新規なアミノペプチダーゼ及びその製造法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シュードモナス属に属する細菌により生産される、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有する新規なアミノペプチダーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】この酵素は、上記の特性を有することから、蛋白系食品加工における呈味付与、増強にも役立ち、消化剤としての医薬品への利用や、また種々のタンパク質の一次構造決定における生化学試薬としても利用し得るものである。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】従来、アミノペプチダーゼとしては、高等動物の臓器から多くの報告がなされている。哺乳動物の腎臓や小腸のミクロソーム画分に存在する膜酵素として、Ｗａｃｈｓｍｕｔｈらによって（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，１６９，１９６６）およびＫｉｍらによって（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，３１９９，１９７６）また、家兎骨格筋中に存在する酵素として、Ｏｔｓｕｋａらによって（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１６１７，１９８０）、サル脳からＳｈｉｍａｍｕｒａらによって（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７５６，２２３，１９８３）さらに豚の肝臓からＫａｗａｔａらによって（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２，１０９３，１９８２）アミノペプチダーゼが報告されている。また、市販されているアミノペプチダーゼとしては、シグマ社からロイシンアミノペプチダーゼ、ミクロソーマル（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ）〔ＥＣ．３．４．１１．２〕が豚腎臓由来のアミノペプチダーゼとしてある。しかし、これらの動物起源の酵素は、その原料の入手の制約、分離、採取の操作、収量などの面で種々の制約を受ける点からも、これに代わる微生物起源の酵素を供給することが望ましい。
【０００４】また、微生物起源のアミノペプチダーゼとして、中台らが（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，１５７，１９７３）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，７６７，１９７３）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，７７５，１９７３）アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の生産するロイシンアミノペプチダーゼＩ，ＩＩ，ＩＩＩ（分子量２６，５００；６１，０００；５６，０００）を報告している。またこれらと同じ起源であるアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ酵素剤が市販されている。これらの酵素は、Ｎ末端のアミノ酸がロイシンであるペプチドのＮ末端に特によく作用するアミノペプチダーゼ活性を有するところの、基質特異性の狭い（高い）とされているものが殆どであり、特に市販のプロテアーゼ製剤で、種々のアミノ酸を導入したナフチルアミド誘導体を基質として使用して、その酵素活性をみてみると、そのアミノ酸がロイシンのものに特によく作用するような基質特異性の狭いものが殆んどである。このように、種々の用途に幅広く使用し得るアミノペプチダーゼとして、広い基質特異性を有する酵素が望まれているにも拘わらず、従来のものは必ずしも満足し得ないのが、実情である。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】そこで本発明者らは、基質特異性の広いアミノペプチダーゼを生産する微生物を探索すべく研究を重ねた結果、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌が目的とする酵素を生産することを見いだし、本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有する特定のアミノペプチダーゼならびにシュードモナス属に属し、該アミノペプチダーゼを産生する能力のある特定の細菌を培養して該アミノペプチダーゼを製造する方法を提供するものである。
【０００７】本発明のアミノペプチダーゼは、シュードモナス属に属し、該酵素生産能を有する特定の細菌を栄養培地に培養し、培養液もしくは、培養上澄液から該酵素を採取することによって製造することができる。
【０００８】目的とするアミノペプチダーゼを生産する能力のある微生物としては、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＩＡＭ１２３５４t ）（この菌は、日本微生物株目録（ＪＦＣＣ ＣＡＴＡＬＯＧＵＥ ＯＦ ＣＵＬＴＵＲＥＳ）第４版１９８７、日本微生物株保存連盟（Ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）、昭和６２年３月１日発行のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓの項にＩＡＭ（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）として記載されている）がある。
【０００９】栄養培地は、上記微生物が十分に生育し、目的とする酵素を生産しうるものであればよく、例えば、ペプトン、肉エキス等に塩化ナトリウムなどの無機塩類等を加えたものが好適に用いられる。
【００１０】培養は、本発明の場合、静置培養法によって行うことが好ましい。一般には、中性付近のｐＨに調整し、２０〜３０℃の温度で２〜１６日間程度培養を行い、アミノペプチダーゼを十分に生成せしめることができる。この酵素は、主として菌体外の培養液中に生成される。
