放出されたピロリン酸を検出することによるオリゴヌクレオチド連結アッセイ
本発明は、核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための新規な方法に関する。本発明の方法は、連結反応を行うことに基づいており、そこでは連結副生成物が検出されて、所望によりヌクレオチド反復を含む核酸サンプル中のヌクレオチド反復単位の数を決定するために使用される。本発明は、本発明の方法を行うためのキット、および本発明の方法を行うための成分を含む組成物にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連結反応を行い、連結副生成物を検出することによって核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的変異は疾患に関係づけられることが多く、遺伝的変異の同定は臨床的診断における重要な手段である。遺伝的変異は、一塩基のレベルでの違い（塩基の変化、挿入または欠失を伴う突然変異およびＳＮＰ）、数塩基のレベルでの違い（典型的にはコドン欠失を伴う）、または、遺伝子全体の増加までの様々な長さの反復した配列の変化する数のレベルでの違いを伴う。
【０００３】
ヌクレオチド反復の拡大は種々の遺伝病に関係づけられることが示されている。例としては、脆弱Ｘ（Ｗｅｂｂ，ＴＰ他，１９８６年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５７３；Ｇｕｓｔａｖｓｏｎ，ＫＨ他，１９８６年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５８１）、筋緊張性ジストロフィー（Ｈａｒｐｅｒ，ＰＳ他，１９８９年、Ｍｙｏｔｏｎｉｃ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（第２版）、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ、ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９８９年）およびハンチントン病（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，ＭＥ他，１９９３年、Ｃｅｌｌ．７２：９７１）が含まれる。これらのヌクレオチド反復は、例えば、ＰＣＲに基づくアッセイおよびサザンブロッティング技術を使用して分析されている。さらに、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復が、遺伝子マッピングプロジェクトにおいて、また、父子鑑定のような種々の法医学的適用において広範囲に使用されている。
【０００４】
パイロシーケンス（商標）（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、ピロリン酸の放出の検出および酵素によるヌクレオチド分解に基づく、王立技術研究所（ストックホルム）で開発された、合成による配列決定の方法である（米国特許第６２１０８９１号および米国特許第６２５８５６８号）。合成による配列決定のこの方法では、従来のサンガー配列決定とは対照的に、ヌクレオチドが配列決定反応時に１つずつ加えられる。使用される酵素混合物は４つの異なる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ−スルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ）からなる。ヌクレオチドが、使用者によって、テンプレートに依存する指定された順序に従って順次加えられ、決定される。加えられたヌクレオチドがテンプレートと一致するならば、ＤＮＡポリメラーゼがそのヌクレオチドを成長途中のＤＮＡ鎖に取り込み、ピロリン酸（ＰＰｉ）が放出される。ＡＴＰ−スルフリラーゼにより、ＰＰｉがＡＴＰに変換され、第３の酵素（ルシフェラーゼ）により、ＡＴＰが光シグナルに転換される。これらの反応の後、第４の酵素（アピラーゼ）により、過剰なヌクレオチドおよびＡＴＰが分解され、テンプレートが、その時点で次の反応サイクル（すなわち、別のヌクレオチド添加）のために使用できる状態になる。ヌクレオチドが取り込まれない限り、ＰＰｉが放出されないので、光シグナルは、正しいヌクレオチドが取り込まれたときにだけ生じることになる。パイロシーケンスは、合成による配列決定に基づくリアルタイムのＤＮＡ配列決定法である。この方法は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）スコア化、より短いＤＮＡ領域（識別タグ）の配列決定、および対立遺伝子頻度の評価のための迅速かつ正確な方法であることが判明している（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．，リアルタイムのピロリン酸に基づく配列決定法（１９９８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８１、３６３〜３６５；Ａｌｄｅｒｂｏｒｎ，Ａ．，Ｋｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．リアルタイムのピロリン酸ＤＮＡ配列決定による単一ヌクレオチド多型の決定（２０００年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１２４９〜１２５８）。
【０００５】
パイロシーケンスの形態での合成による配列決定は遺伝的変異の分析において多くの利点を有する。例えば、ＳＮＰ分析のために使用されている他の技術（例えば、ハイブリダイゼーション技術、ミニ配列分析、ＲＦＬＰおよびＳＳＣＰなど）と比較した場合、合成による配列決定では、周りの配列を示すことによって、多型位置だけでなく正しいＳＮＰ位置を調査できることが確認される。さらに、パイロシーケンスは、分離工程を伴わず、かつ自動化可能な様式でのリアルタイム分析を提供する迅速な技術であり、このことは、ＳＳＣＰおよびＲＦＬＰと比較して有益であり、従って、パイロシーケンスは遺伝子分析のための魅力的な方法である。
【０００６】
しかしながら、パイロシーケンスは、１塩基〜１００塩基の範囲での短いヌクレオチド範囲を分析するときに最も効果的である。この方法は、一致しないプライマー伸長（いわゆる「シフト」）の生成物の蓄積によって主に制限される。シフトは、例えば、最適でないレベルのヌクレオチドの存在に起因するプライマーの不完全な伸長または過度な伸長の結果である。均一なパイロシーケンス反応では、正しいヌクレオチドを取り込むＤＮＡポリメラーゼと、取り込まれなかったヌクレオチドを分解するアピラーゼとの間での競合が伴う。正しいヌクレオチドのレベルが、取り込み工程時においてＤＮＡポリメラーゼについての最適値よりも低くなる場合、一部のプライマーのさらなる伸長が不完全となる。その結果は、正しい完全に伸長したプライマーよりも１塩基または数塩基短い伸長されたプライマー分子の集団である（いわゆるマイナスシフト）。他方で、アピラーゼが、ヌクレオチドを分解することにおいて十分に効果的でない場合、過剰な取り込まれていないヌクレオチドが反応液に残留し得るし、また、次の正しいヌクレオチドが与えられ、かつ取り込まれ、配列により、所望されないヌクレオチドバックグラウンドを使用するさらなる伸長が可能になる特定の状況では取り込まれ得る（いわゆるプラスシフト）。さらなる現象では、ＤＮＡポリメラーゼの活性を妨げ、従って、不完全な取り込みおよびマイナスシフトを生じさせる複雑な二次構造を有するテンプレートが伴う。これらの誤りは、当然のことではあるが、プライマー伸長の数が増大するにつれて増大する。従って、ヌクレオチド反復数を推定するための一ヌクレオチド伸長による核酸の延長に依存する技術の正確性は、ヌクレオチド反復数および長さが増大するにつれて低下する。
【０００７】
米国特許第６３０９８２９号には、ヌクレオチド反復数を分析するための方法が記載され、この方法では、プライマーがテンプレート核酸にアニーリングされ、一ヌクレオチドずつ伸長し、かつ、ヌクレオチドは標識され、伸長が起こったことの目安としての測定可能なシグナルを与える。最後に加えられたヌクレオチドの標識が、その後、次のヌクレオチドが加えられる前に除かれる。１つのサイクルでのシグナルが前回の反応でのシグナルよりも実質的に小さくなるまで、伸長が続けられる。
【０００８】
連結反応に基づく方法は近年、遺伝的変異の分析における重要な手段になっている。米国特許第５６９５９３３号には、ヌクレオチド反復の拡大を検出するための、ＲＥＤ（反復拡大検出）と呼ばれる方法が記載され、この方法では、反復配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドがリガーゼの存在下で反復配列にアニーリングされる。その後、リガーゼは、並置されたオリゴヌクレオチドをつないで、連結されたオリゴヌクレオチドの多量体を生じさせる。多量体および標的ヌクレオチドの複合体が、その後、変性し、アニーリング、連結および変性の新たな一連の操作が開始される。多量体の長さが最終的には、ゲル分離を伴う技術によって決定される。生じた多量体の長さにより、拡大したオリゴヌクレオチド反復の長さが示され、これにより、次に、サンプリングされた個体の遺伝子状態を示すことができる。この方法では、より長い核酸範囲が分析されることになる場合でさえ、反復数を推定することが可能になる。しかしながら、この分析方法では、放射能標識されたＤＮＡのゲルに基づく分離、それに続くハイブリダイゼーションによる検出、または、放射能標識されたＤＮＡの直接的な検出を伴う。このような検出は、時間および手間が非常にかかり、リアルタイムの分析ができない。さらに、ゲルに基づく分離は、より大きなＤＮＡフラグメントの分解能が低く、このことは、反復数に関して不明瞭な結果をもたらすことになる。
【０００９】
まとめると、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復数を含めて、遺伝的変異の迅速かつ正確な分析を可能にする新しい方法が依然として求められている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、連結反応を行い、連結副生成物を検出することによって、ヌクレオチド反復の数を推定するだけでなく、他の遺伝因子（例えば、微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにする新しい方法を見出している。第１の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための方法に関連する：
ａ）遺伝因子を含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）この核酸サンプルの遺伝因子を含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、遺伝因子の存在の指標として検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【００１１】
連結副生成物の量は、起こった連結反応の数に比例しているので、連結反応の数を、どのくらいの連結副生成物が生じているかを明らかにすることによって計算することができる。あるいは、本発明の１つの実施形態において、連結サイクルが続いて行われ、１つの連結反応の存在が、その次の反応が開始される前に検出される。この場合、存在する遺伝因子（例えば、反復した核酸配列における反復ユニットなど）の数を決定するために、（生じた連結副生成物の実際の量ではなく）連結反応が起こっているか否かを検出することが必要であるだけである。本発明はまた、本発明の方法を行うためのキット、および、本発明の方法を行うために必要な成分を含む組成物に関連する。本発明において、連結生成物そのものではなく、連結副生成物が分析されるので、本発明は、ヌクレオチド反復の数を決定する新しい方法を開拓している。本発明は、ヌクレオチド反復配列におけるヌクレオチド反復ユニットの数、または、微生物型決定のためのマーカーを、様々な遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含む非常に長い配列の場合でさえ、これまでに可能であったよりも迅速に、かつ、手間がかからない方法で、かつ、正確に明らかにすることを可能にする。加えて、分析をリアルタイムで行うことができる。本発明はまた、必要な場合には、ヘテロ接合サンプルにおけるヌクレオチド反復などの遺伝因子の数を決定することを可能にする。
【００１２】
図面の簡単な記述
図１は本発明による、いわゆる「終点」分析を説明する図である。
図２は本発明による、いわゆる「段階的」分析を説明する図である。
図３は熱サイクル処理による連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結、それに続く生物発光検出を示す図である。
図４は生物発光検出に連係した連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結（プレアニーリングされたプライマー／テンプレート複合体に対するリガーゼ工程およびＰＰＤＫ工程の組合せ）を示す図である。
図５はＣＴＧ反復数の違いの検出を示す図である。
図６ａは、遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結を示す図であり、ＡＴＰ依存性リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）と、補因子としてのＡＴＰとの使用を示す図である。アピラーゼが、過剰な補因子を減少させるために使用される。図６ｂは、２つの連結方法（ＡＴＰ依存性リガーゼおよびＮＡＤ＋依存性リガーゼ）を使用する遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結の比較を示す図である。
図７は連鎖球菌属の数多くの種から得られたｒｎｐＢ遺伝子の領域に由来する配列のアライメントを示す。
図８は異なる種の領域に対するプローブのアニーリングを示す図である。
【００１３】
（定義）
「遺伝因子」は、核酸分子の検出可能な特徴、例えば、ヌクレオチド反復または微生物型決定のためのマーカーなどを意味する。
【００１４】
「遺伝因子を含む領域」は、核酸分子におけるヌクレオチド配列を意味する。そのような領域は遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）と同一であってもよく、あるいは、１つ以上の遺伝因子（例えば、微生物型決定のためのマーカーなど）を含んでもよい。典型的には、遺伝因子を含む領域は、本発明の方法において使用されるようなオリゴヌクレオチドに対応する領域である。
【００１５】
「微生物型決定のためのマーカー」は、特定の微生物型について特徴的であり、従って、核酸サンプルの型を決定するために使用される核酸サンプルにおける１つ以上のヌクレオチド位置を意味する。
【００１６】
「連結パターン」は、連結事象のパターン（すなわち、連結されるオリゴヌクレオチドの数および／またはオリゴヌクレオチドの同一性）を意味する。典型的には、サンプルの連結パターンはサンプルの型について特徴的である。従って、「参照パターン」は、既知の参照サンプルに対する連結事象のパターンを意味する。
【００１７】
「ヌクレオチド反復」は、２個、３個、４個から、数千個までのヌクレオチドの特定配列の連続した繰り返しを意味する。「反復ユニット」は１つのヌクレオチド反復配列である。反復ユニットが２ヌクレオチド〜６ヌクレオチドの間であるならば、ヌクレオチド反復はミクロサテライトと呼ばれる；反復ユニットが７ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドの間であるならば、ヌクレオチド反復はミニサテライトと呼ばれる；反復ユニットが３０を超えるならば、ヌクレオチド反復はサテライトと呼ばれる。用語「ヌクレオチド反復」はまた、短いタンデム反復および一定しない数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）の用語を包含する。一部の遺伝的障害では、反復ユニットが数千回繰り返され得る。線状染色体を有するヒトおよび他の生物は、数千回反復される短い反復ユニットから構成されるテロメアをその染色体末端に有する。
【００１８】
「隣接配列」は、ヌクレオチド反復の外側に位置する任意のヌクレオチド配列を意味する。この配列は、多くの状況において、増幅工程におけるプライマーのために使用される。
【００１９】
「相補的」は、オリゴヌクレオチドが、選ばれたアニーリング条件のもとでテンプレート核酸にアニーリングすることができるための十分な相補性（すなわち、塩基対形成するための能力）を有することを意味する。従って、「相補的」により、すべてのヌクレオチドが、すべての位置において、テンプレート核酸に対して相補的でなければならないことは意味されず、オリゴヌクレオチドが、選ばれたアニーリング条件のもとでテンプレート核酸にアニーリングするための十分な相補性を有することのみを意味する。
【００２０】
「連結副生成物」は、連結された核酸の一部を構成しないが、連結反応時に放出される生成物を意味する。
【００２１】
「ルシフェラーゼ」は、本発明では、ＡＴＰに依存する酵素反応において光を生成できる任意の酵素を意味する。従って、任意の種から得られるそのような酵素が、その変異体および組換え変異体を含めて、本発明による「ルシフェラーゼ」の定義に含まれる。ルシフェラーゼに基づくアッセイにより、ルシフェラーゼ酵素を用いるアッセイを意味する。
【００２２】
「光度測定法アッセイ」は、酵素の活性または化合物のレベルが光放射反応においてモニターされ、それにより、光の放射が酵素反応の結果（すなわち、ルシフェラーゼ酵素の活性の結果）であるアッセイである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
一部の生物は、生物発光をもたらす発エルゴン反応で光を生成できる。生物発光反応に関与する酵素に対する一般名はルシフェラーゼである。この酵素の種々の変異体が、細菌、昆虫および渦鞭毛藻類などの様々な生物において見出されている。
【００２４】
ホタルルシフェラーゼ（ＥＣ．１．１３．１２．７）は、ＡＴＰ、マグネシウムおよび酸素の存在下でのＤ−ルシフェリンの酸化を触媒する。生成物のオキシルシフェリンが、光子の放射を伴って基底状態に崩壊する励起された状態で生じる。ホタルルシフェラーゼは、特に、ＡＴＰの効率的な検出および定量のために、また、遺伝子の調節および発現の研究のためのレポーター酵素として、分子生物学および細胞生物学において広範囲に使用されている（Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．およびＳｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．（１９８８年）、分子生物学および細胞生物学における手段としてのホタルルシフェラーゼ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５、５〜１３）。ＡＴＰ変換反応に関与するすべての酵素および代謝産物をホタルルシフェラーゼ系によって分析することができる（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（２０００年）生物医学科学における生物発光および化学発光の適用、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０５、３３３〜３４５；Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（１９８８年）、ルシフェラーゼおよびルシフェリンの臨床的適用および生化学的適用、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５，１４〜２１；Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（１９９１年）、化学発光技術および生物発光技術、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７、１４７２〜１４８１）。
【００２５】
その上、様々なルシフェラーゼ系が様々な生物発光アッセイにおいて使用されている。例えば、ルシフェラーゼおよび別のタンパク質（例えば、ＲＮＡ同定のためのＲＮＡ結合タンパク質など）を含む様々な融合タンパク質、あるいは、ホタルルシフェラーゼと、ビオチンアクセプターペプチドまたは免疫アッセイのための単鎖抗体との融合コンジュゲートが知られている。真核生物のルシフェラーゼ酵素は、光を産生する反応においてＡＴＰを用いる。光を検出することができる簡便性のために、ルシフェラーゼに基づく分析は多くの適用のための注目される分析手段である。
【００２６】
第１の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための方法に関連する：
ａ）遺伝因子を含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）この核酸サンプルの遺伝因子を含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、遺伝因子の存在の指標として検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。あるいは、一部の工程を同時に行うことができ、一部の工程を連続して行うことができる。これは、例えば、異なる工程で、実施されるための異なる条件（例えば、異なる緩衝液、温度など）が要求されるときには好ましくなり得る。１つの成分を除いて反応のために必要なすべての成分はまた、分析に先だって混合することができ、この一連の反応を、最後の成分を加えることによって開始することができる。
【００２７】
本発明は、連結生成物そのものの代わりに連結副生成物の検出に関する。これは、連結事象が起こっているかどうかを検出する新しい方法を開拓しており、これにより、先行技術と比較して、より迅速で、より高感度な分析が可能になる。
【００２８】
核酸サンプルは、当業者に既知の標準的な手段によって、必ずしも必要ではないが、好ましくは単離される生物学的サンプル（例えば、組織、細胞または血液など）の任意のＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルであり得る。好ましくは、核酸サンプルは、ヒト対象から得られる核酸サンプルである。好ましくは、核酸サンプルはＤＮＡである。好ましくは、核酸サンプルは、例えば、ＰＣＲによって増幅される。
【００２９】
本発明による方法において、核酸サンプルは、分析される特定の反復した配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドと混合され、アニーリングされる。アニーリング工程に先だって、核酸を変性させなければならない。当業者は、核酸を変性させるための好適な条件を選択する方法を知っている。アニーリングのための条件は、アニーリングされる特定のオリゴヌクレオチドに依存して変化させなければならない。当業者は、種々の適用ためのアニーリング時におけるストリンジェンシーを選択する方法を知っている。オリゴヌクレオチドの長さおよび同一性を、検出されることになる遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含むそれぞれの特定の領域について調節しなければならない。すべてのオリゴヌクレオチドは、連結反応において機能するために、リン酸を５’末端に必要とする。
【００３０】
今日、その起源をトリヌクレオチド反復展開部に有する、ヒトに影響を及ぼす少なくとも１４個の障害が報告されている。それらはポリグルタミン疾患（８個の障害）および非ポリグルタミン疾患（６個の疾患）に分類することができる。
【００３１】
８個の障害（その１つがハンチントン病である）はすべてが、その原因としての同じ反復したコドン（ＣＡＧ）をともに有する。ＣＡＧは、グルタミンと呼ばれるアミノ酸をコードするので、これら８個のトリヌクレオチド反復障害はまとめてポリグルタミン疾患として知られている。
【００３２】
ポリグルタミン疾患は多くの共通点を有する：ポリグルタミン疾患のそれぞれが、身体の特定部分における神経細胞の進行性の変性によって特徴づけられ、これに対して、６個の非ポリグルタミン疾患はそれらの症状発現において非常に不均一である。下記は、疾患、トリヌクレオチド反復、および、知られている場合には、罹患者における反復数に関する表である。
【表１】
【００３３】
現在、これらの反復展開部のすべてが、ＰＣＲ、およびそれに続く電気泳動工程によって分析されている。この分析は時間がかかり、より長い反復した配列については、感度が問題となる場合がある。
【００３４】
第２の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法に関連する：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）このヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）この連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。
