放射性物質を用いたリン酸化阻害活性の検出方法
【課題】簡便な方法による、創薬スクリーニングのためのハイスループット対応も可能であるＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験のための評価系を提供する。
【解決手段】ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなるチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を放射性物質（ＲＩ）により検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法。
【解決手段】ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなるチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を放射性物質（ＲＩ）により検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性物質（以下、ＲＩとも示す。）を用いたリン酸化阻害活性の検出方法に関する。より詳細には、ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなるチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化をＲＩにより検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。なかでも、ポストゲノムの中にあっては、蛋白質の翻訳後修飾、特にリン酸化の解析は蛋白質の活性調節、機能調節を詳細に解明するうえで重要である。
【０００３】
既に報告されている関連技術として、例えばＳＰＯＴ技術によりセルロースメンブラン上で直接ペプチドを合成し、その後チップ上に固定化する技術が知られている。この技術を利用して、ｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光物質もしくは放射性物質を用いてキナーゼ活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、同様の技術で作製されたペプチドアレイを用いて、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示すこともある。）やＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ キナーゼ６（ＮＥＫ６）などの活性を、放射性物質を用いてアッセイしたことについての報告（例えば、非特許文献２及び３参照）もある。その他、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドを固定化し、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献４参照）もある。しかしながら、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。あるいは抗体を用いる方法の場合には、そのコストや要求特性が十分なものでないなどの課題があり、必ずしも満足なものであるとは言い難いのが実情である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３，３１５，２００２
【非特許文献２】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ４３，２６７１，２００４
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １，２７，２００４
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７，２７８３９，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、簡便な方法による、創薬スクリーニングのためのハイスループット対応も可能であるＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験のための評価系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなる金表面を有するチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を、放射性物質を用いる方法により検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法。
（２）放射性物質の核種が３２Ｐもしくは３３Ｐであることを特徴とする（１）のリン酸化阻害活性の検出方法。
（３）放射性物質を用いる方法がオートラジオグラフィである（１）又は（２）のリン酸化阻害活性の検出方法。
（４）ペプチドもしくは蛋白質がチオール基を介してチップ上に固定化されていることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
（５）アミノ酸が３０残基以下のペプチドがチップ上に固定化されていることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
（６）該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物がペプチドもしくは蛋白質であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
（７）該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物が分子量２０００以下の低分子化合物であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明における特にＲＩを用いたアレイ解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験のための測定系を得ることができる。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点も有用である。特に製薬業界に対して、キナーゼ阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＲＩを用いて、金表面を有するアレイを用いた解析によりＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験を行うことを特徴とする。ＲＩを用いることにより、リン酸化反応を直接的にモニターすることができるうえに、感度、特異性の両面で優れた検出系を得ることができる。更に金表面を用いることで、一般的なガラス表面を用いるよりも、表面修飾が容易であり、非特異的な影響も低減されやすいという優位性がある。
【０００９】
本発明において用いられる基板表面の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類も挙げられる。透明なガラスは容易に入手しやすく、汎用性の点でも有利である。ガラス基板を用いる場合、ガラスの種類や基板の厚さは特に限定されるものではないが、厚さとしては０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度の基板が用いられる。大きさや形状に関しても特に限定されるものではないが、通常市販されているスライドグラスのようなものを用いてもよい。
【００１０】
金属基板を形成する方法としては、金薄層をコーティングする方法が好ましい。金をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００１１】
