改良型メバロネートキナーゼ
本発明は、フィードバック阻害に対し低感受性である修飾メバロネートキナーゼ、およびそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、これらポリヌクレオチドを含んでなるベクターおよびかかるベクターを包含する宿主細胞に関連する。本発明は修飾酵素産生および修飾酵素を使用するイソプレノイド化合物産生のためのプロセスを提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、フィードバック阻害に対し低感受性である修飾メバロネートキナーゼを提供する。修飾酵素および修飾酵素をコードするポリヌクレオチドが、イソプレノイド化合物の生産のため、メバロネートキナーゼ活性の低下を特徴とする疾患の治療のため、および診断目的のため使用され得る。
【０００２】
メバロネートキナーゼ（Ｍｖｋ）は、多数の細胞内イソプレノイドの産生を導くメバロン酸経路に必須の酵素である。メバロン酸経路の産物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、および異性体化合物であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が、全ての生物体におけるイソプレノイドの基本的構成要素である。イソプレノイドは２３，０００を超える一次代謝および二次代謝双方の自然発生分子を含む。この天然産物種の化学的多様性は全ての生物系におけるそれらの広範囲にわたる生理学的役割を反映する。イソプレノイドは、例えば、細菌中のホパントリテルペン、ユビキノンおよびメナキノン、植物中のカロテノイド、プラストキノン、モノ−、セスキ−、ジ−およびトリテルペン、およびクロロフィルのプレニル側鎖、および哺乳動物中のヘムＡ、キノン、ドリコール、ステロール／ステロイドおよびレチノイドを含む。加えて、イソプレノイドはイソペンテニルｔＲＮＡ、タンパク質プレニル化および、例えば細胞シグナル伝達タンパク質のヘッジホッグ類の、コレステロール修飾に関与する。
【０００３】
調節に関しては、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼがメバロン酸経路における律速酵素であると広く考えられている（例えば、ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ），ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４３，４２５−４３０頁，１９９０年；ワインベルガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７，１−６頁，１９９６年；ハンプトン（Ｈａｍｐｔｏｎ）ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１，１４０−１４５頁，１９９６年；ホーテン（Ｈｏｕｔｅｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，５７３６−５７４３頁，２００３年）。この見解と一致して、メバロネート培地の補充がファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（カロ（Ｃａｌｏ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７，５７５−５７８頁，１９９５年）とヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１，３３５−３３９頁，１９９１年）との双方においてカロテノイド産生を刺激することが分かっている。しかしながら、近年増える証拠は、メバロネートキナーゼが、例えば下流産物であるゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸およびゲラニルゲラニル二リン酸によりフィードバック阻害を受けやすいことを示す。このフィードバック阻害もまた、メバロン酸経路の、ひいてはイソプレノイド生合成全般の調節および律速に寄与し得る。
【０００４】
ヒトにおいては、メバロネートキナーゼの重要性は、その欠乏をヒト遺伝性疾患メバロン酸尿症および高免疫グロブリンＤ症候群ならびに周期熱症候群の生化学的および分子的原因とする同定により実証された（ホーテン（Ｈｏｕｔｅｎ）ら，２０００年；ンウォコロ（Ｎｗｏｋｏｒｏ）ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７４，１０５−１１９頁，２００１年）。これら疾患の病態生理はいまだ解明されていないが、いずれは急性期反応および発熱に関するメバロネートキナーゼおよびイソプレノイド生合成の生体内での役割への洞察を与えるであろう。メバロネートキナーゼ欠乏はまた、例えばツェルウェガー症候群および肢根型点状軟骨異形成症といった、メバロネートキナーゼを含むペルオキシソーム酵素のサブセットがペルオキシソームへと輸送されないペルオキシソーム生合成の疾患に関与しているとも見られる（ケリー（Ｋｅｌｌｅｙ）およびハーマン（Ｈｅｒｍａｎ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２，２９９−３４１頁，２００１年）。最終的には、メバロネートキナーゼは細胞増殖、細胞周期調節および／または細胞形質転換における役割を果たすことが提唱された（グレーフ（Ｇｒａｅｆ）ら，ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２０８，６９６−７０３頁，１９９５年；ヒンソン（Ｈｉｎｓｏｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２６７５６−２６７６０頁，１９９７年を参照）。
【０００５】
これまで研究されている全てのメバロネートキナーゼは、経路の下流産物、例えばファルネシルピロリン酸またはゲラニルゲラニルピロリン酸によりフィードバック阻害される。
【０００６】
このように、フィードバック阻害に対し低感受性または耐性である、もしくは非修飾メバロネートキナーゼのそれと比べ低減されたフィードバック阻害感受性を備える、すなわち改良された触媒特性を有する、修飾メバロネートキナーゼを提供することが本発明の目的である。フィードバック耐性メバロネートキナーゼ酵素は、例えば、（１）全ての種類のイソプレノイド化合物（例えば、カロテノイド、コエンザイムＱ１０、ビタミンＤ、ステロール等）の生物工学的生産における、（２）例えば生体液中のメバロネート濃度の酵素測定用の、診断用酵素として、または（３）メバロン酸尿症患者中のメバロネート濃度を低下させる治療用酵素として、産業上の可能性を有し得る。フィードバック耐性メバロネートキナーゼは、メバロン酸経路を通るより大きなフラックスを、ひいてはより高いイソプレノイド生産性を可能にし得ることから、特にイソプレノイドの生物工学的生産に適している。
【０００７】
特に、本発明は、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す修飾メバロネートキナーゼに関し、ここで
（ｉ）修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個の突然変異を包含し、かつ
（ｉｉ）少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。
【０００８】
メバロネート（メバロン酸）の５−ホスホメバロネート（５−ホスホメバロン酸）への、またはメバロネート類似体（例えばワイルド（Ｗｉｌｄｅ）およびエゲレア（Ｅｇｇｅｒｅｒ），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１，４６３−４７３頁，１９９４年により記載されるとおり）の対応するリン酸化化合物へのリン酸化触媒能を有するとともにフィードバック阻害感受性を示す任意の酵素が、本発明の目的のためのメバロネートキナーゼとして使用され得る。
【０００９】
用語「野生型酵素」または「野生型メバロネートキナーゼ」はこのように、本発明による（より高い）フィードバック耐性変異体設計のための出発点として役立ち得るフィードバック阻害感受性を示す任意のメバロネートキナーゼを意味する。かかる野生型酵素は例えば天然または合成メバロネートキナーゼの変異型に由来し得るメバロネートキナーゼ／メバロネートキナーゼ配列であってもよく、本発明の任意の教示により（より高い）フィードバック耐性にされ得る。かかるメバロネートキナーゼのアミノ酸配列の例は、例えばスイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）などの、公開の利用可能なデータベースにおいて探し当てられ得るものを含む。好ましくあるのは、例えば配列番号１および６、または配列番号８を含む、図１または表３に示されるアミノ酸配列の任意の１つと相同または同一であるような野生型酵素である。相同であるとは、例えば配列番号１および６、または配列番号８を含む、図１に示されるとおりのアミノ酸配列の１つまたはそれ以上と少なくとも約６０％が同一である、好ましくは少なくとも約７０％が同一である、より好ましくは少なくとも約８０％が同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９０％が同一である、最も好ましくは少なくとも約９５％が同一であるメバロネートキナーゼを言う。用語「野生型メバロネートキナーゼ」および「非修飾メバロネートキナーゼ」は本明細書においては互いに可換に使用される。
【００１０】
必要であれば、好適なリン酸供与体がメバロネート（またはメバロネート類似体）のリン酸化を供するため添加され得る。メバロネートキナーゼのためのリン酸化供与体として、例えばＡＴＰ、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰといった、種々の化合物が考えられ得る（ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら，エンザイム（Ｅｎｚｙｍｅ）４１，４７−５５頁，１９８９年を参照）。最も好ましいリン酸供与体はＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）である。
【００１１】
用語「％同一性」は、当該技術分野において周知のとおり、場合によってはかかる配列のストリング間の一致により決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の類似度を意味する。「同一性」は、例えば、プログラムＧＡＰ（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン１０．２、アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．）、９６８５ スクラントン・ロード（Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ）、サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ）９２１２１−３７５２、米国（ＵＳＡ））で例えば次のパラメータを使用する：ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）８、ギャップ伸張ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）２（デフォルトパラメータ）、プログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．２、アクセルリス社、９６８５ スクラントン・ロード、サン・ディエゴ、カリフォルニア州 ９２１２１−３７５２、米国）で例えば次のパラメータを使用する：ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸張ペナルティ４およびｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐマトリクス（デフォルトパラメータ）、またはプログラムのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ（バージョン１．７、ＥＭＢＬ、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））でＢＬＯＳＵＭ置換マトリクスを使用するなどの、周知の配列アラインメントの方法により容易に決定され得る。かかる配列アラインメントは当業者により日常的に実施されている（例えば、チョ（Ｃｈｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１２５７３−１２５７８頁、２００１年）。
【００１２】
「少なくとも１個の突然変異」をもって、本発明の修飾メバロネートキナーゼが、少なくとも上述の位置における１個を含む１個またはそれ以上の突然変異、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個等（すなわち、およびそれ以上）の突然変異を包含し得ることが意味される。
【００１３】
本発明の目的において、「変異体」、「変異体酵素」、または「変異体メバロネートキナーゼ」は、各々の野生型酵素より（より高い）フィードバック耐性である、または低減されたフィードバック阻害感受性を有する、所与の野生型酵素／メバロネートキナーゼに由来し得る任意の変異型であり得る。変異体は、例えば、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発／定向進化、細胞／生物体全体の化学的またはＵＶ突然変異誘発、合成遺伝子設計、および／またはインビトロ（無細胞）翻訳によるなど、当該技術分野で周知の任意の方法により得られてもよい（例えば、ジェルムテュス（Ｊｅｒｍｕｔｕｓ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，５３４−５４８頁、１９９８年；バトン（Ｂｅｔｔｏｎ），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４，７３−８０頁、２００３年；マルティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）３１，９４８−９５３頁、２００１年を参照）。変異体が如何にして得られるかは関連性がない。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「フィードバック阻害」はイソプレノイド生合成におけるメバロネートの下流代謝産物によるメバロネートキナーゼの酵素活性の任意の阻害を含む。イソプレノイド生合成におけるメバロネートの下流代謝産物は、５−ホスホメバロネート、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ファルネソール、ドリコールリン酸、およびフィチルピロリン酸を含むが限定はされない（ドーシー（Ｄｏｒｓｅｙ）およびポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３，４６６７−４６７０頁、１９６８年；フリント（Ｆｌｉｎｔ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２０，１４５−１５０頁、１９７０年；グレイ（Ｇｒａｙ）およびケクウィック（Ｋｅｋｗｉｃｋ），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２７９，２９０−２９６頁，１９７２年；ヒンソン（Ｈｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３８，２２１６−２２２３頁、１９９７年）。メバロネートキナーゼのフィードバック阻害はメバロネートキナーゼの、イソプレノイド生合成におけるメバロネートの下流代謝産物の酵素に結合することによるアロステリック制御に基づき得る。
【００１５】
好ましくは、フィードバック阻害は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）によるフィードバック阻害である。フィードバック阻害感受性は例えばメバロン酸経路の下流産物、例えばＦＰＰまたはＧＧＰＰの生理学的または工業的に適切な濃度に対する阻害感受性を意味する。
【００１６】
本発明によれば修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す。好ましくは、本発明の修飾メバロネートキナーゼのフィードバック阻害感受性は、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減弱される（フィードバック耐性の測定および定量化については、以下を参照）。このように、言い換えれば、本発明の修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のフィードバック耐性を示し得る。
【００１７】
本明細書で使用される「フィードバック耐性」は「フィードバック阻害」（上記に定義されるとおり）に対する任意の耐性増加であり得る。フィードバック耐性は当業者に周知の種々の方法で分析され得る。かかる分析の然るべき実施例が本明細書に簡潔に記載される：メバロネートキナーゼ活性は、活性アッセイにおいて、例えばＡＴＰ（または別のリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロネート類似体）の非飽和濃度で、すなわち、例えばその濃度前後で反応速度がそれら基質濃度変化に対し感受性をもつＡＴＰ（またはリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロネート類似体）濃度で、例えばそれら基質には研究中酵素の各Ｋｍ値前後の濃度で、測定される。野生型メバロネートキナーゼおよびこの酵素の変異型／変異体の双方の活性は、フィードバック阻害因子の適切な濃度、すなわち、野生型メバロネートキナーゼの有意な阻害を供するフィードバック阻害因子の濃度の不在下および存在下の双方で、その他は同一の条件下において、測定される。フィードバック阻害因子による阻害程度（例えば、％阻害）が野生型酵素に対するより変異体に対する方が小さい場合、ひいては変異体は本特許出願の文意におけるフィードバック耐性である。フィードバック耐性変異型／変異体が同定された時点で、上述と同じ手順がさらなる改良型変異体、すなわち、さらにより高いフィードバック耐性である変異体を同定するために適用され得る。フィードバック耐性（％）は次のとおり計算される：（ａ）および（ｂ）がフィードバック阻害因子（例えば、ＦＰＰ）の不在下および存在下各々における野生型酵素の測定されたメバロネートキナーゼ活性である場合、かつ（ｃ）および（ｄ）が同じフィードバック阻害因子の不在下および存在下各々における変異体酵素の測定されたメバロネートキナーゼ活性である場合、ひいては％フィードバック耐性は、
％耐性＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
【００１８】
好ましくは、フィードバック耐性は本出願の実施例１に記載される実験条件を参照する。約３〜３０ｍＵ／ｍｌ（出芽酵母メバロネートキナーゼの約４０〜４００ｎｇ／ｍｌに相当する）、好ましくは、約１０〜２０ｍＵ／ｍｌのメバロネートキナーゼ活性、および任意にＦＰＰ１μＭがアッセイ混合物中に存在してもよく、かつ反応は２５℃で行われ得る。
【００１９】
本発明の修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個の突然変異を包含する。少なくとも１個の突然変異は例えば添加、欠失および／または置換であり得る。好ましくは、少なくとも１個の突然変異はアミノ酸置換であり、非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列中に存在する所与のアミノ酸が、本発明の修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列中の異なるアミノ酸と置き換えられる。修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個のアミノ酸置換を包含し得る。さらなる実施形態において、修飾メバロネートキナーゼは対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５個の置換を包含する。本発明の他の実施形態において、修飾メバロネートキナーゼは対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時、１から１５、１から１２、１から１０、１から７、１から５、１から４、２から１５、２から１２、２から１０、２から７、２から５、２から４、３から１５、３から１２、３から１０、３から７、３から５または３から４個のアミノ酸置換を包含する。
【００２０】
本発明によれば、少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。配列番号１のこれらアミノ酸位置における突然変異の任意の組み合わせ、すなわち、上述のアミノ酸位置の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４箇所または少なくとも１５箇所全てに対応する位置における突然変異が、上記に定義されるとおりの修飾メバロネートキナーゼを生成するための少なくとも１個の突然変異の標的として選択され得る。好ましくは、本発明は出芽酵母から生じる修飾メバロネートキナーゼを提供し、ここで前記修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は少なくとも１個の突然変異を含んでなり、前記突然変異は１個またはそれ以上の突然変異を、配列番号１に示されるとおりの位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および／または３７５位において含み、ここで配列番号１は野生型アミノ酸配列を表す。
【００２１】
本発明における修飾メバロネートキナーゼは上記に定義されるとおり少なくとも１個の突然変異を１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置において包含することから、さらなる突然変異を上記に挙げられたもの以外のアミノ酸位置において包含し得る。
【００２２】
一態様において、本発明は、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す修飾メバロネートキナーゼに関し、ここで
（ｉ）修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時、１個またはそれ以上の突然変異を包含し、かつ
（ｉｉ）１個またはそれ以上の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。
【００２３】
配列番号１に示されるこれら位置の任意の組み合わせ、すなわち、上述の位置に対応する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４箇所または１５箇所全ての位置が、前記修飾メバロネートキナーゼを生成するための突然変異の標的として選択され得る。
【００２４】
一実施形態において少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、１１７、および１５２位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。
【００２５】
修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時、例えば単一アミノ酸置換などの単一突然変異のみを包含し得る。好ましくは、単一突然変異は配列番号１のアミノ酸位置５５、５９、６６、１１７、および１５２位に対応する位置からなる群より選択される位置においてである。より好ましくは、単一突然変異は、例えばＰ５５Ｌ、Ｆ５９Ｓ、Ｎ６６Ｋ、Ｃ１１７Ｓ、またはＩ１５２Ｍなどのアミノ酸置換である。最も好ましくは、置換はＦ５９Ｓ、すなわち、フェニルアラニンのセリンとの配列番号１の位置５９位に対応する位置上での置換／交換である。
【００２６】
修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時、例えば２個のアミノ酸置換などの少なくとも２個の突然変異を包含し得る。好ましくは、少なくとも２個の突然変異、例えばアミノ酸置換のうちの１個は、位置５５、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１５２、２１８、２４９、および／または３７５位より選択される配列番号１の位置に対応するアミノ酸位置においてである。２個の突然変異、例えばアミノ酸置換の場合、２個の突然変異は、配列番号１の位置の組み合わせ５５／１１７、６６／１５２、８３／２４９、１１１／３７５または１０６／２１８位に対応する位置においてであることが好ましい。より好ましくは、２個の突然変異は１個または２個のアミノ酸置換、さらにより好ましくは、２個のアミノ酸置換から成る。最も好ましくあるのは、Ｐ５５Ｌ／Ｃ１１７Ｓ、Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ、Ｋ８３Ｅ／Ｓ２４９Ｐ、Ｈ１１１Ｎ／Ｋ３７５ＮまたはＬ１０６Ｐ／Ｓ２１８Ｐより選択される配列番号１の位置の組み合わせに対応する２個のアミノ酸置換／交換の組み合わせである。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、修飾メバロネートキナーゼは配列番号１に示されるアミノ酸配列の組み合わせＮ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍに対応する２個のアミノ酸置換を包含する。より好ましくは、２個のアミノ酸置換は配列番号１に示されるとおりの非修飾出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列におけるＮ６６ＫおよびＩ１５２Ｍである。
【００２８】
修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時、少なくとも４個の突然変異、例えば４個のアミノ酸置換などを包含し得る。好ましくは、少なくとも４個の突然変異、例えばアミノ酸置換のうち１個は、位置１４２、１５８、２３１、および３６７位より選択される配列番号１の位置に対応するアミノ酸位置においてである。４個の突然変異、例えばアミノ酸置換の場合、４個の突然変異は配列番号１の位置の組み合わせ１４２／１５８／２３１／３６７位に対応する位置においてであることが好ましい。より好ましくは、４個の突然変異は１、２、３または４個のアミノ酸置換、さらにより好ましくは、４個のアミノ酸置換から成る。最も好ましくあるのは、配列番号１の位置１４２／１５８／２３１／３６７位に対応する４個のアミノ酸置換の組み合わせであるＩ１４２Ｎ／Ｌ１５８Ｓ／Ｌ２３１Ｉ／Ｔ３６７Ｓである。
【００２９】
最も好ましくあるのは、表１に開示される突然変異の組み合わせである（下記参照）。実施例において同定されるアミノ酸位置は種々の起源のメバロネートキナーゼに移し替え得る。
【００３０】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは突然変異を対応する非修飾メバロネートキナーゼに導入することにより得られ得る。
【００３１】
非修飾メバロネートキナーゼは、例えばヒトを含む動物、植物、藻類、酵母を含む菌類、および細菌などの、真核生物または原核生物起源であり得る。好ましくは、非修飾メバロネートキナーゼは、酵母を含む菌類からまたは細菌から選択され、より好ましくは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）からなる群より選択される。さらにより好ましくは、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、出芽酵母、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒ．スフェロイデス（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ ３５０５３などのロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、またはファフィア・ロドジマであり、出芽酵母が最も好ましくある。
【００３２】
本発明の一態様において、非修飾メバロネートキナーゼはＦＰＰによりフィードバック阻害される。ＦＰＰによる非修飾メバロネートキナーゼのフィードバック阻害は、例えばポピヤック（Ｐｏｐｊａｋ）（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５，３９３−頁，１９６９年）、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら（エンザイム（Ｅｎｚｙｍｅ）４１，４７−５５頁，１９８９年）、ヒンソン（Ｈｉｎｓｏｎ）ら（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３８，２２１６−２２２３頁，１９９７年）、シュルト（Ｓｃｈｕｌｔｅ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，２４５−２５４頁，１９９９年）、またはチョ（Ｃｈｏ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１２５７３−１２５７８頁，２００１年）により記載されるとおりなど、当業者に周知の方法により決定されるとおり、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％であり得る。特定のアッセイが、種々のＦＰＰ濃度を使用して実施例１に記載される。
【００３３】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは、好ましくはそのＮまたはＣ末端において、外来アミノ酸を含んでなる。「外来アミノ酸」は、天然の（自然のなかで発生する）メバロネートキナーゼ中に存在しないアミノ酸、例えば天然メバロネートキナーゼ中に存在しない少なくとも約３連続、好ましくは少なくとも約５連続およびより好ましくは少なくとも約７連続アミノ酸の一続きなどを意味する。好適な外来アミノ酸の一続きは、組換え産生された修飾メバロネートキナーゼの精製を円滑にする「タグ」を含むが限定はされない。かかるタグの例はＨｉｓ６タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、および同類のものを含むが限定はされない。
【００３４】
別の実施形態では、修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時、１個またはそれ以上の欠失、例えば、２個の欠失を包含し得る。好ましくは、欠失は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのＮまたはＣ末端アミノ酸に影響するとともに、酵素の機能特性、例えば比活性を有意には減弱しない。
