改良型子宮頸部細胞スクリーニング方法
ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）の組み込みを検出するための分子ベースのプロセスを提供する、改良型子宮頸癌スクリーニング方法である。当該開示された方法は、パパニコロー検査と免疫組織化学検査とを同じスライド上で行う、能率化された手法を可能にする。当該開示された方法は、安価で、感度が高く、特異的で詳細な、かつ、評価と追跡が簡単な検査を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、身体、たとえば子宮頸部の、異常な組織の検出に使用するための、細胞のサンプリング、処理、およびスクリーニングに関する。当該開示は特に、（１）採取された細胞または細胞クラスターが、それらの生物学的特性が検査できるように調製され、（２）ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）が宿主ＤＮＡに組み込まれているこれら細胞が、ＨＰＶ組み込みマーカーで検出されるようにする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は侵襲性子宮頸癌および子宮頸部上皮内腫瘍の前駆体として広く研究されている。子宮頸癌は世界全体で見れば二番目に多い癌であり、発展途上国においては最も多い悪性腫瘍である。
【０００３】
子宮頸癌スクリーニングは、通常、細胞診と膣鏡診の分析に基づいて行われる。一般的に使用されている、子宮頸部の塗抹標本の細胞診（パパニコロー検査、パップ塗抹標本検査）によって、子宮頸癌の発生率と、子宮頸癌が原因の死亡率とが減少した。しかし、パップ塗抹標本検査を使用することには問題もある。従来のパップ塗抹標本検査の限界の一つに、細胞を移してもそれが細胞を正しく代表しない、ということがある。また、異物によって異常な細胞がわかりにくくなり、かかる従来の方法では、偽陰性結果または曖昧な結果が出たりすることが増加しかねない。
【０００４】
パパニコロー検査の形態はどれも、高度な前駆病変をスクリーニングすることに焦点を置き、これら前駆体が侵襲性の癌へ進行する前に治療が開始できるようにしている。前癌性病変および癌性病変について細胞学的ならびに生物学的に区別可能な等級の様子を効果的に区別し、伝えるために、子宮頸部細胞診報告のためのベセズダシステム（Bethesda System for Reporting Cervical Cytology）では、扁平上皮細胞異常を特徴付ける６つの分類を推奨した。前記６分類とは、（１）意義不明異型扁平上皮（ASCUS）、（２）高度扁平上皮病変を除外できない異型扁平上皮（ASC-H）、（３）軽度扁平上皮内病変（LSIL）、（４）高度扁平上皮内病変（HSIL）、（５）扁平上皮癌（SCC）、および（６）正常、である。このシステム下で、HSILはさらに、「HSIL（中程度異形成、CIN II）」または「HSIL（重度異形成、CIN III）」に分類されてもよい。ASC-H、LSIL、HSIL、およびSCCの追跡検査として、膣鏡検査、および可能であれば生検が推奨され、ASCUSにはＨＰＶ検査が推奨される。
【０００５】
＜ＨＰＶ病原＞
ＨＰＶのタイプは数多くある（＞１００）が、そのうちのいくつかだけが性器親和性である。子宮頸癌で選択的に検出されるＨＰＶのタイプは、ハイリスクタイプと分類され、それに対し、非悪性病変に主に検出されるものは、ローリスクタイプと指定されてきた。ハイリスクＨＰＶ−ＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みは、ＨＰＶ病原において重要な役割を果たす。ＨＰＶによって発現する遺伝子は、初期（Ｅ）および後期（Ｌ）発現遺伝子に分かれる。この組み込みは、Ｅ２ウィルス遺伝子の特異的破壊、および、Ｅ１、Ｅ４、およびＥ５遺伝子で開始されるその他のＥ遺伝子の転写と翻訳という結果になる。前記Ｅ２タンパク質はＥ６およびＥ７ウィルス癌遺伝子の転写を通常、負に制御し、Ｅ２が発現しないと、子宮頸癌細胞における前記Ｅ６およびＥ７遺伝子の無秩序な発現が起こる。
【０００６】
これら腫瘍性タンパク質は、主にタンパク質―タンパク質間の相互作用を介して機能して、細胞周期の進行と増殖とを調整する経路を破壊する。Ｅ６は、タンパク質分解酵素による分解のためのｐ５３を標的とし、結果的にｐ５３の転写経路を破壊し、通常ｐ５３によって抑制される数々の遺伝子のアップレギュレーションが起こる。前記Ｅ７遺伝子生成物は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子に対して同様の効果を有する。
【０００７】
＜ＨＰＶ検査＞
ＨＰＶ感染のほとんどの場合、治療とは無関係に退行するというのが、ＨＰＶの自然な経過である。ＨＰＶの組み込みの進行には、ハイリスクＨＰＶタイプの持続が必要である。患者のうちで、かかる進行が起こる割合は小さい。したがって、ＨＰＶ組み込みについて高い感度を持つスクリーニングテストが、早期診断および治療には望ましい。
【０００８】
ＨＰＶ検査で難しいのは、パパニコロー検査でASCUSと判断された女性である。ASCUSの場合に現在推奨されているのは、その患者がもし３０歳以上であれば、ＨＰＶ−ＤＮＡの有無についての検査を受けさせることである。ＨＰＶは数種の検査で検出できる。臨床用の設定の、もっともよく使用されている検査は、ダイジーン（Digene）Hc2検査であり、これはスタンダードキットとして入手可能である。この検査は、乳頭腫ウイルスの特定のタイプの判定を含み、従来の細胞学的スクリーニング手順の代りに使用するか、または、それに加えて使用することが推奨されている。
【０００９】
Digene Hc2検査の欠点の一つは、ハイブリダイゼーション法によってウイルスのＤＮＡの存在を同定するのみであることである。ほとんどの患者ではＨＰＶ感染が女性のゲノムに組み込まれることなく維持されているので、Digene Hc2検査が陽性であることは、ウィルスが存在するかどうかを臨床医に知らせるのみである。すなわち、前記検査は、ウィルスが実際に女性のゲノムに組み込まれているかどうかを示すわけではない。当然、臨床医がDigene Hc2検査から陽性の結果を得たとしても、癌細胞が本当に有るかどうかについての断定的な答えを出すことはできない。さらに、Digene Hc2検査は、複雑で時間がかかり、手間がかかり、高価である。
【００１０】
今までのところ、ＨＰＶ感染用の治療はない。そのため、ＨＰＶ感染の診断を受けた患者は、パパニコロー検査で癌の有無をモニターする回数を増やすだけであった。ＨＰＶ組み込みについての検査が求められているのは明らかである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、最も早い段階で治療できる病変について、細胞試料をスクリーニングすることを含む。一実施形態において、これは、ＰＡＰ染色および免疫組織化学検査の両方に単一の受付構造体を使用しうる、能率的な検査プロセスで達成され、感度と特異性を改善し、かつ、高価なＨＰＶ検査方法に代る低価格な代替手段を提供する。前記開示された方法は、ＨＰＶが女性のゲノムに組み込まれたかどうかを検出する、分子ベースのプロセスを提供する。
【００１２】
一実施形態において、細胞クラスターまたは細胞集塊（clumps）を採取するために好適に設計された細胞収集器によって、試料が採取される。一例においては、前記細胞クラスターまたは細胞集塊は、子宮頸部の腔（cervical cavity）の３６０度全方向から採取される。別の例においては、細胞クラスターや細胞集塊が採取されるときに、細胞収集器が前記細胞クラスターや細胞集塊の空間的位置関係を維持し、前記細胞の子宮頸部組織との空間的位置関係、すなわち子宮頸管内膜、子宮膣部、および形質転換領域との関係、ならびに四分円関係を表す、円状の「子宮頸部マップ」を作るようにする。
【００１３】
