新規なグルコース脱水素酵素
【課題】新規なグルコース脱水素酵素及びその製造法、並びにその用途を提供することを課題とする。
【解決手段】下記の特性（１）及び（２）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のペプチド鎖部分の分子量が約７０ｋＤａ
（２）Ｋｍ値： Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
【解決手段】下記の特性（１）及び（２）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のペプチド鎖部分の分子量が約７０ｋＤａ
（２）Ｋｍ値： Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコース脱水素酵素に関する。詳しくは、本発明はフラビン結合型グルコース脱水素酵素、それをコードするＤＮＡ、及び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造方法、当該酵素を使用したグルコース測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極及び酵素反応層を形成したものである。
【０００３】
ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられる。ＧＯ（ＥＣ １．１．３．４）を用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨでもピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））は、溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。
【０００４】
フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）は、溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しない。特許文献１〜６や非特許文献１〜６には、アスペルギルス・テレウスやアスペルギルス・オリゼ由来のもの、あるいは、それらを改変したもの等が知られている。しかし、これらの酵素は、キシロースに対する反応性が比較的高いため（特許文献１）、キシロース負荷試験を受けている者の血糖を測定する場合には改善の余地がある。
【０００５】
近年、このような問題点の解決を図るべく、ＧＯとＧＤＨの長所を併せ持つ改変型ＧＤＨ（特許文献７）等が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１２３９
【特許文献３】特開２００７−２８９１４８
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０
【特許文献５】ＷＯ２００８／０５９７７７
【特許文献６】ＷＯ２０１０／１４０４３１
【特許文献７】ＷＯ２０１１／０６８０５０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のような現状の下、本発明者等は、ＳＭＢＧにおける使用により適した、新規なグルコース脱水素酵素を開発すべく日夜検討を重ね、優れた基質特異性に加えて、Ｄ−グルコースに対する親和性が高い酵素を利用することで、測定時間を短縮し、且つ、少量の酵素量で正確な血糖値の測定が可能になるという課題を見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは、日夜検討を重ね、これまでにグルコース脱水素酵素を生産することが報告されていない多くの微生物についてスクリーニングした結果、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に帰属する微生物がグルコース脱水素酵素活性を有することを見出した。そして、本発明者等は、更なる研究を重ね、シルシネラ属に属する微生物が産生するフラビン結合型ＧＤＨを単離精製し、その特性を調べた結果、優れた基質特異性と高いＤ−グルコースに対する親和性とを備えていることを見出した。更に、本発明者等は、単離した酵素のアミノ酸配列及び遺伝子配列を決定し、それらの配列
がこれまでに報告されているＦＡＤＧＤＨのものとは異なる新規な酵素であることを突き止めた。
【００１０】
本発明は、係る知見に基づき、更なる研究と改良を重ねた結果完成したものであり、代表的な本発明は、以下の通りである。
項１．下記の特性（１）及び（２）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約７０ｋＤａ
（２）Ｋｍ値： Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
項２．更に下記の特性（３）を備える、項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（３）基質特異性： Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１．７％以下である
項３．更に下記の特性（４）を備える、項１又は２に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（４）至適活性温度： ３７〜４５℃
項４．更に下記の特性（５）〜（７）から成る群より選択される１種以上の特性を備える、項１〜３のいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
（５）至適活性ｐＨ： ６．５
（６）ｐＨ安定性： ｐＨ５〜７の範囲で安定
（７）温度安定性： ４０℃以下で安定
項５．更に下記の特性（８）を備える、項１〜４のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（８）由来： シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物に由来する
項６．シルシネラ属に分類される微生物を培養すること、及び
グルコース脱水素酵素を回収すること
を含む、項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項７. 下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
項８．以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、
且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項９．項８に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項１０．項９に記載のベクターを含む形質転換体。
項１１．項１０に記載の形質転換体を培養することを含む、項７に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項１２．項１〜５及び７のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項１３．項１〜５及び７のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項１４．項１〜５及び７のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＧＤＨ」と称する場合もある。）は、グルコース脱水素酵素活性を有し、Ｄ−グルコースとの親和性が高い（即ち、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が有意に低い）ため、より少ない酵素量で試料中のＤ−グルコース濃度をより短時間で測定することを可能にする。また、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−キシロースに対する反応性が有意に低いため、試料中にＤ−グルコースとＤ−キシロースが共存する場合であってもグルコース量又は濃度を正確に測定することを可能にする。従って、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−グルコースを含むあらゆる試料（例えば、血液や食品（調味料や飲料等））におけるグルコース濃度を正確に測定することを可能にする。更に本発明のＤＮＡは、本発明のＦＧＤＨをコードするため、遺伝子工学的手法を用いて、効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２株から精製したＦＧＤＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す。
【図２】Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨをＦ−グリコシダーゼで糖鎖消化してＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す。
【図３−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。
【図３−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。
【図４−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨの活性に対する温度の影響を示す。
【図４−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの活性に対する温度の影響を示す。
【図５−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図５−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図６−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨの熱安定性を測定した結果を示す。
【図６−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの熱安定性を測定した結果を示す。
【図７−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨのＤ−グルコースに関するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを示す。
【図７−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨのＤ−グルコースに関するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
１．フラビン結合型グルコース脱水素酵素
１−１．グルコース脱水素酵素活性
フラビン結合型グルコース脱水素酵素とは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本明細書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＦＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
【００１５】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。例えば、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができる。
【００１６】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
・５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液 ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
・２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
・２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
・１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２０．５ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍＬ、ＰＭＳ溶液２．０ｍＬ、Ｄ―グルコース溶液５．９ｍＬを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＦＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＧＤＨ溶液の代わりにＦＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＦＧＤＨ活性を求める。ここでＦＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
【００１７】
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×3.1×希釈倍率｝／｛16.3×0.1×1.0｝
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示をしない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
【００１８】
本発明のＦＧＤＨは、フラビンを補欠分子族として要求するフラビン結合型のＧＤＨである。
【００１９】