【００１１】培養液からのアミノペプチダーゼの採取は、適宜既知の手法を組み合わせて行えばよく、その一例を示すと、培養終了後、培養液から遠心分離等によって菌体を除去し、得られた上澄液を適当な緩衝液で透析して粗酵素液を得る。
【００１２】次いで必要に応じ、粗酵素液をイオン交換クロマト、ゲル濾過、ハイドロキシルアパタイトクロマト、疎水クロマトなどの酵素精製に用いられる通常の操作を適宜組み合わせることによって、精製または、部分精製されたアミノペプチダーゼを得ることができる。本発明の場合、透析した粗酵素液を直接カラムクロマトに供することが、好ましい。
【００１３】次に、本発明の酵素の性質を以下に示す。本発明の酵素は、その分子量が、９８，０００で、その至適ｐＨは、ｐＨ８．０付近にあり、至適温度は、３５℃付近にあり、その熱安定性は、３７℃以下では、安定であり、図３及び図４で例証されるように５０℃より高い温度では相対活性が実質上０である。より具体的には、４０℃、１０分間の加熱で約６０％の活性が残存し、１ｍＭのＣｏ2+イオンでその活性が、約１．３倍に上昇し、ベスタチンに著しく阻害され、また、ロイペプチン、ＥＤＴＡにも若干阻害されるが、その基質特異性は、アミノ酸−２−ナフチルアミドの基質においてＮ末端が、アラニン、リジン、ロイシン、メチオニンといったアミノ酸であるものによく作用するなど広い基質特異性が認められ、さらに、トリ、テトラペプチドにも良好な活性を有し、それらのＮ末端から良好にアミノ酸を遊離するアミノペプチダーゼである。
【００１４】なお、酵素活性の測定は、実施例に示した精製酵素を用いて以下の方法で行った。
１）アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する活性の測定アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する活性の測定は、Ｍａｔｓｕｔａｎｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，３００，１９６７）の方法に準じて行った。酵素を０．４ｍｌの１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の存在下、０．５ｍＭ のアミノ酸−２−ナフチルアミドに３７℃で一定時間作用させた後、０．４ｍｌの０．２３Ｎ ＨＣｌ−エタノール溶液を加えて反応を停止させた。さらに０．４ｍｌの０．０６％ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド・エタノール溶液を加えて３０分間放置後、生成したシッフ塩基色素の量を５４０ｎｍにおける吸光値を分光々度計で測定し、遊離した２−ナフチルアミンを定量した。また、アミノ酸の種類によっては、その基質濃度、基質溶液を変えて行った。酵素活性の単位は、ｐＨ８．０、３７℃において酵素が、アミノ酸−２−ナフチルアミドから１分間に１μｍｏｌの２−ナフチルアミンを遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１５】２）一般の合成ペプチドに対する活性の測定一般の合成ペプチドに対する活性の測定は、Ｙｅｍｍ ＆ Ｃｏｃｋｉｎｇ（Ａｎａｌｙｓｔ，８０，２０９，１９７５）の方法に準じて行った。酵素を終濃度０．５ｍＭ の基質と、０．４ｍｌの１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の存在下、一定時間作用させた後、氷冷した０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．２ｍｌを加えて反応を停止した。さらに１Ｍ のモノヨード酢酸（中和済）を０．１ｍｌ加えて後、０．４ｍｌのニンヒドリン試薬を加えて、１００℃で１５分間煮沸した後、流水で５分間冷却した。さらに６０％エタノール２ｍｌで希釈した後、５７０ｎｍにおける吸光値を分光々度計で測定した。
【００１６】１）分子量本酵素の分子量は、Ａｎｄｒｅｗｓの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，９６，５９５，１９６５）に準じ、セファデックスＧ−２００によるゲル濾過カラム（φ２．４×１０５ｃｍ）に精製酵素および標準タンパク質を供して１ｍＭ ＮａＮ３−０．１％ＭＣＥ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ．にて溶出して求めた。精製酵素および標準タンパク質の溶出位置と分子量の関係を第１図に示した。その結果、本酵素の分子量は、９８，０００と推定した。
【００１７】２）至適作用ｐＨ本酵素の至適作用ｐＨは、ｐＨ３．０〜１０．０の範囲で、アラニン−２−ナフチルアミドを基質として３７℃、１０分間の反応条件で測定した。緩衝液は、各ｐＨに調製したＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３〜８）、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８〜１０）を使用した。その結果を第２図に示した。至適作用ｐＨは、８．０付近であった。ｐＨ８．５よりアルカリ性側、ｐＨ７．０より酸性側では、相対的活性は、低下した。
【００１８】３）至適作用温度精製酵素の至適作用温度は、１０℃〜４５℃の温度で、アラニン−２−ナフチルアミドを基質としてｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍ リン酸緩衝液を用いて１０分間の反応で測定した。その結果を第３図に示した。本酵素は、３５℃付近に至適作用温度を示し、４０℃では、相対的活性で約４５％、３０℃では、約５５％であった。
【００１９】４）熱安定性酵素活性の熱安定性は、精製酵素をｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて０℃〜７０℃の範囲で１０分間加熱処理を行い、加熱後に残存する活性は、ｐＨ８．０でアラニン−２−ナフチルアミドを基質として、３７℃、５分間の反応で測定し、未加熱の酵素活性を基準として相対活性値を示した。得られた結果を第４図に示した。４０℃、１０分間の加熱で、約６０％、４４℃、１０分間の加熱で約１０％の活性が残存した。