【００３５】
本発明に従ってヌクレオチド反復を分析するためには２つのタイプのオリゴヌクレオチドが好ましい。一方の好ましいタイプのオリゴヌクレオチドは、反復ユニットそのものの単量体、二量体または多量体である（すなわち、オリゴヌクレオチドは、反復した配列の１つ以上の反復からなる）。もう一方の好ましいタイプは、ヌクレオチド反復ユニットの単量体、二量体または多量体（ｎ−ｍｅｒ体）と等しい長さを有しない「一致しない」オリゴヌクレオチドである（すなわち、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド反復ユニットそのもののｎ−ｍｅｒ体よりも１塩基または数塩基だけ短いか、または長い）。「一致しない」場合におけるオリゴヌクレオチドは一つずつ加えられ、連結させられ、連結副生成物が、その次のオリゴヌクレオチドが加えられる前に検出される。ヌクレオチド反復の開始を、反復した配列のすぐ外側において、すなわち、ヌクレオチド反復に隣接する配列の１つにおいてアニーリングするように適合化されたオリゴヌクレオチドの使用によって開始することが好ましい。これらの異なるタイプのオリゴヌクレオチド、および、そのようなオリゴヌクレオチドにより行うことが可能である異なるタイプの分析が下記においてより詳しく記載される。
【００３６】
下記には、ポリグルタミン障害における反復の数の計算のために使用することができる本発明のために好適なオリゴヌクレオチドの例がいくつか示される。
【表２】
【００３７】
変異体１により、２つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの二量体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００３８】
変異体２により、４つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの４ｍｅｒ体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００３９】
変異体３により、５つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの５ｍｅｒ体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００４０】
変異体４により、７つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの７ｍｅｒ体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００４１】
下記には、脆弱Ｘ症候群における反復の数の計算のために使用することができる本発明のために好適なオリゴヌクレオチドの例がいくつか示される。
【表３】
【００４２】
酵素による連結反応が、リガーゼ活性を有する数多くの異なる酵素によって行われる。そのなかでも、好ましい例が下記に詳しく記載される。リガーゼ活性を有する酵素により、核酸鎖内の末端間で、または、異なる核酸鎖との間でホスホジエステル結合を形成する能力を有する酵素を意味する。リガーゼ酵素の組換え変異体もまた本発明において意図される。
【００４３】
ＤＮＡリガーゼは２つの大きな種類に分けられる（ＤｏｈｅｒｔｙおよびＳｕｈ，２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８、２１：４０５１を参照のこと）：ＡＴＰを補因子として要求するＤＮＡリガーゼ、および、ＮＡＤ＋を要求するＤＮＡリガーゼ。真核生物、ウイルスおよび古細菌のコードされる酵素はすべてがＡＴＰを要求する。しかしながら、ＡＴＰはまた、（下記に記載されるように）真核生物のルシフェラーゼ反応における基質でもあるので、ルシフェラーゼに基づく分析は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼが使用されたときには、連結反応を検出することが以前では事実上不可能であった。ＡＴＰ依存性リガーゼを使用するための１つの可能性は、（１）何らかの手段によって、過剰なＡＴＰを、（例えば、アピラーゼを使用することなどによって）減少させることができるか、あるいは、（２）ルシフェラーゼに対する基質として機能しないか、または、ＡＴＰよりも著しく低い程度にルシフェラーゼに対する基質として機能するＡＴＰアナログ（例えば、ｄＡＴＰなど）が使用されるか、あるいは、（３）（１）および（２）の組合せであると考えられる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明では、ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼが、サンプル核酸にアニーリングさせられたＤＮＡ−オリゴヌクレオチドを連結するために使用される。この結果、エネルギー源として、ＡＴＰの代わりに、ＮＡＤ＋に依存するＤＮＡリガーゼが使用される。ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼは、下記の反応（式中、Ｅはリガーゼであり、ｐＡはＡＭＰであり、ｐはリン酸基を示す）を触媒する、もっぱら真核生物において見出される７０ｋＤ〜８０ｋＤの非常に相同的な単量体タンパク質である：
【００４５】
Ｔ４ＲＮＡリガーゼもまた、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド、または、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド、または、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ−オリゴヌクレオチドの組合せが互いに連結されるときには本発明において好ましく用いられる。例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼはＲＮＡ−ＲＮＡ連結のための下記の反応を触媒する：
【００４６】
従って、この反応における最初の工程では、ＡＴＰを使用するＲＮＡのアデニル化が伴う。しかしながら、いくつかの実施形態では、これは、連結反応を検出するための好ましい分析方法の１つが使用されるとき（すなわち、ルシフェラーゼに基づくアッセイが使用されるとき）には好ましくないので、別の方法が必要である。数多くの研究者がＡｄｏＰＰ５’ＲＮＡ中間体の合成を報告している（例えば、Ｓｎｉｎｓｋｙ ＪＪ他，等モル濃度のアクセプター分子およびドナー分子を含有するＲＮＡリガーゼ反応におけるオリゴヌクレオチドの特異的な結合のための末端ブロック基の使用（１９７６年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３（１１）：３１５７〜３１６６；Ｅｎｇｌａｎｄ，ＴＥ他，ジヌクレシドピロリン酸はＴ４誘導型ＲＮＡリガーゼに対する基質である（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４（１１）：４８３９〜４８４２）。従って、ある方法が、そのような中間体（ＡｄｏＰＰ５’ＲＮＡまたはＡｄｏＰＰ５’ＤＮＡ）を本方法においてそのまま利用するために考案されており、これにより、そうでない場合には検出を妨げるＡＴＰの存在が回避されている。従って、Ｔ４ＲＮＡリガーゼもまた本発明のために好ましい。
【００４７】
代わりの連結方法として、別の態様は、ＡＴＰ依存性リガーゼをＡＴＰアナログ（例えば、ｄＡＴＰまたは２−アミノプリンリボシド三リン酸など）との組合せで使用することである。首尾よく機能するために、アナログは、まず連結反応を助けなければならない。次に、アナログは理想的には、過剰なルシフェラーゼ基質の存在に起因するバックグラウンドを最小限に抑えるために、少なくともＡＴＰによって達成されるのと同じ程度に、ルシフェラーゼ反応において基質として機能すべきではない。加えて、連結反応の生成物は好ましくはピロリン酸でなければならず、その結果、このピロリン酸は、その後、スルフリラーゼによってＡＴＰに変換することができ、次いでこのＡＴＰをルシフェラーゼ反応によって検出することができる。そのような補因子アナログは、過剰なアナログの存在から生じる低いバックグラウンドシグナルを超える連結反応の検出を容易にする。改善された方法では、検出に先だって、アナログそのもののその後の除去を伴うことができる。
【００４８】
例えば、実験により、ｄＡＴＰが、ＡＴＰ依存性リガーゼのＴ４ＤＮＡリガーゼに対する効果的な補因子であることが明らかにされている（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ他，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：２０５〜２１１（１９９７年）を参照のこと）。しかしながら、ｄＡＴＰでさえ、ルシフェラーゼによる著しいバックグラウンドシグナルを生じさせるが、これは、ＡＴＰによって引き起こされるバックグラウンドシグナルよりも低い。代わりの方法は、ｄＡＴＰの使用を、アピラーゼを用いた連結後処理と組み合わせ、その結果、過剰なｄＡＴＰが、ルシフェラーゼを使用する光シグナルの検出に先立って分解されるようにすることである。この組合せは、実施例の節に記載されるように、例えば、ＤＮＡ反復の長さの変動を検出するための驚くほど効果的な方法をもたらしている。その結果はまた、ＮＡＤ＋依存性リガーゼをＰＰＤＫとの組合せで使用して得られた結果と匹敵し得る。
【００４９】
さらに、アピラーゼは基質（例えば、ｄＡＴＰ）についてＡＴＰ依存性リガーゼと競合するので、アピラーゼ、リガーゼおよび基質の濃度は特定の状況について最適化されなければならない。従って、過剰量のＤＮＡリガーゼ基質を減少させるために、アピラーゼを、連結反応の後だけでなく、連結反応の前またはその期間中に加えることもまた可能である。
【００５０】
従って、別の実施形態では、連結工程（工程ｄ）が、ＡＴＰ依存性リガーゼを用いて行われ、アピラーゼが、過剰量のＤＮＡリガーゼ基質を減少させるために、連結前に、または連結期間中に、または連結後に工程ｄ）の連結混合物に加えられる。
【００５１】
好ましい実施形態において、ＡＴＰ依存性リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼである。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、ｄＡＴＰが、連結工程（工程ｄ）においてＡＴＰ依存性リガーゼに対する基質として使用される。
【００５３】
本発明の特許請求項に記載される方法の最後の工程として、連結副生成物が、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために検出される。生じる連結副生成物の量は、起こった連結反応の数に比例している。下記に記載されるように、場合により、ヌクレオチド反復ユニットの数を推定することを可能にするために、連結反応が起こっているか否かを検出することが十分である。当業者は、最終生成物のさらなる操作が望ましいことを明らかにすることができ、従って、本発明では、本発明の方法の使用に対するこのような調節が意図される。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法に関連する：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）このヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、このＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。あるいは、一部の工程を同時に行うことができ、一部の工程を連続して行うことができる。これは、例えば、異なる工程で、実施されるための異なる条件（例えば、異なる緩衝液、温度など）が要求されるときには好ましくなり得る。１つの成分を除いて反応のために必要なすべての成分はまた、分析に先だって混合することができ、この一連の反応を、最後の成分を加えることによって開始することができる。
【００５５】
この実施形態において、連結副生成物の１つ（すなわち、ＡＭＰもしくは修飾ＡＭＰまたはＰＰｉ（ピロリン酸））がＡＴＰに変換される。
【００５６】
１つの好ましい実施形態において、連結副生成物はＡＭＰである。
【００５７】
本発明による連結反応において生じたＡＭＰは好ましくは、ＡＴＰに変換される。１つの好ましい実施形態において、本発明による連結反応において生じたＡＭＰは、下記のようにピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）を使用する一段階の酵素反応によってＡＴＰに変換される：
【００５８】
ＡＭＰに対するＫｍはＡＴＰに対するＫｍの１／２５０である。従って、この反応はＡＭＰ−＞ＡＴＰの方向に強く動かされる。ピルビン酸リン酸ジキナーゼは、６．５〜７のｐＨ至適、６〜１１の範囲内でのｐＨ安定性、５５℃〜６０℃の至適温度を有しており、５５℃未満の温度で安定である。この酵素の特筆すべき利点は、高い温度（５０℃〜６０℃）でのその安定性および高活性である。多くの場合、この範囲での温度は、好適なストリンジェンシーを有するアニーリング条件を提供するために好ましいので、このことは利点である。また、ＰＰＤＫが、ホタルルシフェラーゼを使用する生物発光検出（これは、下記に詳しく記載される好ましい検出アッセイである）が容易に行われる緩衝液において使用される。
【００５９】
あるいは、連結反応の別の副生成物（すなわち、ＰＰｉ）が好ましくはＡＴＰに変化される。上記で議論されたように、連結反応における基質（ＡＴＰ）は、（例えば、上記で概略されたように、アピラーゼが使用されない場合）、ルシフェラーゼ反応のための基質と同じであるので、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、いくつかの実施形態では、本発明のために好適ではない。しかしながら、修飾されたＡＴＰ分子（例えば、ｄＡＴＰまたは２−アミノプリンリボシド三リン酸など）を使用することができるＤＮＡリガーゼ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，ＹおよびＮｉｓｈｉｇａｋｉ，Ｋ、ＡＴＰ要求酵素におけるＡＴＰの予想外の一般的代替可能性、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：２０５〜２１１（１９９７年））が本発明では用いられる。好ましいそのようなＤＮＡリガーゼは下記の反応を触媒する（式中、Ａ＊は、上記で定義されるような修飾されたアデノシン分子を示す）：
【００６０】
修飾されたＡＴＰ分子を使用することの利点の１つは、修飾されたＡＴＰ分子が、（下記に記載される）好ましい、ルシフェラーゼに基づくアッセイを、ＡＴＰが妨害するのと同じ程度に妨害しないことであり、従って、修飾されたＡＴＰ分子を、下記に記載される好ましい、ルシフェラーゼに基づくアッセイの期間中、存在させることができることである。リガーゼによって要求される補因子のタイプおよび濃度は、連結事象のルシフェラーゼ媒介による検出を成功させるための重要な要素である。この補因子は効果的な連結を助けなければならないが、（例えば、上記で概略されたように、アピラーゼが使用されない場合）検出工程を妨害してはならない。
【００６１】
本発明による連結反応において生じるＰＰｉは、その後、好ましくは、ＡＴＰ−スルフリラーゼを用いる下記の反応によってＡＴＰに変換される（式中、ＡＰＳはアデノシン５’−ホスホ硫酸を示す）：
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法に関連する：
ａ）ヌクレオチド配列を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）このヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかの指標として、ルシフェラーゼに基づくアッセイによってこのＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。あるいは、一部の工程を同時に行うことができ、一部の工程を連続して行うことができる。これは、例えば、異なる工程で、実施されるための異なる条件（例えば、異なる緩衝液、温度など）が要求されるときには好ましくなり得る。１つの成分を除いて反応のために必要なすべての成分はまた、分析に先だって混合することができ、この一連の反応を、最後の成分を加えることによって開始することができる。
【００６３】
生じたＡＴＰ（例えば、連結副生成物をＡＴＰに変換するための上記の反応のいずれかによって生じたＡＴＰ）は、好ましくは、この実施形態に従って、ルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて基質として使用される。ＡＴＰの量は、生じた連結副生成物（ＡＭＰまたはＰＰｉ）の量に、すなわち、起こった連結反応の数に比例しているので、また、ＡＴＰの量がルシフェラーゼ反応のために限定されているという条件では、すなわち、ルシフェリンおよびＯ２が過剰に存在するという条件では、光の発生は連結反応の数に対応する。本発明のために好適なルシフェラーゼは下記の反応を触媒する：
【００６４】
放射される光の波長は、用いられるルシフェラーゼの起源に依存する。
【００６５】
さらに別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルの微生物型決定のための方法に関連する：
ａ）微生物型決定のための少なくとも１つのマーカーを含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）この核酸サンプルの微生物型決定のためのマーカーを含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、連結副生成物を検出する工程；
ｆ）微生物型を決定するために、サンプルの連結パターンを参照パターンと比較する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は同時に行われるか、または連続して行われるか、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【００６６】
本発明により、様々な異なる種のＤＮＡ、例えば、様々な異なる微生物種に由来するＤＮＡが、好適な長さおよび組成のプローブを選ぶことによって解明される。例えば、細菌における比較配列分析のための最も広範囲に使用されている標的遺伝子は、３０Ｓのリボソームスモールサブユニットの構造的一部をコードする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子である。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列決定は系統発生的研究のための重要な手段であり、また、微生物同定のためにも使用されている。
【００６７】
上記反応を触媒することができる、すべての異なる微生物に由来するすべてのルシフェラーゼ酵素が、その組換え変異体を含めて、本発明において意図される。熱活性なルシフェラーゼを、種々の種に由来する野生型酵素、変異体および組換え変異体を含めて、入手することができ、また、より高い温度でルシフェラーゼ反応を行うことが好ましいときには使用することができる。ルシフェラーゼ反応を、反応のために必要な試薬を加えることによって、連結反応および変換反応に続いて、これらの反応を生じさせることが可能になった後で行うことができる。あるいは、連結のリアルタイム測定を可能にするために連結反応および変換反応を進行させることができるので、発光反応のために必要な試薬を同時に存在させることができる。別の実施形態において、より低い温度で活性である熱安定性のルシフェラーゼ、例えば、Ｋａｊｉｙａｍａ ＮおよびＮａｋａｎｏ Ｅ，１９９３年（２１７位における一アミノ酸置換によるホタルルシフェラーゼの熱安定化）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（５０ １３７９５〜９））に記載されるルシフェラーゼなどを用いることができ、また、２段階で行われる酵素反応に共役させることができる。すなわち、最初に、連結反応および変換反応が、特異的な適用のために好適なより高い温度で行われ、その後、温度が下げられ、ルシフェラーゼ活性が測定される。
【００６８】
天然のホタルルシフェラーゼは、反応混合物におけるＭｇ２＋、ＡＴＰ、ルシフェリンおよび分子状酸素の存在に完全に依存している（Ｆｏｒｄ，ＳＲおよびＬｅａｃｈ，ＦＲ、ホタルルシフェラーゼアッセイの適用における改善、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１０２巻：生物発光方法およびプロトコル（３頁〜２０頁、Ｒ．Ａ．ＬａＲｏｓｓａ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９８年）を参照のこと）。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が、システイン残基の酸化または金属イオンによる反応の阻害を防止するために反応混合物にそれぞれ加えられる。従って、ルシフェラーゼ反応は、好ましくは、約１０ｍＭのＭｇ２＋（例えば、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ）およびＤＴＴ（例えば、０．２ｍＭ）を含む緩衝液において行われる。至適温度は２５℃である。３０℃を超える温度（特に、３５℃を超える温度）は野生型酵素の迅速な不活性化を引き起こす。従って、ルシフェラーゼ反応は、好ましくは、ｐＨ７．５〜８（より好ましくはｐＨ７．８）において、２ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇ２＋、０．５ｍＭ〜２ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭ〜２ｍＭのＥＤＴＡの存在下、２０℃〜３０℃の温度で行われる。しかしながら、ルシフェラーゼの変異体は、例えば、上記に記載されるような温度に関して、他の要求を有することがある。重要なことは、塩化物イオンはルシフェラーゼ反応を阻害することがあり、従って、塩化物イオンをルシフェラーゼ反応の期間中に存在させることは次善となることがあるということである。
【００６９】
多くの方法を、発光反応の結果としての光の検出のために利用することができ、例えば、写真フィルム、Ｘ線フィルムにおける検出、光電子増倍管（ＰＭＴ）または電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラの使用による検出などのために利用することができる。本発明のために、ＰＭＴまたはＣＣＤカメラによる光度測定法検出アッセイが好ましい。そのような方法は光放射の定量的な測定を可能にするからである。本発明において提供される方法による大きな利点は、この方法が、連結反応をリアルタイムで検出することを可能にすることである。
【００７０】
連結のリアルタイム検出は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応による光産生を、初期レベルが検出された後で「停止する」酵素を含めることによってさらに改善することができる。「初期レベル」は、光放出が検出されるために必要な光のレベルを示す。このレベルは、使用される検出装置に関連して当業者によって容易に決定される。この「停止」原理はまた、ルシフェラーゼ酵素の低い「バーンレート」に関しても好都合であり得る。そのような酵素は連結事象間の応答時間を増大させる。好適な酵素は、上記で記載されたように、ＡＴＰをＡＤＰに分解するが、ＡＭＰを分解しないアピラーゼである。この酵素は、従来のピロシーケンシング（米国特許第６２５８５６８号）において非常に都合良く使用されている。
【００７１】
従って、さらに別の実施形態において、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応における光産生が、産生された光の初期レベルに到達した後、酵素的に停止される。好ましくは、これはアピラーゼの添加によって行われる。
【００７２】
本発明の方法による連結副生成物の検出は２種類の情報をもたらす：１）連結副生成物が生じるならば、連結反応が起こっている。場合により、（下記に記載される）、この情報は十分である。２）上記で述べられたように、連結副生成物の量が連結反応の数に比例しており、従って、核酸サンプルの量が既知であるならば、核酸サンプルにおける反復したヌクレオチド配列の反復数、または微生物型決定のためのマーカーを計算するために使用することができる。
【００７３】
