖に対する及び転移可能性に対する固有の影響は、最近の研究の課題である。乳癌モデルの前臨床試験では、腫瘍間質内の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が高レベルのサイトカインＣＣＬ５を産生することが示された。ＣＣＬ５の分泌は、肺転移の発生率上昇をもたらす。
【００９６】
ＣＣＬ５分泌はまた、膵腺房周囲筋線維芽細胞において異なる形で調節され、これらの細胞についての膵臓における炎症細胞の浸潤及び蓄積の媒介における役割が示唆される29。膵癌患者の間では、膵炎がＣＣＬ５プロモーターにおける多型と有意に関連付けられている30。本明細書の研究では、原発腫瘍の増殖並びに転移に対する腫瘍間質との関連において、自殺遺伝子を選択的に送達するための治療媒体としての改変ＭＳＣの使用を評価する。
【００９７】
組織特異的に発現させるため、ＣＣＬ５プロモーターの制御下に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）を発現するようＭＳＣを改変した。さらに組織特異的に遺伝子発現させるため、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）を使用し、且つＣＣＬ５プロモーターの制御下にＭＳＣをトランスフェクトした。ｔｋはガンシクロビル（ＧＣＶ）をリン酸化し、それにより生成される毒素がトランスフェクト細胞を死滅させ、及びバイスタンダー効果により近傍の腫瘍細胞を死滅させる。ガンシクロビルを伴うＨＳＶ−ＴＫ遺伝子治療は、自殺遺伝子治療に広く用いられる戦略の基礎をなす17。
【００９８】
固形腫瘍は循環する前駆体に対して強力なホーミング駆動力を発揮するため、この手法を用いることで腫瘍環境が効率的に標的化される。自殺遺伝子のＣＣＬ５プロモーターにより駆動される組織特異的遺伝子発現に加え、媒体幹細胞のこの標的化は、高い効力及び低い副作用プロファイルの双方をもたらす。さらに、骨髄由来ＭＳＣは癌患者自身から得ることが可能である。これにより、骨髄破壊及び骨髄移植を必要とすることなく、簡易な静脈内投与によって自殺遺伝子を特異的に送達することが可能となり得る。
【００９９】
前臨床研究に基づく膵癌治療戦略は、患者生存期間を有意に延長させることには奏功していない。診断時、膵癌に罹患している患者のうち、手術可能な限局性の疾患を呈する者はわずか２０％に過ぎない。患者の４０％は局所進行性の（従って切除不能な）疾患を呈し、別の４０％は既に遠隔転移をきたしている。膵腫瘍モデルから、膵癌においてＭＳＣが重要な役割を果たすことが実証された。遊走アッセイ並びにＣＣＬ５／ＲＦＰ ＭＳＣの全身注入により示されるとおり、細胞は腫瘍を能動的に探す。全身注入された幹細胞は、腫瘍内にのみ認められた。続く腫瘍サイズの低下及び腹膜癌腫症の軽減は、個別の患者に適合させた幹細胞／自殺遺伝子の組み合わせによる治療の臨床応用に有望である。
【０１００】
他の組織ニッチに動員される改変幹細胞は同じ分化プログラムを受けず、従って治療遺伝子を発現しない。この手法により、決められた微小環境内での治療遺伝子の選択的発現を高度に制御することが可能となる。
【０１０１】
幹細胞治療を選択的遺伝子治療と連係させることにより、病変細胞又は欠損細胞の再生又は置換に対する、並びに腫瘍破壊に対する治療オプションが増強される。ここでは、遺伝子修飾された幹細胞が組織特異的遺伝子治療を腫瘍に届けるための媒体として機能し得るとともに、ＣＣＬ５プロモーターにより改変されたＭＳＣがｔｋ発現を駆動し得ることが示される。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
転移の発生に対するＭＳＣ治療の効果。媒体対照と未改変ＭＳＣで処置した動物との比較（ＭＳＣは週１回５００，０００細胞で３週間にわたり投与した）。試験は腫瘍増殖の３６日後に観察及び触診により行った。数値は転移を有した動物を表す。両側のフィッシャー直接確率検定により有意性を検定した。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
表２．腫瘍転移の分布。媒体対照動物並びにＧＦＰ及びＲＦＰレポーター遺伝子をトランスフェクトした対照ＭＳＣを、自殺遺伝子治療で処置した動物と比較した。試験は腫瘍増殖の３６日後に観察及び触診により行った。数値は転移を有した動物を表す。両側のフィッシャー直接確率検定により有意性を検定した。全てのＭＳＣが、週１回５００，０００細胞で３週間にわたり投与された。
【０１０６】
ヒトＭＳＣの安定形質導入についてのインビトロ実験及びＨＳＶ ｔｋ発現の誘導についてのインビトロアッセイ
遺伝子修飾されたヒトＭＳＣの生成
ヒトＭＳＣを、ＲＡＮＴＥＳプロモーターの制御下にあるＨＳＶ ｔｋ遺伝子及びＳＶ４０プロモーターの制御下にあるブラストサイジン耐性遺伝子を含むベクターｐＬｅｎｔｉ６ ＴＫ ＲＡＮＴＥＳを有する複製欠損レンチウイルスと共に一晩インキュベートした（感染多重度（ＭＯＩ）：１０）（図８を参照のこと）。
【０１０７】
一晩インキュベートした後、ウイルス含有培地を取り除き、新鮮培地に交換した。翌日、細胞にブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）を添加して遺伝子修飾されたＭＳＣを選択した。ブラストサイジンを含む培養培地は、最小限６日間にわたり３〜４日毎に交換した。
【０１０８】
ＲＡＮＴＥＳプロモーターのインビトロ誘導
サイトカインＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせがヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）においてＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導をもたらすことが実証された35。
【０１０９】
本発明者らの実験では、同じ組み合わせのサイトカインがＭＳＣにおいて内因性ＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導ももたらすことを実証しようとした。本発明者らは、インビトロでの外因性ＨＳＶ ｔｋの発現を誘導可能とするためにこのアッセイの使用を試みた。遺伝子修飾されたＭＳＣを最大４８時間にわたりＴＮＦα及びＩＦＮγと共に、又はサイトカインなしで培養し、０時間後、２４時間後及び４８時間後に全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ（６００ｎｇ）をｃＤＮＡに逆転写し、次にそれをｑＲＴ−ＰＣＲ反応で用いて、ＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ、プライマー：フォワード：ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＴ；リバース：ＧＧＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡ；ユニバーサルプローブ１６）で内因性ＲＡＮＴＥＳの発現を定量化した。異なる試料から同量のＲＮＡを使用したことを確かめるため、ハウスキーピング遺伝子（アクチン）を参照遺伝子として使用し（ユニバーサルプローブライブラリ ヒトＡＣＴＢ遺伝子アッセイ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ｈｕｍａｎ ＡＣＴＢ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ）、Ｒｏｃｈｅ）、ΔΔＣＴ法を用いて相対量を計算した。
【０１１０】
図９に示すとおり、本発明者らは、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）によるＭＳＣの誘導後２４時間及び４８時間において、内因性ＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡの顕著な増加を検出することができた。これらの結果は、ＲＡＮＴＥＳの発現が、ＨＵＶＥＣにおいてのみならず、ヒトＭＳＣにおいてもＴＮＦα及びＩＦＮγにより誘導されることを実証する。
【０１１１】
ガンシクロビル処置後の誘導された遺伝子修飾ＭＳＣの特異的細胞死