前記細胞が臨床医によって採取されると、例えばスライドなどの受付構造体へ移される。一実施形態においては、前記スライドはＰＡＰ染色される。一例において、もし前記結果が陽性であれば、同じスライドが今度は一つ以上のバイオマーカーを使用して免疫染色される。
【００１４】
前記使用されるバイオマーカーは、ＨＰＶ遺伝子タンパク質に対する抗体である。一例において、これらタンパク質は、ＨＰＶが患者のゲノムに組み込まれた場合にのみ検出される。例えば、免疫染色によって、ＨＰＶが患者のゲノムに組み込まれたかどうかを判定することができる。スライドが染色された後、前記スライドはスキャンされ、ＨＰＶ初期（Ｅ）遺伝子生成物（HPV early (E) gene products）を識別する抗体の程度が判定される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、細胞が採取されて、たとえばスライドなどの受付構造体へ移された後、前記スライドはバイオマーカーを使用してまず免疫染色され、スキャンされる。その後、還流検査（reflux test）としてどの試料をＰＡＰ染色するかが決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ１タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図２】図２は、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図３】図３は、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図５】図５は、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ７タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図６】図６は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陰性であることを示す。
【図７】図７は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陽性であることを示す。
【図８】図８は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陰性であることを示す。
【図９】図９は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陽性であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（概要）
改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、ＨＰＶ組み込みを検出するための、分子ベースのプロセスを提供する。前記開示された方法は、同じスライド上でパパニコロー検査と免疫組織化学検査とを行う、能率的な手法を可能にする。前記開示された方法は、安価な、感度の高い、特異的で詳細な、かつ、評価と追従が簡単な、検査を提供する。
【００１８】
一般的に、前記方法は、細胞クラスターを採取する収集器の能力を改善し、スライドなどの受付構造体に採取された細胞クラスターを移すことを簡便にするように設計された収集器を使用して、細胞クラスターを採取する工程を含む。一例において、採集前の細胞クラスター中の細胞間に存在している空間的位置関係を維持するような手段で、細胞クラスターが収集器からスライドへ移動機構を使用して移される。
【００１９】
一実施形態において、検査室は、スライドにＰＡＰ染色を行う。使用されるＰＡＰ染色方法の種類は特に限定されず、従来から使用されているＰＡＰ染色方法であってもよい。
【００２０】
一例において前記方法は、前記検査が陰性であれば標準臨床ガイドラインに従うことを含む。前記検査が陽性であれば、前記スライドは、蛍光タグまたは比色タグ（colorimetric tag）と結合させた（conjugated）ＨＰＶ組み込みマーカー用の抗体を使用して染色される。一例において、使用される前記ＨＰＶ組み込みマーカーは、ＨＰＶ遺伝子生成物（タンパク質）である。使用されるＨＰＶ遺伝子生成物の種類は特に限定されず、その例としてはＥ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７タンパク質がある。使用される染色法およびマーカーは、ＨＰＶ組み込みマーカーの免疫組織化学局在測定が可能である限り、特に限定されない。
【００２１】
前記スライドはその後スキャンされる。使用されるスキャナーは特に限定されず、自動または手動スキャナー、または自動または手動顕微鏡であってもよい。前記スキャナーは、蛍光シグナルまたは色シグナルをスキャンして、ＨＰＶ遺伝子生成物が子宮頸部細胞に存在するかどうかを識別するために使用される。
【００２２】
（採取）
収集器は、細胞および細胞クラスターを採取するために使用される。前記収集器は、細胞および細胞クラスターを採取することが可能な収集器のいずれの形態でもよい。適切な収集器の例としては、公開米国特許出願US 2006/0189893号およびUS 2006/0161076号に記載され、この参照をもって前記出願の全てがここに包含される。使用されうる収集器のその他の詳細のうち、収集器の材料の組み合わせ、収集器の採取面の表面組織、採取中に収集器の伸長と回転の利用が、細胞クラスターの採取を簡便にする、と前記２つの公報は述べている。収集器は、子宮頸部の子宮頚管内膜領域および子宮膣部領域から細胞クラスターを採取する。
【００２３】
（受付構造体）
受付構造体が使用される場合、使用される前記受付構造体は特に限定されない。適切な受付構造体の例としては、スライド、シャーレ、膜（membrane）や、そのほか、その後の分析のために細胞または細胞クラスターを移すことが可能なその他の構造体などである。一例においては、前記受付構造体は、細胞および細胞クラスターが含まれている収集器の表面よりも大きい接着力を有し、前記収集器から前記受付構造体への細胞クラスターの移転を向上させている。前記受付構造体がスライドの場合、前記スライドは接着力が大きくなるコーティングで前処理されてもよい。適切なスライドの一例は、細胞のスライドへの接着を助けるポリ−Ｌ−リシン系コーティングを有する。
【００２４】
別の実施形態において、受付構造体は使用されない。この例では、子宮頸部細胞は固定液に懸濁状態で採取され、受付構造体を介在しないで、懸濁された細胞に直接、免疫学的検査が行われる。
【００２５】
（パパニコロー検査）
細胞クラスターがスライドなど適切な受付構造体に移されたら、従来のパパニコロー検査が行われる。この試験は、パパニコロー法に従ってスライドを染色し、ベセズダシステムにしたがって評価することを含む。前記細胞が正常と思われるなら、または萎縮、異形成、または炎症性変化を示していれば、細胞診は陰性と判断される。パップ塗抹が陽性なら、ASCUSか、それよりも悪いと判断される。
【００２６】
別の実施形態では、前記開示された方法は、免疫染色によってＨＰＶ組み込み検査を行った後に、還流検査としてパパニコロー検査を行うことを含む。
【００２７】
（免疫染色）
一例において、パパニコロー検査が陽性と確認されると、一種以上のＨＰＶ組み込みマーカーを使用して免疫染色が行われる。使用される前記免疫染色法は特に限定されない。例えば、直接または間接免疫染色が行われる。直接免疫染色が行われる場合、一次抗体に直接、検出系が共有結合するか、または結合する（conjugate）。使用される検出系は、蛍光体標識であっても、酵素基質標識であってもよい。
【００２８】
蛍光体マーカーが使用される場合、プロトコルの一例は、スライドを洗浄し、ブロッキング溶液でブロッキングし、蛍光体標識が結合したＨＰＶ−組み込みマーカー特異的抗体で染色し、その後前記スライドを洗浄することを含む。前記スライドは、それから、蛍光顕微鏡で手動で読み取られるか、または自動蛍光スキャナーで読み取られる。前記スキャナーは、ＤＮＡ中にＨＰＶを組み込んだ細胞中のＨＰＶ組み込みマーカーを検出し位置を特定する。ＨＰＶ組み込みマーカーの発現度数もまた、シグナルの定量的評価によって判定される。
