本発明は、テルペノイドと、ステロールと、免疫調節物質と、ポリマーと、Ｔｈ２刺激物質との様々な組合せを含むアジュバント製剤、アジュバント組成物を作製するための方法、ならびに様々な抗原との免疫原性組成物およびワクチン組成物におけるアジュバント製剤の使用に関するものである。本発明はさらに、動物の治療におけるこの製剤の使用にも関するものである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、対象における毒性効果または望ましくない副作用を生じさせることのない、免疫原性組成物およびワクチン組成物において用いるための、抗原に対する免疫応答を増強するための新規なアジュバント製剤に関する。本発明はまた、アジュバント組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物の調製方法および使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、ウイルス、および寄生虫の感染は、ヒトおよび動物において蔓延している。これらの感染物質により生じる疾患は、抗微生物の薬学的療法に対して耐性であることが多く、その場合、治療の効果的手段はもはや存在しない。その結果、ワクチン学的アプローチが、感染性疾患を制御するために次第に用いられている。化学的不活性化または適切な遺伝子操作によって、感染性病原体の全体を、ワクチン製剤における使用に適するようにすることができる。あるいは、病原体のタンパク質サブユニットは、組換え発現系において発現し得、ワクチン製剤における使用のために精製される。ワクチンは、組成物に適切なアジュバントを含ませることによって、より有効なものとすることができる。
【０００３】
動物およびヒトにおける癌の治療にワクチン学的アプローチを用いることに対する興味も増大している。癌を治療するためのこの治療的アプローチは、癌患者に、腫瘍特異的抗原とアジュバントとを含むワクチンでワクチン接種することを伴う。しかし、開発中の多くのこの性質の癌ワクチンのいずれも、規制当局により認可されていない。ワクチンは、癌用薬剤の有効性の標準的な尺度である腫瘍の縮小をもたらすことが示されていない。
【０００４】
「アジュバント」という用語は、通常、抗原に対する液性免疫応答または細胞性免疫応答を増大させるあらゆる材料を指す。アジュバントは、２つの目的を達成するために用いられる。すなわち、それらは注入部位からの抗原の放出を遅延させ、かつ、それらは免疫系を刺激する。従来のワクチンは通常、不活化された、または死滅した、または修飾された生の病原性微生物の粗調製物からなる。病原性微生物のこれらの培養物を伴う不純物は、免疫応答を増強させるためのアジュバントとして作用し得る。しかし、病原性微生物の均質な調製物または精製タンパク質サブユニットを抗原として用いるワクチンにより引き起こされる免疫性は、弱いことが多い。したがって、アジュバントなどの特定の外因性材料の添加が必要となる。さらに、合成ワクチンおよびサブユニットワクチンは製造が高価である。アジュバントの添加により、より少ない用量の抗原を用いて同様の免疫応答を刺激することが可能になり得、それにより、ワクチンの製造コストが減少する。したがって、作用物質をアジュバントと組み合わせると、いくつかの注入可能な薬物の有効性は有意に増大し得る。
【０００５】
アジュバントの選抜には多くの因子が考慮されなくてはならない。アジュバントは、宿主に対する毒性効果、アレルギー誘発性効果、刺激性効果、および他の望ましくない効果が最小の、効率的な様式で、抗原の比較的低速の放出および吸着を生じさせるべきである。望ましいものとするには、アジュバントは、非殺ウイルス性であり、生分解性であり、高レベルの免疫性を常に生じさせ得、交差防御を刺激し得、多抗原に適合し、複数の種において有効であり、非毒性であり、かつ宿主に対して安全である（例えば、注入部位の反応がない）べきである。アジュバントの他の望ましい特徴は、それが、微量投与が可能であること、用量を節約するものであること、優れた貯蔵安定性を有すること、乾燥に適していること、オイルフリーで作製され得ること、個体または液体として存在し得ること、等張性であること、容易に製造されること、かつ製造が安価であることである。最後に、アジュバントは、ワクチン接種の計画の要件に応じて、液性免疫応答もしくは細胞性免疫応答のいずれかまたはその両方を誘発するように構成可能であることが非常に望ましい。しかし、上記の要件を満たし得るアジュバントの数は限られている。
【０００６】
アジュバントの選択は、ワクチンに対する要求が抗体応答の程度もしくは機能の増大であっても、細胞介在性免疫応答の増大であっても、粘膜免疫の誘発であっても、または抗原用量の低減であっても、それに応じる。多くのアジュバントが提案されているが、いずれも全てのワクチンに理想的に適していることは示されていない。文献において報告された最初のアジュバントはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）であり、これは、油中水型エマルジョンおよびマイコバクテリウム抽出物を含有するものである。残念なことに、ＦＣＡは耐性が低く、制御されていない炎症を生じさせ得る。８０年以上前のＦＣＡの発見以来、アジュバントの望ましくない副作用を低減させるための試みが行われている。
【０００７】
アジュバントとして用いられているいくつかの他の材料には、金属酸化物（例えば、水酸化アルミニウム）、ミョウバン、塩の無機キレート、ゼラチン、様々なパラフィンタイプの油、合成樹脂、アルギン酸塩、ムコイドおよび多糖化合物、カゼイン塩、ならびにフィブリン塊などの血液由来物質が含まれる。これらの材料は通常、免疫系の刺激に有効であるが、宿主における副作用（例えば、無菌性膿瘍の生成、器官の損傷、発癌性、もしくはアレルギー誘発性応答）、または望ましくない薬学的特性（例えば、注入部位からの迅速な分散もしくは分散の不十分な制御、または材料の膨潤）のために、いずれも完全に満足のいくものであるとはされていない。
【０００８】
合成油および石油誘導体は、体内において比較的遅い分散を示すため、アジュバントとして用いられているが、それらは発癌性であり得る芳香族炭化水素に分解されることが多いため、望ましくない可能性がある。さらに、これらの物質のいくつかは、無菌性膿腫を生じさせ得ることが明らかになっており、身体から決して完全には除去されない可能性がある。油は、適切に選抜され適当な濃度で製剤されると、比較的安全で非毒性であり得る。
【０００９】
南アメリカの木であるキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から得られるサポニンは、ここしばらくの間、アジュバントとして用いられている。Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，ＭおよびＷａｇｎｅｒ Ｈ．（Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ ３６３−３８６．１９９６）を参照されたい。今日用いられている動物用のワクチンの多くは、南アメリカの木であるキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から得られるサポニン画分であるＱｕｉｌ Ａを含有する。Ｑｕｉｌ Ａのさらなる分画により、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−２１を含む下位画分が得られている（米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）。
【００１０】
アジュバントとしてのサポニンの使用は、多くの不都合を伴う。サポニンは可溶性であり、したがって、非特異的免疫応答を刺激する。しかし、ワクチン学の目的は、１つまたは複数の特異的抗原に対して標的化された応答を刺激することである。サポニンは、コレステロールに対する強力な親和性を有する。それらは、細胞の溶血を生じさせる、細胞膜において見られるコレステロールとの複合体を形成する。それらはまた、注入部位での壊死を生じさせること、および粒子構造への製剤が困難であることが示されている。エンベロープを有する修飾生ウイルスを含有するワクチンにおいて用いられる場合、サポニンはウイルスのエンベロープを崩壊させ、それによりウイルス抗原を不活化する。
【００１１】
Ｑｕｉｌ Ａの溶血特性および殺ウイルス特性を克服するために、Ｑｕｉｌ Ａは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）またはＩＳＣＯＭマトリクス（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）として知られている特異的構造を形成するコレステロールおよびリン脂質と組み合わされている。Ｏｚｅｌ Ｍ．ら、Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃ．ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃ．Ｒｅ １０２、２４０〜２４８（１９８９）を参照されたい。ＩＳＣＯＭは通常、抗原と組み合わされると、Ｔｈ１細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発する。しかし、Ｑｕｉｌ Ａとコレステロールとを組み合わせると、Ｑｕｉｌ Ａの溶血特性は大きく低減する一方、それらは完全には除去されない。ＩＳＣＯＭの別の制限は、タンパク質抗原が、ＩＳＣＯＭと相互作用してＩＳＣＯＭ内に組み込まれるために十分に長い疎水性ドメインを有していなくてはならないことである。非常に疎水性であるタンパク質はＩＳＣＯＭ内に組み込まれ得ない。最後に、ＩＳＣＯＭは、対象において望ましくない自己免疫反応を刺激し得る。
【００１２】
免疫調節物質はアジュバントとして用いられており、例として、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（以下、「ＤＤＡ」）およびアビルジン（avirdine）が含まれる。ＤＤＡは、分子量が６３１の、１８個の炭素からなるアルキル鎖２つと、正に荷電した第４級アンモニウム分子に結合した２つのメチル基とを有する、親油性の第４級アンモニウム化合物（アミン）である。アジュバントとしてのその使用は、Ｇａｌｌにより発見された（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖ．１１、ｐ．３６９、１９６６）。ＤＤＡは、強力な細胞介在性免疫応答を刺激することが報告されており、液性免疫応答を誘発することも示されている。タンパク質抗原、ハプテン、腫瘍、ウイルス、原虫、および細菌についてのアジュバントとしてのＤＤＡの有効性を示す多くの書面が発行されている（Ｋｏｒｓｈｏｌｍ，ＫＳ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１２１、ｐｐ．２１６〜２２６、２００７を参照されたい）。ほとんどの研究が実験動物で行われているが、ごくわずかなものは、ニワトリ（Ｋａｔｚ，Ｄ．ら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ７（４）：３０３〜３１３、１９９３を参照されたい）、豚、および牛などの、より大きな動物で実施されている。ＤＤＡは、実験動物および大きな動物の両方において、遅延型過敏（ＤＴＨ）反応の誘発に効果的である。しかし、ＤＤＡは水にはあまり可溶性ではない。
【００１３】
ポリマーもアジュバントとして用いられており、例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン、ポリエチレングリコール、およびポリアクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））が含まれる。多糖ＤＥＡＥデキストランは、当技術分野において、非常に強力なアジュバントとして知られている。しかし、これは受け入れがたい反応源性を伴っている。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ポリマーは、ポリアルケニルエーテルまたはジビニルグリコールと架橋したアクリル酸のポリマーである。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）は多くのワクチンにおいて用いられているが、アジュバントとしてのその使用は証明されていない。
【００１４】
いくつかのアジュバントはＴｈ２応答を刺激することが示されており、例としては、酢酸塩形態の場合にＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）という商品名でも知られている、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセタート、およびアルミニウムが含まれる。精製ウイルスワクチンまたはサブユニットワクチンと組み合わせたＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）により、ウイルスでチャレンジしたマウスにおける抗体の産生が増大した。他の動物種（豚、羊、馬）における前臨床試行は、抗体産生に関して同程度の結果をもたらした。Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）により誘発される抗体合成の増大は、抗原に特異的に依存しており、ポリクローナル刺激の結果ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の前に、いずれのアジュバント製剤も、理想的なアジュバントが有するべき広範な望ましい特徴を有していなかった。従来のアジュバントの欠点を克服する、ワクチンのための新規なアジュバントを見出すための試みがなされている。とりわけ、ヒトおよび動物において広範な抗原に対する強力な細胞介在性免疫応答および液性免疫応答を引き起こすが従来のアジュバントの副作用および製剤の困難性は有さないアジュバント製剤が非常に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、新規なアジュバント組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物に関する。とりわけ、本発明は、Ｔｈ１刺激因子、免疫調節物質、ポリマー、およびＴｈ２刺激因子を含むアジュバント製剤に関する。本発明はまた、このようなアジュバント製剤と１つまたは複数の抗原とを含む免疫原性組成物およびワクチン組成物、ならびにアジュバント組成物およびワクチン組成物を調製する方法にも関する。
【００１７】
一実施形態において、アジュバント組成物は、サポニン、ステロール、および第４級アンモニウム化合物の組合せを含む。１つの実施形態において、アジュバントの組合せは、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、およびＤＤＡを含む。
【００１８】
別の実施形態において、アジュバント組成物は、サポニン、ステロール、第４級アンモニウム化合物、およびポリマーの組合せを含む。一実施形態において、アジュバントの組合せは、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、およびポリアクリル酸である。
【００１９】
別の実施形態において、アジュバント組成物は、サポニン、ステロール、第４級アンモニウム化合物、ポリマー、および糖脂質の組合せを含む。一実施形態において、アジュバントの組合せは、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ポリアクリル酸、およびＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）である。
【００２０】
一実施形態において、アジュバント製剤と免疫学的に効果的な量の抗原とを含む免疫原性組成物であって、前記アジュバント製剤が、サポニン、ステロール、第４級アンモニウム化合物、ポリマーおよび糖脂質を含む免疫原性組成物は、
ａ）緩衝液中で抗原の組成物を調製するステップ、
ｂ）ステップａの組成物にサポニンを添加するステップ、
ｃ）ステップｂの組成物にステロールを添加するステップ、
ｄ）ステップｃの組成物に第４級アンモニウム化合物を添加するステップ、
ｅ）ステップｄの組成物にポリマーを添加するステップ
を含むプロセスによって調製される。
【００２１】
このプロセスの一実施形態において、サポニンはＱｕｉｌ Ａであり、ステロールはコレステロールであり、第４級アンモニウム化合物はＤＤＡであり、ポリマーはポリアクリル酸である。
【００２２】
一実施形態において、アジュバント製剤と免疫学的に効果的な量の抗原とを含むワクチンであって、アジュバント製剤が、サポニン、ステロール、第４級アンモニウム化合物、およびポリマーを含むワクチンは、
ａ）緩衝液中で抗原の組成物を調製するステップ、
ｂ）ステップａの組成物にサポニンを添加するステップ、
ｃ）ステップｂの組成物にステロールを添加するステップ、
ｄ）ステップｃの組成物に第４級アンモニウム化合物を添加するステップ、
ｅ）ステップｄの組成物にポリマーを添加するステップ、および
ｆ）ステップｅの組成物に糖脂質を添加するステップ
を含むプロセスによって調製される。
【００２３】
このプロセスの一実施形態において、サポニンはＱｕｉｌ Ａであり、ステロールはコレステロールであり、第４級アンモニウム化合物はＤＤＡであり、ポリマーはポリアクリル酸であり、かつ、糖脂質はＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）である。
【００２４】
本明細書において報告されるアジュバント組成物は、このような組合せから予想される特性を超える、驚くべきかつ予期せぬ特性を有することが明らかにされている。驚くべきことに、Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロールの殺ウイルス特性がこれらのアジュバント組成物において引き起こされることが明らかにされている。それらは、凍結乾燥された修飾生ウイルス抗原のための希釈剤として適している。本明細書において記載されるアジュバント組成物は、細胞介在性免疫応答、液性免疫応答のいずれか、またはその両方に対する非常に強力な免疫応答を引き起こすように構成可能である。さらに、これらのアジュバント製剤を用いることにより、注入部位の反応の大部分を避けることができる。反応源性は、組合せアジュバントを含むいくつかの個別の成分の反応源性よりも低い。さらに、これらのアジュバント製剤は、長期の保管能力をもたらす。
【００２５】
本出願人らは、これらの新規なアジュバント組成物が、広範な種にわたって、多くの異なる抗原の１つまたは複数と組み合わされると非常に免疫原性であることを発見した。それらは、１つまたは複数のウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質、組換えタンパク質、および合成ペプチド抗原、ならびにその組合せと共に用いることができる。新規なワクチンアジュバント組成物は、癌を治療するための治療用ワクチンにおいて用いることができる。
【００２６】
したがって、本発明は、アジュバント組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物を提供する。さらに、組成物を製造するための方法も提供される。また、疾患の治療におけるそれらの使用も提供される。また、疾患について、とりわけ以下に記載される疾患について対象を治療するための医薬品の調製におけるそれらの使用も提供される。また、対象における疾患を予防するかまたは低減させるための医薬品の調製におけるそれらの使用も提供される。
【００２７】
さらに、ネコ白血病ウイルスにより生じる感染に対してネコを治療するため、トリコクシジウム症に対してトリを治療するため、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により生じる疾患についてウシを治療するため、ウシウイルス性下痢ウイルスにより生じる疾患に対してウシを治療するため、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により生じる疾患についてブタを治療するため、ネコインフルエンザウイルスにより生じる疾患についてネコを治療するため、癌に対して対象を治療するため、イヌコロナウイルスにより生じる疾患についてイヌを治療するため、ウシロタウイルスにより生じる疾患についてウシを治療するため、およびイヌインフルエンザウイルスにより生じる疾患についてイヌを治療するための医薬品の調製におけるそれらの使用も提供される。また、ワクチン接種されている動物の同定に役立つマーカーワクチンとしてのアジュバントの使用も提供される。また、アジュバントの効果を増強させるためのＣｐＧの使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＢＶＤウイルスのＮＳ２／３タンパク質とＥ２タンパク質との間の抗体プロフィールの差を示す、放射性免疫沈降アッセイによるゲルのランを示す図である。ＰｒｅＺｅｎｔ Ａ処理群は、ＮＳ２／３タンパク質とＥ２タンパク質との両方に対する抗体応答を示すが、ＱＣＤＣおよびＱＣＤＣＲ処理群は、Ｅ２タンパク質のみに対する抗体応答を示し、ＮＳ２／３タンパク質に対しては示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して用いられる場合、示された変数値、および、示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％の信頼区間内）にある全ての変数値または示された値の１０％内にある全ての変数値のどちらか大きい方を指すが、これは、約が週単位の時間間隔について用いられる場合を除くものであり、その場合においては、「約３週間」は１７から２５日間であり、約２から約４週間は１０から４０日間である。
【００３０】
「アジュバント」は、抗原に対する液性免疫応答または細胞性免疫応答を増大させるあらゆる物質を意味する。アジュバントは通常、注入部位からの抗原の放出の遅延および免疫系の刺激という２つの目的を達成するために用いられる。
【００３１】
「アルキル」は、直鎖状および分枝鎖状の両方の飽和炭化水素部分を指す。
【００３２】
「アミン」は、窒素を含有する化学的化合物を指す。アミンは、水素原子を炭化水素基に置換することによりアンモニアから派生する、化合物の基である。「第４級アミン」は、４つの炭化水素基を有する、アンモニアベースの化合物を指す。
【００３３】
「抗体」は、特異的抗原に対する免疫応答の結果としてその抗原に結合し得る、免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有する「軽」ポリペプチド鎖および「重」ポリペプチド鎖からなる血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいてクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられている。
【００３４】
「抗原」または「免疫原」は、免疫応答を刺激するあらゆる物質を指す。この用語には、死滅した、不活化された、弱毒化された、または修飾された生の細菌、ウイルス、または寄生虫が含まれる。この抗原という用語にはまた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成タンパク質、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、もしくは脂質、またはその断片が、個別に、またはそのあらゆる組合せで含まれる。抗原という用語にはまた、抗イディオタイプ抗体またはその断片などの抗体、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープが含まれる。
【００３５】
「バクテリン」は、ワクチン組成物または免疫原性組成物の成分として用いられ得る１つまたは複数の死滅細菌の懸濁液を意味する。
【００３６】
「緩衝液」は、別の化学物質の濃度の変化を防ぐ化学系、例えば、水素イオン濃度（ｐＨ）の大きな変化を防ぐ緩衝液として働くプロトンドナー系およびアクセプター系を意味する。緩衝液のさらなる例は、弱酸およびその塩（共役塩基）の混合物または弱塩基およびその塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【００３７】
「細胞性免疫応答」または「細胞介在性免疫応答」は、Ｔリンパ球または他の白血球細胞またはその両方が介在する免疫応答であり、サイトカイン、ケモカイン、および、活性化されたＴ細胞、白血球細胞、またはその両方により産生される類似の分子の産生が含まれる。
【００３８】
「コレステロール」は、Ｃ_２７Ｈ_４５ＯＨという化学式を有する白色の結晶物質を指す。これは、脂質として分類される環状炭化水素アルコールである。これは、水に不溶性であるが、多くの有機溶剤には可溶性である。
【００３９】
「遅延型過敏（ＤＴＨ）」は、免疫系により異物と認識される抗原への曝露の２４から７２時間後に現れる炎症性応答を指す。このタイプの免疫応答は、（Ｂ細胞により作られる）抗体よりも主にＴ細胞を伴う。
【００４０】
「用量」は、対象に与えられるワクチン組成物または免疫原性組成物を指す。「初回用量」または「プライムワクチン」は、０日目に与えられるこのような組成物の用量を指す。「二次用量」または「三次用量」または「年間用量」は、初回用量と同一のワクチン組成物または免疫原性組成物であってもなくてもよい、初回投与に続いて与えられるこのような組成物の量を指す。
【００４１】
「乳化剤」は、エマルジョンをより安定にするために用いられる物質を意味する。
【００４２】
「エマルジョン」は、１つの液体の小液滴が他の液体の連続相において懸濁している、２つの非混和性液体の組成物を意味する。
【００４３】
「エステル」は、有機酸分子がアルコール分子と合体して水分子を除去する縮合反応から形成される、無機塩に対応する、あらゆる有機化合物を指す。
【００４４】
「賦形剤」は、抗原ではない、ワクチンのあらゆる成分を指す。
【００４５】
「均質化（homogenation）」は、類似しているかまたは類似していない１つまたは複数の成分を単一の混合物に混合するプロセスを指す。
【００４６】
「液性免疫応答」は、抗体が介在する免疫応答を指す。
【００４７】
「疎水性」は、水に不溶性であること、水分を容易に吸収しないこと、または水により悪影響を受けることであり、水と不適合であるかまたは水に対する親和性をほとんど有していないことを意味する。
【００４８】
対象における「免疫応答」は、抗原に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性および細胞性免疫応答の発現を指す。免疫応答は通常、当技術分野において知られている標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて判定され得る。
【００４９】
抗原の「免疫学的に防御的な量」または「免疫学的に効果的な量」または「免疫応答を生じさせるために効果的な量」は、レシピエントにおいて免疫原性応答を誘発するために効果的な量である。免疫原性応答は、診断目的もしくは他の試験のために十分であり得るか、または、疾患物質の感染により生じる健康への悪影響もしくはその合併症を含む疾患の兆候もしくは症候を予防するために適し得る。液性免疫もしくは細胞介在性免疫のいずれかまたはその両方が誘発され得る。免疫原性組成物に対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、または、野生型株でのチャレンジ後の兆候および症候のモニタリングを介して直接的に判断することができ、一方、ワクチンにより付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温、全体的な身体状態、ならびに対象の全体的な健康および能力などの臨床的兆候の低減を測定することによって判断することができる。免疫応答は、限定はしないが、細胞性免疫および／または液性免疫の誘発を含み得る。
【００５０】
「免疫原性」は、免疫応答または抗原応答を引き起こすことを意味する。したがって、免疫原性組成物は、免疫応答を誘発するあらゆる組成物である。
【００５１】
「免疫刺激複合体」またはＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ Ａがコレステロールおよびリン脂質と組み合わされると形成される、特異的構造を指す。
【００５２】
「免疫刺激分子」は、免疫応答を生じさせる分子を指す。
【００５３】
「脂質」は、水に不溶性であるが無極性有機溶剤には可溶性であり、手触りが油っぽく、かつ炭水化物およびタンパク質と共に生細胞の主要な構造材料を構成する、脂肪、油、ワックス、ステロール、およびトリグリセリドを含む、あらゆる有機化合物群を指す。
【００５４】
「親油性」は、脂質に対して著しく引き寄せられること、または脂質において可溶性であることを意味する。
【００５５】
「リポソーム」は、薬剤、抗原、ワクチン、酵素、または別の物質を体内の標的細胞に運ぶために医学的に用いられる、水性区画を包囲する脂質二重層により形成される、微細な球状粒子を指す。
【００５６】
「薬物」は、疾患の予防、治癒、もしくは改善、またはいくつかの生理学的状態もしくは発生の予防において有用な、あらゆる作用物質を指す。
【００５７】
「非経口投与」は、消化管を含まない経路を介して、またはその経路を経由して、ワクチンなどの物質を対象の体内に導入することを指す。非経口投与には、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼球内投与、および静脈内投与が含まれる。
【００５８】
「薬学的に許容できる」は、医学的な正しい判断の範囲内にある、不必要な毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わずに対象の組織と接触させて用いることに適している、妥当な損益比に見合う、かつそれらの意図された使用にとって効果的な物質を指す。
【００５９】
「反応源性」は、アジュバント組成物、免疫原性組成物、またはワクチン組成物の投与に応答して対象において引き起こされる副作用を指す。これは、投与部位で生じ得、通常、多くの症候の発症に関して評価されている。これらの症候には、炎症、発赤、および膿瘍が含まれ得る。これはまた、発生率、期間、および重症度に関しても評価されている。「軽い」反応は、例えば、動悸によってのみ検出可能であり目視によっては検出不可能な腫れを伴うか、または短期間のものである。より重度な反応は、例えば、目で見ることができる反応、または長期間の反応である。
【００６０】
「室温」は、１８から２５℃の温度を意味する。
【００６１】
「サポニン」は、ステロイド構造またはトリテルペノイド構造の疎水性領域を伴った親和性領域（通常はいくつかの糖鎖）からなる、植物由来の界面活性グリコシド群を指す。
【００６２】
「ステロイド」は、有機溶剤には容易に溶解可能であり、水にはわずかに可溶性である、生化学クラスの脂質に属するあらゆる有機化合物群を指す。ステロイドは、３つの融合シクロヘキサン（６個の炭素）環に４つ目のシクロペンタン（５個の炭素）環を加えたものからなる、４つの環が融合した系を含む。
【００６３】
「ステロール」は、テルペノイド前駆体から生物学的に産生される、動物における化合物を指す。それらは、通常は３番炭素に付着しているヒドロキシル（ＯＨ）基を有する、ステロイド環構造を含む。脂肪酸置換基の炭化水素鎖は、通常は１６から２０個の炭素原子で長さが変化し、飽和していても飽和していなくてもよい。ステロイドは、一般に、環構造において１つまたは複数の二重結合を含有し、また、環に付着している様々な置換基も含有する。ステロールおよびそれらの脂肪酸エステルは、基本的には水に不溶性である。
【００６４】
「対象」は、アジュバント組成物の投与が望ましいあらゆる動物を指す。これには、霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、実験室試験用の動物、捕獲した野生動物、鳥類（卵内のものを含む）、爬虫類、および魚類を含む、哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。したがって、この用語には、限定はしないが、サル、ヒト、ブタ、牛、羊、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、他の家禽、カエル、およびトカゲが含まれる。
【００６５】
「ＴＣＩＤ_５０」は「組織培養感染用量」を指し、接種された細胞培養物の、所与のバッチの５０％に感染するために必要なウイルスの希釈として定義される。この明細書を通して用いられるスペアマン−カーバー法を含む様々な方法が、ＴＣＩＤ_５０を計算するために用いられ得る。スペアマン−カーバー法の説明については、Ｂ．Ｗ．ＭａｈｙおよびＨ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ、ｐ．２５〜４６（１９９６）を参照されたい。
【００６６】
「治療上効果的な量」は、ウイルスまたは細菌などの病原体の感染により生じる健康への悪影響またはその合併症を含む疾患の兆候または症候を予防するかまたは低減させるために適した、抗原またはワクチンを与えた対象において免疫応答を誘発する、抗原またはワクチンの量を指す。液性免疫もしくは細胞介在性免疫、または液性免疫および細胞介在性免疫の両方が誘発され得る。ワクチンに対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、または、野生型株でのチャレンジ後の兆候および症候のモニタリングを介して直接的に判断することができる。ワクチンにより付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温、全体的な身体状態、ならびに対象の全体的な健康および能力などの臨床的兆候の低減を測定することによって判断することができる。治療上効果的なワクチンの量は、用いられる特定のアジュバント、用いられる特定の抗原、または対象の状態に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。
【００６７】
「治療すること」は、このような用語が適用される障害、状態、もしくは疾患を予防すること、またはこのような障害、状態、もしくは疾患の１つもしくは複数の症候を予防するかもしくは低減させることを指す。
【００６８】
「治療」は、上記に定義した「治療すること」の行為を指す。
【００６９】
「トリテルペノイド」は、何千もの手段で集合および修飾され得る、５個の炭素からなるイソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）単位６個に由来する、大きなかつ種々のクラスの天然に生じる有機分子を指す。ほとんどは、官能基およびそれらの基本的な炭素骨格が互いに異なる多環構造である。これらの分子は、全てのクラスの生物において見ることができる。
【００７０】
「ワクチン」は、本明細書において定義される場合、抗原を含む組成物を指す。対象にワクチンを投与すると、通常は１つまたは複数の特異的疾患に対する免疫応答が生じる。治療上効果的なワクチンの量は、用いられる特定の抗原または対象の状態に応じて変化し得、当業者により決定され得る。
【００７１】
組成物の成分
トリテルペノイドおよびＣｐＧ
アジュバント組成物における使用に適したトリテルペノイドは、限定はしないが、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）、トマチン、朝鮮人参抽出物、マッシュルーム、およびステロイドサポニンに構造が類似しているアルカノイドグリコシドを含む、植物由来のまたは合成同等物の、多くの源に由来し得る。したがって、アジュバント組成物における使用に適したトリテルペノイドには、サポニン、スクアレン、およびラノステロールが含まれる。アジュバント組成物における使用に適したトリテルペノイドの量は、用いられるトリテルペノイドの性質に応じる。しかし、それらは、通常、１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約１μｇから約４，０００μｇ、１用量当たり約１μｇから約３，０００μｇ、１用量当たり約１μｇから約２，０００μｇ、および１用量当たり約１μｇから約１，０００μｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約５μｇから約７５０μｇ、１用量当たり約５μｇから約５００μｇ、１用量当たり約５μｇから約２００μｇ、１用量当たり約５μｇから約１００μｇ、１用量当たり約１５μｇから約１００μｇ、および１用量当たり約３０μｇから約７５μｇの量で用いられる。
【００７２】
サポニンを用いる場合、アジュバント組成物は通常、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から得られる、免疫学的に活性なサポニン画分を含有する。サポニンは例えば、商業的に入手することができる、Ｑｕｉｌ Ａまたは別の精製されたもしくは部分的に精製されたサポニン調製物であり得る。したがって、サポニン抽出物は、混合物として、またはＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−２１などの精製された個別の成分として用いることができる。１つの実施形態において、Ｑｕｉｌ Ａは少なくとも８５％の純度である。他の実施形態において、Ｑｕｉｌ Ａは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度である。
【００７３】
ＣｐＧ ＯＤＮは、特異的な塩基配列の背景におけるメチル化されていないＣＧジヌクレオチドの存在に特徴を有する（ＣｐＧモチーフ）、最近記載されたクラスの薬物療法剤である（参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｈａｎｓｅｌ ＴＴ、Ｂａｒｎｅｓ ＰＪ（編）：Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ Ａｓｔｈｍａ，Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ＣＯＰＤ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ．Ｂａｓｅｌ、Ｋａｒｇｅｒ、２００１、ｖｏｌ
３１、ｐｐ ２２９〜２３２）。これらのＣｐＧモチーフは、ＣＧジヌクレオチドが抑制されており、かつ、存在する場合には通常はメチル化されている、真核細胞のＤＮＡにおいては見られないが、細菌ＤＮＡには存在し、ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡに対して免疫刺激特性を付与する。これらの免疫刺激特性には、ＩＦＮ−Ａ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８の優れた放出を伴う、Ｔｈ１型応答の誘発が含まれる。ＣｐＧ ＯＤＮ（１８〜２４ｂｐの長さ）は、細菌ＤＮＡに類似の免疫調節特性を有する。細胞表面タンパク質はこれらの分子を取り込み、様々な結果をもたらし得る。しかし、ＱＣＤＣ、ＱＣＤＣＲ、および本特許において挙げられる他の組合せなどの担体を用いると、免疫調節特性およびＣｐＧの取り込みは有意に増強される。
【００７４】
アジュバント組成物において用いるためのＣｐＧの量は、用いられるＣｐＧの性質および目的の種に応じる。しかし、それらは通常、１用量当たり約１μｇから約２０ｍｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約１μｇから約１０ｍｇ、１用量当たり約１μｇから約５ｍｇ、１用量当たり約１μｇから約４ｍｇ、１用量当たり約１μｇから約３ｍｇ、１用量当たり約１μｇから約２ｍｇ、および１用量当たり約１μｇから約１ｍｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約５μｇから約７５０μｇ、１用量当たり約５μｇから約５００μｇ、１用量当たり約５μｇから約２００μｇ、１用量当たり約５μｇから約１００μｇ、１用量当たり約１０μｇから約１００μｇ、１用量当たり約１５μｇから約１００μｇの量、ならびに１用量当たり約３０μｇから約７５μｇの量で用いることができる。
【００７５】
ステロール
アジュバント組成物における使用に適したステロールには、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、およびコレステロールが含まれる。これらのステロールは当技術分野において周知であり、商業的に購入することができる。例えば、コレステロールは、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、第１２版、ｐ．３６９において開示されている。アジュバント組成物における使用に適したステロールの量は、用いられるステロールの性質に応じる。しかし、それらは通常、１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約１μｇから約４，０００μｇ、１用量当たり約１μｇから約３，０００μｇ、１用量当たり約１μｇから約２，０００μｇ、および１用量当たり約１μｇから約１，０００μｇの用量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約５μｇから約７５０μｇ、１用量当たり約５μｇから約５００μｇ、１用量当たり約５μｇから約２００μｇ、１用量当たり約５μｇから約１００μｇ、１用量当たり約１５μｇから約１００μｇ、および１用量当たり約３０μｇから約７５μｇの量で用いられる。
【００７６】
免疫調節物質
アジュバント組成物にはさらに、例えば第４級アンモニウム化合物（例えばＤＤＡ）、およびインターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインなどの、１つまたは複数の免疫調節剤が含まれ得る。これらの材料は商業的に購入することができる。アジュバント組成物における使用に適した免疫調節物質の量は、用いられる免疫調節物質の性質および対象に応じる。しかし、それらは通常、１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約１μｇから約４，０００μｇ、１用量当たり約１μｇから約３，０００μｇ、１用量当たり約１μｇから約２，０００μｇ、および１用量当たり約１μｇから約１，０００μｇの量で用いられる。それらはまた、１用量当たり約５μｇから約７５０μｇ、１用量当たり約５μｇから約５００μｇ、１用量当たり約５μｇから約２００μｇ、１用量当たり約５μｇから約１００μｇ、１用量当たり約１５μｇから約１００μｇの量、および１用量当たり約３０μｇから約７５μｇの量で用いられる。特定の実施例では、ＤＤＡを含有するアジュバント組成物は、抗原溶液と調製されたばかりのＤＤＡ溶液とを単純に混合することにより調製することができる。
【００７７】
ポリマー
アジュバント組成物にはさらに、例えばＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレングリコール、ならびにポリアクリル酸およびポリメタクリル酸（例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））などの、１つまたは複数のポリマーが含まれ得る。このような材料は商業的に購入することができる。アジュバント組成物における使用に適したポリマーの量は、用いられるポリマーの性質に応じる。しかし、それらは通常、約０．０００１容量％（ｖ／ｖ）から約７５％ｖ／ｖの量で用いられる。他の実施形態において、それらは、約０．００１％ｖ／ｖから約５０％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖから約２５％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖから約１０％ｖ／ｖ、約０．０５％ｖ／ｖから約２％ｖ／ｖ、および約０．１％ｖ／ｖから約０．７５％ｖ／ｖの量で用いられる。別の実施形態において、それらは、約０．０２ｖ／ｖから約０．４％ｖ／ｖの量で用いられる。ＤＥＡＥデキストランは、５０，０００Ｄａから５，０００，０００Ｄａの範囲の分子サイズを有し得るか、または前記分子サイズは５００，０００Ｄａから２，０００，０００Ｄａの範囲であり得る。このような材料は、商業的に購入することができるか、またはデキストランから調製することができる。
【００７８】
別の特定の実施例は、平均当量が７６のポリアクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ポリマー）である。それらは、平均直径が約０．２から６．０ミクロンの一次ポリマー粒子から製造される。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ポリマーは、カルボキシル基のｐＫａよりも大きなｐＨ環境に曝露されると、水中でそれらの元の容積の最大１０００倍およびそれらの元の直径の１０倍に膨張して、ゲルを形成する。カルボキシル基のｐＫａよりも大きなｐＨでは、カルボキシル基は電離し、その結果、負電荷間の反発が生じ、これがポリマーの膨張を助長する。
【００７９】
Ｔｈ２刺激物質
アジュバント組成物にはさらに、例えばＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）およびアルミニウムなどの、１つまたは複数のＴｈ２刺激物質が含まれる。アジュバント組成物における使用に適したＴｈ２刺激物質の量は、用いられるＴｈ２刺激物質の性質に応じる。しかし、それらは通常、１用量当たり約０．０１ｍｇから約１０ｍｇの量で用いられる。他の実施形態において、それらは、１用量当たり約０．０５ｍｇから約７．５ｍｇ、１用量当たり約０．１ｍｇから約５ｍｇ、１用量当たり約０．５ｍｇから約２．５ｍｇ、および１用量当たり約１ｍｇから約２ｍｇの量で用いられる。具体的な例は、「Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセタート」という化学名を有する糖脂質である、Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）である。これは、Ｌｏｃｋｈｏｆｆ，Ｏ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：１６１１〜１６２０、１９９１）において見られる手順に従って合成され得る。それは、密封された容器内で２〜８℃で保管することが推奨される。その化学的または物理的特性は、それがわずかに吸湿性であること、多形体を形成しないこと、最大５０℃の温度の空気中および光中、ならびに周囲温度のｐＨ２〜１２の水性溶剤中で化学的に安定であることである。これは、水性溶液においてミセルを形成する両親媒性の分子である。
【００８０】
抗原および疾患
アジュバント組成物は１つまたは複数の抗原を含有し得る。抗原は、対象において望ましい免疫応答を生じさせることが可能な多種多様な物質のいずれかであり得る。Ｑｕｉｌ Ａは単独で殺ウイルス性であるが、Ｑｕｉｌ Ａは、らせん状ミセルを形成する際、コレステロールを加えることによって無害化される（米国特許第７，１２２，１９１号を参照されたい）。本明細書において記載されるアジュバント組成物は、非殺ウイルス性、非溶血性、または膜溶解性であることが明らかにされている。したがって、これらのアジュバント組成物と共に用いられる抗原は、（不活化された、弱毒化された、および修飾された生の）ウイルス、細菌、寄生虫、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、炭水化物、脂肪酸、テイコ酸、ペプチドグリカン、脂質、または糖脂質の１つまたは複数の、個別のもの、またはそのあらゆる組合せであり得る。
【００８１】
本発明のアジュバントと共に用いられる抗原にはまた、本明細書において言及される生物から単離され得る、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドの免疫原性断片が含まれる。
【００８２】
対象において疾患を生じさせない、生の、修飾された生の、および弱毒化されたウイルス株は、非ウイルス性の形態で単離されているか、または、適切な細胞系における連続継代または紫外線光もしくは化学的突然変異原への曝露を含む、当技術分野において周知の方法を用いて弱毒化されている。不活化されたかまたは死滅したウイルス株は、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、殺菌性放射線、熱での処理、または他のこのような方法を含む、当業者に知られている方法によって不活性化されているものである。
【００８３】
病原体により生じる多種多様な疾患について対象を防御し得る多価組成物を製造するために、２つ以上の抗原を組み合わせることができる。現在では、ワクチンの商業的製造業者およびエンドユーザーは、多価ワクチン製品を好む。従来のアジュバントは、アジュバントの効果的な使用を可能にする抗原の種類が限定されることが多いが（一価または多価のいずれか）、本明細書において記載されるアジュバントは、一価でも多価でも、広範な抗原と共に効果的に用いることができる。したがって、本明細書において記載される抗原は、本明細書において記載されるアジュバントを含む単一の組成物に組み合わせることができる。
【００８４】
アジュバント組成物と共に抗原として用いられ得る細菌のいくつかの例には、限定はしないが、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アセトバクター・パセルイアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・サーモカテニュレータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、クロモバクテリウム・ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エールリヒア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、ヘリコバクター・スイス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ）、ローソニア・
イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、モラクセラ種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＬＣ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＬＣ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、オドリバクター・デンティカニス（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ）、パスツレラ（マンヘミア）・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ポルフィロモナス・サリボサ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス・ウィスコンシネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、蛍光菌Ｃ９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ９）、蛍光菌ＳＩＫＷ１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＩＫＷ１）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・ルテオラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス種Ｂ１１−１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ Ｂ１１−１）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、サイクロバクター・インモビリス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ダブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｅｕｉｓ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ハイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、ストレプトマイセス・エクスフォリエーテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ）、ジャガイモそうか病菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、シネコシスティス種ビブリオ・コレレ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・ミヌタム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍｉｎｕｔｕｍ）、トレポネーマ・ファージデニス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ）、トレポネーマ・レフリンゲンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｓ）、トレポネーマ・ビンセンティ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、トレポネーマ・パラジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、ならびに、既知の病原体であるレプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・ハージョ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ）、レプトスピラ・ボルグペテルセニ・ハージョ・ボビス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｖｉｓ）、レプトスピラ・ボルグペテルセニ・ハージョ・プラジトノ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ−ｐｒａｊｉｔｎｏ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ）、およびレプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）などのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）種が含まれる。
【００８５】
不活化ウイルスおよび弱毒化生ウイルスの両方を、アジュバント組成物において用いることができる。抗原として用いられ得るウイルスのいくつかの例には、限定はしないが、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミクソウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒツジパラインフルエンザウイルス３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ＢＶＤＶ Ｉ型、ＢＶＤＶ ＩＩ型、ブタコレラウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ結核菌、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、汎親和性ＣＣＶ、イヌ呼吸器コロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ腸内コロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ブタ伝染性下痢ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）Ｉ型、ＰＣＶ ＩＩ型、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、水胞性口炎ウイルス、レンチウイルス、トリインフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、麻疹ウイルス、およびその組合せが含まれる。
【００８６】
ペプチド抗原の例には、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ｐ６８、ＧｎＲＨ、ＩｇＥペプチド、Ｆｅｌ ｄ１、および癌抗原、ならびにそれらの組合せが含まれる。他の抗原の例には、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖脂質、ペプチド、脂肪酸、およびテイコ酸、およびペプチドグリカン、ならびにそれらの組合せが含まれる。
【００８７】
アジュバント組成物と共に抗原として用いられ得る寄生虫のいくつかの例には、限定はしないが、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）（肝臓の吸虫）、コクシジウム亜綱（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）、アイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）（犬糸状虫）、アンシロストーマ属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）（鉤虫）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．）、トリコモナス種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、テニア属（Ｔａｅｎｉａ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、旋毛虫属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、肉胞子虫属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、およびイソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、ならびにそれらの組合せが含まれる。また、限定はしないが、マダニ属（Ｉｘｏｄｅｓ）、コイタマダニ属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ）、カクマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）、キララマダニ属（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ）、ウシマダニ属（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）、イボマダニ属（Ｈｙａｌｏｍｍａ）、およびチマダニ（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ）種、ならびにそれらの組合せを含むダニを含む、外部寄生虫も意図される。
【００８８】
免疫応答を誘発するために用いられる抗原の量は、用いられる抗原、対象、および所望の応答レベルに応じて著しく変化し、当業者によって決定され得る。修飾生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含有するワクチンでは、抗原の治療上効果的な量は、通常、約１０^２組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）_５０から約１０^１０ＴＣＩＤ_５０までの範囲である。多くのこのようなウイルスでは、治療上効果的な用量は通常、約１０^２ＴＣＩＤ_５０から約１０^８ＴＣＩＤ_５０までの範囲である。いくつかの実施形態において、治療上効果的な用量の範囲は、約１０^３ＴＣＩＤ_５０から約１０^６ＴＣＩＤ_５０までである。いくつかの他の実施形態において、治療上効果的な用量の範囲は、約１０^４ＴＣＩＤ_５０から約１０^５ＴＣＩＤ_５０までの範囲である。
【００８９】
不活化ウイルスを含有するワクチンでは、抗原の治療上効果的な量は通常、１用量当たり少なくとも約１００相対単位であり、１用量当たり約１，０００から約４，５００相対単位までの範囲であることが多い。他の実施形態において、抗原の治療上効果的な量は、１用量当たり約２５０から約４，０００相対単位まで、１用量当たり約５００から約３，０００相対単位まで、１用量当たり約７５０から約２，０００相対単位まで、または１用量当たり約１，０００から約１，５００相対単位までの範囲である。
【００９０】
不活化ウイルスを含有するワクチンにおける抗原の治療上効果的な量はまた、ｍＬ当たりの相対効力（ＲＰ）の観点から測定することができる。治療上効果的な量は、ｍＬ当たり約０．１から約５０ＲＰまでの範囲であることが多い。他の実施形態において、抗原の治療上効果的な量は、ｍＬ当たり約０．５から約３０ＲＰまで、ｍＬ当たり約１から約２５ＲＰまで、ｍＬ当たり約２から約２０ＲＰまで、ｍＬ当たり約３から約１５ＲＰまで、またはｍＬ当たり約５から約１０ＲＰまでの範囲である。
【００９１】
１つの実施形態において、ＦｅＬＶ抗原は、ＫＴ−ＦｅＬＶ−ＵＣＤ−１ネコ白血病ウイルス株に持続感染したＦＬ７４−ＵＣＤ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８０１２）から産生された。ワクチンにおけるＦｅＬＶ抗原の量は、ｍＬ当たりのｇｐ７０ウイルスタンパク質の量として測定され得る。ＦｅＬＶ抗原の治療上効果的な量は、ｍＬ当たりのｇｐ７０ウイルスタンパク質の量によって測定すると、通常、約１００から約３５０，０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲である。別の実施形態において、この範囲は約１，０００から約３００，０００ｎｇ／ｍｌまで、または約２，５００から約２５０，０００ｎｇ／ｍｌまで、または約４，０００から約２２０，０００ｎｇ／ｍｌまで、または約５，０００から約１５０，０００ｎｇ／ｍｌまで、または約１０，０００ｎｇ／ｍｌから約１００，０００ｎｇ／ｍｌまでである。
【００９２】
ワクチンにおいて投与される細菌抗原のための細胞の数は、１用量当たり約１×１０^６から約５×１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）までの範囲である。他の実施形態において、細胞数は、約１×１０^７から５×１０^１０ＣＦＵ／用量まで、または約１×１０^８から５×１０^１０ＣＦＵ／用量までの範囲である。さらに他の実施形態において、細胞数は、約１×１０^２から５×１０^１０ＣＦＵ／用量まで、または約１×１０^４から５×１０^９ＣＦＵ／用量まで、または約１×１０^５から５×１０^９ＣＦＵ／用量まで、または約１×１０^６から５×１０^９ＣＦＵ／用量まで、または約１×１０^６から５×１０^８ＣＦＵ／用量まで、または約１×１０^７から５×１０^９ＣＦＵ／用量までの範囲である。
【００９３】
ワクチンにおいて投与される寄生虫抗原のための細胞の数は、１用量当たり約１×１０^２から約１×１０^１０個までの範囲である。他の実施形態において、細胞数は、１用量当たり約１×１０^３から約１×１０^９個まで、または１用量当たり約１×１０^４から約１×１０^８個まで、または１用量当たり約１×１０^５から約１×１０^７個まで、または１用量当たり約１×１０^６から約１×１０^８個までの範囲である。
【００９４】
従来のアジュバントと共に用いると、同程度のレベルの血清学的応答を刺激するために、修飾生ウイルスまたは弱毒化ウイルスよりも実質的に多い量の不活化ウイルスが必要であることが、当技術分野において周知である。しかし、驚くべきことに、本明細書において記載されるアジュバント組成物と共に用いると、ほぼ同量の不活化ウイルスおよび修飾生ウイルスが同様のレベルの血清学的応答を刺激することが明らかにされた。さらに、本明細書において記載されるアジュバントと共に用いると、従来のアジュバントと比較して、同一のレベルの血清学的応答を達成するために必要とされる修飾生ウイルス、弱毒化ウイルス、および不活化ウイルスの量は少ない。これらの予想外の発見により、資源の保存ならびに免疫原性組成物およびワクチン組成物の調製の際のコストの低減が実証される。広く用いられているワクチンでは、年間で数百用量の製造が必要とされ、したがって、これらの節約は相当なものとなり得る。
【００９５】
賦形剤
水性アジュバントは特定の利点をもたらす。それらは通常、製剤および投与が容易であり、注入部位での重度の反応をほとんど誘発しないか、または誘発しても、よりわずかなものであり得る。しかし、注入部位から拡散する傾向がある抗原を有する水性アジュバントは、対象の肝臓により排出され、望ましくない非特異的免疫応答を生じさせる。驚くべきことに、本明細書において記載される水性アジュバント組成物は、長期にわたり、体内代謝されるまで注入部位に残り、そして標的化された免疫応答をもたらすことが明らかにされている。
【００９６】
油は、アジュバントの成分として添加される場合、通常は、長期でゆっくりとした放出プロフィールをもたらす。本発明において、油は代謝可能また代謝不可能であり得る。油は、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、または水中油中水型エマルジョンの形態であり得る。
【００９７】
本発明における使用に適した油には、アルカン、アルケン、アルキン、およびそれらの対応する酸およびアルコール、前記酸およびアルコールのエーテルおよびエステル、ならびにそれらの混合物が含まれる。油の個別の化合物は軽質炭化水素化合物であり、すなわち、このような成分は６から３０個の炭素原子を有する。油は合成により調製され得るか、または石油製品から精製され得る。この部分は、直鎖または分枝鎖構造を有し得る。部分は、完全に飽和していてもよいし、または１つもしくは複数の二重結合もしくは三重結合を有していてもよい。本発明において用いるためのいくつかの代謝不可能な油には、例えば鉱油、パラフィン油、およびシクロパラフィンが含まれる。
【００９８】
油という用語はまた、「軽油」、すなわち石油の蒸留により同様にして得られるが白色鉱油よりもわずかに低い比重を有する油を含むことを意図したものである。
【００９９】
代謝可能な油には、代謝可能な非毒性の油が含まれる。油は、あらゆる植物油、魚油、動物油、または、アジュバントが投与される予定の対象の身体により代謝可能であり、かつ対象に対して毒性ではない、合成的に調製された油であり得る。植物油の源には、ナッツ、種子、および穀物が含まれる。
【０１００】
本発明により提供される水中油型エマルジョンは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤からなる。この製剤は、水性成分、レシチン、鉱油、および界面活性剤を含む。この製剤の成分を記載している特許には、米国特許第５，０８４，２６９号および米国特許第６，５７２，８６１号が含まれる。
【０１０１】
典型的には、本発明の油の成分は、１容量％から５０容量％の量で、または１０容量％から４５容量％の量で、または２０容量％から４０容量％の量で存在する。
【０１０２】
組成物の他の成分には、担体、溶剤、および希釈剤などの薬学的に許容できる賦形剤、等張剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、血管収縮剤、抗細菌剤、抗真菌剤などが含まれ得る。典型的な担体、溶剤、および希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油などが含まれる。代表的な等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが含まれる。有用な安定剤には、ゼラチン、アルブミンなどが含まれる。
【０１０３】
界面活性剤は、アジュバントおよび抗原のための担体として作用するために選抜されたエマルジョンの安定化を促進するために用いられる。本発明における使用に適した界面活性剤には、生物学的に適合可能な天然の界面活性剤、および非天然の合成界面活性剤が含まれる。生物学的に適合可能な界面活性剤には、リン脂質化合物、またはリン脂質の混合物が含まれる。好ましいリン脂質は、大豆または卵のレシチンなどのホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水で洗浄して、得られた水和ゴムを分離および乾燥させることにより、ホスファチドとトリグリセリドとの混合物として得ることができる。純化生成物は、混合物を、アセトン不溶性のリン脂質と、アセトンでの洗浄によりトリグリセリドおよび植物油が除去された後に残る糖脂質とに分画することにより得ることができる。あるいは、レシチンは様々な市販されている源から得ることができる。他の適切なリン脂質には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびホスファチジルエタノールアミンが含まれる。リン脂質は、天然源から単離することができるか、またはこれまでに合成されていてもよい。
【０１０４】
本発明における使用に適した非天然の合成界面活性剤には、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸で置換されたソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）という名称で市販されている）、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ヒマシ油などの源から得られる脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ（登録商標））；ポリエトキシル化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ Ｍ−５３（登録商標）という名称で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒドポリマー（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ（登録商標））、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ）が含まれる。
【０１０５】
一般的に言うと、界面活性剤、または界面活性剤の組合せは、２つ以上の界面活性剤が用いられる場合、０．０１容量％から１０容量％、好ましくは０．１容量％から６．０容量％、より好ましくは０．２容量％から５．０容量％の量でエマルジョン内に存在する。
【０１０６】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる担体」には、あらゆる、および全ての溶剤、分散媒、被覆剤、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。担体（１つまたは複数）は、組成物の他の成分と適合可能であり、かつ対象に対して有害ではないという意味で「許容できる」ものでなくてはならない。典型的には、担体は無菌であり発熱物質を有しておらず、かつ、用いられる投与様式に基づいて選抜される。組成物を含む薬学的に許容できる担体の好ましい製剤が、米国（ＵＳ）農務省または米国食品医薬品局または米国以外の国における同等の政府機関により公表された適用規制において認可される薬学的担体であることは、当業者に周知である。したがって、組成物を商業的に製造するための薬学的に許容できる担体は、米国または外国における適切な政府機関により既に認可されているかまたは認可されるであろう担体である。
【０１０７】
組成物には、薬学的な媒剤、賦形剤、または媒質として働く、適合可能な薬学的に許容できる（すなわち、無菌もしくは非毒性の）液体、半固体、または固体の希釈剤が含まれていてもよい。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、中でも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ得る。安定剤には、中でもアルブミンが含まれる。
【０１０８】
組成物はまた、例えばゲンタマイシン、メルチオラート(merthiolate)、またはクロロクレゾールを含む、抗生物質または保存剤を含有し得る。選抜の元となる様々なクラスの抗生物質または保存剤が当業者に周知である。
【０１０９】
組成物の調製
アジュバント製剤の調製
ＩＳＣＯＭは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を組み合わせることにより調製され得る。例えば、ＩＳＣＯＭは、５重量％から１０重量％のＱｕｉｌ Ａ、１％から５％のコレステロールおよびリン脂質、ならびに残りに対応するタンパク質を含有し得る。アジュバント製剤におけるステロールに対するサポニンの比率は、典型的には、ほぼ１：１００重量比（ｗ／ｗ）から５：１ｗ／ｗである。いくつかの実施形態においては、過剰なステロールが存在し、ここでは、ステロールに対するサポニンの比率は少なくとも１：２ｗ／ｗ、または１：５ｗ／ｗである。他の実施形態においては、サポニンがステロールに対して過剰であり、約５：１ｗ／ｗという、ステロールに対するサポニンの比率が用いられる。ＩＳＣＯＭおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸはＩｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されている。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）は、ＤＤＡの重量部当たり少なくとも０．１重量部のＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の量で、ＤＤＡと組み合わせて用いられる。他の実施形態において、ＤＤＡの重量部当たり少なくとも０．５重量部のＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）が用いられる。さらに他の実施形態において、ＤＤＡの重量部当たり少なくとも１重量部のＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）が用いられる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）とＤＤＡとの組合せは複合体を形成し、それによりＤＤＡの第４アミン官能基はポリマー上のカルボン酸側基を免疫機能化する。これにより、特異的免疫細胞が抗原およびアジュバントを同時に標的化すること、ならびに抗原およびアジュバントを一緒に最適な時点および濃度で前記細胞に共輸送することが可能になる。
【０１１１】
本明細書において記載されるアジュバントは、通常、いずれの特異的担体も必要とせず、水性緩衝液または他の薬学的に許容できる緩衝液において製剤される。いくつかのケースにおいて、開示される実施形態のワクチンは、例えばさらなるリポソーム、ミクロスフィア、またはカプセル化された抗原粒子などの、適切な媒剤内に存在する。抗原は、小胞膜内に含有され得るか、または小胞膜の外側に含有され得る。通常、可溶性抗原は外側であり、疎水性抗原または脂質化抗原は膜の内側または外側のいずれかに含有される。
【０１１２】
アジュバント組成物は、投与経路、保存要件などに応じて、様々な形態で作製され得る。例えば、それらは、注入使用に適した無菌水性溶液もしくは分散の形態で作製され得るか、またはフリーズドライ技術、真空乾燥技術、もしくは噴霧乾燥技術を用いて凍結乾燥形態で作製され得る。凍結乾燥組成物は、使用の前に、安定化溶液、例えば生理食塩水またはＨＥＰＥＳ内で戻され得る。したがって、アジュバント組成物は、固体、半固体、または液体の投薬形態として用いることができる。
【０１１３】
アジュバントは、当技術分野において知られている技術を用いて製造することができる。例えば、サポニンおよびコレステロールは適切な界面活性剤内に混合され得、その後、溶剤抽出技術を用いてリポソームまたはＩＳＣＯＭが形成される。米国特許第７，１２２，１９１号に記載されているように、サポニンおよびコレステロールはまた、らせん状ミセルを形成するように組み合わせることができる。
【０１１４】
リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を、水性緩衝媒質として用いることができる。緩衝液のｐＨは、中性であるか、またはわずかにアルカリ性であるか、またはわずかに酸性であり得る。したがって、ｐＨは、ｐＨ６から８の範囲であり得る。約７．０から約７．３のｐＨが一般的である。緩衝液の強度は１０から５０ｍＭのＰＯ_４、および１０から１５０ｍＭのＰＯ_４であり得る。１つの実施例において、０．０６３％のＰＢＳが用いられる。ｐＨは、必要に応じて、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて調節され得る。典型的な濃度には、１Ｎから１０ＮのＨＣｌおよび１Ｎから１０ＮのＮａＯＨが含まれる。
【０１１５】
用いられるアジュバントの量は、共に用いる抗原、および適用される抗原投与量に応じる。これはまた、目的の種および所望の製剤にも応じる。通常、量は、アジュバントに従来用いられている範囲内である。例えば、アジュバントは典型的には、１ｍＬの１用量当たり約１μｇから約１０００μｇまでを含む。同様に、抗生物質は典型的には、１ｍＬの１用量当たり約１μｇから約６０μｇまでを含む。
【０１１６】
アジュバント製剤は、均質化またはマイクロ流体化され得る。製剤は、典型的には１つまたは複数のホモジナイザーを１回または複数回通すことによる、第１の混和プロセスに供される。例えばＲｏｓｓ乳化装置（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）、Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー（Ｅｖｅｒｅｔｔ、ＭＡ）、またはＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などの、あらゆる市販されているホモジナイザーをこの目的のために用いることができる。１つの実施形態において、製剤は、１０，０００ｒｐｍで３分間にわたり均質化される。マイクロ流体化は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）から入手可能なモデルナンバー１１ＯＹ、Ｇａｕｌｉｎモデル３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓ．）、およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂタイプ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの商業的なマイクロ流体化装置を用いることによって達成することができる。これらのマイクロ流体化装置は、高い圧力下で流体を小さな開口部に押し通し、それにより、相互作用チャンバにおいて２つの流体流れを高速で相互作用させてサブミクロンサイズの液滴を有する組成物を形成させることにより、作動する。１つの実施形態において、製剤は、１０，０００±５００ｐｓｉで２００ミクロンの限られた直径のチャンバを通されることでマイクロ流体化される。
【０１１７】
本明細書において記載されるアジュバント組成物は、均質化かつマイクロ流体化され得る。１つの実施形態において、抗原を適切な緩衝液に添加することができる。溶液を撹拌し、サポニンを抗原溶液にゆっくりと添加する。ステロールを次に抗原／サポニン溶液にゆっくりと添加し、その後、第４級アンモニウム化合物を抗原／サポニン／ステロール溶液にゆっくりと添加する。得られた組成物を均質化し、その後、マイクロ流体化する。マイクロ流体化の後、ポリマーをマイクロ流体化された組成物に添加する。用いられる成分に応じて、組成物の調製を最適化するためにこれらのステップの順序を変えることができる。
【０１１８】
免疫原性組成物およびワクチン組成物の調製
本明細書において記載されるアジュバント組成物は、免疫原性組成物およびワクチン組成物の製造において用いることができる。ワクチン組成物または免疫原性組成物では、それぞれの用量は、対象の年齢および全身状態、投与経路、抗原の性質、ならびに他の要因に応じて変化し得る、治療上効果的な量の１つまたは複数の抗原を含有する。ワクチン組成物または免疫原性組成物における多の成分の量および濃度は、組成物の物理的および化学的特性を変化させるために調節され得、また、当業者によって容易に決定され得る。アジュバント組成物の有利な特徴は、それらが組成物の所望の特徴に応じて完全に構成可能であることである。例えば、より大きなＴｈ１応答が望ましい場合、Ｔｈ１刺激因子の量を増大させることができる。同様に、より大きなＴｈ２応答が望ましい場合、Ｔｈ２刺激因子の量を増大させることができる。均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答もまた達成することができる。免疫原性組成物およびワクチン組成物はまた、上述のように均質化またはマイクロ流体化することができる。
【０１１９】
組成物の投与および使用
組成物の投与
組成物の用量は、典型的には、対象および抗原に応じて約１ｍＬから約５ｍＬまでの範囲である。例えば、イヌまたはネコでは、約１ｍＬの用量が典型的には用いられ、一方、牛では、約２〜５ｍＬの用量が典型的には用いられる。しかし、これらのアジュバントはまた、約１００μＬの用量を用いることができるマイクロドーズで製剤することができる。
【０１２０】
アジュバント組成物の投与経路には、非経口投与、経口投与、口鼻経路、鼻腔内経路、気管内経路、局所経路、および卵巣内経路が含まれる。組成物を投与するために、シリンジ、点滴器、無針注入器、パッチなどを含むあらゆる適切な装置を用いることができる。使用に選抜される経路および装置は、アジュバントの組成、抗原、および対象に応じるものであり、当業者に周知である。
【０１２１】
組成物の使用
商業的使用のためのあらゆるワクチンアジュバント調製物に対する要件の１つは、長期にわたる保存のためにアジュバント溶液の安定性を確立することである。本明細書においては、製造が容易で少なくとも１８カ月間にわたり安定なアジュバント製剤が提供される。１つの実施形態において、製剤は約１８カ月間にわたり安定である。別の実施形態において、製剤は約１８から約２４カ月間にわたり安定である。別の実施形態において、製剤は約２４カ月間にわたり安定である。加速試験手順によっても、本明細書において記載される製剤が安定であることが示される。
【０１２２】
本アジュバント組成物の有利な特徴は、それらが広範な対象に安全かつ効果的に投与され得ることである。当技術分野において、アジュバントの組合せが個別の成分よりも大きな反応源性を示すことが予想される。しかし、本明細書において記載される組成物は、成分のあらゆる１つまたは２つが用いられる組成物と比較して、低下した反応源性を示す一方、アジュバント効果は維持される。驚くべきことに、本明細書において記載されるアジュバント組成物が他のアジュバント組成物と比較して向上した安全性を示すことも明らかにされている。
【０１２３】
本明細書において記載されるアジュバント組成物は、対象において所望の免疫応答を生じさせるために有用である。それらは、複数の種において有効である。適切な対象は、アジュバント組成物の投与が望ましいあらゆる動物である。これには、霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、実験室試験用の動物、捕獲した野生動物、鳥類（卵内のものを含む）、爬虫類、および魚類を含む、哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。したがって、この用語には、限定はしないが、サル、ヒト、ブタ、牛、羊、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、他の家禽、カエル、およびトカゲが含まれる。
【０１２４】
本明細書において記載されるアジュバントは、感染した動物とワクチン接種された動物との間の血清学的な差別化を示すために用いることができる。したがって、それらは、ワクチン接種された動物においてワクチン内の抗原が野生型ウイルスの場合とは異なる抗体パターンを引き起こす、マーカーワクチンにおいて用いることができる。マーカーワクチンは通常、抗体パターンの差を測定し、どの動物がワクチン接種されておりどの動物が野生型ウイルスに感染しているかを実証する、ペット診断試験と併せて用いられる。このような技術は、ウイルスの管理および対照集団からのウイルスの根絶において有用である。
【０１２５】
以下の実施例は、例示的な実施形態として示されるものであるが、本発明の範囲を限定するものとして考えられるべきではない。本発明の多くの変更、変形、修飾、ならびに他の使用および適用が、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１２６】
（実施例１）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール（ＱＣ）溶液
Ｑｕｉｌ Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）を水中に溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。コレステロール（Ｆａｂｒｉ Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）をエタノール内に溶解し、１８ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。次に、コレステロールストック溶液を、０．２ミクロンのフィルターを用いてろ過した。
【０１２７】
様々な製剤におけるＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールの濃度の範囲は、コレステロールに対するＱｕｉｌ Ａが１／１μｇ／ｍｌという低いものから、１０００／１０００μｇ／ｍＬという高いものであった。５０／５０μｇ／ｍＬのＱｕｉｌ Ａ／コレステロールストック溶液を調製するために、Ｑｕｉｌ Ａストック溶液を５０μｇ／ｍＬの濃度まで水で希釈した。この溶液を撹拌しながら、コレステロールストック溶液を５０μｇ／ｍＬの最終濃度までゆっくりと添加した。
【０１２８】
（実施例２）
ＤＤＡ（Ｄ）溶液
ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ、Ｆｌｕｋａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）をエタノール内に溶解し、１８ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。ＤＤＡストック溶液を０．２ミクロンのフィルターを用いてろ過した。
【０１２９】
（実施例３）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ（ＱＣＤ）溶液
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロールストック溶液を実施例１におけるようにして所望の濃度に調製した。実施例２において調製したＤＤＡストック溶液を、Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロールストック溶液にゆっくりと添加した。溶液を混合して、所望の最終濃度を得た。溶液のｐＨを必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌで調節して、通常は約６．９から約７．５の範囲である所望の最終ｐＨを得た。
【０１３０】
（実施例４）
ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（Ｃ）溶液。
ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（Ｎｏｖｅｏｎ、Ｍｅｘｉｃｏ）を脱イオン水に溶解し、１．５％のストック溶液を調製した。別の実施形態において、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を脱イオン水に溶解し、０．７５％のストック溶液を調製した。
【０１３１】
（実施例５）
ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（ＤＣ）溶液。
ＤＤＡストック溶液を実施例２におけるように調製した。０．７５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ストック溶液を実施例４におけるように調製した。溶液を混合して、所望の最終濃度を得た。
【０１３２】
（実施例６）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（ＱＣＤＣ）溶液
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡストック溶液を実施例３におけるように調製した。０．７５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ストック溶液を実施例４におけるように調製した。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ストック溶液をＱｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡストック溶液にゆっくりと添加して、所望の最終濃度を得た。溶液のｐＨをＮａＯＨまたはＨＣｌで調節して、通常は約６．９から約７．５の範囲である所望の最終ｐＨを得た。
【０１３３】
（実施例７）
Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）（Ｒ）溶液
Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）溶液を調製するために、糖脂質Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドをエタノール内に溶解した（６０％ｖ／ｖ）。次に、Ｔｗｅｅｎ２０および氷酢酸を添加した。１つの実施例において、３．４９ｇｍのＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドを４４．６４ｍＬのエタノール／水に溶解した（６０％ｖ／ｖ）。これを１．１２ｍＬのＴｗｅｅｎ２０および０．６８ｍＬの氷酢酸と組み合わせた。
【０１３４】
（実施例８）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）／Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）（ＱＣＤＣＲ）溶液
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ストック溶液を実施例６におけるように調製した。Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）ストック溶液を実施例７におけるように調製した。Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）溶液をＱｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液にゆっくりと添加して、所望の最終濃度を得た。溶液のｐＨを必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌで調節して、通常は約６．９から約７．５の範囲である所望の最終ｐＨを得た。
【０１３５】
（実施例９）
ＤＥＡＥデキストラン溶液（Ｘ）
ＤＥＡＥデキストラン（Ｘ）ストック溶液を、２００ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランを水に溶解することにより調製した。溶液は、摂氏１２０度（Ｃ）で約２０分間にわたりオートクレーブにかけることができる。
【０１３６】
（実施例１０）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＤＥＡＥ溶液（ＱＣＤＸ）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡストック溶液を実施例３に従って調製した。ＤＥＡＥストック溶液を実施例９に従って調製した。溶液を、それらをホモジナイザー内に直接添加することにより組み合わせた。混合は、１，０００／秒を超えるせん断力を用いる瞬間混和方法を採用する。混合は、水性溶液を、無極性アジュバントおよび抗原成分を含有する油相内に直接入れ、均質な安定混合物が得られるまで混和することにより行われる。典型的には、これは、所望の粒子サイズに応じて、最低でも数分間、またはそれ以上であり得る。
【０１３７】
（実施例１１）
油組成物（Ｏ）
油ストック溶液を、Ｄｒａｋｅｏｌ鉱油とＴｗｅｅｎ８５およびＳｐａｎ８５とを組み合わせることにより調製し、およそ５５℃まで加熱し、その後、冷却して無菌ろ過した。この混合物はしたがって、油ベースの担体のための油相の基本成分を含むものである。コレステロールおよび／またはＤＤＡが、これらの組成物の１つについての協働免疫調節物質として選抜された場合、それらは油相において可溶性であるため、それらもまたろ過の前にこの混合物に添加される。
【０１３８】
（実施例１２）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＤＥＡＥ／油組成物（ＱＣＤＸＯ）
Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＤＥＡＥストック溶液を実施例１０に従って調製した。油ストック組成物を実施例１１に従って調製した。溶液は、前記濃度の量を得るための、Ｑｕｉｌ Ａ、ＤＥＡＥデキストラン、および水の組合せであった。この水性相を、室温以上で数分間以上にわたり反応液を連続的に撹拌することにより混合し、その後、無菌ろ過して、油相に添加するために保存した。水性相を、連続的に混合されている油相内にゆっくりと添加した。
【０１３９】
（実施例１３）
免疫原性組成物またはワクチン組成物の調製
抗原と上述のアジュバントの１つとを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するために、所望の抗原を適切な緩衝液に添加した。次に、所望のアジュバントの成分を上述のように添加した。得られた溶液を、緩衝液を用いて最終容積にした。
【０１４０】
（実施例１３ａ）
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するために、所望の抗原を適切な緩衝液に添加した。Ｑｕｉｌ Ａストック溶液を実施例１におけるように調製し、抗原溶液にゆっくりと添加した。コレステロールストック溶液を実施例１におけるように調製し、抗原／Ｑｕｉｌ Ａ溶液にゆっくりと添加した。ＤＤＡストック溶液を実施例２におけるように調製し、抗原／Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール溶液にゆっくりと添加した。抗原／Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ溶液を均質化およびマイクロ流体化した。０．７５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を実施例４におけるように調製した。マイクロ流体化の後、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液（０．０５％ｖ／ｖ）をマイクロ流体化された組成物に添加し、ｐＨをＮａＯＨまたはＨＣｌで約６．９から約７．５に調節した。
【０１４１】
（実施例１３ｂ）
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、およびＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）を含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するために、所望の抗原を適切な緩衝液に添加した。Ｑｕｉｌ Ａストック溶液を実施例１におけるように調製し、抗原溶液にゆっくりと添加した。コレステロールストック溶液を実施例１におけるように調製し、抗原／Ｑｕｉｌ Ａ溶液にゆっくりと添加した。ＤＤＡストック溶液を実施例２におけるように調製し、抗原／Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール溶液にゆっくりと添加した。抗原／Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ溶液を均質化およびマイクロ流体化した。０．７５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を実施例４におけるように調製した。マイクロ流体化の後、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液（０．０５％ｖ／ｖ）をマイクロ流体化された組成物に添加し、ｐＨをＮａＯＨまたはＨＣｌで約６．９から約７．５に調節した。Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）ストック溶液を実施例７におけるように調製した。ＤＤＡを添加した後に、Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）成分を水性相に添加した。
【０１４２】
（実施例１３ｃ）
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＤＥＡＥデキストラン
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、およびＤＥＡＥデキストランを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するために、所望の抗原を適切な緩衝液に添加した。Ｑｕｉｌ Ａストック溶液を実施例１におけるように調製し、抗原溶液にゆっくりと添加した。組成物を均質化した。コレステロールストック溶液を実施例１におけるように調製し、均質化の間に抗原／Ｑｕｉｌ Ａ溶液にゆっくりと添加した。ＤＤＡストック溶液を実施例２におけるように調製し、均質化の間に抗原／Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール溶液にゆっくりと添加した。ＤＥＡＥデキストラン溶液を実施例９におけるように調製した。均質化の間にＤＥＡＥデキストラン溶液を添加し、得られた組成物を最終容積にした。
【０１４３】
（実施例１３ｄ）
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＤＥＡＥデキストラン、油
抗原、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、ＤＥＡＥデキストラン、および油を含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するために、所望の抗原を適切な緩衝液に添加した。Ｑｕｉｌ Ａストック溶液を実施例１におけるように調製し、抗原溶液にゆっくりと添加した。組成物を均質化した。コレステロールストック溶液を実施例１におけるように調製し、均質化の間に抗原／Ｑｕｉｌ Ａ溶液にゆっくりと添加した。ＤＤＡストック溶液を実施例２におけるように調製し、均質化の間に抗原／Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール溶液にゆっくりと添加した。ＤＥＡＥデキストラン溶液を実施例９におけるように調製した。均質化の間にＤＥＡＥデキストラン溶液を添加した。油組成物を実施例１１におけるように調製した。均質化の間に、均質化しながら水性相を油相内に入れることにより油組成物を添加し、得られた組成物を最終容積にした。
【０１４４】
（実施例１４）
ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ワクチン
ランダム化された完全ブロック設計を用いて、動物を処理群にランダムに割り当てた。表１は研究設計を示す。ブロックは、出生日および一腹産子数に基づくものであった。動物を出生日で分類し、その後、一腹産子数で分類した。４頭からなるブロックを用いた。ブロック内で、動物を処理にランダムに割り当てた。研究のワクチン接種相のために、２つの連続するブロックを組み合わせて８頭の動物からなる群を形成した。動物群を２室にランダムに割り当て、各室が５つの動物群（１０ブロック）を含有するようにした。動物群内で、動物を互いに近くに位置している４つのケージにランダムに割り当て、各ケージが同一の処理を有する２頭の動物を含有するようにした。研究のチャレンジ相のために、１つのワクチン接種室の動物を１つまたは２つのチャレンジ室にランダムに割り当てた。２つのチャレンジ室に行くよう選抜されたワクチン接種室は、各チャレンジ室にランダム化された５つのブロックを有するものであった（２．５群、２０頭の動物）。他のチャレンジ室は１０個のブロックを含有するものであった（５群、４０頭の動物）。チャレンジ室内で、同一のブロック内の動物を、互いに近くに位置する４つのケージにランダムに割り当てた。
【０１４５】
この研究のためのワクチンは、１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ストック溶液を用いたことを除いて、実施例１３におけるように調製した。具体的には、ＬＥＵＫＯＣＥＬＬ（登録商標）２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）を、ＦｅＬＶの亜群Ａ、Ｂ、およびＣをＦｅＬＶで形質転換されたリンパ球内で増殖させることにより調製した。ウイルス抗原を化学的に不活化し、無菌アジュバントと組み合わせて免疫応答を増強させ、液体形態にパッケージした。全量が１００ｍＬの、ネコ白血病ウイルスおよび２５μｇのＱｕｉｌ Ａ／水酸化アルミニウム（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））を含有する試験用獣医学的生成物（ＩＶＰ）を調製した。全量が９４．５ｍＬの１．１０６×１０^５ｎｇ／ｍＬのＦｅＬＶストック溶液を１５分間にわたりゆっくりと混合した。必要であれば、ｐＨを４ＮのＨＣｌまたは１８％のＮａＯＨで５．９から６．１に調節した。撹拌しながら、０．５ｍＬの５．０ｍｇ／ｍＬのＱｕｉｌ Ａ溶液を抗原溶液に添加した。次に、５．０ｍＬの１００％ｖ／ｖのＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）をゆっくりと添加した。組成物を４℃で最低２時間にわたり撹拌した。ｐＨを、必要に応じて、１８％のＮａＯＨまたは１ＮのＨＣｌで７．０から７．３に調節した。
【０１４６】
ネコ白血病ウイルスおよび３７．５μｇのＱｕｉｌ Ａ／水酸化アルミニウム（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））を含むＩＶＰを、７．５ｍｌのＱｕｉｌ Ａストック溶液を抗原溶液に添加したことを除いて、２５μｇのＱｕｉｌ ＡのＩＶＰと同様の様式で調製した。
【０１４７】
全量が３５０ｍＬの、ネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を含有する試験用獣医学的生成物（ＩＶＰ）を調製した。３４９．３ｍＬの１．１０６×１０^５ｎｇ／ｍＬのＦｅＬＶストック溶液を撹拌しながら、０．１４ｍＬの５０．０ｍｇ／ｍＬのＱｕｉｌ Ａ溶液を抗原溶液にゆっくりと添加した。次に、０．３９ｍＬの１８ｍｇ／ｍＬのコレステロール／エタノール溶液をゆっくりと添加した。組成物を１０，０００ｒｐｍで３分間にわたり均質化した。全部で０．１９ｍＬの１８．０ｍｇ／ｍＬのＤＤＡ／エタノール溶液を、撹拌しながら組成物に添加した。全部で５．０ｍＬの１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を、１４５．０ｍＬのネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、およびＤＤＡの組成物にゆっくりと添加した。ｐＨを、必要に応じて、１８％のＮａＯＨまたは１ＮのＨＣｌで７．０から７．３に調節した。
【０１４８】
【表１】

