放射性標識ガリウム錯体、その合成法並びに悪性腫瘍におけるＥＧＦＲ発現のＰＥＴイメージングにおける使用
マイクロ波活性化による放射性標識ガリウム錯体の標識合成法を提供する。得られたガリウム同位体標識化合物は、放射性医薬品として、特に陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）での使用に有用である。ＰＥＴを用いて腫瘍でのＥＧＦＲの過剰発現をイメージングする方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性標識ガリウム錯体及びその合成法に関する。本発明の放射性標識ガリウム錯体は、特に陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）用の放射性医薬品として有用である。これらは悪性腫瘍における上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現の検出に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ１及びＥｒｂＢ−１としても知られる上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、チロシンキナーゼ受容体ファミリーに属する膜貫通型タンパク質である。ＥＧＦＲの活性化は、細胞分裂、運動性の増加及びアポトーシスの抑制を導くシグナル伝達を惹起する（非特許文献１）。数多くの癌腫において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅又は転位置は、転写の増加とその後の高レベルのＥＧＦＲ発現を惹起する（非特許文献２、非特許文献３）。乳癌（非特許文献４、非特許文献５）、肺癌（非特許文献６）及び膀胱癌（非特許文献７）でＥＧＦＲの過剰発現が報告されている。高水準のＥＧＦＲ発現は、細胞の増殖及び転移の広がりが増し、アポトーシスが減少することによって悪性細胞の生存に好都合であるとも考えられる。現在のところ、ＥＧＦＲシグナル伝達の不活性化によって腫瘍成長を抑制する数多くの取組みが臨床で使用又は盛んに臨床試験されている。これらの取組みは、ＥＧＦＲの細胞外領域にリガンドが結合するのを抗ＥＧＦＲ抗体を用いて遮断するか、或いは選択的チロシンキナーゼ阻害剤で細胞内シグナル伝達を阻止するかのいずれかに基づくものである（非特許文献８）。
【０００３】
腫瘍におけるＥＧＦＲ発現の検出が予後値及び予測値として報告されている。ＥＧＦＲの過剰発現が、結腸癌（非特許文献９）、直腸癌（非特許文献１０）、非小細胞肺癌（非特許文献１１）及び乳癌（非特許文献５、非特許文献１２）での低い生存率及び再発と関連していることが報告されている。ＥＧＦＲの発現状態によって、術前化学療法及び放射線療法後の成果の乏しい進行上咽頭癌に属する患者のサブグループを確認できると示唆されている（非特許文献１３）。ＥＧＦＲの発現がヒト前立腺癌での疾患再発及びアンドロゲン非依存性への進行と関連することが明らかにされている（非特許文献１４）。実際の診療でのＥＧＦＲの検出がＥＧＦＲを標的とした薬物の使用の妥当性の問題を始めとする患者管理に影響する可能性があることは明らかである。
【０００４】
ＥＧＦＲの検出は、外科試料又は穿刺生検試料で免疫組織化学的検査又はＦＩＳＨ法を用いて可能である。しかし、核医学画像化は、原発腫瘍及び腫瘍転移を全体的に評価でき、サンプリングエラー及びＥＧＦＲ発現の不均一性に付随する偽陰性の結果を避けることができるという利点があると考えられる。
【０００５】
インジウム−１１１標識抗ＥＧＦＲ抗体４２５が、悪性神経膠腫の検出に成功裡に用いられている（非特許文献１５）。Ｔｃ−９９ｍ−標識抗ＥＧＦＲヒト化抗体ｈＲ３及びＣ２２５は臨床評価の段階にある（非特許文献１６、非特許文献１７）。ただし、嵩高い抗体タンパク質の使用は、健常組織を通しての腫瘍への放射性コンジュゲートの拡散が難しくなるおそれがある。抗ＥＧＦＲ抗体に代わるものとして、腫瘍細胞に放射性核種を送達するためのターゲティングベクターとして天然リガンドである上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いることが考えられる（非特許文献１７）。ＥＧＦは分子量（６．２ｋＤａ）が小さいので、腫瘍への速い浸透及び速い血液クリアランスが可能となり、良好なコントラストの画像を得ることができると考えられる。従前、１３１Ｉ−標識ＥＧＦが肺癌の画像化に成功裡に用いられている（非特許文献１８）。しかし、放射性ハロゲンは細胞保持が不十分なため、腫瘍での蓄積が減少し、画像コントラストも最適とはいいがたいので、ＥＧＦの標識には放射性金属を使用した方がよい選択となり得る（非特許文献１９）。ＥＧＦに対して様々な単一光子放射性金属標識が提案されている。モノアミドＤＴＰＡ（非特許文献１９、非特許文献２０）又はイソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡ（非特許文献２１）を用いてＥＧＦに１１１Ｉｎ（Ｔ１／２＝２，８ｄ）が結合されている。ジェネレータ生成９９ｍＴｃ（Ｔ１／２＝６ｈ）によるＥＧＦの標識にＭＡＧ３（非特許文献２２）、導入ＳＨ基（非特許文献２３）又はＨＹＮＩＣ（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ、未発表データ）が利用されている。しかし、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）の方が、ＳＰＥＣＴと比較して、感度、解像度及び数量化の点で優れた検出技術であるので、ＥＧＦに陽電子放射標識を使用した方が有利であるとも考えられる（非特許文献２４、非特許文献２５）。
【０００６】
ＰＥＴイメージングは、陽電子を放出する放射性トレーサー分子を用いた核断層撮影技術である。陽電子が電子と遭遇すると、それらは消滅してガンマ線としてエネルギーを放出し、これをＰＥＴスキャナーで検出する。トレーサー分子として体内で用いられる天然物質を使用すると、ＰＥＴは体内の構造に関する情報を与えるだけでなく体又は体内の特定領域の生理的機能に関する情報も与える。一般的なトレーサー分子は例えば天然のグルコースと類似した２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（ＦＤＧ）に１８Ｆ原子を付加したものである。陽電子放出フッ素から発生するガンマ線はＰＥＴスキャナーで検出され、体の特定領域又は組織（例えば脳又は心臓）におけるＦＤＧの代謝を示す。トレーサー分子の選択は、何をスキャンすべきかによって左右される。一般に、トレーサーは重要な領域に蓄積又はある種の組織（例えば癌細胞）に選択的に取り込まれるものが選択される。スキャニングは、放射性トレーサー分子が問題とする生化学過程に入る時間間隔後に得られた一連の動的又は静止画像のいずれかからなる。スキャナーはトレーサー分子の空間的及び時間的分布を検出する。ＰＥＴは、放射性トレーサー分子の局所濃度を測定できる定量的イメージング法でもある。
【０００７】
ＰＥＴトレーサーに常用される放射性核種は、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、１３Ｎ又は７６Ｂｒである。近年、二官能性キレート剤と放射性金属とを含む放射性標識金属錯体に基づく新たなＰＥＴトレーサーが製造されている。二官能性キレート剤は金属イオンに配位しているとともに、患者体内の標的部位に結合するターゲティングベクターと連結したキレート剤である。かかるターゲティングベクターとしては、ある種の受容体、大抵は体内の特定の領域又は疾患に関連した受容体と結合するペプチドがある。ターゲティングベクターは、例えば活性化した腫瘍遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドで、腫瘍の位置特定のためのオリゴヌクレオチドであってもよい。かかる錯体の利点は、例えば６８Ｇａ、２１３Ｂｉ又は８６Ｙなどの様々な放射性金属で二官能性キレート剤を標識できることである。こうして、特殊な特性をもつ放射性標識錯体を特定の用途のために「仕立てる」ことができる。
【０００８】
６８Ｇａは、ＰＥＴイメージングでトレーサー分子として用いられるＧａ−放射性標識金属錯体の製造に特に重要である。６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから得られ、サイクロトロンを一切必要としない。６８Ｇａは２．９２ＭｅＶの陽電子放出によって８９％まで崩壊し、その半減期６８分は、不必要な放射線なしでインビボでの数多くの生化学過程を追跡するのに十分である。６８Ｇａはその＋ＩＩＩの酸化状態で各種のキレート剤と安定な錯体を形成し、６８Ｇａトレーサーは脳、腎臓、骨組織、血液プール、肺及び腫瘍のイメージングに用いられている。
【０００９】
この核種の短い半減期はＥＧＦの速い血液クリアランスに適合する。ＤＯＴＡ又はＮＯＴＡのような大環状キレート剤の誘導体の使用によって、ソマトスタチンの類似体及びオリゴヌクレオチドの安定ガリウム標識が得られている（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１）。非環状キレート剤での初期の実験から、それらをＥＧＦに結合しても、その受容体に対するＥＧＦ結合親和性が低減しないことが明らかにされている。こうした理由から、ＥＧＦへのＤＯＴＡのカップリングがガリウムでの標識に適した方法を与えるかもしれない。しかし、先行技術には、これらの科学的知見を腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージングにどのように用いるかについてなんら示唆又は教示されていない。
【００１０】
そこで、医学界では、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出するための非侵襲性ＰＥＴトレーサーが長い間待望されていた。かかるトレーサーは、高感度でのインビボ非侵襲性ＰＥＴ法の開発に極めて有用であろう。多くの癌腫でのＥＧＦＲの過剰発現の検出は重要な診断情報を与え、患者管理に影響を及ぼす可能性がある。従って、ＥＧＦＲの天然リガンドに基づく陽電子放出トレーサーの製造方法、ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）及び腫瘍でのＥＧＦＲ過剰発現のイメージングにおけるトレーサーの使用法を提供することが望ましい。
【００１１】
本明細書における文献についての説明又は引用は、これらの文献が本発明の先行技術であることを是認するもの解釈すべきではない。
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、放射性標識ガリウム錯体の標識合成法であって、
（ａ）６８Ｇａ３＋放射性同位体を用意し、
（ｂ）６８Ｇａ３＋放射性同位体をマイクロ波活性化を用いてキレート剤と反応させ、
（ｃ）得られた放射性標識ガリウム錯体を回収すること
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらにＰＥＴトレーサーとしての放射性標識ガリウム錯体を提供する。本発明に係る好ましいトレーサーは６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦである。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、また、放射性標識ガリウム錯体をヒトに投与することを含んでなる、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージング法であって、上記放射性標識ガリウム錯体が陽電子放射断層撮影でイメージングできるものであり、陽電子放射断層撮影を行って腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、６８Ｇａを得るのに使用できるキット及び６８Ｇａ−放射性標識錯体の製造に使用できるキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の目的の一つは、放射性医薬品として、特にＰＥＴでの使用に有用な放射性標識ガリウム錯体の合成法を提供することである。これらは、悪性腫瘍における上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現の検出に特に有用である。これは、本明細書に記載の方法で達成される。
【００１６】
６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから得られる。かかるジェネレータは当技術分野で公知であり、例えばC. Loc'h et al, J. Nucl. Med. 21, 1980, 171-173又はJ. Schuhmacher et al. Int. J. appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36を参照されたい。６８Ｇｅは、例えば２０ＭｅＶプロトンでのＧｅ２（ＳＯ４）３の照射によってサイクロトロン生産で得ることもできる。また、例えば０．５ＭのＨＣｌ中の６８Ｇｅとしても市販されている。一般に、有機樹脂或いは二酸化スズ、二酸化アルミニウム又は二酸化チタンのような無機金属酸化物からなるカラムに６８Ｇｅをローディングする。ＨＣｌ水溶液によってカラムから６８Ｇａが溶出し、６８ＧａＣｌ３が得られる。６８Ｇａ３＋はその製造にサイクロトロンが不要で、その半減期６８分は、長時間放射せずにＰＥＴイメージング法での多くのインビボ生化学過程の追跡に十分であるので本発明の方法で特に好ましい。
【００１７】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータに適したカラムは、二酸化アルミニウム、二酸化チタン又は二酸化スズのような無機酸化物、或いはフェノール性水酸基（米国特許第４２６４４６８号）又はピロガロール（J. Schuhmacher et al., Int. J. appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36）を含む樹脂のような有機樹脂からなる。好ましい実施形態では、二酸化チタンを含むカラムを備える６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータを本発明の方法に用いる。
【００１８】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータカラムからの６８Ｇａの溶出に用いられるＨＣｌ水溶液の濃度はカラム材料によって左右される。６８Ｇａの溶出には、０．０５〜５ＭのＨＣｌが好適に使用される。好ましい実施形態では、溶出液は、二酸化チタンを含むカラムを備える６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから得られ、６８Ｇａは０．０５〜０．１ＭのＨＣｌ、好ましくは約０．１ＭのＨＣｌを用いて溶出される。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、対イオンとしてＨＣＯ３−を含む強い陰イオン交換体、好ましくは対イオンとしてＨＣＯ３−を含む強い陰イオン交換体を用いる。別の好ましい実施形態では、陰イオン交換体は第四級アミン官能基を含む。さらに別の好ましい実施形態では、陰イオン交換体はポリスチレン−ジビニルベンゼン系の強い陰イオン交換樹脂である。特に好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される陰イオン交換体は、対イオンとしてのＨＣＯ３−、第四級アミン基を含む強い陰イオン交換樹脂であり、樹脂はポリスチレン−ジビニルベンゼン系である。
【００２０】
好適には、本発明の方法では、陰イオン交換体からの６８Ｇａの溶出には水を用いる。
【００２１】
本発明の方法で得られる６８Ｇａは、好ましくは６８Ｇａ−放射性標識錯体の製造、好ましくは二官能性キレート剤（ターゲティングベクターと結合したキレート剤）を含む６８Ｇａ−放射性標識ＰＥＴトレーサーの製造に用いられる。
【００２２】
そこで、本発明の別の態様は、
ａ）６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータからの溶出液を対イオンとしてＨＣＯ３−を含む陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換体から６８Ｇａ３＋を溶出して６８Ｇａを得て、