【００２０】５）金属イオンの影響本酵素の活性におよぼす各種金属イオンを測定した結果を第１表に示した。各種金属イオンをそれぞれ酵素溶液に０．５ｍＭ となるように加え、アラニン−２−ナフチルアミドを基質としてｐＨ８．０、３７℃１０分間の反応を行った。本酵素は、Ｃｏ２＋に対して若干活性化される傾向であった。またＺｎ２＋に対してある程度影響を受けた。
【００２１】
【表１】
【００２２】６）試薬の影響本酵素の活性におよぼす各種試薬の影響を測定した結果を第２表に示した。酵素溶液にそれぞれの濃度の各試薬の存在下で、アラニン−２−ナフチルアミドを基質としてｐＨ８．０、３７℃、１０分間の反応を行った。本酵素の活性は０．１ｍＭ ベスタチンで著しく阻害された。ロイペプチン、ＥＤＴＡに対して若干阻害された。
【００２３】
【表２】
【００２４】７）Ｋｍ値およびＶｍａｘ．
本酵素のＫｍ値およびＶｍａｘ．は、アラニン−２−ナフチルアミドを基質として求めた。各種濃度の基質をｐＨ８．０の０．１Ｍ リン酸緩衝液で調製して、３７℃、１０分間で酵素反応を行った。得られた結果からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロットを第５図に示した。Ｋｍ値は、０．６３ｍＭであり、Ｖｍａｘ．は０．６３μＭ／ｍｉｎ．／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００２５】８）基質特異性（１）．各種アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する基質特異性本酵素の各種アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する基質特異性を測定し、アラニン−２−ナフチルアミドを基準とした相対活性値を第３表に示した。酵素反応は、ｐＨ８．０で３７℃、１０分間行った。本酵素は、アミノ酸が、アラニン、リジン、ロイシン、メチオニンであるアミノ酸−２−ナフチルアミドによく作用し、広い基質特異性を示した。
【００２６】
【表３】
【００２７】（２）．各種ペプチドに対する基質特異性本酵素の各種ペプチドに対する基質特異性を測定し、Ｍｅｔ−Ｇｌｙを基準とした相対活性値を第４表に示した。酵素反応は、ｐＨ８．０で３７℃、３０分間行った。Ｃ末端をＧｌｙに揃えた１３種のジペプチドに作用させた場合、Ｎ末端がＬｙｓ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔのジペプチドによく作用した。その他、Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，のペプチドにも作用した。ジおよびトリペプチドよりテトラペプチドへの作用が大きかった。テトラペプチドでは、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，ＬｙｓがＮ末端にあるものによく作用し、広い基質特異性を示した。
【００２８】
【表４】
【００２９】１０）ペプチドに対する加水分解作用本酵素のＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａに対する加水分解作用を測定した。酵素反応は、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて、３７℃で、作用時間を変えて作用させ、終濃度８０％になるようにエタノールを加えて反応を停止した。反応液を濾過後、濾液を蒸発乾固して、その後蒸留水で一定量にしてアミノ酸分析計で、遊離したアミノ酸を定量した。その結果、作用時間の経過とともに、それぞれ遊離されるＬｅｕ及びＭｅｔがＬｅｕで０．１μＭ／ｍｌ，３０ｍｉｎ．；０．１８μＭ／ｍｌ，６０ｍｉｎ．、Ｍｅｔで０．２μＭ／ｍｌ，１５ｍｉｎ．；０．３４μＭ／ｍｌ，３０ｍｉｎ．というように増加することが示され、本酵素が、アミノペプチダーゼ活性を有する事を確認した。
【００３０】本発明は、上記したような特性を有するものであれば、すべて本発明のアミノペプチダーゼとして含むとしてよいものである。
【００３１】次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
【実施例】ペプトン３０ｇ、肉エキス１５ｇ、ＮａＣｌ １５ｇを脱イオン蒸留水３ｌに溶解し、１２１℃、２０分間滅菌を行ったものを培地とした。この培地にシュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＩＡＭ１２３５４ｔ）を接種し、２５℃で８日間静置培養した。培養後、培養液から遠心分離して菌体を除去した。得られた上澄液を１ｍＭ ＮａＮ３−０．１％ＭＣＥ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）（以下緩衝液Ａと略す）に透析して菌体外粗酵素液とした。次いで、以下の方法により酵素を精製した。
【００３２】１）ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー菌体外粗酵素液２．５ｌをあらかじめ緩衝液Ａで平衡化しておいたＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（φ３．０×２５ｃｍ）にかけた。緩衝液Ａで非吸着タンパク質を除去した後、０Ｍ〜０．４Ｍ ＮａＣｌまでの食塩濃度傾斜法で溶出した。溶出液は、１画分２０ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．４９〜５２を集め、限外濾過膜で濃縮を行った後に、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー酵素画分とした。
【００３３】２）ウルトロゲルＡｃＡ３４カラムクロマトグラフィー先の酵素液をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化しておいたウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（φ２．５×１０３ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出した。溶出液は、１画分１０ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．２４〜２７を集め、０．１％ＭＣＥ−１ｍＭ ＮａＮ３−１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析を行った後に、ウルトロゲルＡｃＡ３４カラムクロマトグラフィー酵素画分とした。