【０１４９】
全ての動物を毎日観察し、所見を記録した。体温を、第１のワクチン用量投与前の−１日目および第２のワクチン用量投与前の２０日目に、鼓膜経路で全ての動物から記録した。血液試料（１．０〜２．０ｍＬ）を、−２日目に、頸静脈の静脈穿刺によって各動物から採取した。動物のストレスを最小限にし、かつ血液採取の際に動物取扱者が負傷することを避けるために、鎮静用量のＴＥＬＡＺＯＬ（登録商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）を、筋肉内経路により、体重（およそ５．０ｍｇ／ｋｇ）に従って投与した。血液は血清分離管（ＳＳＴ）内に採取し、血清分離のための処理を行った。血清を試験するまで−２０℃以下で保管した。
【０１５０】
プラセボワクチンまたはＦｅＬＶワクチンを１．０ｍＬの用量で皮下経路により子猫に投与した。第１のワクチン接種を０日目に行い、第２のワクチン接種を２１日目に行った。全ての動物を、即時型の局所痛反応（刺傷反応）について、第１および第２のワクチン接種の後およそ１時間にわたり観察した。所見は文書記録した。全ての動物の体温を、第１のワクチン用量投与後の１日目および２日目ならびに第２のワクチン用量投与後の２２日目および２３日目に鼓膜経路によって測定した。注入部位の反応（腫れ）もまた、第１のワクチン接種後の１日目ならびに第２のワクチン接種後の２２日目および２３日目に判定した。血液試料（１．０〜２．０ｍＬ）を、３５日目に、頸静脈の静脈穿刺によって各動物から採取し、血清分離のための処理を行い、試験するまで−２０℃以下で保管した。
【０１５１】
３５日目に、動物を個別の隔離ケージに置いた。チャレンジウイルスは、およそ１０^６．１ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価の、ウイルス性ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）のＲｉｃｋａｒｄ株であった。ＦｅＬＶチャレンジ材料を解凍し、投与の前に水を含む氷上に保持した。動物を、３７、４０、４２、および４４日目に、１．０ｍＬの希釈していないチャンレジ材料を経鼻経路で投与することによりチャレンジした。針を有さない１ｍＬのツベルクリンシリンジを、チャレンジ材料で満たした。各子猫におよそ０．５ｍＬを鼻孔から投与した。４２日目に、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）の投与のおよそ５時間後に、チャレンジ投与を行った。各日のチャレンジの後、チャレンジ材料試料は確認滴定のために維持した。
【０１５２】
チャレンジ後、血液試料（１．０〜２．０ｍＬ）を、６４、８５、１０６、１２７、１３４、１４１、１４８、および１５５日目に、頸静脈の静脈穿刺によって各動物から採取した。上述のように、鎮静用量のＴＥＬＡＺＯＬ（登録商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ）を投与した。血液は血清分離管（ＳＳＴ）内に採取し、血清分離のための処理を行い、試験するまで−２０℃以下で保管した。血清試料を、ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）により、ＦｅＬＶ ｐ２７抗原（ＦｅＬＶ感染のマーカー）の存在について試験した。最終結果を、発色の強度、および４０５／４９０ｎｍの光学密度で分光光度計により判断した。有効な試験となるには、陽性対照の光学密度は０．１３１から２．９９９に収まらなくてはならず、陰性対照は０．００３９以下の光学密度を有しているべきである。
【０１５３】
ウイルスの単離を、−２日目および３５日目に採取した血清試料を用いて行った。１２７日目から１５５日目の血清試料を、ＦｅＬＶワクチンの有効性を判断するために検討した。１２７日目（１２週目）、１３４日目（１３週目）、１４１日目（１４週目）、１４８日目（１５週目）、および１５５日目（１６週目）の血清試料を、ＦｅＬＶ ｐ２７抗原の存在について試験した。動物は、１２７日目（１２週目）から１５５日目（１６週目）の間に３つ以上の陽性のＦｅＬＶ ｐ２７抗原試験結果を有している場合に、持続的に感染していると判断された。
【０１５４】
処理全体および／または時点ごとの処理の効果が有意であった場合、一般線形反復測定混合モデルを用いて温度を分析し、各時点で、処理Ｔ０１と処理Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４との間でペアワイズ処理比較を行った。各時点の各処理について、最小二乗平均、９５％信頼区間、最小値、および最大値を計算した。
【０１５５】
刺傷反応の存在の頻度分布を各処理について計算し、時点データを採取した。注入部位の腫れの存在の頻度分布を各処理について計算し、時点データを採取した。ワクチン接種後の全身反応の存在の頻度分布を各処理について計算した。
【０１５６】
即時型の反応は、第１および第２のワクチン接種の間に、いずれの処理群においても観察されなかった。有害反応は、第１および第２のワクチン接種のおよそ１時間後にいずれの処理群においても観察されなかった。発熱（体温≧３９．５℃）も低体温（体温＜３７．０℃）も、第１および第２のワクチン接種後にいずれの処理群においても観察されなかった。いずれの時点でも、処理群間で平均体温に有意な差はなかった（ｐ＞０．０８）。注入部位の腫れは、第１および第２のワクチン接種後にいずれの処理群においても観察されなかった。
【０１５７】
チャレンジ後の１２週目から１６週目の最終結果は、プラセボワクチンを与えた（Ｔ０１群）１９頭の動物のうち１６頭（８４％）が、ＦｅＬＶに対して持続的にウイルス血症であることを示した。Ｔ０２群の１９頭の動物のうち１３頭（６８％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御された。防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０００４）。Ｔ０３群の１９頭の動物のうち１２頭（６３％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御された。防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．００１３）。Ｔ０４群の２０頭の動物うち１９頭（９５％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御された。防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０００１）。
【０１５８】
したがって、Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４群に投与されたワクチンは全て、３週間離れた２回接種レジメンで投与される場合、最低年齢の子猫において安全であることが実証された。さらに、これらの群に投与されたワクチンはまた、３週間離れた２回接種レジメンで投与される場合、最低年齢の子猫においてＦｅＬＶの持続的なウイルス血症のレベルを有意に低減させ得た。Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４群の子猫におけるＦｅＬＶの持続的なウイルス血症の確立は、統計的に有意に低減した。さらに、Ｔ０４と他のワクチン群（Ｔ０２、Ｔ０３）との間には統計的に有意な差が存在した。新規なアジュバント製剤を含有するワクチンが、ネコにおいて一般に用いられるアジュバント組成物を含有するワクチンよりも有効であることが証明されたことは驚くべきことであり、かつ予想外のことであった。
【０１５９】
（実施例１５）
ネコ白血病ウイルスワクチン
子猫を、到着後１６日間にわたり馴致した。次に動物を室にランダムに割り当て、室内で、処理にランダムに割り当てた（各室において処理当たり１頭の動物）。血液試料（１．０〜２．０ｍＬ）を、研究−１日目に、頸静脈の静脈穿刺によって各動物から採取した。動物のストレスを最小限にし、かつ血液採取の際に動物取扱者が負傷することを避けるために、鎮静用量のＴＥＬＡＺＯＬ（登録商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）を、筋肉内経路により、体重（およそ５．０ｍｇ／ｋｇ）に従って投与した。血液は血清分離管内に採取し、血清分離のための処理を行った。全ての動物はまた、毎日観察し、所見を記録した。
【０１６０】
ワクチンは、１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ストック溶液を用いたことを除いて、実施例１３におけるように調製した。ＬＥＵＫＯＣＥＬＬ（登録商標）２を、ＦｅＬＶの亜群Ａ、Ｂ、およびＣをＦｅＬＶで形質転換されたリンパ球内で増殖させることにより調製した。ウイルス抗原を化学的に不活化し、無菌アジュバントと組み合わせて免疫応答を増強させ、液体形態にパッケージした。全量が５００．０ｍＬの、相対効力（ＲＰ）が２のネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、およびＤＤＡを含有するＩＶＰを、以下の様式で調製した。全部で２０．７ｍＬのＦｅＬＶストック溶液（５０．０ＲＰ／ｍＬ、ここで１ＲＰ＝３，６２４ｎｇ／ｍＬの抗原）を、４７８．２ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液に添加した。撹拌しながら、０．２１ｍＬの５０．０ｍｇ／ｍＬのＱｕｉｌ Ａ溶液を抗原溶液にゆっくりと添加した。次に、０．５８ｍＬの１８ｍｇ／ｍＬのコレステロール／エタノール溶液をゆっくりと添加した。全部で０．２９ｍＬの１８．０ｍｇ／ｍＬのＤＤＡ／エタノール溶液を、撹拌しながら組成物にゆっくりと添加した。組成物を１０，０００ｒｐｍで３分間にわたり均質化した。次に、組成物を、１０，０００（＋５００）ｐｓｉで２００ミクロンの限られた直径のチャンバに１回通すことでマイクロ流体化した。撹拌しながら、１０．０ｍＬの１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を、２９０．０ｍＬのネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、およびＤＤＡの組成物にゆっくりと添加した。ｐＨを、必要に応じて、１８％のＮａＯＨまたは１ＮのＨＣｌで７．０から７．３に調節した。
【０１６１】
ＲＰが５のネコ白血病ウイルスを含有するＩＶＰを、５１．７ｍＬのＦｅＬＶストック溶液および４４７．２ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液を用い、他の成分の量はそのままにして、ＲＰが２のＩＶＰと同様の様式で調製した。
【０１６２】
ＲＰが１０のネコ白血病ウイルスを含有するＩＶＰを、９３．１ｍＬのＦｅＬＶストック溶液、３５５．９ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液、０．１９ｍＬのＱｕｉｌ Ａ溶液、０．５２ｍＬのコレステロール溶液、および０．２６ｍＬのＤＤＡ溶液（４５０ｍＬの全容積）を用いて、ＲＰが２のＩＶＰと同様の様式で調製した。次に、８．３ｍＬの１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を、２４１．７ｍＬのネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、およびＤＤＡの組成物にゆっくりと添加した。
【０１６３】
ＲＰが１５のネコ白血病ウイルスを含有するＩＶＰを、１３９．７ｍＬのＦｅＬＶストック溶液および３０９．４ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液を用い、他の成分の量はそのままにして、ＲＰが１０のＩＶＰと同様の様式で調製した。
【０１６４】
ＲＰが２０のネコ白血病ウイルスを含有するＩＶＰを、２０６．９ｍＬのＦｅＬＶストック溶液および２９２．０ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液を用い、他の成分の量はそのままにして、ＲＰが２のＩＶＰと同様の様式で調製した。
【０１６５】
０．５ｍＬの用量を投与するために、３００．０ｍＬの、ＲＰが５のネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を含有するＩＶＰを、以下の様式で調製した。全部で２１．７ｍＬのＦｅＬＶストック溶液（３５．８ＲＰ／ｍＬ、ここで１ＲＰ＝１，８６４μｇ／ｍＬの抗原）を、２７７．７ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液に添加した。撹拌しながら、０．１２ｍＬの５０．０ｍｇ／ｍＬのＱｕｉｌ Ａ溶液を抗原溶液にゆっくりと添加した。次に、０．３５ｍＬの１８ｍｇ／ｍＬのコレステロール／エタノール溶液をゆっくりと添加した。全部で０．１７ｍＬの１８．０ｍｇ／ｍＬのＤＤＡ／エタノール溶液を、撹拌しながら組成物にゆっくりと添加した。組成物を１０，０００ｒｐｍで３分間にわたり均質化した。次に組成物を、１０，０００（＋５００）ｐｓｉで２００ミクロンの限られた直径のチャンバに１回通すことでマイクロ流体化した。撹拌しながら、３．３ｍＬの１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を、９６．７ｍＬのネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、およびＤＤＡの組成物にゆっくりと添加した。ｐＨを、必要に応じて、１８％のＮａＯＨまたは１ＮのＨＣｌで７．０から７．３に調節した。
【０１６６】
１．０ｍＬの用量の、ＲＰが５のネコ白血病ウイルス、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、ＤＤＡ、およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を投与するための、ＩＶＰを、量を適切に調節して、０．５ｍＬ用量と同様にして調製した。
【０１６７】
全量が３００．０ｍＬの、ＲＰが１０のネコ白血病ウイルスおよびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を含有するＩＶＰを調製した。全部で６２．１ｍＬのＦｅＬＶストック溶液（５０．０ＲＰ／ｍＬ、ここで１ＲＰ＝３，６２４μｇ／ｍＬの抗原）を、２３７．９ｍＬの０．０６３％のＰＢＳ緩衝液に添加した。組成物を１０，０００ｒｐｍで３分間にわたり均質化した。次に、組成物を、１０，０００（＋５００）ｐｓｉで２００ミクロンの限られた直径のチャンバに１回通すことでマイクロ流体化した。撹拌しながら、３．３ｍＬの１．５％ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）溶液を、９６．７ｍＬのネコ白血病ウイルス組成物にゆっくりと添加した。ｐＨを、必要に応じて、１８％のＮａＯＨまたは１ＮのＨＣｌで７．０から７．３に調節した。
【０１６８】
プラセボワクチンおよびＦｅＬＶワクチン（表２）を、研究０日目および研究２０日目に、２２内径×３／４”針および３ｃｃのシリンジを用いて皮下経路で子猫に投与した。処理群Ｔ０１には、１．０ｍＬ用量のプラセボワクチンを投与した。処理群Ｔ０２、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、Ｔ０７、Ｔ０８、およびＴ０９には、１．０ｍＬ用量のＦｅＬＶワクチンを投与した。処理群Ｔ０３には、０．５ｍＬ用量のＦｅＬＶワクチンを投与した。処理群Ｔ１０には、ＦｅＬＶカナリア痘ウイルスワクチン（Ｍｅｒｉａｌ）を、皮内銃注入器を用いて皮内経路で投与した。
【０１６９】
【表２】