本発明のＦＧＤＨは、単離されたＦＧＤＨ又は精製されたＦＧＤＨであることが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明の酵素（ＦＧＤＨ）に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＦＧＤＨは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
【００２０】
１−２．ポリペプチド
本発明のＦＧＤＨは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【００２１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、実施例５に示される通り、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２に由来するＦＧＤＨのアミノ酸配列であり、下記１−３〜１−８の特性を全て満たす。
【００２２】
上記（ｂ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで「数個」とは、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは後述する１−３〜１−１０（特に１−３〜１−４）の特性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、例えば、２〜１２７個、好ましくは２〜９６個、より好ましくは２〜６４個、更に好ましくは２〜３２個であり、より更に好ましくは２〜２０個、一層好ましくは２〜１５個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
【００２３】
上記（ｂ）のポリペプチドの具体例としては、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨのアミノ酸配列であり、第５８２位のアミノ酸がグリシンではなくアスパラギン酸である点でのみ、配列番号１のアミノ酸配列と相違する。
【００２４】
アミノ酸の置換の種類は、特に制限されないが、ＦＧＤＨの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００２５】
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して後述する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＦＧＤＨを得ることができる。バリアントＦＧＤＨには、ＦＧＤＨを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
【００２６】
また、ＦＧＤＨの活性を維持するという観点からは、ＦＧＤＨの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。
【００２７】
上記（ｃ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持することを限度で、好ましくは上記１−２〜１−８の特性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＦＧＤＨが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配
列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。上記（ｃ）のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号１６で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。
【００２８】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて、算出することができる。
【００２９】
１−３．基質特異性
本発明のＦＧＤＨは、基質特異性に優れている。特に、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する反応性を基準とした場合に、少なくともＤ−キシロースに対する反応性が有意に低い。より具体的に、本発明のＦＧＤＨは、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、Ｄ−キシロースに対する反応性が１．７％以下であることが好ましく、より好ましくは１．６％以下であり、より好ましくは１．３％以下であり、更に好ましくは１．２％以下である。
【００３０】
本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−キシロースに対する反応性が低いことに加えて、Ｄ−ガラクトース及びマルトースに対する反応性も低いことが好ましい。本発明のＦＧＤＨのＤ−ガラクトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、通常５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下、更に好ましくは１．１％以下、特に好ましくは０．５％以下である。
【００３１】
本発明のＦＧＤＨのマルトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、通常５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下であり、更に好ましくは１％以下であり、特に好ましくは０．６％以下である。
【００３２】
上記本発明のＦＧＤＨのＤ−グルコースに対する反応性を基準としたＤ−キシロース、Ｄ−ガラクトース及びマルトースに対する反応性の下限値は、特に制限されないが、０％又は０％に限りなく近い値を下限値とすることができる。
【００３３】
ＦＧＤＨの各糖類に対する反応性は、上記１−１．に示すグルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法において、Ｄ−グルコースを他の糖（例えば、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、又はマルトース）に置き換えて、Ｄ−グルコースの場合の活性を比較することにより求めることができる。但し、比較する場合の各糖類の濃度は５０ｍMである。
【００３４】
以上のような優れた基質特異性を有する本発明のＦＧＤＨは、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨによれば試料中にマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースなどの夾雑物が存在する場合であっても目的のＤ−グルコースの量を正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適したものであるといえ、当該用途も含め様々な用途に適用可能であり、汎用性が高い。
【００３５】
１−４．Ｄ−グルコースに対する親和性
本発明のＦＧＤＨは、本来の基質であるＤ−グルコースに対する親和性が高いことが好ましい。親和性が高いことにより、試料中のＤ−グルコースの濃度が低い場合であっても、上述する触媒反応を進めることができ、より正確なＤ−グルコース濃度の測定、より短時間での測定、及びより少ない酵素量での測定に資するからである。ＦＧＤＨのＤ−グルコースに対する親和性は、Ｋｍ値によって示される。Ｋｍ値は、いわゆるミカエリス・メンテン式から求められる値であり、具体的には、上記１−１．に示す活性測定方法においてＤ−グルコースの濃度を変化させて各濃度における活性を測定し、ラインウィーバー・バーク・プロットを作成することによって求めることができる。
【００３６】
酵素の反応速度論から判断して、Ｋｍ値が低いほど、酵素は基質に対する親和性が高く、基質濃度が低い場合でも基質との複合体を形成することができ、より早い速度で触媒反応を進めることができる。本発明のＦＧＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、２０ｍＭ以下であることが好ましく、より好ましくは１５ｍＭ以下、更に好ましくは１４ｍＭ以下、更に好ましくは１３ｍＭ以下であり、更に好ましくは１２．５ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下、更に好ましくは８．５ｍＭ以下である。
【００３７】
１−５．至適活性ｐＨ
他の実施形態において、本発明のＦＧＤＨの至適活性ｐＨは、後述する実施例に示す通り、ｐＨ６．５であることが好ましい。ここで至適活性ｐＨが６．５であるとは、典型的に至適活性ｐＨが６．５付近であり、ある程度の許容可能な幅を有することを意味する。本明細書において、至適活性ｐＨは、後述の実施例に示すように、酵素濃度１００Ｕ／ｍＬでＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーを用いて酵素活性を測定することで求められる。
【００３８】
１−６．至適活性温度
他の実施形態において、本発明のＦＧＤＨの至適活性温度は、３７℃〜４５℃であることが好ましい。ここで「３７℃〜４５℃」とは、典型的に至適活性温度が３７〜４５℃付近であり、更にある程度の許容可能な幅を有することを意味する。他の観点から、本発明のＦＧＤＨは、４５℃における酵素活性を基準（１００％）として、５０℃における酵素活性が６０％以上であることが好ましく、６５％以上であることがより好ましい。更に他の観点から、本発明のＦＧＤＨは、３０℃〜５０℃の範囲における酵素活性が、４５℃における酵素活性を基準として、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることがより好ましい。本明細書において、至適活性温度は、後述する実施例に示す通り、酵素濃度０．１Ｕ／ｍＬでＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中における酵素活性を測定することにより求められる。
【００３９】
１−７．ｐＨ安定性
本明細書において、特定のｐＨ条件の下、１０Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上である場合に、当該酵素は、当該ｐＨ条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ５〜７の範囲で安定であることが好ましい。本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ５〜７の範囲で安定である限り、更に、広い範囲（例えば、ｐＨ３〜７）で安定であってもよい。一実施形態において、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ５〜７の範囲又はこれよりも広い範囲（例えば、ｐＨ３．５〜７．５）で前記処理をした場合に、残存酵素活性が９０％以上であることがより好ましい。
【００４０】
１−８．温度安定性
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えば、酢酸カリウムバッファー（ｐＨ５．０））で１００Ｕ／ｍＬの酵素を１５分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して実質的な低下が認められない（つまり約９０％以上を維持する）とき、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、０℃〜４０℃において安定であることが好ましい。
【００４１】
本発明のＦＧＤＨは、上記１−３〜１−８及び下記１−９で示される特徴のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を更に備え、より更に好ましくはその４つ以上を備え、一層好ましくはその５つ以上を備え、より一層好ましくはその６つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のＦＧＤＨは、上記１−３〜１−８及び下記１−９の特性を如何なる組合せで備えていても良い。
【００４２】
１−９．分子量
他の実施形態において、本発明のＦＧＤＨを構成するポリペプチド部分の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約７０ｋＤａであることが好ましい。「約７０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常７０ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のＦＧＤＨを意味する。微生物によって生産された本発明のＦＧＤＨが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質
的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ＦＧＤＨに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ＦＧＤＨが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
【００４３】
糖鎖結合型ＦＧＤＨから糖鎖を除去する手段は、特に制限されないが、例えば、後述する実施例に示すように、糖鎖結合型のＦＧＤＨを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７℃で６時間処理することにより実施することができる。
【００４４】