【００３５】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは通常、非自然発生的メバロネートキナーゼである。修飾メバロネートキナーゼの比活性は、例えば、対応する非修飾メバロネートキナーゼの比活性の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％およびさらにそれ以上、例えば約１５０％、２００％およびそれ以上などであり得る。
【００３６】
比活性の測定方法は当業者に周知である。比活性は例えばＮＡＤＨの消費測定を介して決定され得る。かかる測定に好適な条件は、典型的に飽和基質濃度が使用されること、または高基質濃度、特定の実験条件下で最大活性を与える基質濃度での酵素阻害の場合を除き、例えば実施例１に概説されるとおりのものであり得る。
【００３７】
本発明はさらに、本発明による修飾メバロネートキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドに関する。任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド、例えば非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡもしくは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡなどが、ポリヌクレオチドとして使用され得る。ポリヌクレオチドは、一本および二本鎖ＤＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本および二本鎖ＲＮＡ、および一本および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には二本鎖または一本および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を含むが限定はされない。本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドはさらに、１個またはそれ以上の異常塩基、例えばイノシン、もしくは１個またはそれ以上の修飾塩基、例えばトリチル化された塩基、を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野において周知の突然変異誘発法、例えば、例えば添加、欠失および／または置換などの突然変異の、非修飾メバロネートキナーゼをコードするヌクレオチド配列への、例えば部位特異的な突然変異およびＰＣＲに基づく方法による導入などによって、例えば最新技術において周知のメバロネートキナーゼをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ配列［配列情報については、例えば適切な配列データベース、例えば、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ），カリフォルニア州（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），米国）、欧州生命情報学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ヒンストン・ホール（Ｈｉｎｓｔｏｎ Ｈａｌｌ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），英国（ＧＢ））、ＮＢＲＦ（ジョージタウン大学（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），メディカル・センター（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ），ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）ＤＣ，米国）およびベクベース（Ｖｅｃｂａｓｅ）（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ），バイオテクノロジー・センター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅ），マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ），ウィスコンシン州（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ），米国）を参照］から開始することにより作成される非修飾メバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を修飾することにより容易に得られ得る（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理は、例えば、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．５，１８５−１８９頁，１９８９年により概説されるが、改良された方法が例えばイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら［ＰＣＲプロトコル：方法と応用のための手引（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）（１９９０年）］に記載される。
【００４０】
修飾メバロネートキナーゼの生成は、部位特異的な突然変異誘発、当初はハッチソン（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ）およびエッジェル（Ｅｄｇｅｌｌ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８，１８１−１８９頁，１９７１年）により概説されている、所望のヌクレオチド置換、欠失または添加を突然変異が導入されるべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域へ運搬する合成オリゴヌクレオチドのアニーリングを伴う方法により実施され得る（レビューについて、スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９，４２３−４６２頁，１９８５年を参照；および改良された方法について、スタンセン（Ｓｔａｎｓｓｅｎ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，４４４１−４４５４頁，１９８９年における参考文献２〜６を参照）。出発物質としてのＤＮＡは、当該技術分野において周知の、および例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ））に記載される方法により各株／生物体から単離され得る。しかしながら、本発明に従い作成／突然変異されるべきメバロネートキナーゼをコードするＤＮＡはまた、例えば、当該技術分野において周知の方法による合成遺伝子の作成により、周知のＤＮＡ配列の塩基上に調製され得ることも分かっている（例えば、欧州特許第７４７ ４８３号明細書中およびレーマン（Ｌｅｈｍａｎｎ）ら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１３，４９−５７頁，２０００年に記載のとおり）。
【００４１】
本発明に従い修飾メバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例が配列番号５に示される。
【００４２】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形で提供されるとともに、好ましくは均一に精製される。
【００４３】
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然発生的であるなら自然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、微生物生体中に存在する自然発生的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、自然系における共存物質の一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部分であり得、および／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成の一部分であり得、かつかかるベクターまたは組成はその自然環境の一部分でないという点において、それでも単離されている。
【００４４】
本明細書で使用される単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、それが由来する生物体中の自然発生ゲノムにおいてはそれと直接隣接するコード配列の双方（１つは５’末端上および１つは３’末端上）と直接隣接しないＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。このように、一実施形態において、核酸はコード配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部または全てを含む。それ故、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられる組換えＤＮＡ、もしくは、他の配列に依存しない個別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。それはまた、実質的に細胞物質、生体物質、または培地のない（組換えＤＮＡ技術による産生時）、もしくは化学的前駆体または他の化学薬品のない（化学的合成時）、付加的なポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として自然発生的でないとともに自然状態には見出されないであろう核酸断片である。当業者に周知の従来の核酸精製法が単離されたポリヌクレオチドを得るため使用され得る。
【００４５】
単離されたポリペプチドは実質的に他のポリペプチドのないポリペプチドであり得る。単離されたポリペプチドは、例えば、８０％より高純度、好ましくは９０％より高純度、より好ましくは９５％より高純度、および最も好ましくは９９％より高純度であり得る。純度は当該技術分野において周知の方法に従い、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くタンパク質染色により決定され得る。タンパク質バンドは例えば濃度測定により定量され得る。さらなる純度決定方法は当業者レベルの範囲である。
【００４６】
いまだ別の実施形態において本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたはプラスミドに関連する。ベクターまたはプラスミドは、好ましくは少なくとも１個のマーカー遺伝子を含んでなる。ベクターまたはプラスミドはさらに、本発明のポリヌクレオチドに操作可能に連結される調節エレメントを含んで成ってもよい。本明細書で使用されるとき用語「操作可能に連結」は、例えば、一方の機能が他方により影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を言う。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響する能力がある、すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある時、コード配列と操作可能に連結される。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンスの配向で操作可能に連結され得る。用語「発現」はＤＮＡ配列のｍＲＮＡへの転写および／またはｍＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳を示す。用語「過剰発現」は、例えば、改変生物体（例えば、形質転換または形質移入により改変された）中の対応する非改変生物体中の産物レベルを超える遺伝子産物の産生を意味する。
【００４７】
然るべき宿主系中のコードされたポリペプチドを過剰発現するための、本発明における修飾メバロネートキナーゼをコードするＤＮＡ配列のベクターへの組込みは、当該技術分野において周知の、および例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記参照）に記載の方法により実施され得る。ＤＮＡ配列自体または本発明におけるＤＮＡ配列を含んでなるベクター／プラスミドのいずれかが、コードされたポリペプチドの（過剰）発現を得るため好適な本発明の宿主系を形質転換することに使用され得る。本発明に有用である好適な宿主系は、真核生物または原核生物細胞、例えばヒトを含む動物、植物、細菌、または酵母を含む菌類の細胞より選択され得る。かかる宿主細胞の例は、レンサ球菌、ブドウ球菌、腸球菌、ラン藻、酵母（例えば、サッカロミセス属）、担子菌、裸子植物、被子植物、または例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＫ２９３［ヒト腎２９３株化細胞？？？］、およびＣＶ−１などの株化細胞より選択される細胞を含むが限定はされない。
【００４８】
植物における発現に好適な方法が、例えばペン（Ｐｅｎ）らによりバイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１，８１１−８１４頁，１９９４年または欧州特許第４４９ ３７５号明細書に記載され、好ましくは例えば欧州特許第４４９ ３７６号明細書に記載されるとおり種子においてである。プロモーターおよびターミネーターの好適な例の一部は、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものを含む。使用され得る効果的な植物プロモーターの１種は、高レベル植物プロモーターである。かかるプロモーターは、本発明の遺伝子配列と操作可能に連結され、本遺伝子産物の発現を促進する能力があるべきものである。本発明において使用され得る高レベル植物プロモーターは、例えば、例えばダイズ由来のリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー（Ｂｅｒｒｙ）−ロウ（Ｌｏｗｅ））ら，Ｊ．ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，４８３−４９８頁，１９８２年）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターを含む。
【００４９】
本発明の範囲内で真菌宿主細胞は、例えば、クロカビまたはコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などのトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、出芽酵母などのサッカロミセス属、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）より選択され得、好ましくはＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＤＳＭ ５２１５である。本発明の範囲内で細菌宿主細胞は、例えば、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスなどのパラコッカス属、Ｒ．スフェロイデス（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）などのロドバクター属、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）などのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）より選択され得る（例えば、アンネ（Ａｎｎｅ）およびヴァン・メラエルト（ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ）のＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１４，１２１−１２８頁，１９９３年を参照）。好ましくは、使用され得る大腸菌株は、例えば、例えばＭ１５（ヴィラレヨ（Ｖｉｌｌａｒｅｊｏ）らによりＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２０，４６６−４７４頁，１９７４年にＤＺ ２９１として記載される）、ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）または大腸菌ＳＧ１３００９（ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８，２６５−２７３頁，１９８１年）などの、大腸菌Ｋ１２株より選択され得る。当業者には、かかる好適な宿主が、例えばジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ）『工業所有権（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ）』（第１巻，２９−４０頁，１９９１年）に、または欧州特許庁公報（Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）（第４巻，１５５／１５６頁，２００３年）に挙げられるとおりの、任意の周知の寄託当局から入手可能であり得ることは周知である。
【００５０】
宿主系に応じ、種々のベクターが使用され得、前記ベクターは本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる。菌類における発現に使用され得るベクターの非限定的な例は当該技術分野において周知であるとともに、例えば、欧州特許第４２０ ３５８号明細書またはキュラン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら、（バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，３６９−３７６頁，１９８７年）、ワード（Ｗａｒｄ）（糸状菌のための分子工業菌学、システムおよび応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ），マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９１年）、アプシャル（Ｕｐｓｈａｌｌ）ら（バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，１３０１−１３０４頁，１９８７年）、グウィンヌ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら（バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，７１−７９頁，１９８７年）、またはプント（Ｐｕｎｔ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１９−３４頁，１９９１年）、および酵母についてはスレークリシャナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら（Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，２６５−２７８頁，１９８８年；バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８，４１１７−４１２５頁，１９８９年）、ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎｎ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９３，７１７−７２２頁，１９８１年）または欧州特許第１８３ ０７０号明細書、欧州特許第１８３ ０７１号明細書、欧州特許第２４８ ２２７号明細書、欧州特許第２６３ ３１１号明細書に記載されている。大腸菌における発現に使用され得るベクターの非限定的な例は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより［上記参照］、またはファイアス（Ｆｉｅｒｓ）らにより、第８回国際バイオテクノロジーシンポジウム会報（Ｐｒｏｃ．８ｔｈ Ｉｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｙｍｐ．）のなかで［Ｓｏｃ．Ｆｒａｎｃ．ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，パリ（Ｐａｒｉｓ）（デュラン（Ｄｕｒａｎｄ）ら編），６８０−６９７頁，１９８８年］、ビェジャール（Ｂｕｊａｒｄ）ら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ウー（Ｗｕ）およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ）編，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），第１５５巻，４１６−４３３頁，１９８７年のなかで）、またはステューバー（Ｓｔｕｅｂｅｒ）ら（免疫学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ），レフコヴィッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）およびペルニス（Ｐｅｒｎｉｓ）編，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），第ＩＶ巻，１２１−１５２頁，１９９０年のなかで）述べられている。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｉ）における発現に使用され得るベクターの非限定的な例は当該技術分野において周知であるとともに、例えば、欧州特許第２０７ ４５９号明細書または欧州特許第４０５ ３７０号明細書に、ヤンスラ（Ｙａｎｓｕｒａ）およびヘンナー（Ｈｅｎｎｅｒ）により全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８１，４３９−４４３頁（１９８４年）に、またはヘンナー（Ｈｅｎｎｅｒ）、ルグリス（Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ）およびナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）によりＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，１９９−２２８頁，１９９０年に記載されている。Ｈ．ポリモルファにおける発現に使用され得るベクターの非限定的な例は当該技術分野において周知であるとともに、例えば、ジェリッセン（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ）ら，バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９，２９１−２９５頁，１９９１年に記載されている。
【００５１】
いずれのかかるベクターも調節エレメント、例えばプロモーターを既に保有し、または本発明のＤＮＡ配列はかかるエレメントを包含するよう改変され得る。使用され得る好適なプロモーターエレメントは、当該技術分野において周知であるとともに、例えば、トリコデルマ・リーセイ用にｃｂｈ１プロモーター（ハーキ（Ｈａａｒｋｉ）ら，バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７，５９６−６００頁，１９８９年）またはｐｋｉ１プロモーター（シンドラー（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）１３０，２７１−２７５頁，１９９３年）、コウジカビ用にａｍｙプロモーター［クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら，第１９回分子遺伝学に関するルンテレン講座要約（Ａｂｓｔｒ．１９ｔｈ Ｌｕｎｔｅｒｅｎ Ｌｅｃｔｕｒｅｓ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｆ２３（１９８７年）；クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら，バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６，１４１９−１４２２頁，１９８８年；タダ（Ｔａｄａ）ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２９，３０１−３０６頁，１９９１年］、クロカビ用にｇｌａＡプロモーター（キュラン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，３６９−３７６頁，１９８７年；グウィンヌ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，７１３−７１９頁，１９８７年；ワード（Ｗａｒｄ）の糸状菌のための分子工業菌学、システムおよび応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ），マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），８３−１０６頁，１９９１年）、ａｌｃＡプロモーター（グウィンヌ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，７１８−７１９頁，１９８７年）、ｓｕｃ１プロモーター（ボディ（Ｂｏｄｄｙ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４，６０−６６頁，１９９３年），ａｐｈＡプロモーター（マクリー（ＭａｃＲａｅ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）７１，３３９−３４８頁，１９８８年；マクリー（ＭａｃＲａｅ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）１３２，１９３−１９８頁，１９９３年）、ｔｐｉＡプロモーター（マクナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）ら，セル（Ｃｅｌｌ）４６，１４３−１４７頁，１９８６年；アップシャル（Ｕｐｓｈａｌｌ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，１３０１−１３０４頁，１９８７年）、ｇｐｄＡプロモーター（プント（Ｐｕｎｔ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）６９，４９−５７頁，１９８８年；プント（Ｐｕｎｔ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１９−３７頁，１９９１年）およびｐｋｉＡプロモーター（ドグラフ（ｄｅ Ｇｒａａｆｆ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２２，２１−２７頁，１９９２年）である。酵母における発現に使用され得る好適なプロモーターエレメントは当該技術分野において周知であるとともに、例えば、出芽酵母における発現用にｐｈｏ５プロモーター（フォゲル（Ｖｏｇｅｌ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，２０５０−２０５７頁，１９８９年；ルドルフ（Ｒｕｄｏｌｆ）およびヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ），全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８４，１３４０−１３４４頁，１９８７年）またはｇａｐプロモーター、およびピキア・パストリス用に例えばａｏｘ１プロモーター（クッツ（Ｋｏｕｔｚ）ら，イースト（Ｙｅａｓｔ）５，１６７−１７７頁，１９８９年；スレークリシャナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，２６５−２７８頁，１９８８年）、またはＨ．ポリモルファ用にＦＭＤプロモーター（ホレンベルグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら，ＥＰＡ番号０２９９１０８）またはＭＯＸプロモーター（ルドボア（Ｌｅｄｅｂｏｅｒ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３，３０６３−３０８２頁，１９８５年）である。
【００５２】
好適なプロモーターは、例えばジャコミニ（Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ）ら（ジーン（Ｇｅｎｅ）１４４，１７−２４頁，１９９４年）に記載されるとおり天然および合成プロモーターを含む。細菌中の主張される（変異体）メバロネートキナーゼの発現に対する然るべき教示、然るべきプラスミドによるか、またはメバロネートキナーゼをコードするＤＮＡ配列の染色体ＤＮＡへの組込みを通してかのいずれかが、例えば米国特許第６，３２２，９９５号明細書といった多所に散見され得る。
【００５３】
本発明はさらに、本発明の修飾メバロネートキナーゼを産生する方法／プロセスに関し、
（ａ）本発明の修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および
（ｂ）細胞から、または培地から修飾メバロネートキナーゼを回収するステップ、を含んでなる。
【００５４】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは遺伝子改変宿主細胞から調製され得る。
【００５５】
本発明のポリペプチドの組換え産生のため、宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターまたはプラスミドを組み入れるよう遺伝子改変され得る。ポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験マニュアルに記載される手法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン脂質介在トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、バリスティック導入および感染などにより実効され得る［参考文献として、例えば、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら，分子生物学における基礎的手法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８６年）、およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第２版，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）（１９８９年）を参照］。