ｂ）６８Ｇａをキレート剤と反応させる
ことによって６８Ｇａ−放射性標識錯体を製造する方法である。
【００２３】
本発明の方法での使用に好ましいキレート剤は、生理学的に認容性の形態の６８Ｇａを与えるものである。さらに好ましいキレート剤は、放射性標識錯体を用いた診断検査に要する時間安定な６８Ｇａ錯体を形成するものである。
【００２４】
適当なキレート剤は、例えばＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＡ３、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＨＰ−ＤＯＡ３、ＴＭＴ又はＤＰＤＰのようなポリアミノポリ酸キレート剤である。これらのキレート剤は放射性医薬品及び放射線診断として周知である。これらの使用法及び合成は、例えば、米国特許第４６４７４４７号、同第５３６２４７５号、同第５５３４２４１号、同第５３５８７０４号、同第５１９８２０８号、同第４９６３３４４号、欧州特許出願公開第２３０８９３号、同第１３０９３４号、同第６０６６８３号、同第４３８２０６号、同第４３４３４５号、国際公開第９７／０００８７号、同第９６／４０２７４号、同第９６／３０３７７号、同第９６／２８４２０号、同第９６／１６６７８号、同第９６／１１０２３号、同第９５／３２７４１号、同第９５／２７７０５号、同第９５／２６７５４号、同第９５／２８９６７号、同第９５／２８３９２号、同第９５／２４２２５号、同第９５／１７９２０号、同第９５／１５３１９号、同第９５／０９８４８号、同第９４／２７６４４号、同第９４／２２３６８号、同第９４／０８６２４号、同第９３／１６３７５号、同第９３／０６８６８号、同第９２／１１２３２号、同第９２／０９８８４号、同第９２／０８７０７号、同第９１／１５４６７号、同第９１／１０６６９号、同第９１／１０６４５号、同第９１／０７１９１号、同第９１／０５７６２号、同第９０／１２０５０号、同第９０／０３８０４号、同第８９／０００５２号、同第８９／００５５７号、同第８８／０１１７８号、同第８６／０２８４１号及び同第８６／０２００５号に記載されている。
【００２５】
適当なキレート剤としては、大環状キレート剤、例えばZhang et al., Inorg. Chem. 37(5), 1998, 956-963に記載のポルフィリン様分子及びペンタアザ大環状化合物、フタロシアニン、クラウンエーテル、例えばセパルクレート及びクリプテートのような窒素クラウンエーテル、ヘミン（プロトポルフィリンＩＸクロリド）、ヘム及び平面正方形の対称性を有するキレート剤が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法では大環状キレート剤が好ましく使用される。好ましい実施形態では、これらの大環状キレート剤は、ポリアザ−及びポリオキソ大環状化合物のように酸素及び／又は窒素などの１以上の硬いドナー原子を含む。ポリアザ大環状キレート剤の好ましい例としては、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ及びＨＥＴＡが挙げられ、ＤＯＴＡが特に好ましい。
【００２７】
特に好ましい大環状キレート剤は、カルボキシル基又はアミン基のようにＧａ３＋への配位には必須ではなく、ターゲティングベクターのような他の分子とキレート剤とのカップリングに使用できる官能基を含む。かかる官能基を含む大環状キレート剤の例は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ又はＨＥＴＡである。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、二官能性キレート剤を本発明の方法で用いる。本発明に関して「二官能性キレート剤」とは、ターゲティングベクターと連結したキレート剤を意味する。本発明の方法で有用な二官能性キレート剤に適したターゲティングベクターは、ターゲティングベクターを含む６８Ｇａ放射性標識錯体を患者に投与したとき患者の体内の標的部位に結合する化学又は生物学的部分である。本発明の方法で有用な二官能性キレート剤に好ましいターゲティングベクターは、ＥＧＦＲに対する天然リガンドである上皮増殖因子（ＥＧＦ）又はそれらの一部、断片、誘導体もしくは錯体である。ＥＧＦは分子量（６．２ｋＤａ）が小さいので、腫瘍への速い浸透及び速い血液クリアランスが可能となり、良好なコントラストの画像を与える。ＥＧＦ用の陽電子放射標識の使用は、ＰＥＴがＳＰＥＣＴに比べて感度、解像度及び数量化の点で優れた検出技術であるので特に有利である。特に好ましいターゲティングベクターは、ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）又はその一部、断片、誘導体もしくは錯体である。
【００２９】
特に好ましい実施形態では、大環状二官能性キレート剤を本発明の方法で使用する。好ましい大環状二官能性キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ又はＨＥＴＡをターゲティングベクター、好ましくはＥＧＦ又はその一部、断片、誘導体もしくは錯体、特に好ましくはｈＥＧＦ又はその一部、断片、誘導体若しく錯体に連結したものからなる。
【００３０】
ターゲティングベクターは、リンカー基又はスペーサー分子を介してキレート剤に結合させることができる。リンカー基の例は、ジスルフィド、エステル又はアミドであり、スペーサー分子の例は、鎖状分子、例えばリシン又はヘキシルアミン或いは短鎖ペプチド系スペーサーである。好ましい実施形態では、ターゲティングベクターと放射性標識ガリウム錯体のキレート剤との結合は、ターゲティングベクターが、放射性標識ガリウム錯体の存在によって阻害も妨害もされずに、体内の標的と相互作用できるものである。
【００３１】
本発明の好ましい一態様は、
ｃ）６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータからの溶出液を、ＨＣＯ３−を対イオンとして含む陰イオン交換体と接触させて、陰イオン交換体から６８Ｇａを溶出することによって６８Ｇａを得て、
ｄ）６８Ｇａをマイクロ波活性化を用いてキレート剤と反応させる
ことによって６８Ｇａ−放射性標識錯体を製造する方法である。
【００３２】
マイクロ波活性化の使用によって、６８Ｇａ−キレート剤錯体形成の効率及び再現性が大幅に向上することが判明した。マイクロ波活性化によって、化学反応時間を大幅に短縮することができ、反応は２分以内に完了する。反応時間を１０分短縮できれば、約１０％の６８Ｇａ活性が助かるので、明らかな改善である。さらに、マイクロ波活性化は副反応の低減及び選択性の増加による放射化学的収率の向上ももたらす。
【００３３】
好適には、マイクロ波活性化の実施にはマイクロ波オーブン、好ましくは単一モードマイクロ波オーブンを用いる。マイクロ波活性化は、好適には８０〜１２０Ｗ、好ましくは９０〜１１０Ｗ、特に好ましくは約１００Ｗで実施される。好適なマイクロ波活性化時間は２０秒〜２分、好ましくは３０秒〜９０秒、特に好ましくは４５秒〜６０秒である。
【００３４】
本発明の方法で例えばペプチド又はタンパク質をターゲティングベクターとして含む二官能性キレート剤のような温度感受性のキレート剤を用いるときは反応の温度制御が推奨される。マイクロ波活性化の期間は、反応混合物の温度がキレート剤及び／又はターゲティングベクターの分解を生じないように調節すべきである。本発明の方法で用いるキレート剤がペプチド又はタンパク質を含む場合、高い温度を短時間加える方が低い温度を長時間加えるよりも概して有利である。
【００３５】
マイクロ波活性化は連続的に或いは反応の過程で幾つかのマイクロ波活性化周期で実施できる。
【００３６】
本発明の別の態様は、６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから６８Ｇａを得るためのキットであって、ジェネレータカラムとＨＣＯ３−を対イオンとして含む陰イオン交換体からなる第の二カラムとを備えるキットである。
【００３７】
好ましい実施形態では、キットは、複数のカラムを直列に接続する手段及び／又は６８Ｇａをジェネレータカラムから溶出するためのＨＣｌ水溶液及び／又は６８Ｇａを陰イオン交換カラムから溶出するための水をさらに備える。ＨＣｌ及び水は好ましくは無菌であり、密封容器に収容されている。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るキットは、キレート剤、好ましくは二官能性キレート剤つまりターゲティングベクターに結合したキレート剤をさらに含む。
【００３９】
本発明は、ＰＥＴトレーサーとしての放射性標識ガリウム錯体をさらに提供する。本発明に係る好ましいトレーサーは６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦである。
【００４０】
さらに別の実施形態では、本発明は、放射性標識ガリウム錯体をヒトに投与することを含んでなる、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージング法であって、上記放射性標識ガリウム錯体が陽電子放射断層撮影でイメージングできるものであり、陽電子放射断層撮影法を行って腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出する方法も提供する。
【実施例】
【００４１】
以下の実施例で本発明をさらに例証するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１−６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ調製の化学及び放射化学
Ｉ．材料
組換えヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社（米国カリフォルニア州テメキュラ）から購入した。酢酸ナトリウム（９９．９９５％）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、再蒸留塩酸（Ｒｅｉｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ社製）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ（スウェーデン国ストックホルム）から入手した。リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ国ダルムシュタット）から入手した。ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）のスルホ−ＮＨＳエステルは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社（米国テキサス州ダラス）から購入した。購入した化学物質はそれ以上精製せずに使用した。すべての反応で、Ｅｌｇａ社製Ｐｕｒｅｌａｂ Ｍａｘｉｍａ系（英国バッキンガムシャー）で製造した脱イオン水（１８．２ＭΩ）を使用した。６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｃ．、ロシア国オブニンスク）から入手した。
【００４３】
ＩＩ．ＨＰＬＣ分析
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析は、１２６ポンプ、１６６ＵＶ検出器及び放射線検出器を直列に連結したＢｅｃｋｍａｎ社（米国カリフォルニア州フラートン）製のＨＰＬＣシステムを用いて行った。データの取得及び操作はＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｎｏｕｖｅａｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙソフトウェアパッケージを用いて行った。使用したカラムは、寸法１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径５μｍのＶｙｄａｃ ＲＰ ３００Å ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ社、米国）である。用いた勾配溶出は以下のパラメーターであった：Ａ＝１０ｍＭのＴＦＡ、Ｂ＝７０％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、３０％Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＴＦＡで２２０ｎｍでのＵＶ検出、流速は１．２ｍＬ／分、２０％Ｂの均一濃度で０〜２分、２０〜９０％Ｂの直線濃度勾配８分、９０〜２０％Ｂの直線濃度勾配２分。カラムに保持された６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ及び放射性不純物の量は、カラムに注入した試料及び出口から回収した画分の活性を結晶シンチレーションカウンターで測定することによって得ることができた。システムでの全損失は１０％であった。６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ及び親水性放射性不純物の画分の測定放射能はＨＰＬＣクロマトグラムから得られたそれぞれの値と一致した。対応する相対標準偏差は親水性放射性不純物及び６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦについてそれぞれ７％及び０．５％であった。
【００４４】
ＩＩＩ．６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦの調製
０．０８Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．４）中のｈＥＧＦ（３２〜７０ナノモル、８０〜１８０μＬ）を攪拌しながら乾燥ＤＯＴＡのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（１０〜２０倍過剰）に加え、ホウ酸緩衝液（２４０〜３４０μＬ）を加えてｐＨを９．０に調整した。混合物を室温で３〜４時間又は一晩放置した。コンジュゲートをＢｉｏ−ｓｅｌｅｃｔ ＲＰ Ｃ１８ Ｃ−１８ ＳＰＥカラム（Ｖｙｄａｃ社製）で精製した。反応混合物を抽出ディスクにゆっくりと流し、次いで２ｍＬの０．１％ＴＦＡで洗浄した。生成物は、０．１％のＴＦＡを含む１ｍＬの７０％アセトニトリルで溶出した。溶媒を、５０℃で作動させた真空遠心分離機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ社（米国ミズーリ州カンザスシティ）製ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｓｏｌｅ）を用いて蒸発させ、乾燥精製標品を０℃未満の温度で保存した。
【００４５】
コンジュゲートの標識は、先行技術に記載の通り（Velikyan I, Beyer GJ, Langstrom B. Microwave-supported preparation of (68)Ga bioconjugates with high specific radioactivity. Bioconjug Chem. 2004; 15(3): 554-560）、未濃縮６８Ｇａ−溶出液又は予備濃縮した溶出液のいずれかを用いて行った。場合によっては、標識反応に用いる６８Ｇａの量を増すため、２つのジェネレータからの溶出液を予備濃縮した。標識反応に使用したＤＯＴＡ−ｈＥＧＦの量は、未濃縮及び予備濃縮した６８Ｇａ−溶出液を使用するときそれぞれ６〜１０及び２〜５ナノモルであった。未濃縮６８Ｇａでの標識には酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５）を使用し、予備濃縮した溶出液ではＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ４．６〜４．８）を使用した。標識は１分間のマイクロ波加熱で実施した。生成物は、上述のＢｉｏ−ｓｅｌｅｃｔ ＲＰ Ｃ１８ Ｃ−１８ ＳＰＥカラムで精製した。次いで溶媒をＮＡＰ−５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（スウェーデン国ウプサラ）製）でＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液に交換した。コンジュゲートの純度はＨＰＬＣで調べ、コンジュゲート及びトレーサーの濃度はＵＶ−ＨＰＬＣ較正曲線から求めた。