ＰＰＤＫを使用して、ＡＭＰをＡＴＰに変換し、次いで、そのＡＴＰを使用して、ルシフェリン−ルシフェラーゼに基づくシグナルを生じさせることが、Ｓａｋａｋｉｂａｒａ他（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｔ他，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｎｍ．１９９９年、２６８（１）：９４〜１０１）およびＩｔｏｈ他（Ｉｔｏｈ他，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２００３年，１９：１０５〜１０９））によって報告されている。しかしながら、これらの適用において、この方法は、ＲＮＡの分解によって生じたＡＭＰを測定して、食品の衛生状態に対する指標を提供するために（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ他，１９９９年）、または、二重免疫学的反応において（Ｉｔｏｈ他，２００３年）、それぞれ使用されていた。
【００７４】
数多くのリボザイムが、リガーゼ活性を有することもまた報告されており、これらもまた本発明において意図される（Ｇｌａｓｎｅｒ，ＭＥ他（２００２年）、ＲＮＡリガーゼリボザイムの構造および触媒作用のための金属イオン要求、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，８１０３〜８１１２；ＭｃＧｉｎｎｅｓｓ，Ｋ．Ｅ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（２００２年）、外部ＲＮＡテンプレートにおけるＲＮＡ触媒によるＲＮＡ連結、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ９，２９７〜３０７）。連結は、基質に直接に連結するリボザイム（すなわち、クラスＩリガーゼ、Ｇｌａｓｎｅｒ他，２００２年）を伴い、また、相補的なテンプレートにおいて隣接位置で結合される２つのオリゴヌクレオチドの連結さえ伴う（ｈｃリガーゼリボザイム、ＭｃＧｉｎｎｅｓｓおよびＪｏｙｃｅ，２００２年）。それぞれの場合において、連結は、一方の分子の３’−ＯＨ基を別の分子の５’−三リン酸に結合すること、およびピロリン酸の放出を伴う。ＡＴＰなどの補因子はこの反応に関与しておらず、従って、リボザイムは、連結反応の好ましい検出が、ルシフェラーゼに基づくアッセイの使用を伴うとき、本発明のために好適である。
【００７５】
本開示の他所で言及されたリガーゼ酵素に加えて、本発明のための好適なリガーゼ酵素が下記に例示されるが、下記のリガーゼ酵素に限定されない：ＡＴＰ依存性リガーゼ酵素（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＢｓｔＤＮＡリガーゼ、ＴｆｉＤＮＡリガーゼなど）、ＮＡＤ＋依存性リガーゼ酵素（例えば、ＴｔｈＤＮＡリガーゼ、ＴｆｌＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼなど）、およびＲＮＡリガーゼ酵素（例えば、ｔＲＮＡリガーゼなど）。
【００７６】
本発明の方法が行われるとき、２つのタイプの分析が可能である。特定の核酸サンプルにおける反復の数を、既知の数の反復した配列を有する既知量のテンプレートＤＮＡを使用することにより連結副生成物の検出の標準曲線を構築することによって決定することができる。それぞれの連結反応が１つの連結副生成物をもたらすので、連結副生成物の量の決定により、ヌクレオチド反復の数を決定することが可能になる。分析される核酸サンプルにおけるテンプレートＤＮＡの量が既知であるならば、反復の数を、標準曲線を使用して連結副生成物の量を反復の数に関連づけることによって決定することができる。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、「一致しない」オリゴヌクレオチドが、上記で記載されたように使用される。この場合、例えば、上記で記載されたように、テンプレートＤＮＡの全範囲が連結オリゴヌクレオチドで満たされるまで、さらなるオリゴヌクレオチドのそれぞれの添加において検出可能である連結副生成物が生じる。従って、この場合、テンプレートの量が既知である必要はない。反復ユニットが２である場合、それぞれの一致しないオリゴヌクレオチドは、奇数の数を有する３つ以上のヌクレオチドを有しなければならない。反復数が３である場合、オリゴヌクレオチドは、３の倍数を除いて、２ヌクレオチド以上から、反復したユニットの配列の全長までであり得る。例えば、三重反復の検出の場合、４ｍｅｒ体、５ｍｅｒ体、７ｍｅｒ体、８ｍｅｒ体、１０ｍｅｒ体、１１ｍｅｒ体などの組合せを使用することができる。一致しないオリゴヌクレオチドが使用されるとき、ヌクレオチド反復配列のすぐ外側でアニーリングするように適合化されているオリゴヌクレオチドが好ましくは最初に加えられる。重要なことは、オリゴヌクレオチドは、それぞれのオリゴヌクレオチドが、１つの場所で、（すなわち、現在の連結サイクルの直前の連結サイクルにおいて加えられたオリゴヌクレオチドの隣りで）連結することができるだけであるように構築されなければならないということである。
【００７８】
一致しないオリゴヌクレオチドが使用されるとき、１つの連結サイクルに由来するアニーリングしていないオリゴヌクレオチド（すなわち、アニーリングまたは連結されないオリゴヌクレオチド）が好ましくは、その次の連結サイクルが開始される前に除かれる。これは種々の方法で達成される。１つの方法は、連結反応時に存在するアニーリングしていないオリゴヌクレオチドを消化する一本鎖ＤＮＡ依存性エキソヌクレアーゼを使用することである。例えば、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）（大腸菌のｓｂｃＢ遺伝子の産物）は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを３’から５’の方向で消化するエキソデオキシリボヌクレアーゼである。酵素活性は自由な３’−ヒドロキシル末端の存在を絶対的に要求する。この場合、テンプレートを、３’末端の修飾によって、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するジデオキシヌクレオチドの取り込みなどによって保護することが必要である。あるいは、本発明の別の好ましい実施形態において、アニーリングしていないオリゴヌクレオチドを、５’リン酸をオリゴヌクレオチドから除くことによって不活性化する酵素が連結反応工程の期間中または反応工程の後に加えられる。この酵素はホスファターゼであり得るか、または、５’末端リン酸に依存する５’末端特異的エキソヌクレアーゼであり得る。ホスファターゼは、エビのアルカリホスファターゼＳＡＰ、子ウシ腸アルカリホスファターゼＣＩＰ、または任意の細菌アルカリホスファターゼからなる群から選択することができる。上記で記載されたようなアニーリングしていないオリゴヌクレオチドの除去はまた、反復ユニットのｎ−ｍｅｒ体がオリゴヌクレオチドとして使用されるときに利用され得ることが当業者によって容易に理解される。
【００７９】
本発明の別の好ましい実施形態において、核酸サンプルが担体に固定化される。固定化は共有結合性または非共有結合性のいずれかであり得る。この分野で使用されている一般的な非共有結合性の方法はビオチン−ストレプトアビジン結合対の利用であり、この場合、ビオチンがプライマーに結合され、ストレプトアビジンが担体に結合される。頻繁に使用されている共有結合性の結合方法は、プライマーに結合されたアミノリンカーの使用であり、これは、エポキシシラン処理された表面と容易に反応する。担体は数タイプのものが可能である：例えば、ビーズ（非中空または多孔性）、またはチップもしくはファイバーの表面である。別の方法は、相補的であるプライマーを、遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のための１つのマーカーなど）を含む領域の隣接配列に、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合対を介して結合することである。固定化された核酸サンプルまたはプライマーの使用による１つの利点は、過剰な酵素、オリゴヌクレオチドおよび／または分解生成物が、１つの好ましい実施形態では、１つの連結−検出サイクルの後、その次が開始される前に、洗浄工程によって容易に除くことができることである。
【００８０】
上記で記載されたこれら２つのタイプの分析が、連結副生成物がＡＴＰに変換され、このＡＴＰが、連結反応が起こったことを検出するための、ルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて使用されるときの本発明の変形とともに図１および図２に例示される。図１は、反復ユニットそのものの単量体または多量体であるオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドとして使用される「終点」分析を示す。それぞれの連結反応が特定量の光を放射させ、その総量が定量される。放射された光の量は、サンプル核酸の量が既知であるならば、上記で記載されたような標準曲線を使用して、反復数に関連づけることができる。図２において、続いて加えられ、連結することを可能にする一致しないオリゴヌクレオチドが使用され、１つの連結反応において放射された光が、その次のオリゴヌクレオチドが加えられ、サイクル（すなわち、添加、連結、および光放射の検出）がもう一度開始される前に「段階的」様式で検出される。これは、それ以上の光が放射されなくなるまで繰り返される。すなわち、これは、サンプル核酸における反復した配列の全範囲が連結オリゴヌクレオチドで満たされるときには当てはまる。従って、反復した配列における反復ユニットの数を、サンプル核酸の量を知ることなく決定することができる。
【００８１】
オリゴヌクレオチドの長さおよび配列の選択に依存して、この方法は、２塩基〜数千塩基の範囲における反復配列について使用することができる。
【００８２】
連結反応は、リガーゼ、および、連結されることになる核酸のタイプの選択に依存して、広範囲の温度にわたって行われる。例えば、ハイブリダイゼーションさせられるテンプレート核酸に対する大きな程度の相補性を有するオリゴヌクレオチドプローブが使用されるとき、相補性が低い場合よりも高い温度を、熱に安定なリガーゼを使用することによって連結反応時に使用することができる。緩衝液の選択、および、連結反応時におけるリガーゼの濃度は、それぞれの特異的なリガーゼについて最適化されなければならず、また、当業者の能力の範囲内である。
【００８３】
好ましい実施形態において、連結反応は、ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼを使用して行われ、生じたＡＭＰ連結副生成物が、ＰＰＤＫ酵素を使用してＡＴＰに転換される。生じたＡＴＰが、その後、好ましくは、ルシフェラーゼに基づくアッセイを使用して検出される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、熱安定性リガーゼ（例えば、ＴａｑＤＮＡリガーゼ）が、（熱に不安定な試薬を伴う）検出工程に関係なく、連結反応を循環させるために使用され、反応の生成物が検出試薬に移される。あるいは、反応液を冷却し、その後、熱に不安定な成分が反応チャンバーに導入される。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、ＰＣＲ反応が、標的核酸の量を連結反応の前に増幅するために核酸サンプルに対して行われる。これは、ヌクレオチド反復について分析されるテンプレート核酸の量が低いならば好まれる。また、これは、反復した配列に隣接する対立遺伝子特異的な配列に対して特異的なＰＣＲプライマーが使用されるならば、対立遺伝子特異性が得られることを可能にする。
【００８６】
ヒトなどの生物では、ヌクレオチド反復の２つの対立遺伝子の様々な異なる対立遺伝子形態を見つけることは非常に一般的であり、このことは、犯罪を解決するために法医学においてしばしば使用される。本発明は、連結副生成物の量が連結反応の数に比例しているので、異なる数の反復が２つの対立遺伝子に存在する状況を解決する。短い方の対立遺伝子がオリゴヌクレオチドプローブで満たされるとき、連結副生成物の数が５０％減少する。例えば、連結反応が、上記で記載されるような、ルシフェラーゼに基づくアッセイを使用して、放射された光によって検出されるとき、光の産出は約５０％低下することになり、これは、光度測定法によって容易にモニターすることができる差である。従って、それぞれの対立遺伝子における反復ユニットの数を本発明によって決定することができる。
【００８７】
本発明はまた、本発明による方法を行うためのキットに関連し、そのようなキットは、別個のバイアルにおいて、リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む。好ましくは、リガーゼ酵素はＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼである。好ましくは、連結副生成物を変換するための酵素はＰＰＤＫ酵素である。本発明はまた、別個のバイアルにおいて、ルシフェラーゼ酵素をさらに含むキットに関連する。本発明によるキットは、好ましくは、下記の疾患群から選択される疾患に関連した遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含む領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。さらに、１つの実施形態において、キットはさらに、別個のバイアルにおいて、アピラーゼを含む。
【００８８】
本発明による別のキットは、好ましくは、下記の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【００８９】
本発明によるキットにおけるバイアルはまた、キットが少なくとも２つのバイアルを含むならば、キットの成分の２つ以上を含むことができる。
【００９０】
本発明はまた、本発明による方法を行うための組成物に関連し、そのような組成物は、リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む。好ましくは、リガーゼ酵素はＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼである。好ましくは、連結副生成物を変換するための酵素はＰＰＤＫ酵素である。本発明はまた、ルシフェラーゼ酵素をさらに含む組成物に関連する。本発明による組成物は、好ましくは、下記の疾患群から選択される疾患に関連した遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含む領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。
【００９１】
本発明による別の組成物は、好ましくは、下記の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【００９２】
米国特許第４９８８６１７号には、「上流側」オリゴヌクレオチドの３’末端が多型位置を覆って置かれるように設計された特異的なオリゴヌクレオチドを使用して、連結反応の検出を伴うＳＮＰを分析するための方法が記載される。「下流側」オリゴヌクレオチドが、その５’末端が上流側プライマーに並置されて置かれる。下流側プライマーの５’末端が、下流側オリゴヌクレオチドの３’−ＯＨ末端に対する連結を可能にするためにリン酸化される。上流側プライマーの１つの型は、その３’末端において特定のテンプレート分子に関して相補的であり、一方で、別の遺伝子型のテンプレート分子とのミスマッチを形成する。このミスマッチはＤＮＡリガーゼの特異性のために連結反応を妨げ、従って、連結または連結の欠如を使用して、多型を検出することができる。その後、プローブが標的ヌクレオチド配列から分離され、連結された生成物の存在または非存在が検出される。この検出では、固定化されたプローブを使用することによってゲルでのヌクレオチド範囲の分離を伴うことができる。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＳＮＰを分析するために使用される。ヒトゲノムにおける大多数の変異は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり、それらは多くの場合、遺伝病に関係づけられ得る。従って、そのようなＳＮＰを検出するための確実な方法を有することは重要である。ＳＮＰを検出するための現在利用することができる方法には、ミスマッチしたプローブの異なる変性に依存する方法、例えば、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌｅｃｅ，ＲＢ他，１９７９年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．６：３５５３）および変性勾配ゲル電気泳動（Ｍｙｅｒｓ，ＲＭ他，１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）などにおける方法がある。あるいは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）（Ｇｅｅｖｅｒ他，１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：５０８）を使用することができ、この場合、ヌクレオチド配列の違いの結果である別の消化パターンが検出される。しかしながら、ヒトゲノムにおけるヌクレオチドの約１／３のみがこの技術によって分析され得るにすぎない。ＲＦＬＰでは、ＳＮＰの約１／２を分析することが可能になる。本発明は、任意の植物、動物または微生物から得られる任意のＤＮＡ含有サンプル（例えば、血液、細胞または組織など）におけるＳＮＰを分析するために使用することができる。テンプレートＤＮＡ上において互いにすぐ隣接してアニーリングする様々なオリゴヌクレオチドが構築される。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのうちの１つの末端ヌクレオチドが、もう一方のプローブに隣接する末端で、その位置においてテンプレート核酸のヌクレオチドの正常なヌクレオチドまたは異常なヌクレオチドのいずれかに対して相補的であるヌクレオチドを有するように構築される。これらのオリゴヌクレオチドは、テンプレート核酸にアニーリングすることができ、その後、本発明の方法の各工程を上記のように行うことができる。テンプレート核酸の多型部位におけるヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのこの位置におけるヌクレオチドに対して相補的であるならば、連結反応が起こり、連結副生成物が放出され、この連結副生成物を、光シグナルを生じさせるためにＡＴＰに変換することができ、最終的には光シグナルを検出することができる。オリゴヌクレオチドとテンプレート核酸との間に相補性が存在しないならば、連結は起こらず、従って、光放射が起こらない。従って、多型部位におけるヌクレオチドの同一性を明らかにすることができる。
【００９４】
本発明はまた、約８個〜１０個のヌクレオチドからなるヌクレオチド反復であるテロメアの長さを決定するために好適である。ヒトの老化がテロメアの短縮化に関連づけられ、また、ガンの種々の形態もまたテロメアの短縮化に依存しているかもしれないことが示唆されている。
【００９５】
本発明はまた、種々の法医学的検査および父子鑑定においてしばしば使用されるミクロサテライトの長さを決定するために好適である。最も頻繁に使用されているミクロサテライトはＣＡ反復である。
【００９６】
連続したプローブをアニーリングし、その後、どのプローブがアニーリングしているかを、ルシフェラーゼ反応に連係した連結事象によって明らかにする方法を、多くの他のタイプの遺伝子分析に適用することができる。一例が、そのための分子的方法が標的配列フラグメントの増幅にしばしば基づいている細菌の同定である。その後、アンプリコンが、特定の菌株、種または群に関連し得る、有り／無しの答え（ＤＮＡハイブリダイゼーション、種特異的なＰＣＲ）またはパターン（断片多型、ＤＮＡ配列決定）を得るために分析される。細菌における比較配列分析のための最も広範に使用されている標的遺伝子は、３０Ｓリボソームスモールサブユニットの構造的一部をコードする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子である。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列決定は系統発生的研究のための重要な手段であり、また、微生物同定のためにも使用されている。１６Ｓ遺伝子はかなり大きく（約１５００塩基）、多くの場合、近縁菌株の分類のためにはあまりにも少ない変動を含有する。さらに、多くの属において、１６Ｓ遺伝子は、配列不均一性をもたらし得る多コピー遺伝子である。これらの欠点のために、さらなる標的遺伝子が調べられており、これらには、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｐＥＬが含まれる。２３Ｓ遺伝子もまた、好適な代わりになりつつある。ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列は１塩基対〜１０塩基対および１０塩基対〜１００塩基対の範囲での反復をそれぞれ伴うが、これらもまた、細菌同定において使用される。多くがＶＮＴＲ（変動数のタンデム反復）として示される。さらに、菌類などの真核生物のなかには、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）が、分子的同定のための理想的な標的を提供する。菌類において、２３Ｓ様遺伝子の埋め込まれた拡大セグメント（ＥＳ）領域は非常に変わりやすく、従って、診断的標的配列として役立つ。ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを、数多くの特異的な遺伝子領域を使用して検出し、型決定することができる（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）を型決定するためのＬ１、Ｅ６、Ｅ６／Ｅ７、Ｅ７／Ｅ１およびＥ１の各領域）。上述の可変領域は、連結媒介型方法による分析のための好適な標的であり得る。
【００９７】
従って、本発明はまた、微生物種におけるヌクレオチド反復の長さを決定するために、または、そうでない場合には、微生物種における遺伝子の変動性を特徴づけるために好適であり、このことは、菌株および単離体を同定するための有用な手段である。
【００９８】
さらに、本発明の１つの実施形態において、連結反応から得られたシグナルが、テンプレート分子または代表的な代わりのＤＮＡ鎖における別の位置において行われた別個の連結事象またはプライマー伸長事象により生じたシグナルを使用することによって、本発明の方法を行う前に正規化／校正される。
【００９９】
また、別の実施形態では、多重反応で同時または逐次的に鎖を分析するために、分析される種々のＤＮＡ鎖が同じ反応に含められ、好適な連結可能なプローブが加えられる。
下記において、本発明が実施例として記載されるが、そのような実施例は、本発明を例示することが意図され、本発明の範囲をいかなる点においても限定することは意図されない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：熱サイクルによる連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結、それに続く生物発光検出
これらのオリゴヌクレオチドは、鎌状赤血球貧血を引き起こす点突然変異を含有するβ−グロビン遺伝子の領域の合成体を表すために設計された（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．（１９９１年）、クローン化された熱安定性リガーゼを使用する遺伝病の検出およびＤＮＡ増幅、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１８９〜１９３を参照のこと）。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドは、アニーリング後、下記の複合体を形成する：
【０１０２】
下記を２００μＬのＰＣＲチューブにおいて５０μＬの最終体積で混合した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；１０ｍＭのジチオスレイトール；１ｍＭのＮＡＤ＋；２０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；０ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、４ｐｍｏｌまたは１０ｐｍｏｌのテンプレートＢＧＬ−Ｔ、４０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド（ＢＧＬ−１およびＢＧＬ−２）。リガーゼ酵素を省いたコントロールが含められた。チューブを、下記の方法を使用してサーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｔｒａｄ）でインキュベーションした：