【００３４】３）ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー先の酵素液をあらかじめ０．１％ＭＣＥ−１ｍＭ ＮａＮ３−１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化しておいたハイドロキシルアパタイトカラム（φ１．８×１０．５ｃｍ）にかけた。同緩衝液で非吸着タンパク質を除去した後、リン酸の濃度を１０ｍＭ に上げて酵素を溶出させた。溶出液は、１画分３ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．３０〜３３を集め、０．１％ＭＣＥ−１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４−５ｍＭ ＮａＮ３−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で透析を行った後に、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー酵素画分とした。
【００３５】４）フェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィー先の酵素液をあらかじめ０．１％ＭＣＥ−１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４−５ｍＭ ＮａＮ３−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化しておいたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（φ１．８×５．５ｃｍ）にかけた。非吸着タンパク質を除去した後、硫安濃度を１．５Ｍから０Ｍまで濃度傾斜法で下げることにより、吸着タンパク質を溶出した。溶出液は、１画分３ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．７２〜７５を集め、緩衝液Ａで透析を行った後に、精製酵素溶液とした。
【００３６】以上の精製工程における結果を第５表に要約した。精製酵素は、アラニン−２−ナフチルアミドを基質として、菌体外粗酵素液と比較すると比活性で２１６１倍に精製され、活性の収率は、１４％であった。また、得られた精製酵素の蛋白質濃度（２８０ｎｍの吸光値）は、０．０４７ｍｇ／ｍｌであった。また、得られた精製酵素の総活性は、５．０５５７Ｕであった。活性測定法は、前記した方法に準じて行った。上記フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ処理して得られた酵素を用いると、前記した種々の酵素の物性及び活性の特性結果が得られた。
【００３７】
【表５】
【００３８】
【発明の効果】本発明のアミノペプチダーゼは、広い基質特異性を有している。このように広い基質特異性とペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離するアミノペプチダーゼ作用を有するので、本酵素は、タンパク質の構造や機能の研究、分析用試薬、食品工業への応用などに広く利用されるベく、期待される。また、本酵素は、微生物を用いて効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素および標準タンパク質のゲル濾過カラムにおける溶出位置と分子量の関係を示すグラフであり、図中のＡは、オボアルブミン（分子量４５，０００）、Ｂは、牛血清アルブミン（分子量６７，０００）、Ｃは、カタラーゼ（分子量２４０，０００）、Ｄは、フェリチン（分子量４５０，０００）、Ｅは、本発明の酵素を示す。
【図２】ｐＨと本発明の酵素の活性発現の影響についての関係を示すグラフであり、ｐＨ３〜８は、マックルバインの緩衝液（黒丸）、ｐＨ８〜１０は、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（白丸）を用いた。
【図３】温度と本発明の酵素の活性発現の影響についての関係を示すグラフである。
【図４】温度と本発明の酵素の一定時間後の残存活性を示すグラフである。
【図５】本酵素のＫｍ値とＶｍａｘ．を示すグラフである。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シュードモナス属に属する細菌により生産される、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有する新規なアミノペプチダーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】この酵素は、上記の特性を有することから、蛋白系食品加工における呈味付与、増強にも役立ち、消化剤としての医薬品への利用や、また種々のタンパク質の一次構造決定における生化学試薬としても利用し得るものである。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】従来、アミノペプチダーゼとしては、高等動物の臓器から多くの報告がなされている。哺乳動物の腎臓や小腸のミクロソーム画分に存在する膜酵素として、Ｗａｃｈｓｍｕｔｈらによって（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，１６９，１９６６）およびＫｉｍらによって（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，３１９９，１９７６）また、家兎骨格筋中に存在する酵素として、Ｏｔｓｕｋａらによって（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１６１７，１９８０）、サル脳からＳｈｉｍａｍｕｒａらによって（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７５６，２２３，１９８３）さらに豚の肝臓からＫａｗａｔａらによって（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２，１０９３，１９８２）アミノペプチダーゼが報告されている。また、市販されているアミノペプチダーゼとしては、シグマ社からロイシンアミノペプチダーゼ、ミクロソーマル（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ）〔ＥＣ．３．４．１１．２〕が豚腎臓由来のアミノペプチダーゼとしてある。しかし、これらの動物起源の酵素は、その原料の入手の制約、分離、採取の操作、収量などの面で種々の制約を受ける点からも、これに代わる微生物起源の酵素を供給することが望ましい。