【００４６】
ｈＥＧＦへの６８Ｇａの結合がＤＯＴＡで媒介されることを検証するため、ブランク試験を行った。操作は上記と同じであるが、非連結ｈＥＧＦを使用した。
【００４７】
６９，７１Ｇａの天然同位体組成物を同じ手順を用いてＤＯＴＡ−ｈＥＧＦと錯体化した。放射性ＨＰＬＣクロマトグラムシグナルの同定には、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで特性決定した６９，７１Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦを用いた。
【００４８】
ＩＶ．マイクロ波加熱及びＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析
マイクロ波加熱は、２４５０ＭＨｚでの連続照射を発生するＳｍｉｔｈＣｒｅａｔｏｒ（商標）単一モード空洞共振器（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社（スウェーデン国ウプサラ）製）で実施した。反応の間、温度、圧力及び照射出力をモニターした。照射完了後、反応バイアルを加圧空気で冷却した。
【００４９】
Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社（英国）製）及びフォトダイオードアレーＵＶ検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ社製（Ｗａｔｅｒｓ ２６９、英国）ＨＰＬＣシステムを用いてエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。使用したカラムは、寸法１００ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径３μｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ １８ ＲＰ ＨＰＬＣカラムである。均一濃度溶出を以下のパラメーターで用いた。Ａ＝１０ｍＭギ酸、Ｂ＝１００％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり、２１０〜４００ｎｍでのＵＶ検出、流速０．３ｍＬ／分。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、ポジティブモードスキャン及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋、［Ｍ＋７Ｈ］７＋及び［Ｍ＋８Ｈ］８＋種を検出する選択イオン記録（ＳＩＲ）で実施した。ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝７８１．５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝８９３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１０４２で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝６２４４．６７±１．１５となる。（ＤＯＴＡ）１−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８２９．７５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝９４８．１３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１０５で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝６６２９．９５±０．０５となる。（ＤＯＴＡ）２−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８７８、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１１０３．３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１７０．３６で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７０１６±０．０８となる。（ＤＯＴＡ）３−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝９２６．２９、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１０５８．４７及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１２３４．７２で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７４０２±０．１となる。（Ｇａ−ＤＯＴＡ）１−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８３８．５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝９５８．１３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１１７．６６で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝６６９９．９５±０．０５となる。（Ｇａ−ＤＯＴＡ）２−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８９６．０５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１０２３．３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１９３．６９で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７１５７．５５±２．４７となる。（Ｇａ−ＤＯＴＡ）３−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝９５２．５４、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１０８８．４７及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１２６９．７２で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７６１２．３１±０．０５となる。
【００５０】
Ｖ．結果
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦは、まずｈＥＧＦを二官能性キレート剤ＤＯＴＡに連結し、次いでキレート剤と６８Ｇａとの錯形成反応による６８Ｇａでの標識との二段階法で合成した。連結段階においてＤＯＴＡキレートのカルボキシル基の１つがペプチドのアミン官能価とカップリングしてアミド結合を形成する（スキーム１）。連結反応に必要な塩基性ｐＨはホウ酸緩衝液で与えた。ｈＥＧＦは、１残基の末端リシンと２残基のリシンアミノ基を含有する。したがって、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析で判明したように、ｈＥＧＦの連結反応で、ＤＯＴＡ断片を１、２及び３個有する分子の混合物が形成される。
【００５１】
コンジュゲートのマイクロ波促進標識（スキーム１）を、未濃縮又は予備濃縮ジェネレータ６８Ｇａ溶出液を用いて実施した。未濃縮コンジュゲートの場合、標識収率は６０±１０％（Ｎ＝３）であった。予備濃縮したものを用いると、７７±４％（Ｎ＝３）に増加させることができた。溶出液を予備濃縮すると２８ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比放射能を得ることができた。非連結ｈＥＧＦを同じように処理しても標識ペプチドは得られなかったので、ｈＥＧＦへの６８Ｇａの結合はＤＯＴＡで媒介される。この研究におけるトレーサーの放射化学純度は９９％超であった。このトレーサーはＰＢＳ中で安定であり、４時間の安定性アッセイでそれ以上の放射性ＨＰＬＣ信号を生じなかった。
【００５２】
【化１】
実施例２−細胞結合及び保持実験
Ｉ．細胞培養
ヒト扁平上皮癌細胞系Ａ４３１（ＡＴＣＣ、ＣＬＲ １５５５、米国メリーランド州ロックビル）及び悪性神経膠腫細胞系Ｕ３４３ＭＧａＣ１２：６（Westermark B, Magnusson A, Heldin CH. Effect of epidermal growth factor on membrane motility and cell locomotion in cultures of human clonal glioma cells. J Neurosci Res. 1982; 8(2-3): 491-507）（以下、「Ｕ３４３」という）をすべての細胞実験で使用した。Ａ４３１細胞系は１細胞当り約２×１０６個のＥＧＦＲを発現し、Ｕ３４３細胞系は１細胞当り約５．５×１０５個のＥＧＦＲを発現すると報告されている。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）及びＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）（いずれもＢｉｏｃｈｒｏｍ社製）を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）で培養した。細胞培養及び細胞実験の際の細胞は（特記しない限り）、５％ＣＯ２で平衡化した加湿空気を入れたインキュベーター中３７℃で増殖させた。細胞はＢｉｏｃｈｒｏｍ社製のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｃａ及びＭｇを含まないＰＢＳ中、０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）でトリプシン処理した。
【００５３】
ＩＩ．細胞への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合
Ａ４３１及びＵ３４３細胞は３ｃｍシャーレ中で培養した（それぞれ１シャーレ当りの細胞数３．５×１０５及び１．９×１０５）。細胞を１回洗浄した後、細胞培養液中の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ（Ａ４３１細胞では３５ｎｇ／シャーレ、５０ｋＢｑ／シャーレ、Ｕ３４３細胞では５ｎｇ／シャーレ、２０ｋＢｑ／シャーレ）を添加した。添加したトレーサーの濃度は、Ａ４３１細胞では０．２６〜１６．９ｎＭ、Ｕ３４３細胞では０．１４〜３６ｎＭであった。幾つかのシャーレには、モル過剰のＥＧＦ（５又は３μｇ／シャーレ）を標識コンジュゲートと共に添加して６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦコンジュゲートの結合特異性を調べた。３７℃で０．５〜６時間のインキュベートした後、細胞を血清不含非放射性培地で６回洗浄し、次いで０．５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（３７℃、１５分）を用いて細胞を回収した。１ｍｌの細胞培養液の添加によってトリプシン処理を終了し、細胞懸濁液の一部（０．５ｍｌ）を細胞計数に使用し、残りはガンマカウンターで測定した。
【００５４】
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦコンジュゲートの細胞内部移行を調べるため、結合実験の際に多数の追加の細胞シャーレを用いて、コンジュゲートの膜結合画分を内部移行放射能から分離した。コンジュゲートの膜結合画分の抽出には、細胞のトリプシン処理に代えて、０．５ｍｌの氷冷０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）での０℃で６分間の処理を用いた。追加の０．５ｍｌのグリシン−ＨＣｌ緩衝液を用いて細胞を１回洗浄した。内部移行放射能と考えられる残りの放射能は、３７℃で０．５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ溶液で約６０分間処理することによって回収した。別途０．５ｍｌのＮａＯＨ溶液を洗浄に用いた。回収画分は自動ガンマカウンターで測定した。
【００５５】
飽和実験で結合に要する時間を求めるため、氷上でのＡ４３１細胞及びＵ３４３細胞への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合も調べた。氷上に載せた細胞シャーレを氷冷６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ溶液と共に０．５〜４時間インキュベートした。次いで細胞を上述の通り洗浄し、トリプシン処理し、カウントした。
【００５６】
ＩＩＩ．放射能の細胞保持、飽和アッセイ及び動物腫瘍モデル
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦで１時間インキュベートした後、放射能の細胞保持を調べた。インキュベーション後、細胞を十分に洗浄して未結合コンジュゲートを除去し、次いで新鮮な細胞培養液中でインキュベーションを続けた。０．５〜４時間後、細胞を上述の通りトリプシン処理し、計数し、放射能測定した。
【００５７】
Ａ４３１細胞及びＵ３４３細胞での６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦによる飽和実験から解離平衡定数Ｋｄを求めた。２４ウェルシャーレで培養した細胞（１ウェル当り約３．１×１０４個のＡ４３１細胞及び１ウェル当り約７．８×１０４個のＵ３４３細胞）を氷上に載せ、様々な濃度の氷冷６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ溶液（Ａ４３１では０．２６〜１６．９ｎＭ、Ｕ３４３では０．１４〜３６ｎＭ）を添加した。各濃度について、１００倍過剰の非標識ＥＧＦを幾つかのウェルに添加して非特異的なバックグラウンド結合を調べた。２時間インキュベートした後（この時間は氷上での取込み実験の結果から決定した。）、細胞を血清不含非放射性培地で６回洗浄した。細胞を次で０．５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し（３７℃で１５分間）、細胞数を計数するとともにガンマカウンターで放射能測定した。
【００５８】
腫瘍を異種移植した成熟雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（２１〜２５ｇ）（Ｍｏｌｌｅｇａｒｄ、デンマーク）でインビボ実験を実施した。動物はすべてスウェーデン動物愛護協会の指針に準拠して取り扱い、実験は当地の動物実験に関する倫理委員会によって承認された。マウスの両前肢にＡ４３１腫瘍細胞（１００μｌの細胞培養液中の腫瘍当り約７百万個の細胞）を皮下注射した。腫瘍を１２〜１３日間増殖させてから実験を行ったが、そのときの重量は０．１〜０．８ｇに達していた。
【００５９】
ＩＶ．結果
インビトロでのＥＧＦＲ発現細胞系への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合特異性を図１に示す。細胞実験では、ＥＧＦＲの発現が報告されている子宮頚癌Ａ４３１及び神経膠腫Ｕ３４３細胞系を使用した。結合が受容体特異性であることを実証するため、対照実験では大量の非標識ＥＧＦを細胞に添加してＥＧＦＲを飽和させた。結合特異性実験の結果は、すべての試験データポイントで両細胞系への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合が受容体の飽和によって阻止されることを示していた。これは標識コンジュゲートの結合が受容体特異的であることを示している。
【００６０】