【００２９】
酵素基質標識が使用される場合、可視化でき生成位置からの拡散が最小限である生成物を生成する基質系を、酵素が有していなければならない。使用される前記組織化学的酵素は特に限定されず、たとえば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはベータガラクトシダーゼのいずれであってもよい。このタイプの系のプロトコルの一例は、ブロッキング溶液でブロッキングし、組織化学酵素と結合したＨＰＶ組み込みマーカー特異的抗体とともにインキュベートし、スライドを洗浄し、基質で処理することを含む。前記基質は、クロモゲン基質であればよく、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アルファナフトールピロニン、４−クロロ−１−ナフトール、パラフェニレンジアミンピロカテコール、fast red TR、fast blue BB、BCIPINBT、テトラゾリウムブルー、またはBCIのいずれかひとつであればよい。前記スライドはそれから、自動比色定量スキャナーで読み取られ、シグナルの輝度が定量的に評価される。または、標準的な顕微鏡を使用して、スライドを観察して分子マーカーの有無と細胞に何らかの形態変化があるかとの両方を確認する。
【００３０】
間接的染色が使用された場合、プロトコルの一例は、ＨＰＶ組み込みマーカーに特異的な標識されていない一次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、組織化学的酵素標識と結合した二次抗体とともにインキュベートし、その後洗浄し検出することを含む。
【００３１】
（免疫組織化学染色の定量評価）
マーカーの発現度数を定量的に評価する方法は、特に限定されない。免疫蛍光染色の場合、スキャンされる組織構造の画像は、例えばAnalyzeなどの画像分析ソフトウエアを使用して評価できる。前記ソフトウエアで、シグナルの密度を判定し、輝度と面積の積（brightness-area-product, ＢＡＰ）を算出できる。前記ＢＡＰは、同じ染色条件下にあった同じ解剖学的領域における染色の強度を客観的に比較する手段を提供できる。ＢＡＰは、下記の式を使用して算出できる。
（範囲の画素輝度平均値 ― 範囲の最小輝度）(（範囲の画素数）
比色タグが使用される場合、ワンチップＣＣＤ赤緑青（ＲＧＢ）カラービデオカメラと標準的診断用顕微鏡とを使用して、スキャンされた画像がコンピュータのＳ−ＶＨＳポートへインポートされる。前記色シグナルを評価するために使用されるソフトウエアは、たとえばPhotoshopでもいいが、特に限定されない。もしPhotoshopが使用されるなら、前記シグナルは、たとえばHistogramコマンドを使用して、自動化された画像操作のためのベースとして色調分布を測定することで定量される。この特徴は、たとえばクロモゲンなど、使用される特定の基質について空間的情報が得られるようにし、全画像に対する百分率、または(m2であらわすことができる。
【００３２】
さらに別の実施形態においては、前記比色タグは陽性の細胞のパーセントを数えることによって定量化してもよい。
【００３３】
（ＨＰＶ組み込みマーカー）
一実施形態において、開示された方法に使用される抗体は、ＨＰＶ組み込みマーカーに特異的である。ここで「ＨＰＶ組み込みマーカーに対して特異的な抗体」とは、ＨＰＶ組み込みによる遺伝子生成物のエピトープなど、ＨＰＶ遺伝子のタンパク質生成物のエピトープに対する特異的な抗体を意味し、その例としては、たとえば、Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、および／またはＥ７があるが、これらには限定されない。ここで「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位のことを言う。前記抗原は、ポリペプチドまたはタンパク質生成物であってもよい。前記部位はポリペプチドであってもよい。一例において、エピトープは、抗原であってもよく、ＨＰＶ組み込みマーカーのポリペプチドを指してもよい。
【００３４】
一つのタンパク質またはポリペプチドのみに特異的である抗体が求められることが最も多いが、本発明の発明者らは、タンパク質ファミリーがハイリスクＨＰＶタイプのいずれから来たものであれ、それを識別する抗体を使用することを目的としている。そのためには、本発明の発明者たちは、該当の各タンパク質においてハイリスクタイプのＨＰＶが相互に共通する領域を選択した。図１Ａ〜１Ｃは、Ｅ１タンパク質の高度に保全された領域を示す。図２は、Ｅ４タンパク質の高度に保全された領域を示す。図３は、Ｅ５タンパク質の高度に保全された領域を示す。図４Ａおよび４Ｂは、Ｅ６タンパク質の高度に保全された領域を示す。図５は、Ｅ７タンパク質の高度に保全された領域を示す。
【００３５】
（抗体の調製）
抗体は、先行技術文献に記載された、抗原混合物の接種と追加免疫用接種とによる標準的な免疫技術を使用して、たとえばマウスやウサギなどの適切な動物で産生できる。モノクローナルパネルの調製には、免疫された動物を殺して脾臓細胞を不朽化のために摘出し、所望の抗体を生成することが可能な細胞を得る。これら細胞からの上清液は、該当の抗体の存在についての最初の検査として、注入されたポリペプチドでスクリーニングされる。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
一例では、ＨＰＶ−Ｅ１遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第２０２位：SNAKAMLAKFKELYGC（配列番号１）、
ＨＰＶタイプ１８の第２０８位：NNKQGAMLAVFKDTYGC（配列番号２）、
ＨＰＶタイプ１６の第２９３位：LSKLLCVSPMC(ACM)MMIEPPKLR（配列番号３）、
ＨＰＶタイプ１８の第３０１位：LSTLLHVPETAMLIEPPKLR（配列番号４）、
ＨＰＶタイプ３３、５２、および５８の第２８６位：LSSLLNIPQSQMLIQPPKLR（配列番号５）、
ＨＰＶタイプ１６の第６０６位：DKNWKSFFSRTWC（配列番号６）、
ＨＰＶタイプ１８の第６１３位：DKNWKCFFERTWC（配列番号７）、
ＨＰＶタイプ２６、５１、６６、および７３の第５８７位：NENWKAFFTKTWC（配列番号８）、
ＨＰＶタイプ１６の第６４０位：CVSGQNTNTL（配列番号９）、
ＨＰＶタイプ１８の第６４８位：CLRAGQNHRPL（配列番号１０）、および
ＨＰＶタイプ２６、３１、３３、３９、４５、５１、５２、５８、および５９の第６２０位：CSTGENIRSI（配列番号１１）。
【００３７】
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ４遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第４４位：RRLSSDQD（配列番号１２）、
ＨＰＶタイプ１６の第７９位：LTAHQTK（配列番号１３）、
ＨＰＶタイプ１６の第８５位：DGLTVIVTL（配列番号１４）。
【００３８】
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ５遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ５２、５８、および３３の第５位：VFC(ACM)FILFLC(ACM)LC（配列番号１５）、
ＨＰＶタイプ３５の第１５位：LC(ACM)FC(ACM)VLLC(ACM)LCL （配列番号１６）、
ＨＰＶタイプ１８の第３０位：AYAWVLVFVYIVV（配列番号１７）、
ＨＰＶタイプ５１および６９の第３１位：PLLLSQYVFAAHLLLII（配列番号１８）、
ＨＰＶタイプ１６の第３７位：STYTSLIOLV（配列番号１９）、および
ＨＰＶタイプ７３の第５１位：FFLYVLVFYIF（配列番号２０）。.