【００５６】
宿主中においてポリヌクレオチドを維持、増殖または発現する、および／またはポリペプチドを発現するのに好適な任意の系またはベクターが、他のなかでもとりわけ上記のものを含め、本発明のメバロネートキナーゼの発現／産生に使用され得る。
【００５７】
真核生物中の組換え発現系において、翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔への、細胞膜周辺腔への、または細胞外環境への分泌のため、然るべき分泌シグナルが発現ポリペプチドへと組み入れられ得る。これらのシグナルはポリペプチドに対し内因性であり得るか、または異種シグナルであり得る。
【００５８】
本発明のポリペプチドは組換え細胞培養物から、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む十分に周知の方法により回収および精製され得る。一実施形態において、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられ得る。タンパク質リフォールディング用の十分に周知の技術が、単離および／または精製中にポリペプチドが変性される時活性コンフォメーションを再生するため用いられる。タンパク質精製の方法は、例えば、ドイッチェアー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ），タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９０年； およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ），タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ），ハイデルベルク，１９９４年に記載される。
【００５９】
多様な培養方法論が本発明のタンパク質を産生するため適用され得る。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特異的遺伝子産物の大規模産生は、例えばバッチ、フェドバッチ、連続または半連続培養方法論により産生され得る。様々な培養法の詳細は、例えば、トーマス・Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）のバイオテクノロジー：工業微生物学の教科書（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），第２版（１９８９年）シノエール・アソシエイツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ），Ｍａｓｓ．，またはデシュパンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，２２７−２３４頁、１９９２年に見出され得る。
【００６０】
発酵培地は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはショ糖などの少糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類もしくはそれらの混合物および再生可能原料由来の未精製混合物を含むが限定はされない好適な炭素基質を包含し得る。本発明において利用される炭素源は多種多様な炭素含有基質を網羅し得るとともに生物体の選択に依存する。
【００６１】
本発明はさらに、低減されたフィードバック阻害感受性を有する修飾メバロネートキナーゼの調製のための方法／プロセスに関し、次のステップを含んでなる：
（ａ）フィードバック阻害感受性を示す第１のメバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ、
（ｂ）１個またはそれ以上の突然変異をポリヌクレオチド配列へと導入することで、第１のメバロネートキナーゼと比較した時少なくとも１個のアミノ酸突然変異を包含し、ここで少なくとも１個のアミノ酸突然変異は配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである第２のメバロネートキナーゼを、突然変異ポリヌクレオチド配列がコードするステップ、
（ｃ）ベクターまたはプラスミド内に突然変異ポリヌクレオチドを任意に挿入するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを好適な宿主細胞へと導入するステップ、および
（ｅ）低減されたフィードバック阻害感受性を有する修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養するステップ。
【００６２】
この方法の好ましい実施形態は、修飾メバロネートキナーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド、宿主細胞、および本明細書に記載される方法の好ましい実施形態に対応する。第１および第２のメバロネートキナーゼは、各々非修飾および修飾メバロネートキナーゼに対応する（上記を参照）。
【００６３】
本発明はさらに、イソプレノイド産生のための方法またはプロセスに関し、
（ａ）本発明の宿主細胞を好適な培地において宿主細胞中の修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下で培養するステップ、および
（ｂ）イソプレノイドを培地から任意に分離するステップ、を含んでなる。
【００６４】
好ましくは、本発明の修飾メバロネートキナーゼはイソプレノイドの産生増加に使用される。
【００６５】
かかる方法／プロセスは、任意の種類のイソプレノイドまたはイソプレノイド化合物の生物工学的産生に使用され得る。メバロネートに由来し得る任意の代謝産物およびプレニル化高分子が本特許出願の文意におけるイソプレノイドとして使用され得る。これらイソプレノイドは天然経路または非天然経路（すなわち、自然中で発生しないが、生物工学的に改変された経路）のいずれからも生成され得る。かかるイソプレノイドの非限定的な例は、ホパントリテルペン、キノン、カロテノイド、モノ−、セスキ−、ジ−およびトリテルペン、クロロフィルのプレニル側鎖、ヘムＡ、ドリコール、ステロール／ステロイド、レチノイド、およびゴムまたはゴム誘導体、好ましくは天然ゴム（＝ｃｉｓ−１，４−ポリイソプレン；ムーイブルック（Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ）およびコルニッシュ（Ｃｏｒｎｉｓｈ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３，３５５−３６５頁、２０００年）を含む。
【００６６】
本発明の範囲内でキノンは、例えば、ユビキノン（＝コエンザイムＱ）、メナキノン、プラストキノンおよびアントラキノン、好ましくはコエンザイムＱ６、コエンザイムＱ７、コエンザイムＱ８、コエンザイムＱ９、コエンザイムＱ１０またはコエンザイムＱ１１より選択され得、および最も好ましくはコエンザイムＱ１０である（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、プロトプラズマ（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ）２１３，１３４−１４７頁、２０００年；ハン（Ｈａｎ）ら，植物細胞組織器官培養（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）６７，２０１−２２０頁、２００１年；カワムカイ（Ｋａｗａｍｕｋａｉ）、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４，５１１−５１７頁、２００２年）。本発明の範囲内でカロテノイドは、例えば、フィトエン、リコピン、α−、β−およびγ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、アドニキサンチン、エチネノン、カンタキサンチン、アスタキサンチンおよびそれらの誘導体より選択され得る（ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）＆シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，１６９−１８１頁，１９９８年；ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，１２２６−１２２９頁，１９９８年；ヒルシュベルグ（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１８６−１９１頁、１９９９年；マルガリス（Ｍａｒｇａｌｉｔｈ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１，４３１−４３８頁，１９９９年；シュミット−ダンネルト（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，２５５−２６１頁，２０００年；サンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８５，４−１２頁，２００１年；リー（Ｌｅｅ）およびシュミット−ダンネルト（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０，１−１１頁、２００２年）。本発明の範囲内でステロールは、例えば、エルゴステロール、コレステロール、ヒドロコルチゾン（メナード・スッチェバラ（Ｍｅｎａｒｄ Ｓｚｃｚｅｂａｒａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１４３−１４９頁，２００３年）、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、食事性植物ステロール（リン（Ｌｉｎｇ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７，１９５−２０６頁，１９９５年）および天然界面活性物質（ホルムバーグ（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．６，１４８−１５９頁，２００１年）およびそれらの誘導体より選択され得る。
【００６７】
上記で定義されたとおりの イソプレノイドまたはイソプレノイド化合物の産生に好適な宿主細胞は、遺伝子改変を受け入れやすい全ての種類の生物体、例えば、細菌、酵母を含む菌類、藻類、植物またはヒト細胞を含む動物細胞などであり得る。これら宿主細胞は、本発明の修飾メバロネートキナーゼの発現について上記で定義されるものと同じであり得る。遺伝子的および代謝的改変の方法は当業者に周知である（例えば、ベルポールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１，４６７−４７９頁、１９９９年；ベルポールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ）ら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９，３２３−３４３頁，２０００年；バルコヴィッチ（Ｂａｒｋｏｖｉｃｈ）およびリャオ（Ｌｉａｏ）、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．３，２７−３９頁、２００１年）。同様に、イソプレノイドおよびイソプレノイド化合物に（潜在的に）好適な精製方法は当該技術分野において十分に周知である。
【００６８】
本発明によるイソプレノイドの生物工学的産生のための方法／プロセスは、例えば上記のとおりの細胞全体の発酵プロセス、透過処理された宿主細胞、粗細胞抽出物、例えば遠心分離または濾過といった任意の好適な方法により細胞レムナントから純化される細胞抽出物、または単離された酵素での再構成された反応経路によってさえ、実施され得る。またかかるプロセスの組み合わせは本発明の範囲にありもする。無細胞生合成（例えば再構成された反応経路によるなど）の場合、酵素が如何にして調製されたか、例えば、宿主細胞からの単離によって、インビトロ転写／翻訳によって、またはいまだ当該技術分野において周知の他の手段によってなどには無関係である。
【００６９】
上記のとおり修飾Ｍｖｋを使用する、例えばコエンザイムＱ１０などのイソプレノイドの産生は、非修飾Ｍｖｋを使用する同じイソプレノイドの産生と比較した時、例えば少なくとも約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％またはそれ以上増加し得る。所与の試料中におけるイソプレノイド化合物の濃度測定の一手法が、実施例５に記載される。
【００７０】
本発明の別の態様は、メバロネートキナーゼの活性低下に付随する疾患治療用薬物の製造のための、本発明の修飾メバロネートキナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。かかる疾患はメバロン酸尿症、または高免疫グロブリンＤ症候群および周期熱症候群を含むが限定はされない。本発明の修飾メバロネートキナーゼは治療酵素として投与されることが好ましい。好適な投与様式は、例えば、経口、非経口、腹腔内および／または皮下投与であり得る。本発明の修飾メバロネートキナーゼは、少なくともかかる酵素の１個を単独で含んでなる、または例えば薬剤的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤との混合物における医薬組成物（例えば、顆粒剤、酵素結晶、錠剤、丸剤、カプセル、注射、溶液、および同類のもの）として処方され得る。医薬組成物は従来の方法に従って処方され得る。任意の特定患者に特異的な用量レベルが、例えば用いられる特異的化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および治療中の特定疾患の重症度を含む多様な要因に応じて用いられ得る。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドは遺伝子治療プロトコルに使用され得る。
【００７２】
本発明のさらに別の態様は、生体液中のメバロネート濃度を決定するための、本発明の修飾メバロネートキナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。生体液の非限定的な例は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、涙、汗、ならびに他の細胞内液、細胞間液および／または細胞外液を含む。
【００７３】
上記のとおりの修飾メバロネートキナーゼをコードする核酸配列、ベクター、好ましくはかかるポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、かかるポリヌクレオチドまたはベクターにより形質転換された宿主細胞、上記のとおりの宿主細胞が好適な培養条件下で培養されるとともにメバロネートキナーゼがかかる宿主細胞または培地から当該技術分野において周知の方法により単離される本発明の修飾メバロネートキナーゼの調製のためのプロセス、およびかかるポリヌクレオチドまたはベクターにより形質転換され、および／またはかかるポリヌクレオチドをその染色体へと安定的に組み込まれた宿主細胞に基づくイソプレノイドの生物工学的産生のためのプロセスを含んでなるポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。
【００７４】
（ｉ）本発明の特異的突然変異の少なくとも１個を保有するメバロネートキナーゼをコードするとともに標準条件下で本発明の特異的修飾メバロネートキナーゼの任意のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、または（ｉｉ）本発明の特異的突然変異の少なくとも１個を保有するメバロネートキナーゼをコードするものの、遺伝暗号の縮重のためハイブリダイズしないが、標準条件下で本発明の特異的修飾メバロネートキナーゼの任意のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列と全く同じアミノ酸配列を備えたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）それがその断片であるところのポリペプチドの活性特性を維持するようなＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列を提供することもまた本発明の目的である。
【００７５】
ハイブリダイゼーションのための「標準条件」は文意において、当業者により特異的なハイブリダイゼーションシグナルを検出するため一般に使用されるとともに例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、『分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）』、第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）１９８９年、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載される条件、または当業者が精通しているとともに例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記参照）に記載される、好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特異的例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中において４２℃で一晩のインキュベーション（例えば、１５時間）の後、ハイブリダイゼーション支持体を０．１×ＳＳＣ中において約６５℃で１０分間×３回洗浄する。
【００７６】
いわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、本発明の具体的に記載されたＤＮＡ配列の塩基上で設計される好適なプライマーによって得られ得るＤＮＡ配列を提供することが、さらにその上の本発明の目的である。そのように得られたＤＮＡ配列は、そこからそれらが設計されるとともに同等の活性特性を示す突然変異と少なくとも同じ突然変異のメバロネートキナーゼをコードすることが分かっている。
【００７７】
本明細書に記載される本発明の様々な実施形態は相互併用され得る。
【００７８】
次の非限定的な実施例がさらに本発明を説明する。
【００７９】
実施例１：メバロネートキナーゼ活性およびフィードバック阻害因子による阻害の測定
メバロネートを基質として調製するため、１３０ｍｇのＤＬ−メバロネートラクトン（フルカ・ケミ（ＦＬＵＫＡ Ｃｈｅｍｉｅ）ＡＧ，ブックス（Ｂｕｃｈｓ），スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））が０．２ＭのＫＯＨ５．５ｍｌ中に溶解されるとともに５０℃で１５分間インキュベートされた。溶液は次に、室温（ＲＴ）で０．１ＭのＨＣｌを加えることによりｐＨ７．０に調整された。別段に述べられる場合を除き、アッセイ混合物は１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのメバロネート、０．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．３２ｍＭのＮＡＤＨ、２０Ｕ／ｍｌのピルビン酸キナーゼおよび２７Ｕ／ｍｌの乳酸脱水素酵素（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ），ミズーリ州（ＭＯ），米国）から成った。阻害は１μＭのＦＰＰを添加することにより試験された。
【００８０】
Ｈｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼおよびＨｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼ変異体酵素の精製はＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーでキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＱＩＡエクスプレス（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）システム／試薬を使用して行われた。精製された（Ｈｉｓ６タグ付き）メバロネートキナーゼを加えると、ＮＡＤＨ消費の反映される酵素反応の後に３４０ｎｍでの光度測定が続いた。１ユニット（１Ｕ）のメバロネートキナーゼ活性は、１分間当たり１μｍｏｌのメバロネートのリン酸化を触媒する。
【００８１】
実施例２：出芽酵母メバロネートキナーゼのフィードバック耐性変異体の生成
出芽酵母（配列番号２）由来のメバロネートキナーゼのｃＤＮＡは、ＰＣＲにより、ＳｐｈＩ制限部位（配列番号１０）を包含するプライマーＭｖｋ−ＳｐｈＩをＨｉｓ６配列ならびにＡＴＧ開始コドンのないメバロネートキナーゼの５’末端配列の小片とともに、および終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（配列番号１１）を含む３’末端配列プライマーＭｖｋ−ＨｉｎｄＩＩＩを使用して増幅される。ＰＣＲ反応は供給者のプロトコル（９４．５℃で３０秒間を１サイクル；９４．５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７０℃で３分間を２５サイクル）に従い、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ），カリフォルニア州，米国）のターボ（Ｔｕｒｂｏ）−Ｐｆｕポリメラーゼを使用して実行される。アガロースゲル電気泳動による精製の後、ＰＣＲ産物はＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化されるとともに、同じ酵素で消化されるｐＱＥ−８０Ｌ（キアゲン，ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ），ドイツ）中に連結され、結果としてｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋになる。プラスミドｐＱＥ−８０Ｌはｌａｃオペレーターエレメントにより制御されるＴ５プロモーターを包含し、同じくｐＱＥ−８０Ｌによりコードされるｌａｃリプレッサーによりシス阻害され得る。次にプラスミドが供給者のプロトコルに従い大腸菌ＤＨ５α（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ），カリフォルニア州，米国）に形質転換される。大腸菌の指数関数的成長中に１００μＭのＩＰＴＧを０．６のＯＤ６００ｎｍで加えると、Ｈｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼが３０℃で４時間、２５０ｒｐｍでの振盪により導入される。
【００８２】
Ｈｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼの部位特異的突然変異誘発はいわゆる「２段階ＰＣＲ」によりストラタジーン（ラ・ホーヤ，カリフォルニア州，米国）のターボ（Ｔｕｒｂｏ）−ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して実現される。第１のＰＣＲ（条件については上記を参照）は、第１のプライマーとして突然変異されたコドンを包含する配列番号１２〜２６に表されるプライマーの１つ、および第２のプライマーとしてｐＱＥ−８０Ｌのマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）の５’末端における配列の小片に対応するプライマーｐＱＥ−５’（配列番号２７）で実施される。鋳型はｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋである。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により精製されるとともに、ＭＣＳの３’末端配列の小片を内包するプライマーｐＱＥ−３’（配列番号２８）とともに、野生型ｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋを鋳型として第２のＰＣＲ反応用プライマーとして使用される。ＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）はアガロースゲル電気泳動により精製されるとともに、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化され、これをもってＨｉｓ６−ＭｖｋはｐＱＥ−８０Ｌへとサブクローニングされる。最終的には、消化された断片がアガロース電気泳動により精製されるとともに同じ制限酵素により直線化されるｐＱＥ−８０Ｌへと連結され、結果として突然変異されたｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋとなる。
【００８３】
実施例３：出芽酵母メバロネートキナーゼ変異体のフィードバック耐性
メバロネートの調製および活性測定は、全く実施例１に記載のとおりに実施された。１μＭのＦＰＰが出芽酵母メバロネートキナーゼ野生型酵素およびその変異体で実施される阻害アッセイに使用された。
【００８４】
フィードバック耐性（％）は次式に従い計算された：
％耐性＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
式中、（ａ）および（ｂ）はＦＰＰの不在下および存在下各々における野生型酵素の測定された修飾メバロネートキナーゼ活性を、かつ（ｃ）および（ｄ）はＦＰＰの不在下および存在下各々における変異体酵素の測定されたメバロネートキナーゼ活性を言う。結果は表１に示され、なかでＷＴはＨｉｓ６タグ（配列番号３）を包含する非突然変異メバロネートキナーゼを表す。
【００８５】
【表１】
【００８６】
実施例４：フィードバック阻害に対する酵素の耐性に影響を有することが予め同定されるアミノ酸残基／位置における出芽酵母メバロネートキナーゼの飽和突然変異誘発
飽和突然変異誘発は、飽和突然変異誘発に供されるコドンがランダム化された配列より作られる手法で突然変異誘発プライマーが合成されることを除き、実施例２に記載されるとおりと同じ手法で行われる。
【００８７】
実施例５：フィードバック阻害耐性メバロネートキナーゼを使用するコエンザイムＱ１０の改良された産生
突然変異Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２ＭのコエンザイムＱ１０産生に対するインビボ効果を試験するため、出芽酵母メバロネートキナーゼ変異体Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ（配列番号５）をコードするＤＮＡがパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスへと導入されるとともに、野生型出芽酵母メバロネートキナーゼ（配列番号２）をコードするＤＮＡを保有するＰ．ゼアキサンチニファシエンス中のＣｏＱ１０産物と比較される。
【００８８】
プラスミド作成
プラスミドｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋ（実施例３を参照）が大腸菌へと実施例２に従い導入された。大腸菌株は３７℃でＬＢ培地（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），スパークス（Ｓｐａｒｋｓ），メリーランド州（ＭＤ），米国）中で成長させた。組換え大腸菌株中のプラスミドの維持のため、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）および／またはカナマイシン（２５〜５０μｇ／ｍｌ、実験に応じて）が培地に添加された。寒天（最終濃度１．５％）が固形培地として添加された。培養液は２００ｒｐｍの回転振盪機中で成長させた。
【００８９】
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２の部位ＳａｃＩとＮｓｉＩとの間に挿入されたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４がそのプロモーター領域を含むＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来のメバロネートオペロンを包含するため作成された（コバック（Ｋｏｖａｃｈ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）１６６，１７５−１７６頁，１９９５年）。クローン化メバロネートオペロンは、ジェンバンク／ＥＭＢＬ受託番号ＡＪ４３１６９６を有する配列のヌクレオチド２４６９から９００１由来の配列に対応する。ＳａｃＩ部位とメバロネートオペロン配列との間には短いリンカー配列があり、プラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州，米国）に由来するとともにＳａｃＩ部位からＰＣＲ断片挿入部位までの配列に対応する。
【００９０】
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株ＡＴＣＣ ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子の、Ｅｃｌ１３６ ＩＩとｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４のＳｐｅＩ部位との間のｃｒｔＥプロモーター領域制御下での導入の結果、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔとなった（ｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥの作成については、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例６を参照）。ＡＴＣＣ２１５８８（ｄｄｓＡｗｔ）株のｄｄｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号２９に示され、対応するアミノ酸配列は配列番号３０に表される。
【００９１】
ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔによるプラスミドが作成され、ここでプロモーター領域を含むＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来のメバロネートオペロン（上記参照）は、野生型出芽酵母メバロネートキナーゼ（配列番号２）をコードして結果としてｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔとなるＤＮＡか、出芽酵母メバロネートキナーゼ変異体Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ（配列番号５）をコードして結果としてｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ−Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔとなるＤＮＡかのいずれかにより置換される。
