断片抗体のための精製方法
少なくとも１つの不純物もまた含む培地から断片抗体を精製するための方法を提供する。断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う。こうした精製方法を使用して、断片抗体を調製するための方法もまた提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、断片抗体（ｆＡｂ）の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
断片抗体（ｆＡｂ）は、療法分野範囲で、ますます重要になってきている。ｆＡｂを産生する最も重要な方法の１つは、組換え技術による。こうした技術は、宿主細胞を用いて、所望のｆＡｂを発現させ、これを次いで、産生培地から分離し、そして精製する。ＥＰ１５６１７５６は、核酸混入物からタンパク質を分離するための、酸性ｐＨを含むある範囲のｐＨの使用を開示する。ｐＨ処理前にアフィニティ・クロマトグラフィーによって培地が精製されるか、または低ｐＨ処理前に、使用するタンパク質試料が先に精製され、そして混入ＤＮＡが添加される。ＷＯ２００６／１０１４４１は、酢酸処理後の熱処理による、熱安定性アメリンおよびアメロゲニン・タンパク質の精製方法を開示する。ＷＯ９６／３３２０８は、培地から単離されたｆＡｂのクロマトグラフィー精製後の低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、ｆＡｂ精製のための方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＥＰ１５６１７５６
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１４４１
【特許文献３】ＷＯ９６／３３２０８
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１つの側面にしたがって、少なくとも１つの不純物もまた含む培地から断片抗体を精製するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う、前記方法を提供する。
【０００５】
本発明の第二の側面にしたがって、断片抗体を調製するための方法であって：
ａ）断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地を調製し；
ｂ）培地から断片抗体を精製する、ここで、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う
工程を含む、前記方法を提供する。
【０００６】
本発明の第三の側面にしたがって、断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地から不純物を分離するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させ、そして培地から不溶性不純物を分離する工程を含む、前記方法を提供する。
【０００７】
本発明で使用する培地は、ｐＨ６より大きい、好ましくは６．５より大きいｐＨを有するものである。特定の例において、より高いｐＨの培地を使用してもよいが、典型的には、ｐＨは８以下である。最も好ましくは、ｐＨは、６．７〜７．５であり、特に約７である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図２】図２は、すべての泳動によって、非常に精製されたドメイン断片が生じた結果を示す、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析である。
【図３】図３は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図４】図４は、すべての泳動によって、非常に精製されたＦａｂ断片が生じた結果を示す、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析である。
【図５】図５は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図６】図６は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図７】図７は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法によって精製可能な断片抗体は、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンドメインの集合を含み、そして抗原に結合可能であり、そして多くの態様において、少なくとも１つの重鎖、通常はＶＨ鎖、またはその機能する断片、あるいは軽鎖、通常はＶＬ鎖、またはその機能する断片を、少なくとも１つの他の鎖とともに含む、抗体の部分である。特定の態様において、ｆＡｂは、重鎖および軽鎖を含み、各鎖は、定常ドメインおよび可変ドメインで構成され、例えばＦａｂである。他の態様において、ｆＡｂは、２以上のドメインを含み、典型的には重鎖または軽鎖いずれかの可変および定常ドメインいずれかの組み合わせ、２つの重鎖由来の可変ドメインの組み合わせ、２つの軽鎖由来の可変ドメインの組み合わせ、あるいは軽鎖由来の可変ドメインおよび重鎖由来の可変ドメインの組み合わせである。いくつかの態様において、ｆＡｂは、解離を防止する柔軟なポリペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）。さらにさらなる態様において、ｆＡｂは、単一ドメイン、またはその断片、典型的には可変重鎖またはその断片、あるいは可変軽鎖またはその断片のいずれかを含む。さらにさらなる態様において、ｆＡｂは多量体形式、例えばビスｓｃＦｖ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディまたはｔａｎｄａｂである。
【００１０】
本発明の方法によって精製可能なｆＡｂの例には、組み合わされた重鎖および軽鎖を含むタンパク質またはポリペプチド構築物であって、各鎖が定常ドメインおよび可変ドメインで構成され、こうした免疫グロブリン軽鎖および重鎖が単一の機能する抗原結合部位を形成するよう相互作用する前記構築物が含まれる。
【００１１】
さらなる例には、ターゲットに結合可能であり、少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドであるＶＨ鎖に基づくドメイン抗体であって、結合ドメインが可変重鎖抗体の単一の可変ドメインまたはその機能する断片である、前記ドメイン抗体が含まれる。
【００１２】
さらにさらなる例には、ターゲットに結合可能であり、少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドであるＶＬ鎖に基づくドメイン抗体であって、結合ドメインが可変軽鎖抗体の単一の可変ドメインまたはその機能する断片である、前記ドメイン抗体が含まれる。
【００１３】
多くの態様において、本発明の方法によって精製されるｆＡｂは、５より大きい、好ましくは５．５より大きい、そして最も好ましくは６より大きいｐＩを有する。
ｆＡｂを精製する方法は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、沈降、結晶化およびクロマトグラフィーが含まれる。望ましい場合、こうした方法の組み合わせを使用してもよい。クロマトグラフィーは、精製の最も好ましい方法である。
【００１４】
ｆＡｂのクロマトグラフィー精製法は、当該技術分野に周知である。こうした方法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、特に陽イオン交換クロマトグラフィー；疎水性に基づくクロマトグラフィー、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、および混合様式クロマトグラフィー；サイズに基づく精製、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよびゲルろ過；ならびにアフィニティ・クロマトグラフィーが含まれる。望ましい場合、１以上のクロマトグラフィー工程を使用してもよく、特に、２以上の異なる方法を含む２以上のクロマトグラフィーを使用してもよく、例えばアフィニティ・クロマトグラフィー後にイオン交換クロマトグラフィーを使用してもよい。
【００１５】
特定の態様において、クロマトグラフィー精製は、アフィニティ・クロマトグラフィーを含む。ｆＡｂ精製に使用可能なアフィニティ・クロマトグラフィー法および媒体は、当該技術分野に知られ、そしてターゲットｆＡｂに対する選択的結合特性を有することによって選択される。こうした方法の例には、プロテインＡアフィニティ・クロマトグラフィーおよびプロテインＧアフィニティ・クロマトグラフィーが含まれる。特定の好ましい態様において、アフィニティ・クロマトグラフィー媒体は、式：