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ６遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第１２６位： LDKKRRFHNI（配列番号２１）、LNEKKRFHNI （配列番号２２）、LDKKQRFHNI（配列番号２３）、
ＨＰＶタイプ１６の第１２９位：KQRFHNIRGRWTGRC（配列番号２４）、KRRFHNIAGRYTGQC（配列番号２５）、およびNKRFHNIRGRWTGRC（配列番号２６）。
【００３９】
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ７遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第２９位：DSSEENDEID（配列番号２７）、
ＨＰＶタイプ１６の第４１位：PAGGA（配列番号２８）、および
ＨＰＶタイプ１６の第８９位：VCPIC（配列番号２９）。
【００４０】
上記ポリペプチドは、一つの分析混合物中でハイリスクタイプのＨＰＶ全てを識別するために、それらに対する抗体が組み合わせられて使用できるように構成された。
【００４１】
（実施例２）
開示された方法の一例は、子宮頸部細胞を固定し、室温、１０００ＲＰＭ、２分間の細胞遠心分離によって前記細胞をスライドに付着させ、ｐＨ６．０の０．０１Ｍクエン酸緩衝液中で３０分間前記スライドをインキュベートし、前記スライドをＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水）中で５分間洗浄し、前記スライドを、正常コウシ胎児血清ブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中１０％ＦＣＳ）で１０分間インキュベートし、１：５０、１：７５、または１：１００の希釈倍率（最適な希釈倍率は各抗体ごとに異なる）で、希釈剤緩衝液（ＴＢＳＴ中１ＦＣＳ）で希釈した一次モノクローナルマウス抗体とともに一時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で前記スライドを５分間洗浄し、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）と結合させた二次ウサギ抗マウス抗体とともにインキュベートし、その後、ＨＲＰ酵素用のＤＡＢ（ジアミノベンジジン色原体）基質とともに１０分間インキュベートし、蒸留水の中で１分間前記スライドをすすぎ洗いし、乾かしたあと、ＤＡＰＩ核染色液１滴を加えることを含む。これにより、一次抗体と反応した抗原を含む細胞が、茶色に発色する。明視野顕微鏡で２５０個の細胞を数えることができ、染色された細胞のパーセンテージを判定する。
【００４２】
膣鏡検査を受けた結果ＨＰＶ組み込みと子宮頸部病変が起こっていそうな患者から、一連の臨床試料を採取し、それに対して前記方法を使用して、本発明の発明者は下記表および図６〜９に示される結果を見出した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
上記および図６〜９に示されるような結果は、各患者について、だれが組み込みＨＰＶを有し、だれが有していないかが明瞭であることを示唆している。また、Ｅ６およびＥ７抗体について、それらを単独で使用したことからの情報は、それらを組み合わせて使用した時のものと同じであることを示している。最後に、これら患者の５／２０（２５％）がＨＰＶタイプ１６の組み込みについて陽性であったが、その患者らが既にパパニコロー検査で異常とわかっていた患者の一部であったことは注目に値する。
【００４５】
（実施モデル）
前記改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、いかなる規模または構造の検査室でも使用できる。好適には、すでにパパニコロー検査を実施している検査室や処置担当者によって当該方法が使用される。
【００４６】
前記改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、患者の管理改善のための子宮頸癌スクリーニングに付加価値のあるサービスを提供する、他に例を見ない採取プロセスをもたらす。前記方法は、能率的なアプローチでパパニコロー検査と免疫組織化学染色の両方を行うことによる細胞学的試料の分析を含み、それにより陽性の真偽のみならず、陰性の真偽をも、効率的に確定できるようにする。当該方法は、細胞採取プロセスが一度のみで、内科医または外科医に、従来の方法と比べてより明瞭で詳細な結果を提供する。この利点には以下のものが含まれる：女性のゲノムへのウィルスの組み込みが起こったことをマーカーが示すので、陽性と陰性との予測的な値が改善されている；細胞採取中の患者の快適さを改善することができる独自開発の採取プロセスである；低価格の解決策である；一度の試料採取から複数回分のスクリーニング検査を可能にする細胞量が得られるので、高度な均一性、質、および保全性を呈する十分な細胞を採取する；および、ＰＡＰ染色と免疫細胞化学検査との両方に一つのスライドが使用できる、能率的な検査プロセスである。
【００４７】
本発明の方法は、高価なタイプの特異的ＨＲ−ＨＰＶ検査方法へ移行する前の低価格な選択肢を提供し、感度と特異性の高くなった検査方法を提供することによってＡＳＣＵＳ試料の偽陽性を無くしてＡＳＣＵＳ試料の適切な分類を助け、子宮頸癌分子診断市場に参入して現在および未来の顧客に対する一連の複合的な診断サービスをさらに拡大するので、検査室にメリットを提供する。
【００４８】
上記方法が、子宮頸癌についての一次的スクリーニング検査としてパパニコロー検査を行うことなく使用できることも、明らかである。
【００４９】
前記発明は例示的な実施形態とともに説明されたが、本発明のその他の改良も、下記クレームの範疇にある本発明の範囲内で本発明に対しておこなわれてもよいことは、当業者に自明であるだろう。開示された詳細は、本発明を限定するものとはみなされない。
【００５０】
本願は、２００７年９月２５日出願の米国仮出願第60/975,069号、２００７年１２月６日出願の米国仮出願第60/992,892号、および２００８年９月１６日出願の米国出願第12/211,547号の恩恵を主張し、この参照により前記出願の全てを本願に包含するものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
ヒトヒト乳頭腫ウイルスのアミノ酸配列
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、身体、たとえば子宮頸部の、異常な組織の検出に使用するための、細胞のサンプリング、処理、およびスクリーニングに関する。当該開示は特に、（１）採取された細胞または細胞クラスターが、それらの生物学的特性が検査できるように調製され、（２）ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）が宿主ＤＮＡに組み込まれているこれら細胞が、ＨＰＶ組み込みマーカーで検出されるようにする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は侵襲性子宮頸癌および子宮頸部上皮内腫瘍の前駆体として広く研究されている。子宮頸癌は世界全体で見れば二番目に多い癌であり、発展途上国においては最も多い悪性腫瘍である。
【０００３】
子宮頸癌スクリーニングは、通常、細胞診と膣鏡診の分析に基づいて行われる。一般的に使用されている、子宮頸部の塗抹標本の細胞診（パパニコロー検査、パップ塗抹標本検査）によって、子宮頸癌の発生率と、子宮頸癌が原因の死亡率とが減少した。しかし、パップ塗抹標本検査を使用することには問題もある。従来のパップ塗抹標本検査の限界の一つに、細胞を移してもそれが細胞を正しく代表しない、ということがある。また、異物によって異常な細胞がわかりにくくなり、かかる従来の方法では、偽陰性結果または曖昧な結果が出たりすることが増加しかねない。
【０００４】
パパニコロー検査の形態はどれも、高度な前駆病変をスクリーニングすることに焦点を置き、これら前駆体が侵襲性の癌へ進行する前に治療が開始できるようにしている。前癌性病変および癌性病変について細胞学的ならびに生物学的に区別可能な等級の様子を効果的に区別し、伝えるために、子宮頸部細胞診報告のためのベセズダシステム（Bethesda System for Reporting Cervical Cytology）では、扁平上皮細胞異常を特徴付ける６つの分類を推奨した。前記６分類とは、（１）意義不明異型扁平上皮（ASCUS）、（２）高度扁平上皮病変を除外できない異型扁平上皮（ASC-H）、（３）軽度扁平上皮内病変（LSIL）、（４）高度扁平上皮内病変（HSIL）、（５）扁平上皮癌（SCC）、および（６）正常、である。このシステム下で、HSILはさらに、「HSIL（中程度異形成、CIN II）」または「HSIL（重度異形成、CIN III）」に分類されてもよい。ASC-H、LSIL、HSIL、およびSCCの追跡検査として、膣鏡検査、および可能であれば生検が推奨され、ASCUSにはＨＰＶ検査が推奨される。