本発明者らは、内因性ＲＡＮＴＥＳプロモーターの誘導能を実証することができた後、続いて外因性ＲＡＮＴＥＳプロモーターの制御下にあるＨＳＶ ｔｋの発現を誘導することが可能かどうか、及び結果として、誘導された細胞をガンシクロビルで処置した後に細胞死を促進することが可能かどうかを調査した。上記のとおり生成した遺伝子修飾細胞（６ウェル当たり５００００個の細胞）を、３日毎に新鮮なサイトカインを添加しながら９日間にわたりＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置した。続いて細胞を１００μＭガンシクロビルと共に３日間インキュベートした。
【０１１２】
結果から、ＴＮＦα及びＩＦＮγにより誘導し、続いてガンシクロビルで処置した遺伝子修飾ＭＳＣが生存しなかったことが明らかに実証された（図１０Ｄ）。ＴＮＦα及びＩＦＮγによる誘導のみ（図１０Ｂ）又はガンシクロビルによる処置のみ（図１０Ｃ）の細胞とは対照的であった。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍に罹患した対象を治療するための遺伝子修飾された間葉系幹細胞であって、各遺伝子修飾された間葉系幹細胞が、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより治療上有効な数の前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が前記対象の血流中に導入されたときに該幹細胞が前記腫瘍の間質組織に近接すると、前記細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する、間葉系幹細胞。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項３】
前記腫瘍が転移性である、請求項１又は２に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項４】
前記腫瘍が血管新生している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項５】
前記腫瘍が血管新生していない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項６】
ＣＤ３４-幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項７】
前記対象に対して同種異系である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項８】
前記対象に対して自家性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項９】
前記腫瘍の間質組織が線維芽細胞様細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の前記導入が、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１１】
前記腫瘍が、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫／平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴ及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１２】
前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１３】
前記プロモーターがＲＡＮＴＥＳプロモーターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１４】
前記細胞傷害性タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、及び前記対象が、前記単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法で前記ガンシクロビルにより治療される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が約１×１０5〜約１×１０9細胞／ｋｇ体重である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が約１×１０6〜約１×１０8細胞／ｋｇ体重である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１７】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重である、請求項１６に記載の修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１８】
膵腫瘍に罹患したヒト対象を、前記対象の血流中に約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞を導入することにより治療するための遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞であって、（ａ）各遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞が、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含み、（ｂ）前記対象が、前記単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法で前記ガンシクロビルにより治療され、及び（ｃ）前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の前記導入が、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない、遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項１９】
前記腫瘍が転移性である、請求項１８に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２０】
前記腫瘍が血管新生している、請求項１８又は１９に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２１】
前記腫瘍が血管新生していない、請求項１９に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２２】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２３】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が前記対象に対して自家性である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２４】
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞であって、それにより前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、前記細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する、幹細胞。
【請求項２５】
ヒト幹細胞である、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項２６】
ＣＤ３４-幹細胞である、請求項２４又は２５に記載の幹細胞。
【請求項２７】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、炎症性メディエーターにより誘導可能である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項２８】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、サイトカインにより誘導可能である、請求項２７に記載の幹細胞。
【請求項２９】
前記プロモーターがＲＡＮＴＥＳプロモーターである、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３０】
（ｉｉｉ）（ｉｖ）に作動可能に連結された選択マーカー遺伝子、（ｉｖ）構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３１】
前記選択マーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子又は表面マーカータンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項３０に記載の幹細胞。