【０００４】また、微生物起源のアミノペプチダーゼとして、中台らが（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，１５７，１９７３）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，７６７，１９７３）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，７７５，１９７３）アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の生産するロイシンアミノペプチダーゼＩ，ＩＩ，ＩＩＩ（分子量２６，５００；６１，０００；５６，０００）を報告している。またこれらと同じ起源であるアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼ酵素剤が市販されている。これらの酵素は、Ｎ末端のアミノ酸がロイシンであるペプチドのＮ末端に特によく作用するアミノペプチダーゼ活性を有するところの、基質特異性の狭い（高い）とされているものが殆どであり、特に市販のプロテアーゼ製剤で、種々のアミノ酸を導入したナフチルアミド誘導体を基質として使用して、その酵素活性をみてみると、そのアミノ酸がロイシンのものに特によく作用するような基質特異性の狭いものが殆んどである。このように、種々の用途に幅広く使用し得るアミノペプチダーゼとして、広い基質特異性を有する酵素が望まれているにも拘わらず、従来のものは必ずしも満足し得ないのが、実情である。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】そこで本発明者らは、基質特異性の広いアミノペプチダーゼを生産する微生物を探索すべく研究を重ねた結果、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌が目的とする酵素を生産することを見いだし、本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有する特定のアミノペプチダーゼならびにシュードモナス属に属し、該アミノペプチダーゼを産生する能力のある特定の細菌を培養して該アミノペプチダーゼを製造する方法を提供するものである。
【０００７】本発明のアミノペプチダーゼは、シュードモナス属に属し、該酵素生産能を有する特定の細菌を栄養培地に培養し、培養液もしくは、培養上澄液から該酵素を採取することによって製造することができる。
【０００８】目的とするアミノペプチダーゼを生産する能力のある微生物としては、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＩＡＭ１２３５４t ）（この菌は、日本微生物株目録（ＪＦＣＣ ＣＡＴＡＬＯＧＵＥ ＯＦ ＣＵＬＴＵＲＥＳ）第４版１９８７、日本微生物株保存連盟（Ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）、昭和６２年３月１日発行のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓの項にＩＡＭ（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）として記載されている）がある。
【０００９】栄養培地は、上記微生物が十分に生育し、目的とする酵素を生産しうるものであればよく、例えば、ペプトン、肉エキス等に塩化ナトリウムなどの無機塩類等を加えたものが好適に用いられる。
【００１０】培養は、本発明の場合、静置培養法によって行うことが好ましい。一般には、中性付近のｐＨに調整し、２０〜３０℃の温度で２〜１６日間程度培養を行い、アミノペプチダーゼを十分に生成せしめることができる。この酵素は、主として菌体外の培養液中に生成される。
【００１１】培養液からのアミノペプチダーゼの採取は、適宜既知の手法を組み合わせて行えばよく、その一例を示すと、培養終了後、培養液から遠心分離等によって菌体を除去し、得られた上澄液を適当な緩衝液で透析して粗酵素液を得る。
【００１２】次いで必要に応じ、粗酵素液をイオン交換クロマト、ゲル濾過、ハイドロキシルアパタイトクロマト、疎水クロマトなどの酵素精製に用いられる通常の操作を適宜組み合わせることによって、精製または、部分精製されたアミノペプチダーゼを得ることができる。本発明の場合、透析した粗酵素液を直接カラムクロマトに供することが、好ましい。
【００１３】次に、本発明の酵素の性質を以下に示す。本発明の酵素は、その分子量が、９８，０００で、その至適ｐＨは、ｐＨ８．０付近にあり、至適温度は、３５℃付近にあり、その熱安定性は、３７℃以下では、安定であり、図３及び図４で例証されるように５０℃より高い温度では相対活性が実質上０である。より具体的には、４０℃、１０分間の加熱で約６０％の活性が残存し、１ｍＭのＣｏ2+イオンでその活性が、約１．３倍に上昇し、ベスタチンに著しく阻害され、また、ロイペプチン、ＥＤＴＡにも若干阻害されるが、その基質特異性は、アミノ酸−２−ナフチルアミドの基質においてＮ末端が、アラニン、リジン、ロイシン、メチオニンといったアミノ酸であるものによく作用するなど広い基質特異性が認められ、さらに、トリ、テトラペプチドにも良好な活性を有し、それらのＮ末端から良好にアミノ酸を遊離するアミノペプチダーゼである。
【００１４】なお、酵素活性の測定は、実施例に示した精製酵素を用いて以下の方法で行った。
