放射線照射コラーゲン様ペプチドを用いた核酸導入法
【課題】核酸を細胞内へ効率的に導入する手段を提供する。
【解決手段】放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体、並びに放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物。
【解決手段】放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体、並びに放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞内へ効率的に導入する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾病に関与する遺伝子の機能を補う、あるいは抑えることによって疾病を治療する、いわゆる遺伝子治療が注目を集めており、既に種々の遺伝子疾患やガン等において、遺伝子治療の臨床研究が行われている。ここで、遺伝子治療に用いられる医薬として実用化が期待されているものとして、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する核酸医薬が挙げられる。
【０００３】
ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡにより引き起こされる、配列特異的な遺伝子発現抑制現象であり、二本鎖ＲＮＡのいずれかの配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡが特異的に分解されることに基づく。すなわち、生体内に導入された二本鎖ＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩに属するＤｉｃｅｒと呼ばれる酵素により、２１塩基程度の短い３’末端突出型の二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に分解される。生じたｓｉＲＮＡは、一本鎖に解離して、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ））に取り込まれ、取り込まれた一本鎖と相補的な配列を有するｍＲＮＡが特異的に分解されると言われている。ＲＮＡ干渉は、生体内のさまざまな局面で重要な役割を担っていると考えられ、例えば、ウイルス感染に対する防御機構や、ゲノム上を転移する遺伝因子であるレトロトランスポゾンの転移を抑制し、ゲノムの安定性を保つことにも関わっているようである。
【０００４】
ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子に対する高い特異性を有し、任意の遺伝子の機能を人為的に抑制できることから、遺伝子機能解析の汎用性の高いツールとして注目され、また、遺伝子治療への応用が期待されている。
【０００５】
ここで、ＲＮＡ干渉を臨床応用するために解決しなければならない課題の１つは、ｓｉＲＮＡの生体内への導入法の開発である。すなわち、ｓｉＲＮＡ単独では、細胞膜を抜けて細胞質には導入されない。これは、ｓｉＲＮＡの高い分子量と、核酸の主鎖を構成するリン酸基に基づく強い負電荷が原因である。ｓｉＲＮＡを細胞内に導入する方法としては、エレクトロポレーションによる方法、及びリポソーム、特に正電荷リポソームをキャリアとして利用する方法等が知られている。また、その他にも、コラーゲン又はコラーゲン誘導体をキャリアとして利用し、核酸との複合体を形成させることを特徴とする、核酸の細胞内への効率的な導入技術が既に知られている（特許文献１）。
【０００６】
生体内及び生体外で効率的な遺伝子発現抑制を達成するための有望なｓｉＲＮＡ導入キャリアの１つはアテロコラーゲン（ＡＴＣＯＬ）である（非特許文献１）。ＡＴＣＯＬは、ウシ真皮から得られたＩ型コラーゲンをペプシンにより処理し高純度に精製すること等により得られる。コラーゲン分子は、Ｎ、Ｃ両末端にコラーゲンの主要抗原部位であるテロペプチドを有するが、ＡＴＣＯＬは、ペプシン処理によりテロペプチドが除去されており、免疫原性が低く抑えられている。そのため、ＡＴＣＯＬは、生体適合性の高い生体材料であり、創傷治療、人工血管、代用軟骨、止血剤等の広範囲の用途で、臨床上利用されている。
【０００７】
本発明者らは、骨格筋の成長を抑制する因子をコードするミオスタチンをターゲットとするｓｉＲＮＡをＡＴＣＯＬとともにマウスの骨格筋に導入することで、導入から数週間後には筋量が顕著に増大したことを報告しており、ＡＴＣＯＬは核酸の細胞内への導入を促進することが明らかとなっている（非特許文献２）。
【０００８】
以上のように、核酸を細胞内へ導入する技術はこれまでに知られているが、コラーゲン様ペプチドを導入キャリアとして用いる核酸の導入法は知られていない。コラーゲン様ペプチドについては、例えば、特許文献２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０３／０００２９７号
【特許文献２】特開２００５−０５３８７８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２００４； ３２： ｅ１０９
【非特許文献２】ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）２００８； １５： １１２６−１１３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、核酸を細胞内へ効率的に導入する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、コラーゲン様ペプチドの性質を詳細に検討した結果、放射線を照射したコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内への導入キャリアとして利用することで、核酸を効率的に細胞内に導入できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の通りである。
【００１４】
第１の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、導入促進剤である。第１の発明の好ましい態様において、コラーゲン様ペプチドは、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である。また、第１の発明の好ましい態様において、放射線は電子線である。また、第１の発明の好ましい態様において、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【００１５】
第２の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、複合体である。第２の発明におけるコラーゲン様ペプチド、放射線、及び核酸の好ましい態様は、第１の発明と同様である。
【００１６】
第３の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、医薬組成物である。第３の発明におけるコラーゲン様ペプチド、放射線、及び核酸の好ましい態様は、第１の発明と同様である。
【００１７】
第４の発明は、第２の発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する医療用又は実験用器具である。
【００１８】
第５の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、方法である。第５の発明におけるコラーゲン様ペプチド、放射線、及び核酸の好ましい態様は、第１の発明と同様である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に用いられるコラーゲン様ペプチドは、核酸を細胞内へ導入する際の導入キャリアとして機能する。よって、本発明により、任意の核酸を効率的に細胞内に導入することができる。また、核酸として、特にｓｉＲＮＡを用いることで、ＲＮＡ干渉により特定の遺伝子を効率的にノックダウンできる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡと各導入キャリアとの複合体を形成した際の、ＲＮａｓｅＡ共存下でのｓｉＲＮＡ残存量の推移を示すグラフである。
【図２】図２は、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡのそれぞれと各導入キャリアとの複合体を形成して細胞に導入した際の、ルシフェラーゼの発現量（発光強度）を示すグラフである。結果は、平均値±標準誤差で示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ミオスタチンｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡのそれぞれをＳＹＣＯＬと複合体を形成させて咬筋に投与した際の、咬筋の重量を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、同条件での、咬筋におけるミオフィブリル（筋原線維）の断面積を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、同条件での、咬筋におけるミオスタチンｍＲＮＡの量を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＧＬ３ｓｉＲＮＡと各導入キャリアとの複合体を形成してマウス頭部に投与した際の、頭部におけるルシフェラーゼの発現量（発光強度）を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、同条件での、腹部におけるルシフェラーゼの発現量（発光強度）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明において、コラーゲン様ペプチドは、核酸を細胞内に導入するためのキャリア（輸送担体）として用いられる。すなわち、本発明の核酸を細胞内に導入する方法は、コラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする。
【００２３】
本発明において用いられるコラーゲン様ペプチドとは、機能性ペプチドとしてアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ（以下、配列Ａとも言う）からなるペプチドユニットを含むペプチドである。配列Ａは後述する３重らせん構造の安定性に寄与し、配列Ａの割合が少ないと３重らせん構造の安定性が減少する。ここで、ＸはＰｒｏ又はＨｙｐであり、３重らせん構造の安定性の点からＨｙｐであるのが好ましい。なお、Ｈｙｐは、通常、４Ｈｙｐ（例えば、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）残基である。コラーゲン様ペプチドは、（−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−）nで表される繰り返し構造を含み、よって、好ましくは（−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−）nで表される繰り返し構造を含む。すなわち、コラーゲン様ペプチドの一態様は、（−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−）nからなるポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である。なお、（−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−）nで表される繰り返し構造において、それぞれのＸは独立にＰｒｏ又はＨｙｐであってよい。繰り返し数ｎは、目的の分子量や、共存する配列に応じて適宜設定することができる。繰り返し数ｎは、例えば１０〜５００００であり、２０〜５０００であるのが好ましく、２００〜４０００であるのがより好ましい。
【００２４】
また、コラーゲン様ペプチドは、機能性ペプチドを含有させることにより機能設計が可能である。例えば、コラーゲン様ペプチドを、特定の細胞や組織に対して特異的に取り込まれるよう改変することもできる。
【００２５】
コラーゲン様ペプチドに含有させることのできる機能性ペプチドとしては、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号２）（以下、配列Ｂとも言う）を含むペプチドが挙げられる。ここで、ＹはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであるのが好ましく、Ｇｌｎ又はＬｅｕであるのが特に好ましい。また、ＺはＩｌｅ又はＬｅｕであり、Ｉｌｅであるのが好ましい。配列Ｂの存在は、コラゲナーゼによるコラーゲン様ペプチドの分解性を向上させる。よって、配列Ｂの存在は、コラーゲン様ペプチドを導入キャリアとして用いて、生体内、例えば哺乳動物の生体内に核酸を導入する際に、コラーゲン様ペプチドが分解吸収されるのを補助する。
【００２６】
コラーゲン様ペプチドに含有させることのできるその他の機能性ペプチドとしては、例えば、コラーゲン様ペプチドが酵素分解されるのを抑制するアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒａ（配列番号２）、熱応答性を付与するアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号３）、細胞接着性を付与するアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、神経分化を促進するアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号４）及びＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒａ−Ｖａｌ（配列番号５）等が挙げられる。