【００９２】
組換えＰ．ゼアキサンチニファシエンス株の作成
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株は２８℃で成長させる。Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスの培養に使用される培地の組成は以下に記載される。フラスコ中で成長させるＰ．ゼアキサンチニファシエンスの全ての培養液は、別段に特定されない限り、２００ｒｐｍの回転振盪機中で振盪される。寒天（最終濃度２％）が固形培地として添加される。培地がオートクレーブにより無菌化される時、無菌化後に所望の最終濃度を実現するようグルコースが（濃縮原液として）添加される。Ｆ培地は（１リットル蒸留水当たり）、１０ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、３０ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを包含する。ｐＨは、濾過またはオートクレーブによる無菌化前に７．０に調整される。培地３６２Ｆ／２は（１リットル蒸留水当たり）、３３ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのトリプトン、５ｇのＮａＣｌ、２．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを包含する。培地のｐＨは、濾過またはオートクレーブによる無菌化前に７．４に調整される。無菌化に続き、各２．５ｍｌ（１リットル最終溶液当たり）の微量元素溶液、ＮＫＰ溶液およびＣａＦｅ溶液が添加される。これら３溶液は濾過により無菌化される。微量元素溶液は（１リットル蒸留水当たり）、８０ｇの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、６ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、６ｇのＥＤＴＡを包含する。ＮＫＰ溶液は（１リットル蒸留水当たり）、２５０ｇのＫ２ＨＰＯ４，３００ｇの（ＮＨ４）２ＰＯ４を包含する。ＣａＦｅ溶液は（１リットル蒸留水当たり）、７５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、３．７５ｍｌの濃縮ＨＣｌを包含する。
【００９３】
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４のエレクトロコンピテントセルの調製および電気穿孔は次のとおり実施される：１００ｍｌのＦ培地は、１．５ｍｌのＰ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４の定常期培養物を接種されるとともに２８℃、２００ｒｐｍで、６６０ｎｍでの光学密度が約０．５に達するまで成長させる。細胞は、１５分間、４℃、７０００×ｇの遠心分離により収集されるとともにｐＨ７の氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液１００ｍｌ中で２回洗浄される。最終ペレットはｐＨ７の氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液０．１ｍｌ中で再懸濁されるとともに、細胞は直ちに電気穿孔に使用されるか、グリセロールが最終濃度１５％まで添加されるとともに細胞が−８０℃で５０μｌアリコート中に貯蔵されるかのいずれかである。１から５μｌのプラスミドＤＮＡが無塩溶液中に添加されるとともに電気穿孔が１８ｋＶ／ｃｍおよび１２９オームで氷冷１ｍｍキュベット中において実施される。パルス長は典型的には４と５ミリ秒との間である。１ｍｌのＦ培地が添加されるとともに細胞が２８℃で１時間インキュベートされる。希釈は２５〜５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＦ寒天平板上に塗られるとともに２８℃でインキュベートされる。推定形質転換体が所望のプラスミドを包含することがＰＣＲ分析により確認される。
【００９４】
コエンザイムＱ１０産生評価のための培養条件
コエンザイムＱ１０産生はＰ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔ、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ−Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔのフェドバッチ培養において試験される。全ての培養物は凍結細胞懸濁液（２５％グリセロールストックとして−８０℃で貯蔵される）から開始される。フェドバッチ発酵のための前培養物は各２００ｍｌの３６２Ｆ／２培地を包含する複製２リットルバッフル付き振盪フラスコ中で調製される。２ミリリットルの解凍細胞懸濁液が接種材料として各フラスコ中で使用される。前培養物の初期ｐＨは７．２である。前培養物は２８℃で２５０ｒｐｍの振盪とともに２８時間インキュベートされ、その時間の後６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６６０）は、使用される株に応じて１４と２２吸光度単位との間である。主な培養物は、次の組成（１リットル蒸留水当たり）：２５ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、１７ｇの酵母抽出物（タストーン（Ｔａｓｔｏｎｅ）９００）、４．０ｇのＮａＣｌ、６．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．０３８ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１３ｇのＭｎＳＯ４?Ｈ２Ｏ、０．００１ｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、０．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０６２ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのナイアシン、０．５ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍｌの消泡剤、３．５ｍｌのＫＰ溶液、を有する培地を包含するバイオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ） ＥＤ バイオリアクター（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）（Ｂ．ブラウン バイオテック・インターナショナル（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），メルスンゲン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ），ドイツ）中で成長させる。ＫＰ溶液の組成は（１リットル蒸留水当たり）、２５０ｇのＫ２ＨＰＯ４、２００ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４である。カナマイシン（最終濃度５０ｍｇ／ｌ）がプラスミド保有株用培地に添加される。全てのプロセスにおいて使用されるフィーディング溶液は次の組成を有する（１リットル蒸留水当たり）：５５０ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、１８．２５ｍｌのＫＰ溶液。バイオリアクター（接種後）の初期容量は８．０ｌである。前培養物は必要に応じて滅菌水で、バイオリアクターへの４００ｍｌの添加の結果として初期ＯＤ６６０値が０．５となるよう希釈される。発酵条件は次のとおり自動的に制御される：２８℃、ｐＨ７．２（２８％ＮＨ４ＯＨの添加で制御されるｐＨ）、攪拌により最小４０％相対値で制御される溶存酸素、３００ｒｐｍの最小攪拌および１ｖ．ｖ．ｍ．の通気速度（最終容量に対して）。培養はこれら条件下で約２０時間（バッチ段階）フィード溶液の添加なしに進められフィーディング段階に続く。この時間の後、攪拌速度の低下、塩基消費の休止、ｐＨ急上昇およびＣＯ２産生の低下が、初期グルコースが消耗されるとともにフィーディングが開始されることの指標である。標準的なフィードプロファイルは次のとおり定義される（フィーディング開始点から）：１７時間に５０ｇ／ｈから８０ｇ／ｈまで上昇、８０ｇ／ｈで７時間継続し、次の１１時間に５５ｇ／ｈまで下降、および残りの発酵のため５５ｇ／ｈで継続（総発酵時間＝７０時間）。主培養物の最終容量は約１０リットルである。
【００９５】
分析方法
全培養ブロス４００μｌが使い捨て１５ｍｌポリプロピレン遠心管に移される。１：１（ｖ／ｖ）（ＤＭＳＯ／テトラヒドロフラン）で安定抽出溶液４ミリリットル（０．５ｇ／ｌの３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン）が添加されるとともに、抽出物を増強するため試料が実験室の振盪機（ＩＫＡ，ドイツ）で２０分間混合される。最終的に、試料は遠心分離されるとともに上清がアンバーガラスバイアルへ逆相ＨＰＬＣによる分析のため移される。この方法はユビキノンおよびそれに対応するヒドロキノンの同時定量用に、ＣｏＱ１０のカロテノイド・ゼアキサンチン、フィトエン、β−クリプトキサンチン、β−カロテンおよびリコペンからの明確な分離に伴い、開発された。クロマトグラフィーは、温度制御オートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），米国）を使用して実施される。方法のパラメータは次のとおりであった：
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
コエンザイムＱ１０産生結果
上記のフェドバッチ培養条件下で、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ−Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔにより産生されるコエンザイムＱ１０の最終濃度は、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを保有するＲ１１４株について観測されたものより少なくとも５％高い。
【００９９】
実施例６：出芽酵母メバロネートキナーゼと相同であるメバロネートキナーゼ中の対応する残基の同定
種々のメバロネートキナーゼのマルチプルアミノ酸配列アラインメントが図１に示されるとおり計算された。「Ｍｖｋ＿ｙｅａｓｔ（酵母）」と命名される配列は配列番号１に対応し、「Ｍｖｋ−Ｐ−ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）」と命名される配列は配列番号６に対応する。
【０１００】
出芽酵母メバロネートキナーゼ（配列番号１）のアミノ酸配列の特異的アミノ酸位置に対応する次の残基が同定された（Ｍｖｋの供給源、すなわち各々の配列の受託番号を含む生物体名についてのさらなる参考に、図１の説明文を参照）。
【０１０１】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】プログラムのクラスタルＷ（バージョン１．８２，ＥＭＢＬ，ハイデルベルク，ドイツ）で計算される、様々な供給源（対応するアミノ酸／ヌクレオチド配列各々の受託番号および配列番号が示される）：マウス（ｍｏｕｓｅ）（スイスプロット受託番号Ｑ９Ｒ００８／ジェンバンク受託番号ＡＦ１３７５９８）、ラット（ｒａｔ）（スイスプロット受託番号Ｐ１７２５６／ジェンバンク受託番号Ｍ２９４７２）、ヒト（Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ（サピエンス）；スイスプロット受託番号Ｑ０３４２６／ジェンバンク受託番号Ｍ８８４６８），ファフィア・ロドジマ（Ｐ＿ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（ロドジマ）；配列番号８／９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓ＿ｐｏｍｂｅ（ポンベ）；スイスプロット受託番号Ｑ０９７８０／ジェンバンク受託番号ＡＢ０００５４１）、出芽酵母（ｙｅａｓｔ（酵母）；スイスプロット受託番号Ｐ０７２７７／ジェンバンク受託番号ＮＰ０１３９３５；配列番号１／２）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（Ａ＿ｐｅｒｎｉｘ（ペルニクス）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｙ９４６／ジェンバンク受託番号ＡＰ００００６４）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ＿ａｂｙｓｓｉ（アビシ）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｖ１８７／ジェンバンク受託番号ＡＪ２４８２８４）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐ＿ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ホリコシ）；スイスプロット受託番号Ｏ５９２９１／ジェンバンク受託番号ＡＢ００９５１５）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐ＿ｆｕｒｉｏｓｕｓ（フリオサス）；スイスプロット受託番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３／ジェンバンク受託番号ＡＥ０１０２６３）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍ＿ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（サーモオートトロフィカム）；スイスプロット受託番号Ｑ５０５５９／ジェンバンク受託番号Ｕ４７１３４）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａ＿ｆｕｌｇｉｄｕｓ（フルギダス）；スイスプロット受託番号Ｏ２７９９５／ジェンバンク受託番号ＡＥ０００９４６）、メタノコッカス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ヤンナスキ）；スイスプロット受託番号Ｑ５８４８７／ジェンバンク受託番号Ｕ６７５５１）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ＿ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）；配列番号６／７）からのメバロネートキナーゼ配列のマルチプル配列アラインメント。出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列（配列番号１）が、それに対する他の配列の位置、例えば上記に挙げられたものが参照される（表３も参照）アミノ酸番号付けの参考として使用される。配列番号１の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸が強調表示される。
【図１Ｂ】プログラムのクラスタルＷ（バージョン１．８２，ＥＭＢＬ，ハイデルベルク，ドイツ）で計算される、様々な供給源（対応するアミノ酸／ヌクレオチド配列各々の受託番号および配列番号が示される）：マウス（ｍｏｕｓｅ）（スイスプロット受託番号Ｑ９Ｒ００８／ジェンバンク受託番号ＡＦ１３７５９８）、ラット（ｒａｔ）（スイスプロット受託番号Ｐ１７２５６／ジェンバンク受託番号Ｍ２９４７２）、ヒト（Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ（サピエンス）；スイスプロット受託番号Ｑ０３４２６／ジェンバンク受託番号Ｍ８８４６８）、ファフィア・ロドジマ（Ｐ＿ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（ロドジマ）；配列番号８／９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓ＿ｐｏｍｂｅ（ポンベ）；スイスプロット受託番号Ｑ０９７８０／ジェンバンク受託番号ＡＢ０００５４１）、出芽酵母（ｙｅａｓｔ（酵母）；スイスプロット受託番号Ｐ０７２７７／ジェンバンク受託番号ＮＰ０１３９３５；配列番号１／２）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（Ａ＿ｐｅｒｎｉｘ（ペルニクス）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｙ９４６／ジェンバンク受託番号ＡＰ００００６４）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ＿ａｂｙｓｓｉ（アビシ）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｖ１８７／ジェンバンク受託番号ＡＪ２４８２８４）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐ＿ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ホリコシ）；スイスプロット受託番号Ｏ５９２９１／ジェンバンク受託番号ＡＢ００９５１５）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐ＿ｆｕｒｉｏｓｕｓ（フリオサス）；スイスプロット受託番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３／ジェンバンク受託番号ＡＥ０１０２６３）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍ＿ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（サーモオートトロフィカム）；スイスプロット受託番号Ｑ５０５５９／ジェンバンク受託番号Ｕ４７１３４）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａ＿ｆｕｌｇｉｄｕｓ（フルギダス）；スイスプロット受託番号Ｏ２７９９５／ジェンバンク受託番号ＡＥ０００９４６）、メタノコッカス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ヤンナスキ）；スイスプロット受託番号Ｑ５８４８７／ジェンバンク受託番号Ｕ６７５５１）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ＿ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）；配列番号６／７）からのメバロネートキナーゼ配列のマルチプル配列アラインメント。出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列（配列番号１）が、それに対する他の配列の位置、例えば上記に挙げられたものが参照される（表３も参照）アミノ酸番号付けの参考として使用される。配列番号１の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸が強調表示される。
【図１Ｃ】プログラムのクラスタルＷ（バージョン１．８２，ＥＭＢＬ，ハイデルベルク，ドイツ）で計算される、様々な供給源（対応するアミノ酸／ヌクレオチド配列各々の受託番号および配列番号が示される）：マウス（ｍｏｕｓｅ）（スイスプロット受託番号Ｑ９Ｒ００８／ジェンバンク受託番号ＡＦ１３７５９８）、ラット（ｒａｔ）（スイスプロット受託番号Ｐ１７２５６／ジェンバンク受託番号Ｍ２９４７２）、ヒト（Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ（サピエンス）；スイスプロット受託番号Ｑ０３４２６／ジェンバンク受託番号Ｍ８８４６８）、ファフィア・ロドジマ（Ｐ＿ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（ロドジマ）；配列番号８／９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓ＿ｐｏｍｂｅ（ポンベ）；スイスプロット受託番号Ｑ０９７８０／ジェンバンク受託番号ＡＢ０００５４１）、出芽酵母（ｙｅａｓｔ（酵母）；スイスプロット受託番号Ｐ０７２７７／ジェンバンク受託番号ＮＰ０１３９３５；配列番号１／２）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（Ａ＿ｐｅｒｎｉｘ（ペルニクス）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｙ９４６／ジェンバンク受託番号ＡＰ００００６４）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ＿ａｂｙｓｓｉ（アビシ）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｖ１８７／ジェンバンク受託番号ＡＪ２４８２８４）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐ＿ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ホリコシ）；スイスプロット受託番号Ｏ５９２９１／ジェンバンク受託番号ＡＢ００９５１５）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐ＿ｆｕｒｉｏｓｕｓ（フリオサス）；スイスプロット受託番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３／ジェンバンク受託番号ＡＥ０１０２６３）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍ＿ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（サーモオートトロフィカム）；スイスプロット受託番号Ｑ５０５５９／ジェンバンク受託番号Ｕ４７１３４）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａ＿ｆｕｌｇｉｄｕｓ（フルギダス）；スイスプロット受託番号Ｏ２７９９５／ジェンバンク受託番号ＡＥ０００９４６）、メタノコッカス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ヤンナスキ）；スイスプロット受託番号Ｑ５８４８７／ジェンバンク受託番号Ｕ６７５５１）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ＿ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）；配列番号６／７）からのメバロネートキナーゼ配列のマルチプル配列アラインメント。出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列（配列番号１）が、それに対する他の配列の位置、例えば上記に挙げられたものが参照される（表３も参照）アミノ酸番号付けの参考として使用される。配列番号１の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸が強調表示される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、フィードバック阻害に対し低感受性である修飾メバロネートキナーゼを提供する。修飾酵素および修飾酵素をコードするポリヌクレオチドが、イソプレノイド化合物の生産のため、メバロネートキナーゼ活性の低下を特徴とする疾患の治療のため、および診断目的のため使用され得る。
【０００２】
メバロネートキナーゼ（Ｍｖｋ）は、多数の細胞内イソプレノイドの産生を導くメバロン酸経路に必須の酵素である。メバロン酸経路の産物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、および異性体化合物であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が、全ての生物体におけるイソプレノイドの基本的構成要素である。イソプレノイドは２３，０００を超える一次代謝および二次代謝双方の自然発生分子を含む。この天然産物種の化学的多様性は全ての生物系におけるそれらの広範囲にわたる生理学的役割を反映する。イソプレノイドは、例えば、細菌中のホパントリテルペン、ユビキノンおよびメナキノン、植物中のカロテノイド、プラストキノン、モノ−、セスキ−、ジ−およびトリテルペン、およびクロロフィルのプレニル側鎖、および哺乳動物中のヘムＡ、キノン、ドリコール、ステロール／ステロイドおよびレチノイドを含む。加えて、イソプレノイドはイソペンテニルｔＲＮＡ、タンパク質プレニル化および、例えば細胞シグナル伝達タンパク質のヘッジホッグ類の、コレステロール修飾に関与する。
【０００３】
調節に関しては、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼがメバロン酸経路における律速酵素であると広く考えられている（例えば、ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ），ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４３，４２５−４３０頁，１９９０年；ワインベルガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ），Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７，１−６頁，１９９６年；ハンプトン（Ｈａｍｐｔｏｎ）ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１，１４０−１４５頁，１９９６年；ホーテン（Ｈｏｕｔｅｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，５７３６−５７４３頁，２００３年）。この見解と一致して、メバロネート培地の補充がファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（カロ（Ｃａｌｏ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７，５７５−５７８頁，１９９５年）とヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１，３３５−３３９頁，１９９１年）との双方においてカロテノイド産生を刺激することが分かっている。しかしながら、近年増える証拠は、メバロネートキナーゼが、例えば下流産物であるゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸およびゲラニルゲラニル二リン酸によりフィードバック阻害を受けやすいことを示す。このフィードバック阻害もまた、メバロン酸経路の、ひいてはイソプレノイド生合成全般の調節および律速に寄与し得る。
【０００４】
ヒトにおいては、メバロネートキナーゼの重要性は、その欠乏をヒト遺伝性疾患メバロン酸尿症および高免疫グロブリンＤ症候群ならびに周期熱症候群の生化学的および分子的原因とする同定により実証された（ホーテン（Ｈｏｕｔｅｎ）ら，２０００年；ンウォコロ（Ｎｗｏｋｏｒｏ）ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７４，１０５−１１９頁，２００１年）。これら疾患の病態生理はいまだ解明されていないが、いずれは急性期反応および発熱に関するメバロネートキナーゼおよびイソプレノイド生合成の生体内での役割への洞察を与えるであろう。メバロネートキナーゼ欠乏はまた、例えばツェルウェガー症候群および肢根型点状軟骨異形成症といった、メバロネートキナーゼを含むペルオキシソーム酵素のサブセットがペルオキシソームへと輸送されないペルオキシソーム生合成の疾患に関与しているとも見られる（ケリー（Ｋｅｌｌｅｙ）およびハーマン（Ｈｅｒｍａｎ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２，２９９−３４１頁，２００１年）。最終的には、メバロネートキナーゼは細胞増殖、細胞周期調節および／または細胞形質転換における役割を果たすことが提唱された（グレーフ（Ｇｒａｅｆ）ら，ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２０８，６９６−７０３頁，１９９５年；ヒンソン（Ｈｉｎｓｏｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２６７５６−２６７６０頁，１９９７年を参照）。
【０００５】
これまで研究されている全てのメバロネートキナーゼは、経路の下流産物、例えばファルネシルピロリン酸またはゲラニルゲラニルピロリン酸によりフィードバック阻害される。
【０００６】
このように、フィードバック阻害に対し低感受性または耐性である、もしくは非修飾メバロネートキナーゼのそれと比べ低減されたフィードバック阻害感受性を備える、すなわち改良された触媒特性を有する、修飾メバロネートキナーゼを提供することが本発明の目的である。フィードバック耐性メバロネートキナーゼ酵素は、例えば、（１）全ての種類のイソプレノイド化合物（例えば、カロテノイド、コエンザイムＱ１０、ビタミンＤ、ステロール等）の生物工学的生産における、（２）例えば生体液中のメバロネート濃度の酵素測定用の、診断用酵素として、または（３）メバロン酸尿症患者中のメバロネート濃度を低下させる治療用酵素として、産業上の可能性を有し得る。フィードバック耐性メバロネートキナーゼは、メバロン酸経路を通るより大きなフラックスを、ひいてはより高いイソプレノイド生産性を可能にし得ることから、特にイソプレノイドの生物工学的生産に適している。
【０００７】
特に、本発明は、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す修飾メバロネートキナーゼに関し、ここで
（ｉ）修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個の突然変異を包含し、かつ
（ｉｉ）少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。
【０００８】