１）アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する活性の測定アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する活性の測定は、Ｍａｔｓｕｔａｎｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，３００，１９６７）の方法に準じて行った。酵素を０．４ｍｌの１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の存在下、０．５ｍＭ のアミノ酸−２−ナフチルアミドに３７℃で一定時間作用させた後、０．４ｍｌの０．２３Ｎ ＨＣｌ−エタノール溶液を加えて反応を停止させた。さらに０．４ｍｌの０．０６％ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド・エタノール溶液を加えて３０分間放置後、生成したシッフ塩基色素の量を５４０ｎｍにおける吸光値を分光々度計で測定し、遊離した２−ナフチルアミンを定量した。また、アミノ酸の種類によっては、その基質濃度、基質溶液を変えて行った。酵素活性の単位は、ｐＨ８．０、３７℃において酵素が、アミノ酸−２−ナフチルアミドから１分間に１μｍｏｌの２−ナフチルアミンを遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１５】２）一般の合成ペプチドに対する活性の測定一般の合成ペプチドに対する活性の測定は、Ｙｅｍｍ ＆ Ｃｏｃｋｉｎｇ（Ａｎａｌｙｓｔ，８０，２０９，１９７５）の方法に準じて行った。酵素を終濃度０．５ｍＭ の基質と、０．４ｍｌの１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の存在下、一定時間作用させた後、氷冷した０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．２ｍｌを加えて反応を停止した。さらに１Ｍ のモノヨード酢酸（中和済）を０．１ｍｌ加えて後、０．４ｍｌのニンヒドリン試薬を加えて、１００℃で１５分間煮沸した後、流水で５分間冷却した。さらに６０％エタノール２ｍｌで希釈した後、５７０ｎｍにおける吸光値を分光々度計で測定した。
【００１６】１）分子量本酵素の分子量は、Ａｎｄｒｅｗｓの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，９６，５９５，１９６５）に準じ、セファデックスＧ−２００によるゲル濾過カラム（φ２．４×１０５ｃｍ）に精製酵素および標準タンパク質を供して１ｍＭ ＮａＮ３−０．１％ＭＣＥ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ．にて溶出して求めた。精製酵素および標準タンパク質の溶出位置と分子量の関係を第１図に示した。その結果、本酵素の分子量は、９８，０００と推定した。
【００１７】２）至適作用ｐＨ本酵素の至適作用ｐＨは、ｐＨ３．０〜１０．０の範囲で、アラニン−２−ナフチルアミドを基質として３７℃、１０分間の反応条件で測定した。緩衝液は、各ｐＨに調製したＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３〜８）、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８〜１０）を使用した。その結果を第２図に示した。至適作用ｐＨは、８．０付近であった。ｐＨ８．５よりアルカリ性側、ｐＨ７．０より酸性側では、相対的活性は、低下した。
【００１８】３）至適作用温度精製酵素の至適作用温度は、１０℃〜４５℃の温度で、アラニン−２−ナフチルアミドを基質としてｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍ リン酸緩衝液を用いて１０分間の反応で測定した。その結果を第３図に示した。本酵素は、３５℃付近に至適作用温度を示し、４０℃では、相対的活性で約４５％、３０℃では、約５５％であった。
【００１９】４）熱安定性酵素活性の熱安定性は、精製酵素をｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて０℃〜７０℃の範囲で１０分間加熱処理を行い、加熱後に残存する活性は、ｐＨ８．０でアラニン−２−ナフチルアミドを基質として、３７℃、５分間の反応で測定し、未加熱の酵素活性を基準として相対活性値を示した。得られた結果を第４図に示した。４０℃、１０分間の加熱で、約６０％、４４℃、１０分間の加熱で約１０％の活性が残存した。
【００２０】５）金属イオンの影響本酵素の活性におよぼす各種金属イオンを測定した結果を第１表に示した。各種金属イオンをそれぞれ酵素溶液に０．５ｍＭ となるように加え、アラニン−２−ナフチルアミドを基質としてｐＨ８．０、３７℃１０分間の反応を行った。本酵素は、Ｃｏ２＋に対して若干活性化される傾向であった。またＺｎ２＋に対してある程度影響を受けた。
【００２１】
【表１】
【００２２】６）試薬の影響本酵素の活性におよぼす各種試薬の影響を測定した結果を第２表に示した。酵素溶液にそれぞれの濃度の各試薬の存在下で、アラニン−２−ナフチルアミドを基質としてｐＨ８．０、３７℃、１０分間の反応を行った。本酵素の活性は０．１ｍＭ ベスタチンで著しく阻害された。ロイペプチン、ＥＤＴＡに対して若干阻害された。
【００２３】
【表２】
【００２４】７）Ｋｍ値およびＶｍａｘ．
本酵素のＫｍ値およびＶｍａｘ．は、アラニン−２−ナフチルアミドを基質として求めた。各種濃度の基質をｐＨ８．０の０．１Ｍ リン酸緩衝液で調製して、３７℃、１０分間で酵素反応を行った。得られた結果からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロットを第５図に示した。Ｋｍ値は、０．６３ｍＭであり、Ｖｍａｘ．は０．６３μＭ／ｍｉｎ．／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００２５】８）基質特異性（１）．各種アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する基質特異性本酵素の各種アミノ酸−２−ナフチルアミドに対する基質特異性を測定し、アラニン−２−ナフチルアミドを基準とした相対活性値を第３表に示した。酵素反応は、ｐＨ８．０で３７℃、１０分間行った。本酵素は、アミノ酸が、アラニン、リジン、ロイシン、メチオニンであるアミノ酸−２−ナフチルアミドによく作用し、広い基質特異性を示した。
【００２６】
【表３】