【００１６】
【化１】
【００１７】
式中、
Ｑは、場合によってスペーサー基を介した、固体支持体マトリックスへの付着を示し；
ＡおよびＢは、各々独立に、水素結合可能な１以上の置換基、好ましくは−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＣＯ２Ｈ基の１以上で置換された、Ｙ−フェニルまたはＹ−ナフチル基であり；
各Ｙは、独立に、−ＮＲ−、−Ｏ−または−Ｓ−を示し；そして
各Ｒは、独立に、ＨまたはＣ１−４アルキル基を示す
を有する、合成アフィニティ・リガンドを含む。
【００１８】
好ましいアフィニティ・リガンドは、式：
【００１９】
【化２】
【００２０】
式中、Ｑは、場合によってスペーサー基を介した、固体支持体マトリックスへの付着を示し、そしてＡおよびＢは、各々独立に、−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＣＯ２Ｈ基の１以上で置換された−ＮＨ−フェニルまたは−ＮＨ−ナフチル基である
の化合物である。ＡまたはＢのいずれかがフェニルを示す場合、置換基、最も好ましくは−ＯＨは、好ましくは、−ＮＨ部分への結合に対して、メタまたはパラの位に位置する。特に好ましいアフィニティ・リガンドには、式：
【００２１】
【化３】
【００２２】
および
【００２３】
【化４】
【００２４】
式中、Ｑは、場合によってスペーサー基を介した、固体支持体マトリックスへの付着を示す
の化合物が含まれる。
【００２５】
Ｑによって示されうるスペーサー基には、場合によって置換されたアミノアルキルアミノ部分、例えば、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−Ｇの基、式中、ｎは１２までの正の整数、好ましくは２〜６であり、そしてＧは固体支持体である；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−（ＣＨ２）ｘＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りであり、そしてｘは１〜６である、が含まれる。−ＣＨ２−部分の１以上は、１以上の置換基、例えばＯＨまたはＮＨ２基によって置換されてもよい。
【００２６】
アフィニティ・リガンドが付着してもよい固体支持体マトリックスは、アフィニティ・クロマトグラフィーの分野において周知であり、そしてこれには、合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールまたはポリスチレン、特に架橋合成ポリマー；無機支持体、例えばシリカに基づく支持体；および特に多糖支持体、例えばデンプン、セルロースまたはアガロースが含まれる。
【００２７】
特定の態様において、商標名ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ Ａ１ＰおよびＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ Ａ２Ｐのもとで、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより商業的に入手可能な支持アフィニティ・リガンドを用いて、優れた結果が達成されてきている。
【００２８】
ｆＡｂがアフィニティ・リガンドに結合する条件下で、ｆＡｂを含有する媒体および支持アフィニティ・リガンド間の接触を達成する。多くの態様において、水溶液はｆＡｂをほぼ中性のｐＨ（例えば約６〜８、例えば６．５〜７．５のｐＨ、そして特に７のｐＨ）で含む。水溶液は、好ましくは、低イオン強度、例えば５０ｍＳ／ｃｍ未満、例えば１０〜４０ｍＳ／ｃｍ未満、そして好ましくは３０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。好ましくは、実質的にすべてのｆＡｂがアフィニティ・リガンドに結合するまで、接触を続ける。ｆＡｂを含む媒体中に存在しうる多くの不純物は、アフィニティ・リガンドに結合せず、そしてしたがって、媒体中に残る。
【００２９】
通常、クロマトグラフィー・カラム中で支持アフィニティ・リガンドを使用し、そしてｆＡｂを含む媒体をカラムに流す。カラムへの単回通過を使用してもよいし、または代わりに、媒体をカラムに再循環させてもよい。２以上のカラムを順番に使用してもよい。
【００３０】
結合したｆＡｂを含む支持体を、ｆＡｂが結合したままである条件下で、例えば低イオン強度、およびほぼ中性のｐＨの水性緩衝液を使用して、１以上の洗浄溶液で洗浄してもよい。
【００３１】
次いで、ｆＡｂをリガンドから放出させる溶液と接触させることによって、例えばイオン強度を変化させることによって、ｆＡｂをアフィニティ・リガンドから分離してもよい。多くの態様において、溶出溶媒は、ｆＡｂがリガンドに付着する媒体よりも低いｐＨを有する水溶液、例えば２〜４の範囲のｐＨを有する緩衝溶液を含む。望ましい場合、溶出勾配を使用してもよい。
【００３２】
好ましい態様において、クロマトグラフィー法は、イオン交換クロマトグラフィー、そして特に陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。弱いまたは強い陽イオン交換樹脂を使用してもよい。通常、強い陽イオン交換樹脂は、ｐＨに応じて、スルホン酸またはスルホン酸基を含む支持有機基を含む。通常、弱い陽イオン交換樹脂は、ｐＨに応じて、カルボン酸またはカルボン酸基を含む支持有機基を含む。特定の態様において、多様式陽イオン交換樹脂は、さらなる結合機構ならびにイオン性相互作用、例えば水素結合相互作用および疎水性相互作用の１以上を取り込む。適切な陽イオン交換樹脂の例が当該技術分野に周知である。
【００３３】
本発明の方法において、培地のｐＨは、好ましくは６．０未満、通常５．５未満、最も好ましくは５未満のｐＨに減少している。多くの態様において、２．５より大きい、最も一般的には３．０以上、典型的には３．５以上、そして好ましくは４より大きいｐＨを使用する。多くの好ましい態様において、ｐＨは、３〜５、通常、４〜５、例えば４〜４．５の範囲のｐＨに減少する。
【００３４】
ｆＡｂが培地のｐＨ未満のｐＩ、特に５．５未満のｐＩを有する態様において、培地ｐＨを好適に、ｆＡｂのｐＩと０．５ｐＨ単位より大きく異なる、そして好ましくはｐＩと少なくとも１ｐＨ単位異なるｐＨに減少させる。ｆＡｂのｐＩが低い場合、例えば３．０以下である場合、ｐＨを好ましくはｐＩより少なくとも０．５ｐＨ単位大きいｐＨに減少させる。ｆＡｂのｐＩが比較的高い場合、例えば５〜５．５である場合、ｐＨを好ましくはｐＩより少なくとも０．５ｐＨ単位低いｐＨに減少させる。
【００３５】
本発明の特定の好ましい態様において、ｐＨ減少には、培地のイオン強度の減少が付随する。通常、イオン強度は５ｍＳｃｍ−１以下の伝導率に減少する。
本発明の他の好ましい態様において、特にｆＡｂが、培地ｐＨを減少させるｐＨに近いｐＩを有する場合、例えばこうしたｐＨの０．５ｐＨ単位以内のｐＩを有する場合、イオン強度を減少させず、そして好適に増加させてもよい。こうした態様において、２０ｍＳｃｍ−１以上、例えば２５ｍＳｃｍ−１、例えば２７〜５０ｍＳｃｍ−１を好適に使用してもよい。
【００３６】
必要なｐＨが達成されるまで酸を添加することによって、培地ｐＨを減少させてもよい。多くの態様において、酸は緩衝溶液を含む。特定の特に好ましい態様において、透析またはダイアフィルトレーションによって、所望のｐＨを有する緩衝液と培地を接触させる。透析またはダイアフィルトレーションの使用によって、培地のｐＨおよびイオン強度を同時に減少させることが可能になる。
【００３７】
ｆＡｂを含む培地は、通常、ｆＡｂをコードする組換え宿主細胞の発現によって得られる。宿主細胞は原核または真核であってもよい。原核細胞の例には、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むグラム陰性細菌細胞、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含むグラム陽性細菌細胞が含まれる。真核細胞の例には、酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クロイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が含まれる。使用可能な哺乳動物宿主細胞の例には、ヒト細胞株、例えばヒト胚性腎臓およびＰＥＲＣ．６細胞；ネズミ細胞株、例えばＮＳ０細胞；ならびに特にハムスター細胞株、例えばベビーハムスター腎臓細胞および特にチャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれる。他の真核宿主細胞、例えば糸状菌、植物、昆虫、両生類細胞または卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）種のものもまた使用可能である。好ましい宿主細胞は、細菌、特に腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ）、好ましくは大腸菌、そして特にそのＢまたはＫ１２株である。