メバロネート（メバロン酸）の５−ホスホメバロネート（５−ホスホメバロン酸）への、またはメバロネート類似体（例えばワイルド（Ｗｉｌｄｅ）およびエゲレア（Ｅｇｇｅｒｅｒ），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１，４６３−４７３頁，１９９４年により記載されるとおり）の対応するリン酸化化合物へのリン酸化触媒能を有するとともにフィードバック阻害感受性を示す任意の酵素が、本発明の目的のためのメバロネートキナーゼとして使用され得る。
【０００９】
用語「野生型酵素」または「野生型メバロネートキナーゼ」はこのように、本発明による（より高い）フィードバック耐性変異体設計のための出発点として役立ち得るフィードバック阻害感受性を示す任意のメバロネートキナーゼを意味する。かかる野生型酵素は例えば天然または合成メバロネートキナーゼの変異型に由来し得るメバロネートキナーゼ／メバロネートキナーゼ配列であってもよく、本発明の任意の教示により（より高い）フィードバック耐性にされ得る。かかるメバロネートキナーゼのアミノ酸配列の例は、例えばスイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）などの、公開の利用可能なデータベースにおいて探し当てられ得るものを含む。好ましくあるのは、例えば配列番号１および６、または配列番号８を含む、図１または表３に示されるアミノ酸配列の任意の１つと相同または同一であるような野生型酵素である。相同であるとは、例えば配列番号１および６、または配列番号８を含む、図１に示されるとおりのアミノ酸配列の１つまたはそれ以上と少なくとも約６０％が同一である、好ましくは少なくとも約７０％が同一である、より好ましくは少なくとも約８０％が同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９０％が同一である、最も好ましくは少なくとも約９５％が同一であるメバロネートキナーゼを言う。用語「野生型メバロネートキナーゼ」および「非修飾メバロネートキナーゼ」は本明細書においては互いに可換に使用される。
【００１０】
必要であれば、好適なリン酸供与体がメバロネート（またはメバロネート類似体）のリン酸化を供するため添加され得る。メバロネートキナーゼのためのリン酸化供与体として、例えばＡＴＰ、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰといった、種々の化合物が考えられ得る（ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら，エンザイム（Ｅｎｚｙｍｅ）４１，４７−５５頁，１９８９年を参照）。最も好ましいリン酸供与体はＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）である。
【００１１】
用語「％同一性」は、当該技術分野において周知のとおり、場合によってはかかる配列のストリング間の一致により決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の類似度を意味する。「同一性」は、例えば、プログラムＧＡＰ（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン１０．２、アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．）、９６８５ スクラントン・ロード（Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ）、サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ）９２１２１−３７５２、米国（ＵＳＡ））で例えば次のパラメータを使用する：ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）８、ギャップ伸張ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）２（デフォルトパラメータ）、プログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．２、アクセルリス社、９６８５ スクラントン・ロード、サン・ディエゴ、カリフォルニア州 ９２１２１−３７５２、米国）で例えば次のパラメータを使用する：ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸張ペナルティ４およびｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐマトリクス（デフォルトパラメータ）、またはプログラムのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ（バージョン１．７、ＥＭＢＬ、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））でＢＬＯＳＵＭ置換マトリクスを使用するなどの、周知の配列アラインメントの方法により容易に決定され得る。かかる配列アラインメントは当業者により日常的に実施されている（例えば、チョ（Ｃｈｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１２５７３−１２５７８頁、２００１年）。
【００１２】
「少なくとも１個の突然変異」をもって、本発明の修飾メバロネートキナーゼが、少なくとも上述の位置における１個を含む１個またはそれ以上の突然変異、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個等（すなわち、およびそれ以上）の突然変異を包含し得ることが意味される。
【００１３】
本発明の目的において、「変異体」、「変異体酵素」、または「変異体メバロネートキナーゼ」は、各々の野生型酵素より（より高い）フィードバック耐性である、または低減されたフィードバック阻害感受性を有する、所与の野生型酵素／メバロネートキナーゼに由来し得る任意の変異型であり得る。変異体は、例えば、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発／定向進化、細胞／生物体全体の化学的またはＵＶ突然変異誘発、合成遺伝子設計、および／またはインビトロ（無細胞）翻訳によるなど、当該技術分野で周知の任意の方法により得られてもよい（例えば、ジェルムテュス（Ｊｅｒｍｕｔｕｓ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，５３４−５４８頁、１９９８年；バトン（Ｂｅｔｔｏｎ），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４，７３−８０頁、２００３年；マルティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）３１，９４８−９５３頁、２００１年を参照）。変異体が如何にして得られるかは関連性がない。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「フィードバック阻害」はイソプレノイド生合成におけるメバロネートの下流代謝産物によるメバロネートキナーゼの酵素活性の任意の阻害を含む。イソプレノイド生合成におけるメバロネートの下流代謝産物は、５−ホスホメバロネート、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ファルネソール、ドリコールリン酸、およびフィチルピロリン酸を含むが限定はされない（ドーシー（Ｄｏｒｓｅｙ）およびポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３，４６６７−４６７０頁、１９６８年；フリント（Ｆｌｉｎｔ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２０，１４５−１５０頁、１９７０年；グレイ（Ｇｒａｙ）およびケクウィック（Ｋｅｋｗｉｃｋ），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２７９，２９０−２９６頁，１９７２年；ヒンソン（Ｈｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３８，２２１６−２２２３頁、１９９７年）。メバロネートキナーゼのフィードバック阻害はメバロネートキナーゼの、イソプレノイド生合成におけるメバロネートの下流代謝産物の酵素に結合することによるアロステリック制御に基づき得る。
【００１５】
好ましくは、フィードバック阻害は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）によるフィードバック阻害である。フィードバック阻害感受性は例えばメバロン酸経路の下流産物、例えばＦＰＰまたはＧＧＰＰの生理学的または工業的に適切な濃度に対する阻害感受性を意味する。
【００１６】
本発明によれば修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す。好ましくは、本発明の修飾メバロネートキナーゼのフィードバック阻害感受性は、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減弱される（フィードバック耐性の測定および定量化については、以下を参照）。このように、言い換えれば、本発明の修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のフィードバック耐性を示し得る。
【００１７】
本明細書で使用される「フィードバック耐性」は「フィードバック阻害」（上記に定義されるとおり）に対する任意の耐性増加であり得る。フィードバック耐性は当業者に周知の種々の方法で分析され得る。かかる分析の然るべき実施例が本明細書に簡潔に記載される：メバロネートキナーゼ活性は、活性アッセイにおいて、例えばＡＴＰ（または別のリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロネート類似体）の非飽和濃度で、すなわち、例えばその濃度前後で反応速度がそれら基質濃度変化に対し感受性をもつＡＴＰ（またはリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロネート類似体）濃度で、例えばそれら基質には研究中酵素の各Ｋｍ値前後の濃度で、測定される。野生型メバロネートキナーゼおよびこの酵素の変異型／変異体の双方の活性は、フィードバック阻害因子の適切な濃度、すなわち、野生型メバロネートキナーゼの有意な阻害を供するフィードバック阻害因子の濃度の不在下および存在下の双方で、その他は同一の条件下において、測定される。フィードバック阻害因子による阻害程度（例えば、％阻害）が野生型酵素に対するより変異体に対する方が小さい場合、ひいては変異体は本特許出願の文意におけるフィードバック耐性である。フィードバック耐性変異型／変異体が同定された時点で、上述と同じ手順がさらなる改良型変異体、すなわち、さらにより高いフィードバック耐性である変異体を同定するために適用され得る。フィードバック耐性（％）は次のとおり計算される：（ａ）および（ｂ）がフィードバック阻害因子（例えば、ＦＰＰ）の不在下および存在下各々における野生型酵素の測定されたメバロネートキナーゼ活性である場合、かつ（ｃ）および（ｄ）が同じフィードバック阻害因子の不在下および存在下各々における変異体酵素の測定されたメバロネートキナーゼ活性である場合、ひいては％フィードバック耐性は、
％耐性＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
【００１８】
好ましくは、フィードバック耐性は本出願の実施例１に記載される実験条件を参照する。約３〜３０ｍＵ／ｍｌ（出芽酵母メバロネートキナーゼの約４０〜４００ｎｇ／ｍｌに相当する）、好ましくは、約１０〜２０ｍＵ／ｍｌのメバロネートキナーゼ活性、および任意にＦＰＰ１μＭがアッセイ混合物中に存在してもよく、かつ反応は２５℃で行われ得る。
【００１９】
本発明の修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個の突然変異を包含する。少なくとも１個の突然変異は例えば添加、欠失および／または置換であり得る。好ましくは、少なくとも１個の突然変異はアミノ酸置換であり、非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列中に存在する所与のアミノ酸が、本発明の修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列中の異なるアミノ酸と置き換えられる。修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個のアミノ酸置換を包含し得る。さらなる実施形態において、修飾メバロネートキナーゼは対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５個の置換を包含する。本発明の他の実施形態において、修飾メバロネートキナーゼは対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時、１から１５、１から１２、１から１０、１から７、１から５、１から４、２から１５、２から１２、２から１０、２から７、２から５、２から４、３から１５、３から１２、３から１０、３から７、３から５または３から４個のアミノ酸置換を包含する。
【００２０】
本発明によれば、少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。配列番号１のこれらアミノ酸位置における突然変異の任意の組み合わせ、すなわち、上述のアミノ酸位置の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４箇所または少なくとも１５箇所全てに対応する位置における突然変異が、上記に定義されるとおりの修飾メバロネートキナーゼを生成するための少なくとも１個の突然変異の標的として選択され得る。好ましくは、本発明は出芽酵母から生じる修飾メバロネートキナーゼを提供し、ここで前記修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は少なくとも１個の突然変異を含んでなり、前記突然変異は１個またはそれ以上の突然変異を、配列番号１に示されるとおりの位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および／または３７５位において含み、ここで配列番号１は野生型アミノ酸配列を表す。
【００２１】
本発明における修飾メバロネートキナーゼは上記に定義されるとおり少なくとも１個の突然変異を１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置において包含することから、さらなる突然変異を上記に挙げられたもの以外のアミノ酸位置において包含し得る。
【００２２】
一態様において、本発明は、対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す修飾メバロネートキナーゼに関し、ここで
（ｉ）修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時、１個またはそれ以上の突然変異を包含し、かつ
（ｉｉ）１個またはそれ以上の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。
【００２３】
配列番号１に示されるこれら位置の任意の組み合わせ、すなわち、上述の位置に対応する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４箇所または１５箇所全ての位置が、前記修飾メバロネートキナーゼを生成するための突然変異の標的として選択され得る。
【００２４】
一実施形態において少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、１１７、および１５２位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである。
【００２５】
修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時、例えば単一アミノ酸置換などの単一突然変異のみを包含し得る。好ましくは、単一突然変異は配列番号１のアミノ酸位置５５、５９、６６、１１７、および１５２位に対応する位置からなる群より選択される位置においてである。より好ましくは、単一突然変異は、例えばＰ５５Ｌ、Ｆ５９Ｓ、Ｎ６６Ｋ、Ｃ１１７Ｓ、またはＩ１５２Ｍなどのアミノ酸置換である。最も好ましくは、置換はＦ５９Ｓ、すなわち、フェニルアラニンのセリンとの配列番号１の位置５９位に対応する位置上での置換／交換である。
【００２６】
修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時、例えば２個のアミノ酸置換などの少なくとも２個の突然変異を包含し得る。好ましくは、少なくとも２個の突然変異、例えばアミノ酸置換のうちの１個は、位置５５、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１５２、２１８、２４９、および／または３７５位より選択される配列番号１の位置に対応するアミノ酸位置においてである。２個の突然変異、例えばアミノ酸置換の場合、２個の突然変異は、配列番号１の位置の組み合わせ５５／１１７、６６／１５２、８３／２４９、１１１／３７５または１０６／２１８位に対応する位置においてであることが好ましい。より好ましくは、２個の突然変異は１個または２個のアミノ酸置換、さらにより好ましくは、２個のアミノ酸置換から成る。最も好ましくあるのは、Ｐ５５Ｌ／Ｃ１１７Ｓ、Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ、Ｋ８３Ｅ／Ｓ２４９Ｐ、Ｈ１１１Ｎ／Ｋ３７５ＮまたはＬ１０６Ｐ／Ｓ２１８Ｐより選択される配列番号１の位置の組み合わせに対応する２個のアミノ酸置換／交換の組み合わせである。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、修飾メバロネートキナーゼは配列番号１に示されるアミノ酸配列の組み合わせＮ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍに対応する２個のアミノ酸置換を包含する。より好ましくは、２個のアミノ酸置換は配列番号１に示されるとおりの非修飾出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列におけるＮ６６ＫおよびＩ１５２Ｍである。
【００２８】
修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼと比較した時、少なくとも４個の突然変異、例えば４個のアミノ酸置換などを包含し得る。好ましくは、少なくとも４個の突然変異、例えばアミノ酸置換のうち１個は、位置１４２、１５８、２３１、および３６７位より選択される配列番号１の位置に対応するアミノ酸位置においてである。４個の突然変異、例えばアミノ酸置換の場合、４個の突然変異は配列番号１の位置の組み合わせ１４２／１５８／２３１／３６７位に対応する位置においてであることが好ましい。より好ましくは、４個の突然変異は１、２、３または４個のアミノ酸置換、さらにより好ましくは、４個のアミノ酸置換から成る。最も好ましくあるのは、配列番号１の位置１４２／１５８／２３１／３６７位に対応する４個のアミノ酸置換の組み合わせであるＩ１４２Ｎ／Ｌ１５８Ｓ／Ｌ２３１Ｉ／Ｔ３６７Ｓである。
【００２９】
最も好ましくあるのは、表１に開示される突然変異の組み合わせである（下記参照）。実施例において同定されるアミノ酸位置は種々の起源のメバロネートキナーゼに移し替え得る。
【００３０】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは突然変異を対応する非修飾メバロネートキナーゼに導入することにより得られ得る。
【００３１】
非修飾メバロネートキナーゼは、例えばヒトを含む動物、植物、藻類、酵母を含む菌類、および細菌などの、真核生物または原核生物起源であり得る。好ましくは、非修飾メバロネートキナーゼは、酵母を含む菌類からまたは細菌から選択され、より好ましくは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）からなる群より選択される。さらにより好ましくは、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、出芽酵母、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒ．スフェロイデス（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ ３５０５３などのロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、またはファフィア・ロドジマであり、出芽酵母が最も好ましくある。
【００３２】
本発明の一態様において、非修飾メバロネートキナーゼはＦＰＰによりフィードバック阻害される。ＦＰＰによる非修飾メバロネートキナーゼのフィードバック阻害は、例えばポピヤック（Ｐｏｐｊａｋ）（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５，３９３−頁，１９６９年）、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら（エンザイム（Ｅｎｚｙｍｅ）４１，４７−５５頁，１９８９年）、ヒンソン（Ｈｉｎｓｏｎ）ら（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３８，２２１６−２２２３頁，１９９７年）、シュルト（Ｓｃｈｕｌｔｅ）ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，２４５−２５４頁，１９９９年）、またはチョ（Ｃｈｏ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１２５７３−１２５７８頁，２００１年）により記載されるとおりなど、当業者に周知の方法により決定されるとおり、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％であり得る。特定のアッセイが、種々のＦＰＰ濃度を使用して実施例１に記載される。
【００３３】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは、好ましくはそのＮまたはＣ末端において、外来アミノ酸を含んでなる。「外来アミノ酸」は、天然の（自然のなかで発生する）メバロネートキナーゼ中に存在しないアミノ酸、例えば天然メバロネートキナーゼ中に存在しない少なくとも約３連続、好ましくは少なくとも約５連続およびより好ましくは少なくとも約７連続アミノ酸の一続きなどを意味する。好適な外来アミノ酸の一続きは、組換え産生された修飾メバロネートキナーゼの精製を円滑にする「タグ」を含むが限定はされない。かかるタグの例はＨｉｓ６タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、および同類のものを含むが限定はされない。
【００３４】
別の実施形態では、修飾メバロネートキナーゼは、対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時、１個またはそれ以上の欠失、例えば、２個の欠失を包含し得る。好ましくは、欠失は、対応する非修飾メバロネートキナーゼのＮまたはＣ末端アミノ酸に影響するとともに、酵素の機能特性、例えば比活性を有意には減弱しない。
【００３５】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは通常、非自然発生的メバロネートキナーゼである。修飾メバロネートキナーゼの比活性は、例えば、対応する非修飾メバロネートキナーゼの比活性の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％およびさらにそれ以上、例えば約１５０％、２００％およびそれ以上などであり得る。
【００３６】
比活性の測定方法は当業者に周知である。比活性は例えばＮＡＤＨの消費測定を介して決定され得る。かかる測定に好適な条件は、典型的に飽和基質濃度が使用されること、または高基質濃度、特定の実験条件下で最大活性を与える基質濃度での酵素阻害の場合を除き、例えば実施例１に概説されるとおりのものであり得る。
【００３７】
本発明はさらに、本発明による修飾メバロネートキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドに関する。任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド、例えば非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡもしくは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡなどが、ポリヌクレオチドとして使用され得る。ポリヌクレオチドは、一本および二本鎖ＤＮＡ、一本および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本および二本鎖ＲＮＡ、および一本および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には二本鎖または一本および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を含むが限定はされない。本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドはさらに、１個またはそれ以上の異常塩基、例えばイノシン、もしくは１個またはそれ以上の修飾塩基、例えばトリチル化された塩基、を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野において周知の突然変異誘発法、例えば、例えば添加、欠失および／または置換などの突然変異の、非修飾メバロネートキナーゼをコードするヌクレオチド配列への、例えば部位特異的な突然変異およびＰＣＲに基づく方法による導入などによって、例えば最新技術において周知のメバロネートキナーゼをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ配列［配列情報については、例えば適切な配列データベース、例えば、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ），カリフォルニア州（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），米国）、欧州生命情報学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ヒンストン・ホール（Ｈｉｎｓｔｏｎ Ｈａｌｌ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），英国（ＧＢ））、ＮＢＲＦ（ジョージタウン大学（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），メディカル・センター（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ），ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）ＤＣ，米国）およびベクベース（Ｖｅｃｂａｓｅ）（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ），バイオテクノロジー・センター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅ），マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ），ウィスコンシン州（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ），米国）を参照］から開始することにより作成される非修飾メバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を修飾することにより容易に得られ得る（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理は、例えば、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．５，１８５−１８９頁，１９８９年により概説されるが、改良された方法が例えばイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら［ＰＣＲプロトコル：方法と応用のための手引（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）（１９９０年）］に記載される。
【００４０】
修飾メバロネートキナーゼの生成は、部位特異的な突然変異誘発、当初はハッチソン（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ）およびエッジェル（Ｅｄｇｅｌｌ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８，１８１−１８９頁，１９７１年）により概説されている、所望のヌクレオチド置換、欠失または添加を突然変異が導入されるべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域へ運搬する合成オリゴヌクレオチドのアニーリングを伴う方法により実施され得る（レビューについて、スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９，４２３−４６２頁，１９８５年を参照；および改良された方法について、スタンセン（Ｓｔａｎｓｓｅｎ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，４４４１−４４５４頁，１９８９年における参考文献２〜６を参照）。出発物質としてのＤＮＡは、当該技術分野において周知の、および例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ））に記載される方法により各株／生物体から単離され得る。しかしながら、本発明に従い作成／突然変異されるべきメバロネートキナーゼをコードするＤＮＡはまた、例えば、当該技術分野において周知の方法による合成遺伝子の作成により、周知のＤＮＡ配列の塩基上に調製され得ることも分かっている（例えば、欧州特許第７４７ ４８３号明細書中およびレーマン（Ｌｅｈｍａｎｎ）ら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１３，４９−５７頁，２０００年に記載のとおり）。
【００４１】
本発明に従い修飾メバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例が配列番号５に示される。
【００４２】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形で提供されるとともに、好ましくは均一に精製される。
