説明

改良Fc受容体およびその製造方法

【課題】Ig(免疫グロブリン)Gに対して高度な親和性を有するFc結合性タンパク質を改良することで、熱、酸および/またはアルカリに対する安定性が向上したFc結合性タンパク質およびその製造方法の提供。
【解決手段】野生型ヒトFc受容体のうち、細胞外領域にある1つ以上の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、野生型ヒトFc受容体と比較し熱、酸および/またはアルカリに対する安定性が向上したFc結合性タンパク質。当該Fc結合性タンパク質を固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィー用リガンド。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち、16番目から289番目までのアミノ酸を含むFc結合性タンパク質であって、以下の(1)から(168)のいずれかに記載のアミノ酸置換を1つ以上含む、該Fc結合性タンパク質。
(1)配列番号1の20番目のスレオニンがプロリンに置換
(2)配列番号1の25番目のスレオニンがリジンに置換
(3)配列番号1の38番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
(4)配列番号1の46番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
(5)配列番号1の62番目のアラニンがバリンに置換
(6)配列番号1の63番目のスレオニンがイソロイシンに置換
(7)配列番号1の69番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
(8)配列番号1の71番目のアルギニンがヒスチジンに置換
(9)配列番号1の77番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
(10)配列番号1の78番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
(11)配列番号1の94番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
(12)配列番号1の100番目のイソロイシンがバリンに置換
(13)配列番号1の110番目のセリンがアスパラギンに置換
(14)配列番号1の114番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
(15)配列番号1の125番目のヒスチジンがアルギニンに置換
(16)配列番号1の131番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
(17)配列番号1の149番目のトリプトファンがロイシンに置換
(18)配列番号1の156番目のロイシンがプロリンに置換
(19)配列番号1の160番目のイソロイシンがメチオニンに置換
(20)配列番号1の163番目のアスパラギンがセリンに置換
(21)配列番号1の195番目のアスパラギンがスレオニンに置換
(22)配列番号1の199番目のスレオニンがセリンに置換
(23)配列番号1の206番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
(24)配列番号1の207番目のロイシンがプロリンに置換
(25)配列番号1の218番目のロイシンがバリンに置換
(26)配列番号1の240番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
(27)配列番号1の248番目のロイシンがセリンに置換
(28)配列番号1の283番目のロイシンがヒスチジンに置換
(29)配列番号1の285番目のロイシンがグルタミンに置換
(30)配列番号1の17番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
(31)配列番号1の19番目のスレオニンがイソロイシンに置換
(32)配列番号1の20番目のスレオニンがイソロイシンに置換
(33)配列番号1の25番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
(34)配列番号1の27番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
(35)配列番号1の35番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
(36)配列番号1の36番目のグルタミン酸がグリシンに置換
(37)配列番号1の41番目のロイシンがメチオニンに置換
(38)配列番号1の42番目のヒスチジンがロイシンに置換
(39)配列番号1の44番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
(40)配列番号1の45番目のバリンがアラニンに置換
(41)配列番号1の46番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
(42)配列番号1の47番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
(43)配列番号1の49番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
(44)配列番号1の50番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
(45)配列番号1の51番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
(46)配列番号1の52番目のセリンがグリシンに置換
(47)配列番号1の53番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
(48)配列番号1の55番目のグルタミンがアルギニンに置換
(49)配列番号1の57番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
(50)配列番号1の58番目のロイシンがアルギニンに置換
(51)配列番号1の60番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
(52)配列番号1の61番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
(53)配列番号1の62番目のアラニンがグルタミン酸に置換
(54)配列番号1の63番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
(55)配列番号1の64番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
(56)配列番号1の65番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
(57)配列番号1の66番目のセリンがスレオニンに置換
(58)配列番号1の67番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
(59)配列番号1の69番目のセリンがアラニンに置換
(60)配列番号1の70番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
(61)配列番号1の71番目のアルギニンがチロシンに置換
(62)配列番号1の73番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
(63)配列番号1の74番目のセリンがフェニルアラニンに置換
(64)配列番号1の76番目のセリンがアスパラギンに置換
(65)配列番号1の77番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
(66)配列番号1の78番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
(67)配列番号1の80番目のセリンがアラニンに置換
(68)配列番号1の84番目のアルギニンがセリンに置換
(69)配列番号1の88番目のグリシンがセリンに置換
(70)配列番号1の89番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
(71)配列番号1の90番目のセリンがグリシンに置換
(72)配列番号1の92番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
(73)配列番号1の96番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
(74)配列番号1の97番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
(75)配列番号1の101番目のヒスチジンがロイシンに置換
(76)配列番号1の102番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
(77)配列番号1の103番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
(78)配列番号1の111番目のセリンがアラニンに置換
(79)配列番号1の114番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
(80)配列番号1の115番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
(81)配列番号1の118番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
(82)配列番号1の121番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
(83)配列番号1の128番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
(84)配列番号1の129番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
(85)配列番号1の131番目のロイシンがグルタミンに置換
(86)配列番号1の133番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
(87)配列番号1の134番目のアスパラギンがセリンに置換
(88)配列番号1の137番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
(89)配列番号1の138番目のチロシンがヒスチジンに置換
(90)配列番号1の139番目のアルギニンがヒスチジンに置換
(91)配列番号1の140番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
(92)配列番号1の141番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
(93)配列番号1の142番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
(94)配列番号1の144番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
(95)配列番号1の147番目のフェニルアラニンがセリンに置換
(96)配列番号1の148番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