子宮頚癌Ａ４３１及び神経膠腫Ｕ３４３細胞系での６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦによる飽和実験の結果を、それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。ａｍｏｌ／細胞で示す特異的結合を、添加した放射性標識コンジュゲートの合計モル濃度に対してプロットし、結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形回帰分析で解析した。いずれの曲線も最大値に達し、飽和したことを示している。得られたＫｄ値はＡ４３１では２．０ｎＭ、Ｕ３４３では２．３ｎＭであり、よく一致していた。Ｕ３４３での細胞当りの結合部位の最大数７．８×１０５という値は、［１１１Ｉｎ］−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ＥＧＦコンジュゲートで従前報告されている５．４×１０５という値（２２）とまずまず一致している。Ａ４３１での細胞当り１９０万という結合部位の数も、文献記載のデータとよく一致している。
【００６１】
この実験では、内部移行の程度を酸洗浄によって評価した。放射能のうち、酸性緩衝液で細胞から除かれるものは膜結合型と考えられ、残りは内部移行したものと考えられる。かかる実験の結果を図３に示すが、この図から、いずれの細胞系でも６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの内部移行が迅速なプロセスであることが分かる。ただし、これらの実験の結果は、内部移行の速度がＡ４３１に比べて神経膠腫Ｕ３４３細胞で速かったことを示している。これは、内部移行した受容体を細胞表面に再循環できるというＡ４３１細胞について報告された能力によるものかもしれない。神経膠腫Ｕ３４３細胞の場合には、インキュベーションを開始してから３０分で５０％を超える放射能が内部移行した。
【００６２】
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦでのインキュベーションを中断した後の放射能の保持パターンはＡ４３１及びＵ３４３細胞いずれの細胞系でも同様であった（図４）。最初に放射能が降下するが（膜結合コンジュゲートの解離による可能性が最も高い。）、その後は細胞結合６８Ｇａの量は比較的一定である。いずれの細胞系も良好な保持性を示し、インキュベーション中断後、標識の半減期の３倍を越える４時間の間、７０％を超える放射能が依然として細胞に結合していた。
【００６３】
実施例３−体内分布実験
Ｉ．Ａ４３１腫瘍を異種移植したマウスにおける体内分布
コンジュゲート注入量が腫瘍及び健常組織への取り込みに与える影響を調べるため、体内分布実験を行った。Ａ４３１腫瘍を異種移植したマウスに、５０μｌの６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ溶液（１匹当りＰＢＳ中０．１６ｎｍｏｌ又は０．０１６ｎｍｏｌ）を静脈内注射し、３０分後にマウスを屠殺して解剖した。マウスは、Ｒｏｍｐｕｎ（１ｍｇ／ｍｌ）とＫｅｔａｌａｒ（１０ｍｇ／ｍｌ）の混合物をマウス体重１０ｇ当り０．２ｍｌ腹腔内投与して麻酔し、心臓穿刺によって屠殺した。腫瘍の他に、血液、心臓、膵臓、脾臓、胃、肝臓、腎臓、肺、小腸及び大腸、筋肉、骨並びに唾液腺を回収して秤量し、自動ガンマカウンターで測定した。注射の正確さを判定するため、尾部についても放射能含量を測定した。臓器の値は、臓器１ｇ当りの注射した放射能の百分率（％ＩＡ／ｇ）として計算した。
【００６４】
ＩＩ．結果
Ａ４３１担癌マウスにおける６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの体内分布データの概要を図５に示す。６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの静脈内投与３０分後の臓器放射能の計測は、いずれのコンジュゲートについても腎臓及び肝臓で最も高い値を示した。膵臓、唾液腺、小腸及び大腸、胃並びに脾臓では放射能蓄積量は低かった。Ａ４３１腫瘍異種移植片への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの取込みは、０．０１６ｎｍｏｌ及び０．１６ｎｍｏｌのコンジュゲート注射でそれぞれ１．５１±０．１６％ＩＡ／ｇ及び２．６９±０．２９％ＩＡ／ｇ（ｐ＝０．０３６）であった。放射性トレーサーは速い血液クリアランスを有しており、いずれのコンジュゲートでも（大差なく）、３０分循環したときの残存量は１％ＩＡ／ｇ未満であった。コンジュゲートの注入量が増すと、膵臓、脾臓及び胃における放射能取込み量に統計的に有意な減少が認められた。腫瘍対健常臓器に注目すると、コンジュゲート量の増加の影響は一段と顕著である。腫瘍対血液比では、０．０１６及び０．１６ｎｍｏｌのコンジュゲート注射のそれぞれで４．４２±１．８１％ＩＡ／ｇ及び４．５０±２．５３％ＩＡ／ｇ（ｐ＝０．０３６）と差異はないが、心臓、膵臓、胃、脾臓、肺、腸、筋肉及び唾液腺では、０．１６ｎｍｏｌのコンジュゲートを注射したときに腫瘍対臓器比に統計的に有意な増加が認められる。
【００６５】
実施例４−ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージング
イメージングは、コンピューター制御式ベッドを備えた断面視野１０ｃｍ及び軸方向視野８ｃｍのｍｉｃｒｏＰＥＴ Ｒ４スキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。それは専ら三次元リストモードで作動させ、セプタはなかった。すべての生データをまず三次元シノグラムとし、次いでフーリエリビニング及び二次元フィルタ逆投影による画像再構成によって解像度２ｍｍの画像を得る。マウスは実験直前に実験室に持ち込んだ。マウスを赤色電球下で短時間加温した後、酸素と空気の４５／５５％混合気に２％のイソフルレンを供給するように調節したイソフルレン気化器に接続したシリンダー内に入れた。マウスが気絶したら、ヘパリン処理した静脈カテーテルを尾静脈に入れ、０．９％ＮａＣｌ及び１０ＩＵのヘパリンを含む１ｍｌ注射器に接続した。しかる後、マウスを腹部を下にして腫瘍のある前肢を体からできるだけ前に伸ばしてカメラベッドにセットし、熱及び水分損失を最小限にするためサランラップで覆った。実験中の体温の損失を減少させるために熱風（４０℃）をマウスに吹き付けた。カメラを始動した直後に大量瞬時投与としてトレーサーを１００μｌ注射し、次いで１００μｌの生理食塩水を注射した。実験終了後、マウスを麻酔状態で断頭し、血液、肝臓及び腎臓試料を回収して放射能測定した。
【００６６】
散乱補正、ランダムカウント及び不感時間補正をすべて再構成アルゴリズムに組み込んだ。トレーサー注射前に６８Ｇｅ／６８Ｇａを含む２本の回転ロッド源で各マウスにおける放射能減衰を測定し、画像を放射能減衰について補正した。ＰＥＴ試験はすべて２０分透過スキャンで開始した。注射した納車能量は２．０±０．５ＭＢｑであった。この実験では、２通りのイメージングプロトコルを使用した。取得時間は以下の通りであった：プロトコル１（期間１２０分）１０×３０秒、５×１２０秒及び５×３００秒、８×６００秒、プロトコル２（期間３０分）１０×３０秒、５×６０秒、１０×１２０秒。関心領域（ＲＯＩ）を、肝臓、腎臓、膀胱、唾液腺及び腫瘍に描いた。注射後の時間経過としての放射能濃度（組織１ｇ当りの注射量の百分率）を表す薬物動態曲線を求めた。取込み指数は、臓器中の放射能［ｋＢｑ／ｍＬ］／注射量［ｋＢｑ］×１００％として計算した。
【００６７】
ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングで求めた担癌マウスにおける６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの局在化（図６）に続いて、マウスの断頭後回収した血液、肝臓、及び腎臓の試料の放射能測定を行った。２．０ＭＢｑ（比放射能１２〜２０ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ投与３０分後の担癌マウスの画像を、図６の左側に示す。ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングの評価結果を、血液、肝臓及び腎臓試料の放射能測定と相関させた。右左の脚の腫瘍はいずれも周辺のバックグラウンドから明瞭なコントラストで視認できた。肝臓及び腎臓で顕著な取込みが観察され、膀胱を通しての放射能のクリアランスが歴然であった（図７）。腫瘍及び唾液腺への分布は比較的遅かった。ｍｉｃｒｏＰＥＴ及び体内分布実験で得られた取込みデータは、イメージング後の組織サンプリングで得られたデータと一致し、対照できることが判明した。
【００６８】
具体的な実施形態、参照文献
本発明の技術的範囲は本明細書に記載した特定の実施形態によって限定されるものではない。実際、本明細書の以上の記載から当業者には本明細書に記載した変更例以外の変更例も明らかであろう。かかる変更例も特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。
【００６９】
本明細書では、様々な刊行物及び特許出願を引用したが、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】Ａ４３１癌腫（ａ）及びＵ３４３神経膠腫（ｂ）細胞系に対する６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合特異性を示す図。すべての時点で、対照細胞のＥＧＦ受容体は１００倍過剰量の非標識ＥＧＦで遮断した。結合を抑圧することができたことから、結合が特異的であることが分かる。図示したデータは３つの測定値の平均と標準偏差である。
【図２】培養癌腫Ａ４３１及び神経膠腫Ｕ３４３細胞への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦの結合の飽和を示す図。それぞれ非特異的結合及び全結合量を得るため非標識ｈＥＧＦの存在下又は非存在下で、様々な濃度の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ（Ａ４３１細胞では０．２６〜１６．９ｎＭ及びＵ３４３細胞では０．１４〜３６ｎＭ）と共に氷上で２時間インキュベートした。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０で解析した。すべてのデータポイントは３以上のデータポイントの平均であり、最大偏差も示す。
【図３】癌腫Ａ４３１細胞及び神経膠腫Ｕ３４３細胞に結合した後の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの内部移行を示す図。内部移行は、異なる２つの時点での酸洗浄によって測定した。酸性緩衝液で細胞から除かれたものは膜結合型であり、その残りは内部移行したものと考えた。図示したデータは３つの測定値の平均と標準偏差である。
【図４】６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦでのＡ４３１（実線）及びＵ３４３（破線）のインキュベーションを中断した後の時間の関数としての細胞結合６８Ｇａ放射能を示す図。インキュベーション中断後時間０での細胞結合放射能を１００％とみなした。すべてのデータポイントは３つの測定値の平均と標準偏差である。Ａ４３１及びＵ３４３の細胞培養液はいずれも６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦで４時間インキュベートした。
【図５】図５Ａは、担癌ヌードマウスにおける３０分の時点での組織１グラム当りの注入量％として表される６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの体内分布の図である。図５Ｂは、担癌ヌードマウスにおける３０分の時点での６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの腫瘍対組織比を示す図である。マウスには、０．０１６ｎｍｏｌ又は０．１６ｎｍｏｌのいずれかの量の放射性トレーサーを静脈内注射した。データは平均±標準偏差（ｎ＝４）として示す。
【図６】図６左は、フレーム２０〜２４の相加を示す画像（ｘ−注入３０分後）である。頭の両側に腫瘍が明瞭に認められる。図６右はマウスの配置の写真である。
【図７】６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの（０．１６ｎｍｏｌ注入）の肝臓、腎臓及び腫瘍への急速な分布を示す薬物動態曲線である。尿中への排出が観測期間を通して継続する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性標識ガリウム錯体及びその合成法に関する。本発明の放射性標識ガリウム錯体は、特に陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）用の放射性医薬品として有用である。これらは悪性腫瘍における上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現の検出に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ１及びＥｒｂＢ−１としても知られる上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、チロシンキナーゼ受容体ファミリーに属する膜貫通型タンパク質である。ＥＧＦＲの活性化は、細胞分裂、運動性の増加及びアポトーシスの抑制を導くシグナル伝達を惹起する（非特許文献１）。数多くの癌腫において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅又は転位置は、転写の増加とその後の高レベルのＥＧＦＲ発現を惹起する（非特許文献２、非特許文献３）。乳癌（非特許文献４、非特許文献５）、肺癌（非特許文献６）及び膀胱癌（非特許文献７）でＥＧＦＲの過剰発現が報告されている。高水準のＥＧＦＲ発現は、細胞の増殖及び転移の広がりが増し、アポトーシスが減少することによって悪性細胞の生存に好都合であるとも考えられる。現在のところ、ＥＧＦＲシグナル伝達の不活性化によって腫瘍成長を抑制する数多くの取組みが臨床で使用又は盛んに臨床試験されている。これらの取組みは、ＥＧＦＲの細胞外領域にリガンドが結合するのを抗ＥＧＦＲ抗体を用いて遮断するか、或いは選択的チロシンキナーゼ阻害剤で細胞内シグナル伝達を阻止するかのいずれかに基づくものである（非特許文献８）。
【０００３】
腫瘍におけるＥＧＦＲ発現の検出が予後値及び予測値として報告されている。ＥＧＦＲの過剰発現が、結腸癌（非特許文献９）、直腸癌（非特許文献１０）、非小細胞肺癌（非特許文献１１）及び乳癌（非特許文献５、非特許文献１２）での低い生存率及び再発と関連していることが報告されている。ＥＧＦＲの発現状態によって、術前化学療法及び放射線療法後の成果の乏しい進行上咽頭癌に属する患者のサブグループを確認できると示唆されている（非特許文献１３）。ＥＧＦＲの発現がヒト前立腺癌での疾患再発及びアンドロゲン非依存性への進行と関連することが明らかにされている（非特許文献１４）。実際の診療でのＥＧＦＲの検出がＥＧＦＲを標的とした薬物の使用の妥当性の問題を始めとする患者管理に影響する可能性があることは明らかである。
【０００４】
ＥＧＦＲの検出は、外科試料又は穿刺生検試料で免疫組織化学的検査又はＦＩＳＨ法を用いて可能である。しかし、核医学画像化は、原発腫瘍及び腫瘍転移を全体的に評価でき、サンプリングエラー及びＥＧＦＲ発現の不均一性に付随する偽陰性の結果を避けることができるという利点があると考えられる。
【０００５】