【００４３】
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然発生的であるなら自然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、微生物生体中に存在する自然発生的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、自然系における共存物質の一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部分であり得、および／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成の一部分であり得、かつかかるベクターまたは組成はその自然環境の一部分でないという点において、それでも単離されている。
【００４４】
本明細書で使用される単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、それが由来する生物体中の自然発生ゲノムにおいてはそれと直接隣接するコード配列の双方（１つは５’末端上および１つは３’末端上）と直接隣接しないＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。このように、一実施形態において、核酸はコード配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部または全てを含む。それ故、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられる組換えＤＮＡ、もしくは、他の配列に依存しない個別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。それはまた、実質的に細胞物質、生体物質、または培地のない（組換えＤＮＡ技術による産生時）、もしくは化学的前駆体または他の化学薬品のない（化学的合成時）、付加的なポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として自然発生的でないとともに自然状態には見出されないであろう核酸断片である。当業者に周知の従来の核酸精製法が単離されたポリヌクレオチドを得るため使用され得る。
【００４５】
単離されたポリペプチドは実質的に他のポリペプチドのないポリペプチドであり得る。単離されたポリペプチドは、例えば、８０％より高純度、好ましくは９０％より高純度、より好ましくは９５％より高純度、および最も好ましくは９９％より高純度であり得る。純度は当該技術分野において周知の方法に従い、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くタンパク質染色により決定され得る。タンパク質バンドは例えば濃度測定により定量され得る。さらなる純度決定方法は当業者レベルの範囲である。
【００４６】
いまだ別の実施形態において本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたはプラスミドに関連する。ベクターまたはプラスミドは、好ましくは少なくとも１個のマーカー遺伝子を含んでなる。ベクターまたはプラスミドはさらに、本発明のポリヌクレオチドに操作可能に連結される調節エレメントを含んで成ってもよい。本明細書で使用されるとき用語「操作可能に連結」は、例えば、一方の機能が他方により影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を言う。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響する能力がある、すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある時、コード配列と操作可能に連結される。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンスの配向で操作可能に連結され得る。用語「発現」はＤＮＡ配列のｍＲＮＡへの転写および／またはｍＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳を示す。用語「過剰発現」は、例えば、改変生物体（例えば、形質転換または形質移入により改変された）中の対応する非改変生物体中の産物レベルを超える遺伝子産物の産生を意味する。
【００４７】
然るべき宿主系中のコードされたポリペプチドを過剰発現するための、本発明における修飾メバロネートキナーゼをコードするＤＮＡ配列のベクターへの組込みは、当該技術分野において周知の、および例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記参照）に記載の方法により実施され得る。ＤＮＡ配列自体または本発明におけるＤＮＡ配列を含んでなるベクター／プラスミドのいずれかが、コードされたポリペプチドの（過剰）発現を得るため好適な本発明の宿主系を形質転換することに使用され得る。本発明に有用である好適な宿主系は、真核生物または原核生物細胞、例えばヒトを含む動物、植物、細菌、または酵母を含む菌類の細胞より選択され得る。かかる宿主細胞の例は、レンサ球菌、ブドウ球菌、腸球菌、ラン藻、酵母（例えば、サッカロミセス属）、担子菌、裸子植物、被子植物、または例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＫ２９３［ヒト腎２９３株化細胞？？？］、およびＣＶ−１などの株化細胞より選択される細胞を含むが限定はされない。
【００４８】
植物における発現に好適な方法が、例えばペン（Ｐｅｎ）らによりバイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１，８１１−８１４頁，１９９４年または欧州特許第４４９ ３７５号明細書に記載され、好ましくは例えば欧州特許第４４９ ３７６号明細書に記載されるとおり種子においてである。プロモーターおよびターミネーターの好適な例の一部は、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものを含む。使用され得る効果的な植物プロモーターの１種は、高レベル植物プロモーターである。かかるプロモーターは、本発明の遺伝子配列と操作可能に連結され、本遺伝子産物の発現を促進する能力があるべきものである。本発明において使用され得る高レベル植物プロモーターは、例えば、例えばダイズ由来のリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー（Ｂｅｒｒｙ）−ロウ（Ｌｏｗｅ））ら，Ｊ．ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，４８３−４９８頁，１９８２年）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターを含む。
【００４９】
本発明の範囲内で真菌宿主細胞は、例えば、クロカビまたはコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などのトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、出芽酵母などのサッカロミセス属、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）より選択され得、好ましくはＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＤＳＭ ５２１５である。本発明の範囲内で細菌宿主細胞は、例えば、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスなどのパラコッカス属、Ｒ．スフェロイデス（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）などのロドバクター属、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）などのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）より選択され得る（例えば、アンネ（Ａｎｎｅ）およびヴァン・メラエルト（ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ）のＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１４，１２１−１２８頁，１９９３年を参照）。好ましくは、使用され得る大腸菌株は、例えば、例えばＭ１５（ヴィラレヨ（Ｖｉｌｌａｒｅｊｏ）らによりＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２０，４６６−４７４頁，１９７４年にＤＺ ２９１として記載される）、ＨＢ １０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）または大腸菌ＳＧ１３００９（ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８，２６５−２７３頁，１９８１年）などの、大腸菌Ｋ１２株より選択され得る。当業者には、かかる好適な宿主が、例えばジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ）『工業所有権（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ）』（第１巻，２９−４０頁，１９９１年）に、または欧州特許庁公報（Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ）（第４巻，１５５／１５６頁，２００３年）に挙げられるとおりの、任意の周知の寄託当局から入手可能であり得ることは周知である。
【００５０】
宿主系に応じ、種々のベクターが使用され得、前記ベクターは本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる。菌類における発現に使用され得るベクターの非限定的な例は当該技術分野において周知であるとともに、例えば、欧州特許第４２０ ３５８号明細書またはキュラン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら、（バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，３６９−３７６頁，１９８７年）、ワード（Ｗａｒｄ）（糸状菌のための分子工業菌学、システムおよび応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ），マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９１年）、アプシャル（Ｕｐｓｈａｌｌ）ら（バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，１３０１−１３０４頁，１９８７年）、グウィンヌ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら（バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，７１−７９頁，１９８７年）、またはプント（Ｐｕｎｔ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１９−３４頁，１９９１年）、および酵母についてはスレークリシャナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら（Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，２６５−２７８頁，１９８８年；バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８，４１１７−４１２５頁，１９８９年）、ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎｎ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９３，７１７−７２２頁，１９８１年）または欧州特許第１８３ ０７０号明細書、欧州特許第１８３ ０７１号明細書、欧州特許第２４８ ２２７号明細書、欧州特許第２６３ ３１１号明細書に記載されている。大腸菌における発現に使用され得るベクターの非限定的な例は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより［上記参照］、またはファイアス（Ｆｉｅｒｓ）らにより、第８回国際バイオテクノロジーシンポジウム会報（Ｐｒｏｃ．８ｔｈ Ｉｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｙｍｐ．）のなかで［Ｓｏｃ．Ｆｒａｎｃ．ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，パリ（Ｐａｒｉｓ）（デュラン（Ｄｕｒａｎｄ）ら編），６８０−６９７頁，１９８８年］、ビェジャール（Ｂｕｊａｒｄ）ら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ウー（Ｗｕ）およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ）編，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），第１５５巻，４１６−４３３頁，１９８７年のなかで）、またはステューバー（Ｓｔｕｅｂｅｒ）ら（免疫学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ），レフコヴィッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）およびペルニス（Ｐｅｒｎｉｓ）編，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），第ＩＶ巻，１２１−１５２頁，１９９０年のなかで）述べられている。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｉ）における発現に使用され得るベクターの非限定的な例は当該技術分野において周知であるとともに、例えば、欧州特許第２０７ ４５９号明細書または欧州特許第４０５ ３７０号明細書に、ヤンスラ（Ｙａｎｓｕｒａ）およびヘンナー（Ｈｅｎｎｅｒ）により全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８１，４３９−４４３頁（１９８４年）に、またはヘンナー（Ｈｅｎｎｅｒ）、ルグリス（Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ）およびナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）によりＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，１９９−２２８頁，１９９０年に記載されている。Ｈ．ポリモルファにおける発現に使用され得るベクターの非限定的な例は当該技術分野において周知であるとともに、例えば、ジェリッセン（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ）ら，バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９，２９１−２９５頁，１９９１年に記載されている。
【００５１】
いずれのかかるベクターも調節エレメント、例えばプロモーターを既に保有し、または本発明のＤＮＡ配列はかかるエレメントを包含するよう改変され得る。使用され得る好適なプロモーターエレメントは、当該技術分野において周知であるとともに、例えば、トリコデルマ・リーセイ用にｃｂｈ１プロモーター（ハーキ（Ｈａａｒｋｉ）ら，バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７，５９６−６００頁，１９８９年）またはｐｋｉ１プロモーター（シンドラー（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）１３０，２７１−２７５頁，１９９３年）、コウジカビ用にａｍｙプロモーター［クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら，第１９回分子遺伝学に関するルンテレン講座要約（Ａｂｓｔｒ．１９ｔｈ Ｌｕｎｔｅｒｅｎ Ｌｅｃｔｕｒｅｓ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｆ２３（１９８７年）；クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら，バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６，１４１９−１４２２頁，１９８８年；タダ（Ｔａｄａ）ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２９，３０１−３０６頁，１９９１年］、クロカビ用にｇｌａＡプロモーター（キュラン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，３６９−３７６頁，１９８７年；グウィンヌ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，７１３−７１９頁，１９８７年；ワード（Ｗａｒｄ）の糸状菌のための分子工業菌学、システムおよび応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ），マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），８３−１０６頁，１９９１年）、ａｌｃＡプロモーター（グウィンヌ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，７１８−７１９頁，１９８７年）、ｓｕｃ１プロモーター（ボディ（Ｂｏｄｄｙ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４，６０−６６頁，１９９３年），ａｐｈＡプロモーター（マクリー（ＭａｃＲａｅ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）７１，３３９−３４８頁，１９８８年；マクリー（ＭａｃＲａｅ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）１３２，１９３−１９８頁，１９９３年）、ｔｐｉＡプロモーター（マクナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）ら，セル（Ｃｅｌｌ）４６，１４３−１４７頁，１９８６年；アップシャル（Ｕｐｓｈａｌｌ）ら，バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５，１３０１−１３０４頁，１９８７年）、ｇｐｄＡプロモーター（プント（Ｐｕｎｔ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）６９，４９−５７頁，１９８８年；プント（Ｐｕｎｔ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１９−３７頁，１９９１年）およびｐｋｉＡプロモーター（ドグラフ（ｄｅ Ｇｒａａｆｆ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２２，２１−２７頁，１９９２年）である。酵母における発現に使用され得る好適なプロモーターエレメントは当該技術分野において周知であるとともに、例えば、出芽酵母における発現用にｐｈｏ５プロモーター（フォゲル（Ｖｏｇｅｌ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，２０５０−２０５７頁，１９８９年；ルドルフ（Ｒｕｄｏｌｆ）およびヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ），全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８４，１３４０−１３４４頁，１９８７年）またはｇａｐプロモーター、およびピキア・パストリス用に例えばａｏｘ１プロモーター（クッツ（Ｋｏｕｔｚ）ら，イースト（Ｙｅａｓｔ）５，１６７−１７７頁，１９８９年；スレークリシャナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，２６５−２７８頁，１９８８年）、またはＨ．ポリモルファ用にＦＭＤプロモーター（ホレンベルグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら，ＥＰＡ番号０２９９１０８）またはＭＯＸプロモーター（ルドボア（Ｌｅｄｅｂｏｅｒ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３，３０６３−３０８２頁，１９８５年）である。
【００５２】
好適なプロモーターは、例えばジャコミニ（Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ）ら（ジーン（Ｇｅｎｅ）１４４，１７−２４頁，１９９４年）に記載されるとおり天然および合成プロモーターを含む。細菌中の主張される（変異体）メバロネートキナーゼの発現に対する然るべき教示、然るべきプラスミドによるか、またはメバロネートキナーゼをコードするＤＮＡ配列の染色体ＤＮＡへの組込みを通してかのいずれかが、例えば米国特許第６，３２２，９９５号明細書といった多所に散見され得る。
【００５３】
本発明はさらに、本発明の修飾メバロネートキナーゼを産生する方法／プロセスに関し、
（ａ）本発明の修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および
（ｂ）細胞から、または培地から修飾メバロネートキナーゼを回収するステップ、を含んでなる。
【００５４】
本発明の修飾メバロネートキナーゼは遺伝子改変宿主細胞から調製され得る。
【００５５】
本発明のポリペプチドの組換え産生のため、宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターまたはプラスミドを組み入れるよう遺伝子改変され得る。ポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験マニュアルに記載される手法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン脂質介在トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、バリスティック導入および感染などにより実効され得る［参考文献として、例えば、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら，分子生物学における基礎的手法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８６年）、およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第２版，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）（１９８９年）を参照］。
【００５６】
宿主中においてポリヌクレオチドを維持、増殖または発現する、および／またはポリペプチドを発現するのに好適な任意の系またはベクターが、他のなかでもとりわけ上記のものを含め、本発明のメバロネートキナーゼの発現／産生に使用され得る。
【００５７】
真核生物中の組換え発現系において、翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔への、細胞膜周辺腔への、または細胞外環境への分泌のため、然るべき分泌シグナルが発現ポリペプチドへと組み入れられ得る。これらのシグナルはポリペプチドに対し内因性であり得るか、または異種シグナルであり得る。
【００５８】
本発明のポリペプチドは組換え細胞培養物から、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む十分に周知の方法により回収および精製され得る。一実施形態において、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられ得る。タンパク質リフォールディング用の十分に周知の技術が、単離および／または精製中にポリペプチドが変性される時活性コンフォメーションを再生するため用いられる。タンパク質精製の方法は、例えば、ドイッチェアー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ），タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９０年； およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ），タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ），ハイデルベルク，１９９４年に記載される。
【００５９】
多様な培養方法論が本発明のタンパク質を産生するため適用され得る。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特異的遺伝子産物の大規模産生は、例えばバッチ、フェドバッチ、連続または半連続培養方法論により産生され得る。様々な培養法の詳細は、例えば、トーマス・Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）のバイオテクノロジー：工業微生物学の教科書（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），第２版（１９８９年）シノエール・アソシエイツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ），Ｍａｓｓ．，またはデシュパンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，２２７−２３４頁、１９９２年に見出され得る。
【００６０】
発酵培地は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはショ糖などの少糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類もしくはそれらの混合物および再生可能原料由来の未精製混合物を含むが限定はされない好適な炭素基質を包含し得る。本発明において利用される炭素源は多種多様な炭素含有基質を網羅し得るとともに生物体の選択に依存する。
【００６１】
本発明はさらに、低減されたフィードバック阻害感受性を有する修飾メバロネートキナーゼの調製のための方法／プロセスに関し、次のステップを含んでなる：
（ａ）フィードバック阻害感受性を示す第１のメバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ、
（ｂ）１個またはそれ以上の突然変異をポリヌクレオチド配列へと導入することで、第１のメバロネートキナーゼと比較した時少なくとも１個のアミノ酸突然変異を包含し、ここで少なくとも１個のアミノ酸突然変異は配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである第２のメバロネートキナーゼを、突然変異ポリヌクレオチド配列がコードするステップ、
（ｃ）ベクターまたはプラスミド内に突然変異ポリヌクレオチドを任意に挿入するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを好適な宿主細胞へと導入するステップ、および
（ｅ）低減されたフィードバック阻害感受性を有する修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養するステップ。
【００６２】
この方法の好ましい実施形態は、修飾メバロネートキナーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド、宿主細胞、および本明細書に記載される方法の好ましい実施形態に対応する。第１および第２のメバロネートキナーゼは、各々非修飾および修飾メバロネートキナーゼに対応する（上記を参照）。
【００６３】
本発明はさらに、イソプレノイド産生のための方法またはプロセスに関し、
（ａ）本発明の宿主細胞を好適な培地において宿主細胞中の修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下で培養するステップ、および
（ｂ）イソプレノイドを培地から任意に分離するステップ、を含んでなる。
【００６４】
好ましくは、本発明の修飾メバロネートキナーゼはイソプレノイドの産生増加に使用される。
【００６５】
かかる方法／プロセスは、任意の種類のイソプレノイドまたはイソプレノイド化合物の生物工学的産生に使用され得る。メバロネートに由来し得る任意の代謝産物およびプレニル化高分子が本特許出願の文意におけるイソプレノイドとして使用され得る。これらイソプレノイドは天然経路または非天然経路（すなわち、自然中で発生しないが、生物工学的に改変された経路）のいずれからも生成され得る。かかるイソプレノイドの非限定的な例は、ホパントリテルペン、キノン、カロテノイド、モノ−、セスキ−、ジ−およびトリテルペン、クロロフィルのプレニル側鎖、ヘムＡ、ドリコール、ステロール／ステロイド、レチノイド、およびゴムまたはゴム誘導体、好ましくは天然ゴム（＝ｃｉｓ−１，４−ポリイソプレン；ムーイブルック（Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ）およびコルニッシュ（Ｃｏｒｎｉｓｈ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３，３５５−３６５頁、２０００年）を含む。
【００６６】