本発明のＦＧＤＨが糖鎖に結合している場合、その分子量は、グルコース脱水素酵素活性、基質特異性、及びＤ−グルコースに対する親和性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明ＦＧＤＨの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定において、９０，０００〜１１０，０００Ｄａであることが好ましい。糖鎖結合型のＦＧＤＨは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高め、水に溶け易くするという観点から好ましい。
【００４５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。
【００４６】
１−１０．由来
代表的な本発明のＦＧＤＨは、シルシネラ属に帰属する微生物から単離された。よって、本発明のＦＧＤＨは、シルシネラ属に帰属する微生物に由来することが好ましい。本発明のＦＧＤＨが由来し得る具体的なシルシネラ属に分類される微生物種には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ等が含まれる。これらの種の属する具体的な菌株としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４
８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２等が挙げられる。この中でも、本発明のＦＧＤＨは、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２に由来することが好ましい。
【００４７】
２．フラビン結合型グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記１のＦＧＤＨをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列をからなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４８】
本書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
【００４９】
本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは上記１−３〜１−８の特性の少なくとも１つ（特に、上記１−２〜１−３の特性）を備える限り、配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。このような本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番号１７で示される塩基配列を含むＤＮＡを挙げることが出来る。配列番号１７で示される塩基配列は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨをコードし、配列番号２の塩基配列と５塩基のみが相違する。
【００５０】
塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００５１】
本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がグルコース脱水素活性を有し、好ましくは上記１−２〜１−８の特性の少なくとも１つを備える限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）を参照して設定することができる。
【００５２】
具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液とし
て５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができる。
【００５３】
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定するこ
とによって容易に取り除くことができる。
【００５４】
上記（Ｅ）及び（Ｆ）のＤＮＡに関し、「数個」とは上記１−２に説明したものと同義である。
【００５５】
好適な一実施形態において、本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。
【００５６】
本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２）を基に、化学的DNA合成法により製造、取得することができるが、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる（Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
【００５７】
標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のＦＧＤＨが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science122, 778 (1983)等〕。
【００５８】
ｃＤＮＡライブラリーを調整するための起源微生物は、本発明ＦＧＤＨを発現する微生物であれば特に制限れないが、好ましくは、シルシネラ属に分類される微生物である。起源微生物として好適なシルシネラ属種は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ等である。より具体的な起源微生物菌株としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉ
ｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２等が挙げられる。これらの中でもＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２が好ましい。
【００５９】
上記の微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
【００６０】
ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science130, 1350 (1985)〕またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕等の採用が好適である。
【００６１】
ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーも配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
【００６２】
本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のＦＧＤＨを容易に大量に、安定して製造することができる。
【００６３】
３．ベクター
本発明のベクターは、上記２．で説明する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡが組み込まれている。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００６４】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８等）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００６５】
発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００６６】
４．形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記３．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
【００６７】
宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α等が用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス等が例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２等が挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ シルシネラ・シンプレックス等を例示することができる。また、本発明のＦＧＤＨが単離されたシルシネラ属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００６８】
本発明の形質転換体は、好ましくは、上記３．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション、トランスフォーメーションは、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，７１６１−７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，３６６−３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９−３４６（１９８９））、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，１４７０−１４７４（１９８４））等によって実施することができる。
【００６９】
本発明の形質転換体は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することが可能となる。
【００７０】
５．フラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法
本発明のＦＧＤＨは、本発明のＦＧＤＨの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記１．に示すシルシネラ属に帰属する野生型の微生物及び上記４．に示す形質転換体を好適に利用することができる。
【００７１】
具体的なシルシネラ属に分類される微生物としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２が挙げられる。
【００７２】
上記のシルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンターに保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
【００７３】
培養法及び培養条件は、本発明のＦＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００７４】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸等を培地に添加してもよい。
【００７５】
シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物を培養して本発明のＦＧＤＨを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００７６】
培地のｐＨは、例えば、約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００７７】
上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。シルシネラ属に属する微生物が産生するフラビン結合型グルコース脱水素酵素は基本的に分泌型のタンパク質である。
【００７８】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理等によって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００７９】
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン等による分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤等によるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００８０】
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等によるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００８１】
なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製等）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性等のうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。各精製工程では原則としてＦＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験等によって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。
【００８２】
本発明のＦＧＤＨを精製標品とする場合は、例えば、比活性が３００〜５１０（Ｕ／ｍｇ）、好ましくは比活性が４００〜５１０（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００８３】
組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００８４】
６．グルコースの測定方法
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法を既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記１−１．に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従って、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のＦＧＤＨを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を揚げることができる。