【０００５】
＜ＨＰＶ病原＞
ＨＰＶのタイプは数多くある（＞１００）が、そのうちのいくつかだけが性器親和性である。子宮頸癌で選択的に検出されるＨＰＶのタイプは、ハイリスクタイプと分類され、それに対し、非悪性病変に主に検出されるものは、ローリスクタイプと指定されてきた。ハイリスクＨＰＶ−ＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みは、ＨＰＶ病原において重要な役割を果たす。ＨＰＶによって発現する遺伝子は、初期（Ｅ）および後期（Ｌ）発現遺伝子に分かれる。この組み込みは、Ｅ２ウィルス遺伝子の特異的破壊、および、Ｅ１、Ｅ４、およびＥ５遺伝子で開始されるその他のＥ遺伝子の転写と翻訳という結果になる。前記Ｅ２タンパク質はＥ６およびＥ７ウィルス癌遺伝子の転写を通常、負に制御し、Ｅ２が発現しないと、子宮頸癌細胞における前記Ｅ６およびＥ７遺伝子の無秩序な発現が起こる。
【０００６】
これら腫瘍性タンパク質は、主にタンパク質―タンパク質間の相互作用を介して機能して、細胞周期の進行と増殖とを調整する経路を破壊する。Ｅ６は、タンパク質分解酵素による分解のためのｐ５３を標的とし、結果的にｐ５３の転写経路を破壊し、通常ｐ５３によって抑制される数々の遺伝子のアップレギュレーションが起こる。前記Ｅ７遺伝子生成物は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子に対して同様の効果を有する。
【０００７】
＜ＨＰＶ検査＞
ＨＰＶ感染のほとんどの場合、治療とは無関係に退行するというのが、ＨＰＶの自然な経過である。ＨＰＶの組み込みの進行には、ハイリスクＨＰＶタイプの持続が必要である。患者のうちで、かかる進行が起こる割合は小さい。したがって、ＨＰＶ組み込みについて高い感度を持つスクリーニングテストが、早期診断および治療には望ましい。
【０００８】
ＨＰＶ検査で難しいのは、パパニコロー検査でASCUSと判断された女性である。ASCUSの場合に現在推奨されているのは、その患者がもし３０歳以上であれば、ＨＰＶ−ＤＮＡの有無についての検査を受けさせることである。ＨＰＶは数種の検査で検出できる。臨床用の設定の、もっともよく使用されている検査は、ダイジーン（Digene）Hc2検査であり、これはスタンダードキットとして入手可能である。この検査は、乳頭腫ウイルスの特定のタイプの判定を含み、従来の細胞学的スクリーニング手順の代りに使用するか、または、それに加えて使用することが推奨されている。
【０００９】
Digene Hc2検査の欠点の一つは、ハイブリダイゼーション法によってウイルスのＤＮＡの存在を同定するのみであることである。ほとんどの患者ではＨＰＶ感染が女性のゲノムに組み込まれることなく維持されているので、Digene Hc2検査が陽性であることは、ウィルスが存在するかどうかを臨床医に知らせるのみである。すなわち、前記検査は、ウィルスが実際に女性のゲノムに組み込まれているかどうかを示すわけではない。当然、臨床医がDigene Hc2検査から陽性の結果を得たとしても、癌細胞が本当に有るかどうかについての断定的な答えを出すことはできない。さらに、Digene Hc2検査は、複雑で時間がかかり、手間がかかり、高価である。
【００１０】
今までのところ、ＨＰＶ感染用の治療はない。そのため、ＨＰＶ感染の診断を受けた患者は、パパニコロー検査で癌の有無をモニターする回数を増やすだけであった。ＨＰＶ組み込みについての検査が求められているのは明らかである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、最も早い段階で治療できる病変について、細胞試料をスクリーニングすることを含む。一実施形態において、これは、ＰＡＰ染色および免疫組織化学検査の両方に単一の受付構造体を使用しうる、能率的な検査プロセスで達成され、感度と特異性を改善し、かつ、高価なＨＰＶ検査方法に代る低価格な代替手段を提供する。前記開示された方法は、ＨＰＶが女性のゲノムに組み込まれたかどうかを検出する、分子ベースのプロセスを提供する。
【００１２】
一実施形態において、細胞クラスターまたは細胞集塊（clumps）を採取するために好適に設計された細胞収集器によって、試料が採取される。一例においては、前記細胞クラスターまたは細胞集塊は、子宮頸部の腔（cervical cavity）の３６０度全方向から採取される。別の例においては、細胞クラスターや細胞集塊が採取されるときに、細胞収集器が前記細胞クラスターや細胞集塊の空間的位置関係を維持し、前記細胞の子宮頸部組織との空間的位置関係、すなわち子宮頸管内膜、子宮膣部、および形質転換領域との関係、ならびに四分円関係を表す、円状の「子宮頸部マップ」を作るようにする。
【００１３】
前記細胞が臨床医によって採取されると、例えばスライドなどの受付構造体へ移される。一実施形態においては、前記スライドはＰＡＰ染色される。一例において、もし前記結果が陽性であれば、同じスライドが今度は一つ以上のバイオマーカーを使用して免疫染色される。
【００１４】
前記使用されるバイオマーカーは、ＨＰＶ遺伝子タンパク質に対する抗体である。一例において、これらタンパク質は、ＨＰＶが患者のゲノムに組み込まれた場合にのみ検出される。例えば、免疫染色によって、ＨＰＶが患者のゲノムに組み込まれたかどうかを判定することができる。スライドが染色された後、前記スライドはスキャンされ、ＨＰＶ初期（Ｅ）遺伝子生成物（HPV early (E) gene products）を識別する抗体の程度が判定される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、細胞が採取されて、たとえばスライドなどの受付構造体へ移された後、前記スライドはバイオマーカーを使用してまず免疫染色され、スキャンされる。その後、還流検査（reflux test）としてどの試料をＰＡＰ染色するかが決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ１タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図２】図２は、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図３】図３は、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ６タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図５】図５は、主要なハイリスクタイプのＨＰＶのＥ７タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線部配列は、開示された方法の一実施形態において診断抗体を生成するために用いられるポリペプチドの共通領域を示す。
【図６】図６は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陰性であることを示す。
【図７】図７は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陽性であることを示す。
【図８】図８は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陰性であることを示す。
【図９】図９は、ＨＰＶタイプ１６のＥ６およびＥ７抗体で染色された子宮頸部細胞を示す。この染色は、子宮頸部細胞がＨＰＶ組み込みについて陽性であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（概要）
改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、ＨＰＶ組み込みを検出するための、分子ベースのプロセスを提供する。前記開示された方法は、同じスライド上でパパニコロー検査と免疫組織化学検査とを行う、能率的な手法を可能にする。前記開示された方法は、安価な、感度の高い、特異的で詳細な、かつ、評価と追従が簡単な、検査を提供する。
【００１８】
一般的に、前記方法は、細胞クラスターを採取する収集器の能力を改善し、スライドなどの受付構造体に採取された細胞クラスターを移すことを簡便にするように設計された収集器を使用して、細胞クラスターを採取する工程を含む。一例において、採集前の細胞クラスター中の細胞間に存在している空間的位置関係を維持するような手段で、細胞クラスターが収集器からスライドへ移動機構を使用して移される。
【００１９】
一実施形態において、検査室は、スライドにＰＡＰ染色を行う。使用されるＰＡＰ染色方法の種類は特に限定されず、従来から使用されているＰＡＰ染色方法であってもよい。
【００２０】