【０１０３】
連結の成功が、ストレプトアビジン−セファロースビーズでの連結生成物（ビオチン−ＢＧＬ１−ＢＧＬ２）の捕獲、それに続く、変性、特異的な配列決定用プライマーＢＧ−Ｓ１のアニーリング、および、パイロシーケンスによる完全な配列の確認を伴う並行実験において確認された。
【０１０４】
２５マイクロリットルの反応液をＰＳＱ９６プレートに移した。２０マイクロリットルの検出混合物＃１を加えた（これは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；０．６２５ｍＭのホスホエノールピルビン酸；０．３７５ｍＭのピロリン酸ナトリウム；５０μｇのＰＰＤＫを含有した）。プレートをＰＳＱ９６パイロシーケンス装置に移した。装置内で、５μＬの検出混合物＃２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；１３μｇのルシフェラーゼ；７．５μｇのルシフェリン）が、３７℃のインキュベーション温度とともに、ＰＳＱ９６装置の分注カセットを使用して加えられた。光の発生が、ＰＳＱ９６装置においてＣＣＤカメラを使用して追跡された。最初の反応における０ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、４ｐｍｏｌおよび１０ｐｍｏｌのテンプレートＢＧＬ−Ｔについての結果が図３に示される。
【０１０５】
シグナルが、反応混合物におけるテンプレートの量とともに明らかに増大している。このことは、連結、放出されたＡＭＰのＡＴＰへの変換、次いで光への変換の連係が機能していることを示している。
【０１０６】
実施例２：生物発光検出に連係した連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結。プレアニーリングされたプライマー／テンプレート複合体に対するリガーゼ工程およびＰＰＤＫ工程の組合せ。
下記を、三連ウエルで、２００μＬのＰＣＲチューブにおいて２０μＬの最終体積で混合した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液、ｐＨ７．６；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；５ｐｍｏｌのテンプレートＢＧＬ−Ｔ；２０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド（ＢＧＬ−１およびＢＧＬ−２）。オリゴヌクレオチドを、８０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温に冷却することによってテンプレートにアニーリングさせた。アニーリングした反応液を、ＰＳＱ９６において使用されるマイクロタイタープレートに移した。コントロールは緩衝液のみを含んだ。その後、連結、および、放出されたＡＭＰのＡＴＰへの変換のための試薬を含有する混合物の２０マイクロリットルを加えた。この混合物は下記を含有した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；２．５ｍＭのＮＡＤ＋；２５ｍＭのＤＴＴ；０．６２５ｍＭのホスホエノールピルビン酸；０．３７５ｍＭのピロリン酸ナトリウム；５０μｇのＰＰＤＫ；２０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ（コントロールでは省かれた）。反応液を４５℃で１０分間インキュベーションした。プレートをＰＳＱ９６に移し、５μＬの検出混合物＃２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；１３μｇのルシフェラーゼ；７．５μｇのルシフェリン）が、２８℃のインキュベーション温度とともに、ＰＳＱ９６装置の分注カセットを使用して加えられた。光の発生が、ＰＳＱ９６装置においてＣＣＤカメラを使用して追跡された（図４参照）。
【０１０７】
実施例３：ＣＴＧ反復の数の差の検出
本実験は、数多くのポリグルタミン疾患（上記の表を参照のこと）に関与するトリヌクレオチド反復（ＣＡＧ／ＣＴＧ）に基づいた。（ＣＴＧ）２０または（ＣＴＧ）１０の配列を有するオリゴヌクレオチドテンプレートの１ピコモルを、９６ウエルのＰＳＱ９６プレートにおいて、２０μＬのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；２０ｍＭの酢酸カリウム）中で、４０ピコモルの相補的な５’−リン酸化オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）３と混合した。短いリン酸化オリゴヌクレオチドを、８０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温に冷却することによって、長い方のオリゴヌクレオチドテンプレートにアニ−リングさせた。連結を、５μＬの連結混合物（アニーリング緩衝液において２０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ、６．２５ｍＭのＮＡＤ＋、および６２．５ｍＭのジチオスレイトール）を加え、４５℃で３０分間インキュベーションすることによって行った。リガーゼを含まない連結混合物を用いたコントロールもまた処理された。連結反応によって放出されたＡＭＰを、１５μＬのＰＰＤＫ混合物（アニーリング緩衝液において５０μｇのＰＰＤＫ、０．８ｍＭのＰＥＰ、および０．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム）を加え、４５℃で１０分間インキュベーションすることによってＡＴＰに変換した。生じたＡＴＰの量を明らかにするために、ＰＳＱ９６プレートをＰＳＱ９６パイロシーケンス装置に移した。装置内で、５μＬの検出混合物（アニーリング緩衝液において１３μｇのルシフェラーゼおよび７．５μｇのルシフェリン）が装置によって分注され、生じた光放出が検出された。四連についての結果が、コントロール（リガーゼを含まない）からのシグナルが引かれて、図５に示される。これらの結果は、ＣＴＧ反復の数が増大するとき、シグナルの増大を明瞭に示している（図５）。
【０１０８】
実施例４：ヌクレオチド反復の数を決定するためのずれたオリゴヌクレオチドの使用
本実施例では、サンプルＤＮＡにおける反復した配列が、本発明によって分析されることになる反復したユニットよりも長いオリゴヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチド（すなわち、ずれたオリゴヌクレオチド）の段階的な連結工程を用いてどのように分析されるかが記載される。
【０１０９】
最初に、プライマー−テンプレート複合体を、ヌクレオチド反復配列に隣接する配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを、アニーリングが起こることを可能にする条件のもとで加えることによって形成させる：
【０１１０】
次に、反復したユニットよりも長い（または短い）リン酸化オリゴヌクレオチド（この場合には３）を好適な連結緩衝液においてリガーゼおよび連結補因子と一緒に加える：
【０１１１】
その後、連結反応において放出された連結副生成物を、連結反応が起こっていることの目安として検出する。例えば、放出されたＡＭＰまたはＰＰｉを、上記で記載されたような、ルシフェラーゼに基づくアッセイで検出することができるＡＴＰに変換することによって。
【０１１２】
その後、過剰なリン酸化オリゴヌクレオチドを、その次のリン酸化オリゴヌクレオチド（ｐＣＣＧＣ）が、上記で記載されたように、リガーゼおよび連結補因子と一緒に加えられ、アニーリング、連結および検出の別の一連操作が開始される前に除く。
【０１１３】
その後、アニーリング、連結および検出のこのサイクルを、ヌクレオチド反復の全範囲が連結オリゴヌクレオチドで満たされるまで繰り返す。起こった連結反応の数は既知であるので、テンプレート核酸における反復ユニットの数を計算することができる。
【０１１４】
実施例５：過剰な補因子のアピラーゼ媒介による除去との組合せでのＡＴＰ依存性リガーゼの使用
本実験は、数多くのポリグルタミン疾患（上記の表を参照のこと）に関与するトリヌクレオチド反復（ＣＡＧ／ＣＴＧ）に基づいた。（ＣＴＧ）１０または（ＣＴＧ）２０の配列を有するオリゴヌクレオチドテンプレートの１ピコモルを、９６ウエルのＰＳＱ９６プレートにおいて、１５μＬのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；２ｍＭの酢酸マグネシウム）中で、４０ピコモルの相補的な５’−リン酸化オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）３と混合した。短いリン酸化オリゴヌクレオチドを、８０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温に冷却することによって、長い方のオリゴヌクレオチドテンプレートにアニ−リングさせた。連結を、１５μＬの連結混合物（アニーリング緩衝液において２００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、２ｍＭのｄＡＴＰ、および２ｍＭのジチオスレイトール）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって行った。リガーゼおよび（ＣＡＧ）３を含まない連結混合物を用いたコントロールもまた処理された。連結反応液の２５マイクロリットルを、５０ｍＵのアピラーゼを１５μｌのアニーリング緩衝液において加え、室温（約２５℃）で２５分間インキュベーションすることによってアピラーゼで処理して、過剰なｄＡＴＰを消化した。連結反応によって生じたピロリン酸の量を明らかにするために、ＰＳＱ９６プレートをＰＳＱ９６パイロシーケンス装置に移した。装置内で、５μｌの酵素混合物（アニーリング緩衝液において２５ｍＵのスルフリラーゼおよび０．５μｇのルシフェラーゼ）および５μＬの基質混合物（アニーリング緩衝液において２８０ｐｍｏｌのＡＰＳおよび７．５μｇのルシフェリン）が装置によって分注され、生じた光放射が検出された。その後、既知量のピロリン酸およびＡＴＰから得られるシグナルを、５ピコモルのピロリン酸をそれぞれのウエルに分注し、続いて５ピコモルのＡＴＰを分注することによって測定した。三連についての結果が、コントロール（リガーゼおよびリン酸化オリゴヌクレオチドを含まない）からのシグナルとともに、図６ａに示される。
【０１１５】
図６ａにおける結果は、ｄＡＴＰとの組合せでＴ４ＤＮＡリガーゼから得られたシグナルが、連結されたオリゴヌクレオチドの非存在（コントロール）下で測定されるようなバックグラウンドを上回る連結シグナル（試験）の良好な分離を伴って、ＤＮＡ反復領域の長さに依存していることを明瞭に示している。
【０１１６】
図６ｂにおいて、ＮＡＤ＋依存性ＴａｑＤＮＡリガーゼ＋ＰＰＤＫ（実施例３）およびＡＴＰ依存性Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ｄＡＴＰを基質として使用する；本実施例）から得られた結果（「観測シグナル」）が、テンプレート分子あたりの連結の最大数から得ることができるシグナル（これは連結の理論的最大数から計算される）、および、５ｐｍｏｌのピロリン酸から得られるシグナル（「最大予想シグナル」）と比較される。これらの結果は、（１）予想された結果と、観測された結果との間における明瞭な相関、および、（２）２つの独立した連結方法の間における明瞭な相関さえも示している。
【０１１７】
実施例６：微生物の型決定
本実施例では、本発明の連結法が、細菌の型を決定するためにどのように使用され得るかが明らかにされる。図７は、連鎖球菌属の数多くの種に由来するｒｎｐＢ遺伝子の領域から得られた配列のアラインメントを示す。認められ得るように、共通する領域（陰影部）と、種間で変化する領域との両方が存在する。異なる種または種群の連結媒介による検出が下記のように行われる。長さおよび組成が異なるプローブが、種に依存して大きい効率または低い効率でそのような領域の連続した部分に対して同時または連続的のいずれかでアニーリングすることができるように設計される（図８参照）。アニーリングのレベルは、例えば、温度、塩濃度、または当業者に既知の他の薬剤（例えば、ジメチルスルホキシドなど）とともにストリンジェントな条件を適用することによって制御される。アニーリングの成功が、得られるシグナルが、どのくらい多くのプローブがアニーリングしているかの目安であるように連結反応によってモニターされ、従って、アニーリングの成功はテンプレートの同一性の目安を与える。アニーリング工程および検出工程が、適用に依存して、その後の検出を伴って、すべてのプローブを同時に使用するか、または、プローブを連続して加えることによるかのいずれかで行われる。これは、種の異なる群などを同定するための簡便なスクリーニング方法として使用することができ、その後、必要ならば、配列決定によって詳しく分析することができる。この原理は、当然ながら、数塩基を伴う任意の遺伝的変異に対して適用することができ、また、微生物の型決定に限定されない。本発明の方法ではさらに、アニーリングし、かつ、従って、（１）反応が機能していることを確認し、また（２）他の連結事象からのその後のシグナルを正規化するための標準シグナルをもたらすシグナルを与えることが常に予想され得る保存された領域におけるプローブを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明による、いわゆる「終点」分析を説明する図である。
【図２】本発明による、いわゆる「段階的」分析を説明する図である。
【図３】熱サイクル処理による連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結、それに続く生物発光検出を示す図である。
【図４】生物発光検出に連係した連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結（プレアニーリングされたプライマー／テンプレート複合体に対するリガーゼ工程およびＰＰＤＫ工程の組合せ）を示す図である。
【図５】ＣＴＧ反復数の違いの検出を示す図である。
【図６】図６ａは、遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結を示し、ＡＴＰ依存性リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）と、補因子としてのＡＴＰとの使用を示す図である。アピラーゼが、過剰な補因子を減少させるために使用される。図６ｂは、２つの連結方法（ＡＴＰ依存性リガーゼおよびＮＡＤ＋依存性リガーゼ）を使用する遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結の比較を示す図である。
【図７】連鎖球菌属の数多くの種から得られたｒｎｐＢ遺伝子の領域に由来する配列のアライメントを示す。
【図８】異なる種の領域に対するプローブのアニーリングを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号１〜１９は人工的な配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連結反応を行い、連結副生成物を検出することによって核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的変異は疾患に関係づけられることが多く、遺伝的変異の同定は臨床的診断における重要な手段である。遺伝的変異は、一塩基のレベルでの違い（塩基の変化、挿入または欠失を伴う突然変異およびＳＮＰ）、数塩基のレベルでの違い（典型的にはコドン欠失を伴う）、または、遺伝子全体の増加までの様々な長さの反復した配列の変化する数のレベルでの違いを伴う。
【０００３】
ヌクレオチド反復の拡大は種々の遺伝病に関係づけられることが示されている。例としては、脆弱Ｘ（Ｗｅｂｂ，ＴＰ他，１９８６年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５７３；Ｇｕｓｔａｖｓｏｎ，ＫＨ他，１９８６年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５８１）、筋緊張性ジストロフィー（Ｈａｒｐｅｒ，ＰＳ他，１９８９年、Ｍｙｏｔｏｎｉｃ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（第２版）、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ、ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９８９年）およびハンチントン病（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，ＭＥ他，１９９３年、Ｃｅｌｌ．７２：９７１）が含まれる。これらのヌクレオチド反復は、例えば、ＰＣＲに基づくアッセイおよびサザンブロッティング技術を使用して分析されている。さらに、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復が、遺伝子マッピングプロジェクトにおいて、また、父子鑑定のような種々の法医学的適用において広範囲に使用されている。
【０００４】
パイロシーケンス（商標）（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、ピロリン酸の放出の検出および酵素によるヌクレオチド分解に基づく、王立技術研究所（ストックホルム）で開発された、合成による配列決定の方法である（米国特許第６２１０８９１号および米国特許第６２５８５６８号）。合成による配列決定のこの方法では、従来のサンガー配列決定とは対照的に、ヌクレオチドが配列決定反応時に１つずつ加えられる。使用される酵素混合物は４つの異なる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ−スルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ）からなる。ヌクレオチドが、使用者によって、テンプレートに依存する指定された順序に従って順次加えられ、決定される。加えられたヌクレオチドがテンプレートと一致するならば、ＤＮＡポリメラーゼがそのヌクレオチドを成長途中のＤＮＡ鎖に取り込み、ピロリン酸（ＰＰｉ）が放出される。ＡＴＰ−スルフリラーゼにより、ＰＰｉがＡＴＰに変換され、第３の酵素（ルシフェラーゼ）により、ＡＴＰが光シグナルに転換される。これらの反応の後、第４の酵素（アピラーゼ）により、過剰なヌクレオチドおよびＡＴＰが分解され、テンプレートが、その時点で次の反応サイクル（すなわち、別のヌクレオチド添加）のために使用できる状態になる。ヌクレオチドが取り込まれない限り、ＰＰｉが放出されないので、光シグナルは、正しいヌクレオチドが取り込まれたときにだけ生じることになる。パイロシーケンスは、合成による配列決定に基づくリアルタイムのＤＮＡ配列決定法である。この方法は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）スコア化、より短いＤＮＡ領域（識別タグ）の配列決定、および対立遺伝子頻度の評価のための迅速かつ正確な方法であることが判明している（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．，リアルタイムのピロリン酸に基づく配列決定法（１９９８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８１、３６３〜３６５；Ａｌｄｅｒｂｏｒｎ，Ａ．，Ｋｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．リアルタイムのピロリン酸ＤＮＡ配列決定による単一ヌクレオチド多型の決定（２０００年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１２４９〜１２５８）。
【０００５】
パイロシーケンスの形態での合成による配列決定は遺伝的変異の分析において多くの利点を有する。例えば、ＳＮＰ分析のために使用されている他の技術（例えば、ハイブリダイゼーション技術、ミニ配列分析、ＲＦＬＰおよびＳＳＣＰなど）と比較した場合、合成による配列決定では、周りの配列を示すことによって、多型位置だけでなく正しいＳＮＰ位置を調査できることが確認される。さらに、パイロシーケンスは、分離工程を伴わず、かつ自動化可能な様式でのリアルタイム分析を提供する迅速な技術であり、このことは、ＳＳＣＰおよびＲＦＬＰと比較して有益であり、従って、パイロシーケンスは遺伝子分析のための魅力的な方法である。
【０００６】
しかしながら、パイロシーケンスは、１塩基〜１００塩基の範囲での短いヌクレオチド範囲を分析するときに最も効果的である。この方法は、一致しないプライマー伸長（いわゆる「シフト」）の生成物の蓄積によって主に制限される。シフトは、例えば、最適でないレベルのヌクレオチドの存在に起因するプライマーの不完全な伸長または過度な伸長の結果である。均一なパイロシーケンス反応では、正しいヌクレオチドを取り込むＤＮＡポリメラーゼと、取り込まれなかったヌクレオチドを分解するアピラーゼとの間での競合が伴う。正しいヌクレオチドのレベルが、取り込み工程時においてＤＮＡポリメラーゼについての最適値よりも低くなる場合、一部のプライマーのさらなる伸長が不完全となる。その結果は、正しい完全に伸長したプライマーよりも１塩基または数塩基短い伸長されたプライマー分子の集団である（いわゆるマイナスシフト）。他方で、アピラーゼが、ヌクレオチドを分解することにおいて十分に効果的でない場合、過剰な取り込まれていないヌクレオチドが反応液に残留し得るし、また、次の正しいヌクレオチドが与えられ、かつ取り込まれ、配列により、所望されないヌクレオチドバックグラウンドを使用するさらなる伸長が可能になる特定の状況では取り込まれ得る（いわゆるプラスシフト）。さらなる現象では、ＤＮＡポリメラーゼの活性を妨げ、従って、不完全な取り込みおよびマイナスシフトを生じさせる複雑な二次構造を有するテンプレートが伴う。これらの誤りは、当然のことではあるが、プライマー伸長の数が増大するにつれて増大する。従って、ヌクレオチド反復数を推定するための一ヌクレオチド伸長による核酸の延長に依存する技術の正確性は、ヌクレオチド反復数および長さが増大するにつれて低下する。
【０００７】
米国特許第６３０９８２９号には、ヌクレオチド反復数を分析するための方法が記載され、この方法では、プライマーがテンプレート核酸にアニーリングされ、一ヌクレオチドずつ伸長し、かつ、ヌクレオチドは標識され、伸長が起こったことの目安としての測定可能なシグナルを与える。最後に加えられたヌクレオチドの標識が、その後、次のヌクレオチドが加えられる前に除かれる。１つのサイクルでのシグナルが前回の反応でのシグナルよりも実質的に小さくなるまで、伸長が続けられる。
【０００８】
連結反応に基づく方法は近年、遺伝的変異の分析における重要な手段になっている。米国特許第５６９５９３３号には、ヌクレオチド反復の拡大を検出するための、ＲＥＤ（反復拡大検出）と呼ばれる方法が記載され、この方法では、反復配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドがリガーゼの存在下で反復配列にアニーリングされる。その後、リガーゼは、並置されたオリゴヌクレオチドをつないで、連結されたオリゴヌクレオチドの多量体を生じさせる。多量体および標的ヌクレオチドの複合体が、その後、変性し、アニーリング、連結および変性の新たな一連の操作が開始される。多量体の長さが最終的には、ゲル分離を伴う技術によって決定される。生じた多量体の長さにより、拡大したオリゴヌクレオチド反復の長さが示され、これにより、次に、サンプリングされた個体の遺伝子状態を示すことができる。この方法では、より長い核酸範囲が分析されることになる場合でさえ、反復数を推定することが可能になる。しかしながら、この分析方法では、放射能標識されたＤＮＡのゲルに基づく分離、それに続くハイブリダイゼーションによる検出、または、放射能標識されたＤＮＡの直接的な検出を伴う。このような検出は、時間および手間が非常にかかり、リアルタイムの分析ができない。さらに、ゲルに基づく分離は、より大きなＤＮＡフラグメントの分解能が低く、このことは、反復数に関して不明瞭な結果をもたらすことになる。
【０００９】
まとめると、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復数を含めて、遺伝的変異の迅速かつ正確な分析を可能にする新しい方法が依然として求められている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、連結反応を行い、連結副生成物を検出することによって、ヌクレオチド反復の数を推定するだけでなく、他の遺伝因子（例えば、微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにする新しい方法を見出している。第１の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための方法に関連する：