【００８５】
後述するセンサの形態でのグルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして実施することができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８６】
７．グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のＦＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のＦＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００８７】
８．グルコースセンサ
本発明はまた、本発明のＦＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極等を用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー等があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００８８】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８９】
なお、本明細書において「プロダクト」とは、使用者が当該用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むものを意味する。
【００９０】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００９１】
実施例１ 菌株の復元
独立行政法人製品評価技術基盤機構から、シルシネラ属に帰属する幾つかの菌株を入手した。Ｌ−乾燥標品の菌株は、アンプルを開封し、復元水１００μＬを注入し、乾燥菌体を懸濁した後、懸濁液を復元培地に滴下し、２５℃で３日間から７日間、静置培養することで菌株を復元させた。復元水としては、滅菌水（オートクレーブで１２０℃、２０分間処理した蒸留水）使用し、復元培地としては、ＤＰ培地（デキストリン ２．０％、ポリペプトン １．０％、ＫＨ２ＰＯ４ １．０％、アガロース １．５％）を使用した。グリセロールストックされた菌株は、１００μｌをＤＰ寒天培地にプレーティングして復元させた。
【００９２】
実施例２ 培養上清の回収
小麦胚芽２ｇ、水２ｍＬを含む培地をオートクレーブで１２０℃、２０分間、滅菌した固体培地に、実施例１で復元させたＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属の各菌株を一白金耳植菌し、２５℃で３日間から７日間程度、静置培養した。培養後、２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を４ｍＬを添加し、ボルテックスで十分に懸濁した。懸濁液に少量のガラスビーズを加えた後、ビーズショッカー（安井器械（株）製）で３，０００ｒｐｍ、３分間×２回の条件で破砕し、４℃、２，０００×ｇ、５分間の遠心分離して、回収した上清を粗酵素液とした。
【００９３】
実施例３ グルコース脱水素酵素活性の確認
実施例２で得た粗酵素液中のグルコース脱水素酵素活性を、上記１−１．に示したＦＧＤＨ測定方法を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００９４】
【表１】
【００９５】
表１の結果から、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来の粗酵素液にＧＤＨ活性が存在することが確認された。
【００９６】
実施例４ Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの精製
５０ｍＬのＤＰ液体培地を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地とした。予めＤＰプレート培地で復元したＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２を別個に前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養し、種培養液とした。
【００９７】
次に、６．０Ｌの生産培地（イーストイクストラクト ２．０％、グルコース １％、ｐＨ６．０）を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａで３日間培養した。その後、培養液をろ布でろ過し、菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
【００９８】
懸濁液をフレンチプレス（Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ製）に流速１６０ｍＬ／分で送液し、１０００〜１３００ｂａｒで破砕した。続いて、破砕液に硫酸アンモニウム（住友化学（株）製）を０．２飽和になるように徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に分画分子量１０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株）製）を用いて濃縮し、濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ のゲルを用いて脱塩した。その後、脱塩液に０．５飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、予め０．５飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した４００ｍＬのＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。そして、溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮後、ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、精製酵素を得た。得られた精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐｈａｓｔ Ｇｅｌ １０−１５％ Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ ＧＥヘルスケア製）に供した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２６７ダルトン）、アルドラーゼ（４２，４００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）を用いた。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２に関する結果を図１に示す。
【００９９】
図１に示されるように、単一のバンドが得られたことから、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨが十分に精製されていることが分かる。また分子量マーカーと比較した移動度から、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨの分子量は９０，０００〜１１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１００】
実施例５ 単離されたＦＧＤＨのペプチド部分の分子量
実施例４で精製したＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨを１００℃、１０分間、加熱処理して変性させた後、５ＵのＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス製）で３７℃、１時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。その後、実施例４と同様の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定を行った。分子量マーカーは、実施例４と同じものを使用した（図２）。図２に示される結果から、精製したＦＧＤＨのポリペプチド部分の分子量は約７０，０００ダルトンであることが判明した。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨについても、後述するように、そのアミノ酸配列が、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨのアミノ酸配列と１アミノ酸のみで相違することから、分子量は約７０，０００ダルトンである。
【０１０１】
実施例６ 基質特異性
上述したＦＧＤＨの活性測定法に従い、基質としてＤ−グルコースを用いたときの活性と、比較対象の糖を用いたときの見かけの活性とを比較することにより、精製酵素の基質特異性を調査した。比較対象の糖としてはマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースをそれぞれ使用した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表２に示す。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
表２の結果から、本発明のＦＧＤＨの基質特異性は、Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する見かけの活性は、いずれも２％以下であり、本発明のＦＧＤＨは基質特異性に優れていることが示された。
【０１０４】
実施例７ 至適活性ｐＨ
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを調べた。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨの至適ｐＨは、緩衝溶液として５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ７．５）を用いて測定した。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨの至適ｐＨは、緩衝液として５０ｍＭの酢酸カリウム（ｐＨ５〜５．５）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５〜６．５）、リン酸カリウム（ｐＨ６．０〜８．０）を用いて測定した。結果を図３−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び図３−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１０５】
その結果、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ６．５で最も高い見かけの活性値を示し、ｐＨ６．０及び７．０における活性よりもｐＨ６．５における活性の方が高いことから、ｐＨ６．５付近が至適ｐＨであることが示された。
【０１０６】
実施例８ 至適活性温度
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（０．１Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適温度を調べた。緩衝溶液には４２ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃における見かけの活性を求めた。結果を図４−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び４−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１０７】
その結果、本発明のＦＧＤＨは、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃で比較検討した中において、３７℃〜４５℃で最も高い見かけの活性値を示し、５０℃における活性よりも４５℃における活性の方が高かったことから、至適温度は凡そ３７℃〜４５℃付近である。
【０１０８】
実施例９ ｐＨ安定性
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（１０Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ 酢酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０−ｐＨ５．５図中四角黒色印でプロット）、１００ｍＭ リン酸−カリウム緩衝液（ｐＨ５．５−ｐＨ７．５図中四角白色印でプロット）、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０図中三角白色印でプロット）、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５−ｐＨ７．５図中三角黒色印でプロット）を用い、２５℃、１６時間処理した後の見かけの活性の残存率を測定した。結果を図５−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び５−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１０９】