一例において前記方法は、前記検査が陰性であれば標準臨床ガイドラインに従うことを含む。前記検査が陽性であれば、前記スライドは、蛍光タグまたは比色タグ（colorimetric tag）と結合させた（conjugated）ＨＰＶ組み込みマーカー用の抗体を使用して染色される。一例において、使用される前記ＨＰＶ組み込みマーカーは、ＨＰＶ遺伝子生成物（タンパク質）である。使用されるＨＰＶ遺伝子生成物の種類は特に限定されず、その例としてはＥ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７タンパク質がある。使用される染色法およびマーカーは、ＨＰＶ組み込みマーカーの免疫組織化学局在測定が可能である限り、特に限定されない。
【００２１】
前記スライドはその後スキャンされる。使用されるスキャナーは特に限定されず、自動または手動スキャナー、または自動または手動顕微鏡であってもよい。前記スキャナーは、蛍光シグナルまたは色シグナルをスキャンして、ＨＰＶ遺伝子生成物が子宮頸部細胞に存在するかどうかを識別するために使用される。
【００２２】
（採取）
収集器は、細胞および細胞クラスターを採取するために使用される。前記収集器は、細胞および細胞クラスターを採取することが可能な収集器のいずれの形態でもよい。適切な収集器の例としては、公開米国特許出願US 2006/0189893号およびUS 2006/0161076号に記載され、この参照をもって前記出願の全てがここに包含される。使用されうる収集器のその他の詳細のうち、収集器の材料の組み合わせ、収集器の採取面の表面組織、採取中に収集器の伸長と回転の利用が、細胞クラスターの採取を簡便にする、と前記２つの公報は述べている。収集器は、子宮頸部の子宮頚管内膜領域および子宮膣部領域から細胞クラスターを採取する。
【００２３】
（受付構造体）
受付構造体が使用される場合、使用される前記受付構造体は特に限定されない。適切な受付構造体の例としては、スライド、シャーレ、膜（membrane）や、そのほか、その後の分析のために細胞または細胞クラスターを移すことが可能なその他の構造体などである。一例においては、前記受付構造体は、細胞および細胞クラスターが含まれている収集器の表面よりも大きい接着力を有し、前記収集器から前記受付構造体への細胞クラスターの移転を向上させている。前記受付構造体がスライドの場合、前記スライドは接着力が大きくなるコーティングで前処理されてもよい。適切なスライドの一例は、細胞のスライドへの接着を助けるポリ−Ｌ−リシン系コーティングを有する。
【００２４】
別の実施形態において、受付構造体は使用されない。この例では、子宮頸部細胞は固定液に懸濁状態で採取され、受付構造体を介在しないで、懸濁された細胞に直接、免疫学的検査が行われる。
【００２５】
（パパニコロー検査）
細胞クラスターがスライドなど適切な受付構造体に移されたら、従来のパパニコロー検査が行われる。この試験は、パパニコロー法に従ってスライドを染色し、ベセズダシステムにしたがって評価することを含む。前記細胞が正常と思われるなら、または萎縮、異形成、または炎症性変化を示していれば、細胞診は陰性と判断される。パップ塗抹が陽性なら、ASCUSか、それよりも悪いと判断される。
【００２６】
別の実施形態では、前記開示された方法は、免疫染色によってＨＰＶ組み込み検査を行った後に、還流検査としてパパニコロー検査を行うことを含む。
【００２７】
（免疫染色）
一例において、パパニコロー検査が陽性と確認されると、一種以上のＨＰＶ組み込みマーカーを使用して免疫染色が行われる。使用される前記免疫染色法は特に限定されない。例えば、直接または間接免疫染色が行われる。直接免疫染色が行われる場合、一次抗体に直接、検出系が共有結合するか、または結合する（conjugate）。使用される検出系は、蛍光体標識であっても、酵素基質標識であってもよい。
【００２８】
蛍光体マーカーが使用される場合、プロトコルの一例は、スライドを洗浄し、ブロッキング溶液でブロッキングし、蛍光体標識が結合したＨＰＶ−組み込みマーカー特異的抗体で染色し、その後前記スライドを洗浄することを含む。前記スライドは、それから、蛍光顕微鏡で手動で読み取られるか、または自動蛍光スキャナーで読み取られる。前記スキャナーは、ＤＮＡ中にＨＰＶを組み込んだ細胞中のＨＰＶ組み込みマーカーを検出し位置を特定する。ＨＰＶ組み込みマーカーの発現度数もまた、シグナルの定量的評価によって判定される。
【００２９】
酵素基質標識が使用される場合、可視化でき生成位置からの拡散が最小限である生成物を生成する基質系を、酵素が有していなければならない。使用される前記組織化学的酵素は特に限定されず、たとえば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはベータガラクトシダーゼのいずれであってもよい。このタイプの系のプロトコルの一例は、ブロッキング溶液でブロッキングし、組織化学酵素と結合したＨＰＶ組み込みマーカー特異的抗体とともにインキュベートし、スライドを洗浄し、基質で処理することを含む。前記基質は、クロモゲン基質であればよく、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アルファナフトールピロニン、４−クロロ−１−ナフトール、パラフェニレンジアミンピロカテコール、fast red TR、fast blue BB、BCIPINBT、テトラゾリウムブルー、またはBCIのいずれかひとつであればよい。前記スライドはそれから、自動比色定量スキャナーで読み取られ、シグナルの輝度が定量的に評価される。または、標準的な顕微鏡を使用して、スライドを観察して分子マーカーの有無と細胞に何らかの形態変化があるかとの両方を確認する。
【００３０】
間接的染色が使用された場合、プロトコルの一例は、ＨＰＶ組み込みマーカーに特異的な標識されていない一次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、組織化学的酵素標識と結合した二次抗体とともにインキュベートし、その後洗浄し検出することを含む。
【００３１】
（免疫組織化学染色の定量評価）
マーカーの発現度数を定量的に評価する方法は、特に限定されない。免疫蛍光染色の場合、スキャンされる組織構造の画像は、例えばAnalyzeなどの画像分析ソフトウエアを使用して評価できる。前記ソフトウエアで、シグナルの密度を判定し、輝度と面積の積（brightness-area-product, ＢＡＰ）を算出できる。前記ＢＡＰは、同じ染色条件下にあった同じ解剖学的領域における染色の強度を客観的に比較する手段を提供できる。ＢＡＰは、下記の式を使用して算出できる。
（範囲の画素輝度平均値 ― 範囲の最小輝度）(（範囲の画素数）
比色タグが使用される場合、ワンチップＣＣＤ赤緑青（ＲＧＢ）カラービデオカメラと標準的診断用顕微鏡とを使用して、スキャンされた画像がコンピュータのＳ−ＶＨＳポートへインポートされる。前記色シグナルを評価するために使用されるソフトウエアは、たとえばPhotoshopでもいいが、特に限定されない。もしPhotoshopが使用されるなら、前記シグナルは、たとえばHistogramコマンドを使用して、自動化された画像操作のためのベースとして色調分布を測定することで定量される。この特徴は、たとえばクロモゲンなど、使用される特定の基質について空間的情報が得られるようにし、全画像に対する百分率、または(m2であらわすことができる。
【００３２】
さらに別の実施形態においては、前記比色タグは陽性の細胞のパーセントを数えることによって定量化してもよい。
【００３３】
（ＨＰＶ組み込みマーカー）
一実施形態において、開示された方法に使用される抗体は、ＨＰＶ組み込みマーカーに特異的である。ここで「ＨＰＶ組み込みマーカーに対して特異的な抗体」とは、ＨＰＶ組み込みによる遺伝子生成物のエピトープなど、ＨＰＶ遺伝子のタンパク質生成物のエピトープに対する特異的な抗体を意味し、その例としては、たとえば、Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、および／またはＥ７があるが、これらには限定されない。ここで「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位のことを言う。前記抗原は、ポリペプチドまたはタンパク質生成物であってもよい。前記部位はポリペプチドであってもよい。一例において、エピトープは、抗原であってもよく、ＨＰＶ組み込みマーカーのポリペプチドを指してもよい。
【００３４】
一つのタンパク質またはポリペプチドのみに特異的である抗体が求められることが最も多いが、本発明の発明者らは、タンパク質ファミリーがハイリスクＨＰＶタイプのいずれから来たものであれ、それを識別する抗体を使用することを目的としている。そのためには、本発明の発明者たちは、該当の各タンパク質においてハイリスクタイプのＨＰＶが相互に共通する領域を選択した。図１Ａ〜１Ｃは、Ｅ１タンパク質の高度に保全された領域を示す。図２は、Ｅ４タンパク質の高度に保全された領域を示す。図３は、Ｅ５タンパク質の高度に保全された領域を示す。図４Ａおよび４Ｂは、Ｅ６タンパク質の高度に保全された領域を示す。図５は、Ｅ７タンパク質の高度に保全された領域を示す。