【００３８】
関心対象の細胞に関して、当該技術分野で知られる方法を用いて宿主細胞を培養する。ｆＡｂが宿主細胞から分泌されてもよく、または細胞内に留まってもよく、あるいは両方の組み合わせであってもよいことが認識されるであろう。宿主細胞内に保持されるｆＡｂを、当該技術分野に知られる方法、例えば物理的分解、例えば高剪断混合または高圧ホモジナイゼーション、および化学的方法、例えばアルカリ界面活性剤を用いた、例えばＳＤＳでの処理による、細胞溶解また破壊によって得てもよい。
【００３９】
ターゲットタンパク質に加えて、培地は、通常、不純物、例えば損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞、部分的に分解された細胞、細胞壁構成要素、細胞断片、核酸および天然宿主細胞タンパク質の１以上を含む。
【００４０】
６未満のｐＨに減少させる前に、物理的分離、例えばろ過または遠心分離によって、培地中の不溶性構成要素を除去してもよい。ｐＨ減少に続いて、培地中の不溶性構成要素は、好ましくは、物理的手段、最も好ましくはろ過または遠心分離によって除去される。好ましくは、ｐＨ減少工程前に、不溶性構成要素を除去するための物理的分離は行わない。ろ過を使用する場合、正常流または接線流法のいずれかを使用してもよい。こうした方法で有用なフィルター媒体が当該技術分野に周知である。ｐＨ減少後の不溶性構成要素の除去に続いて、ｆＡｂの続く精製の前に、ｐＨを、例えばほぼ中性のｐＨに、例えば６〜８に、好ましくは６．５〜７．５に増加させてもよい。
【００４１】
本発明は、以下の例によって限定なしに例示される。
【実施例】
【００４２】
実施例１
組換え大腸菌株における周辺質発現によってドメイン抗体断片（抗ＴＮＦαドメイン）を産生した。断片ドメインは１２ｋＤａの総分子量を有し、そして細胞周辺質内に分泌され、そして続いて発酵増殖培地内に分泌される。発酵終了時には、存在する抗ＴＮＦα断片ドメインのレベルはほぼ２．３ｇ／Ｌであった。
【００４３】
抗ＴＮＦα断片ドメインの最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、２９ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．８のｐＨを有した。
【００４４】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、３つの異なる緩衝液に対して１６時間透析した。
１． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
２． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０
３． ２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。透析溶液の伝導率は、２．５〜４ｍＳ／ｃｍの範囲であった。
【００４５】
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動し、結果を図１に示す。
緩衝液の変化とともに、ｐＨを低下させた影響の結果、除去される宿主細胞タンパク質量が増加し、一方で、固体（ペレット）分画中に存在するドメイン断片の量が無視しうる量であることによってわかるように、すべての条件で、ドメイン断片は溶液中に残った。宿主細胞不純物からの最高の精製の傾向は、ｐＨ４＞ｐＨ５＞ｐＨ６であった。
【００４６】
２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５に透析し、次いで遠心分離して沈殿固体を取り除くことにより、この方式で処理した物質を、３つの異なる陽イオン交換媒体（Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ ＳおよびＳＰ ＸＬ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて精製した。１０ｃｍベッド高のカラムを用い、そして同一プロトコルを用いて、ドメイン断片の精製を行った。およそ１７ｇドメイン断片／媒体ｍｌまで、各カラム上に物質を装填した。カラムを２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で平衡化し、そして２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０まで、１５カラム体積に渡って、直線勾配で溶出させた。直線流速は１２０ｃｍ／時間であった。
【００４７】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によってわかるように、すべての泳動によって、非常に精製されたドメイン断片が生じ、この結果を図２に示す。
実施例２
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、Ｆａｂ（モノクローナル抗リゾチーム抗体Ｄ１．３由来）を産生した。総分子量４７．４ｋＤａのＦａｂ（２つの鎖を含む−一方の鎖は定常ドメインが付着した可変軽鎖ドメインで構成され、そして第二の鎖は定常ドメインが付着した可変重鎖ドメインで構成される）が細胞周辺質内に、そして続いて発酵増殖培地内に分泌された。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するＤ１．３のレベルはほぼ１００ｍｇ／Ｌであった。
【００４８】
Ｆａｂ Ｄ１．３の最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、２９．３ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．７のｐＨを有した。
【００４９】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、３つの異なる緩衝液に対して１６時間透析した。
１． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
２． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０
３． ２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。透析溶液の伝導率は、２．５〜４ｍＳ／ｃｍの範囲であった。
【００５０】
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動し、結果を図３に示す。
緩衝液の変化とともに、ｐＨを低下させた影響の結果、除去される宿主細胞タンパク質量が増加し、一方で、固体（ペレット）分画中に存在するＦａｂ断片の量が無視しうる量であることによってわかるように、すべての条件で、ドメイン断片は溶液中に残った。宿主細胞不純物からの最高の精製の傾向は、ｐＨ４＞ｐＨ５＞ｐＨ６であった。
【００５１】
２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６に透析し、次いで遠心分離して沈殿固体を取り除くことにより、この方式で処理した物質を、陽イオン交換媒体（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。２ｃｍベッド高のカラムを用い、そしてＦａｂ断片の精製を行った。カラムを２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化し、そして２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０まで、１０カラム体積に渡って、直線勾配で溶出させた。直線流速は１２０ｃｍ／時間であった。
【００５２】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によってわかるように、すべての泳動によって、非常に精製されたＦａｂ断片が生じ、この結果を図４に示す。
実施例３