【００２７】
配列Ａと配列Ｂの比率（モル比）は、例えばＡ：Ｂ＝１００：０〜３０：７０であり、１００：０〜５０：５０が好ましく、１００：０〜７０：３０がより好ましく、１００：０〜９０：１０がさらに好ましく、１００：０〜９５：５が特に好ましい。また、配列Ａと配列Ｂの合計量と、配列Ａ又はＢ以外のその他の機能性ペプチドの比率（モル比）は、例えばＡ＋Ｂ：Ａ＋Ｂ以外の機能性ペプチド＝１００：０〜５０：５０であり、１００：０〜７０：３０が好ましく、１００：０〜８０：２０がより好ましく、１００：０〜９０：１０がさらに好ましく、１００：０〜９５：５が特に好ましい。
【００２８】
また、コラーゲン様ペプチドは、核酸の細胞内への導入キャリアとしての機能を損なわない限り、その他の任意のアミノ酸配列を含んでいてもよい。その他の任意のアミノ酸配列の含有量は、コラーゲン様ペプチド全体に対して、例えばアミノ酸残基数として２０％以下であり、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下である。
【００２９】
また、コラーゲン様ペプチドは、上述のペプチドにさらに核酸等が付加されたペプチドであってもよい。
【００３０】
コラーゲン様ペプチドの分子量は、好ましくは５×１０3〜１×１０7、より好ましくは１×１０4〜１×１０6、より好ましくは１×１０5〜１×１０6である。例えば、本発明の一態様において、分子量１０5以上のコラーゲン様ペプチドを用いることができる。分子量は、高分子化合物の分子量を測定する一般的な方法で測定することができる。高分子化合物の分子量を測定する一般的な方法としては、例えば、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）が挙げられ、ＳＥＣとしては、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）が好適に用いられる。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより分子量を測定する場合の一態様としては、分離カラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（Ｉ．Ｄ．７．８ｍｍ ｘ Ｌ３０ｃｍ）（東ソー製）を、分子量標準として分子量既知のプルラン、デキストラン、又はポリエチレンオキサイド等を用い、緩衝液を移動相として測定が行われる。
【００３１】
コラーゲン様ペプチドは、その一態様において、三重らせん構造を形成し、当該三重らせん構造が複数集合し、直径１０ｎｍ〜３００ｎｍのコラーゲン原繊維を構成し、コラーゲン原繊維がさらに集合して、直径０．５ｎｍ〜３ｎｍのコラーゲン様繊維を形成する。
【００３２】
コラーゲン様ペプチドを製造する方法は特に限定されず、例えば、アミノ酸やペプチドを縮重合することにより製造できる。例えば、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなるトリペプチドを縮重合させることによりポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）を製造できる。なお、例えば、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）を製造する場合には、縮重合に用いられるトリペプチドはＨｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏや−ＧｌｙＰｒｏ−Ｈｙｐからなるトリペプチドであってもよいことは言うまでもない。ペプチドの縮重合は、公知の手法（特開２００５−５３８７８等）により行うことができる。また、目的の物性や目的の分子量に応じて、反応条件や共重合させる機能性ペプチドを適宜選択できる。機能性ペプチドを共重合させることにより、機能性の高分子としてコラーゲン様ペプチドを製造できる。
【００３３】
コラーゲン様ペプチドは、通常のコラーゲンのような免疫原性を示さないため、例えば医療用素材として優秀である。また、アミノ酸やペプチドの縮重合等の化学合成によりコラーゲン様ペプチドを製造した場合には、動物由来の成分を含まないことから、未知の病原体や病原因子による汚染の可能性がない点で好ましい。
【００３４】
本発明において、コラーゲン様ペプチドは、放射線を照射する処理をされて用いられる。コラーゲン様ペプチドは、放射線を照射する処理により、核酸を細胞内に導入するキャリアとしての機能を示すようになる。放射線を照射する処理の態様は特に限定されず、任意の手法により行うことができる。放射線を照射する処理に用いられる放射線の線量は特に限定されないが、例えば、好ましくは１ｋＧｙ以上、より好ましくは５ｋＧｙ以上、特に好ましくは１０ｋＧｙ以上の放射線が用いられる。また、放射線の線量の好ましい範囲としては、例えば、１〜１０００ｋＧｙ、５０〜５００ｋＧｙ、１０〜２００ｋＧｙ等が挙げられる。放射線としては、例えば電子線が好適に用いられる。放射線を照射する処理は、例えば、コラーゲン様ペプチドを含有する溶液に４０ｋＧｙの電子線を２分間照射することにより行うことができる。
【００３５】
本発明において、核酸は、特に限定されず、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、核酸は、ＤＮＡとＲＮＡの両方により複合的に構成されていてもよい。核酸は、１本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。また部分的に、１本鎖部分と二本鎖部分が共存していてもよい。また、核酸の配列は、特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。また、核酸は線状であってもよく、環状であってもよい。例えば、核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。また、本発明において、核酸には、核酸として機能するもの、例えばウイルスが含まれる。ウイルスとしては、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウイルスでもよい。また、本発明において、核酸は、任意の修飾がなされた核酸を含む。任意の修飾がなされた核酸を、まとめて、核酸誘導体と称する。核酸誘導体としては、蛍光標識された核酸等が挙げられる。本発明において、複数の態様の核酸が同時に存在していてもよく、複数の態様の核酸が同時に細胞内に導入されてもよい。
【００３６】
本発明において、核酸としては、ｓｉＲＮＡが特に好ましく用いられる。ｓｉＲＮＡとは、遺伝子のノックダウン、すなわち遺伝子発現の抑制に用いられる二本鎖ＲＮＡであり、その片方の鎖は、ノックダウン対象の遺伝子から転写されるｍＲＮＡの少なくとも一部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含む。ｓｉＲＮＡとしては、通常２１〜２７塩基程度の３’末端突出型の二本鎖ＲＮＡを用いる。また、３’末端は片側あるいは両側とも突出しない場合がある。
【００３７】
本発明において、コラーゲン様ペプチドは、核酸と複合体を形成することにより、核酸の細胞内導入キャリアとして機能する。
【００３８】
コラーゲン様ペプチドと核酸は、溶媒中で接触することにより、コラーゲン様ペプチド及び核酸を含む核酸／コラーゲン様ペプチド複合体（以下、単に複合体とも言う）を形成する。溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、緩衝液等の水系溶媒が好ましく用いられる。溶媒は、核酸が細胞内に導入されるのを阻害しない限り、任意の成分を含有していてよい。なお、コラーゲン様ペプチドと核酸を接触させ複合体を形成する工程は、特に限定されず、例えば、コラーゲン様ペプチドを含む溶液と核酸を含む溶液を混合することにより行われてもよく、コラーゲン様ペプチド及び核酸の一方を含む溶液にコラーゲン様ペプチド及び核酸のもう一方をさらに溶解させることにより行われてもよく、また、あらかじめコラーゲン様ペプチド及び核酸を混合したものを任意の溶媒に溶解することにより行われてもよい。
【００３９】
なお、複合体を形成するとは、コラーゲン様ペプチド及び核酸の少なくとも一部が核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成すればよい。よって、コラーゲン様ペプチド及び核酸の少なくとも一部は、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成せず、単独で存在していてもよい。
【００４０】
上記のように核酸とコラーゲン様ペプチドを含む核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成することで、任意の細胞に、核酸を効率よく導入することができる。核酸／コラーゲン様ペプチド複合体は細胞と混合すること等によって接触させることにより、あるいは、生体に投与することにより、細胞内に核酸が導入される。すなわち、本発明は、合成コラーゲンを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法を提供する。なお、当該方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで用いてもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いてもよい。また、特定の細胞や組織に特異的に取り込まれるよう改変されたコラーゲン様ペプチドを用いることで、特定の細胞や組織に特異的に核酸を導入することができる。
【００４１】
本発明において、コラーゲン様ペプチドと核酸の比率は、特に限定されず、コラーゲン様ペプチドの態様、核酸の態様、核酸を導入する細胞の態様、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体の存在態様等に応じて適宜設定できる。コラーゲン様ペプチドの濃度としては、細胞あるいは生体に導入する際の濃度として、０．００１％〜５％が好ましく、０．００５％〜２％がより好ましく、０．０１％〜１％が特に好ましい。コラーゲン様ペプチドは、例えば、０．０３％で用いることができる。核酸の濃度としては、核酸の態様、核酸を導入する細胞の態様、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体の存在態様等に応じて適宜設定できるが、例えば、０．０１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、０．１ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭが特に好ましい。例えば、終濃度１０ｍＭでｓｉＲＮＡを用いることができる。また、例えば核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を器具の表面に保持する態様においては、保持される核酸の量としては、核酸の態様、核酸を導入する細胞の態様等に応じて適宜設定できる。例えばアレイ化する場合には、保持される核酸の量が、ウェル当たり好ましくは０．１ｐｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、より好ましくは１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌとなるよう核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持させることができる。このような範囲濃度で核酸を保持するウェルに、例えば３．５ｘ１０4の細胞を播種することで、セルトランスフェクションアレイを行える。
【００４２】
本発明は、コラーゲン様ペプチドを有効成分として含む、核酸の細胞への導入促進剤を提供する。導入促進剤としては、コラーゲン様ペプチドを含む限り特に限定されず、核酸やコラーゲン様ペプチドの態様、及び導入促進剤の利用目的（例えば、疾患の治療に用いるのであれば対象となる疾患の態様等）等に応じて、適宜態様を設定できる。本発明の導入促進剤は、核酸と混合して用いることができる。核酸と混合することにより、少なくとも核酸が細胞内あるいは生体内等に導入される時点において、コラーゲン様ペプチド及び核酸は核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成する。
【００４３】
なお、本発明の導入促進剤は、その一実施態様において、さらに核酸を含んでいてもよい。本発明の導入促進剤が核酸を含む場合に、本発明の導入促進剤に含まれるコラーゲン様ペプチド及び核酸はそれぞれ別個に存在していてもよく、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成していてもよいが、少なくとも核酸が細胞内あるいは生体内等に導入される時点において、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成する。
【００４４】