ａ）遺伝因子を含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）この核酸サンプルの遺伝因子を含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、遺伝因子の存在の指標として検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【００１１】
連結副生成物の量は、起こった連結反応の数に比例しているので、連結反応の数を、どのくらいの連結副生成物が生じているかを明らかにすることによって計算することができる。あるいは、本発明の１つの実施形態において、連結サイクルが続いて行われ、１つの連結反応の存在が、その次の反応が開始される前に検出される。この場合、存在する遺伝因子（例えば、反復した核酸配列における反復ユニットなど）の数を決定するために、（生じた連結副生成物の実際の量ではなく）連結反応が起こっているか否かを検出することが必要であるだけである。本発明はまた、本発明の方法を行うためのキット、および、本発明の方法を行うために必要な成分を含む組成物に関連する。本発明において、連結生成物そのものではなく、連結副生成物が分析されるので、本発明は、ヌクレオチド反復の数を決定する新しい方法を開拓している。本発明は、ヌクレオチド反復配列におけるヌクレオチド反復ユニットの数、または、微生物型決定のためのマーカーを、様々な遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含む非常に長い配列の場合でさえ、これまでに可能であったよりも迅速に、かつ、手間がかからない方法で、かつ、正確に明らかにすることを可能にする。加えて、分析をリアルタイムで行うことができる。本発明はまた、必要な場合には、ヘテロ接合サンプルにおけるヌクレオチド反復などの遺伝因子の数を決定することを可能にする。
【００１２】
図面の簡単な記述
図１は本発明による、いわゆる「終点」分析を説明する図である。
図２は本発明による、いわゆる「段階的」分析を説明する図である。
図３は熱サイクル処理による連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結、それに続く生物発光検出を示す図である。
図４は生物発光検出に連係した連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結（プレアニーリングされたプライマー／テンプレート複合体に対するリガーゼ工程およびＰＰＤＫ工程の組合せ）を示す図である。
図５はＣＴＧ反復数の違いの検出を示す図である。
図６ａは、遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結を示す図であり、ＡＴＰ依存性リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）と、補因子としてのＡＴＰとの使用を示す図である。アピラーゼが、過剰な補因子を減少させるために使用される。図６ｂは、２つの連結方法（ＡＴＰ依存性リガーゼおよびＮＡＤ＋依存性リガーゼ）を使用する遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結の比較を示す図である。
図７は連鎖球菌属の数多くの種から得られたｒｎｐＢ遺伝子の領域に由来する配列のアライメントを示す。
図８は異なる種の領域に対するプローブのアニーリングを示す図である。
【００１３】
（定義）
「遺伝因子」は、核酸分子の検出可能な特徴、例えば、ヌクレオチド反復または微生物型決定のためのマーカーなどを意味する。
【００１４】
「遺伝因子を含む領域」は、核酸分子におけるヌクレオチド配列を意味する。そのような領域は遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）と同一であってもよく、あるいは、１つ以上の遺伝因子（例えば、微生物型決定のためのマーカーなど）を含んでもよい。典型的には、遺伝因子を含む領域は、本発明の方法において使用されるようなオリゴヌクレオチドに対応する領域である。
【００１５】
「微生物型決定のためのマーカー」は、特定の微生物型について特徴的であり、従って、核酸サンプルの型を決定するために使用される核酸サンプルにおける１つ以上のヌクレオチド位置を意味する。
【００１６】
「連結パターン」は、連結事象のパターン（すなわち、連結されるオリゴヌクレオチドの数および／またはオリゴヌクレオチドの同一性）を意味する。典型的には、サンプルの連結パターンはサンプルの型について特徴的である。従って、「参照パターン」は、既知の参照サンプルに対する連結事象のパターンを意味する。
【００１７】
「ヌクレオチド反復」は、２個、３個、４個から、数千個までのヌクレオチドの特定配列の連続した繰り返しを意味する。「反復ユニット」は１つのヌクレオチド反復配列である。反復ユニットが２ヌクレオチド〜６ヌクレオチドの間であるならば、ヌクレオチド反復はミクロサテライトと呼ばれる；反復ユニットが７ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドの間であるならば、ヌクレオチド反復はミニサテライトと呼ばれる；反復ユニットが３０を超えるならば、ヌクレオチド反復はサテライトと呼ばれる。用語「ヌクレオチド反復」はまた、短いタンデム反復および一定しない数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）の用語を包含する。一部の遺伝的障害では、反復ユニットが数千回繰り返され得る。線状染色体を有するヒトおよび他の生物は、数千回反復される短い反復ユニットから構成されるテロメアをその染色体末端に有する。
【００１８】
「隣接配列」は、ヌクレオチド反復の外側に位置する任意のヌクレオチド配列を意味する。この配列は、多くの状況において、増幅工程におけるプライマーのために使用される。
【００１９】
「相補的」は、オリゴヌクレオチドが、選ばれたアニーリング条件のもとでテンプレート核酸にアニーリングすることができるための十分な相補性（すなわち、塩基対形成するための能力）を有することを意味する。従って、「相補的」により、すべてのヌクレオチドが、すべての位置において、テンプレート核酸に対して相補的でなければならないことは意味されず、オリゴヌクレオチドが、選ばれたアニーリング条件のもとでテンプレート核酸にアニーリングするための十分な相補性を有することのみを意味する。
【００２０】
「連結副生成物」は、連結された核酸の一部を構成しないが、連結反応時に放出される生成物を意味する。
【００２１】
「ルシフェラーゼ」は、本発明では、ＡＴＰに依存する酵素反応において光を生成できる任意の酵素を意味する。従って、任意の種から得られるそのような酵素が、その変異体および組換え変異体を含めて、本発明による「ルシフェラーゼ」の定義に含まれる。ルシフェラーゼに基づくアッセイにより、ルシフェラーゼ酵素を用いるアッセイを意味する。
【００２２】
「光度測定法アッセイ」は、酵素の活性または化合物のレベルが光放射反応においてモニターされ、それにより、光の放射が酵素反応の結果（すなわち、ルシフェラーゼ酵素の活性の結果）であるアッセイである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
一部の生物は、生物発光をもたらす発エルゴン反応で光を生成できる。生物発光反応に関与する酵素に対する一般名はルシフェラーゼである。この酵素の種々の変異体が、細菌、昆虫および渦鞭毛藻類などの様々な生物において見出されている。
【００２４】
ホタルルシフェラーゼ（ＥＣ．１．１３．１２．７）は、ＡＴＰ、マグネシウムおよび酸素の存在下でのＤ−ルシフェリンの酸化を触媒する。生成物のオキシルシフェリンが、光子の放射を伴って基底状態に崩壊する励起された状態で生じる。ホタルルシフェラーゼは、特に、ＡＴＰの効率的な検出および定量のために、また、遺伝子の調節および発現の研究のためのレポーター酵素として、分子生物学および細胞生物学において広範囲に使用されている（Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．およびＳｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．（１９８８年）、分子生物学および細胞生物学における手段としてのホタルルシフェラーゼ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５、５〜１３）。ＡＴＰ変換反応に関与するすべての酵素および代謝産物をホタルルシフェラーゼ系によって分析することができる（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（２０００年）生物医学科学における生物発光および化学発光の適用、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０５、３３３〜３４５；Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（１９８８年）、ルシフェラーゼおよびルシフェリンの臨床的適用および生化学的適用、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５，１４〜２１；Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．（１９９１年）、化学発光技術および生物発光技術、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７、１４７２〜１４８１）。
【００２５】
その上、様々なルシフェラーゼ系が様々な生物発光アッセイにおいて使用されている。例えば、ルシフェラーゼおよび別のタンパク質（例えば、ＲＮＡ同定のためのＲＮＡ結合タンパク質など）を含む様々な融合タンパク質、あるいは、ホタルルシフェラーゼと、ビオチンアクセプターペプチドまたは免疫アッセイのための単鎖抗体との融合コンジュゲートが知られている。真核生物のルシフェラーゼ酵素は、光を産生する反応においてＡＴＰを用いる。光を検出することができる簡便性のために、ルシフェラーゼに基づく分析は多くの適用のための注目される分析手段である。
【００２６】
第１の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおける遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のためのマーカーなど）の存在を明らかにするための方法に関連する：
ａ）遺伝因子を含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）この核酸サンプルの遺伝因子を含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、遺伝因子の存在の指標として検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。あるいは、一部の工程を同時に行うことができ、一部の工程を連続して行うことができる。これは、例えば、異なる工程で、実施されるための異なる条件（例えば、異なる緩衝液、温度など）が要求されるときには好ましくなり得る。１つの成分を除いて反応のために必要なすべての成分はまた、分析に先だって混合することができ、この一連の反応を、最後の成分を加えることによって開始することができる。
【００２７】
本発明は、連結生成物そのものの代わりに連結副生成物の検出に関する。これは、連結事象が起こっているかどうかを検出する新しい方法を開拓しており、これにより、先行技術と比較して、より迅速で、より高感度な分析が可能になる。
【００２８】
核酸サンプルは、当業者に既知の標準的な手段によって、必ずしも必要ではないが、好ましくは単離される生物学的サンプル（例えば、組織、細胞または血液など）の任意のＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルであり得る。好ましくは、核酸サンプルは、ヒト対象から得られる核酸サンプルである。好ましくは、核酸サンプルはＤＮＡである。好ましくは、核酸サンプルは、例えば、ＰＣＲによって増幅される。
【００２９】
本発明による方法において、核酸サンプルは、分析される特定の反復した配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドと混合され、アニーリングされる。アニーリング工程に先だって、核酸を変性させなければならない。当業者は、核酸を変性させるための好適な条件を選択する方法を知っている。アニーリングのための条件は、アニーリングされる特定のオリゴヌクレオチドに依存して変化させなければならない。当業者は、種々の適用ためのアニーリング時におけるストリンジェンシーを選択する方法を知っている。オリゴヌクレオチドの長さおよび同一性を、検出されることになる遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含むそれぞれの特定の領域について調節しなければならない。すべてのオリゴヌクレオチドは、連結反応において機能するために、リン酸を５’末端に必要とする。
【００３０】
今日、その起源をトリヌクレオチド反復展開部に有する、ヒトに影響を及ぼす少なくとも１４個の障害が報告されている。それらはポリグルタミン疾患（８個の障害）および非ポリグルタミン疾患（６個の疾患）に分類することができる。
【００３１】
８個の障害（その１つがハンチントン病である）はすべてが、その原因としての同じ反復したコドン（ＣＡＧ）をともに有する。ＣＡＧは、グルタミンと呼ばれるアミノ酸をコードするので、これら８個のトリヌクレオチド反復障害はまとめてポリグルタミン疾患として知られている。
【００３２】
ポリグルタミン疾患は多くの共通点を有する：ポリグルタミン疾患のそれぞれが、身体の特定部分における神経細胞の進行性の変性によって特徴づけられ、これに対して、６個の非ポリグルタミン疾患はそれらの症状発現において非常に不均一である。下記は、疾患、トリヌクレオチド反復、および、知られている場合には、罹患者における反復数に関する表である。
【表１】
【００３３】
現在、これらの反復展開部のすべてが、ＰＣＲ、およびそれに続く電気泳動工程によって分析されている。この分析は時間がかかり、より長い反復した配列については、感度が問題となる場合がある。
【００３４】
第２の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法に関連する：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）このヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）この連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。
【００３５】
本発明に従ってヌクレオチド反復を分析するためには２つのタイプのオリゴヌクレオチドが好ましい。一方の好ましいタイプのオリゴヌクレオチドは、反復ユニットそのものの単量体、二量体または多量体である（すなわち、オリゴヌクレオチドは、反復した配列の１つ以上の反復からなる）。もう一方の好ましいタイプは、ヌクレオチド反復ユニットの単量体、二量体または多量体（ｎ−ｍｅｒ体）と等しい長さを有しない「一致しない」オリゴヌクレオチドである（すなわち、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド反復ユニットそのもののｎ−ｍｅｒ体よりも１塩基または数塩基だけ短いか、または長い）。「一致しない」場合におけるオリゴヌクレオチドは一つずつ加えられ、連結させられ、連結副生成物が、その次のオリゴヌクレオチドが加えられる前に検出される。ヌクレオチド反復の開始を、反復した配列のすぐ外側において、すなわち、ヌクレオチド反復に隣接する配列の１つにおいてアニーリングするように適合化されたオリゴヌクレオチドの使用によって開始することが好ましい。これらの異なるタイプのオリゴヌクレオチド、および、そのようなオリゴヌクレオチドにより行うことが可能である異なるタイプの分析が下記においてより詳しく記載される。
【００３６】
下記には、ポリグルタミン障害における反復の数の計算のために使用することができる本発明のために好適なオリゴヌクレオチドの例がいくつか示される。
【表２】
【００３７】
変異体１により、２つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの二量体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００３８】
変異体２により、４つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの４ｍｅｒ体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００３９】
変異体３により、５つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの５ｍｅｒ体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００４０】
変異体４により、７つの反復したユニットを分析するためのオリゴヌクレオチドの３つの異なるタイプの７ｍｅｒ体（それぞれ通常の書体、太字および下線）が記述される。
【００４１】
下記には、脆弱Ｘ症候群における反復の数の計算のために使用することができる本発明のために好適なオリゴヌクレオチドの例がいくつか示される。
【表３】
【００４２】
酵素による連結反応が、リガーゼ活性を有する数多くの異なる酵素によって行われる。そのなかでも、好ましい例が下記に詳しく記載される。リガーゼ活性を有する酵素により、核酸鎖内の末端間で、または、異なる核酸鎖との間でホスホジエステル結合を形成する能力を有する酵素を意味する。リガーゼ酵素の組換え変異体もまた本発明において意図される。
【００４３】
ＤＮＡリガーゼは２つの大きな種類に分けられる（ＤｏｈｅｒｔｙおよびＳｕｈ，２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２８、２１：４０５１を参照のこと）：ＡＴＰを補因子として要求するＤＮＡリガーゼ、および、ＮＡＤ＋を要求するＤＮＡリガーゼ。真核生物、ウイルスおよび古細菌のコードされる酵素はすべてがＡＴＰを要求する。しかしながら、ＡＴＰはまた、（下記に記載されるように）真核生物のルシフェラーゼ反応における基質でもあるので、ルシフェラーゼに基づく分析は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼが使用されたときには、連結反応を検出することが以前では事実上不可能であった。ＡＴＰ依存性リガーゼを使用するための１つの可能性は、（１）何らかの手段によって、過剰なＡＴＰを、（例えば、アピラーゼを使用することなどによって）減少させることができるか、あるいは、（２）ルシフェラーゼに対する基質として機能しないか、または、ＡＴＰよりも著しく低い程度にルシフェラーゼに対する基質として機能するＡＴＰアナログ（例えば、ｄＡＴＰなど）が使用されるか、あるいは、（３）（１）および（２）の組合せであると考えられる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明では、ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼが、サンプル核酸にアニーリングさせられたＤＮＡ−オリゴヌクレオチドを連結するために使用される。この結果、エネルギー源として、ＡＴＰの代わりに、ＮＡＤ＋に依存するＤＮＡリガーゼが使用される。ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼは、下記の反応（式中、Ｅはリガーゼであり、ｐＡはＡＭＰであり、ｐはリン酸基を示す）を触媒する、もっぱら真核生物において見出される７０ｋＤ〜８０ｋＤの非常に相同的な単量体タンパク質である：
【００４５】
Ｔ４ＲＮＡリガーゼもまた、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド、または、ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド、または、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ−オリゴヌクレオチドの組合せが互いに連結されるときには本発明において好ましく用いられる。例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼはＲＮＡ−ＲＮＡ連結のための下記の反応を触媒する：
【００４６】
従って、この反応における最初の工程では、ＡＴＰを使用するＲＮＡのアデニル化が伴う。しかしながら、いくつかの実施形態では、これは、連結反応を検出するための好ましい分析方法の１つが使用されるとき（すなわち、ルシフェラーゼに基づくアッセイが使用されるとき）には好ましくないので、別の方法が必要である。数多くの研究者がＡｄｏＰＰ５’ＲＮＡ中間体の合成を報告している（例えば、Ｓｎｉｎｓｋｙ ＪＪ他，等モル濃度のアクセプター分子およびドナー分子を含有するＲＮＡリガーゼ反応におけるオリゴヌクレオチドの特異的な結合のための末端ブロック基の使用（１９７６年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３（１１）：３１５７〜３１６６；Ｅｎｇｌａｎｄ，ＴＥ他，ジヌクレシドピロリン酸はＴ４誘導型ＲＮＡリガーゼに対する基質である（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４（１１）：４８３９〜４８４２）。従って、ある方法が、そのような中間体（ＡｄｏＰＰ５’ＲＮＡまたはＡｄｏＰＰ５’ＤＮＡ）を本方法においてそのまま利用するために考案されており、これにより、そうでない場合には検出を妨げるＡＴＰの存在が回避されている。従って、Ｔ４ＲＮＡリガーゼもまた本発明のために好ましい。
【００４７】
代わりの連結方法として、別の態様は、ＡＴＰ依存性リガーゼをＡＴＰアナログ（例えば、ｄＡＴＰまたは２−アミノプリンリボシド三リン酸など）との組合せで使用することである。首尾よく機能するために、アナログは、まず連結反応を助けなければならない。次に、アナログは理想的には、過剰なルシフェラーゼ基質の存在に起因するバックグラウンドを最小限に抑えるために、少なくともＡＴＰによって達成されるのと同じ程度に、ルシフェラーゼ反応において基質として機能すべきではない。加えて、連結反応の生成物は好ましくはピロリン酸でなければならず、その結果、このピロリン酸は、その後、スルフリラーゼによってＡＴＰに変換することができ、次いでこのＡＴＰをルシフェラーゼ反応によって検出することができる。そのような補因子アナログは、過剰なアナログの存在から生じる低いバックグラウンドシグナルを超える連結反応の検出を容易にする。改善された方法では、検出に先だって、アナログそのもののその後の除去を伴うことができる。
【００４８】
例えば、実験により、ｄＡＴＰが、ＡＴＰ依存性リガーゼのＴ４ＤＮＡリガーゼに対する効果的な補因子であることが明らかにされている（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ他，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：２０５〜２１１（１９９７年）を参照のこと）。しかしながら、ｄＡＴＰでさえ、ルシフェラーゼによる著しいバックグラウンドシグナルを生じさせるが、これは、ＡＴＰによって引き起こされるバックグラウンドシグナルよりも低い。代わりの方法は、ｄＡＴＰの使用を、アピラーゼを用いた連結後処理と組み合わせ、その結果、過剰なｄＡＴＰが、ルシフェラーゼを使用する光シグナルの検出に先立って分解されるようにすることである。この組合せは、実施例の節に記載されるように、例えば、ＤＮＡ反復の長さの変動を検出するための驚くほど効果的な方法をもたらしている。その結果はまた、ＮＡＤ＋依存性リガーゼをＰＰＤＫとの組合せで使用して得られた結果と匹敵し得る。
【００４９】
さらに、アピラーゼは基質（例えば、ｄＡＴＰ）についてＡＴＰ依存性リガーゼと競合するので、アピラーゼ、リガーゼおよび基質の濃度は特定の状況について最適化されなければならない。従って、過剰量のＤＮＡリガーゼ基質を減少させるために、アピラーゼを、連結反応の後だけでなく、連結反応の前またはその期間中に加えることもまた可能である。
【００５０】
従って、別の実施形態では、連結工程（工程ｄ）が、ＡＴＰ依存性リガーゼを用いて行われ、アピラーゼが、過剰量のＤＮＡリガーゼ基質を減少させるために、連結前に、または連結期間中に、または連結後に工程ｄ）の連結混合物に加えられる。
【００５１】