【請求項３２】
（ｖ）前記細胞傷害性タンパク質コード領域と前記表面マーカー遺伝子との間に位置するインシュレーター配列をさらに含む、請求項３０又は３１に記載の幹細胞。
【請求項３３】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記細胞傷害性タンパク質コード領域が、前記幹細胞ゲノムに組み込まれる、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３４】
前記構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記選択マーカー遺伝子が、前記幹細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３５】
前記幹細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルス配列をさらに含む、請求項３３又は３４に記載の幹細胞であって、前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記細胞傷害性タンパク質コード領域、及び前記構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記選択マーカー遺伝子が、前記プロウイルス配列の一部である、幹細胞。
【請求項３６】
前記プロウイルス配列が、レンチウイルス配列、α−レトロウイルス配列又はγ−レトロウイルス配列である、請求項３５に記載の幹細胞。
【請求項３７】
前記細胞傷害性タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又はシトシンデアミナーゼである、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３８】
− （ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
− 間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項３９】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、サイトカインにより誘導可能である、請求項３８に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項４０】
前記プロモーターがＲＡＮＴＥＳプロモーターである、請求項３８又は３９に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項４１】
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾されたヒトＣＤ３４-幹細胞。
【請求項１】
腫瘍に罹患した対象を治療するための遺伝子修飾された間葉系幹細胞であって、各遺伝子修飾された間葉系幹細胞が、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含み、それにより治療上有効な数の前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が前記対象の血流中に導入されたときに該幹細胞が前記腫瘍の間質組織に近接すると、前記細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する、間葉系幹細胞。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項３】
前記腫瘍が転移性である、請求項１又は２に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項４】
前記腫瘍が血管新生している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項５】
前記腫瘍が血管新生していない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項６】
ＣＤ３４-幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項７】
前記対象に対して同種異系である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項８】
前記対象に対して自家性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項９】
前記腫瘍の間質組織が線維芽細胞様細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の前記導入が、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１１】
前記腫瘍が、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、膵腫瘍、扁平上皮癌、乳房腫瘍、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌、精巣癌、神経芽細胞腫、神経膠腫又は多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）などの悪性星細胞系腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜癌、肺癌、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫／平滑筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴ及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１２】
前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１３】
前記プロモーターがＲＡＮＴＥＳプロモーターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１４】
前記細胞傷害性タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、及び前記対象が、前記単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法で前記ガンシクロビルにより治療される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が約１×１０5〜約１×１０9細胞／ｋｇ体重である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が約１×１０6〜約１×１０8細胞／ｋｇ体重である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１７】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の治療上有効な数が約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重である、請求項１６に記載の修飾された間葉系幹細胞。
【請求項１８】
膵腫瘍に罹患したヒト対象を、前記対象の血流中に約５×１０6〜約２×１０7細胞／ｋｇ体重の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞を導入することにより治療するための遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞であって、（ａ）各遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞が、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含み、（ｂ）前記対象が、前記単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによってガンシクロビルが細胞傷害性になることが可能な方法で前記ガンシクロビルにより治療され、及び（ｃ）前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞の前記導入が、その前、それと同時又はその後に骨髄破壊を伴わない、遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項１９】