【０１７０】
全ての動物は、第１のワクチン接種（研究０日目）および第２のワクチン接種（研究２０日目）の後に、発声、引っかき／噛み、および攻撃的なまたは脱走の試みを含む、試験ワクチン投与での痛みの兆候を観察した。ワクチン接種後の様子（正常または異常）もまた文書記録した。全ての動物は、研究０日目および研究２０日目のワクチン投与後のおよそ１時間にわたり、全身性の有害反応の発現についても観察した。所見は文書記録した。ワクチン接種部位を触診し、注入部位の痛み、注入部位の発赤、注入部位の腫れ、および腫れのサイズを記録した。観察は、第１のワクチン接種後の研究２日目、５日目、および９日目、ならびに第２のワクチン接種後の研究２５日目、２８日目、および３２日目に行った。所見は文書記録した。
【０１７１】
血液試料（１．０〜２．０ｍＬ）を、研究３２日目（チャレンジ前）に、頸静脈の静脈穿刺によって各動物から採取した。動物を、研究３４日目、３６日目、３９日目、および４１日目に、１．０ｍＬの希釈していないチャンレジ材料を経鼻経路で投与することによりチャレンジした。針を有さない１ｍＬのツベルクリンシリンジを、チャレンジ材料で満たした。各子猫におよそ０．５ｍＬを鼻孔から投与した。ＦｅＬＶチャレンジ材料は１０^６．１ＴＣＩＤ_５０／ｍＬの平均力価を有していた。次に、血液試料（１．０〜２．０ｍＬ）を、研究６１日目、８３日目、１０６日目、１２６日目、１３３日目、１３８日目、１４６日目、および１５２日目に、頸静脈の静脈穿刺によって各動物から採取した。
【０１７２】
結果−安全性
第１の（研究０日目）ワクチン接種の間、処理群Ｔ０９の３頭の動物が即時型の刺傷型反応を示した。第２のワクチン接種（研究２０日目）の間、処理群Ｔ０５の１頭の動物、処理群Ｔ０８の４頭の動物、および処理群Ｔ０９の２頭の動物が、即時型の刺傷型反応を示した。
【０１７３】
第１のワクチン接種の間、処理群Ｔ０９の３頭の動物がわずかな発声を示した。第１のワクチン接種で痛みを示した動物は、その時にわずかな発声も示した。第２のワクチン接種の間、処理群Ｔ０５の１頭の動物、処理群Ｔ０８の４頭の動物、および処理群Ｔ０９の２頭の動物が、わずかな発声を示した。第２のワクチン接種で痛みを示した動物は、その時にわずかな発声も示した。
【０１７４】
第１のワクチン接種の間、処理群Ｔ０９の３頭の動物が、攻撃的な挙動／脱走の試みを示した。第２のワクチン接種の間、処理群Ｔ０５の１頭の動物、処理群Ｔ０８の４頭の動物、および処理群Ｔ０９の２頭の動物が、攻撃的な挙動／脱走の試みを示した。
【０１７５】
いずれの処理群も、第１または第２のワクチン接種で注入部位に引っかき／噛みを示さなかった。注入部位の反応は、第１または第２のワクチン接種後に、いずれの処理群においても観察されなかった。有害反応もまた、いずれの処理群においても観察されなかった。
【０１７６】
結果−有効性
全ての動物は、−１日目に採取された血清試料からのＦｅＬＶ ｐ２７抗原について、ワクチン接種の前に陰性という試験結果であった。全ての動物はまた、３２日目に採取された血清試料からのＦｅＬＶ ｐ２７抗原について、チャレンジの前に陰性という試験結果であった。
【０１７７】
チャレンジ後の１２週目から１６週目の最終結果（表３）は、処理群Ｔ０１（プラセボ）の１０頭の動物のうち９頭（９０％）が、ＦｅＬＶに対して持続的にウイルス血症であることを示した。同一の期間からの結果は、処理群Ｔ０２の１０頭の動物のうち６頭（６０％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御されたことを示し、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０５７３）。処理群Ｔ０３の１０頭の動物のうち９頭（９０％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．００１１）。処理群Ｔ０４の１０頭の動物うち１０頭（１００％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０００１）。処理群Ｔ０５の１０頭の動物のうち１０頭（１００％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０００１）。処理群Ｔ０６の１０頭の動物のうち７頭（７０％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０１９８）。処理群Ｔ０７の１０頭の動物のうち１０頭（１００％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０００１）。処理群Ｔ０８の１０頭の動物のうち８頭（８０％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．００５５）。処理群Ｔ０９の１０頭の動物のうち５頭（５０％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１４０９）。最後に、処理群Ｔ１０の１０頭の動物のうち６頭（６０％）が、ＦｅＬＶのウイルス性チャレンジから防御され、この防御レベルは、プラセボワクチン接種された子猫と比較して統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０５７３）。
【０１７８】
【表３】