好ましい実施形態において、ＡＴＰ依存性リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼである。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、ｄＡＴＰが、連結工程（工程ｄ）においてＡＴＰ依存性リガーゼに対する基質として使用される。
【００５３】
本発明の特許請求項に記載される方法の最後の工程として、連結副生成物が、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために検出される。生じる連結副生成物の量は、起こった連結反応の数に比例している。下記に記載されるように、場合により、ヌクレオチド反復ユニットの数を推定することを可能にするために、連結反応が起こっているか否かを検出することが十分である。当業者は、最終生成物のさらなる操作が望ましいことを明らかにすることができ、従って、本発明では、本発明の方法の使用に対するこのような調節が意図される。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法に関連する：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）このヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、このＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。あるいは、一部の工程を同時に行うことができ、一部の工程を連続して行うことができる。これは、例えば、異なる工程で、実施されるための異なる条件（例えば、異なる緩衝液、温度など）が要求されるときには好ましくなり得る。１つの成分を除いて反応のために必要なすべての成分はまた、分析に先だって混合することができ、この一連の反応を、最後の成分を加えることによって開始することができる。
【００５５】
この実施形態において、連結副生成物の１つ（すなわち、ＡＭＰもしくは修飾ＡＭＰまたはＰＰｉ（ピロリン酸））がＡＴＰに変換される。
【００５６】
１つの好ましい実施形態において、連結副生成物はＡＭＰである。
【００５７】
本発明による連結反応において生じたＡＭＰは好ましくは、ＡＴＰに変換される。１つの好ましい実施形態において、本発明による連結反応において生じたＡＭＰは、下記のようにピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）を使用する一段階の酵素反応によってＡＴＰに変換される：
【００５８】
ＡＭＰに対するＫｍはＡＴＰに対するＫｍの１／２５０である。従って、この反応はＡＭＰ−＞ＡＴＰの方向に強く動かされる。ピルビン酸リン酸ジキナーゼは、６．５〜７のｐＨ至適、６〜１１の範囲内でのｐＨ安定性、５５℃〜６０℃の至適温度を有しており、５５℃未満の温度で安定である。この酵素の特筆すべき利点は、高い温度（５０℃〜６０℃）でのその安定性および高活性である。多くの場合、この範囲での温度は、好適なストリンジェンシーを有するアニーリング条件を提供するために好ましいので、このことは利点である。また、ＰＰＤＫが、ホタルルシフェラーゼを使用する生物発光検出（これは、下記に詳しく記載される好ましい検出アッセイである）が容易に行われる緩衝液において使用される。
【００５９】
あるいは、連結反応の別の副生成物（すなわち、ＰＰｉ）が好ましくはＡＴＰに変化される。上記で議論されたように、連結反応における基質（ＡＴＰ）は、（例えば、上記で概略されたように、アピラーゼが使用されない場合）、ルシフェラーゼ反応のための基質と同じであるので、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼは、いくつかの実施形態では、本発明のために好適ではない。しかしながら、修飾されたＡＴＰ分子（例えば、ｄＡＴＰまたは２−アミノプリンリボシド三リン酸など）を使用することができるＤＮＡリガーゼ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，ＹおよびＮｉｓｈｉｇａｋｉ，Ｋ、ＡＴＰ要求酵素におけるＡＴＰの予想外の一般的代替可能性、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：２０５〜２１１（１９９７年））が本発明では用いられる。好ましいそのようなＤＮＡリガーゼは下記の反応を触媒する（式中、Ａ＊は、上記で定義されるような修飾されたアデノシン分子を示す）：
【００６０】
修飾されたＡＴＰ分子を使用することの利点の１つは、修飾されたＡＴＰ分子が、（下記に記載される）好ましい、ルシフェラーゼに基づくアッセイを、ＡＴＰが妨害するのと同じ程度に妨害しないことであり、従って、修飾されたＡＴＰ分子を、下記に記載される好ましい、ルシフェラーゼに基づくアッセイの期間中、存在させることができることである。リガーゼによって要求される補因子のタイプおよび濃度は、連結事象のルシフェラーゼ媒介による検出を成功させるための重要な要素である。この補因子は効果的な連結を助けなければならないが、（例えば、上記で概略されたように、アピラーゼが使用されない場合）検出工程を妨害してはならない。
【００６１】
本発明による連結反応において生じるＰＰｉは、その後、好ましくは、ＡＴＰ−スルフリラーゼを用いる下記の反応によってＡＴＰに変換される（式中、ＡＰＳはアデノシン５’−ホスホ硫酸を示す）：
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法に関連する：
ａ）ヌクレオチド配列を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）このヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかの指標として、ルシフェラーゼに基づくアッセイによってこのＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、すなわち、すべての成分を一緒に混合することによって行われるか、または連続して、すなわち、それぞれの工程のために必要な成分のみを混合し、さらなる成分を続いて加えることによって行われる。あるいは、一部の工程を同時に行うことができ、一部の工程を連続して行うことができる。これは、例えば、異なる工程で、実施されるための異なる条件（例えば、異なる緩衝液、温度など）が要求されるときには好ましくなり得る。１つの成分を除いて反応のために必要なすべての成分はまた、分析に先だって混合することができ、この一連の反応を、最後の成分を加えることによって開始することができる。
【００６３】
生じたＡＴＰ（例えば、連結副生成物をＡＴＰに変換するための上記の反応のいずれかによって生じたＡＴＰ）は、好ましくは、この実施形態に従って、ルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて基質として使用される。ＡＴＰの量は、生じた連結副生成物（ＡＭＰまたはＰＰｉ）の量に、すなわち、起こった連結反応の数に比例しているので、また、ＡＴＰの量がルシフェラーゼ反応のために限定されているという条件では、すなわち、ルシフェリンおよびＯ２が過剰に存在するという条件では、光の発生は連結反応の数に対応する。本発明のために好適なルシフェラーゼは下記の反応を触媒する：
【００６４】
放射される光の波長は、用いられるルシフェラーゼの起源に依存する。
【００６５】
さらに別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、核酸サンプルの微生物型決定のための方法に関連する：
ａ）微生物型決定のための少なくとも１つのマーカーを含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）この核酸サンプルの微生物型決定のためのマーカーを含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）このオリゴヌクレオチドをこの核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）この核酸サンプルにアニーリングしたこのオリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、連結副生成物を検出する工程；
ｆ）微生物型を決定するために、サンプルの連結パターンを参照パターンと比較する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は同時に行われるか、または連続して行われるか、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【００６６】
本発明により、様々な異なる種のＤＮＡ、例えば、様々な異なる微生物種に由来するＤＮＡが、好適な長さおよび組成のプローブを選ぶことによって解明される。例えば、細菌における比較配列分析のための最も広範囲に使用されている標的遺伝子は、３０Ｓのリボソームスモールサブユニットの構造的一部をコードする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子である。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列決定は系統発生的研究のための重要な手段であり、また、微生物同定のためにも使用されている。
【００６７】
上記反応を触媒することができる、すべての異なる微生物に由来するすべてのルシフェラーゼ酵素が、その組換え変異体を含めて、本発明において意図される。熱活性なルシフェラーゼを、種々の種に由来する野生型酵素、変異体および組換え変異体を含めて、入手することができ、また、より高い温度でルシフェラーゼ反応を行うことが好ましいときには使用することができる。ルシフェラーゼ反応を、反応のために必要な試薬を加えることによって、連結反応および変換反応に続いて、これらの反応を生じさせることが可能になった後で行うことができる。あるいは、連結のリアルタイム測定を可能にするために連結反応および変換反応を進行させることができるので、発光反応のために必要な試薬を同時に存在させることができる。別の実施形態において、より低い温度で活性である熱安定性のルシフェラーゼ、例えば、Ｋａｊｉｙａｍａ ＮおよびＮａｋａｎｏ Ｅ，１９９３年（２１７位における一アミノ酸置換によるホタルルシフェラーゼの熱安定化）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（５０ １３７９５〜９））に記載されるルシフェラーゼなどを用いることができ、また、２段階で行われる酵素反応に共役させることができる。すなわち、最初に、連結反応および変換反応が、特異的な適用のために好適なより高い温度で行われ、その後、温度が下げられ、ルシフェラーゼ活性が測定される。
【００６８】
天然のホタルルシフェラーゼは、反応混合物におけるＭｇ２＋、ＡＴＰ、ルシフェリンおよび分子状酸素の存在に完全に依存している（Ｆｏｒｄ，ＳＲおよびＬｅａｃｈ，ＦＲ、ホタルルシフェラーゼアッセイの適用における改善、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１０２巻：生物発光方法およびプロトコル（３頁〜２０頁、Ｒ．Ａ．ＬａＲｏｓｓａ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９８年）を参照のこと）。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が、システイン残基の酸化または金属イオンによる反応の阻害を防止するために反応混合物にそれぞれ加えられる。従って、ルシフェラーゼ反応は、好ましくは、約１０ｍＭのＭｇ２＋（例えば、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ）およびＤＴＴ（例えば、０．２ｍＭ）を含む緩衝液において行われる。至適温度は２５℃である。３０℃を超える温度（特に、３５℃を超える温度）は野生型酵素の迅速な不活性化を引き起こす。従って、ルシフェラーゼ反応は、好ましくは、ｐＨ７．５〜８（より好ましくはｐＨ７．８）において、２ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇ２＋、０．５ｍＭ〜２ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭ〜２ｍＭのＥＤＴＡの存在下、２０℃〜３０℃の温度で行われる。しかしながら、ルシフェラーゼの変異体は、例えば、上記に記載されるような温度に関して、他の要求を有することがある。重要なことは、塩化物イオンはルシフェラーゼ反応を阻害することがあり、従って、塩化物イオンをルシフェラーゼ反応の期間中に存在させることは次善となることがあるということである。
【００６９】
多くの方法を、発光反応の結果としての光の検出のために利用することができ、例えば、写真フィルム、Ｘ線フィルムにおける検出、光電子増倍管（ＰＭＴ）または電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラの使用による検出などのために利用することができる。本発明のために、ＰＭＴまたはＣＣＤカメラによる光度測定法検出アッセイが好ましい。そのような方法は光放射の定量的な測定を可能にするからである。本発明において提供される方法による大きな利点は、この方法が、連結反応をリアルタイムで検出することを可能にすることである。
【００７０】
連結のリアルタイム検出は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応による光産生を、初期レベルが検出された後で「停止する」酵素を含めることによってさらに改善することができる。「初期レベル」は、光放出が検出されるために必要な光のレベルを示す。このレベルは、使用される検出装置に関連して当業者によって容易に決定される。この「停止」原理はまた、ルシフェラーゼ酵素の低い「バーンレート」に関しても好都合であり得る。そのような酵素は連結事象間の応答時間を増大させる。好適な酵素は、上記で記載されたように、ＡＴＰをＡＤＰに分解するが、ＡＭＰを分解しないアピラーゼである。この酵素は、従来のピロシーケンシング（米国特許第６２５８５６８号）において非常に都合良く使用されている。
【００７１】
従って、さらに別の実施形態において、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応における光産生が、産生された光の初期レベルに到達した後、酵素的に停止される。好ましくは、これはアピラーゼの添加によって行われる。
【００７２】
本発明の方法による連結副生成物の検出は２種類の情報をもたらす：１）連結副生成物が生じるならば、連結反応が起こっている。場合により、（下記に記載される）、この情報は十分である。２）上記で述べられたように、連結副生成物の量が連結反応の数に比例しており、従って、核酸サンプルの量が既知であるならば、核酸サンプルにおける反復したヌクレオチド配列の反復数、または微生物型決定のためのマーカーを計算するために使用することができる。
【００７３】
ＰＰＤＫを使用して、ＡＭＰをＡＴＰに変換し、次いで、そのＡＴＰを使用して、ルシフェリン−ルシフェラーゼに基づくシグナルを生じさせることが、Ｓａｋａｋｉｂａｒａ他（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｔ他，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｎｍ．１９９９年、２６８（１）：９４〜１０１）およびＩｔｏｈ他（Ｉｔｏｈ他，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２００３年，１９：１０５〜１０９））によって報告されている。しかしながら、これらの適用において、この方法は、ＲＮＡの分解によって生じたＡＭＰを測定して、食品の衛生状態に対する指標を提供するために（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ他，１９９９年）、または、二重免疫学的反応において（Ｉｔｏｈ他，２００３年）、それぞれ使用されていた。
【００７４】
数多くのリボザイムが、リガーゼ活性を有することもまた報告されており、これらもまた本発明において意図される（Ｇｌａｓｎｅｒ，ＭＥ他（２００２年）、ＲＮＡリガーゼリボザイムの構造および触媒作用のための金属イオン要求、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，８１０３〜８１１２；ＭｃＧｉｎｎｅｓｓ，Ｋ．Ｅ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（２００２年）、外部ＲＮＡテンプレートにおけるＲＮＡ触媒によるＲＮＡ連結、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ９，２９７〜３０７）。連結は、基質に直接に連結するリボザイム（すなわち、クラスＩリガーゼ、Ｇｌａｓｎｅｒ他，２００２年）を伴い、また、相補的なテンプレートにおいて隣接位置で結合される２つのオリゴヌクレオチドの連結さえ伴う（ｈｃリガーゼリボザイム、ＭｃＧｉｎｎｅｓｓおよびＪｏｙｃｅ，２００２年）。それぞれの場合において、連結は、一方の分子の３’−ＯＨ基を別の分子の５’−三リン酸に結合すること、およびピロリン酸の放出を伴う。ＡＴＰなどの補因子はこの反応に関与しておらず、従って、リボザイムは、連結反応の好ましい検出が、ルシフェラーゼに基づくアッセイの使用を伴うとき、本発明のために好適である。
【００７５】
本開示の他所で言及されたリガーゼ酵素に加えて、本発明のための好適なリガーゼ酵素が下記に例示されるが、下記のリガーゼ酵素に限定されない：ＡＴＰ依存性リガーゼ酵素（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＢｓｔＤＮＡリガーゼ、ＴｆｉＤＮＡリガーゼなど）、ＮＡＤ＋依存性リガーゼ酵素（例えば、ＴｔｈＤＮＡリガーゼ、ＴｆｌＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼなど）、およびＲＮＡリガーゼ酵素（例えば、ｔＲＮＡリガーゼなど）。
【００７６】
本発明の方法が行われるとき、２つのタイプの分析が可能である。特定の核酸サンプルにおける反復の数を、既知の数の反復した配列を有する既知量のテンプレートＤＮＡを使用することにより連結副生成物の検出の標準曲線を構築することによって決定することができる。それぞれの連結反応が１つの連結副生成物をもたらすので、連結副生成物の量の決定により、ヌクレオチド反復の数を決定することが可能になる。分析される核酸サンプルにおけるテンプレートＤＮＡの量が既知であるならば、反復の数を、標準曲線を使用して連結副生成物の量を反復の数に関連づけることによって決定することができる。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、「一致しない」オリゴヌクレオチドが、上記で記載されたように使用される。この場合、例えば、上記で記載されたように、テンプレートＤＮＡの全範囲が連結オリゴヌクレオチドで満たされるまで、さらなるオリゴヌクレオチドのそれぞれの添加において検出可能である連結副生成物が生じる。従って、この場合、テンプレートの量が既知である必要はない。反復ユニットが２である場合、それぞれの一致しないオリゴヌクレオチドは、奇数の数を有する３つ以上のヌクレオチドを有しなければならない。反復数が３である場合、オリゴヌクレオチドは、３の倍数を除いて、２ヌクレオチド以上から、反復したユニットの配列の全長までであり得る。例えば、三重反復の検出の場合、４ｍｅｒ体、５ｍｅｒ体、７ｍｅｒ体、８ｍｅｒ体、１０ｍｅｒ体、１１ｍｅｒ体などの組合せを使用することができる。一致しないオリゴヌクレオチドが使用されるとき、ヌクレオチド反復配列のすぐ外側でアニーリングするように適合化されているオリゴヌクレオチドが好ましくは最初に加えられる。重要なことは、オリゴヌクレオチドは、それぞれのオリゴヌクレオチドが、１つの場所で、（すなわち、現在の連結サイクルの直前の連結サイクルにおいて加えられたオリゴヌクレオチドの隣りで）連結することができるだけであるように構築されなければならないということである。
【００７８】
一致しないオリゴヌクレオチドが使用されるとき、１つの連結サイクルに由来するアニーリングしていないオリゴヌクレオチド（すなわち、アニーリングまたは連結されないオリゴヌクレオチド）が好ましくは、その次の連結サイクルが開始される前に除かれる。これは種々の方法で達成される。１つの方法は、連結反応時に存在するアニーリングしていないオリゴヌクレオチドを消化する一本鎖ＤＮＡ依存性エキソヌクレアーゼを使用することである。例えば、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）（大腸菌のｓｂｃＢ遺伝子の産物）は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを３’から５’の方向で消化するエキソデオキシリボヌクレアーゼである。酵素活性は自由な３’−ヒドロキシル末端の存在を絶対的に要求する。この場合、テンプレートを、３’末端の修飾によって、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するジデオキシヌクレオチドの取り込みなどによって保護することが必要である。あるいは、本発明の別の好ましい実施形態において、アニーリングしていないオリゴヌクレオチドを、５’リン酸をオリゴヌクレオチドから除くことによって不活性化する酵素が連結反応工程の期間中または反応工程の後に加えられる。この酵素はホスファターゼであり得るか、または、５’末端リン酸に依存する５’末端特異的エキソヌクレアーゼであり得る。ホスファターゼは、エビのアルカリホスファターゼＳＡＰ、子ウシ腸アルカリホスファターゼＣＩＰ、または任意の細菌アルカリホスファターゼからなる群から選択することができる。上記で記載されたようなアニーリングしていないオリゴヌクレオチドの除去はまた、反復ユニットのｎ−ｍｅｒ体がオリゴヌクレオチドとして使用されるときに利用され得ることが当業者によって容易に理解される。
【００７９】
本発明の別の好ましい実施形態において、核酸サンプルが担体に固定化される。固定化は共有結合性または非共有結合性のいずれかであり得る。この分野で使用されている一般的な非共有結合性の方法はビオチン−ストレプトアビジン結合対の利用であり、この場合、ビオチンがプライマーに結合され、ストレプトアビジンが担体に結合される。頻繁に使用されている共有結合性の結合方法は、プライマーに結合されたアミノリンカーの使用であり、これは、エポキシシラン処理された表面と容易に反応する。担体は数タイプのものが可能である：例えば、ビーズ（非中空または多孔性）、またはチップもしくはファイバーの表面である。別の方法は、相補的であるプライマーを、遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復、または微生物型決定のための１つのマーカーなど）を含む領域の隣接配列に、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合対を介して結合することである。固定化された核酸サンプルまたはプライマーの使用による１つの利点は、過剰な酵素、オリゴヌクレオチドおよび／または分解生成物が、１つの好ましい実施形態では、１つの連結−検出サイクルの後、その次が開始される前に、洗浄工程によって容易に除くことができることである。
【００８０】
上記で記載されたこれら２つのタイプの分析が、連結副生成物がＡＴＰに変換され、このＡＴＰが、連結反応が起こったことを検出するための、ルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて使用されるときの本発明の変形とともに図１および図２に例示される。図１は、反復ユニットそのものの単量体または多量体であるオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドとして使用される「終点」分析を示す。それぞれの連結反応が特定量の光を放射させ、その総量が定量される。放射された光の量は、サンプル核酸の量が既知であるならば、上記で記載されたような標準曲線を使用して、反復数に関連づけることができる。図２において、続いて加えられ、連結することを可能にする一致しないオリゴヌクレオチドが使用され、１つの連結反応において放射された光が、その次のオリゴヌクレオチドが加えられ、サイクル（すなわち、添加、連結、および光放射の検出）がもう一度開始される前に「段階的」様式で検出される。これは、それ以上の光が放射されなくなるまで繰り返される。すなわち、これは、サンプル核酸における反復した配列の全範囲が連結オリゴヌクレオチドで満たされるときには当てはまる。従って、反復した配列における反復ユニットの数を、サンプル核酸の量を知ることなく決定することができる。
【００８１】
オリゴヌクレオチドの長さおよび配列の選択に依存して、この方法は、２塩基〜数千塩基の範囲における反復配列について使用することができる。
【００８２】