本発明は、コラーゲン様ペプチド及び核酸を含む医薬組成物（以下、本発明の医薬とも言う）を提供する。本発明の医薬は、核酸及びコラーゲン様ペプチドを含む限り特に限定されず、核酸やコラーゲン様ペプチドの態様、対象となる疾患の態様等に応じて、適宜態様を設定できる。なお、本発明の医薬は、本発明の導入促進剤と核酸を混合することにより調製されたものであってもよい。本発明の医薬を投与することにより、本発明の医薬に含まれる核酸が、細胞内あるいは生体内等に導入される。本発明の医薬に含まれるコラーゲン様ペプチド及び核酸は、それぞれ別個に存在していてもよく、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成していてもよいが、少なくとも核酸が細胞内あるいは生体内等に導入される時点において、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成する。本発明の医薬を用いることにより、例えば任意の遺伝子の発現プラスミドを導入し、遺伝子機能を補うことができる。また、本発明の医薬を用いることにより、例えば任意の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、遺伝子発現を抑制することができる。よって、本発明の医薬により、任意の疾病について、遺伝子治療を行うことができる。
【００４５】
本発明の医薬の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。本発明の医薬は、そのまま、あるいは水、生理食塩水、緩衝液等を用いて希釈又は溶解し、細胞あるいは生体に投与できる。このように希釈あるいは溶解等した場合にも、本発明の医薬の範囲内であることは言うまでもない。なお、本発明の導入促進剤においても、本発明の医薬と同様の剤形や製剤担体を利用できる。また、本発明の導入促進剤においても、本発明の医薬と同様に、希釈あるいは溶解等した場合にも、本発明の導入促進剤の範囲内である。
【００４６】
本発明の医薬を生体に投与する方法としては、特に制限されず、例えば経口、注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚を介した吸収等の任意の方法により行うことができる。本発明の医薬を生体に投与する方法としては、経口又は注射が好ましい。投与部位は、対象とする疾患等に応じて適宜設定できる。また、本発明の医薬は、例えば、外科的手法により投与部位に直接留置することで使用されてもよい。
【００４７】
本発明の導入促進剤や本発明の医薬におけるコラーゲン様ペプチド及び核酸の濃度や比率は特に限定されないが、細胞に導入又は生体に投与する際に、上記の好ましい比率及び濃度範囲に収まるよう調整されるのが好ましい。
【００４８】
また、本発明は、本発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する器具を提供する。器具としては、特に限定されないが、例えば医療用器具及び実験用器具が挙げられる。器具としては、例えば、セルトランスフェクションアレイに用いられるプレートが挙げられる。セルトランスフェクションアレイとは、あらかじめ導入可能な状態の核酸を基板上にアレイ化しておき、そこに細胞を播種して、細胞内に取り込ませる手法である。よって、本発明の核酸を、基板上に、すなわち例えば細胞を播種するためのウェル上にアレイ化することができる。アレイ化は公知の手法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２００４； ３２： ｅ１０９、等）により行うことができる。こうして得られたアレイを用いることで、効率よく遺伝子機能の解析等を行うことができる。後述する実施例で示すように、固相表面に保持された核酸／コラーゲン様ペプチド複合体に細胞を接触させることで、核酸は細胞内に効率的に導入される。本発明で用いられるコラーゲン様ペプチドは、リポソームと比較し保存性が高く、コラーゲン様ペプチドを含む複合体を表面に保持した器具は、長期間の保存に耐え得る。また、本発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する器具とは、例えば、外科的手法等により生体内に留置され、本発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を徐々に放出するような器具であってもよい。
【００４９】
また、本発明に基づき核酸を効率的に細胞内に導入することで、遺伝子又はタンパク質の細胞内での機能を効率的に解析できる。例えば、機能を解析したい遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを細胞内に導入し、当該遺伝子を発現させることにより遺伝子の機能を解析することができる。また、機能を解析したい遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡやｓｉＲＮＡを細胞内に導入し、当該遺伝子の発現を抑制することにより遺伝子の機能を解析することができる。導入及び解析は、例えば、セルトランスフェクションアレイ技術によりハイスループットに行うことができる。
【００５０】
また、本発明に基づき核酸を効率的に細胞内に導入することで、種々の疾患、例えば遺伝子疾患、癌、ＡＩＤＳ、慢性関節リウマチ、生活習慣病等の治療に用いることのできる核酸医薬をスクリーニングできる。例えば、スクリーニングは、任意の病態を示す細胞に核酸を導入し、任意の遺伝子を発現させることにより、あるいは任意の遺伝子発現を抑制することにより、当該病態に与える効果を解析することにより行われる。導入及び解析は、例えば、セルトランスフェクションアレイ技術によりハイスループットに行うことができる。
【００５１】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
〔実施例１〕安定性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸の安定性に与える影響について評価した。
【００５３】
＜材料＞
核酸の細胞内への導入キャリアとしては、コラーゲン様ペプチド、及びＡＴＣＯＬを用いた。コラーゲン様ペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのアミノ酸配列からなるトリペプチドを縮重合して生産したポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）を、４０ｋＧｙの電子線を２分間照射して使用した。当該コラーゲン様ペプチドの分子量は１０5以上であった。なお、当該コラーゲン様ペプチドを、合成コラーゲン（ＳＹＣＯＬ）とも称する。当該コラーゲン様ペプチドは、チッソ株式会社より入手した。ＡＴＣＯＬは、株式会社高研より、生体内ｓｉＲＮＡ導入キットとして購入し、製造元の指示に従い使用した。
【００５４】
また、ＳＹＣＯＬ、ＡＴＣＯＬ以外の導入キャリアとして、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン製）を用いた。リポフェクタミン２０００は、正電荷リポソームを含む試薬であり、負電荷を有する核酸と複合体を形成し安定化する。リポフェクタミン２０００は、製造元の指示に従い使用した。
【００５５】
核酸としては、ホタルルシフェラーゼＧＬ３をコードする遺伝子を発現抑制の対象とするｓｉＲＮＡを、株式会社ニッポンジーンより購入して用いた。当該ｓｉＲＮＡを、ＧＬ３ｓｉＲＮＡと称する。
【００５６】
また、スクランブルｓｉＲＮＡとして、５’−ＡＵＣＧＡＡＵＡＡＣＣＧＵＡＡＣＧＵＵＧＡ−３’（配列番号６）及び５’−ＵＣＡＡＣＧＵＵＡＣＧＧＵＵＡＵＵＣＧＡＵ−３’（配列番号７）の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡを、株式会社ニッポンジーンより購入して用いた。スクランブルｓｉＲＮＡとは、対照実験に用いるｓｉＲＮＡであり、試験対象のｓｉＲＮＡと塩基の構成比が等しく、使用する細胞又は個体に相同な塩基配列が存在しない二本鎖ＲＮＡである。
【００５７】
＜複合体の調製＞
滅菌水にＳＹＣＯＬを溶解し、０．０６％ＳＹＣＯＬ溶液を調製した。ＳＹＣＯＬ溶液とｓｉＲＮＡ溶液を等量ずつ合わせ、ピペッティングにより混合し、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体を形成した。同様に、ｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ複合体、及びｓｉＲＮＡ／０．５％ＡＴＣＯＬ複合体を調製した。なお、０．０３％ＳＹＣＯＬ、０．０５％ＡＴＣＯＬ、及び０．５％ＡＴＣＯＬとは、いずれもｓｉＲＮＡと混合した後の終濃度を示す（以下、同じ）。調製した複合体は、４℃で１６時間置いてから、以降の実験に用いた。
【００５８】
＜安定性試験＞
各導入キャリアと複合体を形成させた０．９μｇのＧＬ３ｓｉＲＮＡを、０．１μｇ／μｌのＲＮａｓｅＡ（ニッポンジーン製）の共存下で、３７℃、０、５、１５、３０、４５、及び６０分の各時間インキュベートした。インキュベート後の溶液を、フェノール処理、及びフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、容量比）処理に供し、残存するＧＬ３ｓｉＲＮＡをエタノール沈殿により回収した。回収したＧＬ３ｓｉＲＮＡを、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。染色後のゲルをＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）で配布）により解析し、蛍光強度を数値化した。
【００５９】
＜結果＞
各複合体形成時のＧＬ３ｓｉＲＮＡ残存率の推移を図１に示す。ｓｉＲＮＡ単独の場合と比較し、ｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００複合体及びｓｉＲＮＡ／０．５％ＡＴＣＯＬ複合体においては、顕著に高いｓｉＲＮＡ残存率が認められた。また、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体及びｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ複合体においても、リポフェクタミン２０００や０．５％ＡＴＣＯＬと複合体を形成した場合には劣るが、ｓｉＲＮＡ単独の場合と比較し高いｓｉＲＮＡ残存率が認められた。よって、ｓｉＲＮＡはＳＹＣＯＬと複合体を形成することにより、ＲＮａｓｅによる分解を受けにくくなることが示された。
【００６０】
以上より、核酸とＳＹＣＯＬを組み合わせることで、核酸の安定性を高めることができると考えられる。これは、ＳＹＣＯＬを核酸の細胞内への導入キャリアとして用いることによる効果の１つである。
【実施例２】
【００６１】
〔実施例２〕細胞への導入試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸の細胞への導入効率に与える影響について評価した。
【００６２】
＜材料＞
細胞としては、恒常的にルシフェラーゼを発現したＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ−Ｇ５メラノーマ細胞（以下、単に細胞とも言う）を用いた。細胞は、１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．２ｍｇ／ｍｌのゼオシン（登録商標）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）により維持した。培養細胞は、トリプシン処理により回収し、以降の実験に用いた。
【００６３】
核酸としては、ＧＬ３ｓｉＲＮＡを用いた。また、対照として、実施例１に記載のスクランブルｓｉＲＮＡを用いた。核酸の細胞内への導入キャリアとしては、ＳＹＣＯＬ、ＡＴＣＯＬ、及びリポフェクタミン２０００を用いた。各ｓｉＲＮＡと各導入キャリアとの複合体の形成は、実施例１と同様に行った。
【００６４】
＜導入効率試験＞
ＧＬ３ｓｉＲＮＡ単独、ＳＹＣＯＬ単独、及び各ｓｉＲＮＡ／コラーゲン複合体を、公知の手法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２００４； ３２： ｅ１０９）により２４ウェルプレートに結合させた。ｓｉＲＮＡの結合量は、１０〜１７３ｐｍｏｌ／５０μｌ／ウェルとした。培養細胞を、３．５ｘ１０4細胞／ウェルとなるよう２４ウェルプレートに播種し、ｓｉＲＮＡの導入を行った。また、リポフェクタミン２０００を用いた際のｓｉＲＮＡ導入は、製造元の指示に従い行った。導入効率はルシフェラーゼを利用したレポーターアッセイにより測定した。ｓｉＲＮＡ導入後２日で細胞（ｎ＝３）を溶解させ、マイクロプレートリーダー モデル６８０（ＢｉｏＲａｄ製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。統計処理は、ボンフェローニ補正法による多重比較検定を行い、危険率は５％とした。
【００６５】