(97)配列番号1の149番目のトリプトファンがアルギニンに置換
(98)配列番号1の151番目のセリンがスレオニンに置換
(99)配列番号1の152番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
(100)配列番号1の154番目のスレオニンがセリンに置換
(101)配列番号1の156番目のロイシンがヒスチジンに置換
(102)配列番号1の157番目のリジンがアルギニンに置換
(103)配列番号1の159番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
(104)配列番号1の160番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
(105)配列番号1の161番目のセリンがスレオニンに置換
(106)配列番号1の165番目のスレオニンがメチオニンに置換
(107)配列番号1の171番目のメチオニンがスレオニンに置換
(108)配列番号1の173番目のリジンがアルギニンに置換
(109)配列番号1の174番目のヒスチジンがグルタミンに置換
(110)配列番号1の177番目のスレオニンがセリンに置換
(111)配列番号1の181番目のイソロイシンがスレオニンに置換
(112)配列番号1の182番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
(113)配列番号1の184番目のスレオニンがセリンに置換
(114)配列番号1の190番目のプロリンがセリンに置換
(115)配列番号1の193番目のバリンがロイシンに置換
(116)配列番号1の195番目のアスパラギンがアラニンに置換
(117)配列番号1の196番目のアラニンがセリンに置換
(118)配列番号1の198番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
(119)配列番号1の199番目のスレオニンがアラニンに置換
(120)配列番号1の200番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
(121)配列番号1の202番目のロイシンがメチオニンに置換
(122)配列番号1の203番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
(123)配列番号1の204番目のグルタミン酸がバリンに置換
(124)配列番号1の207番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
(125)配列番号1の209番目のスレオニンがアラニンに置換
(126)配列番号1の211番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
(127)配列番号1の213番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
(128)配列番号1の215番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
(129)配列番号1の217番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
(130)配列番号1の218番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
(131)配列番号1の219番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
(132)配列番号1の223番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
(133)配列番号1の224番目のグルタミンがアルギニンに置換
(134)配列番号1の225番目のロイシンがグルタミンに置換
(135)配列番号1の227番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
(136)配列番号1の230番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
(137)配列番号1の231番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
(138)配列番号1の233番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
(139)配列番号1の234番目のリジンがグルタミン酸に置換
(140)配列番号1の240番目のアスパラギンがグリシンに置換
(141)配列番号1の244番目のグルタミン酸がバリンに置換
(142)配列番号1の245番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
(143)配列番号1の246番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
(144)配列番号1の248番目のロイシンがイソロイシンに置換
(145)配列番号1の249番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
(146)配列番号1の250番目のアラニンがバリンに置換
(147)配列番号1の251番目のアルギニンがセリンに置換
(148)配列番号1の252番目のアルギニンがヒスチジンに置換
(149)配列番号1の253番目のグルタミン酸がグリシンに置換
(150)配列番号1の257番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
(151)配列番号1の261番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
(152)配列番号1の262番目のアラニンがバリンに置換
(153)配列番号1の263番目のアラニンがセリンに置換
(154)配列番号1の264番目のスレオニンがセリンに置換
(155)配列番号1の265番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
(156)配列番号1の268番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
(157)配列番号1の270番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
(158)配列番号1の271番目のリジンがアルギニンに置換
(159)配列番号1の272番目のアルギニンがグルタミンに置換
(160)配列番号1の277番目のグルタミン酸がバリンに置換
(161)配列番号1の279番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
(162)配列番号1の282番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
(163)配列番号1の283番目のロイシンがプロリンに置換
(164)配列番号1の285番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
(165)配列番号1の286番目のプロリンがグルタミン、アルギニン、セリンまたはグルタミン酸に置換
(166)配列番号1の287番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニン、バリンまたはセリンに置換
(167)配列番号1の288番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
(168)配列番号1の289番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
【請求項2】
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち、16番目から289番目までのアミノ酸を含むFc結合性タンパク質であって、少なくとも以下の(4)、(14)、(41)および(79)のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のFc結合性タンパク質。
(4)配列番号1の46番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
(14)配列番号1の114番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
(41)配列番号1の46番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
(79)配列番号1の114番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
【請求項3】
配列番号2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174および176のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、34番目から307番目までのアミノ酸を含む、請求項2に記載のFc結合性タンパク質。
【請求項4】
配列番号2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174および176のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項2に記載のFc結合性タンパク質。
【請求項5】
請求項1から4のいずれかに記載のFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項7】
請求項6に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項8】
宿主が大腸菌である、請求項7に記載の形質転換体。
【請求項9】
請求項7または8に記載の形質転換体を用いた、Fc結合性タンパク質の製造方法。
【請求項10】
請求項1から4のいずれかに記載のFc結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、Fc結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材。
【請求項11】
(1)配列番号114、118、130、134、148、154、164、170、174および176のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるFc結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、Fc結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材に、抗体を含む溶液を添加して該吸着材に該抗体を吸着させる工程と、
(2)該吸着材に吸着した該抗体をpH3.0から4.5の緩衝液を用いて溶出させる工程と、
を含む抗体精製法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【公開番号】特開2011−206046(P2011−206046A)
【公開日】平成23年10月20日(2011.10.20)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−38500(P2011−38500)
【出願日】平成23年2月24日(2011.2.24)
【出願人】(000173762)公益財団法人相模中央化学研究所 (151)
【出願人】(000003300)東ソー株式会社 (1,901)
【Fターム(参考)】