本発明においては、ペプチドもしくは蛋白質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチドもしくは蛋白質は、プロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものを少なくとも１つ、好ましくは異なる種類のプロテインキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列のものを複数種が用いられる。更には、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはネガティブコントロールも同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に、リン酸化部位がチロシン残基の場合はフェニルアラニン残基に置換されたものが好ましい。合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。ここでペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、３０残基以下が好ましく、１０〜２５残基程度がより好ましい。
【００１２】
本発明のペプチドアレイにおけるペプチドの固定化方法は特に限定されるものではなく、ペプチド配列におけるアミノ基やチオール基を介した方法、Ｈｉｓタグを用いる方法などが挙げられる。この中では、特にチオール基を介してペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。
【００１３】
固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００１４】
また、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものを用いてもよい。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
【００１５】
本発明において、チオール基を介してペプチドを固定化する場合、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチドの固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
上述したような低分子量化合物を適用することにより、特に高分子量の物質を架橋剤として用いる場合と比べて、ペプチドのチップへの固定化効率が格段に高くなるため標的物質との結合効率も向上して、結合によるシグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる点で有利である。しかしながら、本発明において架橋剤の種類は、特にこれらに限定されるものではない。
【００１９】
上記ＳＭＣＣもしくはＳＳＭＣＣをチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、ＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスクシンイミド基あるいはＳＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有する硫酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
【００２０】
本発明のペプチドアレイは、ペプチドの固定化されていない部分（バックグラウンド部）が、式（ＩＩＩ）に示すような化合物によりコーティングされていることを特徴とするものである。式（ＩＩＩ）においてｍは１〜２０の整数、ｎは１〜１０の整数を示す。ｍの値は、２〜１０の範囲がより好ましく、４〜８の範囲が更に好ましい。ｎの値は、２〜８の範囲がより好ましく、３〜６の範囲が更に好ましい。この化合物によりバックグラウンド部をコーティングすることにより、バックグラウンド部における非特異的吸着を非常に効果的に抑制することが実現される。また、本発明のペプチドアレイは、基板の製造ロットや処理条件などの様々な変動要因に依存されるデータの再現性も向上し、非常に安定な測定データを得ることが可能である。
【００２１】
【化３】
【００２２】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体が好適に用いられる。
【００２３】
本発明は、ＲＩを用いたリン酸化阻害活性の検出を目的とする。ＲＩの核種としては、３２Ｐもしくは３３Ｐが挙げられるが、感度、半減期がやや長めで試薬自体の安定性の点からは３３Ｐがより好ましい。上述のようにして得られたアレイ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。
【００２４】
例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中にすでに含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ）を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。この場合、ＡＴＰとしてはＲＩ標識されたものが用いられる。例えば。γ３２Ｐ−ＡＴＰ、γ３３Ｐ−ＡＴＰが挙げられる。試薬の安定性の点では、γ３３Ｐ−ＡＴＰがより好ましい。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、ペプチドもしくは蛋白質をリン酸化することができる。必要に応じて反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。
【００２５】
アレイ上のリン酸化の検出には、オートラジオグラフィを行うのが効果的である。リン酸化反応を行ったアレイを十分に洗浄した後、乾燥させて専用のフイルムやシートへの露光処理を行い、専用のイメージリーダーにより解析することができる。この方法は抗体などを用いる検出系に対して、直接的にリン酸の取り込みを観察することができる点で非常に有用な手法である。また、感度や特異性の観点からも最も優れた方法である。
【００２６】
共存される阻害剤は特に限定されるものではないが、ペプチドもしくは蛋白質であってもよいし、その他の低分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、分子量２０００以下のものが挙げられるが特に制約されない。
【００２７】
上述のように、本発明によりＯｎ−ｃｈｉｐでリン酸化反応を行うことにより、プロテインキナーゼ活性のプロファイリングによる網羅的な解析を行うことができる。特に阻害活性をモニターすることにより、創薬のスクリーニングに有用な技術を提供することが実現される。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
（アレイの作製）
式（ＩＶ）に示すような、末端官能基がチオール基である直鎖型チオールＰＥＧ試薬（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＳＰＴ−００１１）を１ｍＭの濃度でエタノール７ｍｌに溶解させた。直鎖型チオールＰＥＧの分子量は３３６．５４である。特に、金に対する金属結合性を示す。
【００３０】
【化４】
【００３１】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記直鎖型ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００３２】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００３３】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００３４】
上記のようにして得られた表面に、図１に示したように、ＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）の基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１）、ＰＫＡ基質のネガティブコントロール（配列番号２；セリン残基がアラニン残基に置換）、ＰＫＡ基質のポジティブコントロール（配列番号１のセリン残基がリン酸化）、ｃＳｒｃキナーゼの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号３）、ｃＳｒｃキナーゼ基質のポジティブコントロール（配列番号３のチロシン残基がリン酸化；配列番号５）を、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）スポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００３５】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００３６】