図２は、各条件で導入試験を行った際の発光強度を示したものである。０．０５％ＡＴＣＯＬやリポフェクタミン２０００と複合体を形成させた際と同様に、０．０３％ＳＹＣＯＬと複合体を形成させたＧＬ３ｓｉＲＮＡを導入することで、同じく複合体を形成させたスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合と比較して、蛍光強度の有意な減少が認められた。なお、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ単独あるいはＳＹＣＯＬ単独で細胞を処理した場合には、複合体を形成させたスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合と比較して、蛍光強度に有意差は認められなかった。よって、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬの導入による蛍光強度の減少は、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いたことに基づく効果であると考えられる。以上より、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体は細胞内に取り込まれ、ｓｉＲＮＡはルシフェラーゼＧＬ３の発現を、０．０５％ＡＴＣＯＬやリポフェクタミン２０００を導入キャリアとして用いた際と同等の効率で抑制したと示唆された。実施例１の結果も考慮すると、ＳＹＣＯＬはｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅによる分解から保護し、それによって、ｓｉＲＮＡが効率的にＲＮＡ干渉の効果を発揮することができると考えられる。
【実施例３】
【００６６】
〔実施例３〕局所投与試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸のマウス咬筋への局所投与の効果に与える影響について評価した。
【００６７】
＜材料＞
被験体としては、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス（２０週齢、オス）を各試験群に４匹ずつ用いた。
【００６８】
核酸としては、ミオスタチンをコードする遺伝子を発現抑制の対象とするｓｉＲＮＡを、株式会社高研より購入して用いた。当該ｓｉＲＮＡを、ミオスタチンｓｉＲＮＡと称する。ミオスタチンは、ＧＤＦ−８として知られる成長分化因子（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：ＧＤＦ）であり、筋肉の成長を抑制する機能を有する。すなわち、ミオスタチンの発現が抑制されれば筋肉の成長が促進されると考えられる。用いたミオスタチンｓｉＲＮＡは、５’−ＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵＣＡＣＧＣＵＡ−３’（配列番号８）及び５’−ＵＡＧＣＧＵＧＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵ−３’（配列番号９）の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡである。また、対照として、実施例１に記載のスクランブルｓｉＲＮＡを用いた。核酸の細胞内への導入キャリアとしては、ＳＹＣＯＬを用いた。ｓｉＲＮＡは、ＳＹＣＯＬと混合し、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬを形成した。ｓｉＲＮＡの終濃度は１０ｍＭとした。
【００６９】
＜導入試験＞
ネンブタール（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）によりマウスを麻酔し、ミオスタチンｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を左側咬筋に、スクランブルｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を右側咬筋に、それぞれ１００μｌ注射した。２週間後、両側の咬筋を単離し、分析に供した。左側咬筋を試験群、右側咬筋を対照群とした。
【００７０】
図３Ａは、単離した咬筋の重量を示す。試験群の重量は、対照群の重量に対し、顕著に大きいことが認められる。また、図３Ｂは、各群２００本ずつのミオフィブリル（筋原線維）の断面積の平均値を示す。試験群では、対照群と比較し、ミオフィブリルの断面積が１．８倍程度に増大していることが明らかとなった。以上より、ミオスタチンｓｉＲＮＡを導入することによる筋肉の増強が認められ、ミオスタチンの発現が有効に抑制されていることが示唆された。
【００７１】
＜ｍＲＮＡの定量＞
総ＲＮＡをマウス咬筋から抽出し、ミオスタチンｍＲＮＡの定量を行った。ｍＲＮＡの定量は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造製）とＤＮＡエンジンＯＰＴＩＣＯＮシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）によりミオスタチンｍＲＮＡから逆転写を行い、転写量をモニターすることで行った。用いた特異的プライマーの配列は、５’−ＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＴＡＧＧ−３’（フォワード）（配列番号１０）、５’−ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴ−３’（リバース）（配列番号１１）とした。結果を図３Ｃに示す。ミオスタチンｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体で処理した試験群においては、スクランブルｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体で処理した対照と比較し、ミオスタチンｍＲＮＡの量が４８％程度まで減少していた。よって、ミオスタチンｓｉＲＮＡによりＲＮＡ干渉が起こったものと考えられる。
【００７２】
なお、本実施例において、咬筋以外の組織には、ｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を投与することによる形態上の明らかな変化は認められなかった。また、本実施例において、ｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を投与することによる、マウスにおける健康障害や死亡の兆候等の副作用も認められなかった。
【００７３】
以上より、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いることにより、ｓｉＲＮＡを組織に導入し、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが可能であると明らかになった。また、その際、目立った副作用は認められないことから、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いる核酸導入技術は臨床上有用であると考えられる。
【実施例４】
【００７４】
〔実施例４〕全身投与試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸のマウスへの全身投与の効果に与える影響について評価した。
【００７５】
＜材料＞
被験体としては、無胸腺ヌードマウスを、各試験群に２匹ずつ用いた。
【００７６】
核酸としては、ＧＬ３ｓｉＲＮＡを用いた。核酸の細胞内への導入キャリアとしては、ＳＹＣＯＬ及びＡＴＣＯＬを用いた。ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体は、０．０６％ＳＹＣＯＬとｓｉＲＮＡ溶液を等量ずつ混合し、４℃、２０分遠心して調製した。同様に、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ複合体を調製した。
【００７７】
＜導入試験＞
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁したＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ−Ｇ５メラノーマ細胞を、無胸腺ヌードマウスの左心室に皮下注射し（１ｘ１０6細胞／１００μｌ ＰＢＳ／箇所）、腫瘍の転移モデルを作成した。メラノーマ細胞を注射してから２日後、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ単独、ＳＹＣＯＬ単独、並びにＧＬ３ｓｉＲＮＡとＳＹＣＯＬ及びＡＴＣＯＬそれぞれとの複合体をマウスの頭部に注射して投与した。投与量は、４ｎｍｏｌ／５０μｌ／５０ｍｍ3腫瘍とした。ｓｉＲＮＡの投与日を０日目とし、０日目と３日目に、極低温冷却されたＩＶＩＳシステムを用いた非侵襲バイオイメージングにより導入効果を測定した。導入効果はバイオイメージングの結果を基に発光強度として数値化した。なお、ＩＶＩＳシステムによる測定によっては、腫瘍の成長は影響を受けなかった。
【００７８】
図４Ａ、Ｂは、それぞれ頭部及び腹部における発光強度の推移を示す。腫瘍の形成に基づく発光が、０日目に、頭部及び腹部に認められた。ｓｉＲＮＡ単独やＳＹＣＯＬ単独で投与した群では、投与してから３日後には、０日目と比較して、頭部及び腹部とも発光強度が増大した。一方、ｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ投与群では、投与してから３日後には、頭部及び腹部ともに発光強度が減少した。また、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ投与群では、腹部の発光強度は増大したが、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体の投与部位である頭部においては減少しており、頭部においてはルシフェラーゼの発現が持続的に阻害されていることが明らかとなった。よって、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いたｓｉＲＮＡの導入は、少なくともｓｉＲＮＡ投与箇所の付近において有効であることが示唆された。
【００７９】
以上の実施例より、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいてもｓｉＲＮＡの導入効率を向上させることができると明らかとなった。すなわち、放射線照射コラーゲン様ペプチドを導入キャリアとして利用することにより、核酸を細胞内に効率的に導入できる。
【００８０】
なお、コラーゲンを導入キャリアとして用いる核酸導入法は公知である（国際公開第０３／０００２９７号）が、これは、生理条件下では核酸が負電荷、コラーゲンが正電荷を有するため、静電気的結合することにより複合体を形成するためであると考えられていた。すなわち、コラーゲンが導入キャリアとして機能するには、コラーゲンが正電荷を有することが重要であるとされていた。これは、ＡＴＣＯＬでも同様である。それに対し、実施例で用いたＳＹＣＯＬは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのアミノ酸配列の繰り返しからなり、一般的なコラーゲンのようには正電荷を有さない。それにも関わらず、ＡＴＣＯＬや正電荷リポソームと同様に、核酸の分解を抑制し、核酸の細胞内への導入効率を高めることができたのは、驚くべき結果であった。さらに、ＳＹＣＯＬ等のコラーゲン様ペプチドが核酸の細胞への導入キャリアとして機能するには放射線の照射が必要である。放射線の照射によりコラーゲン様ペプチドが導入キャリアとしての機能を発揮するようになることは、予想できない新規な知見であった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、任意の核酸を効率的に細胞内に導入することができる。よって、本発明は、特に遺伝子の機能の解析や遺伝子治療に有効である。すなわち、本発明は、基礎研究や臨床応用に極めて有効に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞内へ効率的に導入する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾病に関与する遺伝子の機能を補う、あるいは抑えることによって疾病を治療する、いわゆる遺伝子治療が注目を集めており、既に種々の遺伝子疾患やガン等において、遺伝子治療の臨床研究が行われている。ここで、遺伝子治療に用いられる医薬として実用化が期待されているものとして、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する核酸医薬が挙げられる。
【０００３】
ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡにより引き起こされる、配列特異的な遺伝子発現抑制現象であり、二本鎖ＲＮＡのいずれかの配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡが特異的に分解されることに基づく。すなわち、生体内に導入された二本鎖ＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩに属するＤｉｃｅｒと呼ばれる酵素により、２１塩基程度の短い３’末端突出型の二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に分解される。生じたｓｉＲＮＡは、一本鎖に解離して、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ））に取り込まれ、取り込まれた一本鎖と相補的な配列を有するｍＲＮＡが特異的に分解されると言われている。ＲＮＡ干渉は、生体内のさまざまな局面で重要な役割を担っていると考えられ、例えば、ウイルス感染に対する防御機構や、ゲノム上を転移する遺伝因子であるレトロトランスポゾンの転移を抑制し、ゲノムの安定性を保つことにも関わっているようである。
【０００４】
ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子に対する高い特異性を有し、任意の遺伝子の機能を人為的に抑制できることから、遺伝子機能解析の汎用性の高いツールとして注目され、また、遺伝子治療への応用が期待されている。
【０００５】
ここで、ＲＮＡ干渉を臨床応用するために解決しなければならない課題の１つは、ｓｉＲＮＡの生体内への導入法の開発である。すなわち、ｓｉＲＮＡ単独では、細胞膜を抜けて細胞質には導入されない。これは、ｓｉＲＮＡの高い分子量と、核酸の主鎖を構成するリン酸基に基づく強い負電荷が原因である。ｓｉＲＮＡを細胞内に導入する方法としては、エレクトロポレーションによる方法、及びリポソーム、特に正電荷リポソームをキャリアとして利用する方法等が知られている。また、その他にも、コラーゲン又はコラーゲン誘導体をキャリアとして利用し、核酸との複合体を形成させることを特徴とする、核酸の細胞内への効率的な導入技術が既に知られている（特許文献１）。
【０００６】
生体内及び生体外で効率的な遺伝子発現抑制を達成するための有望なｓｉＲＮＡ導入キャリアの１つはアテロコラーゲン（ＡＴＣＯＬ）である（非特許文献１）。ＡＴＣＯＬは、ウシ真皮から得られたＩ型コラーゲンをペプシンにより処理し高純度に精製すること等により得られる。コラーゲン分子は、Ｎ、Ｃ両末端にコラーゲンの主要抗原部位であるテロペプチドを有するが、ＡＴＣＯＬは、ペプシン処理によりテロペプチドが除去されており、免疫原性が低く抑えられている。そのため、ＡＴＣＯＬは、生体適合性の高い生体材料であり、創傷治療、人工血管、代用軟骨、止血剤等の広範囲の用途で、臨床上利用されている。
【０００７】
本発明者らは、骨格筋の成長を抑制する因子をコードするミオスタチンをターゲットとするｓｉＲＮＡをＡＴＣＯＬとともにマウスの骨格筋に導入することで、導入から数週間後には筋量が顕著に増大したことを報告しており、ＡＴＣＯＬは核酸の細胞内への導入を促進することが明らかとなっている（非特許文献２）。
【０００８】
以上のように、核酸を細胞内へ導入する技術はこれまでに知られているが、コラーゲン様ペプチドを導入キャリアとして用いる核酸の導入法は知られていない。コラーゲン様ペプチドについては、例えば、特許文献２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０３／０００２９７号
【特許文献２】特開２００５−０５３８７８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２００４； ３２： ｅ１０９
【非特許文献２】ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）２００８； １５： １１２６−１１３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、核酸を細胞内へ効率的に導入する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、コラーゲン様ペプチドの性質を詳細に検討した結果、放射線を照射したコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内への導入キャリアとして利用することで、核酸を効率的に細胞内に導入できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の通りである。
【００１４】
第１の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、導入促進剤である。第１の発明の好ましい態様において、コラーゲン様ペプチドは、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である。また、第１の発明の好ましい態様において、放射線は電子線である。また、第１の発明の好ましい態様において、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【００１５】
第２の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、複合体である。第２の発明におけるコラーゲン様ペプチド、放射線、及び核酸の好ましい態様は、第１の発明と同様である。
【００１６】
第３の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、医薬組成物である。第３の発明におけるコラーゲン様ペプチド、放射線、及び核酸の好ましい態様は、第１の発明と同様である。
【００１７】
第４の発明は、第２の発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する医療用又は実験用器具である。
【００１８】
第５の発明は、放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法であって、コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、方法である。第５の発明におけるコラーゲン様ペプチド、放射線、及び核酸の好ましい態様は、第１の発明と同様である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に用いられるコラーゲン様ペプチドは、核酸を細胞内へ導入する際の導入キャリアとして機能する。よって、本発明により、任意の核酸を効率的に細胞内に導入することができる。また、核酸として、特にｓｉＲＮＡを用いることで、ＲＮＡ干渉により特定の遺伝子を効率的にノックダウンできる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡと各導入キャリアとの複合体を形成した際の、ＲＮａｓｅＡ共存下でのｓｉＲＮＡ残存量の推移を示すグラフである。
【図２】図２は、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡのそれぞれと各導入キャリアとの複合体を形成して細胞に導入した際の、ルシフェラーゼの発現量（発光強度）を示すグラフである。結果は、平均値±標準誤差で示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ミオスタチンｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡのそれぞれをＳＹＣＯＬと複合体を形成させて咬筋に投与した際の、咬筋の重量を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、同条件での、咬筋におけるミオフィブリル（筋原線維）の断面積を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、同条件での、咬筋におけるミオスタチンｍＲＮＡの量を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＧＬ３ｓｉＲＮＡと各導入キャリアとの複合体を形成してマウス頭部に投与した際の、頭部におけるルシフェラーゼの発現量（発光強度）を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、同条件での、腹部におけるルシフェラーゼの発現量（発光強度）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明において、コラーゲン様ペプチドは、核酸を細胞内に導入するためのキャリア（輸送担体）として用いられる。すなわち、本発明の核酸を細胞内に導入する方法は、コラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする。
【００２３】
本発明において用いられるコラーゲン様ペプチドとは、機能性ペプチドとしてアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ（以下、配列Ａとも言う）からなるペプチドユニットを含むペプチドである。配列Ａは後述する３重らせん構造の安定性に寄与し、配列Ａの割合が少ないと３重らせん構造の安定性が減少する。ここで、ＸはＰｒｏ又はＨｙｐであり、３重らせん構造の安定性の点からＨｙｐであるのが好ましい。なお、Ｈｙｐは、通常、４Ｈｙｐ（例えば、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）残基である。コラーゲン様ペプチドは、（−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−）nで表される繰り返し構造を含み、よって、好ましくは（−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−）nで表される繰り返し構造を含む。すなわち、コラーゲン様ペプチドの一態様は、（−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−）nからなるポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である。なお、（−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−）nで表される繰り返し構造において、それぞれのＸは独立にＰｒｏ又はＨｙｐであってよい。繰り返し数ｎは、目的の分子量や、共存する配列に応じて適宜設定することができる。繰り返し数ｎは、例えば１０〜５００００であり、２０〜５０００であるのが好ましく、２００〜４０００であるのがより好ましい。
【００２４】
また、コラーゲン様ペプチドは、機能性ペプチドを含有させることにより機能設計が可能である。例えば、コラーゲン様ペプチドを、特定の細胞や組織に対して特異的に取り込まれるよう改変することもできる。
【００２５】
コラーゲン様ペプチドに含有させることのできる機能性ペプチドとしては、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号２）（以下、配列Ｂとも言う）を含むペプチドが挙げられる。ここで、ＹはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであるのが好ましく、Ｇｌｎ又はＬｅｕであるのが特に好ましい。また、ＺはＩｌｅ又はＬｅｕであり、Ｉｌｅであるのが好ましい。配列Ｂの存在は、コラゲナーゼによるコラーゲン様ペプチドの分解性を向上させる。よって、配列Ｂの存在は、コラーゲン様ペプチドを導入キャリアとして用いて、生体内、例えば哺乳動物の生体内に核酸を導入する際に、コラーゲン様ペプチドが分解吸収されるのを補助する。
【００２６】
コラーゲン様ペプチドに含有させることのできるその他の機能性ペプチドとしては、例えば、コラーゲン様ペプチドが酵素分解されるのを抑制するアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒａ（配列番号２）、熱応答性を付与するアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号３）、細胞接着性を付与するアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、神経分化を促進するアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号４）及びＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒａ−Ｖａｌ（配列番号５）等が挙げられる。
【００２７】
配列Ａと配列Ｂの比率（モル比）は、例えばＡ：Ｂ＝１００：０〜３０：７０であり、１００：０〜５０：５０が好ましく、１００：０〜７０：３０がより好ましく、１００：０〜９０：１０がさらに好ましく、１００：０〜９５：５が特に好ましい。また、配列Ａと配列Ｂの合計量と、配列Ａ又はＢ以外のその他の機能性ペプチドの比率（モル比）は、例えばＡ＋Ｂ：Ａ＋Ｂ以外の機能性ペプチド＝１００：０〜５０：５０であり、１００：０〜７０：３０が好ましく、１００：０〜８０：２０がより好ましく、１００：０〜９０：１０がさらに好ましく、１００：０〜９５：５が特に好ましい。
【００２８】
また、コラーゲン様ペプチドは、核酸の細胞内への導入キャリアとしての機能を損なわない限り、その他の任意のアミノ酸配列を含んでいてもよい。その他の任意のアミノ酸配列の含有量は、コラーゲン様ペプチド全体に対して、例えばアミノ酸残基数として２０％以下であり、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下である。
【００２９】
また、コラーゲン様ペプチドは、上述のペプチドにさらに核酸等が付加されたペプチドであってもよい。
【００３０】
コラーゲン様ペプチドの分子量は、好ましくは５×１０3〜１×１０7、より好ましくは１×１０4〜１×１０6、より好ましくは１×１０5〜１×１０6である。例えば、本発明の一態様において、分子量１０5以上のコラーゲン様ペプチドを用いることができる。分子量は、高分子化合物の分子量を測定する一般的な方法で測定することができる。高分子化合物の分子量を測定する一般的な方法としては、例えば、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）が挙げられ、ＳＥＣとしては、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）が好適に用いられる。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより分子量を測定する場合の一態様としては、分離カラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（Ｉ．Ｄ．７．８ｍｍ ｘ Ｌ３０ｃｍ）（東ソー製）を、分子量標準として分子量既知のプルラン、デキストラン、又はポリエチレンオキサイド等を用い、緩衝液を移動相として測定が行われる。