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、ＶＨに基づくドメイン断片（抗ニワトリ卵白リゾチームドメインＨＥＬ４−Ｊｅｓｐｅｒｓら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００４）３３７ ８９３−９０３）を産生した。１２．８ｋＤａの分子量のドメインは、細胞周辺質内に分泌され、そして続いて発酵増殖培地内に分泌される。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するＨＥＬ４ドメインのレベルはほぼ１．５ｇ／Ｌであった。
【００５３】
ＨＥＬ４の最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、およそ３１ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．９のｐＨを有した。
【００５４】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、異なる緩衝液マトリックスに対して１６時間透析した。
【００５５】
【表１】
【００５６】
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動し、結果を図５に示す。
【００５７】
ｐＨを低下させた影響の結果、研究範囲に渡る伝導率には主に独立に、宿主細胞タンパク質の減少が生じる。ＨＥＬ４抗体断片を、宿主細胞タンパク質に対して抗体断片の精製を提供する、より低い溶液ｐＨで溶液中に維持する。このデータによって、ある条件（ｐＨ５）の元では、ＨＥＬ４抗体断片の多くは、溶液中に保持されず、そして宿主細胞タンパク質とともに沈殿することが示される。これは、タンパク質のｐＩ（およそ４．８）によって生じる。より低いｐＨでは、抗体断片は溶液中に残る一方、宿主細胞タンパク質は沈殿する。
【００５８】
実施例４
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、タンデム抗体断片由来の多価抗体断片（４つのドメインを各々含有する２つの鎖で構成されるｔａｎｄａｂ（国際特許出願ＷＯ２００７／０８８３７１の実施例１５に記載されるような、形式（ＶＨＶＬＶＨＶＬ）２の２つのＶＨおよび２つのＶＬドメイン））を産生した。およそ１００ｋＤａの全体分子量のｔａｎｔａｂは、細胞周辺質内に分泌され、そして続いて発酵増殖培地内に分泌される。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するｔａｎｔａｂのレベルはおよそ１００ｍｇ／Ｌと概算された。
【００５９】
ｔａｎｔａｂの最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、およそ３１ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．９のｐＨを有した。
【００６０】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、異なる緩衝液マトリックスに対して１６時間透析した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動し、結果を図６に示す。
【００６３】
図６でわかるように、ｐＨを低下させた影響の結果、研究範囲に渡る伝導率には主に独立に、宿主細胞タンパク質の減少が生じる。ｐＨ３での宿主細胞タンパク質に対して抗体断片の精製を提供するイオン強度範囲に渡って、ＥＬＩＳＡによって、ｔａｎｔａｂ抗体断片は、ｐＨ７およびｐＨ３の両方で、溶液中、類似の濃度で検出された。
【００６４】
実施例５
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、ｆＡｂ（モノクローナル抗リゾチーム抗体Ｄ１．３由来）を産生した。総分子量４７．４ｋＤａのｆＡｂ（２つの鎖−定常（ｃｏｎｔｅｓｔａｎｔ）ドメインが付着した可変軽鎖ドメインを含む重鎖、および定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）ドメインが付着した可変軽鎖ドメインを含む重鎖）が細胞周辺質内に、そして続いて発酵増殖培地内に分泌された。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するＤ１．３のレベルはほぼ１００ｍｇ／Ｌであった。
【００６５】
ｆＡｂＤ１．３の最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、およそ２９．３ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．７のｐＨを有した。
【００６６】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、異なる緩衝液マトリックスに対して１６時間透析した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動し、結果を図７に示す。
【００６９】
ｐＨを低下させた影響の結果、研究範囲に渡る伝導率には主に独立に、宿主細胞タンパク質の減少が生じる。宿主細胞タンパク質に対して抗体断片の精製を提供するｐＨおよびイオン強度範囲に渡って、プロテインＧ ｈｐｌｃによって測定した際、Ｄ１．３抗体断片は溶液中に維持された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、断片抗体（ｆＡｂ）の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
断片抗体（ｆＡｂ）は、療法分野範囲で、ますます重要になってきている。ｆＡｂを産生する最も重要な方法の１つは、組換え技術による。こうした技術は、宿主細胞を用いて、所望のｆＡｂを発現させ、これを次いで、産生培地から分離し、そして精製する。ＥＰ１５６１７５６は、核酸混入物からタンパク質を分離するための、酸性ｐＨを含むある範囲のｐＨの使用を開示する。ｐＨ処理前にアフィニティ・クロマトグラフィーによって培地が精製されるか、または低ｐＨ処理前に、使用するタンパク質試料が先に精製され、そして混入ＤＮＡが添加される。ＷＯ２００６／１０１４４１は、酢酸処理後の熱処理による、熱安定性アメリンおよびアメロゲニン・タンパク質の精製方法を開示する。ＷＯ９６／３３２０８は、培地から単離されたｆＡｂのクロマトグラフィー精製後の低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、ｆＡｂ精製のための方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＥＰ１５６１７５６
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１４４１
【特許文献３】ＷＯ９６／３３２０８
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１つの側面にしたがって、少なくとも１つの不純物もまた含む培地から断片抗体を精製するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う、前記方法を提供する。
【０００５】
本発明の第二の側面にしたがって、断片抗体を調製するための方法であって：
ａ）断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地を調製し；
ｂ）培地から断片抗体を精製する、ここで、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う
工程を含む、前記方法を提供する。
【０００６】
本発明の第三の側面にしたがって、断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地から不純物を分離するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させ、そして培地から不溶性不純物を分離する工程を含む、前記方法を提供する。
【０００７】
本発明で使用する培地は、ｐＨ６より大きい、好ましくは６．５より大きいｐＨを有するものである。特定の例において、より高いｐＨの培地を使用してもよいが、典型的には、ｐＨは８以下である。最も好ましくは、ｐＨは、６．７〜７．５であり、特に約７である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図２】図２は、すべての泳動によって、非常に精製されたドメイン断片が生じた結果を示す、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析である。
【図３】図３は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図４】図４は、すべての泳動によって、非常に精製されたＦａｂ断片が生じた結果を示す、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析である。