【００２７】（２）．各種ペプチドに対する基質特異性本酵素の各種ペプチドに対する基質特異性を測定し、Ｍｅｔ−Ｇｌｙを基準とした相対活性値を第４表に示した。酵素反応は、ｐＨ８．０で３７℃、３０分間行った。Ｃ末端をＧｌｙに揃えた１３種のジペプチドに作用させた場合、Ｎ末端がＬｙｓ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔのジペプチドによく作用した。その他、Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，のペプチドにも作用した。ジおよびトリペプチドよりテトラペプチドへの作用が大きかった。テトラペプチドでは、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，ＬｙｓがＮ末端にあるものによく作用し、広い基質特異性を示した。
【００２８】
【表４】
【００２９】１０）ペプチドに対する加水分解作用本酵素のＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａに対する加水分解作用を測定した。酵素反応は、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ−０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて、３７℃で、作用時間を変えて作用させ、終濃度８０％になるようにエタノールを加えて反応を停止した。反応液を濾過後、濾液を蒸発乾固して、その後蒸留水で一定量にしてアミノ酸分析計で、遊離したアミノ酸を定量した。その結果、作用時間の経過とともに、それぞれ遊離されるＬｅｕ及びＭｅｔがＬｅｕで０．１μＭ／ｍｌ，３０ｍｉｎ．；０．１８μＭ／ｍｌ，６０ｍｉｎ．、Ｍｅｔで０．２μＭ／ｍｌ，１５ｍｉｎ．；０．３４μＭ／ｍｌ，３０ｍｉｎ．というように増加することが示され、本酵素が、アミノペプチダーゼ活性を有する事を確認した。
【００３０】本発明は、上記したような特性を有するものであれば、すべて本発明のアミノペプチダーゼとして含むとしてよいものである。
【００３１】次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
【実施例】ペプトン３０ｇ、肉エキス１５ｇ、ＮａＣｌ １５ｇを脱イオン蒸留水３ｌに溶解し、１２１℃、２０分間滅菌を行ったものを培地とした。この培地にシュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＩＡＭ１２３５４ｔ）を接種し、２５℃で８日間静置培養した。培養後、培養液から遠心分離して菌体を除去した。得られた上澄液を１ｍＭ ＮａＮ３−０．１％ＭＣＥ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）（以下緩衝液Ａと略す）に透析して菌体外粗酵素液とした。次いで、以下の方法により酵素を精製した。
【００３２】１）ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー菌体外粗酵素液２．５ｌをあらかじめ緩衝液Ａで平衡化しておいたＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（φ３．０×２５ｃｍ）にかけた。緩衝液Ａで非吸着タンパク質を除去した後、０Ｍ〜０．４Ｍ ＮａＣｌまでの食塩濃度傾斜法で溶出した。溶出液は、１画分２０ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．４９〜５２を集め、限外濾過膜で濃縮を行った後に、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー酵素画分とした。
【００３３】２）ウルトロゲルＡｃＡ３４カラムクロマトグラフィー先の酵素液をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化しておいたウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（φ２．５×１０３ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出した。溶出液は、１画分１０ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．２４〜２７を集め、０．１％ＭＣＥ−１ｍＭ ＮａＮ３−１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析を行った後に、ウルトロゲルＡｃＡ３４カラムクロマトグラフィー酵素画分とした。
【００３４】３）ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー先の酵素液をあらかじめ０．１％ＭＣＥ−１ｍＭ ＮａＮ３−１ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化しておいたハイドロキシルアパタイトカラム（φ１．８×１０．５ｃｍ）にかけた。同緩衝液で非吸着タンパク質を除去した後、リン酸の濃度を１０ｍＭ に上げて酵素を溶出させた。溶出液は、１画分３ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．３０〜３３を集め、０．１％ＭＣＥ−１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４−５ｍＭ ＮａＮ３−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で透析を行った後に、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィー酵素画分とした。
【００３５】４）フェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィー先の酵素液をあらかじめ０．１％ＭＣＥ−１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４−５ｍＭ ＮａＮ３−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化しておいたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（φ１．８×５．５ｃｍ）にかけた。非吸着タンパク質を除去した後、硫安濃度を１．５Ｍから０Ｍまで濃度傾斜法で下げることにより、吸着タンパク質を溶出した。溶出液は、１画分３ｍｌずつ分画した。分画した各画分のタンパク質量（２８０ｎｍの吸光値）およびアラニン−２−ナフチルアミドに対する加水分解活性を測定し、アミノペプチダーゼ活性を含む溶出画分Ｎｏ．７２〜７５を集め、緩衝液Ａで透析を行った後に、精製酵素溶液とした。