その結果、見かけの活性が最大の残存率を示したｐＨ６．５の残存率を１００％とした場合、相対値で８０％以上の残存率を示したｐＨ範囲は、ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨではｐＨ５．３〜ｐＨ７．２の範囲であり、ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨでは、ｐＨ３．５〜８．０であることが判明した。
【０１１０】
実施例１０ 熱安定性
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて、熱安定性を調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、ＦＧＤＨ酵素液を各温度（４℃、３０℃、４０℃、５０℃）で１５分間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した。結果を図６−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び６−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１１１】
その結果、本発明のＦＧＤＨは４０℃に９８％（ＮＢＲＣ６４１２）及び９４％（ＲＤ０５５４２２）の残存率を示していた。このことから、４０℃以下で安定であることが示された。
【０１１２】
実施例１１ Ｋｍ値の測定
上述したＦＧＤＨの活性測定法において、基質であるＤ−グルコースの濃度を変化させて見かけの活性測定を行い、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを作成し（図７−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び図７−２（ＲＤ０５５４２２））Ｋｍ値を算出した。その結果、本発明のＦＧＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、１２．５ｍＭ（ＮＢＲＣ６４１２）及び８．３ｍＭ（ＲＤ０５５４２２）であることが判明した。
【０１１３】
実施例１２ ＦＧＤＨをコードするＤＮＡの単離
（１）染色体ＤＮＡの抽出
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １％、Ｇｌｕｃｏｓｅ ２％）５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて２５℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約０．３ｇの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕し、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１％ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、０．７Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ メルカプトエタノール）１２ｍｌに懸濁した。室温で３０分回転撹拌を続けた後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えて攪拌、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）して上清を得た。得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に等量のイソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって析出した染色体ＤＮＡを遠心分離（２０，０００ｇ、１０分、４℃）して得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。
【０１１４】
このようにして得られた染色体ＤＮＡを再び４ｍｌのＴＥに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を２００μｌ加えた後、３７℃、３０分間インキュベートした。次いで、２０ｍｇ／ｍｌ のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）溶液４０μｌを加えて３７℃、３０分間インキュベートした後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えた。攪拌後、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）し、上清を得た。この洗浄操作を２回繰り返した後、得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に対して、その１／１０容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）と２．５倍容量のエタノールを加えて遠心処理（２０，０００ｇ、２０分、４℃）を行うことにより回収した。回収された染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に４００μｌのＴＥ溶液に溶解して濃度約１ｍｇ／ｍｌの染色体ＤＮＡ溶液を得た。
【０１１５】
（２）合成プライマーの設計
配列番号３に示すＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＧＤＨのアミノ酸配列（特許４２９２４８６の配列表において配列番号４で示されるアミノ酸配列）やその他公知のアミノ配列を参考にして、比較的アミノ酸配列が保存されていると判断できる領域に基づいて、ミックス塩基を含有する縮重プライマー、ｄｅｇｅＦ１１、ｄｅｇｅＲ１３（配列番号４、５）を合成した。
【０１１６】
（３）ＰＣＲ法によるＦＧＤＨ遺伝子部分配列の取得
上記（１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。プライマーには、上記（２）で作製したプライマー（配列番号４、５）を使用した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１５００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたＤＮＡ断片を精製し、クローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＴＡ２にクローニングし、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、形質転換体を取得した。
【０１１７】
該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、当該酵素遺伝子に相当する領域の塩基配列解析を実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用い、製品の使用説明書に従ってシークエンス反応を行った。解析にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０シークエンサー（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。当該酵素遺伝子の塩基配列解析を実施するためには、配列解析用プライマー、上記で使用したプライマー（配列番号４、５）、Ｐ７（配列番号６）及びＰ８（配列番号７）を使用した。その塩基配列解析の結果、約１５００ｂｐのＦＧＤＨの部分配列を取得した。
【０１１８】
（４）ＦＧＤＨ遺伝子全長配列の取得
上記ようにして得られた、塩基配列に基づき、開始コドンを含むＮ末端方向の遺伝子配列取得のために、遺伝子の外側方向に向けた２種類のプライマー（配列番号８、９）を新たに設計した。このインバースＰＣＲ用プライマーを用い、上記（１）で得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとで、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、開始コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。また、終止コドンを含むＣ末端方向の遺伝子配列取得のためには、上記記載のインバースＰＣＲ用プライマー（配列番号１０、１１）を用い、上記（１）で得たゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型として、上記記載、同様の方法でＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、終止コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。
【０１１９】
（５）Ｎ末端及びＣ末端の決定
Ｎ末端の決定は、公知の情報を最大限に活用し、アミノ酸配列の相同性、塩基配列の長さ等の観点から（４）で得られた配列と多角的な比較を行い、開始コドンを判断した。また、Ｃ末端の決定も同様の方法にて判断した。
【０１２０】
（６）Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＧＤＨ遺伝子全長を増幅させるためのプライマー設計
（５）での判断結果に基づき、開始コドンの上流にアニーリングするプライマー、５ＵＴＲ Ｆ１（配列番号１２）及び終止コドンの下流にアニーリングするプライマー、３ＵＴＲ Ｒ１（配列番号１３）を設計した。
【０１２１】
（７）ｃＤＮＡ配列の決定
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １％、Ｇｌｕｃｏｓｅ ２％）５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて２５℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約０．３ｇの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。続いて、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写のプライマーには、（６）で作製した３ＵＴＲ Ｒ１（配列番号１３）を用いた。続いて、上記で合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。プライマーには、上記（６）で作製したプライマー（配列番号１２、１３）を使用した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２０５０ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたＤＮＡ断片の配列解析を、上記記載と同様にして行った。なお、ここでのｃＤＮＡ配列解析には、３クローンの異なるプラスミド由来の塩基配列を解析した。なお、塩基配列の解析には、配列解析用プライマー（配列番号１４，１５）も使用した。このようにして、配列番号２に示すＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨのｃＤＮＡ配列を決定した。また、当該ｃＤＮＡ配列がコードする当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【０１２２】
（８）ＲＤ０５５４２２株由来のＦＧＤＨのＤＮＡ及びアミノ酸配列決定
上記（１）〜（７）と同じ作業をＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２株についても実施して、ＲＤ０５５４２２株由来のＦＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１６）及びｃＤＮＡ配列（配列番号１７）を決定した。
【０１２３】
（９）公知のＧＤＨとのアミノ酸配列比較
上記（７）で明らかにしたアミノ酸配列と公知のアスペルギルスオリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨとの同一性は各々３５％及び３４％であった。アミノ酸配列解析は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出した。
【０１２４】
実施例１３ Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨ及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨのサッカロマイセス・セルビジエでの発現及び酵素活性の確認
【０１２５】
（１）発現ベクターの構築
実施例１２で明らかにしたＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＦＧＤＨ遺伝子（配列番号２）又はＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２株由来のＦＧＤＨ遺伝子(配列番号１７)を含む組み換えプラスミドｐＣＳＧＤＨを鋳型とし、Ｎ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩの切断部位を結合させた配列を有するプライマー（配列番号１８及び配列番号１９）を用いて、オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＹＥＳ３（インビトロジェン社）と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出した。このようにして、サッカロマイセス・セルビジエでの大量発現を可能とするように設計された発現ベクターを構築した。
【０１２６】
（２）形質転換