【図５】図５は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図６】図６は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【図７】図７は、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動した結果を示す、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法によって精製可能な断片抗体は、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンドメインの集合を含み、そして抗原に結合可能であり、そして多くの態様において、少なくとも１つの重鎖、通常はＶＨ鎖、またはその機能する断片、あるいは軽鎖、通常はＶＬ鎖、またはその機能する断片を、少なくとも１つの他の鎖とともに含む、抗体の部分である。特定の態様において、ｆＡｂは、重鎖および軽鎖を含み、各鎖は、定常ドメインおよび可変ドメインで構成され、例えばＦａｂである。他の態様において、ｆＡｂは、２以上のドメインを含み、典型的には重鎖または軽鎖いずれかの可変および定常ドメインいずれかの組み合わせ、２つの重鎖由来の可変ドメインの組み合わせ、２つの軽鎖由来の可変ドメインの組み合わせ、あるいは軽鎖由来の可変ドメインおよび重鎖由来の可変ドメインの組み合わせである。いくつかの態様において、ｆＡｂは、解離を防止する柔軟なポリペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）。さらにさらなる態様において、ｆＡｂは、単一ドメイン、またはその断片、典型的には可変重鎖またはその断片、あるいは可変軽鎖またはその断片のいずれかを含む。さらにさらなる態様において、ｆＡｂは多量体形式、例えばビスｓｃＦｖ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディまたはｔａｎｄａｂである。
【００１０】
本発明の方法によって精製可能なｆＡｂの例には、組み合わされた重鎖および軽鎖を含むタンパク質またはポリペプチド構築物であって、各鎖が定常ドメインおよび可変ドメインで構成され、こうした免疫グロブリン軽鎖および重鎖が単一の機能する抗原結合部位を形成するよう相互作用する前記構築物が含まれる。
【００１１】
さらなる例には、ターゲットに結合可能であり、少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドであるＶＨ鎖に基づくドメイン抗体であって、結合ドメインが可変重鎖抗体の単一の可変ドメインまたはその機能する断片である、前記ドメイン抗体が含まれる。
【００１２】
さらにさらなる例には、ターゲットに結合可能であり、少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドであるＶＬ鎖に基づくドメイン抗体であって、結合ドメインが可変軽鎖抗体の単一の可変ドメインまたはその機能する断片である、前記ドメイン抗体が含まれる。
【００１３】
多くの態様において、本発明の方法によって精製されるｆＡｂは、５より大きい、好ましくは５．５より大きい、そして最も好ましくは６より大きいｐＩを有する。
ｆＡｂを精製する方法は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、沈降、結晶化およびクロマトグラフィーが含まれる。望ましい場合、こうした方法の組み合わせを使用してもよい。クロマトグラフィーは、精製の最も好ましい方法である。
【００１４】
ｆＡｂのクロマトグラフィー精製法は、当該技術分野に周知である。こうした方法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、特に陽イオン交換クロマトグラフィー；疎水性に基づくクロマトグラフィー、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、および混合様式クロマトグラフィー；サイズに基づく精製、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよびゲルろ過；ならびにアフィニティ・クロマトグラフィーが含まれる。望ましい場合、１以上のクロマトグラフィー工程を使用してもよく、特に、２以上の異なる方法を含む２以上のクロマトグラフィーを使用してもよく、例えばアフィニティ・クロマトグラフィー後にイオン交換クロマトグラフィーを使用してもよい。
【００１５】
特定の態様において、クロマトグラフィー精製は、アフィニティ・クロマトグラフィーを含む。ｆＡｂ精製に使用可能なアフィニティ・クロマトグラフィー法および媒体は、当該技術分野に知られ、そしてターゲットｆＡｂに対する選択的結合特性を有することによって選択される。こうした方法の例には、プロテインＡアフィニティ・クロマトグラフィーおよびプロテインＧアフィニティ・クロマトグラフィーが含まれる。特定の好ましい態様において、アフィニティ・クロマトグラフィー媒体は、式：
【００１６】
【化１】
【００１７】
式中、
Ｑは、場合によってスペーサー基を介した、固体支持体マトリックスへの付着を示し；
ＡおよびＢは、各々独立に、水素結合可能な１以上の置換基、好ましくは−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＣＯ２Ｈ基の１以上で置換された、Ｙ−フェニルまたはＹ−ナフチル基であり；
各Ｙは、独立に、−ＮＲ−、−Ｏ−または−Ｓ−を示し；そして
各Ｒは、独立に、ＨまたはＣ１−４アルキル基を示す
を有する、合成アフィニティ・リガンドを含む。
【００１８】
好ましいアフィニティ・リガンドは、式：
【００１９】
【化２】
【００２０】
式中、Ｑは、場合によってスペーサー基を介した、固体支持体マトリックスへの付着を示し、そしてＡおよびＢは、各々独立に、−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＣＯ２Ｈ基の１以上で置換された−ＮＨ−フェニルまたは−ＮＨ−ナフチル基である
の化合物である。ＡまたはＢのいずれかがフェニルを示す場合、置換基、最も好ましくは−ＯＨは、好ましくは、−ＮＨ部分への結合に対して、メタまたはパラの位に位置する。特に好ましいアフィニティ・リガンドには、式：
【００２１】
【化３】
【００２２】
および
【００２３】
【化４】
【００２４】
式中、Ｑは、場合によってスペーサー基を介した、固体支持体マトリックスへの付着を示す
の化合物が含まれる。
【００２５】
Ｑによって示されうるスペーサー基には、場合によって置換されたアミノアルキルアミノ部分、例えば、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−Ｇの基、式中、ｎは１２までの正の整数、好ましくは２〜６であり、そしてＧは固体支持体である；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りである；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−（ＣＨ２）ｘＯ−Ｇ、式中、ｎおよびＧは先に定義される通りであり、そしてｘは１〜６である、が含まれる。−ＣＨ２−部分の１以上は、１以上の置換基、例えばＯＨまたはＮＨ２基によって置換されてもよい。
【００２６】
アフィニティ・リガンドが付着してもよい固体支持体マトリックスは、アフィニティ・クロマトグラフィーの分野において周知であり、そしてこれには、合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールまたはポリスチレン、特に架橋合成ポリマー；無機支持体、例えばシリカに基づく支持体；および特に多糖支持体、例えばデンプン、セルロースまたはアガロースが含まれる。
【００２７】
特定の態様において、商標名ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ Ａ１ＰおよびＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ Ａ２Ｐのもとで、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより商業的に入手可能な支持アフィニティ・リガンドを用いて、優れた結果が達成されてきている。
【００２８】