【００３６】以上の精製工程における結果を第５表に要約した。精製酵素は、アラニン−２−ナフチルアミドを基質として、菌体外粗酵素液と比較すると比活性で２１６１倍に精製され、活性の収率は、１４％であった。また、得られた精製酵素の蛋白質濃度（２８０ｎｍの吸光値）は、０．０４７ｍｇ／ｍｌであった。また、得られた精製酵素の総活性は、５．０５５７Ｕであった。活性測定法は、前記した方法に準じて行った。上記フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ処理して得られた酵素を用いると、前記した種々の酵素の物性及び活性の特性結果が得られた。
【００３７】
【表５】
【００３８】
【発明の効果】本発明のアミノペプチダーゼは、広い基質特異性を有している。このように広い基質特異性とペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離するアミノペプチダーゼ作用を有するので、本酵素は、タンパク質の構造や機能の研究、分析用試薬、食品工業への応用などに広く利用されるベく、期待される。また、本酵素は、微生物を用いて効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素および標準タンパク質のゲル濾過カラムにおける溶出位置と分子量の関係を示すグラフであり、図中のＡは、オボアルブミン（分子量４５，０００）、Ｂは、牛血清アルブミン（分子量６７，０００）、Ｃは、カタラーゼ（分子量２４０，０００）、Ｄは、フェリチン（分子量４５０，０００）、Ｅは、本発明の酵素を示す。
【図２】ｐＨと本発明の酵素の活性発現の影響についての関係を示すグラフであり、ｐＨ３〜８は、マックルバインの緩衝液（黒丸）、ｐＨ８〜１０は、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（白丸）を用いた。
【図３】温度と本発明の酵素の活性発現の影響についての関係を示すグラフである。
【図４】温度と本発明の酵素の一定時間後の残存活性を示すグラフである。
【図５】本酵素のＫｍ値とＶｍａｘ．を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 微生物により産生され、分子量が９８，０００で、至適ｐＨが８．０付近にあり、至適温度３５℃付近にあり、３７℃以下では安定であるが５０℃より高い温度では相対活性が実質上０である熱安定特性を有し、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有するアミノペプチダーゼ。
【請求項２】 シュードモナス・クロロラフィス（ＩＡＭ１２３５４t ）により産生され、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有するアミノペプチダーゼ。
【請求項３】 ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有するアミノペプチダーゼを産生する能力のあるシュードモナス・クロロラフィス（ＩＡＭ１２３５４t ）を栄養培地に培養して得られる培養液、もしくは培養上澄液をイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーあるいはそれらの任意の組み合わせに付することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造法。
【請求項１】 微生物により産生され、分子量が９８，０００で、至適ｐＨが８．０付近にあり、至適温度３５℃付近にあり、３７℃以下では安定であるが５０℃より高い温度では相対活性が実質上０である熱安定特性を有し、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有するアミノペプチダーゼ。
【請求項２】 シュードモナス・クロロラフィス（ＩＡＭ１２３５４t ）により産生され、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有するアミノペプチダーゼ。
【請求項３】 ペプチドのＮ末端からアミノ酸を順次遊離する作用を有し、基質特異性の広い特性を有するアミノペプチダーゼを産生する能力のあるシュードモナス・クロロラフィス（ＩＡＭ１２３５４t ）を栄養培地に培養して得られる培養液、もしくは培養上澄液をイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーあるいはそれらの任意の組み合わせに付することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許番号】特許第３０７６９３６号（Ｐ３０７６９３６）
【登録日】平成１２年６月１６日（２０００．６．１６）
【発行日】平成１２年８月１４日（２０００．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平３−３０８５５１
【出願日】平成３年９月１２日（１９９１．９．１２）
【公開番号】特開平５−６８５５０
【公開日】平成５年３月２３日（１９９３．３．２３）
【審査請求日】平成１０年８月５日（１９９８．８．５）
【出願人】（０００２０１７３３）曽田香料株式会社 (56)
【参考文献】
【文献】Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．３，（１９８３），ｐ．４６３−４７６
【登録日】平成１２年６月１６日（２０００．６．１６）
【発行日】平成１２年８月１４日（２０００．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成３年９月１２日（１９９１．９．１２）
【公開番号】特開平５−６８５５０
【公開日】平成５年３月２３日（１９９３．３．２３）
【審査請求日】平成１０年８月５日（１９９８．８．５）
【出願人】（０００２０１７３３）曽田香料株式会社 (56)
【参考文献】
【文献】Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．３，（１９８３），ｐ．４６３−４７６
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