【００３１】
コラーゲン様ペプチドは、その一態様において、三重らせん構造を形成し、当該三重らせん構造が複数集合し、直径１０ｎｍ〜３００ｎｍのコラーゲン原繊維を構成し、コラーゲン原繊維がさらに集合して、直径０．５ｎｍ〜３ｎｍのコラーゲン様繊維を形成する。
【００３２】
コラーゲン様ペプチドを製造する方法は特に限定されず、例えば、アミノ酸やペプチドを縮重合することにより製造できる。例えば、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙからなるトリペプチドを縮重合させることによりポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）を製造できる。なお、例えば、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）を製造する場合には、縮重合に用いられるトリペプチドはＨｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏや−ＧｌｙＰｒｏ−Ｈｙｐからなるトリペプチドであってもよいことは言うまでもない。ペプチドの縮重合は、公知の手法（特開２００５−５３８７８等）により行うことができる。また、目的の物性や目的の分子量に応じて、反応条件や共重合させる機能性ペプチドを適宜選択できる。機能性ペプチドを共重合させることにより、機能性の高分子としてコラーゲン様ペプチドを製造できる。
【００３３】
コラーゲン様ペプチドは、通常のコラーゲンのような免疫原性を示さないため、例えば医療用素材として優秀である。また、アミノ酸やペプチドの縮重合等の化学合成によりコラーゲン様ペプチドを製造した場合には、動物由来の成分を含まないことから、未知の病原体や病原因子による汚染の可能性がない点で好ましい。
【００３４】
本発明において、コラーゲン様ペプチドは、放射線を照射する処理をされて用いられる。コラーゲン様ペプチドは、放射線を照射する処理により、核酸を細胞内に導入するキャリアとしての機能を示すようになる。放射線を照射する処理の態様は特に限定されず、任意の手法により行うことができる。放射線を照射する処理に用いられる放射線の線量は特に限定されないが、例えば、好ましくは１ｋＧｙ以上、より好ましくは５ｋＧｙ以上、特に好ましくは１０ｋＧｙ以上の放射線が用いられる。また、放射線の線量の好ましい範囲としては、例えば、１〜１０００ｋＧｙ、５０〜５００ｋＧｙ、１０〜２００ｋＧｙ等が挙げられる。放射線としては、例えば電子線が好適に用いられる。放射線を照射する処理は、例えば、コラーゲン様ペプチドを含有する溶液に４０ｋＧｙの電子線を２分間照射することにより行うことができる。
【００３５】
本発明において、核酸は、特に限定されず、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、核酸は、ＤＮＡとＲＮＡの両方により複合的に構成されていてもよい。核酸は、１本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。また部分的に、１本鎖部分と二本鎖部分が共存していてもよい。また、核酸の配列は、特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。また、核酸は線状であってもよく、環状であってもよい。例えば、核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。また、本発明において、核酸には、核酸として機能するもの、例えばウイルスが含まれる。ウイルスとしては、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウイルスでもよい。また、本発明において、核酸は、任意の修飾がなされた核酸を含む。任意の修飾がなされた核酸を、まとめて、核酸誘導体と称する。核酸誘導体としては、蛍光標識された核酸等が挙げられる。本発明において、複数の態様の核酸が同時に存在していてもよく、複数の態様の核酸が同時に細胞内に導入されてもよい。
【００３６】
本発明において、核酸としては、ｓｉＲＮＡが特に好ましく用いられる。ｓｉＲＮＡとは、遺伝子のノックダウン、すなわち遺伝子発現の抑制に用いられる二本鎖ＲＮＡであり、その片方の鎖は、ノックダウン対象の遺伝子から転写されるｍＲＮＡの少なくとも一部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含む。ｓｉＲＮＡとしては、通常２１〜２７塩基程度の３’末端突出型の二本鎖ＲＮＡを用いる。また、３’末端は片側あるいは両側とも突出しない場合がある。
【００３７】
本発明において、コラーゲン様ペプチドは、核酸と複合体を形成することにより、核酸の細胞内導入キャリアとして機能する。
【００３８】
コラーゲン様ペプチドと核酸は、溶媒中で接触することにより、コラーゲン様ペプチド及び核酸を含む核酸／コラーゲン様ペプチド複合体（以下、単に複合体とも言う）を形成する。溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、緩衝液等の水系溶媒が好ましく用いられる。溶媒は、核酸が細胞内に導入されるのを阻害しない限り、任意の成分を含有していてよい。なお、コラーゲン様ペプチドと核酸を接触させ複合体を形成する工程は、特に限定されず、例えば、コラーゲン様ペプチドを含む溶液と核酸を含む溶液を混合することにより行われてもよく、コラーゲン様ペプチド及び核酸の一方を含む溶液にコラーゲン様ペプチド及び核酸のもう一方をさらに溶解させることにより行われてもよく、また、あらかじめコラーゲン様ペプチド及び核酸を混合したものを任意の溶媒に溶解することにより行われてもよい。
【００３９】
なお、複合体を形成するとは、コラーゲン様ペプチド及び核酸の少なくとも一部が核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成すればよい。よって、コラーゲン様ペプチド及び核酸の少なくとも一部は、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成せず、単独で存在していてもよい。
【００４０】
上記のように核酸とコラーゲン様ペプチドを含む核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成することで、任意の細胞に、核酸を効率よく導入することができる。核酸／コラーゲン様ペプチド複合体は細胞と混合すること等によって接触させることにより、あるいは、生体に投与することにより、細胞内に核酸が導入される。すなわち、本発明は、合成コラーゲンを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法を提供する。なお、当該方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで用いてもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いてもよい。また、特定の細胞や組織に特異的に取り込まれるよう改変されたコラーゲン様ペプチドを用いることで、特定の細胞や組織に特異的に核酸を導入することができる。
【００４１】
本発明において、コラーゲン様ペプチドと核酸の比率は、特に限定されず、コラーゲン様ペプチドの態様、核酸の態様、核酸を導入する細胞の態様、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体の存在態様等に応じて適宜設定できる。コラーゲン様ペプチドの濃度としては、細胞あるいは生体に導入する際の濃度として、０．００１％〜５％が好ましく、０．００５％〜２％がより好ましく、０．０１％〜１％が特に好ましい。コラーゲン様ペプチドは、例えば、０．０３％で用いることができる。核酸の濃度としては、核酸の態様、核酸を導入する細胞の態様、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体の存在態様等に応じて適宜設定できるが、例えば、０．０１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、０．１ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭが特に好ましい。例えば、終濃度１０ｍＭでｓｉＲＮＡを用いることができる。また、例えば核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を器具の表面に保持する態様においては、保持される核酸の量としては、核酸の態様、核酸を導入する細胞の態様等に応じて適宜設定できる。例えばアレイ化する場合には、保持される核酸の量が、ウェル当たり好ましくは０．１ｐｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、より好ましくは１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌとなるよう核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持させることができる。このような範囲濃度で核酸を保持するウェルに、例えば３．５ｘ１０4の細胞を播種することで、セルトランスフェクションアレイを行える。
【００４２】
本発明は、コラーゲン様ペプチドを有効成分として含む、核酸の細胞への導入促進剤を提供する。導入促進剤としては、コラーゲン様ペプチドを含む限り特に限定されず、核酸やコラーゲン様ペプチドの態様、及び導入促進剤の利用目的（例えば、疾患の治療に用いるのであれば対象となる疾患の態様等）等に応じて、適宜態様を設定できる。本発明の導入促進剤は、核酸と混合して用いることができる。核酸と混合することにより、少なくとも核酸が細胞内あるいは生体内等に導入される時点において、コラーゲン様ペプチド及び核酸は核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成する。
【００４３】
なお、本発明の導入促進剤は、その一実施態様において、さらに核酸を含んでいてもよい。本発明の導入促進剤が核酸を含む場合に、本発明の導入促進剤に含まれるコラーゲン様ペプチド及び核酸はそれぞれ別個に存在していてもよく、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成していてもよいが、少なくとも核酸が細胞内あるいは生体内等に導入される時点において、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成する。
【００４４】
本発明は、コラーゲン様ペプチド及び核酸を含む医薬組成物（以下、本発明の医薬とも言う）を提供する。本発明の医薬は、核酸及びコラーゲン様ペプチドを含む限り特に限定されず、核酸やコラーゲン様ペプチドの態様、対象となる疾患の態様等に応じて、適宜態様を設定できる。なお、本発明の医薬は、本発明の導入促進剤と核酸を混合することにより調製されたものであってもよい。本発明の医薬を投与することにより、本発明の医薬に含まれる核酸が、細胞内あるいは生体内等に導入される。本発明の医薬に含まれるコラーゲン様ペプチド及び核酸は、それぞれ別個に存在していてもよく、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成していてもよいが、少なくとも核酸が細胞内あるいは生体内等に導入される時点において、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を形成する。本発明の医薬を用いることにより、例えば任意の遺伝子の発現プラスミドを導入し、遺伝子機能を補うことができる。また、本発明の医薬を用いることにより、例えば任意の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、遺伝子発現を抑制することができる。よって、本発明の医薬により、任意の疾病について、遺伝子治療を行うことができる。
【００４５】
本発明の医薬の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。本発明の医薬は、そのまま、あるいは水、生理食塩水、緩衝液等を用いて希釈又は溶解し、細胞あるいは生体に投与できる。このように希釈あるいは溶解等した場合にも、本発明の医薬の範囲内であることは言うまでもない。なお、本発明の導入促進剤においても、本発明の医薬と同様の剤形や製剤担体を利用できる。また、本発明の導入促進剤においても、本発明の医薬と同様に、希釈あるいは溶解等した場合にも、本発明の導入促進剤の範囲内である。
【００４６】
本発明の医薬を生体に投与する方法としては、特に制限されず、例えば経口、注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚を介した吸収等の任意の方法により行うことができる。本発明の医薬を生体に投与する方法としては、経口又は注射が好ましい。投与部位は、対象とする疾患等に応じて適宜設定できる。また、本発明の医薬は、例えば、外科的手法により投与部位に直接留置することで使用されてもよい。
【００４７】