【００３５】
（抗体の調製）
抗体は、先行技術文献に記載された、抗原混合物の接種と追加免疫用接種とによる標準的な免疫技術を使用して、たとえばマウスやウサギなどの適切な動物で産生できる。モノクローナルパネルの調製には、免疫された動物を殺して脾臓細胞を不朽化のために摘出し、所望の抗体を生成することが可能な細胞を得る。これら細胞からの上清液は、該当の抗体の存在についての最初の検査として、注入されたポリペプチドでスクリーニングされる。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
一例では、ＨＰＶ−Ｅ１遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第２０２位：SNAKAMLAKFKELYGC（配列番号１）、
ＨＰＶタイプ１８の第２０８位：NNKQGAMLAVFKDTYGC（配列番号２）、
ＨＰＶタイプ１６の第２９３位：LSKLLCVSPMC(ACM)MMIEPPKLR（配列番号３）、
ＨＰＶタイプ１８の第３０１位：LSTLLHVPETAMLIEPPKLR（配列番号４）、
ＨＰＶタイプ３３、５２、および５８の第２８６位：LSSLLNIPQSQMLIQPPKLR（配列番号５）、
ＨＰＶタイプ１６の第６０６位：DKNWKSFFSRTWC（配列番号６）、
ＨＰＶタイプ１８の第６１３位：DKNWKCFFERTWC（配列番号７）、
ＨＰＶタイプ２６、５１、６６、および７３の第５８７位：NENWKAFFTKTWC（配列番号８）、
ＨＰＶタイプ１６の第６４０位：CVSGQNTNTL（配列番号９）、
ＨＰＶタイプ１８の第６４８位：CLRAGQNHRPL（配列番号１０）、および
ＨＰＶタイプ２６、３１、３３、３９、４５、５１、５２、５８、および５９の第６２０位：CSTGENIRSI（配列番号１１）。
【００３７】
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ４遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第４４位：RRLSSDQD（配列番号１２）、
ＨＰＶタイプ１６の第７９位：LTAHQTK（配列番号１３）、
ＨＰＶタイプ１６の第８５位：DGLTVIVTL（配列番号１４）。
【００３８】
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ５遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ５２、５８、および３３の第５位：VFC(ACM)FILFLC(ACM)LC（配列番号１５）、
ＨＰＶタイプ３５の第１５位：LC(ACM)FC(ACM)VLLC(ACM)LCL （配列番号１６）、
ＨＰＶタイプ１８の第３０位：AYAWVLVFVYIVV（配列番号１７）、
ＨＰＶタイプ５１および６９の第３１位：PLLLSQYVFAAHLLLII（配列番号１８）、
ＨＰＶタイプ１６の第３７位：STYTSLIOLV（配列番号１９）、および
ＨＰＶタイプ７３の第５１位：FFLYVLVFYIF（配列番号２０）。.
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ６遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第１２６位： LDKKRRFHNI（配列番号２１）、LNEKKRFHNI （配列番号２２）、LDKKQRFHNI（配列番号２３）、
ＨＰＶタイプ１６の第１２９位：KQRFHNIRGRWTGRC（配列番号２４）、KRRFHNIAGRYTGQC（配列番号２５）、およびNKRFHNIRGRWTGRC（配列番号２６）。
【００３９】
別の例では、ＨＰＶ−Ｅ７遺伝子を使用して、ポリペプチドに対する抗体が産生された。抗体を産生するために使用されるポリペプチドの特定の例を下記に示す。
ＨＰＶタイプ１６の第２９位：DSSEENDEID（配列番号２７）、
ＨＰＶタイプ１６の第４１位：PAGGA（配列番号２８）、および
ＨＰＶタイプ１６の第８９位：VCPIC（配列番号２９）。
【００４０】
上記ポリペプチドは、一つの分析混合物中でハイリスクタイプのＨＰＶ全てを識別するために、それらに対する抗体が組み合わせられて使用できるように構成された。
【００４１】
（実施例２）
開示された方法の一例は、子宮頸部細胞を固定し、室温、１０００ＲＰＭ、２分間の細胞遠心分離によって前記細胞をスライドに付着させ、ｐＨ６．０の０．０１Ｍクエン酸緩衝液中で３０分間前記スライドをインキュベートし、前記スライドをＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水）中で５分間洗浄し、前記スライドを、正常コウシ胎児血清ブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中１０％ＦＣＳ）で１０分間インキュベートし、１：５０、１：７５、または１：１００の希釈倍率（最適な希釈倍率は各抗体ごとに異なる）で、希釈剤緩衝液（ＴＢＳＴ中１ＦＣＳ）で希釈した一次モノクローナルマウス抗体とともに一時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で前記スライドを５分間洗浄し、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）と結合させた二次ウサギ抗マウス抗体とともにインキュベートし、その後、ＨＲＰ酵素用のＤＡＢ（ジアミノベンジジン色原体）基質とともに１０分間インキュベートし、蒸留水の中で１分間前記スライドをすすぎ洗いし、乾かしたあと、ＤＡＰＩ核染色液１滴を加えることを含む。これにより、一次抗体と反応した抗原を含む細胞が、茶色に発色する。明視野顕微鏡で２５０個の細胞を数えることができ、染色された細胞のパーセンテージを判定する。
【００４２】
膣鏡検査を受けた結果ＨＰＶ組み込みと子宮頸部病変が起こっていそうな患者から、一連の臨床試料を採取し、それに対して前記方法を使用して、本発明の発明者は下記表および図６〜９に示される結果を見出した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
上記および図６〜９に示されるような結果は、各患者について、だれが組み込みＨＰＶを有し、だれが有していないかが明瞭であることを示唆している。また、Ｅ６およびＥ７抗体について、それらを単独で使用したことからの情報は、それらを組み合わせて使用した時のものと同じであることを示している。最後に、これら患者の５／２０（２５％）がＨＰＶタイプ１６の組み込みについて陽性であったが、その患者らが既にパパニコロー検査で異常とわかっていた患者の一部であったことは注目に値する。
【００４５】
（実施モデル）
前記改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、いかなる規模または構造の検査室でも使用できる。好適には、すでにパパニコロー検査を実施している検査室や処置担当者によって当該方法が使用される。
【００４６】
前記改良型子宮頸癌スクリーニング方法は、患者の管理改善のための子宮頸癌スクリーニングに付加価値のあるサービスを提供する、他に例を見ない採取プロセスをもたらす。前記方法は、能率的なアプローチでパパニコロー検査と免疫組織化学染色の両方を行うことによる細胞学的試料の分析を含み、それにより陽性の真偽のみならず、陰性の真偽をも、効率的に確定できるようにする。当該方法は、細胞採取プロセスが一度のみで、内科医または外科医に、従来の方法と比べてより明瞭で詳細な結果を提供する。この利点には以下のものが含まれる：女性のゲノムへのウィルスの組み込みが起こったことをマーカーが示すので、陽性と陰性との予測的な値が改善されている；細胞採取中の患者の快適さを改善することができる独自開発の採取プロセスである；低価格の解決策である；一度の試料採取から複数回分のスクリーニング検査を可能にする細胞量が得られるので、高度な均一性、質、および保全性を呈する十分な細胞を採取する；および、ＰＡＰ染色と免疫細胞化学検査との両方に一つのスライドが使用できる、能率的な検査プロセスである。
【００４７】
本発明の方法は、高価なタイプの特異的ＨＲ−ＨＰＶ検査方法へ移行する前の低価格な選択肢を提供し、感度と特異性の高くなった検査方法を提供することによってＡＳＣＵＳ試料の偽陽性を無くしてＡＳＣＵＳ試料の適切な分類を助け、子宮頸癌分子診断市場に参入して現在および未来の顧客に対する一連の複合的な診断サービスをさらに拡大するので、検査室にメリットを提供する。
【００４８】