［実施例２］
（オートラジオグラフィによるＰＫＡリン酸化の阻害活性の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイ上を用いてＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃、１時間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７８μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、γ３３Ｐ−ＡＴＰ（５０μＣｉ／ｍｌ；アマシャムバイオサイエンス製）１μｌとした。その際に、ＰＫＡ阻害剤ペプチドとして、ＰＫＩ ６−２２ Ａｍｉｄｅ，ＰＫＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）を共存させて、リン酸化の阻害効果を検討した。共存濃度は１０−８Ｍ，１０−６Ｍ，１０−４Ｍで検討した。該阻害剤のアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
【００３７】
その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、オートラジオグラフィによる各固定化基質におけるＲＩの取り込みの読み取りを、ＢＡＳ−１８００ＩＩ（富士写真フイルム製）を用いて行った。露光は装置専用のシート（富士写真フイルム製ＳＧイメージングプレート）を用いて３０分間実施した。その結果を図２に示した。
【００３８】
図２に矢印で示したように、ＰＫＩの共存濃度が増すとともに、ＰＫＡの基質ペプチド（図１におけるＮｏ．１）におけるＲＩの取り込みのみが弱くなる様子が確認されている。図３には定量化した結果を示した。定量化は上記装置の専用解析ソフトイェアを用いて行ったものである。ＰＫＩ非添加におけるＮｏ．１の基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みを１００％として、ＰＫＩが共存する場合の同基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みの比率をグラフにしたものであり、ＰＫＩ共存濃度に依存してリン酸化の阻害がされている様子が認められている。
【００３９】
［実施例３］
実施例１と同様のアレイを作製して、ＰＫＡ阻害剤をＰＫＡ Ｈｅａｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｉｓｏｆｏｒｍ α（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）に変更する以外は実施例２と同様にして、ＰＫＡリン酸化の阻害活性の検出を検討した。この阻害剤は蛋白質であり、アミノ酸配列は配列番号５に示す通りである。共存濃度は、１０−４，１０−３，１０−２Ｕｎｉｔ/μｌとした。実施例２の場合と同様に、阻害剤が非添加におけるＮｏ．１の基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みを１００％として、ＰＫＡ Ｈｅａｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｉｓｏｆｏｒｍ αが共存する場合の同基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みの比率をグラフにした結果を図４に示した。この場合も、阻害剤の共存濃度に依存してリン酸化の阻害がされている様子が認められる。
【００４０】
［実施例４］
実施例１と同様のアレイを作製して、ＰＫＡ阻害剤をＨ−８９（Ｎ−［２−（ｐ−Ｂｒｏｍｏｃｉｎｎａｍｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ， Ｄｉ−ＨＣｌ Ｓａｌｔ；Ｂｉｏｍｏｌ製）に変更する以外は実施例２と同様にして、ＰＫＡリン酸化の阻害活性の検出を検討した。この阻害剤の構造は式（Ｖ）に示す通りである。共存濃度は、１０−８Ｍ，１０−６Ｍ，１０−４Ｍで検討した。
【００４１】
【化５】
【００４２】
実施例２の場合と同様に、阻害剤が非添加におけるＮｏ．１の基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みを１００％として、Ｈ−８９が共存する場合の同基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みの比率をグラフにした結果を図５に示した。この場合も、阻害剤の共存濃度に依存してリン酸化の阻害がされている様子が認められる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１において作製したペプチドアレイにおける各固定化ペプチドの配置を示す図である。
【図２】実施例２において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＰＫＩの共存により阻害を受ける様子をオートラジオグラフィにより観察した結果を示す図である。
【図３】実施例２において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＰＫＩの共存により阻害を受ける様子を、オートラジオグラフィによるＲＩ取り込み量の変化により示した図である。
【図４】実施例３において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＰＫＡ Ｈｅａｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｉｓｏｆｏｒｍ αの共存により阻害を受ける様子を、オートラジオグラフィによるＲＩ取り込み量の変化により示した図である。
【図５】実施例４において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＨ−８９の共存により阻害を受ける様子を、オートラジオグラフィによるＲＩ取り込み量の変化により示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性物質（以下、ＲＩとも示す。）を用いたリン酸化阻害活性の検出方法に関する。より詳細には、ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなるチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化をＲＩにより検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。なかでも、ポストゲノムの中にあっては、蛋白質の翻訳後修飾、特にリン酸化の解析は蛋白質の活性調節、機能調節を詳細に解明するうえで重要である。
【０００３】
既に報告されている関連技術として、例えばＳＰＯＴ技術によりセルロースメンブラン上で直接ペプチドを合成し、その後チップ上に固定化する技術が知られている。この技術を利用して、ｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光物質もしくは放射性物質を用いてキナーゼ活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、同様の技術で作製されたペプチドアレイを用いて、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示すこともある。）やＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ キナーゼ６（ＮＥＫ６）などの活性を、放射性物質を用いてアッセイしたことについての報告（例えば、非特許文献２及び３参照）もある。その他、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドを固定化し、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献４参照）もある。しかしながら、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。あるいは抗体を用いる方法の場合には、そのコストや要求特性が十分なものでないなどの課題があり、必ずしも満足なものであるとは言い難いのが実情である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３，３１５，２００２