本発明の導入促進剤や本発明の医薬におけるコラーゲン様ペプチド及び核酸の濃度や比率は特に限定されないが、細胞に導入又は生体に投与する際に、上記の好ましい比率及び濃度範囲に収まるよう調整されるのが好ましい。
【００４８】
また、本発明は、本発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する器具を提供する。器具としては、特に限定されないが、例えば医療用器具及び実験用器具が挙げられる。器具としては、例えば、セルトランスフェクションアレイに用いられるプレートが挙げられる。セルトランスフェクションアレイとは、あらかじめ導入可能な状態の核酸を基板上にアレイ化しておき、そこに細胞を播種して、細胞内に取り込ませる手法である。よって、本発明の核酸を、基板上に、すなわち例えば細胞を播種するためのウェル上にアレイ化することができる。アレイ化は公知の手法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２００４； ３２： ｅ１０９、等）により行うことができる。こうして得られたアレイを用いることで、効率よく遺伝子機能の解析等を行うことができる。後述する実施例で示すように、固相表面に保持された核酸／コラーゲン様ペプチド複合体に細胞を接触させることで、核酸は細胞内に効率的に導入される。本発明で用いられるコラーゲン様ペプチドは、リポソームと比較し保存性が高く、コラーゲン様ペプチドを含む複合体を表面に保持した器具は、長期間の保存に耐え得る。また、本発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する器具とは、例えば、外科的手法等により生体内に留置され、本発明の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を徐々に放出するような器具であってもよい。
【００４９】
また、本発明に基づき核酸を効率的に細胞内に導入することで、遺伝子又はタンパク質の細胞内での機能を効率的に解析できる。例えば、機能を解析したい遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを細胞内に導入し、当該遺伝子を発現させることにより遺伝子の機能を解析することができる。また、機能を解析したい遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡやｓｉＲＮＡを細胞内に導入し、当該遺伝子の発現を抑制することにより遺伝子の機能を解析することができる。導入及び解析は、例えば、セルトランスフェクションアレイ技術によりハイスループットに行うことができる。
【００５０】
また、本発明に基づき核酸を効率的に細胞内に導入することで、種々の疾患、例えば遺伝子疾患、癌、ＡＩＤＳ、慢性関節リウマチ、生活習慣病等の治療に用いることのできる核酸医薬をスクリーニングできる。例えば、スクリーニングは、任意の病態を示す細胞に核酸を導入し、任意の遺伝子を発現させることにより、あるいは任意の遺伝子発現を抑制することにより、当該病態に与える効果を解析することにより行われる。導入及び解析は、例えば、セルトランスフェクションアレイ技術によりハイスループットに行うことができる。
【００５１】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
〔実施例１〕安定性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸の安定性に与える影響について評価した。
【００５３】
＜材料＞
核酸の細胞内への導入キャリアとしては、コラーゲン様ペプチド、及びＡＴＣＯＬを用いた。コラーゲン様ペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのアミノ酸配列からなるトリペプチドを縮重合して生産したポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）を、４０ｋＧｙの電子線を２分間照射して使用した。当該コラーゲン様ペプチドの分子量は１０5以上であった。なお、当該コラーゲン様ペプチドを、合成コラーゲン（ＳＹＣＯＬ）とも称する。当該コラーゲン様ペプチドは、チッソ株式会社より入手した。ＡＴＣＯＬは、株式会社高研より、生体内ｓｉＲＮＡ導入キットとして購入し、製造元の指示に従い使用した。
【００５４】
また、ＳＹＣＯＬ、ＡＴＣＯＬ以外の導入キャリアとして、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン製）を用いた。リポフェクタミン２０００は、正電荷リポソームを含む試薬であり、負電荷を有する核酸と複合体を形成し安定化する。リポフェクタミン２０００は、製造元の指示に従い使用した。
【００５５】
核酸としては、ホタルルシフェラーゼＧＬ３をコードする遺伝子を発現抑制の対象とするｓｉＲＮＡを、株式会社ニッポンジーンより購入して用いた。当該ｓｉＲＮＡを、ＧＬ３ｓｉＲＮＡと称する。
【００５６】
また、スクランブルｓｉＲＮＡとして、５’−ＡＵＣＧＡＡＵＡＡＣＣＧＵＡＡＣＧＵＵＧＡ−３’（配列番号６）及び５’−ＵＣＡＡＣＧＵＵＡＣＧＧＵＵＡＵＵＣＧＡＵ−３’（配列番号７）の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡを、株式会社ニッポンジーンより購入して用いた。スクランブルｓｉＲＮＡとは、対照実験に用いるｓｉＲＮＡであり、試験対象のｓｉＲＮＡと塩基の構成比が等しく、使用する細胞又は個体に相同な塩基配列が存在しない二本鎖ＲＮＡである。
【００５７】
＜複合体の調製＞
滅菌水にＳＹＣＯＬを溶解し、０．０６％ＳＹＣＯＬ溶液を調製した。ＳＹＣＯＬ溶液とｓｉＲＮＡ溶液を等量ずつ合わせ、ピペッティングにより混合し、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体を形成した。同様に、ｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ複合体、及びｓｉＲＮＡ／０．５％ＡＴＣＯＬ複合体を調製した。なお、０．０３％ＳＹＣＯＬ、０．０５％ＡＴＣＯＬ、及び０．５％ＡＴＣＯＬとは、いずれもｓｉＲＮＡと混合した後の終濃度を示す（以下、同じ）。調製した複合体は、４℃で１６時間置いてから、以降の実験に用いた。
【００５８】
＜安定性試験＞
各導入キャリアと複合体を形成させた０．９μｇのＧＬ３ｓｉＲＮＡを、０．１μｇ／μｌのＲＮａｓｅＡ（ニッポンジーン製）の共存下で、３７℃、０、５、１５、３０、４５、及び６０分の各時間インキュベートした。インキュベート後の溶液を、フェノール処理、及びフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、容量比）処理に供し、残存するＧＬ３ｓｉＲＮＡをエタノール沈殿により回収した。回収したＧＬ３ｓｉＲＮＡを、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。染色後のゲルをＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）で配布）により解析し、蛍光強度を数値化した。
【００５９】
＜結果＞
各複合体形成時のＧＬ３ｓｉＲＮＡ残存率の推移を図１に示す。ｓｉＲＮＡ単独の場合と比較し、ｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００複合体及びｓｉＲＮＡ／０．５％ＡＴＣＯＬ複合体においては、顕著に高いｓｉＲＮＡ残存率が認められた。また、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体及びｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ複合体においても、リポフェクタミン２０００や０．５％ＡＴＣＯＬと複合体を形成した場合には劣るが、ｓｉＲＮＡ単独の場合と比較し高いｓｉＲＮＡ残存率が認められた。よって、ｓｉＲＮＡはＳＹＣＯＬと複合体を形成することにより、ＲＮａｓｅによる分解を受けにくくなることが示された。
【００６０】
以上より、核酸とＳＹＣＯＬを組み合わせることで、核酸の安定性を高めることができると考えられる。これは、ＳＹＣＯＬを核酸の細胞内への導入キャリアとして用いることによる効果の１つである。
【実施例２】
【００６１】
〔実施例２〕細胞への導入試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸の細胞への導入効率に与える影響について評価した。
【００６２】
＜材料＞
細胞としては、恒常的にルシフェラーゼを発現したＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ−Ｇ５メラノーマ細胞（以下、単に細胞とも言う）を用いた。細胞は、１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．２ｍｇ／ｍｌのゼオシン（登録商標）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）により維持した。培養細胞は、トリプシン処理により回収し、以降の実験に用いた。
【００６３】
核酸としては、ＧＬ３ｓｉＲＮＡを用いた。また、対照として、実施例１に記載のスクランブルｓｉＲＮＡを用いた。核酸の細胞内への導入キャリアとしては、ＳＹＣＯＬ、ＡＴＣＯＬ、及びリポフェクタミン２０００を用いた。各ｓｉＲＮＡと各導入キャリアとの複合体の形成は、実施例１と同様に行った。
【００６４】
＜導入効率試験＞
ＧＬ３ｓｉＲＮＡ単独、ＳＹＣＯＬ単独、及び各ｓｉＲＮＡ／コラーゲン複合体を、公知の手法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２００４； ３２： ｅ１０９）により２４ウェルプレートに結合させた。ｓｉＲＮＡの結合量は、１０〜１７３ｐｍｏｌ／５０μｌ／ウェルとした。培養細胞を、３．５ｘ１０4細胞／ウェルとなるよう２４ウェルプレートに播種し、ｓｉＲＮＡの導入を行った。また、リポフェクタミン２０００を用いた際のｓｉＲＮＡ導入は、製造元の指示に従い行った。導入効率はルシフェラーゼを利用したレポーターアッセイにより測定した。ｓｉＲＮＡ導入後２日で細胞（ｎ＝３）を溶解させ、マイクロプレートリーダー モデル６８０（ＢｉｏＲａｄ製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。統計処理は、ボンフェローニ補正法による多重比較検定を行い、危険率は５％とした。
【００６５】
図２は、各条件で導入試験を行った際の発光強度を示したものである。０．０５％ＡＴＣＯＬやリポフェクタミン２０００と複合体を形成させた際と同様に、０．０３％ＳＹＣＯＬと複合体を形成させたＧＬ３ｓｉＲＮＡを導入することで、同じく複合体を形成させたスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合と比較して、蛍光強度の有意な減少が認められた。なお、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ単独あるいはＳＹＣＯＬ単独で細胞を処理した場合には、複合体を形成させたスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合と比較して、蛍光強度に有意差は認められなかった。よって、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬの導入による蛍光強度の減少は、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いたことに基づく効果であると考えられる。以上より、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体は細胞内に取り込まれ、ｓｉＲＮＡはルシフェラーゼＧＬ３の発現を、０．０５％ＡＴＣＯＬやリポフェクタミン２０００を導入キャリアとして用いた際と同等の効率で抑制したと示唆された。実施例１の結果も考慮すると、ＳＹＣＯＬはｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅによる分解から保護し、それによって、ｓｉＲＮＡが効率的にＲＮＡ干渉の効果を発揮することができると考えられる。
【実施例３】
【００６６】
〔実施例３〕局所投与試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸のマウス咬筋への局所投与の効果に与える影響について評価した。
【００６７】
＜材料＞
被験体としては、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス（２０週齢、オス）を各試験群に４匹ずつ用いた。
【００６８】
核酸としては、ミオスタチンをコードする遺伝子を発現抑制の対象とするｓｉＲＮＡを、株式会社高研より購入して用いた。当該ｓｉＲＮＡを、ミオスタチンｓｉＲＮＡと称する。ミオスタチンは、ＧＤＦ−８として知られる成長分化因子（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：ＧＤＦ）であり、筋肉の成長を抑制する機能を有する。すなわち、ミオスタチンの発現が抑制されれば筋肉の成長が促進されると考えられる。用いたミオスタチンｓｉＲＮＡは、５’−ＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵＣＡＣＧＣＵＡ−３’（配列番号８）及び５’−ＵＡＧＣＧＵＧＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵ−３’（配列番号９）の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡである。また、対照として、実施例１に記載のスクランブルｓｉＲＮＡを用いた。核酸の細胞内への導入キャリアとしては、ＳＹＣＯＬを用いた。ｓｉＲＮＡは、ＳＹＣＯＬと混合し、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬを形成した。ｓｉＲＮＡの終濃度は１０ｍＭとした。