【０１７９】
考察
処理群Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０６、およびＴ０７において用いられたワクチンは、第１のワクチン接種の際に、その時点で反応が観察されなかったため、十分な安全性プロフィールを示した。処理群Ｔ０５の１頭の動物が、第２のワクチン接種で即時型の反応を示した（投与での痛み、わずかな発声、および攻撃的な／脱走の試み）。この事象は、ワクチン製剤の問題よりもむしろ、特定の動物へのワクチン接種に対する悪化した応答に関連する可能性がある。全てのワクチンは、ワクチン接種に関連する局所的反応も不都合な事象も観察されなかったため、ワクチン接種後の十分な安全性プロフィールを示した。
【０１８０】
ウイルス性ＦｅＬＶでのチャレンジの後に、８０％以上の防御（７５％以上の予防的画分）が達成されたため、処理群Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０７、およびＴ０８に投与されたＦｅＬＶワクチンは、十分な有効性を示した。Ｔ０７群の動物には、Ｔ０４群およびＴ０５群の抗原用量のそれぞれ２５％および３３％を与えたため、Ｔ０７群に与えられたワクチンが１００％の防御をもたらしたことは驚くべきことであり、かつ予想外のことである。本明細書において開示および試験されたアジュバントの明らかな利点は、そのアジュバントにより、より少ない用量の抗原を用いながらも依然として完全に防御的な免疫応答を誘発することが可能になることである。処理群Ｔ０２、Ｔ０６、およびＴ０９に投与されたワクチンは、ウイルス性ＦｅＬＶでのチャレンジの後にある程度低下した有効性（８０％未満の防御、７５％未満の予防的画分）を示した。処理群Ｔ０２に投与されたワクチンの有効性の低下は、その群に応答が弱い動物が存在することによる可能性があった。
【０１８１】
（実施例１６）
ニワトリにおけるアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）に対する卵内でのワクチン接種
トリコクシジウム症は、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の原虫により通常は生じる腸疾患であり、家禽産業にとって深刻な世界中の問題となっている。採餌中に摂取される寄生虫は腸管に局在化し、そこで、寄生虫は腸および下層の組織に対する深刻な損傷を生じさせる。ブロイラー鳥と産卵鳥との両方の飼料効率および体重増加が損なわれるため、家禽産業に対して生じる経済的損失は非常に大きなものである。例えば、組換えアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）タンパク質を抗原として用い、かつ様々なアジュバント系を用いる、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）に対するワクチン接種の試みを含む、最新技術の全体的な要約が、参照することにより、あたかも完全に明記されているかのように本明細書に組み込まれる全ての文献、すなわち、（１）Ｈ．Ｓ．Ｌｉｌｌｅｈｏｊら、Ｊ．Ｐａｒｉｓｉｔｏｌ、９１（３）、２００５、ｐｐ．６６６〜６７３；（２）Ｈ．Ｓ．Ｌｉｌｌｅｈｏｊら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、４９ ２００５、１１２〜１１７；および（３）Ｒ．Ａ．Ｄａｌｌｏｕｌら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ、５（１）、２００６、ｐｐ．１４３〜１６３において記載されている。本実施例は、コクシジウム症の背景において優れた性能をもたらすアジュバント成分を採用する新規なワクチン組成物の使用を対象とするものである。
【０１８２】
本発明の非常に効果的なアジュバントは、全てのアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種から得られる抗原材料と組み合わせて用いることができ、前記抗原材料には、その精製されたかもしくは部分的に精製されたタンパク質抽出物、または組換えにより発現したその１つもしくは複数のタンパク質、またはあらゆるおよび全てのこのようなタンパク質の断片が含まれ、したがって、中でも、アイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、アイメリア・アーサタ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｈｓａｔａ）、アイメリア・ボビス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｂｏｖｉｓ）、アイメリア・ブルネッティ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、アイメリア・フラテルキュレ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｆｒａｔｅｒｃｕｌａｅ）、アイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）、アイメリア・メレアグリディス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、アイメリア・ミチス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓ）、アイメリア・ネカトリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ）、アイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ）、ウサギ肝コクシジウム（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｔｉｅｄａｅ）、ニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）、およびアイメリア・ツェルニー（Ｅｉｍｅｒｉａ ｚｕｒｎｉｉ）からもたらされる抗原材料が含まれる。
【０１８３】
本発明のアジュバント化ワクチンは、限定はしないがオーシスト（胞子形成または非胞子形成）、スポロシスト、スポロゾイト、シゾント、メロゾイト、雄または雌の配偶子細胞を含む原生動物の生活環における１つまたは複数の点で産生されるあらゆるタンパク質または高分子に対して提供され得る。好ましい実施例において、オーシスト段階において大量に糞内に排泄されるタンパク質は、組換えタンパク質抗原の源、または従来の手段によって精製されたようなこのようなタンパク質の部分的にもしくは完全に精製された試料の源として作用するために好ましい材料である。
【０１８４】
本ワクチンの製剤における抗原の源として有用なアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）タンパク質のさらなる例には、Ｋａｒｋｈａｎｉｓら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９１、ｐｐ．９８３〜９８９によって記載されているようなものが含まれ、これには、約２０から約３０ｋＤＡの質量範囲を有する、前記文献において記載されてような防御的抗原が含まれる。さらなる例にはアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の２３ｋＤａの３−１Ｅタンパク質、および、例えばニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）から回収されるＥｔｐ１００タンパク質が含まれる。
【０１８５】
本発明の非常に効果的なアジュバントは、ニューロスポラ・カニナム（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ）から得られる抗原材料と組み合わせて用いることができる。
【０１８６】
さらに、本発明の非常に効果的なアジュバントは、原生動物病原体、すなわち、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）（クリプトスポリジウム症）、シクロスポラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）（サイクロスポーラ症）、戦争イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ）（イソスポラ症）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）（トキソプラズマ症）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（マラリア）、およびバベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）（バベシア症）、ならびに、通常はこれらのまたは関連する疾患の原因となるアピコンプレクサ群（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎ）のものである関連する原生動物のいずれかと組み合わせて用いることができる。
【０１８７】
特定のアジュバント系を含有するワクチンの卵内送達の有効性を以下のように判断した。
【０１８８】
材料および方法：
１．材料：
（３−１Ｅタンパク質の）組換えアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させ、アフィニティーカラム精製した。細胞全体のアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の高分子（破壊細胞から界面活性剤で可溶化した）の粗調製物もまた抗原として用い、この粗抗原は「ＥＭ」と呼ばれる。好ましい実施例において、アジュバントは上記の実施例８において記載されているものであり、実施例のプロトコルに従って、定められているように調製される。したがって、典型的な実施例において、各胚に、約５０から約１００マイクロリットルのワクチン溶液を羊膜内に注入し（したがって、羊水および羊膜空間を含む）、前記溶液の１ＭＬは、例えば２０ｍＭのＰＢＳ内に全て提供される、約５０または１００マイクログラムの組換え３−１Ｅタンパク質または他のタンパク質種、あるいは、約５０または１００マイクログラムの粗細胞「ＥＭ」の抽出物、約２０マイクログラムのＱｕｉｌ Ａ、約２０マイクログラムのコレステロール、約０．０７５％（ｖ／ｖ）のＣＡＲＢＯＰＯＬ、約１０マイクログラムのＤＤＡ、および約２５０マイクログラムのＲ１００５を含む。
【０１８９】
本明細書において用いるためのサポニンの選抜に関連して、以下のさらなる情報が有益である。定義された用語であるサポニンは、植物由来のグリコシドを指し、その多くが生物学的特性について広く研究されている（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ、Ｍｃｌｌｒｏｙ，Ｒ．Ｊ．、Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ ａｎｄ ｃｏ．、Ｌｏｎｄｏｎ、１９５１）。ワクチンの製造のために当技術分野において最も多く用いられているサポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ ｍｏｌｉｎａ）、セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）、またはジプソフィラ・ストラチウム（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ）という植物に由来するものである。アジュバント活性を有することが知られている、キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ ｍｏｌｉｎａ）の樹皮の抽出物、例えばＱｕｉｌ Ａが知られている。また、Ｑｕｉｌ Ａの純粋画分も、アジュバント活性を維持する一方でＱｕｉｌ Ａよりも毒性が低いということが記載されており、それは例えばＱＳ２１である。ＱＳ２１はまた、Ｋｅｎｓｉｌら（１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ １４６、４３１〜４３７）に記載されている。上記および以下に記載されるように、本発明のさらなるアジュバント成分と混合すると、このようなサポニン含有材料は非常に効果的な材料となる。さらなる効果的な製剤には、セイヨウトチノキの種子に生じるサポニンの混合物としてＭｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（第１２版、項目３７３７）において記載されているエスチンを用いるものが含まれる。本発明の好ましい実施形態において、サポニンは、Ｅ．Ｍ Ｓｅｒｇｅａｎｔ社によりアメリカ合衆国において販売されている「Ｑｕｉｌ−Ａ」を指す。
【０１９０】
サポニン抽出物を混合物またはそれから精製された個別の成分として用いることができ、このような画分／生成物には、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡからのＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−２１、または、スウェーデンのＩｓｃｏｎｏｖａ Ｃｏｍｐａｎｙにより提供されている類似の粗サポニン生成物、分画されたサポニン生成物、もしくは純化されたサポニン生成物、およびその混合物が含まれることもさらに理解されるべきである。１つの実施形態において、Ｑｕｉｌ Ａは少なくとも８５％の純度である。他の実施形態において、Ｑｕｉｌ Ａは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度である。
【０１９１】
２．胚のワクチン接種：
卵をＭｏｙｅｒｓ Ｈａｔｃｈｅｒｙ、Ｑｕａｋｅｒｔｏｗｎ、ＰＡから購入した。卵内での免疫化のために、ブロイラーの卵を１８日間インキュベートし、ろうそくに当てて（胚形成１８日目に）受精卵を選抜し、次に、２０ｍＭのＰＢＳとアジュバント単独または組換え３−１Ｅタンパク質もしくは「ＥＭ」調製物で製剤されたアジュバントとを注入した。注入は「Ｉｎｔｅｌｌｉｊｅｃｔ」卵内注入器（Ａｖｉｔｅｃｈ、Ｈｅｂｒｏｎ、ＭＤ）を製造業者の指示に従って用いて行った。各卵には、Ａｖｉｔｅｃｈ（Ｈｅｂｒｏｎ、ＭＤ）により提供されている１７．５ｃｍ長の１８内径の針を用いて、１００マイクロリットルの試料を羊膜腔内に与えた。５０マイクロリットルの用量もまた、本発明の実施における機能可能な用量の範囲内である。
【０１９２】
３．ニワトリ：
ブロイラーのニワトリが孵化したらすぐに（約２１〜２２日目）、使い捨てのニワトリ運搬箱（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を用いて前記ニワトリを実験室に移し、次にニワトリをＰｅｔｅｒｓｉｍｅユニットに収容し、飼料および水を自由摂取で提供した。
【０１９３】
鳥をアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）が存在しない施設内の育雛用の檻内で維持し、場所が離れている大きなぶら下がったケージ内に移し、そこでアイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）の生のオーシストに感染させ、実験期間が終了するまでそこで維持した。
【０１９４】
４．寄生虫：
Ａｎｉｍａｌ Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ＢＡＲＣにおいて維持され Ｌｉｌｌｅｈｏｊ博士の実験室において確立された手順に従って増殖させたアイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）のＵＳＤＡ ＢＡＲＣ株＃４１を用いた。アイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の株（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ ＃４１）から新たに産生されたオーシストを５％次亜塩素酸ナトリウム上に浮かべることで清掃し、ＰＢＳで３回洗浄し、血球計を用いてトリパンブルーによって生存率を数えた。
【０１９５】
５．アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）チャレンジ感染：
７日齢の鳥の羽にタグを付け、感染していない対照群以外の全ての実験群の鳥に、接種針を用いて食道にアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）を接種し、次にオーシスト採取ケージ内に置いた。
【０１９６】
６．体重増加の判定：
個別の鳥の体重をアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）での感染後０日目（感染していない）、６日目、および１０日目に判定した。
【０１９７】
７．糞内のオーシスト産生の評価：
動物管理者はケージを清掃しないように指示され、糞落下物が採取された。採取皿を、感染後６日目から開始して５日間にわたり各ケージの下に置き、糞材料を大きなプラスチック製の瓶（２Ｌ）に採取した。各瓶内で水道水に浸した糞落下物を、さらなる水（全容量は３Ｌ）と共に混和器内ですりつぶし、２つの４０ｍｌのランダムな試料を各試料から取り、それらを計数するまで冷蔵庫内に保存した。コクシジアのオーシストを計数するために、まず様々な希釈物を作製して、各試料についてオーシストを数えるために最適な希釈を決定した。オーシストを、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ博士の実験室において確立されたショ糖浮遊法を用いて、ＭｃＭａｓｔｅｒ計数チャンバを用いて顕微鏡により計数した。ニワトリにより排泄されたオーシストの総数を、
全オーシスト／鳥＝（オーシスト数×希釈計数×糞試料容積／計数チャンバ容積）／ケージ当たりの鳥数
という式を用いて計算した。
【０１９８】
８．試料の採取：
感染日後６日目に血液を採取し、血清の抗体応答を判定した。血液試料は個別の鳥（Ｎ＝４〜５羽／群）から得、４℃で４時間にわたり凝固させ、血清を採取した。血清試料を、ＥＬＩＳＡを用いて抗Ｅｉｍｅｒｉａ抗体について試験した。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを１０μｇ／ウェルの組換えコクシジア抗原Ｅａ３−１Ｅ、ＥｔＭＩＦ、またはＥｔＭＩＣ２で一晩被覆し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。血清希釈物（１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、１００μｌ／ウェル）を添加し、連続して穏やかに振とうしながらインキュベートし、洗浄し、そして、結合Ａｂを、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびペルオキシダーゼ特異的基質で検出した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて４５０ｎｍで判定した。
【０１９９】
孵化の時点ならびにその６日および１０日後に腸組織を採取し、Ｔｈ１刺激の尺度として、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２）の産生について試験した。
【０２００】
９．ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて腸ＩＥＬから抽出した。５マイクログラムのＲＮＡを１．０ＵのＤＮアーゼＩおよび１．０μｌの１０倍反応緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で処理し、室温で１５分にわたりインキュベートし、１．０μｌの停止溶液を添加してＤＮアーゼＩを不活化し、混合物を７０℃で１０分間にわたり加熱した。ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を製造業者の推奨に従って用いて、ＲＮＡを逆転写した。
【０２０１】
１０．定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ニワトリインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＧＡＰＤＨ対照のための定量的ＲＴ−ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを表４に列挙する。増幅および検出を、Ｍｘ３０００Ｐ系およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、等量の、腸ＩＥＬからの全ＲＮＡを用いて実施した。希釈された標準ＲＮＡのｌｏｇ_１０を用いて標準曲線を作製し、個別の転写産物のレベルを、Ｑ遺伝子プログラムによって分析されたＧＡＰＤＨのレベルに対して標準化した。各分析は３回行った。実験内の試料間でＲＮＡレベルを標準化するため、増幅産物についての平均閾値サイクル（Ｃｔ）値を、その実験における全ての試料からの値をプールすることにより計算した。
【０２０２】
【表４】