インジウム−１１１標識抗ＥＧＦＲ抗体４２５が、悪性神経膠腫の検出に成功裡に用いられている（非特許文献１５）。Ｔｃ−９９ｍ−標識抗ＥＧＦＲヒト化抗体ｈＲ３及びＣ２２５は臨床評価の段階にある（非特許文献１６、非特許文献１７）。ただし、嵩高い抗体タンパク質の使用は、健常組織を通しての腫瘍への放射性コンジュゲートの拡散が難しくなるおそれがある。抗ＥＧＦＲ抗体に代わるものとして、腫瘍細胞に放射性核種を送達するためのターゲティングベクターとして天然リガンドである上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いることが考えられる（非特許文献１７）。ＥＧＦは分子量（６．２ｋＤａ）が小さいので、腫瘍への速い浸透及び速い血液クリアランスが可能となり、良好なコントラストの画像を得ることができると考えられる。従前、１３１Ｉ−標識ＥＧＦが肺癌の画像化に成功裡に用いられている（非特許文献１８）。しかし、放射性ハロゲンは細胞保持が不十分なため、腫瘍での蓄積が減少し、画像コントラストも最適とはいいがたいので、ＥＧＦの標識には放射性金属を使用した方がよい選択となり得る（非特許文献１９）。ＥＧＦに対して様々な単一光子放射性金属標識が提案されている。モノアミドＤＴＰＡ（非特許文献１９、非特許文献２０）又はイソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡ（非特許文献２１）を用いてＥＧＦに１１１Ｉｎ（Ｔ１／２＝２，８ｄ）が結合されている。ジェネレータ生成９９ｍＴｃ（Ｔ１／２＝６ｈ）によるＥＧＦの標識にＭＡＧ３（非特許文献２２）、導入ＳＨ基（非特許文献２３）又はＨＹＮＩＣ（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ、未発表データ）が利用されている。しかし、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）の方が、ＳＰＥＣＴと比較して、感度、解像度及び数量化の点で優れた検出技術であるので、ＥＧＦに陽電子放射標識を使用した方が有利であるとも考えられる（非特許文献２４、非特許文献２５）。
【０００６】
ＰＥＴイメージングは、陽電子を放出する放射性トレーサー分子を用いた核断層撮影技術である。陽電子が電子と遭遇すると、それらは消滅してガンマ線としてエネルギーを放出し、これをＰＥＴスキャナーで検出する。トレーサー分子として体内で用いられる天然物質を使用すると、ＰＥＴは体内の構造に関する情報を与えるだけでなく体又は体内の特定領域の生理的機能に関する情報も与える。一般的なトレーサー分子は例えば天然のグルコースと類似した２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（ＦＤＧ）に１８Ｆ原子を付加したものである。陽電子放出フッ素から発生するガンマ線はＰＥＴスキャナーで検出され、体の特定領域又は組織（例えば脳又は心臓）におけるＦＤＧの代謝を示す。トレーサー分子の選択は、何をスキャンすべきかによって左右される。一般に、トレーサーは重要な領域に蓄積又はある種の組織（例えば癌細胞）に選択的に取り込まれるものが選択される。スキャニングは、放射性トレーサー分子が問題とする生化学過程に入る時間間隔後に得られた一連の動的又は静止画像のいずれかからなる。スキャナーはトレーサー分子の空間的及び時間的分布を検出する。ＰＥＴは、放射性トレーサー分子の局所濃度を測定できる定量的イメージング法でもある。
【０００７】
ＰＥＴトレーサーに常用される放射性核種は、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、１３Ｎ又は７６Ｂｒである。近年、二官能性キレート剤と放射性金属とを含む放射性標識金属錯体に基づく新たなＰＥＴトレーサーが製造されている。二官能性キレート剤は金属イオンに配位しているとともに、患者体内の標的部位に結合するターゲティングベクターと連結したキレート剤である。かかるターゲティングベクターとしては、ある種の受容体、大抵は体内の特定の領域又は疾患に関連した受容体と結合するペプチドがある。ターゲティングベクターは、例えば活性化した腫瘍遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドで、腫瘍の位置特定のためのオリゴヌクレオチドであってもよい。かかる錯体の利点は、例えば６８Ｇａ、２１３Ｂｉ又は８６Ｙなどの様々な放射性金属で二官能性キレート剤を標識できることである。こうして、特殊な特性をもつ放射性標識錯体を特定の用途のために「仕立てる」ことができる。
【０００８】
６８Ｇａは、ＰＥＴイメージングでトレーサー分子として用いられるＧａ−放射性標識金属錯体の製造に特に重要である。６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから得られ、サイクロトロンを一切必要としない。６８Ｇａは２．９２ＭｅＶの陽電子放出によって８９％まで崩壊し、その半減期６８分は、不必要な放射線なしでインビボでの数多くの生化学過程を追跡するのに十分である。６８Ｇａはその＋ＩＩＩの酸化状態で各種のキレート剤と安定な錯体を形成し、６８Ｇａトレーサーは脳、腎臓、骨組織、血液プール、肺及び腫瘍のイメージングに用いられている。
【０００９】
この核種の短い半減期はＥＧＦの速い血液クリアランスに適合する。ＤＯＴＡ又はＮＯＴＡのような大環状キレート剤の誘導体の使用によって、ソマトスタチンの類似体及びオリゴヌクレオチドの安定ガリウム標識が得られている（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１）。非環状キレート剤での初期の実験から、それらをＥＧＦに結合しても、その受容体に対するＥＧＦ結合親和性が低減しないことが明らかにされている。こうした理由から、ＥＧＦへのＤＯＴＡのカップリングがガリウムでの標識に適した方法を与えるかもしれない。しかし、先行技術には、これらの科学的知見を腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージングにどのように用いるかについてなんら示唆又は教示されていない。
【００１０】
そこで、医学界では、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出するための非侵襲性ＰＥＴトレーサーが長い間待望されていた。かかるトレーサーは、高感度でのインビボ非侵襲性ＰＥＴ法の開発に極めて有用であろう。多くの癌腫でのＥＧＦＲの過剰発現の検出は重要な診断情報を与え、患者管理に影響を及ぼす可能性がある。従って、ＥＧＦＲの天然リガンドに基づく陽電子放出トレーサーの製造方法、ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）及び腫瘍でのＥＧＦＲ過剰発現のイメージングにおけるトレーサーの使用法を提供することが望ましい。
【００１１】
本明細書における文献についての説明又は引用は、これらの文献が本発明の先行技術であることを是認するもの解釈すべきではない。
【非特許文献１】Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signaling network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001; 2(2): 127-137
【非特許文献２】Collins VP. Amplified genes in human gliomas. Semin Cancer Biol. 1993; 4(1): 27-32
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、放射性標識ガリウム錯体の標識合成法であって、
（ａ）６８Ｇａ３＋放射性同位体を用意し、
（ｂ）６８Ｇａ３＋放射性同位体をマイクロ波活性化を用いてキレート剤と反応させ、
（ｃ）得られた放射性標識ガリウム錯体を回収すること
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらにＰＥＴトレーサーとしての放射性標識ガリウム錯体を提供する。本発明に係る好ましいトレーサーは６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦである。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、また、放射性標識ガリウム錯体をヒトに投与することを含んでなる、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージング法であって、上記放射性標識ガリウム錯体が陽電子放射断層撮影でイメージングできるものであり、陽電子放射断層撮影を行って腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、６８Ｇａを得るのに使用できるキット及び６８Ｇａ−放射性標識錯体の製造に使用できるキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の目的の一つは、放射性医薬品として、特にＰＥＴでの使用に有用な放射性標識ガリウム錯体の合成法を提供することである。これらは、悪性腫瘍における上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現の検出に特に有用である。これは、本明細書に記載の方法で達成される。
【００１６】
６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから得られる。かかるジェネレータは当技術分野で公知であり、例えばC. Loc'h et al, J. Nucl. Med. 21, 1980, 171-173又はJ. Schuhmacher et al. Int. J. appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36を参照されたい。６８Ｇｅは、例えば２０ＭｅＶプロトンでのＧｅ２（ＳＯ４）３の照射によってサイクロトロン生産で得ることもできる。また、例えば０．５ＭのＨＣｌ中の６８Ｇｅとしても市販されている。一般に、有機樹脂或いは二酸化スズ、二酸化アルミニウム又は二酸化チタンのような無機金属酸化物からなるカラムに６８Ｇｅをローディングする。ＨＣｌ水溶液によってカラムから６８Ｇａが溶出し、６８ＧａＣｌ３が得られる。６８Ｇａ３＋はその製造にサイクロトロンが不要で、その半減期６８分は、長時間放射せずにＰＥＴイメージング法での多くのインビボ生化学過程の追跡に十分であるので本発明の方法で特に好ましい。
【００１７】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータに適したカラムは、二酸化アルミニウム、二酸化チタン又は二酸化スズのような無機酸化物、或いはフェノール性水酸基（米国特許第４２６４４６８号）又はピロガロール（J. Schuhmacher et al., Int. J. appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36）を含む樹脂のような有機樹脂からなる。好ましい実施形態では、二酸化チタンを含むカラムを備える６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータを本発明の方法に用いる。
【００１８】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータカラムからの６８Ｇａの溶出に用いられるＨＣｌ水溶液の濃度はカラム材料によって左右される。６８Ｇａの溶出には、０．０５〜５ＭのＨＣｌが好適に使用される。好ましい実施形態では、溶出液は、二酸化チタンを含むカラムを備える６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから得られ、６８Ｇａは０．０５〜０．１ＭのＨＣｌ、好ましくは約０．１ＭのＨＣｌを用いて溶出される。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、対イオンとしてＨＣＯ３−を含む強い陰イオン交換体、好ましくは対イオンとしてＨＣＯ３−を含む強い陰イオン交換体を用いる。別の好ましい実施形態では、陰イオン交換体は第四級アミン官能基を含む。さらに別の好ましい実施形態では、陰イオン交換体はポリスチレン−ジビニルベンゼン系の強い陰イオン交換樹脂である。特に好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される陰イオン交換体は、対イオンとしてのＨＣＯ３−、第四級アミン基を含む強い陰イオン交換樹脂であり、樹脂はポリスチレン−ジビニルベンゼン系である。
【００２０】
好適には、本発明の方法では、陰イオン交換体からの６８Ｇａの溶出には水を用いる。
【００２１】
本発明の方法で得られる６８Ｇａは、好ましくは６８Ｇａ−放射性標識錯体の製造、好ましくは二官能性キレート剤（ターゲティングベクターと結合したキレート剤）を含む６８Ｇａ−放射性標識ＰＥＴトレーサーの製造に用いられる。
【００２２】
そこで、本発明の別の態様は、
ａ）６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータからの溶出液を対イオンとしてＨＣＯ３−を含む陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換体から６８Ｇａ３＋を溶出して６８Ｇａを得て、
ｂ）６８Ｇａをキレート剤と反応させる
ことによって６８Ｇａ−放射性標識錯体を製造する方法である。
【００２３】
本発明の方法での使用に好ましいキレート剤は、生理学的に認容性の形態の６８Ｇａを与えるものである。さらに好ましいキレート剤は、放射性標識錯体を用いた診断検査に要する時間安定な６８Ｇａ錯体を形成するものである。
【００２４】
適当なキレート剤は、例えばＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＡ３、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＨＰ−ＤＯＡ３、ＴＭＴ又はＤＰＤＰのようなポリアミノポリ酸キレート剤である。これらのキレート剤は放射性医薬品及び放射線診断として周知である。これらの使用法及び合成は、例えば、米国特許第４６４７４４７号、同第５３６２４７５号、同第５５３４２４１号、同第５３５８７０４号、同第５１９８２０８号、同第４９６３３４４号、欧州特許出願公開第２３０８９３号、同第１３０９３４号、同第６０６６８３号、同第４３８２０６号、同第４３４３４５号、国際公開第９７／０００８７号、同第９６／４０２７４号、同第９６／３０３７７号、同第９６／２８４２０号、同第９６／１６６７８号、同第９６／１１０２３号、同第９５／３２７４１号、同第９５／２７７０５号、同第９５／２６７５４号、同第９５／２８９６７号、同第９５／２８３９２号、同第９５／２４２２５号、同第９５／１７９２０号、同第９５／１５３１９号、同第９５／０９８４８号、同第９４／２７６４４号、同第９４／２２３６８号、同第９４／０８６２４号、同第９３／１６３７５号、同第９３／０６８６８号、同第９２／１１２３２号、同第９２／０９８８４号、同第９２／０８７０７号、同第９１／１５４６７号、同第９１／１０６６９号、同第９１／１０６４５号、同第９１／０７１９１号、同第９１／０５７６２号、同第９０／１２０５０号、同第９０／０３８０４号、同第８９／０００５２号、同第８９／００５５７号、同第８８／０１１７８号、同第８６／０２８４１号及び同第８６／０２００５号に記載されている。
【００２５】
適当なキレート剤としては、大環状キレート剤、例えばZhang et al., Inorg. Chem. 37(5), 1998, 956-963に記載のポルフィリン様分子及びペンタアザ大環状化合物、フタロシアニン、クラウンエーテル、例えばセパルクレート及びクリプテートのような窒素クラウンエーテル、ヘミン（プロトポルフィリンＩＸクロリド）、ヘム及び平面正方形の対称性を有するキレート剤が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法では大環状キレート剤が好ましく使用される。好ましい実施形態では、これらの大環状キレート剤は、ポリアザ−及びポリオキソ大環状化合物のように酸素及び／又は窒素などの１以上の硬いドナー原子を含む。ポリアザ大環状キレート剤の好ましい例としては、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ及びＨＥＴＡが挙げられ、ＤＯＴＡが特に好ましい。
【００２７】
特に好ましい大環状キレート剤は、カルボキシル基又はアミン基のようにＧａ３＋への配位には必須ではなく、ターゲティングベクターのような他の分子とキレート剤とのカップリングに使用できる官能基を含む。かかる官能基を含む大環状キレート剤の例は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ又はＨＥＴＡである。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、二官能性キレート剤を本発明の方法で用いる。本発明に関して「二官能性キレート剤」とは、ターゲティングベクターと連結したキレート剤を意味する。本発明の方法で有用な二官能性キレート剤に適したターゲティングベクターは、ターゲティングベクターを含む６８Ｇａ放射性標識錯体を患者に投与したとき患者の体内の標的部位に結合する化学又は生物学的部分である。本発明の方法で有用な二官能性キレート剤に好ましいターゲティングベクターは、ＥＧＦＲに対する天然リガンドである上皮増殖因子（ＥＧＦ）又はそれらの一部、断片、誘導体もしくは錯体である。ＥＧＦは分子量（６．２ｋＤａ）が小さいので、腫瘍への速い浸透及び速い血液クリアランスが可能となり、良好なコントラストの画像を与える。ＥＧＦ用の陽電子放射標識の使用は、ＰＥＴがＳＰＥＣＴに比べて感度、解像度及び数量化の点で優れた検出技術であるので特に有利である。特に好ましいターゲティングベクターは、ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）又はその一部、断片、誘導体もしくは錯体である。