【非特許文献２】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ４３，２６７１，２００４
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １，２７，２００４
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７，２７８３９，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、簡便な方法による、創薬スクリーニングのためのハイスループット対応も可能であるＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験のための評価系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなる金表面を有するチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を、放射性物質を用いる方法により検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法。
（２）放射性物質の核種が３２Ｐもしくは３３Ｐであることを特徴とする（１）のリン酸化阻害活性の検出方法。
（３）放射性物質を用いる方法がオートラジオグラフィである（１）又は（２）のリン酸化阻害活性の検出方法。
（４）ペプチドもしくは蛋白質がチオール基を介してチップ上に固定化されていることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
（５）アミノ酸が３０残基以下のペプチドがチップ上に固定化されていることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
（６）該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物がペプチドもしくは蛋白質であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
（７）該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物が分子量２０００以下の低分子化合物であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかのリン酸化阻害活性の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明における特にＲＩを用いたアレイ解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験のための測定系を得ることができる。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点も有用である。特に製薬業界に対して、キナーゼ阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＲＩを用いて、金表面を有するアレイを用いた解析によりＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの阻害試験を行うことを特徴とする。ＲＩを用いることにより、リン酸化反応を直接的にモニターすることができるうえに、感度、特異性の両面で優れた検出系を得ることができる。更に金表面を用いることで、一般的なガラス表面を用いるよりも、表面修飾が容易であり、非特異的な影響も低減されやすいという優位性がある。
【０００９】
本発明において用いられる基板表面の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類も挙げられる。透明なガラスは容易に入手しやすく、汎用性の点でも有利である。ガラス基板を用いる場合、ガラスの種類や基板の厚さは特に限定されるものではないが、厚さとしては０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度の基板が用いられる。大きさや形状に関しても特に限定されるものではないが、通常市販されているスライドグラスのようなものを用いてもよい。
【００１０】
金属基板を形成する方法としては、金薄層をコーティングする方法が好ましい。金をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００１１】
本発明においては、ペプチドもしくは蛋白質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチドもしくは蛋白質は、プロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものを少なくとも１つ、好ましくは異なる種類のプロテインキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列のものを複数種が用いられる。更には、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはネガティブコントロールも同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に、リン酸化部位がチロシン残基の場合はフェニルアラニン残基に置換されたものが好ましい。合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。ここでペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、３０残基以下が好ましく、１０〜２５残基程度がより好ましい。
【００１２】
本発明のペプチドアレイにおけるペプチドの固定化方法は特に限定されるものではなく、ペプチド配列におけるアミノ基やチオール基を介した方法、Ｈｉｓタグを用いる方法などが挙げられる。この中では、特にチオール基を介してペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。
【００１３】
固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００１４】
また、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものを用いてもよい。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
【００１５】
本発明において、チオール基を介してペプチドを固定化する場合、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチドの固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
上述したような低分子量化合物を適用することにより、特に高分子量の物質を架橋剤として用いる場合と比べて、ペプチドのチップへの固定化効率が格段に高くなるため標的物質との結合効率も向上して、結合によるシグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる点で有利である。しかしながら、本発明において架橋剤の種類は、特にこれらに限定されるものではない。
【００１９】
上記ＳＭＣＣもしくはＳＳＭＣＣをチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、ＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスクシンイミド基あるいはＳＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有する硫酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