ｆＡｂがアフィニティ・リガンドに結合する条件下で、ｆＡｂを含有する媒体および支持アフィニティ・リガンド間の接触を達成する。多くの態様において、水溶液はｆＡｂをほぼ中性のｐＨ（例えば約６〜８、例えば６．５〜７．５のｐＨ、そして特に７のｐＨ）で含む。水溶液は、好ましくは、低イオン強度、例えば５０ｍＳ／ｃｍ未満、例えば１０〜４０ｍＳ／ｃｍ未満、そして好ましくは３０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する。好ましくは、実質的にすべてのｆＡｂがアフィニティ・リガンドに結合するまで、接触を続ける。ｆＡｂを含む媒体中に存在しうる多くの不純物は、アフィニティ・リガンドに結合せず、そしてしたがって、媒体中に残る。
【００２９】
通常、クロマトグラフィー・カラム中で支持アフィニティ・リガンドを使用し、そしてｆＡｂを含む媒体をカラムに流す。カラムへの単回通過を使用してもよいし、または代わりに、媒体をカラムに再循環させてもよい。２以上のカラムを順番に使用してもよい。
【００３０】
結合したｆＡｂを含む支持体を、ｆＡｂが結合したままである条件下で、例えば低イオン強度、およびほぼ中性のｐＨの水性緩衝液を使用して、１以上の洗浄溶液で洗浄してもよい。
【００３１】
次いで、ｆＡｂをリガンドから放出させる溶液と接触させることによって、例えばイオン強度を変化させることによって、ｆＡｂをアフィニティ・リガンドから分離してもよい。多くの態様において、溶出溶媒は、ｆＡｂがリガンドに付着する媒体よりも低いｐＨを有する水溶液、例えば２〜４の範囲のｐＨを有する緩衝溶液を含む。望ましい場合、溶出勾配を使用してもよい。
【００３２】
好ましい態様において、クロマトグラフィー法は、イオン交換クロマトグラフィー、そして特に陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。弱いまたは強い陽イオン交換樹脂を使用してもよい。通常、強い陽イオン交換樹脂は、ｐＨに応じて、スルホン酸またはスルホン酸基を含む支持有機基を含む。通常、弱い陽イオン交換樹脂は、ｐＨに応じて、カルボン酸またはカルボン酸基を含む支持有機基を含む。特定の態様において、多様式陽イオン交換樹脂は、さらなる結合機構ならびにイオン性相互作用、例えば水素結合相互作用および疎水性相互作用の１以上を取り込む。適切な陽イオン交換樹脂の例が当該技術分野に周知である。
【００３３】
本発明の方法において、培地のｐＨは、好ましくは６．０未満、通常５．５未満、最も好ましくは５未満のｐＨに減少している。多くの態様において、２．５より大きい、最も一般的には３．０以上、典型的には３．５以上、そして好ましくは４より大きいｐＨを使用する。多くの好ましい態様において、ｐＨは、３〜５、通常、４〜５、例えば４〜４．５の範囲のｐＨに減少する。
【００３４】
ｆＡｂが培地のｐＨ未満のｐＩ、特に５．５未満のｐＩを有する態様において、培地ｐＨを好適に、ｆＡｂのｐＩと０．５ｐＨ単位より大きく異なる、そして好ましくはｐＩと少なくとも１ｐＨ単位異なるｐＨに減少させる。ｆＡｂのｐＩが低い場合、例えば３．０以下である場合、ｐＨを好ましくはｐＩより少なくとも０．５ｐＨ単位大きいｐＨに減少させる。ｆＡｂのｐＩが比較的高い場合、例えば５〜５．５である場合、ｐＨを好ましくはｐＩより少なくとも０．５ｐＨ単位低いｐＨに減少させる。
【００３５】
本発明の特定の好ましい態様において、ｐＨ減少には、培地のイオン強度の減少が付随する。通常、イオン強度は５ｍＳｃｍ−１以下の伝導率に減少する。
本発明の他の好ましい態様において、特にｆＡｂが、培地ｐＨを減少させるｐＨに近いｐＩを有する場合、例えばこうしたｐＨの０．５ｐＨ単位以内のｐＩを有する場合、イオン強度を減少させず、そして好適に増加させてもよい。こうした態様において、２０ｍＳｃｍ−１以上、例えば２５ｍＳｃｍ−１、例えば２７〜５０ｍＳｃｍ−１を好適に使用してもよい。
【００３６】
必要なｐＨが達成されるまで酸を添加することによって、培地ｐＨを減少させてもよい。多くの態様において、酸は緩衝溶液を含む。特定の特に好ましい態様において、透析またはダイアフィルトレーションによって、所望のｐＨを有する緩衝液と培地を接触させる。透析またはダイアフィルトレーションの使用によって、培地のｐＨおよびイオン強度を同時に減少させることが可能になる。
【００３７】
ｆＡｂを含む培地は、通常、ｆＡｂをコードする組換え宿主細胞の発現によって得られる。宿主細胞は原核または真核であってもよい。原核細胞の例には、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むグラム陰性細菌細胞、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含むグラム陽性細菌細胞が含まれる。真核細胞の例には、酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クロイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が含まれる。使用可能な哺乳動物宿主細胞の例には、ヒト細胞株、例えばヒト胚性腎臓およびＰＥＲＣ．６細胞；ネズミ細胞株、例えばＮＳ０細胞；ならびに特にハムスター細胞株、例えばベビーハムスター腎臓細胞および特にチャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれる。他の真核宿主細胞、例えば糸状菌、植物、昆虫、両生類細胞または卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）種のものもまた使用可能である。好ましい宿主細胞は、細菌、特に腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ）、好ましくは大腸菌、そして特にそのＢまたはＫ１２株である。
【００３８】
関心対象の細胞に関して、当該技術分野で知られる方法を用いて宿主細胞を培養する。ｆＡｂが宿主細胞から分泌されてもよく、または細胞内に留まってもよく、あるいは両方の組み合わせであってもよいことが認識されるであろう。宿主細胞内に保持されるｆＡｂを、当該技術分野に知られる方法、例えば物理的分解、例えば高剪断混合または高圧ホモジナイゼーション、および化学的方法、例えばアルカリ界面活性剤を用いた、例えばＳＤＳでの処理による、細胞溶解また破壊によって得てもよい。
【００３９】
ターゲットタンパク質に加えて、培地は、通常、不純物、例えば損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞、部分的に分解された細胞、細胞壁構成要素、細胞断片、核酸および天然宿主細胞タンパク質の１以上を含む。
【００４０】
６未満のｐＨに減少させる前に、物理的分離、例えばろ過または遠心分離によって、培地中の不溶性構成要素を除去してもよい。ｐＨ減少に続いて、培地中の不溶性構成要素は、好ましくは、物理的手段、最も好ましくはろ過または遠心分離によって除去される。好ましくは、ｐＨ減少工程前に、不溶性構成要素を除去するための物理的分離は行わない。ろ過を使用する場合、正常流または接線流法のいずれかを使用してもよい。こうした方法で有用なフィルター媒体が当該技術分野に周知である。ｐＨ減少後の不溶性構成要素の除去に続いて、ｆＡｂの続く精製の前に、ｐＨを、例えばほぼ中性のｐＨに、例えば６〜８に、好ましくは６．５〜７．５に増加させてもよい。
【００４１】
本発明は、以下の例によって限定なしに例示される。
【実施例】
【００４２】
実施例１
組換え大腸菌株における周辺質発現によってドメイン抗体断片（抗ＴＮＦαドメイン）を産生した。断片ドメインは１２ｋＤａの総分子量を有し、そして細胞周辺質内に分泌され、そして続いて発酵増殖培地内に分泌される。発酵終了時には、存在する抗ＴＮＦα断片ドメインのレベルはほぼ２．３ｇ／Ｌであった。
【００４３】
抗ＴＮＦα断片ドメインの最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、２９ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．８のｐＨを有した。
【００４４】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、３つの異なる緩衝液に対して１６時間透析した。
１． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
２． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０
３． ２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。透析溶液の伝導率は、２．５〜４ｍＳ／ｃｍの範囲であった。
【００４５】
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動し、結果を図１に示す。