【００２９】
特に好ましい実施形態では、大環状二官能性キレート剤を本発明の方法で使用する。好ましい大環状二官能性キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ又はＨＥＴＡをターゲティングベクター、好ましくはＥＧＦ又はその一部、断片、誘導体もしくは錯体、特に好ましくはｈＥＧＦ又はその一部、断片、誘導体若しく錯体に連結したものからなる。
【００３０】
ターゲティングベクターは、リンカー基又はスペーサー分子を介してキレート剤に結合させることができる。リンカー基の例は、ジスルフィド、エステル又はアミドであり、スペーサー分子の例は、鎖状分子、例えばリシン又はヘキシルアミン或いは短鎖ペプチド系スペーサーである。好ましい実施形態では、ターゲティングベクターと放射性標識ガリウム錯体のキレート剤との結合は、ターゲティングベクターが、放射性標識ガリウム錯体の存在によって阻害も妨害もされずに、体内の標的と相互作用できるものである。
【００３１】
本発明の好ましい一態様は、
ｃ）６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータからの溶出液を、ＨＣＯ３−を対イオンとして含む陰イオン交換体と接触させて、陰イオン交換体から６８Ｇａを溶出することによって６８Ｇａを得て、
ｄ）６８Ｇａをマイクロ波活性化を用いてキレート剤と反応させる
ことによって６８Ｇａ−放射性標識錯体を製造する方法である。
【００３２】
マイクロ波活性化の使用によって、６８Ｇａ−キレート剤錯体形成の効率及び再現性が大幅に向上することが判明した。マイクロ波活性化によって、化学反応時間を大幅に短縮することができ、反応は２分以内に完了する。反応時間を１０分短縮できれば、約１０％の６８Ｇａ活性が助かるので、明らかな改善である。さらに、マイクロ波活性化は副反応の低減及び選択性の増加による放射化学的収率の向上ももたらす。
【００３３】
好適には、マイクロ波活性化の実施にはマイクロ波オーブン、好ましくは単一モードマイクロ波オーブンを用いる。マイクロ波活性化は、好適には８０〜１２０Ｗ、好ましくは９０〜１１０Ｗ、特に好ましくは約１００Ｗで実施される。好適なマイクロ波活性化時間は２０秒〜２分、好ましくは３０秒〜９０秒、特に好ましくは４５秒〜６０秒である。
【００３４】
本発明の方法で例えばペプチド又はタンパク質をターゲティングベクターとして含む二官能性キレート剤のような温度感受性のキレート剤を用いるときは反応の温度制御が推奨される。マイクロ波活性化の期間は、反応混合物の温度がキレート剤及び／又はターゲティングベクターの分解を生じないように調節すべきである。本発明の方法で用いるキレート剤がペプチド又はタンパク質を含む場合、高い温度を短時間加える方が低い温度を長時間加えるよりも概して有利である。
【００３５】
マイクロ波活性化は連続的に或いは反応の過程で幾つかのマイクロ波活性化周期で実施できる。
【００３６】
本発明の別の態様は、６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータから６８Ｇａを得るためのキットであって、ジェネレータカラムとＨＣＯ３−を対イオンとして含む陰イオン交換体からなる第の二カラムとを備えるキットである。
【００３７】
好ましい実施形態では、キットは、複数のカラムを直列に接続する手段及び／又は６８Ｇａをジェネレータカラムから溶出するためのＨＣｌ水溶液及び／又は６８Ｇａを陰イオン交換カラムから溶出するための水をさらに備える。ＨＣｌ及び水は好ましくは無菌であり、密封容器に収容されている。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るキットは、キレート剤、好ましくは二官能性キレート剤つまりターゲティングベクターに結合したキレート剤をさらに含む。
【００３９】
本発明は、ＰＥＴトレーサーとしての放射性標識ガリウム錯体をさらに提供する。本発明に係る好ましいトレーサーは６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦである。
【００４０】
さらに別の実施形態では、本発明は、放射性標識ガリウム錯体をヒトに投与することを含んでなる、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージング法であって、上記放射性標識ガリウム錯体が陽電子放射断層撮影でイメージングできるものであり、陽電子放射断層撮影法を行って腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出する方法も提供する。
【実施例】
【００４１】
以下の実施例で本発明をさらに例証するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１−６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ調製の化学及び放射化学
Ｉ．材料
組換えヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社（米国カリフォルニア州テメキュラ）から購入した。酢酸ナトリウム（９９．９９５％）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、再蒸留塩酸（Ｒｅｉｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ社製）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ（スウェーデン国ストックホルム）から入手した。リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ国ダルムシュタット）から入手した。ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）のスルホ−ＮＨＳエステルは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社（米国テキサス州ダラス）から購入した。購入した化学物質はそれ以上精製せずに使用した。すべての反応で、Ｅｌｇａ社製Ｐｕｒｅｌａｂ Ｍａｘｉｍａ系（英国バッキンガムシャー）で製造した脱イオン水（１８．２ＭΩ）を使用した。６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｃ．、ロシア国オブニンスク）から入手した。
【００４３】
ＩＩ．ＨＰＬＣ分析
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析は、１２６ポンプ、１６６ＵＶ検出器及び放射線検出器を直列に連結したＢｅｃｋｍａｎ社（米国カリフォルニア州フラートン）製のＨＰＬＣシステムを用いて行った。データの取得及び操作はＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｎｏｕｖｅａｕ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙソフトウェアパッケージを用いて行った。使用したカラムは、寸法１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径５μｍのＶｙｄａｃ ＲＰ ３００Å ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ社、米国）である。用いた勾配溶出は以下のパラメーターであった：Ａ＝１０ｍＭのＴＦＡ、Ｂ＝７０％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、３０％Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＴＦＡで２２０ｎｍでのＵＶ検出、流速は１．２ｍＬ／分、２０％Ｂの均一濃度で０〜２分、２０〜９０％Ｂの直線濃度勾配８分、９０〜２０％Ｂの直線濃度勾配２分。カラムに保持された６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ及び放射性不純物の量は、カラムに注入した試料及び出口から回収した画分の活性を結晶シンチレーションカウンターで測定することによって得ることができた。システムでの全損失は１０％であった。６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ及び親水性放射性不純物の画分の測定放射能はＨＰＬＣクロマトグラムから得られたそれぞれの値と一致した。対応する相対標準偏差は親水性放射性不純物及び６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦについてそれぞれ７％及び０．５％であった。
【００４４】
ＩＩＩ．６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦの調製
０．０８Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．４）中のｈＥＧＦ（３２〜７０ナノモル、８０〜１８０μＬ）を攪拌しながら乾燥ＤＯＴＡのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（１０〜２０倍過剰）に加え、ホウ酸緩衝液（２４０〜３４０μＬ）を加えてｐＨを９．０に調整した。混合物を室温で３〜４時間又は一晩放置した。コンジュゲートをＢｉｏ−ｓｅｌｅｃｔ ＲＰ Ｃ１８ Ｃ−１８ ＳＰＥカラム（Ｖｙｄａｃ社製）で精製した。反応混合物を抽出ディスクにゆっくりと流し、次いで２ｍＬの０．１％ＴＦＡで洗浄した。生成物は、０．１％のＴＦＡを含む１ｍＬの７０％アセトニトリルで溶出した。溶媒を、５０℃で作動させた真空遠心分離機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ社（米国ミズーリ州カンザスシティ）製ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｓｏｌｅ）を用いて蒸発させ、乾燥精製標品を０℃未満の温度で保存した。
【００４５】
コンジュゲートの標識は、先行技術に記載の通り（Velikyan I, Beyer GJ, Langstrom B. Microwave-supported preparation of (68)Ga bioconjugates with high specific radioactivity. Bioconjug Chem. 2004; 15(3): 554-560）、未濃縮６８Ｇａ−溶出液又は予備濃縮した溶出液のいずれかを用いて行った。場合によっては、標識反応に用いる６８Ｇａの量を増すため、２つのジェネレータからの溶出液を予備濃縮した。標識反応に使用したＤＯＴＡ−ｈＥＧＦの量は、未濃縮及び予備濃縮した６８Ｇａ−溶出液を使用するときそれぞれ６〜１０及び２〜５ナノモルであった。未濃縮６８Ｇａでの標識には酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５）を使用し、予備濃縮した溶出液ではＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ４．６〜４．８）を使用した。標識は１分間のマイクロ波加熱で実施した。生成物は、上述のＢｉｏ−ｓｅｌｅｃｔ ＲＰ Ｃ１８ Ｃ−１８ ＳＰＥカラムで精製した。次いで溶媒をＮＡＰ−５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（スウェーデン国ウプサラ）製）でＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液に交換した。コンジュゲートの純度はＨＰＬＣで調べ、コンジュゲート及びトレーサーの濃度はＵＶ−ＨＰＬＣ較正曲線から求めた。
【００４６】
ｈＥＧＦへの６８Ｇａの結合がＤＯＴＡで媒介されることを検証するため、ブランク試験を行った。操作は上記と同じであるが、非連結ｈＥＧＦを使用した。
【００４７】
６９，７１Ｇａの天然同位体組成物を同じ手順を用いてＤＯＴＡ−ｈＥＧＦと錯体化した。放射性ＨＰＬＣクロマトグラムシグナルの同定には、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで特性決定した６９，７１Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦを用いた。
【００４８】
ＩＶ．マイクロ波加熱及びＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析
マイクロ波加熱は、２４５０ＭＨｚでの連続照射を発生するＳｍｉｔｈＣｒｅａｔｏｒ（商標）単一モード空洞共振器（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社（スウェーデン国ウプサラ）製）で実施した。反応の間、温度、圧力及び照射出力をモニターした。照射完了後、反応バイアルを加圧空気で冷却した。
【００４９】
Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社（英国）製）及びフォトダイオードアレーＵＶ検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ社製（Ｗａｔｅｒｓ ２６９、英国）ＨＰＬＣシステムを用いてエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。使用したカラムは、寸法１００ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径３μｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ １８ ＲＰ ＨＰＬＣカラムである。均一濃度溶出を以下のパラメーターで用いた。Ａ＝１０ｍＭギ酸、Ｂ＝１００％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）であり、２１０〜４００ｎｍでのＵＶ検出、流速０．３ｍＬ／分。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳは、ポジティブモードスキャン及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋、［Ｍ＋７Ｈ］７＋及び［Ｍ＋８Ｈ］８＋種を検出する選択イオン記録（ＳＩＲ）で実施した。ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝７８１．５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝８９３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１０４２で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝６２４４．６７±１．１５となる。（ＤＯＴＡ）１−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８２９．７５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝９４８．１３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１０５で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝６６２９．９５±０．０５となる。（ＤＯＴＡ）２−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８７８、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１１０３．３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１７０．３６で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７０１６±０．０８となる。（ＤＯＴＡ）３−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝９２６．２９、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１０５８．４７及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１２３４．７２で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７４０２±０．１となる。（Ｇａ−ＤＯＴＡ）１−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８３８．５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝９５８．１３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１１７．６６で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝６６９９．９５±０．０５となる。（Ｇａ−ＤＯＴＡ）２−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝８９６．０５、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１０２３．３及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１１９３．６９で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７１５７．５５±２．４７となる。（Ｇａ−ＤＯＴＡ）３−ｈＥＧＦは、［Ｍ＋８Ｈ］８＋についてｍ／ｚ＝９５２．５４、［Ｍ＋７Ｈ］７＋についてｍ／ｚ＝１０８８．４７及び［Ｍ＋６Ｈ］６＋についてｍ／ｚ＝１２６９．７２で検出された。データを再構成すると、Ｍ＝７６１２．３１±０．０５となる。