【０２０３】
脾臓細胞増幅アッセイのために、アイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）を接種する前、およびＤＰＩ（感染後日）１０日目に、脾臓を採取した。脾臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補った１０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を有するペトリ皿内に置いた。脾臓リンパ球の単一細胞の懸濁液を調製し、リンパ球の増殖を実施した。簡潔に述べると、脾臓細胞を、１０％完全ＩＭＤＭ培地と呼ばれる、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補ったＩＭＤＭ培地（Ｓｉｇｍａ）内で、５×１０^６または１×１０^７個細胞／ｍｌに調節した。脾臓細胞（１００μｌ／ウェル）を、５％ＣＯ_２および９５％空気を有する湿潤化したインキュベーター（Ｆｏｒｍａ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ）内で、４８時間にわたり、平底の９６ウェルプレート内において４１℃でインキュベートした。細胞増殖を２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩（ＷＳＴ−８、Ｃｅｌｌ−Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（登録商標）、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で判定した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０２０４】
結果
結果は、１００マイクロリットルのアジュバント製剤（すなわち、先に定義された用量に従った組換え３−１Ｅタンパク質を含む１００マイクロリットル）をワクチン接種されたブロイラー鳥が、ワクチン接種していないがアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）に感染した鳥と比較して、さらに約４５から８５グラムの体重の増加を得たことを示した。
【０２０５】
本発明のワクチンはまた、マイトジェンリンパ球増殖アッセイにより測定されるような細胞介在性の免疫に対する明らかな効果も示した。Ｃｏｎ Ａと４８時間にわたりインキュベートされた脾臓リンパ球の１×１０^７個細胞／ｍｌの増殖の結果は、抗原を伴ってまたは伴わずにファイザー社のアジュバントで免疫化された、アイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）に感染したニワトリが、全体として、とりわけ５０μｇの用量を用いた場合に、高いレベルのリンパ球増幅を示すことを示した。特に脾臓における、ＩＬ−１Ｂの産生、ＩＦＮ−γの産生、およびＩＬ−１５の産生の有意な増強が、本発明のアジュバント化ワクチン組成物の投与の後に見られた。要約すると、これらの結果は、サイトカイン応答に対する本アジュバントの効果を明らかに示し、液性免疫応答よりも細胞介在性免疫応答を増強することに対するその効果を裏付けるものである。
【０２０６】
本発明のワクチンはまた、糞内のオーシストの産出に対する明らかな効果も示した。感染していない対照鳥はオーシストを全く排泄しなかった。アイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の感染の後、ファイザー社のアジュバントのみで処理した群において糞内のオーシストの産出が有意に低減した。粗精製のアイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）およびアジュバントを卵内でワクチン接種された鳥は、粗アイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）調製物のみを接種した群、すなわちＥＭ群と比較してはるかに少ない糞内のオーシストの産出を示した。
【０２０７】
精製された組換えアイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）タンパク質３−１Ｅが前述の実験の実施において用いられていても、組換えＥａ３−１Ｅ、ＥａＭＩＦ、およびＥｔＭＩＣ２抗原を単独で、または３−１Ｅと組み合わせて、または互いに組み合わせて、またはそのいずれかのあらゆる組合せとして使用することもまた、本発明の好ましい実施形態であり、通常、全てのアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）タンパク質抗原は、本発明のアジュバントと混合される限り、本発明の実施において機能可能であることに注意されたい。
【０２０８】
（実施例１７）
牛における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｊ５株バクテリンの判断
本研究の目的は、様々な新規な製剤において投与された場合の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｊ−５株）抗原に対する牛における免疫応答を判断することである。市販されているＪ５バクテリンは、乳牛における大腸菌性乳房炎に対する予防的ワクチンとして販売されており、その現在の製剤において中程度に効果的である。ワクチン接種の前に、動物は、ワクチン接種の前に行われた血清試料の分析にそれぞれ基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ５に対する抗体について力価が低いことが判定された。
【０２０９】
肉牛
実験的ワクチンを、不活化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ５バクテリンを抗原として用いて製剤し、上記の実施例１３に従って作製した。各処理群は、最初は７頭の動物を含有していた（表５）。１つの処理群には生理食塩水を与え（Ｔ０１）、別の群には市販されているＪ５ワクチンを与えた（Ｔ０２−Ｅｎｖｉｒａｃｏｒ（商標）ファイザーＪ−５大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）バクテリン）。他の処理群には、表５において特定されるアジュバントを含有する様々な製剤を与えた。全てのワクチン接種では、研究０日目および２１日目に皮下注入によって投与した。投与容積は５ｍＬであった。
【０２１０】
【表５】