連結反応は、リガーゼ、および、連結されることになる核酸のタイプの選択に依存して、広範囲の温度にわたって行われる。例えば、ハイブリダイゼーションさせられるテンプレート核酸に対する大きな程度の相補性を有するオリゴヌクレオチドプローブが使用されるとき、相補性が低い場合よりも高い温度を、熱に安定なリガーゼを使用することによって連結反応時に使用することができる。緩衝液の選択、および、連結反応時におけるリガーゼの濃度は、それぞれの特異的なリガーゼについて最適化されなければならず、また、当業者の能力の範囲内である。
【００８３】
好ましい実施形態において、連結反応は、ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼを使用して行われ、生じたＡＭＰ連結副生成物が、ＰＰＤＫ酵素を使用してＡＴＰに転換される。生じたＡＴＰが、その後、好ましくは、ルシフェラーゼに基づくアッセイを使用して検出される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、熱安定性リガーゼ（例えば、ＴａｑＤＮＡリガーゼ）が、（熱に不安定な試薬を伴う）検出工程に関係なく、連結反応を循環させるために使用され、反応の生成物が検出試薬に移される。あるいは、反応液を冷却し、その後、熱に不安定な成分が反応チャンバーに導入される。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、ＰＣＲ反応が、標的核酸の量を連結反応の前に増幅するために核酸サンプルに対して行われる。これは、ヌクレオチド反復について分析されるテンプレート核酸の量が低いならば好まれる。また、これは、反復した配列に隣接する対立遺伝子特異的な配列に対して特異的なＰＣＲプライマーが使用されるならば、対立遺伝子特異性が得られることを可能にする。
【００８６】
ヒトなどの生物では、ヌクレオチド反復の２つの対立遺伝子の様々な異なる対立遺伝子形態を見つけることは非常に一般的であり、このことは、犯罪を解決するために法医学においてしばしば使用される。本発明は、連結副生成物の量が連結反応の数に比例しているので、異なる数の反復が２つの対立遺伝子に存在する状況を解決する。短い方の対立遺伝子がオリゴヌクレオチドプローブで満たされるとき、連結副生成物の数が５０％減少する。例えば、連結反応が、上記で記載されるような、ルシフェラーゼに基づくアッセイを使用して、放射された光によって検出されるとき、光の産出は約５０％低下することになり、これは、光度測定法によって容易にモニターすることができる差である。従って、それぞれの対立遺伝子における反復ユニットの数を本発明によって決定することができる。
【００８７】
本発明はまた、本発明による方法を行うためのキットに関連し、そのようなキットは、別個のバイアルにおいて、リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む。好ましくは、リガーゼ酵素はＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼである。好ましくは、連結副生成物を変換するための酵素はＰＰＤＫ酵素である。本発明はまた、別個のバイアルにおいて、ルシフェラーゼ酵素をさらに含むキットに関連する。本発明によるキットは、好ましくは、下記の疾患群から選択される疾患に関連した遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含む領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。さらに、１つの実施形態において、キットはさらに、別個のバイアルにおいて、アピラーゼを含む。
【００８８】
本発明による別のキットは、好ましくは、下記の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【００８９】
本発明によるキットにおけるバイアルはまた、キットが少なくとも２つのバイアルを含むならば、キットの成分の２つ以上を含むことができる。
【００９０】
本発明はまた、本発明による方法を行うための組成物に関連し、そのような組成物は、リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む。好ましくは、リガーゼ酵素はＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼである。好ましくは、連結副生成物を変換するための酵素はＰＰＤＫ酵素である。本発明はまた、ルシフェラーゼ酵素をさらに含む組成物に関連する。本発明による組成物は、好ましくは、下記の疾患群から選択される疾患に関連した遺伝因子（例えば、ヌクレオチド反復など）を含む領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。
【００９１】
本発明による別の組成物は、好ましくは、下記の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）を含むことができる：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【００９２】
米国特許第４９８８６１７号には、「上流側」オリゴヌクレオチドの３’末端が多型位置を覆って置かれるように設計された特異的なオリゴヌクレオチドを使用して、連結反応の検出を伴うＳＮＰを分析するための方法が記載される。「下流側」オリゴヌクレオチドが、その５’末端が上流側プライマーに並置されて置かれる。下流側プライマーの５’末端が、下流側オリゴヌクレオチドの３’−ＯＨ末端に対する連結を可能にするためにリン酸化される。上流側プライマーの１つの型は、その３’末端において特定のテンプレート分子に関して相補的であり、一方で、別の遺伝子型のテンプレート分子とのミスマッチを形成する。このミスマッチはＤＮＡリガーゼの特異性のために連結反応を妨げ、従って、連結または連結の欠如を使用して、多型を検出することができる。その後、プローブが標的ヌクレオチド配列から分離され、連結された生成物の存在または非存在が検出される。この検出では、固定化されたプローブを使用することによってゲルでのヌクレオチド範囲の分離を伴うことができる。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＳＮＰを分析するために使用される。ヒトゲノムにおける大多数の変異は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり、それらは多くの場合、遺伝病に関係づけられ得る。従って、そのようなＳＮＰを検出するための確実な方法を有することは重要である。ＳＮＰを検出するための現在利用することができる方法には、ミスマッチしたプローブの異なる変性に依存する方法、例えば、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌｅｃｅ，ＲＢ他，１９７９年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．６：３５５３）および変性勾配ゲル電気泳動（Ｍｙｅｒｓ，ＲＭ他，１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）などにおける方法がある。あるいは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）（Ｇｅｅｖｅｒ他，１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：５０８）を使用することができ、この場合、ヌクレオチド配列の違いの結果である別の消化パターンが検出される。しかしながら、ヒトゲノムにおけるヌクレオチドの約１／３のみがこの技術によって分析され得るにすぎない。ＲＦＬＰでは、ＳＮＰの約１／２を分析することが可能になる。本発明は、任意の植物、動物または微生物から得られる任意のＤＮＡ含有サンプル（例えば、血液、細胞または組織など）におけるＳＮＰを分析するために使用することができる。テンプレートＤＮＡ上において互いにすぐ隣接してアニーリングする様々なオリゴヌクレオチドが構築される。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのうちの１つの末端ヌクレオチドが、もう一方のプローブに隣接する末端で、その位置においてテンプレート核酸のヌクレオチドの正常なヌクレオチドまたは異常なヌクレオチドのいずれかに対して相補的であるヌクレオチドを有するように構築される。これらのオリゴヌクレオチドは、テンプレート核酸にアニーリングすることができ、その後、本発明の方法の各工程を上記のように行うことができる。テンプレート核酸の多型部位におけるヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのこの位置におけるヌクレオチドに対して相補的であるならば、連結反応が起こり、連結副生成物が放出され、この連結副生成物を、光シグナルを生じさせるためにＡＴＰに変換することができ、最終的には光シグナルを検出することができる。オリゴヌクレオチドとテンプレート核酸との間に相補性が存在しないならば、連結は起こらず、従って、光放射が起こらない。従って、多型部位におけるヌクレオチドの同一性を明らかにすることができる。
【００９４】
本発明はまた、約８個〜１０個のヌクレオチドからなるヌクレオチド反復であるテロメアの長さを決定するために好適である。ヒトの老化がテロメアの短縮化に関連づけられ、また、ガンの種々の形態もまたテロメアの短縮化に依存しているかもしれないことが示唆されている。
【００９５】
本発明はまた、種々の法医学的検査および父子鑑定においてしばしば使用されるミクロサテライトの長さを決定するために好適である。最も頻繁に使用されているミクロサテライトはＣＡ反復である。
【００９６】
連続したプローブをアニーリングし、その後、どのプローブがアニーリングしているかを、ルシフェラーゼ反応に連係した連結事象によって明らかにする方法を、多くの他のタイプの遺伝子分析に適用することができる。一例が、そのための分子的方法が標的配列フラグメントの増幅にしばしば基づいている細菌の同定である。その後、アンプリコンが、特定の菌株、種または群に関連し得る、有り／無しの答え（ＤＮＡハイブリダイゼーション、種特異的なＰＣＲ）またはパターン（断片多型、ＤＮＡ配列決定）を得るために分析される。細菌における比較配列分析のための最も広範に使用されている標的遺伝子は、３０Ｓリボソームスモールサブユニットの構造的一部をコードする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子である。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列決定は系統発生的研究のための重要な手段であり、また、微生物同定のためにも使用されている。１６Ｓ遺伝子はかなり大きく（約１５００塩基）、多くの場合、近縁菌株の分類のためにはあまりにも少ない変動を含有する。さらに、多くの属において、１６Ｓ遺伝子は、配列不均一性をもたらし得る多コピー遺伝子である。これらの欠点のために、さらなる標的遺伝子が調べられており、これらには、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｐＥＬが含まれる。２３Ｓ遺伝子もまた、好適な代わりになりつつある。ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列は１塩基対〜１０塩基対および１０塩基対〜１００塩基対の範囲での反復をそれぞれ伴うが、これらもまた、細菌同定において使用される。多くがＶＮＴＲ（変動数のタンデム反復）として示される。さらに、菌類などの真核生物のなかには、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）が、分子的同定のための理想的な標的を提供する。菌類において、２３Ｓ様遺伝子の埋め込まれた拡大セグメント（ＥＳ）領域は非常に変わりやすく、従って、診断的標的配列として役立つ。ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを、数多くの特異的な遺伝子領域を使用して検出し、型決定することができる（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）を型決定するためのＬ１、Ｅ６、Ｅ６／Ｅ７、Ｅ７／Ｅ１およびＥ１の各領域）。上述の可変領域は、連結媒介型方法による分析のための好適な標的であり得る。
【００９７】
従って、本発明はまた、微生物種におけるヌクレオチド反復の長さを決定するために、または、そうでない場合には、微生物種における遺伝子の変動性を特徴づけるために好適であり、このことは、菌株および単離体を同定するための有用な手段である。
【００９８】
さらに、本発明の１つの実施形態において、連結反応から得られたシグナルが、テンプレート分子または代表的な代わりのＤＮＡ鎖における別の位置において行われた別個の連結事象またはプライマー伸長事象により生じたシグナルを使用することによって、本発明の方法を行う前に正規化／校正される。
【００９９】
また、別の実施形態では、多重反応で同時または逐次的に鎖を分析するために、分析される種々のＤＮＡ鎖が同じ反応に含められ、好適な連結可能なプローブが加えられる。
下記において、本発明が実施例として記載されるが、そのような実施例は、本発明を例示することが意図され、本発明の範囲をいかなる点においても限定することは意図されない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：熱サイクルによる連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結、それに続く生物発光検出
これらのオリゴヌクレオチドは、鎌状赤血球貧血を引き起こす点突然変異を含有するβ−グロビン遺伝子の領域の合成体を表すために設計された（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．（１９９１年）、クローン化された熱安定性リガーゼを使用する遺伝病の検出およびＤＮＡ増幅、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１８９〜１９３を参照のこと）。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドは、アニーリング後、下記の複合体を形成する：
【０１０２】
下記を２００μＬのＰＣＲチューブにおいて５０μＬの最終体積で混合した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；１０ｍＭのジチオスレイトール；１ｍＭのＮＡＤ＋；２０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；０ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、４ｐｍｏｌまたは１０ｐｍｏｌのテンプレートＢＧＬ−Ｔ、４０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド（ＢＧＬ−１およびＢＧＬ−２）。リガーゼ酵素を省いたコントロールが含められた。チューブを、下記の方法を使用してサーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｔｒａｄ）でインキュベーションした：
【０１０３】
連結の成功が、ストレプトアビジン−セファロースビーズでの連結生成物（ビオチン−ＢＧＬ１−ＢＧＬ２）の捕獲、それに続く、変性、特異的な配列決定用プライマーＢＧ−Ｓ１のアニーリング、および、パイロシーケンスによる完全な配列の確認を伴う並行実験において確認された。
【０１０４】
２５マイクロリットルの反応液をＰＳＱ９６プレートに移した。２０マイクロリットルの検出混合物＃１を加えた（これは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；０．６２５ｍＭのホスホエノールピルビン酸；０．３７５ｍＭのピロリン酸ナトリウム；５０μｇのＰＰＤＫを含有した）。プレートをＰＳＱ９６パイロシーケンス装置に移した。装置内で、５μＬの検出混合物＃２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；１３μｇのルシフェラーゼ；７．５μｇのルシフェリン）が、３７℃のインキュベーション温度とともに、ＰＳＱ９６装置の分注カセットを使用して加えられた。光の発生が、ＰＳＱ９６装置においてＣＣＤカメラを使用して追跡された。最初の反応における０ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、４ｐｍｏｌおよび１０ｐｍｏｌのテンプレートＢＧＬ−Ｔについての結果が図３に示される。
【０１０５】
シグナルが、反応混合物におけるテンプレートの量とともに明らかに増大している。このことは、連結、放出されたＡＭＰのＡＴＰへの変換、次いで光への変換の連係が機能していることを示している。
【０１０６】
実施例２：生物発光検出に連係した連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結。プレアニーリングされたプライマー／テンプレート複合体に対するリガーゼ工程およびＰＰＤＫ工程の組合せ。
下記を、三連ウエルで、２００μＬのＰＣＲチューブにおいて２０μＬの最終体積で混合した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液、ｐＨ７．６；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；５ｐｍｏｌのテンプレートＢＧＬ−Ｔ；２０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド（ＢＧＬ−１およびＢＧＬ−２）。オリゴヌクレオチドを、８０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温に冷却することによってテンプレートにアニーリングさせた。アニーリングした反応液を、ＰＳＱ９６において使用されるマイクロタイタープレートに移した。コントロールは緩衝液のみを含んだ。その後、連結、および、放出されたＡＭＰのＡＴＰへの変換のための試薬を含有する混合物の２０マイクロリットルを加えた。この混合物は下記を含有した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；２．５ｍＭのＮＡＤ＋；２５ｍＭのＤＴＴ；０．６２５ｍＭのホスホエノールピルビン酸；０．３７５ｍＭのピロリン酸ナトリウム；５０μｇのＰＰＤＫ；２０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ（コントロールでは省かれた）。反応液を４５℃で１０分間インキュベーションした。プレートをＰＳＱ９６に移し、５μＬの検出混合物＃２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；１３μｇのルシフェラーゼ；７．５μｇのルシフェリン）が、２８℃のインキュベーション温度とともに、ＰＳＱ９６装置の分注カセットを使用して加えられた。光の発生が、ＰＳＱ９６装置においてＣＣＤカメラを使用して追跡された（図４参照）。
【０１０７】
実施例３：ＣＴＧ反復の数の差の検出
本実験は、数多くのポリグルタミン疾患（上記の表を参照のこと）に関与するトリヌクレオチド反復（ＣＡＧ／ＣＴＧ）に基づいた。（ＣＴＧ）２０または（ＣＴＧ）１０の配列を有するオリゴヌクレオチドテンプレートの１ピコモルを、９６ウエルのＰＳＱ９６プレートにおいて、２０μＬのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；２０ｍＭの酢酸カリウム）中で、４０ピコモルの相補的な５’−リン酸化オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）３と混合した。短いリン酸化オリゴヌクレオチドを、８０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温に冷却することによって、長い方のオリゴヌクレオチドテンプレートにアニ−リングさせた。連結を、５μＬの連結混合物（アニーリング緩衝液において２０ＵのＴａｑＤＮＡリガーゼ、６．２５ｍＭのＮＡＤ＋、および６２．５ｍＭのジチオスレイトール）を加え、４５℃で３０分間インキュベーションすることによって行った。リガーゼを含まない連結混合物を用いたコントロールもまた処理された。連結反応によって放出されたＡＭＰを、１５μＬのＰＰＤＫ混合物（アニーリング緩衝液において５０μｇのＰＰＤＫ、０．８ｍＭのＰＥＰ、および０．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム）を加え、４５℃で１０分間インキュベーションすることによってＡＴＰに変換した。生じたＡＴＰの量を明らかにするために、ＰＳＱ９６プレートをＰＳＱ９６パイロシーケンス装置に移した。装置内で、５μＬの検出混合物（アニーリング緩衝液において１３μｇのルシフェラーゼおよび７．５μｇのルシフェリン）が装置によって分注され、生じた光放出が検出された。四連についての結果が、コントロール（リガーゼを含まない）からのシグナルが引かれて、図５に示される。これらの結果は、ＣＴＧ反復の数が増大するとき、シグナルの増大を明瞭に示している（図５）。
【０１０８】
実施例４：ヌクレオチド反復の数を決定するためのずれたオリゴヌクレオチドの使用
本実施例では、サンプルＤＮＡにおける反復した配列が、本発明によって分析されることになる反復したユニットよりも長いオリゴヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチド（すなわち、ずれたオリゴヌクレオチド）の段階的な連結工程を用いてどのように分析されるかが記載される。
【０１０９】
最初に、プライマー−テンプレート複合体を、ヌクレオチド反復配列に隣接する配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを、アニーリングが起こることを可能にする条件のもとで加えることによって形成させる：
【０１１０】
次に、反復したユニットよりも長い（または短い）リン酸化オリゴヌクレオチド（この場合には３）を好適な連結緩衝液においてリガーゼおよび連結補因子と一緒に加える：
【０１１１】
その後、連結反応において放出された連結副生成物を、連結反応が起こっていることの目安として検出する。例えば、放出されたＡＭＰまたはＰＰｉを、上記で記載されたような、ルシフェラーゼに基づくアッセイで検出することができるＡＴＰに変換することによって。
【０１１２】
その後、過剰なリン酸化オリゴヌクレオチドを、その次のリン酸化オリゴヌクレオチド（ｐＣＣＧＣ）が、上記で記載されたように、リガーゼおよび連結補因子と一緒に加えられ、アニーリング、連結および検出の別の一連操作が開始される前に除く。
【０１１３】
その後、アニーリング、連結および検出のこのサイクルを、ヌクレオチド反復の全範囲が連結オリゴヌクレオチドで満たされるまで繰り返す。起こった連結反応の数は既知であるので、テンプレート核酸における反復ユニットの数を計算することができる。
【０１１４】
実施例５：過剰な補因子のアピラーゼ媒介による除去との組合せでのＡＴＰ依存性リガーゼの使用
本実験は、数多くのポリグルタミン疾患（上記の表を参照のこと）に関与するトリヌクレオチド反復（ＣＡＧ／ＣＴＧ）に基づいた。（ＣＴＧ）１０または（ＣＴＧ）２０の配列を有するオリゴヌクレオチドテンプレートの１ピコモルを、９６ウエルのＰＳＱ９６プレートにおいて、１５μＬのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）；２ｍＭの酢酸マグネシウム）中で、４０ピコモルの相補的な５’−リン酸化オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）３と混合した。短いリン酸化オリゴヌクレオチドを、８０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温に冷却することによって、長い方のオリゴヌクレオチドテンプレートにアニ−リングさせた。連結を、１５μＬの連結混合物（アニーリング緩衝液において２００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、２ｍＭのｄＡＴＰ、および２ｍＭのジチオスレイトール）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって行った。リガーゼおよび（ＣＡＧ）３を含まない連結混合物を用いたコントロールもまた処理された。連結反応液の２５マイクロリットルを、５０ｍＵのアピラーゼを１５μｌのアニーリング緩衝液において加え、室温（約２５℃）で２５分間インキュベーションすることによってアピラーゼで処理して、過剰なｄＡＴＰを消化した。連結反応によって生じたピロリン酸の量を明らかにするために、ＰＳＱ９６プレートをＰＳＱ９６パイロシーケンス装置に移した。装置内で、５μｌの酵素混合物（アニーリング緩衝液において２５ｍＵのスルフリラーゼおよび０．５μｇのルシフェラーゼ）および５μＬの基質混合物（アニーリング緩衝液において２８０ｐｍｏｌのＡＰＳおよび７．５μｇのルシフェリン）が装置によって分注され、生じた光放射が検出された。その後、既知量のピロリン酸およびＡＴＰから得られるシグナルを、５ピコモルのピロリン酸をそれぞれのウエルに分注し、続いて５ピコモルのＡＴＰを分注することによって測定した。三連についての結果が、コントロール（リガーゼおよびリン酸化オリゴヌクレオチドを含まない）からのシグナルとともに、図６ａに示される。