緩衝液の変化とともに、ｐＨを低下させた影響の結果、除去される宿主細胞タンパク質量が増加し、一方で、固体（ペレット）分画中に存在するドメイン断片の量が無視しうる量であることによってわかるように、すべての条件で、ドメイン断片は溶液中に残った。宿主細胞不純物からの最高の精製の傾向は、ｐＨ４＞ｐＨ５＞ｐＨ６であった。
【００４６】
２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５に透析し、次いで遠心分離して沈殿固体を取り除くことにより、この方式で処理した物質を、３つの異なる陽イオン交換媒体（Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ ＳおよびＳＰ ＸＬ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて精製した。１０ｃｍベッド高のカラムを用い、そして同一プロトコルを用いて、ドメイン断片の精製を行った。およそ１７ｇドメイン断片／媒体ｍｌまで、各カラム上に物質を装填した。カラムを２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で平衡化し、そして２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０まで、１５カラム体積に渡って、直線勾配で溶出させた。直線流速は１２０ｃｍ／時間であった。
【００４７】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によってわかるように、すべての泳動によって、非常に精製されたドメイン断片が生じ、この結果を図２に示す。
実施例２
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、Ｆａｂ（モノクローナル抗リゾチーム抗体Ｄ１．３由来）を産生した。総分子量４７．４ｋＤａのＦａｂ（２つの鎖を含む−一方の鎖は定常ドメインが付着した可変軽鎖ドメインで構成され、そして第二の鎖は定常ドメインが付着した可変重鎖ドメインで構成される）が細胞周辺質内に、そして続いて発酵増殖培地内に分泌された。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するＤ１．３のレベルはほぼ１００ｍｇ／Ｌであった。
【００４８】
Ｆａｂ Ｄ１．３の最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、２９．３ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．７のｐＨを有した。
【００４９】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、３つの異なる緩衝液に対して１６時間透析した。
１． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
２． ２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０
３． ２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。透析溶液の伝導率は、２．５〜４ｍＳ／ｃｍの範囲であった。
【００５０】
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して固体および上清分画両方を泳動し、結果を図３に示す。
緩衝液の変化とともに、ｐＨを低下させた影響の結果、除去される宿主細胞タンパク質量が増加し、一方で、固体（ペレット）分画中に存在するＦａｂ断片の量が無視しうる量であることによってわかるように、すべての条件で、ドメイン断片は溶液中に残った。宿主細胞不純物からの最高の精製の傾向は、ｐＨ４＞ｐＨ５＞ｐＨ６であった。
【００５１】
２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６に透析し、次いで遠心分離して沈殿固体を取り除くことにより、この方式で処理した物質を、陽イオン交換媒体（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。２ｃｍベッド高のカラムを用い、そしてＦａｂ断片の精製を行った。カラムを２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化し、そして２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０まで、１０カラム体積に渡って、直線勾配で溶出させた。直線流速は１２０ｃｍ／時間であった。
【００５２】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によってわかるように、すべての泳動によって、非常に精製されたＦａｂ断片が生じ、この結果を図４に示す。
実施例３
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、ＶＨに基づくドメイン断片（抗ニワトリ卵白リゾチームドメインＨＥＬ４−Ｊｅｓｐｅｒｓら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００４）３３７ ８９３−９０３）を産生した。１２．８ｋＤａの分子量のドメインは、細胞周辺質内に分泌され、そして続いて発酵増殖培地内に分泌される。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するＨＥＬ４ドメインのレベルはほぼ１．５ｇ／Ｌであった。
【００５３】
ＨＥＬ４の最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、およそ３１ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．９のｐＨを有した。
【００５４】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、異なる緩衝液マトリックスに対して１６時間透析した。
【００５５】
【表１】
【００５６】
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動し、結果を図５に示す。
【００５７】
ｐＨを低下させた影響の結果、研究範囲に渡る伝導率には主に独立に、宿主細胞タンパク質の減少が生じる。ＨＥＬ４抗体断片を、宿主細胞タンパク質に対して抗体断片の精製を提供する、より低い溶液ｐＨで溶液中に維持する。このデータによって、ある条件（ｐＨ５）の元では、ＨＥＬ４抗体断片の多くは、溶液中に保持されず、そして宿主細胞タンパク質とともに沈殿することが示される。これは、タンパク質のｐＩ（およそ４．８）によって生じる。より低いｐＨでは、抗体断片は溶液中に残る一方、宿主細胞タンパク質は沈殿する。
【００５８】
実施例４
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、タンデム抗体断片由来の多価抗体断片（４つのドメインを各々含有する２つの鎖で構成されるｔａｎｄａｂ（国際特許出願ＷＯ２００７／０８８３７１の実施例１５に記載されるような、形式（ＶＨＶＬＶＨＶＬ）２の２つのＶＨおよび２つのＶＬドメイン））を産生した。およそ１００ｋＤａの全体分子量のｔａｎｔａｂは、細胞周辺質内に分泌され、そして続いて発酵増殖培地内に分泌される。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するｔａｎｔａｂのレベルはおよそ１００ｍｇ／Ｌと概算された。
【００５９】
ｔａｎｔａｂの最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、およそ３１ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．９のｐＨを有した。
【００６０】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、異なる緩衝液マトリックスに対して１６時間透析した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動し、結果を図６に示す。
【００６３】
図６でわかるように、ｐＨを低下させた影響の結果、研究範囲に渡る伝導率には主に独立に、宿主細胞タンパク質の減少が生じる。ｐＨ３での宿主細胞タンパク質に対して抗体断片の精製を提供するイオン強度範囲に渡って、ＥＬＩＳＡによって、ｔａｎｔａｂ抗体断片は、ｐＨ７およびｐＨ３の両方で、溶液中、類似の濃度で検出された。
【００６４】
実施例５