本発明の範囲内でキノンは、例えば、ユビキノン（＝コエンザイムＱ）、メナキノン、プラストキノンおよびアントラキノン、好ましくはコエンザイムＱ６、コエンザイムＱ７、コエンザイムＱ８、コエンザイムＱ９、コエンザイムＱ１０またはコエンザイムＱ１１より選択され得、および最も好ましくはコエンザイムＱ１０である（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、プロトプラズマ（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ）２１３，１３４−１４７頁、２０００年；ハン（Ｈａｎ）ら，植物細胞組織器官培養（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）６７，２０１−２２０頁、２００１年；カワムカイ（Ｋａｗａｍｕｋａｉ）、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４，５１１−５１７頁、２００２年）。本発明の範囲内でカロテノイドは、例えば、フィトエン、リコピン、α−、β−およびγ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、アドニキサンチン、エチネノン、カンタキサンチン、アスタキサンチンおよびそれらの誘導体より選択され得る（ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）＆シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，１６９−１８１頁，１９９８年；ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，１２２６−１２２９頁，１９９８年；ヒルシュベルグ（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１８６−１９１頁、１９９９年；マルガリス（Ｍａｒｇａｌｉｔｈ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１，４３１−４３８頁，１９９９年；シュミット−ダンネルト（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，２５５−２６１頁，２０００年；サンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８５，４−１２頁，２００１年；リー（Ｌｅｅ）およびシュミット−ダンネルト（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０，１−１１頁、２００２年）。本発明の範囲内でステロールは、例えば、エルゴステロール、コレステロール、ヒドロコルチゾン（メナード・スッチェバラ（Ｍｅｎａｒｄ Ｓｚｃｚｅｂａｒａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１４３−１４９頁，２００３年）、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、食事性植物ステロール（リン（Ｌｉｎｇ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７，１９５−２０６頁，１９９５年）および天然界面活性物質（ホルムバーグ（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．６，１４８−１５９頁，２００１年）およびそれらの誘導体より選択され得る。
【００６７】
上記で定義されたとおりの イソプレノイドまたはイソプレノイド化合物の産生に好適な宿主細胞は、遺伝子改変を受け入れやすい全ての種類の生物体、例えば、細菌、酵母を含む菌類、藻類、植物またはヒト細胞を含む動物細胞などであり得る。これら宿主細胞は、本発明の修飾メバロネートキナーゼの発現について上記で定義されるものと同じであり得る。遺伝子的および代謝的改変の方法は当業者に周知である（例えば、ベルポールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１，４６７−４７９頁、１９９９年；ベルポールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ）ら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９，３２３−３４３頁，２０００年；バルコヴィッチ（Ｂａｒｋｏｖｉｃｈ）およびリャオ（Ｌｉａｏ）、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．３，２７−３９頁、２００１年）。同様に、イソプレノイドおよびイソプレノイド化合物に（潜在的に）好適な精製方法は当該技術分野において十分に周知である。
【００６８】
本発明によるイソプレノイドの生物工学的産生のための方法／プロセスは、例えば上記のとおりの細胞全体の発酵プロセス、透過処理された宿主細胞、粗細胞抽出物、例えば遠心分離または濾過といった任意の好適な方法により細胞レムナントから純化される細胞抽出物、または単離された酵素での再構成された反応経路によってさえ、実施され得る。またかかるプロセスの組み合わせは本発明の範囲にありもする。無細胞生合成（例えば再構成された反応経路によるなど）の場合、酵素が如何にして調製されたか、例えば、宿主細胞からの単離によって、インビトロ転写／翻訳によって、またはいまだ当該技術分野において周知の他の手段によってなどには無関係である。
【００６９】
上記のとおり修飾Ｍｖｋを使用する、例えばコエンザイムＱ１０などのイソプレノイドの産生は、非修飾Ｍｖｋを使用する同じイソプレノイドの産生と比較した時、例えば少なくとも約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％またはそれ以上増加し得る。所与の試料中におけるイソプレノイド化合物の濃度測定の一手法が、実施例５に記載される。
【００７０】
本発明の別の態様は、メバロネートキナーゼの活性低下に付随する疾患治療用薬物の製造のための、本発明の修飾メバロネートキナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。かかる疾患はメバロン酸尿症、または高免疫グロブリンＤ症候群および周期熱症候群を含むが限定はされない。本発明の修飾メバロネートキナーゼは治療酵素として投与されることが好ましい。好適な投与様式は、例えば、経口、非経口、腹腔内および／または皮下投与であり得る。本発明の修飾メバロネートキナーゼは、少なくともかかる酵素の１個を単独で含んでなる、または例えば薬剤的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤との混合物における医薬組成物（例えば、顆粒剤、酵素結晶、錠剤、丸剤、カプセル、注射、溶液、および同類のもの）として処方され得る。医薬組成物は従来の方法に従って処方され得る。任意の特定患者に特異的な用量レベルが、例えば用いられる特異的化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および治療中の特定疾患の重症度を含む多様な要因に応じて用いられ得る。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドは遺伝子治療プロトコルに使用され得る。
【００７２】
本発明のさらに別の態様は、生体液中のメバロネート濃度を決定するための、本発明の修飾メバロネートキナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。生体液の非限定的な例は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、涙、汗、ならびに他の細胞内液、細胞間液および／または細胞外液を含む。
【００７３】
上記のとおりの修飾メバロネートキナーゼをコードする核酸配列、ベクター、好ましくはかかるポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、かかるポリヌクレオチドまたはベクターにより形質転換された宿主細胞、上記のとおりの宿主細胞が好適な培養条件下で培養されるとともにメバロネートキナーゼがかかる宿主細胞または培地から当該技術分野において周知の方法により単離される本発明の修飾メバロネートキナーゼの調製のためのプロセス、およびかかるポリヌクレオチドまたはベクターにより形質転換され、および／またはかかるポリヌクレオチドをその染色体へと安定的に組み込まれた宿主細胞に基づくイソプレノイドの生物工学的産生のためのプロセスを含んでなるポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。
【００７４】
（ｉ）本発明の特異的突然変異の少なくとも１個を保有するメバロネートキナーゼをコードするとともに標準条件下で本発明の特異的修飾メバロネートキナーゼの任意のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、または（ｉｉ）本発明の特異的突然変異の少なくとも１個を保有するメバロネートキナーゼをコードするものの、遺伝暗号の縮重のためハイブリダイズしないが、標準条件下で本発明の特異的修飾メバロネートキナーゼの任意のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列と全く同じアミノ酸配列を備えたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）それがその断片であるところのポリペプチドの活性特性を維持するようなＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列を提供することもまた本発明の目的である。
【００７５】
ハイブリダイゼーションのための「標準条件」は文意において、当業者により特異的なハイブリダイゼーションシグナルを検出するため一般に使用されるとともに例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、『分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）』、第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）１９８９年、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載される条件、または当業者が精通しているとともに例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記参照）に記載される、好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特異的例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中において４２℃で一晩のインキュベーション（例えば、１５時間）の後、ハイブリダイゼーション支持体を０．１×ＳＳＣ中において約６５℃で１０分間×３回洗浄する。
【００７６】
いわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、本発明の具体的に記載されたＤＮＡ配列の塩基上で設計される好適なプライマーによって得られ得るＤＮＡ配列を提供することが、さらにその上の本発明の目的である。そのように得られたＤＮＡ配列は、そこからそれらが設計されるとともに同等の活性特性を示す突然変異と少なくとも同じ突然変異のメバロネートキナーゼをコードすることが分かっている。
【００７７】
本明細書に記載される本発明の様々な実施形態は相互併用され得る。
【００７８】
次の非限定的な実施例がさらに本発明を説明する。
【００７９】
実施例１：メバロネートキナーゼ活性およびフィードバック阻害因子による阻害の測定
メバロネートを基質として調製するため、１３０ｍｇのＤＬ−メバロネートラクトン（フルカ・ケミ（ＦＬＵＫＡ Ｃｈｅｍｉｅ）ＡＧ，ブックス（Ｂｕｃｈｓ），スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））が０．２ＭのＫＯＨ５．５ｍｌ中に溶解されるとともに５０℃で１５分間インキュベートされた。溶液は次に、室温（ＲＴ）で０．１ＭのＨＣｌを加えることによりｐＨ７．０に調整された。別段に述べられる場合を除き、アッセイ混合物は１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのメバロネート、０．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．３２ｍＭのＮＡＤＨ、２０Ｕ／ｍｌのピルビン酸キナーゼおよび２７Ｕ／ｍｌの乳酸脱水素酵素（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ），ミズーリ州（ＭＯ），米国）から成った。阻害は１μＭのＦＰＰを添加することにより試験された。
【００８０】
Ｈｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼおよびＨｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼ変異体酵素の精製はＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーでキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＱＩＡエクスプレス（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）システム／試薬を使用して行われた。精製された（Ｈｉｓ６タグ付き）メバロネートキナーゼを加えると、ＮＡＤＨ消費の反映される酵素反応の後に３４０ｎｍでの光度測定が続いた。１ユニット（１Ｕ）のメバロネートキナーゼ活性は、１分間当たり１μｍｏｌのメバロネートのリン酸化を触媒する。
【００８１】
実施例２：出芽酵母メバロネートキナーゼのフィードバック耐性変異体の生成
出芽酵母（配列番号２）由来のメバロネートキナーゼのｃＤＮＡは、ＰＣＲにより、ＳｐｈＩ制限部位（配列番号１０）を包含するプライマーＭｖｋ−ＳｐｈＩをＨｉｓ６配列ならびにＡＴＧ開始コドンのないメバロネートキナーゼの５’末端配列の小片とともに、および終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（配列番号１１）を含む３’末端配列プライマーＭｖｋ−ＨｉｎｄＩＩＩを使用して増幅される。ＰＣＲ反応は供給者のプロトコル（９４．５℃で３０秒間を１サイクル；９４．５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７０℃で３分間を２５サイクル）に従い、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ），カリフォルニア州，米国）のターボ（Ｔｕｒｂｏ）−Ｐｆｕポリメラーゼを使用して実行される。アガロースゲル電気泳動による精製の後、ＰＣＲ産物はＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化されるとともに、同じ酵素で消化されるｐＱＥ−８０Ｌ（キアゲン，ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ），ドイツ）中に連結され、結果としてｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋになる。プラスミドｐＱＥ−８０Ｌはｌａｃオペレーターエレメントにより制御されるＴ５プロモーターを包含し、同じくｐＱＥ−８０Ｌによりコードされるｌａｃリプレッサーによりシス阻害され得る。次にプラスミドが供給者のプロトコルに従い大腸菌ＤＨ５α（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ），カリフォルニア州，米国）に形質転換される。大腸菌の指数関数的成長中に１００μＭのＩＰＴＧを０．６のＯＤ６００ｎｍで加えると、Ｈｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼが３０℃で４時間、２５０ｒｐｍでの振盪により導入される。
【００８２】
Ｈｉｓ６タグ付きメバロネートキナーゼの部位特異的突然変異誘発はいわゆる「２段階ＰＣＲ」によりストラタジーン（ラ・ホーヤ，カリフォルニア州，米国）のターボ（Ｔｕｒｂｏ）−ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して実現される。第１のＰＣＲ（条件については上記を参照）は、第１のプライマーとして突然変異されたコドンを包含する配列番号１２〜２６に表されるプライマーの１つ、および第２のプライマーとしてｐＱＥ−８０Ｌのマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）の５’末端における配列の小片に対応するプライマーｐＱＥ−５’（配列番号２７）で実施される。鋳型はｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋである。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により精製されるとともに、ＭＣＳの３’末端配列の小片を内包するプライマーｐＱＥ−３’（配列番号２８）とともに、野生型ｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋを鋳型として第２のＰＣＲ反応用プライマーとして使用される。ＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）はアガロースゲル電気泳動により精製されるとともに、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化され、これをもってＨｉｓ６−ＭｖｋはｐＱＥ−８０Ｌへとサブクローニングされる。最終的には、消化された断片がアガロース電気泳動により精製されるとともに同じ制限酵素により直線化されるｐＱＥ−８０Ｌへと連結され、結果として突然変異されたｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋとなる。
【００８３】
実施例３：出芽酵母メバロネートキナーゼ変異体のフィードバック耐性
メバロネートの調製および活性測定は、全く実施例１に記載のとおりに実施された。１μＭのＦＰＰが出芽酵母メバロネートキナーゼ野生型酵素およびその変異体で実施される阻害アッセイに使用された。
【００８４】
フィードバック耐性（％）は次式に従い計算された：
％耐性＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
式中、（ａ）および（ｂ）はＦＰＰの不在下および存在下各々における野生型酵素の測定された修飾メバロネートキナーゼ活性を、かつ（ｃ）および（ｄ）はＦＰＰの不在下および存在下各々における変異体酵素の測定されたメバロネートキナーゼ活性を言う。結果は表１に示され、なかでＷＴはＨｉｓ６タグ（配列番号３）を包含する非突然変異メバロネートキナーゼを表す。
【００８５】
【表１】
【００８６】
実施例４：フィードバック阻害に対する酵素の耐性に影響を有することが予め同定されるアミノ酸残基／位置における出芽酵母メバロネートキナーゼの飽和突然変異誘発
飽和突然変異誘発は、飽和突然変異誘発に供されるコドンがランダム化された配列より作られる手法で突然変異誘発プライマーが合成されることを除き、実施例２に記載されるとおりと同じ手法で行われる。
【００８７】
実施例５：フィードバック阻害耐性メバロネートキナーゼを使用するコエンザイムＱ１０の改良された産生
突然変異Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２ＭのコエンザイムＱ１０産生に対するインビボ効果を試験するため、出芽酵母メバロネートキナーゼ変異体Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ（配列番号５）をコードするＤＮＡがパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスへと導入されるとともに、野生型出芽酵母メバロネートキナーゼ（配列番号２）をコードするＤＮＡを保有するＰ．ゼアキサンチニファシエンス中のＣｏＱ１０産物と比較される。
【００８８】
プラスミド作成
プラスミドｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ６−Ｍｖｋ（実施例３を参照）が大腸菌へと実施例２に従い導入された。大腸菌株は３７℃でＬＢ培地（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），スパークス（Ｓｐａｒｋｓ），メリーランド州（ＭＤ），米国）中で成長させた。組換え大腸菌株中のプラスミドの維持のため、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）および／またはカナマイシン（２５〜５０μｇ／ｍｌ、実験に応じて）が培地に添加された。寒天（最終濃度１．５％）が固形培地として添加された。培養液は２００ｒｐｍの回転振盪機中で成長させた。
【００８９】
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２の部位ＳａｃＩとＮｓｉＩとの間に挿入されたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４がそのプロモーター領域を含むＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来のメバロネートオペロンを包含するため作成された（コバック（Ｋｏｖａｃｈ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）１６６，１７５−１７６頁，１９９５年）。クローン化メバロネートオペロンは、ジェンバンク／ＥＭＢＬ受託番号ＡＪ４３１６９６を有する配列のヌクレオチド２４６９から９００１由来の配列に対応する。ＳａｃＩ部位とメバロネートオペロン配列との間には短いリンカー配列があり、プラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州，米国）に由来するとともにＳａｃＩ部位からＰＣＲ断片挿入部位までの配列に対応する。
【００９０】
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株ＡＴＣＣ ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子の、Ｅｃｌ１３６ ＩＩとｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４のＳｐｅＩ部位との間のｃｒｔＥプロモーター領域制御下での導入の結果、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔとなった（ｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥの作成については、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例６を参照）。ＡＴＣＣ２１５８８（ｄｄｓＡｗｔ）株のｄｄｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号２９に示され、対応するアミノ酸配列は配列番号３０に表される。
【００９１】
ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔによるプラスミドが作成され、ここでプロモーター領域を含むＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来のメバロネートオペロン（上記参照）は、野生型出芽酵母メバロネートキナーゼ（配列番号２）をコードして結果としてｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔとなるＤＮＡか、出芽酵母メバロネートキナーゼ変異体Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ（配列番号５）をコードして結果としてｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ−Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔとなるＤＮＡかのいずれかにより置換される。
【００９２】
組換えＰ．ゼアキサンチニファシエンス株の作成
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株は２８℃で成長させる。Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスの培養に使用される培地の組成は以下に記載される。フラスコ中で成長させるＰ．ゼアキサンチニファシエンスの全ての培養液は、別段に特定されない限り、２００ｒｐｍの回転振盪機中で振盪される。寒天（最終濃度２％）が固形培地として添加される。培地がオートクレーブにより無菌化される時、無菌化後に所望の最終濃度を実現するようグルコースが（濃縮原液として）添加される。Ｆ培地は（１リットル蒸留水当たり）、１０ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、３０ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを包含する。ｐＨは、濾過またはオートクレーブによる無菌化前に７．０に調整される。培地３６２Ｆ／２は（１リットル蒸留水当たり）、３３ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのトリプトン、５ｇのＮａＣｌ、２．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを包含する。培地のｐＨは、濾過またはオートクレーブによる無菌化前に７．４に調整される。無菌化に続き、各２．５ｍｌ（１リットル最終溶液当たり）の微量元素溶液、ＮＫＰ溶液およびＣａＦｅ溶液が添加される。これら３溶液は濾過により無菌化される。微量元素溶液は（１リットル蒸留水当たり）、８０ｇの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、６ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、６ｇのＥＤＴＡを包含する。ＮＫＰ溶液は（１リットル蒸留水当たり）、２５０ｇのＫ２ＨＰＯ４，３００ｇの（ＮＨ４）２ＰＯ４を包含する。ＣａＦｅ溶液は（１リットル蒸留水当たり）、７５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、３．７５ｍｌの濃縮ＨＣｌを包含する。
【００９３】
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４のエレクトロコンピテントセルの調製および電気穿孔は次のとおり実施される：１００ｍｌのＦ培地は、１．５ｍｌのＰ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４の定常期培養物を接種されるとともに２８℃、２００ｒｐｍで、６６０ｎｍでの光学密度が約０．５に達するまで成長させる。細胞は、１５分間、４℃、７０００×ｇの遠心分離により収集されるとともにｐＨ７の氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液１００ｍｌ中で２回洗浄される。最終ペレットはｐＨ７の氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液０．１ｍｌ中で再懸濁されるとともに、細胞は直ちに電気穿孔に使用されるか、グリセロールが最終濃度１５％まで添加されるとともに細胞が−８０℃で５０μｌアリコート中に貯蔵されるかのいずれかである。１から５μｌのプラスミドＤＮＡが無塩溶液中に添加されるとともに電気穿孔が１８ｋＶ／ｃｍおよび１２９オームで氷冷１ｍｍキュベット中において実施される。パルス長は典型的には４と５ミリ秒との間である。１ｍｌのＦ培地が添加されるとともに細胞が２８℃で１時間インキュベートされる。希釈は２５〜５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＦ寒天平板上に塗られるとともに２８℃でインキュベートされる。推定形質転換体が所望のプラスミドを包含することがＰＣＲ分析により確認される。
【００９４】
コエンザイムＱ１０産生評価のための培養条件
コエンザイムＱ１０産生はＰ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔ、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ−Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔのフェドバッチ培養において試験される。全ての培養物は凍結細胞懸濁液（２５％グリセロールストックとして−８０℃で貯蔵される）から開始される。フェドバッチ発酵のための前培養物は各２００ｍｌの３６２Ｆ／２培地を包含する複製２リットルバッフル付き振盪フラスコ中で調製される。２ミリリットルの解凍細胞懸濁液が接種材料として各フラスコ中で使用される。前培養物の初期ｐＨは７．２である。前培養物は２８℃で２５０ｒｐｍの振盪とともに２８時間インキュベートされ、その時間の後６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６６０）は、使用される株に応じて１４と２２吸光度単位との間である。主な培養物は、次の組成（１リットル蒸留水当たり）：２５ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、１７ｇの酵母抽出物（タストーン（Ｔａｓｔｏｎｅ）９００）、４．０ｇのＮａＣｌ、６．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．０３８ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１３ｇのＭｎＳＯ４?Ｈ２Ｏ、０．００１ｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、０．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０６２ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのナイアシン、０．５ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍｌの消泡剤、３．５ｍｌのＫＰ溶液、を有する培地を包含するバイオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ） ＥＤ バイオリアクター（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ）（Ｂ．ブラウン バイオテック・インターナショナル（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），メルスンゲン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ），ドイツ）中で成長させる。ＫＰ溶液の組成は（１リットル蒸留水当たり）、２５０ｇのＫ２ＨＰＯ４、２００ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４である。カナマイシン（最終濃度５０ｍｇ／ｌ）がプラスミド保有株用培地に添加される。全てのプロセスにおいて使用されるフィーディング溶液は次の組成を有する（１リットル蒸留水当たり）：５５０ｇのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏ、１８．２５ｍｌのＫＰ溶液。バイオリアクター（接種後）の初期容量は８．０ｌである。前培養物は必要に応じて滅菌水で、バイオリアクターへの４００ｍｌの添加の結果として初期ＯＤ６６０値が０．５となるよう希釈される。発酵条件は次のとおり自動的に制御される：２８℃、ｐＨ７．２（２８％ＮＨ４ＯＨの添加で制御されるｐＨ）、攪拌により最小４０％相対値で制御される溶存酸素、３００ｒｐｍの最小攪拌および１ｖ．ｖ．ｍ．の通気速度（最終容量に対して）。培養はこれら条件下で約２０時間（バッチ段階）フィード溶液の添加なしに進められフィーディング段階に続く。この時間の後、攪拌速度の低下、塩基消費の休止、ｐＨ急上昇およびＣＯ２産生の低下が、初期グルコースが消耗されるとともにフィーディングが開始されることの指標である。標準的なフィードプロファイルは次のとおり定義される（フィーディング開始点から）：１７時間に５０ｇ／ｈから８０ｇ／ｈまで上昇、８０ｇ／ｈで７時間継続し、次の１１時間に５５ｇ／ｈまで下降、および残りの発酵のため５５ｇ／ｈで継続（総発酵時間＝７０時間）。主培養物の最終容量は約１０リットルである。