【０１１５】
図６ａにおける結果は、ｄＡＴＰとの組合せでＴ４ＤＮＡリガーゼから得られたシグナルが、連結されたオリゴヌクレオチドの非存在（コントロール）下で測定されるようなバックグラウンドを上回る連結シグナル（試験）の良好な分離を伴って、ＤＮＡ反復領域の長さに依存していることを明瞭に示している。
【０１１６】
図６ｂにおいて、ＮＡＤ＋依存性ＴａｑＤＮＡリガーゼ＋ＰＰＤＫ（実施例３）およびＡＴＰ依存性Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ｄＡＴＰを基質として使用する；本実施例）から得られた結果（「観測シグナル」）が、テンプレート分子あたりの連結の最大数から得ることができるシグナル（これは連結の理論的最大数から計算される）、および、５ｐｍｏｌのピロリン酸から得られるシグナル（「最大予想シグナル」）と比較される。これらの結果は、（１）予想された結果と、観測された結果との間における明瞭な相関、および、（２）２つの独立した連結方法の間における明瞭な相関さえも示している。
【０１１７】
実施例６：微生物の型決定
本実施例では、本発明の連結法が、細菌の型を決定するためにどのように使用され得るかが明らかにされる。図７は、連鎖球菌属の数多くの種に由来するｒｎｐＢ遺伝子の領域から得られた配列のアラインメントを示す。認められ得るように、共通する領域（陰影部）と、種間で変化する領域との両方が存在する。異なる種または種群の連結媒介による検出が下記のように行われる。長さおよび組成が異なるプローブが、種に依存して大きい効率または低い効率でそのような領域の連続した部分に対して同時または連続的のいずれかでアニーリングすることができるように設計される（図８参照）。アニーリングのレベルは、例えば、温度、塩濃度、または当業者に既知の他の薬剤（例えば、ジメチルスルホキシドなど）とともにストリンジェントな条件を適用することによって制御される。アニーリングの成功が、得られるシグナルが、どのくらい多くのプローブがアニーリングしているかの目安であるように連結反応によってモニターされ、従って、アニーリングの成功はテンプレートの同一性の目安を与える。アニーリング工程および検出工程が、適用に依存して、その後の検出を伴って、すべてのプローブを同時に使用するか、または、プローブを連続して加えることによるかのいずれかで行われる。これは、種の異なる群などを同定するための簡便なスクリーニング方法として使用することができ、その後、必要ならば、配列決定によって詳しく分析することができる。この原理は、当然ながら、数塩基を伴う任意の遺伝的変異に対して適用することができ、また、微生物の型決定に限定されない。本発明の方法ではさらに、アニーリングし、かつ、従って、（１）反応が機能していることを確認し、また（２）他の連結事象からのその後のシグナルを正規化するための標準シグナルをもたらすシグナルを与えることが常に予想され得る保存された領域におけるプローブを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明による、いわゆる「終点」分析を説明する図である。
【図２】本発明による、いわゆる「段階的」分析を説明する図である。
【図３】熱サイクル処理による連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結、それに続く生物発光検出を示す図である。
【図４】生物発光検出に連係した連結反応を用いた遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結（プレアニーリングされたプライマー／テンプレート複合体に対するリガーゼ工程およびＰＰＤＫ工程の組合せ）を示す図である。
【図５】ＣＴＧ反復数の違いの検出を示す図である。
【図６】図６ａは、遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結を示し、ＡＴＰ依存性リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）と、補因子としてのＡＴＰとの使用を示す図である。アピラーゼが、過剰な補因子を減少させるために使用される。図６ｂは、２つの連結方法（ＡＴＰ依存性リガーゼおよびＮＡＤ＋依存性リガーゼ）を使用する遺伝子内の可変位置における２つのオリゴヌクレオチドの連結の比較を示す図である。
【図７】連鎖球菌属の数多くの種から得られたｒｎｐＢ遺伝子の領域に由来する配列のアライメントを示す。
【図８】異なる種の領域に対するプローブのアニーリングを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号１〜１９は人工的な配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおける、ヌクレオチド反復または微生物型決定のためのマーカーの如き遺伝因子の存在を明らかにするための方法：
ａ）遺伝因子を含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記核酸サンプルの遺伝因子を含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、遺伝因子の存在の指標として検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項２】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記ヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項３】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記ヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、前記ＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項４】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記ヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかの指標として、ルシフェラーゼに基づくアッセイによって前記ＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項５】
以下の工程を含む、核酸サンプルの微生物型決定のための方法：
ａ）微生物型決定のための少なくとも１つのマーカーを含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記核酸サンプルの微生物型決定のためのマーカーを含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、連結副生成物を検出する工程；
ｆ）微生物型を決定するために、サンプルの連結パターンを参照パターンと比較する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項６】
工程ｂ）におけるオリゴヌクレオチドの一つが、反復配列のすぐ外側でアニーリングするように適合されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
連結副生成物がＡＭＰである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）がＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼを使用して行われる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）がピルビン酸リン酸ジキナーゼを使用して行われる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）が、ＡＴＰ依存性リガーゼを用いて行われ、アピラーゼが、過剰量のＤＮＡリガーゼ基質を減少させるために、連結前に、または連結期間中に、または連結後に工程ｄ）の連結混合物に加えられる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＴＰ依存性リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｄＡＴＰが、工程ｄ）においてＡＴＰ依存性リガーゼに対する基質として使用される請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
連結副生成物がＰＰｉである請求項１〜６または１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｅ）がＡＴＰ−スルフリラーゼを使用して行われる請求項１〜６または１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
使用されたオリゴヌクレオチドが反復そのものの単量体、二量体または多量体である請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが前記ヌクレオチド反復に相補的であるが、前記ヌクレオチド反復とはずれている請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アニーリングしていないオリゴヌクレオチドが検出の後でエキソヌクレアーゼの使用によって除かれる工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アニーリングしていないオリゴヌクレオチドが検出の後でホスファターゼの使用によって不活性化される工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
核酸サンプルが担体に固定化される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アニーリングしていないオリゴヌクレオチドが検出の後で洗浄によって除かれる工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸サンプルが増幅される工程によって先行される請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ルシフェラーゼに基づくアッセイが光度測定法アッセイである請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ルシフェラーゼ反応で産生された光が、産生された光の初期レベルが達成された後、酵素的に停止される請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
光産生が、アピラーゼの添加によって停止される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分析されるべき領域の外側に相補的なオリゴヌクレオチドが、分析されるべき領域から得られるシグナルを正規化するために使用されることができるシグナルを、連結またはプライマー伸長によって生成するために使用される請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
別個のバイアルにおいて、リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項２７】
別個のバイアルにおいて、ルシフェラーゼ酵素をさらに含む請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
別個のバイアルにおいて、アピラーゼをさらに含む請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
以下の疾患群から選択される疾患に関連したヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。
【請求項３０】
以下の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【請求項３１】
リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む組成物。
【請求項３２】
ルシフェラーゼ酵素をさらに含む請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
以下の疾患群から選択される疾患に関連したヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項３１または３２に記載の組成物：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。
【請求項３４】
以下の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項３１または３２に記載の組成物：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【請求項１】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおける、ヌクレオチド反復または微生物型決定のためのマーカーの如き遺伝因子の存在を明らかにするための方法：
ａ）遺伝因子を含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記核酸サンプルの遺伝因子を含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、遺伝因子の存在の指標として検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項２】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記ヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結副生成物を、連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項３】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記ヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、前記ＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項４】
以下の工程を含む、核酸サンプルにおけるヌクレオチド反復の数を分析するための方法：
ａ）ヌクレオチド反復を含む可能性がある核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記ヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；
ｅ）連結副生成物をＡＴＰに変換する工程；および
ｆ）連結反応が起こっているかどうかの指標として、ルシフェラーゼに基づくアッセイによって前記ＡＴＰを検出する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｆ）は、同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項５】
以下の工程を含む、核酸サンプルの微生物型決定のための方法：
ａ）微生物型決定のための少なくとも１つのマーカーを含む核酸サンプルを提供する工程；
ｂ）前記核酸サンプルの微生物型決定のためのマーカーを含む領域に対して完全または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する工程；
ｃ）前記オリゴヌクレオチドを前記核酸サンプルにアニーリングさせる工程；
ｄ）前記核酸サンプルにアニーリングした前記オリゴヌクレオチドを、リガーゼ酵素を使用して互いに連結する工程；および
ｅ）連結反応が起こっているかどうかを明らかにするために、連結副生成物を検出する工程；
ｆ）微生物型を決定するために、サンプルの連結パターンを参照パターンと比較する工程；
ただし、工程ａ）〜工程ｅ）は同時に、または連続して、または任意の組合せの連続する工程で行われる。
【請求項６】
工程ｂ）におけるオリゴヌクレオチドの一つが、反復配列のすぐ外側でアニーリングするように適合されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
連結副生成物がＡＭＰである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）がＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼを使用して行われる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）がピルビン酸リン酸ジキナーゼを使用して行われる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）が、ＡＴＰ依存性リガーゼを用いて行われ、アピラーゼが、過剰量のＤＮＡリガーゼ基質を減少させるために、連結前に、または連結期間中に、または連結後に工程ｄ）の連結混合物に加えられる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＴＰ依存性リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｄＡＴＰが、工程ｄ）においてＡＴＰ依存性リガーゼに対する基質として使用される請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
連結副生成物がＰＰｉである請求項１〜６または１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｅ）がＡＴＰ−スルフリラーゼを使用して行われる請求項１〜６または１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
使用されたオリゴヌクレオチドが反復そのものの単量体、二量体または多量体である請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが前記ヌクレオチド反復に相補的であるが、前記ヌクレオチド反復とはずれている請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アニーリングしていないオリゴヌクレオチドが検出の後でエキソヌクレアーゼの使用によって除かれる工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アニーリングしていないオリゴヌクレオチドが検出の後でホスファターゼの使用によって不活性化される工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
核酸サンプルが担体に固定化される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アニーリングしていないオリゴヌクレオチドが検出の後で洗浄によって除かれる工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸サンプルが増幅される工程によって先行される請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ルシフェラーゼに基づくアッセイが光度測定法アッセイである請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ルシフェラーゼ反応で産生された光が、産生された光の初期レベルが達成された後、酵素的に停止される請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
光産生が、アピラーゼの添加によって停止される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分析されるべき領域の外側に相補的なオリゴヌクレオチドが、分析されるべき領域から得られるシグナルを正規化するために使用されることができるシグナルを、連結またはプライマー伸長によって生成するために使用される請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
別個のバイアルにおいて、リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項２７】
別個のバイアルにおいて、ルシフェラーゼ酵素をさらに含む請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
別個のバイアルにおいて、アピラーゼをさらに含む請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
以下の疾患群から選択される疾患に関連したヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。
【請求項３０】
以下の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【請求項３１】
リガーゼ酵素と、連結副生成物をＡＴＰに変換するための酵素とを含む組成物。
【請求項３２】
ルシフェラーゼ酵素をさらに含む請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
以下の疾患群から選択される疾患に関連したヌクレオチド反復に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項３１または３２に記載の組成物：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脆弱Ｘ症候群、脆弱部位ＦＲＡＸＥ、ハンチントン病、ケネディ病、マシャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、１型脊髄小脳運動失調、２型脊髄小脳運動失調、３型脊髄小脳運動失調、６型脊髄小脳運動失調、８型脊髄小脳運動失調および１２型脊髄小脳運動失調。
【請求項３４】
以下の群に由来する、微生物種の同定のための情報を提供する遺伝子領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド（必要な場合にはＡｄｏＰＰ５’修飾を有する）をさらに含む請求項３１または３２に記載の組成物：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｎｐＢおよびｇｒｏＥＬ、ミクロサテライト配列およびミニサテライト配列、ＶＮＴＲ、核リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）アレイ、すなわち、スモールサブユニット（ＳＳＵ）（１８Ｓ様）、ラージサブユニット（ＬＳＵ）（２３Ｓ、２６Ｓまたは２８Ｓ様）、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子、ならびに内部転写リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）スペーサー（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１３１０５（Ｐ２００９−５１３１０５Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８０７１（Ｐ２００６−５１８０７１）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７０９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３８６
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０４３７１５６１）バイオタージ アクチボラゲット (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７０９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３８６
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０４３７１５６１）バイオタージ アクチボラゲット (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]