組換え大腸菌株における周辺質発現によって、ｆＡｂ（モノクローナル抗リゾチーム抗体Ｄ１．３由来）を産生した。総分子量４７．４ｋＤａのｆＡｂ（２つの鎖−定常（ｃｏｎｔｅｓｔａｎｔ）ドメインが付着した可変軽鎖ドメインを含む重鎖、および定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）ドメインが付着した可変軽鎖ドメインを含む重鎖）が細胞周辺質内に、そして続いて発酵増殖培地内に分泌された。発酵終了時には、発酵槽上清中に存在するＤ１．３のレベルはほぼ１００ｍｇ／Ｌであった。
【００６５】
ｆＡｂＤ１．３の最初の単離には、細胞物質を除去する遠心分離が伴い、０．４５／０．２ミクロンフィルターを通じたろ過が続いた。生じた透明の溶液は、およそ２９．３ｍＳ／ｃｍの伝導率および６．７のｐＨを有した。
【００６６】
遠心分離しそしてろ過したこの上清の３つのアリコットを、異なる緩衝液マトリックスに対して１６時間透析した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
透析後、各試料を遠心分離し、そして固体および上清を別々に収集した。
還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、未処理上清の試料に対して、各試料に関して上清分画を泳動し、結果を図７に示す。
【００６９】
ｐＨを低下させた影響の結果、研究範囲に渡る伝導率には主に独立に、宿主細胞タンパク質の減少が生じる。宿主細胞タンパク質に対して抗体断片の精製を提供するｐＨおよびイオン強度範囲に渡って、プロテインＧ ｈｐｌｃによって測定した際、Ｄ１．３抗体断片は溶液中に維持された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの不純物もまた含む培地から断片抗体を精製するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う、前記方法。
【請求項２】
断片抗体を調製するための方法であって：
ａ）断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地を調製し；
ｂ）培地から断片抗体を精製する、ここで、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地から不純物を分離するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させ、そして培地から不溶性不純物を分離する工程を含む、前記方法。
【請求項４】
培地ｐＨが６〜８である、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項５】
培地ｐＨが６．７〜７．５である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
培地ｐＨを６．０未満のｐＨに減少させる、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項７】
培地ｐＨを３〜５の範囲のｐＨに減少させる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ｐＨの減少に、培地のイオン強度の減少が付随する、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項９】
イオン強度を５ｍＳｃｍ−１以下の伝導率に減少させる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびゲルろ過またはアフィニティ・クロマトグラフィーを含む精製方法によって、断片抗体を精製する、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項１１】
精製方法が陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
断片抗体が、Ｆａｂ断片；ＳｃＦｖ断片または単一ドメイン抗体、あるいはその断片である、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項１３】
断片抗体をコードする組換え宿主細胞の発現によって培地を得る、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
大腸菌がそのＢまたはＫ１２株である、請求項１４記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つの不純物もまた含む培地から断片抗体を精製するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う、前記方法。
【請求項２】
断片抗体を調製するための方法であって：
ａ）断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地を調製し；
ｂ）培地から断片抗体を精製する、ここで、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させた後に、精製を行う
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
断片抗体および少なくとも１つの不純物を含む培地から不純物を分離するための方法であって、断片抗体が可溶性であるが、不純物の１以上が不溶性であるｐＨまで、培地のｐＨを減少させ、そして培地から不溶性不純物を分離する工程を含む、前記方法。
【請求項４】
培地ｐＨが６〜８である、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項５】
培地ｐＨが６．７〜７．５である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
培地ｐＨを６．０未満のｐＨに減少させる、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項７】
培地ｐＨを３〜５の範囲のｐＨに減少させる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ｐＨの減少に、培地のイオン強度の減少が付随する、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項９】
イオン強度を５ｍＳｃｍ−１以下の伝導率に減少させる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびゲルろ過またはアフィニティ・クロマトグラフィーを含む精製方法によって、断片抗体を精製する、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項１１】
精製方法が陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
断片抗体が、Ｆａｂ断片；ＳｃＦｖ断片または単一ドメイン抗体、あるいはその断片である、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項１３】
断片抗体をコードする組換え宿主細胞の発現によって培地を得る、先行する請求項いずれか記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
大腸菌がそのＢまたはＫ１２株である、請求項１４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０４５８６（Ｐ２０１２−５０４５８６Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２９６１９（Ｐ２０１１−５２９６１９）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２３６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０９８８
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０８２３６０３３）フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ ・ユーケイ・リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２３６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０９８８
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０８２３６０３３）フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ ・ユーケイ・リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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