【００２０】
本発明のペプチドアレイは、ペプチドの固定化されていない部分（バックグラウンド部）が、式（ＩＩＩ）に示すような化合物によりコーティングされていることを特徴とするものである。式（ＩＩＩ）においてｍは１〜２０の整数、ｎは１〜１０の整数を示す。ｍの値は、２〜１０の範囲がより好ましく、４〜８の範囲が更に好ましい。ｎの値は、２〜８の範囲がより好ましく、３〜６の範囲が更に好ましい。この化合物によりバックグラウンド部をコーティングすることにより、バックグラウンド部における非特異的吸着を非常に効果的に抑制することが実現される。また、本発明のペプチドアレイは、基板の製造ロットや処理条件などの様々な変動要因に依存されるデータの再現性も向上し、非常に安定な測定データを得ることが可能である。
【００２１】
【化３】
【００２２】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体が好適に用いられる。
【００２３】
本発明は、ＲＩを用いたリン酸化阻害活性の検出を目的とする。ＲＩの核種としては、３２Ｐもしくは３３Ｐが挙げられるが、感度、半減期がやや長めで試薬自体の安定性の点からは３３Ｐがより好ましい。上述のようにして得られたアレイ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。
【００２４】
例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中にすでに含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ）を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。この場合、ＡＴＰとしてはＲＩ標識されたものが用いられる。例えば。γ３２Ｐ−ＡＴＰ、γ３３Ｐ−ＡＴＰが挙げられる。試薬の安定性の点では、γ３３Ｐ−ＡＴＰがより好ましい。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、ペプチドもしくは蛋白質をリン酸化することができる。必要に応じて反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。
【００２５】
アレイ上のリン酸化の検出には、オートラジオグラフィを行うのが効果的である。リン酸化反応を行ったアレイを十分に洗浄した後、乾燥させて専用のフイルムやシートへの露光処理を行い、専用のイメージリーダーにより解析することができる。この方法は抗体などを用いる検出系に対して、直接的にリン酸の取り込みを観察することができる点で非常に有用な手法である。また、感度や特異性の観点からも最も優れた方法である。
【００２６】
共存される阻害剤は特に限定されるものではないが、ペプチドもしくは蛋白質であってもよいし、その他の低分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、分子量２０００以下のものが挙げられるが特に制約されない。
【００２７】
上述のように、本発明によりＯｎ−ｃｈｉｐでリン酸化反応を行うことにより、プロテインキナーゼ活性のプロファイリングによる網羅的な解析を行うことができる。特に阻害活性をモニターすることにより、創薬のスクリーニングに有用な技術を提供することが実現される。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
（アレイの作製）
式（ＩＶ）に示すような、末端官能基がチオール基である直鎖型チオールＰＥＧ試薬（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＳＰＴ−００１１）を１ｍＭの濃度でエタノール７ｍｌに溶解させた。直鎖型チオールＰＥＧの分子量は３３６．５４である。特に、金に対する金属結合性を示す。
【００３０】
【化４】
【００３１】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記直鎖型ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００３２】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００３３】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００３４】
上記のようにして得られた表面に、図１に示したように、ＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）の基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１）、ＰＫＡ基質のネガティブコントロール（配列番号２；セリン残基がアラニン残基に置換）、ＰＫＡ基質のポジティブコントロール（配列番号１のセリン残基がリン酸化）、ｃＳｒｃキナーゼの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号３）、ｃＳｒｃキナーゼ基質のポジティブコントロール（配列番号３のチロシン残基がリン酸化；配列番号５）を、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）スポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００３５】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００３６】
［実施例２］
（オートラジオグラフィによるＰＫＡリン酸化の阻害活性の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイ上を用いてＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃、１時間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７８μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、γ３３Ｐ−ＡＴＰ（５０μＣｉ／ｍｌ；アマシャムバイオサイエンス製）１μｌとした。その際に、ＰＫＡ阻害剤ペプチドとして、ＰＫＩ ６−２２ Ａｍｉｄｅ，ＰＫＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）を共存させて、リン酸化の阻害効果を検討した。共存濃度は１０−８Ｍ，１０−６Ｍ，１０−４Ｍで検討した。該阻害剤のアミノ酸配列は配列番号４に示す通りである。
【００３７】
その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、オートラジオグラフィによる各固定化基質におけるＲＩの取り込みの読み取りを、ＢＡＳ−１８００ＩＩ（富士写真フイルム製）を用いて行った。露光は装置専用のシート（富士写真フイルム製ＳＧイメージングプレート）を用いて３０分間実施した。その結果を図２に示した。
【００３８】
図２に矢印で示したように、ＰＫＩの共存濃度が増すとともに、ＰＫＡの基質ペプチド（図１におけるＮｏ．１）におけるＲＩの取り込みのみが弱くなる様子が確認されている。図３には定量化した結果を示した。定量化は上記装置の専用解析ソフトイェアを用いて行ったものである。ＰＫＩ非添加におけるＮｏ．１の基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みを１００％として、ＰＫＩが共存する場合の同基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みの比率をグラフにしたものであり、ＰＫＩ共存濃度に依存してリン酸化の阻害がされている様子が認められている。
【００３９】
［実施例３］