【００９５】
分析方法
全培養ブロス４００μｌが使い捨て１５ｍｌポリプロピレン遠心管に移される。１：１（ｖ／ｖ）（ＤＭＳＯ／テトラヒドロフラン）で安定抽出溶液４ミリリットル（０．５ｇ／ｌの３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン）が添加されるとともに、抽出物を増強するため試料が実験室の振盪機（ＩＫＡ，ドイツ）で２０分間混合される。最終的に、試料は遠心分離されるとともに上清がアンバーガラスバイアルへ逆相ＨＰＬＣによる分析のため移される。この方法はユビキノンおよびそれに対応するヒドロキノンの同時定量用に、ＣｏＱ１０のカロテノイド・ゼアキサンチン、フィトエン、β−クリプトキサンチン、β−カロテンおよびリコペンからの明確な分離に伴い、開発された。クロマトグラフィーは、温度制御オートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），米国）を使用して実施される。方法のパラメータは次のとおりであった：
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
コエンザイムＱ１０産生結果
上記のフェドバッチ培養条件下で、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ−Ｎ６６Ｋ／Ｉ１５２Ｍ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔにより産生されるコエンザイムＱ１０の最終濃度は、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍｖｋ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを保有するＲ１１４株について観測されたものより少なくとも５％高い。
【００９９】
実施例６：出芽酵母メバロネートキナーゼと相同であるメバロネートキナーゼ中の対応する残基の同定
種々のメバロネートキナーゼのマルチプルアミノ酸配列アラインメントが図１に示されるとおり計算された。「Ｍｖｋ＿ｙｅａｓｔ（酵母）」と命名される配列は配列番号１に対応し、「Ｍｖｋ−Ｐ−ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）」と命名される配列は配列番号６に対応する。
【０１００】
出芽酵母メバロネートキナーゼ（配列番号１）のアミノ酸配列の特異的アミノ酸位置に対応する次の残基が同定された（Ｍｖｋの供給源、すなわち各々の配列の受託番号を含む生物体名についてのさらなる参考に、図１の説明文を参照）。
【０１０１】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】プログラムのクラスタルＷ（バージョン１．８２，ＥＭＢＬ，ハイデルベルク，ドイツ）で計算される、様々な供給源（対応するアミノ酸／ヌクレオチド配列各々の受託番号および配列番号が示される）：マウス（ｍｏｕｓｅ）（スイスプロット受託番号Ｑ９Ｒ００８／ジェンバンク受託番号ＡＦ１３７５９８）、ラット（ｒａｔ）（スイスプロット受託番号Ｐ１７２５６／ジェンバンク受託番号Ｍ２９４７２）、ヒト（Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ（サピエンス）；スイスプロット受託番号Ｑ０３４２６／ジェンバンク受託番号Ｍ８８４６８），ファフィア・ロドジマ（Ｐ＿ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（ロドジマ）；配列番号８／９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓ＿ｐｏｍｂｅ（ポンベ）；スイスプロット受託番号Ｑ０９７８０／ジェンバンク受託番号ＡＢ０００５４１）、出芽酵母（ｙｅａｓｔ（酵母）；スイスプロット受託番号Ｐ０７２７７／ジェンバンク受託番号ＮＰ０１３９３５；配列番号１／２）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（Ａ＿ｐｅｒｎｉｘ（ペルニクス）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｙ９４６／ジェンバンク受託番号ＡＰ００００６４）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ＿ａｂｙｓｓｉ（アビシ）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｖ１８７／ジェンバンク受託番号ＡＪ２４８２８４）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐ＿ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ホリコシ）；スイスプロット受託番号Ｏ５９２９１／ジェンバンク受託番号ＡＢ００９５１５）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐ＿ｆｕｒｉｏｓｕｓ（フリオサス）；スイスプロット受託番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３／ジェンバンク受託番号ＡＥ０１０２６３）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍ＿ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（サーモオートトロフィカム）；スイスプロット受託番号Ｑ５０５５９／ジェンバンク受託番号Ｕ４７１３４）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａ＿ｆｕｌｇｉｄｕｓ（フルギダス）；スイスプロット受託番号Ｏ２７９９５／ジェンバンク受託番号ＡＥ０００９４６）、メタノコッカス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ヤンナスキ）；スイスプロット受託番号Ｑ５８４８７／ジェンバンク受託番号Ｕ６７５５１）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ＿ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）；配列番号６／７）からのメバロネートキナーゼ配列のマルチプル配列アラインメント。出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列（配列番号１）が、それに対する他の配列の位置、例えば上記に挙げられたものが参照される（表３も参照）アミノ酸番号付けの参考として使用される。配列番号１の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸が強調表示される。
【図１Ｂ】プログラムのクラスタルＷ（バージョン１．８２，ＥＭＢＬ，ハイデルベルク，ドイツ）で計算される、様々な供給源（対応するアミノ酸／ヌクレオチド配列各々の受託番号および配列番号が示される）：マウス（ｍｏｕｓｅ）（スイスプロット受託番号Ｑ９Ｒ００８／ジェンバンク受託番号ＡＦ１３７５９８）、ラット（ｒａｔ）（スイスプロット受託番号Ｐ１７２５６／ジェンバンク受託番号Ｍ２９４７２）、ヒト（Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ（サピエンス）；スイスプロット受託番号Ｑ０３４２６／ジェンバンク受託番号Ｍ８８４６８）、ファフィア・ロドジマ（Ｐ＿ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（ロドジマ）；配列番号８／９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓ＿ｐｏｍｂｅ（ポンベ）；スイスプロット受託番号Ｑ０９７８０／ジェンバンク受託番号ＡＢ０００５４１）、出芽酵母（ｙｅａｓｔ（酵母）；スイスプロット受託番号Ｐ０７２７７／ジェンバンク受託番号ＮＰ０１３９３５；配列番号１／２）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（Ａ＿ｐｅｒｎｉｘ（ペルニクス）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｙ９４６／ジェンバンク受託番号ＡＰ００００６４）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ＿ａｂｙｓｓｉ（アビシ）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｖ１８７／ジェンバンク受託番号ＡＪ２４８２８４）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐ＿ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ホリコシ）；スイスプロット受託番号Ｏ５９２９１／ジェンバンク受託番号ＡＢ００９５１５）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐ＿ｆｕｒｉｏｓｕｓ（フリオサス）；スイスプロット受託番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３／ジェンバンク受託番号ＡＥ０１０２６３）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍ＿ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（サーモオートトロフィカム）；スイスプロット受託番号Ｑ５０５５９／ジェンバンク受託番号Ｕ４７１３４）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａ＿ｆｕｌｇｉｄｕｓ（フルギダス）；スイスプロット受託番号Ｏ２７９９５／ジェンバンク受託番号ＡＥ０００９４６）、メタノコッカス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ヤンナスキ）；スイスプロット受託番号Ｑ５８４８７／ジェンバンク受託番号Ｕ６７５５１）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ＿ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）；配列番号６／７）からのメバロネートキナーゼ配列のマルチプル配列アラインメント。出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列（配列番号１）が、それに対する他の配列の位置、例えば上記に挙げられたものが参照される（表３も参照）アミノ酸番号付けの参考として使用される。配列番号１の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸が強調表示される。
【図１Ｃ】プログラムのクラスタルＷ（バージョン１．８２，ＥＭＢＬ，ハイデルベルク，ドイツ）で計算される、様々な供給源（対応するアミノ酸／ヌクレオチド配列各々の受託番号および配列番号が示される）：マウス（ｍｏｕｓｅ）（スイスプロット受託番号Ｑ９Ｒ００８／ジェンバンク受託番号ＡＦ１３７５９８）、ラット（ｒａｔ）（スイスプロット受託番号Ｐ１７２５６／ジェンバンク受託番号Ｍ２９４７２）、ヒト（Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ（サピエンス）；スイスプロット受託番号Ｑ０３４２６／ジェンバンク受託番号Ｍ８８４６８）、ファフィア・ロドジマ（Ｐ＿ｒｈｏｄｏｚｙｍａ（ロドジマ）；配列番号８／９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｓ＿ｐｏｍｂｅ（ポンベ）；スイスプロット受託番号Ｑ０９７８０／ジェンバンク受託番号ＡＢ０００５４１）、出芽酵母（ｙｅａｓｔ（酵母）；スイスプロット受託番号Ｐ０７２７７／ジェンバンク受託番号ＮＰ０１３９３５；配列番号１／２）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（Ａ＿ｐｅｒｎｉｘ（ペルニクス）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｙ９４６／ジェンバンク受託番号ＡＰ００００６４）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（Ｐ＿ａｂｙｓｓｉ（アビシ）；スイスプロット受託番号Ｑ９Ｖ１８７／ジェンバンク受託番号ＡＪ２４８２８４）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐ＿ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ホリコシ）；スイスプロット受託番号Ｏ５９２９１／ジェンバンク受託番号ＡＢ００９５１５）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐ＿ｆｕｒｉｏｓｕｓ（フリオサス）；スイスプロット受託番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３／ジェンバンク受託番号ＡＥ０１０２６３）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍ＿ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（サーモオートトロフィカム）；スイスプロット受託番号Ｑ５０５５９／ジェンバンク受託番号Ｕ４７１３４）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａ＿ｆｕｌｇｉｄｕｓ（フルギダス）；スイスプロット受託番号Ｏ２７９９５／ジェンバンク受託番号ＡＥ０００９４６）、メタノコッカス・ヤンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ヤンナスキ）；スイスプロット受託番号Ｑ５８４８７／ジェンバンク受託番号Ｕ６７５５１）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ＿ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（ゼアキサンチニファシエンス）；配列番号６／７）からのメバロネートキナーゼ配列のマルチプル配列アラインメント。出芽酵母メバロネートキナーゼアミノ酸配列（配列番号１）が、それに対する他の配列の位置、例えば上記に挙げられたものが参照される（表３も参照）アミノ酸番号付けの参考として使用される。配列番号１の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸が強調表示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す修飾メバロネートキナーゼであって、
（ｉ）前記修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列が対応する前記非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個の突然変異を包含し、かつ
（ｉｉ）前記少なくとも１個の突然変異が、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである、修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項２】
配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置における１個またはそれ以上の突然変異から成る、請求項１に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項３】
前記非修飾メバロネートキナーゼが出芽酵母由来である、請求項１または２に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項４】
前記フィードバック阻害が、ファルネシル二リン酸またはゲラニルゲラニル二リン酸によるフィードバック阻害である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項５】
前記修飾メバロネートキナーゼが前記対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において少なくとも１０％のフィードバック耐性を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項６】
前記少なくとも１個の突然変異が少なくとも１個のアミノ酸置換である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項７】
前記修飾メバロネートキナーゼが、前記対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時２個の置換を、好ましくは配列番号１に示されるとおりの配列のアミノ酸位置６６および１５２位に対応するアミノ酸位置における２個の置換を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項８】
配列番号１に示されるとおりの配列のアミノ酸位置６６位に対応するアミノ酸位置における前記置換がアスパラギンのリジンとの交換から成るとともに、配列番号１に示されるとおりの配列のアミノ酸位置１５２位に対応するアミノ酸位置における前記置換がイソロイシンのメチオニンとの交換から成る、請求項７に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項９】
前記対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列が図１に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項１０】
前記非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列が配列番号１である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
修飾メバロネートキナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号５のヌクレオチド配列である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたはプラスミド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１５】
エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群より選択される請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼを産生するプロセスであって、
（ａ）請求項１４または１５に記載の宿主細胞を好適な培地および前記修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下において培養するステップ、および
（ｂ）前記修飾メバロネートキナーゼを前記細胞から、または前記培地から回収するステップ、を含んでなるプロセス。
【請求項１７】
低減されたフィードバック阻害感受性を有するメバロネートキナーゼの調製のためのプロセスであって、次のステップ、
（ａ）フィードバック阻害感受性を示す第１のメバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ、
（ｂ）１個またはそれ以上の突然変異を前記ポリヌクレオチド配列へと導入するステップであって、前記変異されたポリヌクレオチド配列が請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼである第２のメバロネートキナーゼをコードするステップ、
（ｃ）前記変異されたポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドへ任意に挿入するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）または（ｃ）の前記ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞へと導入するステップ、および
（ｅ）前記宿主細胞を低減されたフィードバック阻害感受性を有する前記修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下において培養するステップ、を含んでなる、プロセス。
【請求項１８】
イソプレノイドを産生するプロセスであって、
（ａ）請求項１４または１５に記載の宿主細胞を好適な培地で前記修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下において培養するステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイドを前記培地から任意に分離するステップ、を含んでなるプロセス。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼまたは請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドの、メバロネートキナーゼの活性低下に付随する疾患の治療用薬剤の製造のための使用。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼまたは請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドの、生体液中のメバロネート濃度を決定するための使用。
【請求項１】
対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において低減されたフィードバック阻害感受性を示す修飾メバロネートキナーゼであって、
（ｉ）前記修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列が対応する前記非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時少なくとも１個の突然変異を包含し、かつ
（ｉｉ）前記少なくとも１個の突然変異が、配列番号１に示されるとおりの出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置においてである、修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項２】
配列番号１に示されるとおりの出芽酵母メバロネートキナーゼのアミノ酸配列の位置５５、５９、６６、８３、１０６、１１１、１１７、１４２、１５２、１５８、２１８、２３１、２４９、３６７および３７５位に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１箇所またはそれ以上のアミノ酸位置における１個またはそれ以上の突然変異から成る、請求項１に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項３】
前記非修飾メバロネートキナーゼが出芽酵母由来である、請求項１または２に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項４】
前記フィードバック阻害が、ファルネシル二リン酸またはゲラニルゲラニル二リン酸によるフィードバック阻害である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項５】
前記修飾メバロネートキナーゼが前記対応する非修飾メバロネートキナーゼとの比較において少なくとも１０％のフィードバック耐性を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項６】
前記少なくとも１個の突然変異が少なくとも１個のアミノ酸置換である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項７】
前記修飾メバロネートキナーゼが、前記対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列と比較した時２個の置換を、好ましくは配列番号１に示されるとおりの配列のアミノ酸位置６６および１５２位に対応するアミノ酸位置における２個の置換を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項８】
配列番号１に示されるとおりの配列のアミノ酸位置６６位に対応するアミノ酸位置における前記置換がアスパラギンのリジンとの交換から成るとともに、配列番号１に示されるとおりの配列のアミノ酸位置１５２位に対応するアミノ酸位置における前記置換がイソロイシンのメチオニンとの交換から成る、請求項７に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項９】
前記対応する非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列が図１に示されるとおりのアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項１０】
前記非修飾メバロネートキナーゼのアミノ酸配列が配列番号１である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
修飾メバロネートキナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号５のヌクレオチド配列である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたはプラスミド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１５】
エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群より選択される請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼを産生するプロセスであって、
（ａ）請求項１４または１５に記載の宿主細胞を好適な培地および前記修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下において培養するステップ、および
（ｂ）前記修飾メバロネートキナーゼを前記細胞から、または前記培地から回収するステップ、を含んでなるプロセス。
【請求項１７】
低減されたフィードバック阻害感受性を有するメバロネートキナーゼの調製のためのプロセスであって、次のステップ、
（ａ）フィードバック阻害感受性を示す第１のメバロネートキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ、
（ｂ）１個またはそれ以上の突然変異を前記ポリヌクレオチド配列へと導入するステップであって、前記変異されたポリヌクレオチド配列が請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼである第２のメバロネートキナーゼをコードするステップ、
（ｃ）前記変異されたポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドへ任意に挿入するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）または（ｃ）の前記ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞へと導入するステップ、および
（ｅ）前記宿主細胞を低減されたフィードバック阻害感受性を有する前記修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下において培養するステップ、を含んでなる、プロセス。
【請求項１８】
イソプレノイドを産生するプロセスであって、
（ａ）請求項１４または１５に記載の宿主細胞を好適な培地で前記修飾メバロネートキナーゼの発現を可能にする条件下において培養するステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイドを前記培地から任意に分離するステップ、を含んでなるプロセス。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼまたは請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドの、メバロネートキナーゼの活性低下に付随する疾患の治療用薬剤の製造のための使用。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾メバロネートキナーゼまたは請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチドの、生体液中のメバロネート濃度を決定するための使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【公表番号】特表２００８−５２２６３５（Ｐ２００８−５２２６３５Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５９１２（Ｐ２００７−５４５９１２）
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３７５２
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３７５２
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]