前記腫瘍が転移性である、請求項１８に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２０】
前記腫瘍が血管新生している、請求項１８又は１９に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２１】
前記腫瘍が血管新生していない、請求項１９に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２２】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２３】
前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が前記対象に対して自家性である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたＣＤ３４-幹細胞。
【請求項２４】
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾された間葉系幹細胞であって、それにより前記遺伝子修飾された間葉系幹細胞が腫瘍の間質組織に近接すると、前記細胞傷害性タンパク質が選択的に発現する、幹細胞。
【請求項２５】
ヒト幹細胞である、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項２６】
ＣＤ３４-幹細胞である、請求項２４又は２５に記載の幹細胞。
【請求項２７】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、炎症性メディエーターにより誘導可能である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項２８】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、サイトカインにより誘導可能である、請求項２７に記載の幹細胞。
【請求項２９】
前記プロモーターがＲＡＮＴＥＳプロモーターである、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３０】
（ｉｉｉ）（ｉｖ）に作動可能に連結された選択マーカー遺伝子、（ｉｖ）構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３１】
前記選択マーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子又は表面マーカータンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項３０に記載の幹細胞。
【請求項３２】
（ｖ）前記細胞傷害性タンパク質コード領域と前記表面マーカー遺伝子との間に位置するインシュレーター配列をさらに含む、請求項３０又は３１に記載の幹細胞。
【請求項３３】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記細胞傷害性タンパク質コード領域が、前記幹細胞ゲノムに組み込まれる、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３４】
前記構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記選択マーカー遺伝子が、前記幹細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３５】
前記幹細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルス配列をさらに含む、請求項３３又は３４に記載の幹細胞であって、前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記細胞傷害性タンパク質コード領域、及び前記構成的プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された前記選択マーカー遺伝子が、前記プロウイルス配列の一部である、幹細胞。
【請求項３６】
前記プロウイルス配列が、レンチウイルス配列、α−レトロウイルス配列又はγ−レトロウイルス配列である、請求項３５に記載の幹細胞。
【請求項３７】
前記細胞傷害性タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又はシトシンデアミナーゼである、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項３８】
− （ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された細胞傷害性タンパク質コード領域、（ｉｉ）炎症性メディエーターにより誘導可能な、プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含むレトロウイルスベクターと、
− 間葉系幹細胞又はＣＤ３４-幹細胞に対する向性を提供するウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子と、
を含むレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項３９】
前記プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、サイトカインにより誘導可能である、請求項３８に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項４０】
前記プロモーターがＲＡＮＴＥＳプロモーターである、請求項３８又は３９に記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
【請求項４１】
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード領域、（ｉｉ）ＲＡＮＴＥＳプロモーターを含む外因性核酸を含む遺伝子修飾されたヒトＣＤ３４-幹細胞。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５２３２４３（Ｐ２０１２−５２３２４３Ａ）
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５１４９（Ｐ２０１２−５０５１４９）
【出願日】平成２２年４月１３日（２０１０．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４８４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１９０３９
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１１２４６１３１）アプセト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＣＥＴＨ ＧＭＢＨ ＆ ＣＯ． ＫＧ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｘ−Ｌｅｂｓｃｈｅ−Ｐｌａｔｚ ３０， ８１３７７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， ＧＥＲＭＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１３日（２０１０．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４８４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１９０３９
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１１２４６１３１）アプセト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＣＥＴＨ ＧＭＢＨ ＆ ＣＯ． ＫＧ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｘ−Ｌｅｂｓｃｈｅ−Ｐｌａｔｚ ３０， ８１３７７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， ＧＥＲＭＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]