実施例１と同様のアレイを作製して、ＰＫＡ阻害剤をＰＫＡ Ｈｅａｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｉｓｏｆｏｒｍ α（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）に変更する以外は実施例２と同様にして、ＰＫＡリン酸化の阻害活性の検出を検討した。この阻害剤は蛋白質であり、アミノ酸配列は配列番号５に示す通りである。共存濃度は、１０−４，１０−３，１０−２Ｕｎｉｔ/μｌとした。実施例２の場合と同様に、阻害剤が非添加におけるＮｏ．１の基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みを１００％として、ＰＫＡ Ｈｅａｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｉｓｏｆｏｒｍ αが共存する場合の同基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みの比率をグラフにした結果を図４に示した。この場合も、阻害剤の共存濃度に依存してリン酸化の阻害がされている様子が認められる。
【００４０】
［実施例４］
実施例１と同様のアレイを作製して、ＰＫＡ阻害剤をＨ−８９（Ｎ−［２−（ｐ−Ｂｒｏｍｏｃｉｎｎａｍｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ， Ｄｉ−ＨＣｌ Ｓａｌｔ；Ｂｉｏｍｏｌ製）に変更する以外は実施例２と同様にして、ＰＫＡリン酸化の阻害活性の検出を検討した。この阻害剤の構造は式（Ｖ）に示す通りである。共存濃度は、１０−８Ｍ，１０−６Ｍ，１０−４Ｍで検討した。
【００４１】
【化５】
【００４２】
実施例２の場合と同様に、阻害剤が非添加におけるＮｏ．１の基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みを１００％として、Ｈ−８９が共存する場合の同基質ペプチドにおけるＲＩの取り込みの比率をグラフにした結果を図５に示した。この場合も、阻害剤の共存濃度に依存してリン酸化の阻害がされている様子が認められる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１において作製したペプチドアレイにおける各固定化ペプチドの配置を示す図である。
【図２】実施例２において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＰＫＩの共存により阻害を受ける様子をオートラジオグラフィにより観察した結果を示す図である。
【図３】実施例２において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＰＫＩの共存により阻害を受ける様子を、オートラジオグラフィによるＲＩ取り込み量の変化により示した図である。
【図４】実施例３において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＰＫＡ Ｈｅａｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｉｓｏｆｏｒｍ αの共存により阻害を受ける様子を、オートラジオグラフィによるＲＩ取り込み量の変化により示した図である。
【図５】実施例４において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化がＨ−８９の共存により阻害を受ける様子を、オートラジオグラフィによるＲＩ取り込み量の変化により示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなる金表面を有するチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を、放射性物質を用いる方法により検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項２】
放射性物質の核種が３２Ｐもしくは３３Ｐであることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項３】
放射性物質を用いる方法がオートラジオグラフィである請求項１又は２に記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項４】
ペプチドもしくは蛋白質がチオール基を介してチップ上に固定化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項５】
アミノ酸が３０残基以下のペプチドがチップ上に固定化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項６】
該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物がペプチドもしくは蛋白質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項７】
該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物が分子量２０００以下の低分子化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項１】
ペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなる金表面を有するチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該ペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を、放射性物質を用いる方法により検出するに際し、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることを特徴とするリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項２】
放射性物質の核種が３２Ｐもしくは３３Ｐであることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項３】
放射性物質を用いる方法がオートラジオグラフィである請求項１又は２に記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項４】
ペプチドもしくは蛋白質がチオール基を介してチップ上に固定化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項５】
アミノ酸が３０残基以下のペプチドがチップ上に固定化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項６】
該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物がペプチドもしくは蛋白質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【請求項７】
該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物が分子量２０００以下の低分子化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリン酸化阻害活性の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−６８５０９（Ｐ２００７−６８５０９Ａ）
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６２０３９（Ｐ２００５−２６２０３９）
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１４年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ゲノム研究成果産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１４年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ゲノム研究成果産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]