【００５０】
Ｖ．結果
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦは、まずｈＥＧＦを二官能性キレート剤ＤＯＴＡに連結し、次いでキレート剤と６８Ｇａとの錯形成反応による６８Ｇａでの標識との二段階法で合成した。連結段階においてＤＯＴＡキレートのカルボキシル基の１つがペプチドのアミン官能価とカップリングしてアミド結合を形成する（スキーム１）。連結反応に必要な塩基性ｐＨはホウ酸緩衝液で与えた。ｈＥＧＦは、１残基の末端リシンと２残基のリシンアミノ基を含有する。したがって、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析で判明したように、ｈＥＧＦの連結反応で、ＤＯＴＡ断片を１、２及び３個有する分子の混合物が形成される。
【００５１】
コンジュゲートのマイクロ波促進標識（スキーム１）を、未濃縮又は予備濃縮ジェネレータ６８Ｇａ溶出液を用いて実施した。未濃縮コンジュゲートの場合、標識収率は６０±１０％（Ｎ＝３）であった。予備濃縮したものを用いると、７７±４％（Ｎ＝３）に増加させることができた。溶出液を予備濃縮すると２８ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比放射能を得ることができた。非連結ｈＥＧＦを同じように処理しても標識ペプチドは得られなかったので、ｈＥＧＦへの６８Ｇａの結合はＤＯＴＡで媒介される。この研究におけるトレーサーの放射化学純度は９９％超であった。このトレーサーはＰＢＳ中で安定であり、４時間の安定性アッセイでそれ以上の放射性ＨＰＬＣ信号を生じなかった。
【００５２】
【化１】
実施例２−細胞結合及び保持実験
Ｉ．細胞培養
ヒト扁平上皮癌細胞系Ａ４３１（ＡＴＣＣ、ＣＬＲ １５５５、米国メリーランド州ロックビル）及び悪性神経膠腫細胞系Ｕ３４３ＭＧａＣ１２：６（Westermark B, Magnusson A, Heldin CH. Effect of epidermal growth factor on membrane motility and cell locomotion in cultures of human clonal glioma cells. J Neurosci Res. 1982; 8(2-3): 491-507）（以下、「Ｕ３４３」という）をすべての細胞実験で使用した。Ａ４３１細胞系は１細胞当り約２×１０６個のＥＧＦＲを発現し、Ｕ３４３細胞系は１細胞当り約５．５×１０５個のＥＧＦＲを発現すると報告されている。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）及びＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）（いずれもＢｉｏｃｈｒｏｍ社製）を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）で培養した。細胞培養及び細胞実験の際の細胞は（特記しない限り）、５％ＣＯ２で平衡化した加湿空気を入れたインキュベーター中３７℃で増殖させた。細胞はＢｉｏｃｈｒｏｍ社製のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｃａ及びＭｇを含まないＰＢＳ中、０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）でトリプシン処理した。
【００５３】
ＩＩ．細胞への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合
Ａ４３１及びＵ３４３細胞は３ｃｍシャーレ中で培養した（それぞれ１シャーレ当りの細胞数３．５×１０５及び１．９×１０５）。細胞を１回洗浄した後、細胞培養液中の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ（Ａ４３１細胞では３５ｎｇ／シャーレ、５０ｋＢｑ／シャーレ、Ｕ３４３細胞では５ｎｇ／シャーレ、２０ｋＢｑ／シャーレ）を添加した。添加したトレーサーの濃度は、Ａ４３１細胞では０．２６〜１６．９ｎＭ、Ｕ３４３細胞では０．１４〜３６ｎＭであった。幾つかのシャーレには、モル過剰のＥＧＦ（５又は３μｇ／シャーレ）を標識コンジュゲートと共に添加して６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦコンジュゲートの結合特異性を調べた。３７℃で０．５〜６時間のインキュベートした後、細胞を血清不含非放射性培地で６回洗浄し、次いで０．５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（３７℃、１５分）を用いて細胞を回収した。１ｍｌの細胞培養液の添加によってトリプシン処理を終了し、細胞懸濁液の一部（０．５ｍｌ）を細胞計数に使用し、残りはガンマカウンターで測定した。
【００５４】
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦコンジュゲートの細胞内部移行を調べるため、結合実験の際に多数の追加の細胞シャーレを用いて、コンジュゲートの膜結合画分を内部移行放射能から分離した。コンジュゲートの膜結合画分の抽出には、細胞のトリプシン処理に代えて、０．５ｍｌの氷冷０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）での０℃で６分間の処理を用いた。追加の０．５ｍｌのグリシン−ＨＣｌ緩衝液を用いて細胞を１回洗浄した。内部移行放射能と考えられる残りの放射能は、３７℃で０．５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ溶液で約６０分間処理することによって回収した。別途０．５ｍｌのＮａＯＨ溶液を洗浄に用いた。回収画分は自動ガンマカウンターで測定した。
【００５５】
飽和実験で結合に要する時間を求めるため、氷上でのＡ４３１細胞及びＵ３４３細胞への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合も調べた。氷上に載せた細胞シャーレを氷冷６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ溶液と共に０．５〜４時間インキュベートした。次いで細胞を上述の通り洗浄し、トリプシン処理し、カウントした。
【００５６】
ＩＩＩ．放射能の細胞保持、飽和アッセイ及び動物腫瘍モデル
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦで１時間インキュベートした後、放射能の細胞保持を調べた。インキュベーション後、細胞を十分に洗浄して未結合コンジュゲートを除去し、次いで新鮮な細胞培養液中でインキュベーションを続けた。０．５〜４時間後、細胞を上述の通りトリプシン処理し、計数し、放射能測定した。
【００５７】
Ａ４３１細胞及びＵ３４３細胞での６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦによる飽和実験から解離平衡定数Ｋｄを求めた。２４ウェルシャーレで培養した細胞（１ウェル当り約３．１×１０４個のＡ４３１細胞及び１ウェル当り約７．８×１０４個のＵ３４３細胞）を氷上に載せ、様々な濃度の氷冷６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ溶液（Ａ４３１では０．２６〜１６．９ｎＭ、Ｕ３４３では０．１４〜３６ｎＭ）を添加した。各濃度について、１００倍過剰の非標識ＥＧＦを幾つかのウェルに添加して非特異的なバックグラウンド結合を調べた。２時間インキュベートした後（この時間は氷上での取込み実験の結果から決定した。）、細胞を血清不含非放射性培地で６回洗浄した。細胞を次で０．５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し（３７℃で１５分間）、細胞数を計数するとともにガンマカウンターで放射能測定した。
【００５８】
腫瘍を異種移植した成熟雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（２１〜２５ｇ）（Ｍｏｌｌｅｇａｒｄ、デンマーク）でインビボ実験を実施した。動物はすべてスウェーデン動物愛護協会の指針に準拠して取り扱い、実験は当地の動物実験に関する倫理委員会によって承認された。マウスの両前肢にＡ４３１腫瘍細胞（１００μｌの細胞培養液中の腫瘍当り約７百万個の細胞）を皮下注射した。腫瘍を１２〜１３日間増殖させてから実験を行ったが、そのときの重量は０．１〜０．８ｇに達していた。
【００５９】
ＩＶ．結果
インビトロでのＥＧＦＲ発現細胞系への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合特異性を図１に示す。細胞実験では、ＥＧＦＲの発現が報告されている子宮頚癌Ａ４３１及び神経膠腫Ｕ３４３細胞系を使用した。結合が受容体特異性であることを実証するため、対照実験では大量の非標識ＥＧＦを細胞に添加してＥＧＦＲを飽和させた。結合特異性実験の結果は、すべての試験データポイントで両細胞系への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合が受容体の飽和によって阻止されることを示していた。これは標識コンジュゲートの結合が受容体特異的であることを示している。
【００６０】
子宮頚癌Ａ４３１及び神経膠腫Ｕ３４３細胞系での６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦによる飽和実験の結果を、それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。ａｍｏｌ／細胞で示す特異的結合を、添加した放射性標識コンジュゲートの合計モル濃度に対してプロットし、結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形回帰分析で解析した。いずれの曲線も最大値に達し、飽和したことを示している。得られたＫｄ値はＡ４３１では２．０ｎＭ、Ｕ３４３では２．３ｎＭであり、よく一致していた。Ｕ３４３での細胞当りの結合部位の最大数７．８×１０５という値は、［１１１Ｉｎ］−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ＥＧＦコンジュゲートで従前報告されている５．４×１０５という値（２２）とまずまず一致している。Ａ４３１での細胞当り１９０万という結合部位の数も、文献記載のデータとよく一致している。
【００６１】
この実験では、内部移行の程度を酸洗浄によって評価した。放射能のうち、酸性緩衝液で細胞から除かれるものは膜結合型と考えられ、残りは内部移行したものと考えられる。かかる実験の結果を図３に示すが、この図から、いずれの細胞系でも６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの内部移行が迅速なプロセスであることが分かる。ただし、これらの実験の結果は、内部移行の速度がＡ４３１に比べて神経膠腫Ｕ３４３細胞で速かったことを示している。これは、内部移行した受容体を細胞表面に再循環できるというＡ４３１細胞について報告された能力によるものかもしれない。神経膠腫Ｕ３４３細胞の場合には、インキュベーションを開始してから３０分で５０％を超える放射能が内部移行した。
【００６２】
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦでのインキュベーションを中断した後の放射能の保持パターンはＡ４３１及びＵ３４３細胞いずれの細胞系でも同様であった（図４）。最初に放射能が降下するが（膜結合コンジュゲートの解離による可能性が最も高い。）、その後は細胞結合６８Ｇａの量は比較的一定である。いずれの細胞系も良好な保持性を示し、インキュベーション中断後、標識の半減期の３倍を越える４時間の間、７０％を超える放射能が依然として細胞に結合していた。
【００６３】
実施例３−体内分布実験
Ｉ．Ａ４３１腫瘍を異種移植したマウスにおける体内分布
コンジュゲート注入量が腫瘍及び健常組織への取り込みに与える影響を調べるため、体内分布実験を行った。Ａ４３１腫瘍を異種移植したマウスに、５０μｌの６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ溶液（１匹当りＰＢＳ中０．１６ｎｍｏｌ又は０．０１６ｎｍｏｌ）を静脈内注射し、３０分後にマウスを屠殺して解剖した。マウスは、Ｒｏｍｐｕｎ（１ｍｇ／ｍｌ）とＫｅｔａｌａｒ（１０ｍｇ／ｍｌ）の混合物をマウス体重１０ｇ当り０．２ｍｌ腹腔内投与して麻酔し、心臓穿刺によって屠殺した。腫瘍の他に、血液、心臓、膵臓、脾臓、胃、肝臓、腎臓、肺、小腸及び大腸、筋肉、骨並びに唾液腺を回収して秤量し、自動ガンマカウンターで測定した。注射の正確さを判定するため、尾部についても放射能含量を測定した。臓器の値は、臓器１ｇ当りの注射した放射能の百分率（％ＩＡ／ｇ）として計算した。
【００６４】
ＩＩ．結果
Ａ４３１担癌マウスにおける６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの体内分布データの概要を図５に示す。６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの静脈内投与３０分後の臓器放射能の計測は、いずれのコンジュゲートについても腎臓及び肝臓で最も高い値を示した。膵臓、唾液腺、小腸及び大腸、胃並びに脾臓では放射能蓄積量は低かった。Ａ４３１腫瘍異種移植片への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの取込みは、０．０１６ｎｍｏｌ及び０．１６ｎｍｏｌのコンジュゲート注射でそれぞれ１．５１±０．１６％ＩＡ／ｇ及び２．６９±０．２９％ＩＡ／ｇ（ｐ＝０．０３６）であった。放射性トレーサーは速い血液クリアランスを有しており、いずれのコンジュゲートでも（大差なく）、３０分循環したときの残存量は１％ＩＡ／ｇ未満であった。コンジュゲートの注入量が増すと、膵臓、脾臓及び胃における放射能取込み量に統計的に有意な減少が認められた。腫瘍対健常臓器に注目すると、コンジュゲート量の増加の影響は一段と顕著である。腫瘍対血液比では、０．０１６及び０．１６ｎｍｏｌのコンジュゲート注射のそれぞれで４．４２±１．８１％ＩＡ／ｇ及び４．５０±２．５３％ＩＡ／ｇ（ｐ＝０．０３６）と差異はないが、心臓、膵臓、胃、脾臓、肺、腸、筋肉及び唾液腺では、０．１６ｎｍｏｌのコンジュゲートを注射したときに腫瘍対臓器比に統計的に有意な増加が認められる。