【０２１１】
表５において、ＱＣはＱｕｉｌ Ａ／コレステロールの、ＤはＤＤＡの、Ｃはカルボポールの、ＲはＲ１００５の、ＸはＤＥＡＥ−デキストランの、そしてＯは油の省略形である。
【０２１２】
以下のために、ストック溶液を、上記の実施例１から１３におけるようにして調製した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、光学顕微鏡によって直接的に計数することによって判定して、１用量当たり約４〜５×１０^９生物で与えた。水中のＱｕｉｌ Ａは５０ｍｇ／ｍｌであり、エタノール中のコレステロールは１７ｍｇ／ｍｌであり、エタノール中のＤＤＡは１７ｍｇ／ｍｌであり、２０ｍＭリン酸緩衝液中のＲ１００５は５ｍｇ／ｍｌであり、水中のＤＥＡＥ−デキストランは２００ｍｇ／ｍｌであり、ＴＥ緩衝液中のＴＬＲアゴニストは２０ｍｇ／ｍｌであり、水中のＩｓｃｏｍａｔｒｉｘは５．４ｍｇ／ｍｌであった。個別の成分は、左から右の文字記号の順にｖ／ｖを添加した。例えば、ＱＣＤＣでは、適切な容積のＱｕｉｌ Ａを添加し、その後にコレステロール、ＤＤＡを添加し、最後にカルボポールを添加した。製剤が油を含有していた場合、分離した成分を添加し、混和し、次に、Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）５ＬＴ鉱油と、Ｓｐａｎ８０およびＴｗｅｅｎ８０（ＱＣＤＯ）またはＳｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８５（ＱＣＤＸＯ）のいずれかとの混合物内に乳化した。Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）は市販されている軽油である。
【０２１３】
血液試料を、血清学的試験のために、研究０日目、２１日目、および４９日目に採取した。血清試料における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ５に対する抗体力価を、Ｊ５特異的な間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。ＩｇＧ抗体のアイソタイプをヒツジ抗ウシ抗体コンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ）で判定した。力価は、それらの幾何学的平均として判定し、表した。
【０２１４】
結果
研究の血清学的結果を表６〜８に示す。抗体力価が高いほど、通常、ワクチンのさらに良好な防御に関連する。Ｊ５特異的ＩｇＧの総力価を表６に示す。本発明の製剤のいくつかが、これらの製剤に同様の量のＪ５抗原を添加したにも関わらず、市販されている製品よりもはるかに高い力価をもたらした。ＱＣＤＯ、ＱＣＤＸ、およびＱＣＤＸＯ製剤は、これらの牛における良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。
【０２１５】
【表６】

【０２１６】
Ｊ５特異的ＩｇＧ１抗体のアイソタイプを判定した。これらの結果を表７に示す。ここでも、ＱＣＤＯ、ＱＣＤＸ、およびＱＣＤＸＯ製剤は、これらの牛における良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。これらの製剤は、１回のワクチン接種であっても、２回注入された市販されているワクチンよりもはるかに高い力価をもたらした。
【０２１７】
【表７】

【０２１８】
ＩｇＧ２抗体の力価を表８に示す。この抗体アイソタイプは、乳中での好中球による良好な食作用および動物に対する防御に関連することが多い。ＱＣＤＯ、ＱＣＤＸ、およびＱＣＤＸＯ製剤は、これらの牛における良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。
【０２１９】
【表８】

【０２２０】
乳牛
実験的ワクチンを、不活化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ５バクテリンを抗原として用いて製剤し、上記の実施例１３に従って作製した。各処理群は、最初は７頭の動物を含有していた（表９）。１つの処理群には生理食塩水を与え（Ｔ０１）、別の群には市販されているＪ５ワクチンを与えた（Ｔ０２−Ｅｎｖｉｒａｃｏｒ（商標）ファイザーＪ−５大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）バクテリン）。他の処理群には、表９において特定されるアジュバントを含有する様々な製剤を与えた。全てのワクチン接種では、研究０日目および２１日目に皮下注入によって投与した。投与容積は５ｍＬであった。
【０２２１】
【表９】

【０２２２】
表９において、ＱＣはＱｕｉｌ Ａ／コレステロールの、ＤはＤＤＡの、Ｃはカルボポールの、ＲはＲ１００５の、ＸはＤＥＡＥ−デキストランの、ＴはＴＬＲアゴニスト（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の、そしてＯは油の省略形である。以下のために、ストック溶液を調製した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、光学顕微鏡によって直接的に計数することによって判定して、１用量当たり約４〜５×１０^９生物で与えた。水中のＱｕｉｌ Ａは５０ｍｇ／ｍｌであり、エタノール中のコレステロールは１７ｍｇ／ｍｌであり、エタノール中のＤＤＡは１７ｍｇ／ｍｌであり、２０ｍＭリン酸緩衝液中のＲ１００５は５ｍｇ／ｍｌであり、水中のＤＥＡＥ−デキストランは２００ｍｇ／ｍｌであり、ＴＥ緩衝液中のＴＬＲアゴニストは２０ｍｇ／ｍｌであった。個別の成分は、左から右の文字記号の順もｖ／ｖを添加した。例えば、ＱＣＤＣＲでは、適切な容積のＱｕｉｌ Ａを添加し、その後にコレステロール、ＤＤＡを添加し、最後にカルボポールを添加した。製剤が油を含有していた場合、分離した成分を添加し、混和し、次に、Ｄｒａｋｅｏｌ ５ＬＴ鉱油と、Ｓｐａｎ８０およびＴｗｅｅｎ８０（ＴＸＯ、ＱＣＤＯ）またはＳｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８５のいずれかとの混合物内に乳化した。
【０２２３】
血液の採取
血液試料を、血清学的試験のために、研究０日目、２１日目、および４９日目に採取した。血清試料における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｊ５に対する抗体力価を、Ｊ５特異的な間接的ＥＬＩＳＡアッセイによって判定した。ＩｇＧ抗体のアイソタイプをヒツジ抗ウシ抗体コンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ）で判定した。力価は、それらの幾何学的平均として判定し、表した。
【０２２４】
結果
研究の血清学的結果を表１０に示す。抗体力価が高いほど、通常、ワクチンのさらに良好な防御に関連する。Ｊ５特異的ＩｇＧの総力価を表１０に示す。本発明の製剤のいくつかが、これらの製剤に同様の量のＪ５抗原を添加したにも関わらず、市販されている製品よりもはるかに高い力価をもたらした。ＱＣＤＯ、ＴＸＯ、およびＱＣＤＸＯ製剤は、これらの牛における良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。
【０２２５】
【表１０】

【０２２６】
Ｊ５特異的ＩｇＧ１抗体のアイソタイプを判定した。これらの結果を表１０に示す。ここでも、ＱＣＤＯ、ＴＸＯ、およびＱＣＤＸＯ製剤は、これらの牛における良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。これらの製剤は、１回のワクチン接種であっても、２回注入された市販されているワクチンよりもはるかに高い力価をもたらした。
【０２２７】
この抗体アイソタイプは、乳中での好中球による良好な食作用および動物に対する防御に関連することが多い。ＱＣＤＸＯ製剤は、これらの牛における良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。
【０２２８】
（実施例１８）
ウシウイルス性下痢ウイルスのワクチン
研究の目的
この研究は、未処理子牛におけるＢＶＤＶ−１でのチャレンジに対して、死滅ウシウイルス性下痢ウイルス１型および２型（ＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２またはＢＶＤ−１／２）の２つのワクチン、ならびに本発明のアジュバントと共に製剤された１つのＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２抽出物ワクチンの、安全性、有効性、および交差防御を、１つの陰性対照（生理食塩水）および２つの陽性対照（修飾生ＢＶＤＶ−２ワクチン、および現在入手可能な死滅ＢＶＤＶ−１／２ワクチン）と比較した。表１１は、研究設計を表す。
【０２２９】
この研究はまた、本発明のアジュバントが、ＢＶＤＶに自然に曝露された動物から得られる本発明のワクチン組成物をワクチン接種された動物を区別するために用いられ得ることを示した。
【０２３０】
動物
ＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２について血清反応陰性である、雄または雌の７から１５カ月齢の健康な離乳した肉牛を用いた。
【０２３１】
【表１１】

【０２３２】
ワクチン接種
研究０日目および２１日目に、動物（Ｎ＝１０／群）を表１１において記載されているようにワクチン接種した。抗原（ＢＶＤＶ）は、ＥＬＩＳＡアッセイによって判定して、１用量当たり５５００相対効力単位（ＲＵ）で与えた。Ｔ０１群における子牛は対照群として用いた。それらには０．９％塩化ナトリウム無菌溶液を与えた。Ｔ０２群からＴ０６群における子牛には、表１１に示されるアジュバントと有する実験的ＢＶＤＶ１／２ワクチンを与えた。Ｔ０２群には１回のみのワクチン接種を行った（研究０日目）。それらには、アジュバントを含有しない修飾生ウイルス（ＭＬＶ）ＢＶＤＶ−２ワクチンを与えた。Ｔ０３群には、２．５％水中油型エマルジョン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）およびＱｕｉｌ Ａ／コレステロールアジュバント（ＰｒｅＺｅｎｔ Ａ（登録商標））を含有する死滅ウイルスＢＶＤＶ−１／２ワクチンを与えた。Ｔ０４群には、Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール、ＤＤＡ、およびカルボポールを含有する死滅ウイルスＢＶＤＶ−１／２ワクチンを与えた。Ｔ０５群には、Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール、ＤＤＡ、カルボポール、およびＲ１００５を含有する死滅ウイルスＢＶＤＶ−１／２ワクチンを与えた。Ｔ０６群には、Ｑｕｉｌ Ａ／コレステロール、ＤＤＡ、およびカルボポールを含有する死滅ウイルスＢＶＤＶ−１／２高力価抽出物ワクチンを０日目に与え、同様の低力価抽出物ワクチンを２１日目に与えた。全ての処理に、群２を除いて、０日目および２１日目に２ｍＬ用量を１回皮下投与した。
【０２３３】
ＱＣＤＣ＋／−Ｒは、１００μｇのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇのコレステロール、５０μｇのＤＤＡ、および０．０７５％のカルボポールを含有し、含む場合には、前述したように、全て２ｍＬの１用量当たり１，０００μｇのＲ１００５を含むものであった。
【０２３４】
チャレンジ
４２日目に、全ての動物を、５ｍＬの１用量当たり５．４ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の濃度の、約４ｍＬ（鼻孔ごとにおよそ２ｍＬ）の非細胞変性ＢＶＤＶ−１株（株ＮＹ−１；ＣＶＢ、ＵＳＤＡ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を用いて、鼻腔内でチャレンジした。
【０２３５】
所見
第１の注入部位（左頸部）について、注入部位の所見を、研究０日目（ワクチン接種前）、１日目、２日目、３日目、７日目、および２１日目に記録した。第２の注入部位（同様に左頸部）についての所見を、研究２１日目（ワクチン接種前）、２２日目、２３日目、２４日目、２８日目、および３５日目に記録した。全ての明白な注入部位反応を測定した（Ｌ×Ｗ×Ｈ、ｃｍ）。最初のワクチン接種では、直腸温度を研究−１日目、０日目（ワクチン接種前）、１日目、２日目、および３日目に記録した。追加ワクチン接種での温度を、研究２０日目、２１日目（ワクチン接種前）、２２日目、２３日目、および２４日目に記録した。
【０２３６】
血液のサンプリング
血液試料を、研究−１日目、２０日目、３４日目、および４９日目に、血清分離管（ＳＳＴ）を用いて、利用可能な各動物から採取した。血液試料を、研究３３から３５日目（チャレンジ前）および３６から４９日目にＥＤＴＡ管を用いて採取した。血液試料を、研究３４日目（チャレンジ前）および３６から４９日目に細胞調製管（ＣＰＴ）を用いて採取した。
【０２３７】
結果
表１２は、その研究日の、血球凝集アッセイによる、ＢＶＤウイルスに対する血清中和抗体力価の幾何学的な最小二乗平均（ＧＬＳＭ）を示す。結果は、本発明のアジュバントが、研究が進むにつれてＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２の両方に対する力価を増大させたことを示す。ＵＤＳＡでの許容できる力価は、力価８を超える。これらのデータは５，０００を超える力価を実証し、このことは、生ウイルスが感染および疾患の可能性を有する動物に入った場合にそのウイルスを停止させ得る、強力な抗体産生を示す。
【０２３８】
【表１２】

【０２３９】
表１３は、研究４３〜５６日目の白血球減少のデータを表す。研究日の白血球減少の結果は、ＭＬＶワクチン（Ｔ０２）がチャレンジの特異的ウイルスによる感染を予防したことを実証する。白血球減少の測定値は、ＵＳＤＡによるＭＬＶ製品の認可の基準である。しかし、不活化ウイルスでは、白血球減少はＵＳＤＡによる基準ではないが、データにより、本発明のアジュバントが動物の最大２０％のみにおいて白血球減少を有する一方で、ほとんどの不活化ウイルスワクチンが１００％の白血球減少を有することが示唆される。これは、本発明のアジュバントが不活化抗原と共に強力なＴｈ１応答を促進し得たことを示す。これは、不活化生成物では行うことが困難であり、ほとんど見られない。
【０２４０】
【表１３】

【０２４１】
表１４は、４１日目（第２のワクチン接種後２０日目、チャレンジ前）の血清中和力価を表す。修飾生ウイルスは、ワクチン内の正確なウイルスに対する抗体応答のみを発現し得る。これは、Ｔ０２群がＢＶＤＶ−２のみに対する防御を示すことからうかがえる。しかし、Ｔ０３（ＰｒｅＺｅｎｔ−Ａ）、Ｔ０４（ＱＣＤＣ）、およびＴ０５（ＱＣＤＣＲ）アジュバント化不活化ワクチンは、免疫開始の初期において、および動物研究の生存相を通して、血清学的に種々のＢＶＤＶパネルに対して強力な抗体応答を示した。このことは、これらのアジュバントが、同種チャレンジだけではなく異種チャレンジにおいても、牛を防御するためのチャレンジモデルにおいて、安全性および有効性をもたらす能力を有することを示す。
【０２４２】
【表１４】

【０２４３】
マーカー活性。ここでは、本発明のアジュバントが、本発明のワクチン組成物でワクチン接種された動物とＢＶＤＶに自然に曝露された動物とを区別するために用いられ得ることを示すデータを表す。これは、ウイルスの構造遺伝子産物と非構造遺伝子産物との間の抗体プロフィールの差を判定することにより見ることができる。マーカー活性は、放射性免疫沈降アッセイによるゲルのランにより実証される（図１）。ＢＶＤＶのＮＳ２／３およびＥ２タンパク質に対する抗体応答は、ＭＬＶワクチンでワクチン接種された動物、またはＢＶＤＶもしくはＰｒｅＺｅｎｔ−Ａアジュバント化不活化ワクチンに自然に曝露された動物において非常に顕著である。しかし、本発明のアジュバントはＥ２タンパク質のみに対する抗体応答を示し、ＮＳ２／３タンパク質に対しては示さなかった。したがって、本発明のアジュバントを含む不活化ＢＶＤＶワクチンでワクチン接種された動物は、自然感染した動物またはＭＬＶワクチン接種された動物またはＰｒｅＺｅｎｔ−Ａワクチン接種された動物のいずれかとの間で区別化することができる。これは、動物集団におけるこれらのタイプの疾患の根絶に有益なマーカー−ワクチンであろうと考えられる。
【０２４４】
（実施例１９）
ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）
背景
ブタのマイコプラズマ肺炎（ＭＰＳ）または流行性肺炎は、咳、成長遅延、および飼料効率の低減を特徴とする、蔓延している慢性疾患である。病原因子はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であるが、自然に生じる疾患は細菌感染とマイコプラズマ感染との組合せによることが多い。
【０２４５】
ＭＰＳは、ブタが飼育されている全ての領域において多大なる経済的損失の原因となっている。世界中の様々な場所で行われた調査は、ＭＰＳで見られる病変に典型的な病変が、屠殺体重のブタの３０％〜８０％において生じることを示す。マイコプラズマによる病変はブタが屠殺体重に達する前に解消し得るため、実際の発症はより高い可能性がある。慢性ブタ肺炎におけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の罹患率は、２５％〜９３％の範囲であると報告されている。全ての年齢の豚がＭＰＳに感染しやすいが、この疾患は成長中のブタおよび肥育仕上げ期のブタにおいて最も一般的である。現在の証拠によって、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）がエアロゾルによって、または感染したブタからの気道分泌物との直接的な接触によって伝染することが示されている。雌豚から泌乳中の豚への伝染が可能である。ＭＰＳは、一度確立されると、感染した群れにおいて毎年生じ、その重症度は、季節、換気、およびブタの密度などの環境要因で変化する。
【０２４６】
研究の目的
ウイルス性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）肺ホモジネートで気管内チャレンジした後の、本発明の新規なアジュバントと共に製剤されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンの有効性と、実験的な一連の市販されているマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリンの有効性とを比較することである。
【０２４７】
動物
６６頭の臨床的に健康な、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＰＲＲＳＶにより生じる疾患または同一の生物に対するワクチン接種の経験がない、およそ１７日齢の交配豚を、本研究において用いた。研究場所に移送する前に、また到着後２日間にわたり、豚を、後肢の筋肉内で、ラベルの指示の通りにＮａｘｃｅｌ（登録商標）で処理して、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）などのストレス関連の疾患を予防した。動物を、ランダム化プランに従って、処理および檻に割り当てた。研究設計を表１５に示す。
【０２４８】
【表１５】

【０２４９】
試験用獣医学的生成物（ＩＶＰ）
抗原および試験用獣医学的生成物（ＩＶＰ）を表１６に示す。処理群Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４（Ｔ０５以外全て）のためのワクチンを、以下の表１６において示される成分の濃度を用いて、実施例１３に従って調製した。成分を、表に列挙された順に添加した。
【０２５０】
生理食塩水増量剤を器に添加し、均質化を開始し、調製手順の間中、継続した。不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、８００リットルの最終製剤生成物当たり７５リットルの混和容積の発酵物から調製し、１用量当たり０．０９３７５ｍｌの濃度まで添加した。Ｑｕｉｌ Ａを、表１６に列挙された濃度まで添加した。次に、コレステロール／エタノール溶液を添加した。ＤＤＡ／エタノール溶液を添加し、その後、Ｂａｙ Ｒ１００５糖脂質溶液を添加した。次にカルボポールを添加し、溶液を、生理食塩水増量剤を用いて最終容積にした。
【０２５１】
処理群Ｔ０５（Ａｍｐｈｉｇｅｎベースのワクチン製剤）に対するワクチンは、市販されている製品Ｒｅｓｐｉｓｕｒｅ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）であった。
【０２５２】
【表１６】

【０２５３】
ワクチン接種
ＮＴＸ処理群における動物にはワクチン接種またはチャレンジを行わなかった。およそ３週齢（０日目−右頸部）および５週齢（１４日目−左頸部）に、処理群を明らかにされていない有資格者が、Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、およびＴ０５に、１用量当たり２ｍＬを筋肉内にワクチン接種した。
【０２５４】
チャレンジ材料
Ｔ０１からＴ０５の動物を、第２のワクチン接種の３週間後（およそ８週齢−研究３５日目）に、気管内にチャレンジした。動物は、５ｍＬ用量の、Ｆｒｉｉｓ培地において１：５０希釈の、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）１１株（ＬＩ３６）の１０％凍結肺ホモジネートでチャレンジした。
【０２５５】
血液のサンプリング
−１日目または０日目（第１のワクチン接種の前）、１３日目または１４日目（第２のワクチン接種の前）、３４日目または３５日目（チャレンジの前）、および６３日目（剖検時）に、全ての豚から血液試料（血清分離管におよそ５から１０ｍＬ）を採取し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清学について試験した（ＥＬＩＳＡ−ＩＤＥＸＸ）。
【０２５６】
体重
全ての動物は、割り当ての目的のために到着時に、３４日目または３５日目（チャレンジ前）に、および６２日目または６３日目（剖検前）に体重測定した。
【０２５７】
剖検
６３日目に、全ての生存している動物を、部位特異的手順に従って安楽死させた。肺を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に起因する特徴的な病変について肉眼で判断し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）チャレンジに起因する病変についてスコア付けした。肺の病変のスコアは、各肺葉についての肺病変のパーセンテージとして記録した。各肺葉（左上葉、左中葉、左下葉、右上葉、右中葉、右下葉、および副葉）についての硬化のパーセンテージを、０〜１００％の実測値としてスコア付けした。各肺葉についてのパーセンテージを、病変を有する肺の全パーセンテージを計算するための重み付けされた式において用いた。６頭のＮＴＸ動物をチャレンジ前の３４日目または３５日目に剖検し、それらの肺を病変についてスコア付けした。
【０２５８】
肺病変スコア
病変を有する肺全体のパーセンテージは、病変を有する肺全体のパーセンテージ＝１００×｛（０．１０×左上葉）＋（０．１０×左中葉）＋（０．２５×左下葉）＋（０．１０×右上葉）＋（０．１０×右中葉）＋（０．２５×右下葉）＋（０．１０×副葉）｝という式を用いて計算した。分析の前に、逆正弦平方根変換を、病変を有する肺全体のパーセンテージに適用した。変換された肺病変を、一般線形混合モデルを用いて分析した。処理の効果について試験した後に、パラメータ推定値の線形結合を演繹的対比（ｐｒｉｏｒ ｃｏｎｔｒａｓｔｓ）において用いた。病変を有する肺全体の有意な（Ｐ≦０．１０）パーセンテージの逆変換最小二乗平均、それらの標準誤差、およびそれらの９０％信頼区間、ならびに最小値および最大値を計算した。
【０２５９】
結果
以下の表１７の結果により示されるように、本発明のアジュバントは、アジュバントＡｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）を含有していた油アジュバント化処理群Ｔ０５と等しく機能した。典型的には、３未満の肺病変スコアは、ワクチン処理により付与された有効性を有すると考えられる。本発明のアジュバントの組合せは全てこの基準を満たすものであり、ＱＣＤＣＲは、個別の動物の間で、スコアおよび範囲において最良に機能した。
【０２６０】
【表１７】

【０２６１】
（実施例２０）
ネコトリインフルエンザウイルス（ＦＡＩＶ）
この研究は、ウイルス性トリインフルエンザウイルス株でチャレンジすることにより、ネコにおける、本発明のアジュバントを用いたインフルエンザワクチンの有効性を判断した。
【０２６２】
方法および結果
ワクチン接種の前に行った口腔咽頭スワブおよび血清試料の分析にそれぞれに基づいて、ワクチン接種の前に、動物がインフルエンザウイルスおよびインフルエンザウイルスに対する抗体の両方について陰性であることを判定した。
【０２６３】
不活化病原性トリインフルエンザおよび精製ヘマグルチニン（ＨＡ）を用いて、実験的ワクチンを製剤した。各処理群は最初、６頭の動物を含有していた（表１８）。２つの処理群には実験的ＦＡＩＶワクチンを与え（Ｔ０１のワクチン抗原は精製Ｈ５ＨＡタンパク質であり、Ｔ０２のワクチン抗原は不活化Ｈ５Ｎ２株であった）、１つの処理群には不活化修飾Ｈ５Ｎ１ウイルス株ワクチンを与え（Ｔ０３）、１つのプラセボ対照群にはアジュバントのみのワクチンを与え（Ｔ０４）、そして１つの陰性対照群には生理食塩水のみを与えた（Ｔ０５）。全てのワクチン接種では、研究０日目および２１日目に皮下注入によって投与した。投与量は１ｍＬであった。ワクチン接種の後、動物が回復し直立することができるまで動物を常に観察し、有害反応がないことを確認した。ワクチン接種のおよそ１時間後の所見を記録し、ワクチン接種後に観察されるあらゆる他の合併症を記録した。
【０２６４】
アジュバント組成物は、１用量当たりＱｕｉｌ Ａ（２０μｇ）、コレステロール（２０μｇ）、ＤＤＡ（１０μｇ）、およびカルボポール（０．０５％）を用いるＱＣＤＣの実施例により上記に記載された。抗原は、不活化された全ウイルスまたは精製Ｈ５ＨＡタンパク質である。
【０２６５】
動物を、ワクチンに対する注入部位の反応および血清学的応答について評価した。３頭の動物（Ｔ０２−不活化Ｈ５Ｎ２の２頭、およびＴ０５−生理食塩水の１頭）を、チャレンジの前に、先天性高シュウ酸尿症のために安楽死させた。研究４９日目に、全ての生存している猫を、Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４株で気管内経路を介してチャレンジして、ワクチン候補の有効性を判断した。動物を、１０^５ＴＣＩＤ_５０を含有する５．０ｍＬの材料でチャレンジし、前記材料は、気管鏡を用いて気管内に入れた小さなカテーテルを用いて、分岐点の真上で放出した。動物を観察し、チャレンジ後５日間にわたりサンプリングした。動物相の最後に（研究５４日目）、全ての生存している動物を安楽死させ、それぞれに対して剖検を行った。
【０２６６】
【表１８】