続いて、サッカロマイセス・セルビジエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）に形質転換した。なお、方法は、ｐＹＥＳ３のマニュアルを参考にした。
【０１２７】
（３）培養
得られた形質転換体は１０Ｌ容ジャーファーメンター（ＢＭＳ１０−ＰＩ／バイオット）を使用して培養した。種培養は、マニュアルに記載の通り、実施し、本培養は（３％ 酵母エキス、１％ ポリペプトン、３％ ガラクトース）培地にて、培地液量６．０Ｌ、攪拌数４００ｒｐｍ、温度２５℃、通気量１．０ｖｖｍの条件で培養した。この培養液を粗酵素液として、ＧＤＨ活性を確認したところ、本発明のＦＧＤＨが発現されていることが確認された。
【０１２８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１２９】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明のＦＧＤＨは基質特異性に優れ、グルコース量をより正確に測定することを可能
にする。従って本発明のＦＧＤＨは血糖値の測定等に好適といえる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコース脱水素酵素に関する。詳しくは、本発明はフラビン結合型グルコース脱水素酵素、それをコードするＤＮＡ、及び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造方法、当該酵素を使用したグルコース測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極及び酵素反応層を形成したものである。
【０００３】
ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられる。ＧＯ（ＥＣ １．１．３．４）を用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨでもピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））は、溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。
【０００４】
フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）は、溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しない。特許文献１〜６や非特許文献１〜６には、アスペルギルス・テレウスやアスペルギルス・オリゼ由来のもの、あるいは、それらを改変したもの等が知られている。しかし、これらの酵素は、キシロースに対する反応性が比較的高いため（特許文献１）、キシロース負荷試験を受けている者の血糖を測定する場合には改善の余地がある。
【０００５】
近年、このような問題点の解決を図るべく、ＧＯとＧＤＨの長所を併せ持つ改変型ＧＤＨ（特許文献７）等が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１２３９
【特許文献３】特開２００７−２８９１４８
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０
【特許文献５】ＷＯ２００８／０５９７７７
【特許文献６】ＷＯ２０１０／１４０４３１
【特許文献７】ＷＯ２０１１／０６８０５０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のような現状の下、本発明者等は、ＳＭＢＧにおける使用により適した、新規なグルコース脱水素酵素を開発すべく日夜検討を重ね、優れた基質特異性に加えて、Ｄ−グルコースに対する親和性が高い酵素を利用することで、測定時間を短縮し、且つ、少量の酵素量で正確な血糖値の測定が可能になるという課題を見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは、日夜検討を重ね、これまでにグルコース脱水素酵素を生産することが報告されていない多くの微生物についてスクリーニングした結果、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に帰属する微生物がグルコース脱水素酵素活性を有することを見出した。そして、本発明者等は、更なる研究を重ね、シルシネラ属に属する微生物が産生するフラビン結合型ＧＤＨを単離精製し、その特性を調べた結果、優れた基質特異性と高いＤ−グルコースに対する親和性とを備えていることを見出した。更に、本発明者等は、単離した酵素のアミノ酸配列及び遺伝子配列を決定し、それらの配列
がこれまでに報告されているＦＡＤＧＤＨのものとは異なる新規な酵素であることを突き止めた。
【００１０】
本発明は、係る知見に基づき、更なる研究と改良を重ねた結果完成したものであり、代表的な本発明は、以下の通りである。
項１．下記の特性（１）及び（２）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約７０ｋＤａ
（２）Ｋｍ値： Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
項２．更に下記の特性（３）を備える、項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（３）基質特異性： Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１．７％以下である
項３．更に下記の特性（４）を備える、項１又は２に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（４）至適活性温度： ３７〜４５℃
項４．更に下記の特性（５）〜（７）から成る群より選択される１種以上の特性を備える、項１〜３のいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
（５）至適活性ｐＨ： ６．５
（６）ｐＨ安定性： ｐＨ５〜７の範囲で安定
（７）温度安定性： ４０℃以下で安定
項５．更に下記の特性（８）を備える、項１〜４のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（８）由来： シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物に由来する
項６．シルシネラ属に分類される微生物を培養すること、及び
グルコース脱水素酵素を回収すること
を含む、項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項７. 下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
項８．以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、
且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項９．項８に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項１０．項９に記載のベクターを含む形質転換体。
項１１．項１０に記載の形質転換体を培養することを含む、項７に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項１２．項１〜５及び７のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項１３．項１〜５及び７のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項１４．項１〜５及び７のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＧＤＨ」と称する場合もある。）は、グルコース脱水素酵素活性を有し、Ｄ−グルコースとの親和性が高い（即ち、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が有意に低い）ため、より少ない酵素量で試料中のＤ−グルコース濃度をより短時間で測定することを可能にする。また、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−キシロースに対する反応性が有意に低いため、試料中にＤ−グルコースとＤ−キシロースが共存する場合であってもグルコース量又は濃度を正確に測定することを可能にする。従って、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−グルコースを含むあらゆる試料（例えば、血液や食品（調味料や飲料等））におけるグルコース濃度を正確に測定することを可能にする。更に本発明のＤＮＡは、本発明のＦＧＤＨをコードするため、遺伝子工学的手法を用いて、効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２株から精製したＦＧＤＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す。
【図２】Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨをＦ−グリコシダーゼで糖鎖消化してＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す。
【図３−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。
【図３−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。
【図４−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨの活性に対する温度の影響を示す。
【図４−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの活性に対する温度の影響を示す。
【図５−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図５−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図６−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨの熱安定性を測定した結果を示す。
【図６−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの熱安定性を測定した結果を示す。
【図７−１】ＮＢＲＣ６４１２由来ＦＧＤＨのＤ−グルコースに関するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを示す。
【図７−２】ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨのＤ−グルコースに関するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
１．フラビン結合型グルコース脱水素酵素
１−１．グルコース脱水素酵素活性
フラビン結合型グルコース脱水素酵素とは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本明細書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＦＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
【００１５】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。例えば、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができる。
【００１６】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
・５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液 ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
・２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
・２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
・１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２０．５ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍＬ、ＰＭＳ溶液２．０ｍＬ、Ｄ―グルコース溶液５．９ｍＬを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＦＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＧＤＨ溶液の代わりにＦＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＦＧＤＨ活性を求める。ここでＦＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
【００１７】
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×3.1×希釈倍率｝／｛16.3×0.1×1.0｝
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示をしない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