上記方法が、子宮頸癌についての一次的スクリーニング検査としてパパニコロー検査を行うことなく使用できることも、明らかである。
【００４９】
前記発明は例示的な実施形態とともに説明されたが、本発明のその他の改良も、下記クレームの範疇にある本発明の範囲内で本発明に対しておこなわれてもよいことは、当業者に自明であるだろう。開示された詳細は、本発明を限定するものとはみなされない。
【００５０】
本願は、２００７年９月２５日出願の米国仮出願第60/975,069号、２００７年１２月６日出願の米国仮出願第60/992,892号、および２００８年９月１６日出願の米国出願第12/211,547号の恩恵を主張し、この参照により前記出願の全てを本願に包含するものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
ヒトヒト乳頭腫ウイルスのアミノ酸配列
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の組み込みをスクリーニングする方法であって、
（ａ）子宮頸部から採取された細胞および細胞クラスターの試料の一部である細胞および細胞クラスターに、ＨＰＶ組み込み検出マーカーを適用し、
（ｂ）前記細胞および細胞クラスターを分析することから得られる情報を手動で、または自動化された手段で読み取ることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ組み込み検出マーカーは抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体は、ＨＰＶ組み込みマーカーに対する特異的な抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＰＶ組み込みマーカーは、Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は、共通アミノ酸配列を有するポリペプチドと反応し、前記共通アミノ酸配列は、前記抗体が一つ以上のハイリスクＨＰＶタイプのポリペプチドと反応するようにする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
子宮頸部の異常組織を検出する方法であって、
収集器を使用して前記子宮頸部から細胞および細胞クラスターを採取し、
前記収集器によって採取された細胞および細胞クラスターの少なくとも一部を、受付構造体へ移すか、または前記受付構造体へ移すことが可能な液体ベースの試料中で懸濁状態にし、
前記受付構造体へ移された前記細胞および細胞クラスターに、細胞学的ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）組み込み検出マーカーを適用し、
ＨＰＶ組み込みについて前記細胞および細胞クラスターを、手動で、または自動化された手段で分析することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記細胞および細胞クラスターが前記受付構造体へ移された後、前記細胞および細胞クラスターを採取した後の前記収集器上の残った細胞を、バイアル中の懸濁液に入れる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイアル中の前記採取された細胞の一定部分が、ＨＰＶ組み込みについての免疫的検査に使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記採取された細胞の全ては、バイアルやその他の容器の懸濁液に入れられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイアル中の懸濁液中の細胞は、ＨＰＶ組み込みについての免疫学的検査に使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記受付構造体は、スライド、シャーレ、または膜である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
パパニコロー法に従って、前記受付構造体に移された前記細胞および細胞クラスターを染色し、ベセズダシステムに従って前記染色された細胞を評価することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の組み込みをスクリーニングする方法であって、
（ａ）子宮頸部から採取された細胞および細胞クラスターの試料の一部である細胞および細胞クラスターに、ＨＰＶ組み込み検出マーカーを適用し、
（ｂ）前記細胞および細胞クラスターを分析することから得られる情報を手動で、または自動化された手段で読み取ることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ組み込み検出マーカーは抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体は、ＨＰＶ組み込みマーカーに対する特異的な抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＰＶ組み込みマーカーは、Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は、共通アミノ酸配列を有するポリペプチドと反応し、前記共通アミノ酸配列は、前記抗体が一つ以上のハイリスクＨＰＶタイプのポリペプチドと反応するようにする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
子宮頸部の異常組織を検出する方法であって、
収集器を使用して前記子宮頸部から細胞および細胞クラスターを採取し、
前記収集器によって採取された細胞および細胞クラスターの少なくとも一部を、受付構造体へ移すか、または前記受付構造体へ移すことが可能な液体ベースの試料中で懸濁状態にし、
前記受付構造体へ移された前記細胞および細胞クラスターに、細胞学的ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）組み込み検出マーカーを適用し、
ＨＰＶ組み込みについて前記細胞および細胞クラスターを、手動で、または自動化された手段で分析することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記細胞および細胞クラスターが前記受付構造体へ移された後、前記細胞および細胞クラスターを採取した後の前記収集器上の残った細胞を、バイアル中の懸濁液に入れる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイアル中の前記採取された細胞の一定部分が、ＨＰＶ組み込みについての免疫的検査に使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記採取された細胞の全ては、バイアルやその他の容器の懸濁液に入れられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイアル中の懸濁液中の細胞は、ＨＰＶ組み込みについての免疫学的検査に使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記受付構造体は、スライド、シャーレ、または膜である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
パパニコロー法に従って、前記受付構造体に移された前記細胞および細胞クラスターを染色し、ベセズダシステムに従って前記染色された細胞を評価することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５４０９３２（Ｐ２０１０−５４０９３２Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７０３８（Ｐ２０１０−５２７０３８）
【出願日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６８１３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２４８８
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５１００８２７８７）キャンヴァー，インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６８１３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２４８８
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５１００８２７８７）キャンヴァー，インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
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