【０２６７】
血液試料を、研究−１４日目（ワクチン接種前）、０日目、２１日目、および４９日目に、血清学的試験のために採取した。研究４９日目および５４日目に、血液試料を、ウイルス学的試験のために採取した。研究４２日目に、予定していなかった血液試料を全ての生存している動物から採取し、チャレンジ前の血清で腎機能を試験した。
【０２６８】
チャレンジ前の研究−１４日目、４９日目、および５０日目から５４日目に、全ての動物から口腔咽頭スワブを採取した。チャレンジ前の研究４９日目、および５０日目から５４日目に、全ての動物から直腸スワブを採取した。スワブの採取は研究日４９日目のチャレンジの直前に行った。
【０２６９】
剖検の間、全ての肺葉を無菌的に取り出し、秤量し、ＦＡＩＶ感染に起因する特徴的な病変について肉眼で判断した。肺の硬化の程度を同定するために、パーセンテージを用いた。左肺を、組織病理学のために、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。右肺を採取し、ウイルス学的試験のためにサンプリングした。肺に加え、腎臓試料および肉眼での病理を有するあらゆる組織もまたサンプリングし、組織病理学のために、１０％中性緩衝ホルマリン内に保存した。
【０２７０】
血液試料、口腔咽頭スワブ、および直腸スワブ、ならびに肺組織試料におけるウイルス力価を、Ｈ５Ｎ１特異的ＴａｑＭａｎ ＰＣＲによって判定した。簡潔に述べると、ＭａｇｎａＰｕｒｅ ＬＣ系およびＭａｇｎａＰｕｒｅ ＬＣ全核酸単離キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｌｍｅｒｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いてインフルエンザＡウイルスを検出した。データは対照希釈単位（ＣＤＵ）として表した。ＣＤＵは、連続希釈したウイルスストックから作成された標準曲線から判定し、この各希釈物は核酸抽出し、試験試料と同様の様式でＴａｑＭａｎ ＰＣＲ増幅を行ったものである。
【０２７１】
ＲＴ−ＰＣＲ陽性の口腔咽喉スワブおよび肺組織試料はまた、Ｍａｄｉｎｅ Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞でのウイルスの単離および適定によっても分析した。結果は、試料のミリリットルまたはグラム当たりの５０％組織培養感染用量のｌｏｇ_１０（ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬまたはｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｇ）として表した。
【０２７２】
ウイルス中和および血球凝集阻害によって、血漿試料を分析した。血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイでは、インフルエンザ株Ｖｉｅｔｎａｍ １１９４／０４（Ｈ５Ｎ１、クレード１）またはＩｎｄｏｎｅｓｉａ ０５／２００５（Ｈ５Ｎ１、クレード２）のウイルス懸濁液を、コレラろ過物（ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）の培養物から得られた）で事前処理した血清試料の連続（２倍）希釈物と共にインキュベートした。その後、赤血球を希釈物に添加し、インキュベーションの後、血球凝集の完全な阻害を示す最大希釈の作用物質をＨＩの力価として規定した。
【０２７３】
ウイルス中和（ＶＮ）アッセイは、血清の限界希釈に基づくものであった。簡潔に述べると、一定量のウイルスを連続（２倍）希釈の血清試料と混合した。ウイルス中和を、指標細胞としてＭＤＣＫ細胞を用いて読み取り、赤血球の凝集によって視覚化した。接種された細胞培養物の５０％が赤血球の凝集を示した、血清の最大希釈を取ることにより、ＶＮの力価をスコア付けした。
【０２７４】
左の肺を剖検時に採取し、組織病理学のために、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。固定の後、組織をパラフィン内に包埋し、組織切片を調製し、組織学的試験のために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。観察された病理学的変化の説明および程度を記録した。
【０２７５】
結果
５つの処理群のいずれの動物も、第１および第２のワクチン接種の後に注入部位で痛みまたは腫れを全く示さなかった。さらに、注入部位での皮膚異常も記録されなかった。線形混合モデル分析によると、ワクチン接種の後、かつチャレンジの前では、処理間の体温において、０．１の有意性レベルでは有意な差はなかった。０日目の第１のワクチン接種の前、およびその後数日間、１頭のＴ０１動物は発熱していた（≧４０℃）。個別の動物における４０℃以上までの散発性の体温上昇をワクチン接種の後に記録した（０日目および２１日目）。ワクチン接種に関連する異常な健康状態は研究の間には観察されなかった。３頭の動物（Ｔ０２−Ｈ５Ｎ２の２頭、およびＴ０５−生理食塩水の１頭）を、チャレンジの前に、先天性高シュウ酸尿症のために安楽死させた。全ての処理からの数頭の動物は、温度記録装置の移植の後に創傷合併症を示した。０日目から、研究が完了するまで、同時処理は投与しなかった。
【０２７６】
ワクチン接種されたＴ０１、Ｔ０２、およびＴ０３の動物は、チャレンジ後に、対照Ｔ０４およびＴ０５の動物と比較して小さい臨床兆候を示し、死亡は示さなかった。Ｔ０１において、１頭の動物が、チャレンジの２日後に、鬱状態および呼吸努力の増大を示した。残りの５頭のＴ０１動物のいずれも、チャレンジ後に異常な健康状態を全く示さなかった。Ｔ０２（ｎ＝４）およびＴ０３（ｎ＝６）において、全ての動物はチャレンジ後に健康のままであった。Ｔ０４（ｎ＝６）において、第１の異常な臨床兆候（鬱状態および呼吸努力の増大）が、チャレンジの２日後に２頭の動物において見られた。チャレンジの３日後、Ｔ０４における全ての６頭の動物が鬱状態となり、呼吸努力の増大を示した。結局、２頭の動物を福祉上の理由から安楽死させなくてはならなかった。チャレンジの４日後（５３日目）、１頭の動物が死亡していることが確認され、残りの３頭のＴ０４動物は、鬱状態、呼吸努力の増大、瞬膜突出、および鼻水を示し、福祉上の理由から安楽死させた。Ｔ０５（ｎ＝５）において、鬱状態および呼吸努力の増大という第１の異常な臨床兆候が、チャレンジの１日後に１頭の動物において見られた。チャレンジの２日後、さらに２頭の動物がこれらの兆候を示し始めた。チャレンジの３日後、１頭の動物が死亡していることが確認され、残りの４頭の動物は、鬱状態、呼吸努力の増大、瞬膜突出を示した。１頭の動物を、福祉上の理由から、その後に安楽死させた。チャレンジの４日後、３頭の残りの動物の１頭において呼吸努力が悪化し、別の動物もさらに鼻水を示した。全ての３頭の残りの動物を、チャレンジの４日後（５３日目）に、福祉上の理由から安楽死させた。
【０２７７】
チャレンジの後に、ワクチン接種された動物（Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３）において、平均体温は４０．０℃未満のままであった。対照動物（Ｔ０４およびＴ０５）の平均体温は、チャレンジの１日後から４０．０℃以上に上昇した。線形混合モデル分析によると、処理間の平均体温の差は有意であった（ｐ＝０．０００１）。個別の動物のデータは、Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３動物の少数において、５３日目の散発的な時点で、体温が４０．０℃以上に上昇したことを示した。Ｔ０１において、２頭の動物が、１つの時点で、それぞれ発熱した（４０．０から４０．１℃の範囲）。Ｔ０２において、２頭の動物が、１つおよび３つの時点で、それぞれ発熱した（４０．０から４０．３℃の範囲）。Ｔ０３において、１頭の動物が、３つの時点で発熱した（４０．０から４０．３℃の範囲）。Ｔ０４およびＴ０５において、全ての動物が、５０日目から５１日目の少なくとも１２時間にわたり発熱した。
【０２７８】
インフルエンザ株Ｖｉｅｔｎａｍ １１９４／０４（Ｈ５Ｎ１、クレード１）およびＩｎｄｏｎｅｓｉａ ０５／２００５（Ｈ５Ｎ１、クレード２）に対するＨＩ抗体の力価を、第１および第２のワクチン接種の前ならびにチャレンジの前に判定した。判定の下限値は５であった。ワクチン接種の前に、全ての５つの処理群における力価は、下限値５より低かった。ワクチン接種の後、全てのワクチン接種された（Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３）動物は５を超えるＨＩ抗体力価を発現し、ワクチン接種前の値と比較して少なくとも６倍増大した力価を示した。Ｔ０１およびＴ０３において、Ｖｉｅｔｎａｍ １１９４／０４に対する力価は、第１のワクチン接種の後には２０から１６０の範囲であり、第２のワクチン接種の後には１４０から９６０の範囲であった。Ｔ０２において、Ｖｉｅｔｎａｍ １１９４／０４に対する力価は、Ｔ０１およびＴ０３において見られたものよりも低く、第１のワクチン接種の後には５から３０の範囲であり、第２のワクチン接種の後には５から７０の範囲であった。Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ０５／２００５に対するＨＩ抗体の力価は、Ｖｉｅｔｎａｍ １１９４／０４に対するものと同様であった。
【０２７９】
チャレンジの前後に取った血漿試料を、ウイルスのロードについて、Ｈ５Ｎ１特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって試験した。全ての動物は、チャレンジ前に、ウイルス陰性の試料を有していた。チャレンジの後、Ｔ０１およびＴ０３の動物の血漿においてウイルスは検出されなかった。逆に、Ｔ０２動物の２５％（４頭のうち１頭）、Ｔ０４動物の６７％（６頭のうち４頭）、およびＴ０５動物の６０％（５頭のうち３頭）は、チャレンジ後の血漿においてウイルス陽性であった。線形混合モデル分析によると、処理間の差は有意であった（ｐ＝０．０２４７）。
【０２８０】
チャレンジ後のウイルスの排泄を、喉のスワブ試料においてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウイルス滴定によって判断し、直腸のスワブ試料においてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。喉からのウイルスの排泄が、チャレンジ後にＴ０１動物において検出されなかった。Ｔ０２において、全ての４頭の動物（１００％）がチャレンジ後の１つの時点でウイルスを排泄した。Ｔ０３において、６頭の動物のうち全部で２頭（３３％）がチャレンジ後にウイルスを排泄した。Ｔ０４において、６頭の動物のうち３頭（５０％）がチャレンジ後にウイルスを排泄した。Ｔ０５において、５頭の動物のうち４頭（８０％）がチャレンジ後にウイルスを排泄した。全ての動物がそれまでに死亡したため、チャレンジの５日後にはＴ０４およびＴ０５の動物から試料は採取されなかった。しかし、統計分析を目的として、研究の最終日の前に死亡したかまたは安楽死させられた動物の最後の試験結果は、研究の最終日に繰り越した。
【０２８１】
ＲＴ−ＰＣＲで陽性の結果（≧１．８ＣＤＵ）であった喉の試料をまた、ウイルス滴定アッセイにおいて使用した。ウイルス滴定により、全てのＲＴ−ＰＣＲ陽性の試料が感染性インフルエンザウイルスを含有することが確認された（データは示されていない）。感染性ウイルスの力価は、対照動物（Ｔ０４およびＴ０５）よりもワクチン接種された動物（Ｔ０２およびＴ０３）において低かった。これらの差は、Ｔ０２またはＴ０３とＴ０４とを比較した場合にはチャレンジの３日後に有意であり、Ｔ０２またはＴ０３とＴ０５とを比較した場合にはチャレンジの３日後、４日後、および５日後に有意であった。Ｔ０２およびＴ０３の動物における力価は、０．５ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０であった。Ｔ０４において見られた力価は、２．３から４．３ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の範囲であった。Ｔ０５において見られた力価は、１．５から３．８ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の範囲であった。
【０２８２】
直腸のスワブにより評価された糞内の排泄を、チャレンジの３日後または４日後に、Ｔ０２を除いた全ての処理群で検出した。ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたウイルス量は、Ｔ０１においては２．２から２．３ｌｏｇ_１０ＣＤＵであり、Ｔ０３においては３．２ｌｏｇ_１０ＣＤＵであり、Ｔ０４においては２．０から２．７ｌｏｇ_１０ＣＤＵであり、Ｔ０５においては２．２ｌｏｇ_１０ＣＤＵであった。チャレンジ後のいずれの日においても、処理間で０．１の有意性レベルでは有意な差はなかった。
【０２８３】
肺の病理学は、対照動物（Ｔ０４およびＴ０５）よりもワクチン接種された動物（Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３）において重症度が低かった。全てのワクチン接種された動物は、軽度の多発性の亜急性気管支間質性肺炎を示した。対照動物は、中程度（２頭のＴ０４動物および１頭のＴ０５動物）または重度の（４頭のＴ０４動物および４頭のＴ０５動物）の亜急性気管支間質性肺炎を示し、びまん性分布を示した２頭の対照動物（１頭のＴ０４動物および１頭のＴ０５動物）を除いた全ての動物が多発性分布を伴っていた。肺全体を硬化の程度について評価し、それを全肺組織の硬化のパーセンテージで表した。肺の病理の所見と一致して、硬化のパーセンテージは対照動物（Ｔ０４およびＴ０５）よりもワクチン接種された動物（Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３）において有意に低かった。
【０２８４】
死亡または安楽死の時点で採取した肺組織におけるウイルスのロードを、ウイルス滴定およびＨ５Ｎ１のＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ワクチン接種された動物（Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３）の肺組織は、対照（Ｔ０４およびＴ０５）のものよりも有意に低い平均ウイルス力価を有していた。ワクチン接種された動物（Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３）の肺組織における平均力価間には有意な差はなかった。ＲＴ−ＰＣＲによる分析では同一の結果が得られた。
【０２８５】
病原性の高いＨ５Ｎ１トリインフルエンザ株でチャレンジした後、熱、死亡、ウイルス血症、喉からのおよび糞内へのウイルスの排泄、肺のウイルス感染、ならびに硬化を含む肺の病理を含む、臨床兆候が、アジュバント（Ｔ０４）または生理食塩水（Ｔ０５）を与えた対照動物において観察された。
【０２８６】
精製Ｈ５ＨＡタンパク質（Ｔ０１）でのワクチン接種は、病原性の高いＨ５Ｎ１トリインフルエンザ株でチャレンジした後に、６頭の若い猫において、ウイルス血症、喉からのウイルスの排泄、および死亡を防御した。さらに、精製Ｈ５ＨＡタンパク質（Ｔ０１）でのワクチン接種は、熱、肺におけるウイルスのロード、および硬化を含む肺の病理を含む臨床兆候を低減させた。
【０２８７】
不活化Ｈ５Ｎ２株（Ｔ０２）でのワクチン接種は、病原性の高いＨ５Ｎ１トリインフルエンザ株でチャレンジした後に、４頭の若い猫において、臨床兆候、糞内へのウイルスの排泄、および死亡を防御した。さらに、不活化Ｈ５Ｎ２タンパク質（Ｔ０２）でのワクチン接種は、ウイルス血症、熱、喉からのウイルスの排泄、肺におけるウイルスのロード、および硬化を含む肺の病理を低減させた。
【０２８８】
不活化Ｈ５Ｎ１株（Ｔ０３）でのワクチン接種は、病原性の高いＨ５Ｎ１トリインフルエンザ株でチャレンジした後に、６頭の若い猫において、臨床兆候、ウイルス血症、および死亡を防御した。さらに、不活化Ｈ５Ｎ１株（Ｔ０３）でのワクチン接種は、熱、喉からのウイルスの排泄、肺におけるウイルスのロード、および硬化を含む肺の病理を低減させた。
【０２８９】
概要
注入部位の反応は、不活化または精製ＨＡ抗原のいずれかおよびＱＣ／ＤＣアジュバントと共に製剤されたワクチンでは観察されなかった。ワクチンは、ワクチン接種された猫において臨床疾患および死亡の完全な防御をもたらし、血液および組織におけるウイルスのロードを有意に低減させ、ウイルスの排泄を有意に低減させた。
【０２９０】
（実施例２１）
癌
背景
この研究は、異所性モデルおよび同所性モデルを作製するために、ヒトおよびラットの肝細胞癌細胞を用いて、免疫不全ラットおよび免疫適格性ラットにおいて実施した。
【０２９１】
動物
６〜８週齢の雄のヌード（Ｃｒｌ：ＮＩＨ−ｍｕ）ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）から購入した。ラットをポリカーボネート製のマイクロアイソレーターケージに対で収容し、逆浸透水および放射線照射された標準的なラット飼料を自由摂取とし、全ての水および床敷きはオートクレーブにかけたものである。体重を１週間に２回記録した。動物はおよそ７週間にわたり維持し、実験の最後にＣＯ_２吸入により安楽死させた。
【０２９２】
実験設計では２相を組み込んだ。Ｉ相において、ラットをそれらの体重に基づいて２つの群にランダム化した。群１におけるラットには腫瘍細胞の注入を行わず、一方、群２のラットには腫瘍細胞を皮下注入した。腫瘍注入の３週間後、群２におけるラットをＩＩ相のために２つの群にランダム化し（腫瘍サイズおよび獲得率に基づく−表１９を参照されたい）、一方の群は、１）生理食塩水を与えた非担腫瘍対照（対照群）、２）アジュバントのみで処理した担腫瘍対照（腫瘍群）、および３）ワクチンを投与した担腫瘍対象（腫瘍処理）（２週間の間隔をあけて、２回の皮下注入）という２つの亜群を含むものであった。全ての動物を、第２のワクチン投与の１４日後に剖検した。
【０２９３】
ワクチン
ワクチンは、１用量当たり０．２ｍｌで、皮下注入により投与した。
【０２９４】
【表１９】

【０２９５】
ワクチン調製物
ワクチンを、糖脂質Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）（１，０００μｇ／用量）および抗原を伴って、または伴わずに、Ｑｕｉｌ Ａ（２０μｇ／用量）、コレステロール（２０μｇ／用量）、ＤＤＡ（１０μｇ／用量）、カルボポール（０．０５％）を用いて調製した。ホモジナイザーを用いて組成物を混和し、上述の添加順で添加した。
【０２９６】
抗原調製物
ＨｅｐＧ２細胞（クローンＨＢ−８０６５）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＨｅｐＧ２は、高分化型の肝細胞癌を有する１５歳の白人男性の肝組織に由来する恒久的な細胞系である。細胞を標準的な細胞培養条件下で拡張させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に１×１０^７個細胞／ｍｌの濃度で注入するために調製した。各ラットに、０．５ｍｌの細胞懸濁液を、第２の乳頭部位に皮下的に注入した。
【０２９７】
測定
ｃｍ^３単位の容積＝｛［Ｗ（ｍｍ）×Ｗ（ｍｍ）］／２×Ｌ（ｍｍ）｝／１０００である測径方法を用いて、研究を通して、腫瘍サイズを１週間に２回測定した。血清の化学およびバイオマーカーの測定のために、血液を、後眼窩を出血させることにより採取した。動物を、出血手順の間にＣＯ_２／Ｏ_２で軽く麻酔した。化学の終点を、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１７自動分析器（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて分析した。末端の血液を、ＣＯ_２麻酔下で心穿刺により採取した。血清の終点を、商業的なＥＬＩＳＡアッセイであるＡｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）およびＨｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＴＸ）を用いて判断した。動物はＣＯ_２吸引により安楽死させた。腫瘍を切り出し、秤量し、組織学のためにホルマリンの中に置いた。
【０２９８】
対応のないスチューデントＴ検定を用いて、処理群ラットと対照群ラットとの間で様々なパラメータを比較した。全ての値は平均±ＳＤとして表し、ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると判断した。
【０２９９】
結果
体重の測定値を、腫瘍重量を差し引くことにより補正した（容積データおよび１ｃｍ^３＝１ｇという仮定に基づく）。データを、処理群ごと、および担腫瘍動物または非担腫瘍動物ごとという２つの方法で分析した。担腫瘍動物および非担腫瘍動物における体重を比較すると、終点の時点で群間に有意な差があり、ベースラインでは差はなかった。おそらく研究期間が短かったため、処理群ごとに比較した場合には体重は有意に異ならなかったが、対照よりも両方の担腫瘍群において体重が減少する十分な傾向があり、抗原を有さない媒剤を与えた担腫瘍動物と比較して、ワクチンを与えた動物において回復する正の傾向があった（表２０）。また、実験期間にわたる体重の変化のパーセンテージと、腫瘍の容積（ｒ^２＝０．７２）または終点時の重量（切り出したもの）（ｒ^２＝０．７３）における変化のパーセンテージとの間に、ある程度の相関があった。
【０３００】
【表２０】

【０３０１】
腫瘍サイズ
４週間の期間にわたり、対照ラットにおける腫瘍サイズを、ワクチン処理したラットにおける腫瘍サイズと比較した。比較した群の間で統計的に有意な差は見られなかったが（腫瘍サイズにおける大きなばらつきのため）、全腫瘍容積が減少する強い傾向があり（表２１）、また、ワクチンを与えたラットにおける切り出した腫瘍重量の平均が減少した（表２２）。
【０３０２】
【表２１】