【００６５】
実施例４−ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージング
イメージングは、コンピューター制御式ベッドを備えた断面視野１０ｃｍ及び軸方向視野８ｃｍのｍｉｃｒｏＰＥＴ Ｒ４スキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。それは専ら三次元リストモードで作動させ、セプタはなかった。すべての生データをまず三次元シノグラムとし、次いでフーリエリビニング及び二次元フィルタ逆投影による画像再構成によって解像度２ｍｍの画像を得る。マウスは実験直前に実験室に持ち込んだ。マウスを赤色電球下で短時間加温した後、酸素と空気の４５／５５％混合気に２％のイソフルレンを供給するように調節したイソフルレン気化器に接続したシリンダー内に入れた。マウスが気絶したら、ヘパリン処理した静脈カテーテルを尾静脈に入れ、０．９％ＮａＣｌ及び１０ＩＵのヘパリンを含む１ｍｌ注射器に接続した。しかる後、マウスを腹部を下にして腫瘍のある前肢を体からできるだけ前に伸ばしてカメラベッドにセットし、熱及び水分損失を最小限にするためサランラップで覆った。実験中の体温の損失を減少させるために熱風（４０℃）をマウスに吹き付けた。カメラを始動した直後に大量瞬時投与としてトレーサーを１００μｌ注射し、次いで１００μｌの生理食塩水を注射した。実験終了後、マウスを麻酔状態で断頭し、血液、肝臓及び腎臓試料を回収して放射能測定した。
【００６６】
散乱補正、ランダムカウント及び不感時間補正をすべて再構成アルゴリズムに組み込んだ。トレーサー注射前に６８Ｇｅ／６８Ｇａを含む２本の回転ロッド源で各マウスにおける放射能減衰を測定し、画像を放射能減衰について補正した。ＰＥＴ試験はすべて２０分透過スキャンで開始した。注射した納車能量は２．０±０．５ＭＢｑであった。この実験では、２通りのイメージングプロトコルを使用した。取得時間は以下の通りであった：プロトコル１（期間１２０分）１０×３０秒、５×１２０秒及び５×３００秒、８×６００秒、プロトコル２（期間３０分）１０×３０秒、５×６０秒、１０×１２０秒。関心領域（ＲＯＩ）を、肝臓、腎臓、膀胱、唾液腺及び腫瘍に描いた。注射後の時間経過としての放射能濃度（組織１ｇ当りの注射量の百分率）を表す薬物動態曲線を求めた。取込み指数は、臓器中の放射能［ｋＢｑ／ｍＬ］／注射量［ｋＢｑ］×１００％として計算した。
【００６７】
ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングで求めた担癌マウスにおける６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの局在化（図６）に続いて、マウスの断頭後回収した血液、肝臓、及び腎臓の試料の放射能測定を行った。２．０ＭＢｑ（比放射能１２〜２０ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦ投与３０分後の担癌マウスの画像を、図６の左側に示す。ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングの評価結果を、血液、肝臓及び腎臓試料の放射能測定と相関させた。右左の脚の腫瘍はいずれも周辺のバックグラウンドから明瞭なコントラストで視認できた。肝臓及び腎臓で顕著な取込みが観察され、膀胱を通しての放射能のクリアランスが歴然であった（図７）。腫瘍及び唾液腺への分布は比較的遅かった。ｍｉｃｒｏＰＥＴ及び体内分布実験で得られた取込みデータは、イメージング後の組織サンプリングで得られたデータと一致し、対照できることが判明した。
【００６８】
具体的な実施形態、参照文献
本発明の技術的範囲は本明細書に記載した特定の実施形態によって限定されるものではない。実際、本明細書の以上の記載から当業者には本明細書に記載した変更例以外の変更例も明らかであろう。かかる変更例も特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。
【００６９】
本明細書では、様々な刊行物及び特許出願を引用したが、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】Ａ４３１癌腫（ａ）及びＵ３４３神経膠腫（ｂ）細胞系に対する６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの結合特異性を示す図。すべての時点で、対照細胞のＥＧＦ受容体は１００倍過剰量の非標識ＥＧＦで遮断した。結合を抑圧することができたことから、結合が特異的であることが分かる。図示したデータは３つの測定値の平均と標準偏差である。
【図２】培養癌腫Ａ４３１及び神経膠腫Ｕ３４３細胞への６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦの結合の飽和を示す図。それぞれ非特異的結合及び全結合量を得るため非標識ｈＥＧＦの存在下又は非存在下で、様々な濃度の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦ（Ａ４３１細胞では０．２６〜１６．９ｎＭ及びＵ３４３細胞では０．１４〜３６ｎＭ）と共に氷上で２時間インキュベートした。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０で解析した。すべてのデータポイントは３以上のデータポイントの平均であり、最大偏差も示す。
【図３】癌腫Ａ４３１細胞及び神経膠腫Ｕ３４３細胞に結合した後の６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの内部移行を示す図。内部移行は、異なる２つの時点での酸洗浄によって測定した。酸性緩衝液で細胞から除かれたものは膜結合型であり、その残りは内部移行したものと考えた。図示したデータは３つの測定値の平均と標準偏差である。
【図４】６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦでのＡ４３１（実線）及びＵ３４３（破線）のインキュベーションを中断した後の時間の関数としての細胞結合６８Ｇａ放射能を示す図。インキュベーション中断後時間０での細胞結合放射能を１００％とみなした。すべてのデータポイントは３つの測定値の平均と標準偏差である。Ａ４３１及びＵ３４３の細胞培養液はいずれも６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦで４時間インキュベートした。
【図５】図５Ａは、担癌ヌードマウスにおける３０分の時点での組織１グラム当りの注入量％として表される６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの体内分布の図である。図５Ｂは、担癌ヌードマウスにおける３０分の時点での６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの腫瘍対組織比を示す図である。マウスには、０．０１６ｎｍｏｌ又は０．１６ｎｍｏｌのいずれかの量の放射性トレーサーを静脈内注射した。データは平均±標準偏差（ｎ＝４）として示す。
【図６】図６左は、フレーム２０〜２４の相加を示す画像（ｘ−注入３０分後）である。頭の両側に腫瘍が明瞭に認められる。図６右はマウスの配置の写真である。
【図７】６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＥＧＦの（０．１６ｎｍｏｌ注入）の肝臓、腎臓及び腫瘍への急速な分布を示す薬物動態曲線である。尿中への排出が観測期間を通して継続する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性標識ガリウム錯体の標識合成方法であって、
（ａ）６８Ｇａ３＋放射性同位体を用意し、
（ｂ）６８Ｇａ３＋放射性同位体をマイクロ波活性化を用いてキレート剤と反応させ、
（ｃ）得られた放射性標識ガリウム錯体を回収する
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
キレート剤が大環状キレート剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
キレート剤が硬いドナー原子、好ましくはＯ原子及びＮ原子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
キレート剤が二官能性キレート剤である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
キレート剤が、ターゲティングベクターを含む二官能性キレート剤である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ターゲティングベクターがＥＧＦ又はその一部、断片、誘導体もしくは錯体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦがｈＥＧＦである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
マイクロ波活性化が８０〜１２０Ｗ、好ましくは９０〜１１０Ｗで実施される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
マイクロ波活性化が２０秒〜２分間、好ましくは３０秒〜９０秒間実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータからの溶出液を陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換体から６８Ｇａ３＋を溶出することによって６８Ｇａ３＋を得る、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータが、二酸化チタンを含むカラムを備える、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記陰イオン交換体がＨＣＯ３−を対イオンとして含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換体が強陰イオン交換体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法で合成される放射性標識ガリウム錯体。
【請求項１５】
式６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧを有する、請求項１４記載の放射性標識ガリウム錯体。
【請求項１６】
放射性標識ガリウム錯体をヒトに投与することを含んでなる、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージング方法であって、上記放射性標識ガリウム錯体がＰＥＴでイメージングできるものであり、ＰＥＴを行って腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出する方法。
【請求項１７】
前記放射性標識ガリウム錯体が６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦである、請求項１６記載の方法。
【請求項１】
放射性標識ガリウム錯体の標識合成方法であって、
（ａ）６８Ｇａ３＋放射性同位体を用意し、
（ｂ）６８Ｇａ３＋放射性同位体をマイクロ波活性化を用いてキレート剤と反応させ、
（ｃ）得られた放射性標識ガリウム錯体を回収する
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
キレート剤が大環状キレート剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
キレート剤が硬いドナー原子、好ましくはＯ原子及びＮ原子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
キレート剤が二官能性キレート剤である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
キレート剤が、ターゲティングベクターを含む二官能性キレート剤である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ターゲティングベクターがＥＧＦ又はその一部、断片、誘導体もしくは錯体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦがｈＥＧＦである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
マイクロ波活性化が８０〜１２０Ｗ、好ましくは９０〜１１０Ｗで実施される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
マイクロ波活性化が２０秒〜２分間、好ましくは３０秒〜９０秒間実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータからの溶出液を陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換体から６８Ｇａ３＋を溶出することによって６８Ｇａ３＋を得る、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータが、二酸化チタンを含むカラムを備える、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記陰イオン交換体がＨＣＯ３−を対イオンとして含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換体が強陰イオン交換体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法で合成される放射性標識ガリウム錯体。
【請求項１５】
式６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧを有する、請求項１４記載の放射性標識ガリウム錯体。
【請求項１６】
放射性標識ガリウム錯体をヒトに投与することを含んでなる、腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現のイメージング方法であって、上記放射性標識ガリウム錯体がＰＥＴでイメージングできるものであり、ＰＥＴを行って腫瘍におけるＥＧＦＲ過剰発現を検出する方法。
【請求項１７】
前記放射性標識ガリウム錯体が６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｈＥＧＦである、請求項１６記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５３１９８８（Ｐ２００８−５３１９８８Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５７２５（Ｐ２００７−５５５７２５）
【出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００３４５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９０２３２
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（３０５０４０７１０）ジーイー・ヘルスケア・リミテッド (99)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００３４５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９０２３２
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（３０５０４０７１０）ジーイー・ヘルスケア・リミテッド (99)
【Ｆターム（参考）】
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