【００１８】
本発明のＦＧＤＨは、フラビンを補欠分子族として要求するフラビン結合型のＧＤＨである。
【００１９】
本発明のＦＧＤＨは、単離されたＦＧＤＨ又は精製されたＦＧＤＨであることが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明の酵素（ＦＧＤＨ）に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＦＧＤＨは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
【００２０】
１−２．ポリペプチド
本発明のＦＧＤＨは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【００２１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、実施例５に示される通り、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２に由来するＦＧＤＨのアミノ酸配列であり、下記１−３〜１−８の特性を全て満たす。
【００２２】
上記（ｂ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで「数個」とは、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは後述する１−３〜１−１０（特に１−３〜１−４）の特性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、例えば、２〜１２７個、好ましくは２〜９６個、より好ましくは２〜６４個、更に好ましくは２〜３２個であり、より更に好ましくは２〜２０個、一層好ましくは２〜１５個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
【００２３】
上記（ｂ）のポリペプチドの具体例としては、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨのアミノ酸配列であり、第５８２位のアミノ酸がグリシンではなくアスパラギン酸である点でのみ、配列番号１のアミノ酸配列と相違する。
【００２４】
アミノ酸の置換の種類は、特に制限されないが、ＦＧＤＨの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００２５】
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して後述する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＦＧＤＨを得ることができる。バリアントＦＧＤＨには、ＦＧＤＨを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
【００２６】
また、ＦＧＤＨの活性を維持するという観点からは、ＦＧＤＨの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。
【００２７】
上記（ｃ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持することを限度で、好ましくは上記１−２〜１−８の特性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＦＧＤＨが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配
列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。上記（ｃ）のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号１６で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。
【００２８】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて、算出することができる。
【００２９】
１−３．基質特異性
本発明のＦＧＤＨは、基質特異性に優れている。特に、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する反応性を基準とした場合に、少なくともＤ−キシロースに対する反応性が有意に低い。より具体的に、本発明のＦＧＤＨは、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、Ｄ−キシロースに対する反応性が１．７％以下であることが好ましく、より好ましくは１．６％以下であり、より好ましくは１．３％以下であり、更に好ましくは１．２％以下である。
【００３０】
本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−キシロースに対する反応性が低いことに加えて、Ｄ−ガラクトース及びマルトースに対する反応性も低いことが好ましい。本発明のＦＧＤＨのＤ−ガラクトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、通常５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下、更に好ましくは１．１％以下、特に好ましくは０．５％以下である。
【００３１】
本発明のＦＧＤＨのマルトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、通常５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下であり、更に好ましくは１％以下であり、特に好ましくは０．６％以下である。
【００３２】
上記本発明のＦＧＤＨのＤ−グルコースに対する反応性を基準としたＤ−キシロース、Ｄ−ガラクトース及びマルトースに対する反応性の下限値は、特に制限されないが、０％又は０％に限りなく近い値を下限値とすることができる。
【００３３】
ＦＧＤＨの各糖類に対する反応性は、上記１−１．に示すグルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法において、Ｄ−グルコースを他の糖（例えば、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、又はマルトース）に置き換えて、Ｄ−グルコースの場合の活性を比較することにより求めることができる。但し、比較する場合の各糖類の濃度は５０ｍMである。
【００３４】
以上のような優れた基質特異性を有する本発明のＦＧＤＨは、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨによれば試料中にマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースなどの夾雑物が存在する場合であっても目的のＤ−グルコースの量を正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適したものであるといえ、当該用途も含め様々な用途に適用可能であり、汎用性が高い。
【００３５】
１−４．Ｄ−グルコースに対する親和性
本発明のＦＧＤＨは、本来の基質であるＤ−グルコースに対する親和性が高いことが好ましい。親和性が高いことにより、試料中のＤ−グルコースの濃度が低い場合であっても、上述する触媒反応を進めることができ、より正確なＤ−グルコース濃度の測定、より短時間での測定、及びより少ない酵素量での測定に資するからである。ＦＧＤＨのＤ−グルコースに対する親和性は、Ｋｍ値によって示される。Ｋｍ値は、いわゆるミカエリス・メンテン式から求められる値であり、具体的には、上記１−１．に示す活性測定方法においてＤ−グルコースの濃度を変化させて各濃度における活性を測定し、ラインウィーバー・バーク・プロットを作成することによって求めることができる。
【００３６】
酵素の反応速度論から判断して、Ｋｍ値が低いほど、酵素は基質に対する親和性が高く、基質濃度が低い場合でも基質との複合体を形成することができ、より早い速度で触媒反応を進めることができる。本発明のＦＧＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、２０ｍＭ以下であることが好ましく、より好ましくは１５ｍＭ以下、更に好ましくは１４ｍＭ以下、更に好ましくは１３ｍＭ以下であり、更に好ましくは１２．５ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下、更に好ましくは８．５ｍＭ以下である。
【００３７】
１−５．至適活性ｐＨ
他の実施形態において、本発明のＦＧＤＨの至適活性ｐＨは、後述する実施例に示す通り、ｐＨ６．５であることが好ましい。ここで至適活性ｐＨが６．５であるとは、典型的に至適活性ｐＨが６．５付近であり、ある程度の許容可能な幅を有することを意味する。本明細書において、至適活性ｐＨは、後述の実施例に示すように、酵素濃度１００Ｕ／ｍＬでＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファーを用いて酵素活性を測定することで求められる。
【００３８】
１−６．至適活性温度
他の実施形態において、本発明のＦＧＤＨの至適活性温度は、３７℃〜４５℃であることが好ましい。ここで「３７℃〜４５℃」とは、典型的に至適活性温度が３７〜４５℃付近であり、更にある程度の許容可能な幅を有することを意味する。他の観点から、本発明のＦＧＤＨは、４５℃における酵素活性を基準（１００％）として、５０℃における酵素活性が６０％以上であることが好ましく、６５％以上であることがより好ましい。更に他の観点から、本発明のＦＧＤＨは、３０℃〜５０℃の範囲における酵素活性が、４５℃における酵素活性を基準として、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることがより好ましい。本明細書において、至適活性温度は、後述する実施例に示す通り、酵素濃度０．１Ｕ／ｍＬでＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中における酵素活性を測定することにより求められる。
【００３９】
１−７．ｐＨ安定性
本明細書において、特定のｐＨ条件の下、１０Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上である場合に、当該酵素は、当該ｐＨ条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ５〜７の範囲で安定であることが好ましい。本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ５〜７の範囲で安定である限り、更に、広い範囲（例えば、ｐＨ３〜７）で安定であってもよい。一実施形態において、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ５〜７の範囲又はこれよりも広い範囲（例えば、ｐＨ３．５〜７．５）で前記処理をした場合に、残存酵素活性が９０％以上であることがより好ましい。
【００４０】
１−８．温度安定性
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えば、酢酸カリウムバッファー（ｐＨ５．０））で１００Ｕ／ｍＬの酵素を１５分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して実質的な低下が認められない（つまり約９０％以上を維持する）とき、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、０℃〜４０℃において安定であることが好ましい。
【００４１】
本発明のＦＧＤＨは、上記１−３〜１−８及び下記１−９で示される特徴のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を更に備え、より更に好ましくはその４つ以上を備え、一層好ましくはその５つ以上を備え、より一層好ましくはその６つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のＦＧＤＨは、上記１−３〜１−８及び下記１−９の特性を如何なる組合せで備えていても良い。
【００４２】
１−９．分子量
他の実施形態において、本発明のＦＧＤＨを構成するポリペプチド部分の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約７０ｋＤａであることが好ましい。「約７０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常７０ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のＦＧＤＨを意味する。微生物によって生産された本発明のＦＧＤＨが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質
的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ＦＧＤＨに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ＦＧＤＨが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
【００４３】
糖鎖結合型ＦＧＤＨから糖鎖を除去する手段は、特に制限されないが、例えば、後述する実施例に示すように、糖鎖結合型のＦＧＤＨを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７℃で６時間処理することにより実施することができる。
【００４４】