【００６９】
＜導入試験＞
ネンブタール（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）によりマウスを麻酔し、ミオスタチンｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を左側咬筋に、スクランブルｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を右側咬筋に、それぞれ１００μｌ注射した。２週間後、両側の咬筋を単離し、分析に供した。左側咬筋を試験群、右側咬筋を対照群とした。
【００７０】
図３Ａは、単離した咬筋の重量を示す。試験群の重量は、対照群の重量に対し、顕著に大きいことが認められる。また、図３Ｂは、各群２００本ずつのミオフィブリル（筋原線維）の断面積の平均値を示す。試験群では、対照群と比較し、ミオフィブリルの断面積が１．８倍程度に増大していることが明らかとなった。以上より、ミオスタチンｓｉＲＮＡを導入することによる筋肉の増強が認められ、ミオスタチンの発現が有効に抑制されていることが示唆された。
【００７１】
＜ｍＲＮＡの定量＞
総ＲＮＡをマウス咬筋から抽出し、ミオスタチンｍＲＮＡの定量を行った。ｍＲＮＡの定量は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造製）とＤＮＡエンジンＯＰＴＩＣＯＮシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）によりミオスタチンｍＲＮＡから逆転写を行い、転写量をモニターすることで行った。用いた特異的プライマーの配列は、５’−ＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＴＡＧＧ−３’（フォワード）（配列番号１０）、５’−ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴ−３’（リバース）（配列番号１１）とした。結果を図３Ｃに示す。ミオスタチンｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体で処理した試験群においては、スクランブルｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体で処理した対照と比較し、ミオスタチンｍＲＮＡの量が４８％程度まで減少していた。よって、ミオスタチンｓｉＲＮＡによりＲＮＡ干渉が起こったものと考えられる。
【００７２】
なお、本実施例において、咬筋以外の組織には、ｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を投与することによる形態上の明らかな変化は認められなかった。また、本実施例において、ｓｉＲＮＡ／ＳＹＣＯＬ複合体を投与することによる、マウスにおける健康障害や死亡の兆候等の副作用も認められなかった。
【００７３】
以上より、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いることにより、ｓｉＲＮＡを組織に導入し、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが可能であると明らかになった。また、その際、目立った副作用は認められないことから、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いる核酸導入技術は臨床上有用であると考えられる。
【実施例４】
【００７４】
〔実施例４〕全身投与試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
本実施例では、核酸とコラーゲン様ペプチドとの複合体を形成させることによる、核酸のマウスへの全身投与の効果に与える影響について評価した。
【００７５】
＜材料＞
被験体としては、無胸腺ヌードマウスを、各試験群に２匹ずつ用いた。
【００７６】
核酸としては、ＧＬ３ｓｉＲＮＡを用いた。核酸の細胞内への導入キャリアとしては、ＳＹＣＯＬ及びＡＴＣＯＬを用いた。ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体は、０．０６％ＳＹＣＯＬとｓｉＲＮＡ溶液を等量ずつ混合し、４℃、２０分遠心して調製した。同様に、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ複合体を調製した。
【００７７】
＜導入試験＞
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁したＢ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ−Ｇ５メラノーマ細胞を、無胸腺ヌードマウスの左心室に皮下注射し（１ｘ１０6細胞／１００μｌ ＰＢＳ／箇所）、腫瘍の転移モデルを作成した。メラノーマ細胞を注射してから２日後、ＧＬ３ｓｉＲＮＡ単独、ＳＹＣＯＬ単独、並びにＧＬ３ｓｉＲＮＡとＳＹＣＯＬ及びＡＴＣＯＬそれぞれとの複合体をマウスの頭部に注射して投与した。投与量は、４ｎｍｏｌ／５０μｌ／５０ｍｍ3腫瘍とした。ｓｉＲＮＡの投与日を０日目とし、０日目と３日目に、極低温冷却されたＩＶＩＳシステムを用いた非侵襲バイオイメージングにより導入効果を測定した。導入効果はバイオイメージングの結果を基に発光強度として数値化した。なお、ＩＶＩＳシステムによる測定によっては、腫瘍の成長は影響を受けなかった。
【００７８】
図４Ａ、Ｂは、それぞれ頭部及び腹部における発光強度の推移を示す。腫瘍の形成に基づく発光が、０日目に、頭部及び腹部に認められた。ｓｉＲＮＡ単独やＳＹＣＯＬ単独で投与した群では、投与してから３日後には、０日目と比較して、頭部及び腹部とも発光強度が増大した。一方、ｓｉＲＮＡ／０．０５％ＡＴＣＯＬ投与群では、投与してから３日後には、頭部及び腹部ともに発光強度が減少した。また、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ投与群では、腹部の発光強度は増大したが、ｓｉＲＮＡ／０．０３％ＳＹＣＯＬ複合体の投与部位である頭部においては減少しており、頭部においてはルシフェラーゼの発現が持続的に阻害されていることが明らかとなった。よって、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いたｓｉＲＮＡの導入は、少なくともｓｉＲＮＡ投与箇所の付近において有効であることが示唆された。
【００７９】
以上の実施例より、ＳＹＣＯＬを導入キャリアとして用いることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいてもｓｉＲＮＡの導入効率を向上させることができると明らかとなった。すなわち、放射線照射コラーゲン様ペプチドを導入キャリアとして利用することにより、核酸を細胞内に効率的に導入できる。
【００８０】
なお、コラーゲンを導入キャリアとして用いる核酸導入法は公知である（国際公開第０３／０００２９７号）が、これは、生理条件下では核酸が負電荷、コラーゲンが正電荷を有するため、静電気的結合することにより複合体を形成するためであると考えられていた。すなわち、コラーゲンが導入キャリアとして機能するには、コラーゲンが正電荷を有することが重要であるとされていた。これは、ＡＴＣＯＬでも同様である。それに対し、実施例で用いたＳＹＣＯＬは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙのアミノ酸配列の繰り返しからなり、一般的なコラーゲンのようには正電荷を有さない。それにも関わらず、ＡＴＣＯＬや正電荷リポソームと同様に、核酸の分解を抑制し、核酸の細胞内への導入効率を高めることができたのは、驚くべき結果であった。さらに、ＳＹＣＯＬ等のコラーゲン様ペプチドが核酸の細胞への導入キャリアとして機能するには放射線の照射が必要である。放射線の照射によりコラーゲン様ペプチドが導入キャリアとしての機能を発揮するようになることは、予想できない新規な知見であった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、任意の核酸を効率的に細胞内に導入することができる。よって、本発明は、特に遺伝子の機能の解析や遺伝子治療に有効である。すなわち、本発明は、基礎研究や臨床応用に極めて有効に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、導入促進剤。
【請求項２】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項１に記載の導入促進剤。
【請求項３】
前記放射線が、電子線である、請求項１又は２に記載の導入促進剤。
【請求項４】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の導入促進剤。
【請求項５】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、複合体。
【請求項６】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記放射線が、電子線である、請求項５又は６に記載の複合体。
【請求項８】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、医薬組成物。
【請求項１０】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記放射線が、電子線である、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する医療用又は実験用器具。
【請求項１４】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、方法。
【請求項１５】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線が、電子線である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを含む、核酸の細胞内への導入促進剤であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、導入促進剤。
【請求項２】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項１に記載の導入促進剤。
【請求項３】
前記放射線が、電子線である、請求項１又は２に記載の導入促進剤。
【請求項４】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の導入促進剤。
【請求項５】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、核酸／コラーゲン様ペプチド複合体であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、複合体。
【請求項６】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記放射線が、電子線である、請求項５又は６に記載の複合体。
【請求項８】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチド及び核酸を含む、医薬組成物であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、医薬組成物。
【請求項１０】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記放射線が、電子線である、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸／コラーゲン様ペプチド複合体を保持する医療用又は実験用器具。
【請求項１４】
放射線を照射する処理をされたコラーゲン様ペプチドを核酸の細胞内導入キャリアとして用いることを特徴とする、核酸を細胞内に導入する方法であって、
前記コラーゲン様ペプチドが、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙの繰り返しからなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは繰り返しにおいて独立にＨｙｐ又はＰｒｏである、方法。
【請求項１５】
前記コラーゲン様ペプチドが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線が、電子線である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−２９６５１（Ｐ２０１２−２９６５１Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７２７１１（Ｐ２０１０−１７２７１１）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]