【０３０３】
【表２２】

【０３０４】
血清アッセイ
研究中の様々な時点で、ヒトアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）をＥＬＩＳＡによって測定した。これらのデータを体重および腫瘍サイズのデータと併せて用いて、動物を処理群にランダム化した。この研究からのデータおよび組織学的データは、ＡＦＰが担腫瘍動物においてのみ検出可能であることを示す。腫瘍対照群および処理群における長期的なＡＦＰデータの比較は、ＡＦＰが第１のワクチン注入の後に処理動物において減少し、研究の最後では担腫瘍対照よりも処理ラットにおいて非常に低かったことを示し、それぞれ、媒剤処理ラットでは４．７８±３．２ｎｇ／ｍｌであり、ワクチン処理ラットでは０．９７±２．５ｎｇ／ｍｌである。さらに、ＡＦＰは、腫瘍容積と切り出した腫瘍重量との両方に対して相関を示した。
【０３０５】
研究中の様々な時点で、ヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）をＥＬＩＳＡによって測定した。この研究からのデータおよび組織学的データは、ｈＡＬＢが担腫瘍動物においてのみ検出可能であることを示す。腫瘍対照群および処理群におけるｈＡＬＢデータの比較は、ｈＡＬＢが、研究の最後では担腫瘍対照よりも処理ラットにおいて低かったことを示す（データは示されていない）。さらに、ＡＦＰと同様に、ｈＡＬＢは、腫瘍容積と切り出した腫瘍重量との両方に対して相関を示した（データは示されていない）。
【０３０６】
核血清化学パネルを、研究を通して様々な時点でアッセイした。パネルは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、コレステロール、アルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、ＢＵＮ、グルコース、クレアチニン、全ビリルビン、全タンパク質、アルブミン、グロブリン、ならびに無機物Ｃａ、Ｐ、Ｎａ、Ｋ、およびＣｌを含むものであった。体重と同様に、データを処理群ごと、および担腫瘍動物または非担腫瘍動物ごとという２つの方法で分析した。差が観察された唯一の終点は、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびコレステロールであった。両方の比較により、ベースラインの時点では群間で有意な差はなかった（データは示されていない）。担腫瘍動物と非担腫瘍動物とにおいて化学的指標を比較すると、最終点で群間に有意な差があり、担腫瘍動物においてはＡＳＴ、ＡＬＴ、およびコレステロールが上昇した（データは示されていない）。
【０３０７】
結論
本発明者らのデータを総合すると、腫瘍組織量は、媒剤を与えた対照の担腫瘍群と比較して、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞系に対して調製されたワクチンで処理された動物において低減したことが実証される。
【０３０８】
（実施例２２）
ＣｐＧ
背景
本明細書において記載されるアジュバントは、ＣｐＧのための送達系としてアジュバントを用いることにより免疫応答を強化するためのＯＲＮ／ＯＤＮ（ＣｐＧ）を用いることにより増強され得る、潜在的なワクチンアジュバントプラットフォームである。
【０３０９】
材料および方法
体重が約１８〜２０ｇの雌のＣ５７ＢＩ／６マウス（群当たりｎ＝１０）を、本研究において用いた。それらを、研究０日目、１４日目、および２１日目に、全容積が５０μｌの左前脛骨筋内への筋肉内（ＩＭ）注入を介して免疫化した。
【０３１０】
試薬用量
組成物の用量は、様々な組合せで、以下の成分の１つまたは複数を含むものであった。
緩衝液：ＷＦＩ内に溶解し、０．１μｍのフィルターで無菌ろ過した、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ（２２９．３２ｍｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１１６８．００ ｍｇ／Ｌ）、およびＮａ_２ＨＰＯ_４（１１４４．００ｍｇ／Ｌ）
オボアルブミン（ＯＶＡ抗原）：１０μｇ
ＣｐＧ ＯＤＮ：１０μｇ
コレステロール：１μｇ
Ｑｕｉｌ Ａ：１μｇ
ＤＤＡ：０．５μｇ
カルボポール：０．０３７５％
Ｒ１００５：５０μｇ
【０３１１】
ワクチン調製物
緩衝液を、撹拌棒と共に５０ｍｌのフラスコの中に入れ、全ての以下のステップを通して一定の速度で撹拌した。成分を、抗原（ＯＶＡ）、ＣＰＧ ＯＤＮ、Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール（液滴）、ＤＤＡ（液滴）、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、およびＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）の順で添加した。組成物を最低でも３０分間にわたり室温（およそ２５℃）で撹拌し、その間、ホイルで被服することにより光から保護した。溶液を２５Ｇの針に押し通してシリンジ内に入れ、均一の（濁った）懸濁液を得るためにあらゆる大きな浮遊粒子を破壊し、保存のために無菌のガラスバイアルに移した。
【０３１２】
試料採取
以下の試料を採取した。
血漿：プライムワクチン接種の４週間後（第２の追加ワクチン接種の１週間後）
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（プライムワクチン接種の６週間後（第２の追加ワクチン接種の３週間後）
上清におけるサイトカイン分泌物（プライムワクチン接種の４週間後）
２４時間の上清（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ）
７２時間の上清（ＩＦＮ−ｇ）
四量体（プライムワクチン接種の４週間後）
サイトカイン産生Ｔ細胞（プライムワクチン接種の６週間後）
【０３１３】
結果は、アジュバントの効果を示す各アジュバントについての相対的スコアとして示す。終点は、個別の細胞傷害性Ｔリンパ球応答の合計に基づく相対的スケールである。
【０３１４】
結果および考察
表２３に示すように、ＱＣＤＣＲにＯＶＡを加えたものは、その下位成分よりも強いＣＴＬ応答をもたらしたが、全体的な応答は低かった（＜２０％）。ＱＣＤＣＲまたはその下位成分をＣＰＧと組み合わせると、ＯＶＡ特異的なＣＴＬ応答が有意に向上した。ＱＣＤＣＲ／ＣＰＧにＯＶＡを加えたものの全体は、最も高いＣＴＬ応答をもたらしたが、この群とコレステロール／ＣＰＧにＯＶＡを加えたものとの間で応答に有意な差はなかった（２５：１の比率）。ＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）で刺激した脾細胞からの培養上清を、ＥＬＩＳＡによりサイトカインについてアッセイした。ＱＣＤＣＲ単独またはその下位成分は、非常に弱いサイトカイン応答のみをもたらした。ＱＣＤＣＲまたはその下位成分とＣＰＧとを組み合わせると、抗原特異的ＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１バイアスを有するサイトカイン）の分泌が増強した。ＱＣＤＣＲおよびＣｐＧは、細胞性免疫応答を増大させる潜在性において等しい。２つを組み合わせると相乗効果が示される。ＱＣＤＣＲの下位成分をＣｐＧで分析すると、Ｑｕｉｌ Ａとの組合せは最良の応答をもたらし、その次に、ＣｐＧを有するコレステロール包含物が続く。
【０３１５】
【表２３】

【０３１６】
（実施例２３）
イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）
範囲
イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）および新規な組合せのアジュバントを用いてマウスモデルを採用し、所与の抗原成分とのアジュバントの能力を判断した。
【０３１７】
動物
処理群当たり１０頭のＣＦ−１マウスに、各処理群の動物当たり０．２ｍＬを皮下的に投与した。
【０３１８】
処理群
表２４に示した試験製剤は、以下に示す濃度を有する１．０ｍＬフィールドの用量容積として調製した。わずか０．２ｍＬのワクチンを各マウスに投与した。
【０３１９】
【表２４】

【０３２０】
ワクチン調製物
本発明のアジュバントのためのワクチン調製物は、上記の実施例１〜１３に記載されている。アジュバント成分の濃度を表２４に示す。アジュバントを表に列挙された順で添加した。
【０３２１】
生理食塩水増量剤を器に添加し、均質化を開始した。不活化ＣＣＶを表２４に示されている濃度まで添加した。Ｑｕｉｌ Ａを、表２４に列挙された濃度で添加した。次に、均質化を継続しながら、エタノール溶液中のコレステロールを添加した。次に、ＤＤＡ／エタノール溶液を均質化の間に添加した。混合物を１０，０００ｐｓｉでマイクロ流体化した。次に、カルボポールを混合しながら添加し、ｐＨを６．８から７．２に調節した。次に、Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）糖脂質を混合しながら添加した。最後に、組成物を、生理食塩水増量剤を用いて最終容積にした。
【０３２２】
市販されているＡｂＩＳＣＯ製品（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を与えた処理群のためのワクチンを、ラベルの指示に従って調製した。ＡｂＩＳＣＯ製品は、キラヤサポニンと、高度に精製されたサポニンを用いるＩＳＣＯＭ技術とに基づくものである。
【０３２３】
アッセイ方法：ベータＣＣＶ血清の中和
血清を５６℃で３０から４０分間にわたり熱不活化した。清潔な無菌プレート内で、各血清の連続希釈（希釈なし、２、４、８など）を、１２０μｌを１２０μｌの希釈物に入れることにより行った。希釈当たり少なくとも２つの複製ウェルを用いた。必要であれば、１：１６の希釈を最初に用いた。作業用のチャレンジストックを、１２０μｌ内に約２４０個のウイルス粒子を含有するレベルまで生ＣＣＶを希釈することにより調製した。次に、１２０μｌの各血清希釈物を１２０μｌのウイルス溶液と組み合わせて、全体で２４０μｌとした。溶液を混合し、中和を可能にするために室温（およそ２５℃）で３０から６０分間にわたり保持した。次に、１２０μｌの各連続希釈物を、準備してある、７から１２日前に播種されたＮＬＦＫ細胞のむきだしの単層上に移した。ＣＰＥを４から６日後に評価した。逆滴定により、５０から３１６個のウイルス粒子が各単層に当たったことを確認した。
【０３２４】
結果
【０３２５】
【表２５】

【０３２６】
概説
各成分の化学的特性を考慮してＣＣＶと製剤したアジュバントの組み合わされた効果は、ワクチンアジュバントに優れた特性をもたらした。
【０３２７】
研究の血清学的結果を表２５に示す。さらに高い血清中和抗体力価は、通常、ワクチンによりもたらされるさらに良好な防御と関連する。本発明のアジュバント製剤のいくつかは、添加されたＣＣＶ抗原の量が同様であっても、商業的なアジュバント化製品よりもはるかに高い力価をもたらした。ＱＣＤＣ、ＱＣＲ、ＤＲＣ、ＱＣＲＣ、およびＱＣＤＲＣ製剤は、マウスにおける良好な免疫応答の誘発においてとりわけ効果的であった。
【０３２８】
（実施例２４）
ウシロタウイルス抗原
範囲
ウシロタウイルスおよび本発明の組合せアジュバントを用いてマウスモデルを採用し、所与の抗原成分とのアジュバントの能力を判断した。
【０３２９】
動物
処理群当たり１０頭のＣＦ−１マウスに、各処理群の動物当たり０．２ｍＬを皮下的に投与した。
【０３３０】
処理群
表２６に示した試験製剤は、以下に示す濃度を有する２．０ｍＬフィールドの用量容積として調製した。わずか０．２ｍＬのワクチンを各マウスに投与した。
【０３３１】
【表２６】

【０３３２】
ワクチン調製物
本発明のアジュバントのためのワクチン調製物は、上記の実施例１〜１３に記載されている。アジュバント成分の濃度を表２６に示す。アジュバントを表に列挙された順で添加した。
【０３３３】
生理食塩水増量剤を器に添加し、均質化を開始した。不活化ウシロタウイルスを表２６に示されている濃度まで添加した。Ｑｕｉｌ Ａを、表２６に列挙された濃度で添加した。次に、均質化を継続しながら、コレステロール／エタノール溶液を添加した。次に、ＤＤＡ／エタノール溶液を均質化の間に添加した。混合物を１０，０００ｐｓｉでマイクロ流体化した。次に、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）を混合しながら添加し、ｐＨを６．８から７．２に調節した。次に、Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）糖脂質を混合しながら添加した。最後に、組成物を、生理食塩水増量剤を用いて最終容積にした。
【０３３４】
市販されているＡｂＩＳＣＯ製品（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を与えた処理群のためのワクチンを、ラベルの指示に従って調製した。ＡｂＩＳＣＯ製品は、キラヤサポニンと、高度に精製されたサポニンを用いるＩＳＣＯＭ技術とに基づくものである。
【０３３５】
結果
【０３３６】
【表２７】

【０３３７】
ウシロタウイルスと製剤し、各成分の化学的特性を考慮したアジュバントの、組み合わされた効果は、ワクチンアジュバントに優れた特性をもたらした（表２７を参照されたい）。
【０３３８】
アジュバント製剤のいくつかは同様のレベルの血清中和抗体力価をもたらした一方で、ＱＣＤＣＲアジュバントは最も高いレベルをもたらした。
【０３３９】
（実施例２５）
イヌインフルエンザウイルス
範囲／研究設計
イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）および新規な組合せアジュバントを用いてイヌモデルを採用し、所与の抗原成分とのアジュバントの能力を判断した。
【０３４０】
この研究は、ランダム化された完全ブロック設計を有する（表２８を参照されたい）。動物を出生日で分類し、サイズ５のブロックを形成した。ブロック内で、動物を処理にランダムに割り当てた。同一ブロック内の動物を、互いに近くに位置している檻（ケージ）にランダムに割り当てた。動物は良好な健康状態であり、商業的なワクチンに対する過敏の経験がないものであった。動物にはＣＩＶに対するワクチンを与えなかった。
【０３４１】
【表２８】

【０３４２】
【表２９】

【０３４３】
ワクチン調製物
本発明のアジュバントのためのワクチン調製物は、上記の実施例１〜１３に記載されている。アジュバント成分の濃度を表２９に示す。アジュバントを、表に列挙された順に添加した。
【０３４４】
生理食塩水増量剤を器に添加し、均質化を開始した。不活化イヌインフルエンザウイルスを表２９に示された濃度まで添加した。Ｑｕｉｌ Ａを、表２９に列挙された濃度で添加した。次に、均質化を継続しながら、コレステロール／エタノール溶液を添加した。次に、ＤＤＡ／エタノール溶液を均質化の間に添加した。混合物を１０，０００ｐｓｉでマイクロ流体化した。次に、カルボポールを混合しながら添加し、ｐＨを６．８から７．２に調節した。最後に、組成物を、生理食塩水増量剤を用いて最終容積にした。
【０３４５】
試験
血清学を、ＵＳＤＡによる標準的なアッセイ方法による血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを用いて評価した。
【０３４６】
結果／概説
ＨＡＩ Ｇｅｏ．の平均力価の、４２日目および１８０日目のＴＨＥ血清学的結果を表３０に示す。
【０３４７】
【表３０】

【０３４８】
インフルエンザウイルスと製剤し、各成分の化学的特性を考慮したアジュバントの、組み合わされた効果は、ワクチンアジュバントに優れた特性をもたらした。
【０３４９】
さらに高い抗体力価は、通常、ワクチンのさらに良好な防御と関連する。通常、アルミニウムアジュバント（Ｔ０２）と本発明のアジュバント（Ｔ０３、Ｔ０４、およびＴ０５）との両方によりＨＡＩ力価が上昇したが、本発明のアジュバントにより生じる応答は、高用量群（Ｔ０５）において１８０日目に優れており、力価はより高かった。本発明のアジュバントの低用量および中用量についての力価は、インフルエンザのための従来のアルミニウム含有ワクチンのものと等しかった。さらに、本発明のアジュバントはヘルパーＴ細胞１の免疫応答をもたらすのに対しアルミニウムはもたらさないため、免疫性の期間は、より速いリコールメカニズムを伴って、より長くなると予想される。
【０３５０】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバント製剤と免疫学的に効果的な量の抗原成分とを含む免疫原性組成物であって、アジュバント製剤が、サポニン、ステロール、第４級アンモニウム化合物、およびポリマーを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
サポニンが１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で存在し、ステロールが１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で存在し、第４級アンモニウム化合物が１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で存在し、ポリマーが約０．０００１容量％（ｖ／ｖ）から約７５％ｖ／ｖの量で存在する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
サポニンがＱｕｉｌ Ａまたはその精製画分であり、ステロールがコレステロールであり、第４級アンモニウム化合物がジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）であり、ポリマーがポリアクリル酸である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｔｈ２刺激物質をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
Ｔｈ２刺激物質が糖脂質である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
Ｔｈ２刺激物質がＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセタートである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
糖脂質が１用量当たり約０．０１ｍｇから約１０ｍｇの量で存在する、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記抗原成分が不活化ウイルスを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ａ）緩衝液中で抗原成分の組成物を調製するステップ、
ｂ）ステップａの組成物にサポニンを添加するステップ、
ｃ）ステップｂの組成物にステロールを添加するステップ、
ｄ）ステップｃの組成物に第４級アンモニウム化合物を添加するステップ、
ｅ）ステップｄの組成物にポリマーを添加するステップ
を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項１０】
サポニンがＱｕｉｌ Ａまたはその精製画分であり、ステロールがコレステロールであり、第４級アンモニウム化合物がＤＤＡであり、ポリマーがポリアクリル酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａの組成物を均質化し、ステップａからｄの各ステップの間に均質化を継続するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｄの組成物のマイクロ流体化を含むステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｅの組成物にＴｈ２刺激物質を添加するステップｆ）をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔｈ２刺激物質が糖脂質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔｈ２刺激物質がＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセタートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アジュバント製剤と治療上効果的な量の抗原成分とを含むワクチン組成物であって、アジュバント製剤が、サポニン、ステロール、第４級アンモニウム化合物、およびポリマーを含むワクチン組成物。
【請求項１７】
サポニンが１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で存在し、ステロールが１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で存在し、第４級アンモニウム化合物が１用量当たり約１μｇから約５，０００μｇの量で存在し、ポリマーが約０．０００１％ｖ／ｖから約７５％ｖ／ｖの量で存在する、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
サポニンがＱｕｉｌ Ａまたはその精製画分であり、ステロールがコレステロールであり、第４級アンモニウム化合物がＤＤＡであり、ポリマーがポリアクリル酸である、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
Ｔｈ２刺激物質をさらに含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
Ｔｈ２刺激物質が糖脂質である、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
Ｔｈ２刺激物質がＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセタートである、請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
糖脂質が１用量当たり約０．０１ｍｇから約１０ｍｇの量で存在する、請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記抗原成分が不活化ウイルスを含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
ａ）緩衝液中で抗原成分の組成物を調製するステップ、
ｂ）ステップａの組成物にサポニンを添加するステップ、
ｃ）ステップｂの組成物にステロールを添加するステップ、
ｄ）ステップｃの組成物に第４級アンモニウム化合物を添加するステップ、
ｅ）ステップｄの組成物にポリマーを添加するステップ
を含む、請求項１６に記載のワクチン組成物を調製する方法。
【請求項２５】
サポニンがＱｕｉｌ Ａまたはその精製画分であり、ステロールがコレステロールであり、第４級アンモニウム化合物がＤＤＡであり、ポリマーがポリアクリル酸である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップａの組成物を均質化し、ステップａからｄの各ステップの間に均質化を継続するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ステップｄの組成物のマイクロ流体化を含むステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップｅの組成物にＴｈ２刺激物質を添加するステップｆ）をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
Ｔｈ２刺激物質が糖脂質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔｈ２刺激物質がＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセタートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
油をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
油をさらに含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
抗原成分がネコ白血病ウイルスを含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
抗原成分がネコ白血病ウイルスを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
抗原成分がネコ白血病ウイルスを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
ネコ白血病ウイルスが約１００ｎｇ／ｍＬから約３５０，０００ｎｇ／ｍＬまでの量で存在する、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
抗原成分が、ＫＴ−ＦｅＬＶ−ＵＣＤ−１ネコ白血病ウイルス株に持続感染したＦＬ−７４細胞系により産生されたｇｐ７０を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
請求項３５に記載のワクチン組成物をネコに投与することを含む、ネコ白血病ウイルスにより生じる感染に対してネコを治療する方法。
【請求項３９】
ネコ白血病ウイルスにより生じる感染に対してネコを治療するための医薬品の調製における、請求項３５に記載のワクチンの使用。
【請求項４０】
卵内投与のためのトリコクシジウム症ワクチンであって、
（ａ）Ｑｕｉｌ ＡまたはＱＳ２１を含むその精製画分、コレステロール、ＣＡＲＢＯＰＯＬ、ＤＤＡ、およびＲ１００５を含むアジュバントと、
（ｂ）次の（１）〜（３）から選択される原生動物の抗原
（１）組換えにより発現した１つまたは複数のタンパク質、
（２）従来の手段により前記原生動物から単離された１つまたは複数のタンパク質または他の高分子、および
（３）前記原生動物からの全細胞抽出物または調製物
とを含むワクチン。
【請求項４１】
抗原成分が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｊ−５株バクテリンを含む、請求項１から７および３１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
抗原成分が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｊ−５株バクテリンを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
抗原成分が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｊ−５株バクテリンを含む、請求項１６から２２および３２のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載のワクチン組成物をウシに投与することを含む、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により生じる感染に対してウシを治療する方法。
【請求項４５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により生じる感染に対してウシを治療するための医薬品の調製における、請求項４３に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項４６】
抗原成分がウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
抗原成分がＢＶＤＶ１型（ＢＶＤＶ−１）およびＢＶＤＶ２型（ＢＶＤＶ−２）を含む、請求項４６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
抗原成分がＢＶＤＶを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
抗原成分がＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
抗原成分がＢＶＤＶを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
抗原成分がＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２を含む、請求項５０に記載のワクチン組成物。
【請求項５２】
請求項５０または請求項５１に記載のワクチン組成物をウシに投与することを含む、ＢＶＤＶにより生じる感染に対してウシを治療する方法。
【請求項５３】
ＢＶＤＶにより生じる感染に対してウシを治療するための医薬品の調製における、請求項５０または請求項５１に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項５４】
抗原成分がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を含む、請求項１から７のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
抗原成分がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
抗原成分がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を含む、請求項１６から２２のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項５７】
請求項５６に記載のワクチン組成物をブタに投与することを含む、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）により生じる感染に対してブタを治療する方法。
【請求項５８】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）により生じる感染に対してブタを治療するための医薬品の調製における、請求項５６に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項５９】
抗原成分がネコインフルエンザウイルス（ＦＩＶ）を含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
抗原成分がＦＩＶを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
抗原成分がＦＩＶを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６２】
請求項６１に記載のワクチン組成物をネコに投与することを含む、ＦＩＶにより生じる感染に対してネコを治療する方法。
【請求項６３】
ＦＩＶにより生じる感染に対してネコを治療するための医薬品の調製における、請求項６１に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項６４】
抗原成分が癌抗原を含む、請求項１から７のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
抗原成分が癌抗原を含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
抗原成分が癌抗原を含む、請求項１６から２２のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６７】
請求項６６に記載のワクチン組成物を対象に投与することを含む、癌に対して対象を治療する方法。
【請求項６８】
癌に対して対象を治療するための医薬品の調製における、請求項６６に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項６９】
ＯＲＮ／ＯＤＮをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
ＯＲＮ／ＯＤＮがＣｐＧである、請求項６９に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
ステップａの組成物にＯＲＮ／ＯＤＮを添加するステップをさらに含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
ＯＲＮ／ＯＤＮがＣｐＧである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＯＲＮ／ＯＤＮをさらに含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７４】
ＯＲＮ／ＯＤＮがＣｐＧである、請求項７３に記載のワクチン組成物。
【請求項７５】
抗原成分がイヌコロナウイルス（ＣＣＶ）を含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
抗原成分がＣＣＶを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
抗原成分がＣＣＶを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７８】
請求項７７に記載のワクチン組成物をイヌに投与することを含む、ＣＣＶにより生じる感染に対してイヌを治療する方法。
【請求項７９】
ＣＣＶにより生じる感染に対してイヌを治療するための医薬品の調製における、請求項７７に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項８０】
抗原がウシロタウイルスを含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
抗原成分がウシロタウイルスを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
抗原成分がウシロタウイルスを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８３】
請求項８２に記載のワクチン組成物をウシに投与することを含む、ウシロタウイルスにより生じる感染に対してウシを治療する方法。
【請求項８４】
ウシロタウイルスにより生じる感染に対してウシを治療するための医薬品の調製における、請求項８２に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項８５】
抗原成分がイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）を含む、請求項１から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
抗原成分がＣＩＶを含む、請求項９から１５のいずれかおよび請求項２４から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
抗原成分がＣＩＶを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８８】
請求項８７に記載のワクチン組成物をイヌに投与することを含む、ＣＩＶにより生じる感染に対してイヌを治療する方法。
【請求項８９】
ＣＩＶにより生じる感染に対してイヌを治療するための医薬品の調製における、請求項８７に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項９０】
ＢＶＤＶに自然に感染した動物と、請求項５０または５１のワクチン組成物でワクチン接種された動物とを区別する方法であって、試験動物から試料を得ること、ならびに前記試料におけるＥ２タンパク質およびＮＳ２／３タンパク質のレベルを測定することを含み、ＮＳ２／３タンパク質が存在しないことにより、動物が前記ワクチン組成物でワクチン接種されたことが示される方法。

【図１】

【公表番号】特表２０１１−５２５９１１（Ｐ２０１１−５２５９１１Ａ）
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５７０６（Ｐ２０１１−５１５７０６）
【出願日】平成２１年６月２４日（２００９．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５２７２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５６９６０
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】