本発明のＦＧＤＨが糖鎖に結合している場合、その分子量は、グルコース脱水素酵素活性、基質特異性、及びＤ−グルコースに対する親和性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明ＦＧＤＨの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定において、９０，０００〜１１０，０００Ｄａであることが好ましい。糖鎖結合型のＦＧＤＨは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高め、水に溶け易くするという観点から好ましい。
【００４５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。
【００４６】
１−１０．由来
代表的な本発明のＦＧＤＨは、シルシネラ属に帰属する微生物から単離された。よって、本発明のＦＧＤＨは、シルシネラ属に帰属する微生物に由来することが好ましい。本発明のＦＧＤＨが由来し得る具体的なシルシネラ属に分類される微生物種には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ等が含まれる。これらの種の属する具体的な菌株としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４
８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２等が挙げられる。この中でも、本発明のＦＧＤＨは、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２に由来することが好ましい。
【００４７】
２．フラビン結合型グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記１のＦＧＤＨをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列をからなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４８】
本書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
【００４９】
本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは上記１−３〜１−８の特性の少なくとも１つ（特に、上記１−２〜１−３の特性）を備える限り、配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。このような本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番号１７で示される塩基配列を含むＤＮＡを挙げることが出来る。配列番号１７で示される塩基配列は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨをコードし、配列番号２の塩基配列と５塩基のみが相違する。
【００５０】
塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００５１】
本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がグルコース脱水素活性を有し、好ましくは上記１−２〜１−８の特性の少なくとも１つを備える限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）を参照して設定することができる。
【００５２】
具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液とし
て５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができる。
【００５３】
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定するこ
とによって容易に取り除くことができる。
【００５４】
上記（Ｅ）及び（Ｆ）のＤＮＡに関し、「数個」とは上記１−２に説明したものと同義である。
【００５５】
好適な一実施形態において、本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。
【００５６】
本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２）を基に、化学的DNA合成法により製造、取得することができるが、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる（Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
【００５７】
標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のＦＧＤＨが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science122, 778 (1983)等〕。
【００５８】
ｃＤＮＡライブラリーを調整するための起源微生物は、本発明ＦＧＤＨを発現する微生物であれば特に制限れないが、好ましくは、シルシネラ属に分類される微生物である。起源微生物として好適なシルシネラ属種は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ等である。より具体的な起源微生物菌株としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉ
ｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２等が挙げられる。これらの中でもＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２が好ましい。
【００５９】
上記の微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
【００６０】
ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science130, 1350 (1985)〕またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕等の採用が好適である。
【００６１】
ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーも配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
【００６２】
本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のＦＧＤＨを容易に大量に、安定して製造することができる。
【００６３】
３．ベクター
本発明のベクターは、上記２．で説明する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡが組み込まれている。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００６４】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８等）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００６５】
発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００６６】
４．形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記３．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
【００６７】
宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α等が用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス等が例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２等が挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ シルシネラ・シンプレックス等を例示することができる。また、本発明のＦＧＤＨが単離されたシルシネラ属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００６８】
本発明の形質転換体は、好ましくは、上記３．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション、トランスフォーメーションは、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，７１６１−７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，３６６−３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９−３４６（１９８９））、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，１４７０−１４７４（１９８４））等によって実施することができる。
【００６９】
本発明の形質転換体は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することが可能となる。
【００７０】
５．フラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法
本発明のＦＧＤＨは、本発明のＦＧＤＨの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記１．に示すシルシネラ属に帰属する野生型の微生物及び上記４．に示す形質転換体を好適に利用することができる。
【００７１】
具体的なシルシネラ属に分類される微生物としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２が挙げられる。
【００７２】
上記のシルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンターに保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
【００７３】
培養法及び培養条件は、本発明のＦＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００７４】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸等を培地に添加してもよい。
【００７５】
シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物を培養して本発明のＦＧＤＨを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００７６】
培地のｐＨは、例えば、約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００７７】
上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。シルシネラ属に属する微生物が産生するフラビン結合型グルコース脱水素酵素は基本的に分泌型のタンパク質である。
【００７８】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理等によって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００７９】
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン等による分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤等によるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００８０】
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等によるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００８１】
なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製等）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性等のうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。各精製工程では原則としてＦＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験等によって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。
【００８２】
本発明のＦＧＤＨを精製標品とする場合は、例えば、比活性が３００〜５１０（Ｕ／ｍｇ）、好ましくは比活性が４００〜５１０（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００８３】
組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００８４】
６．グルコースの測定方法
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法を既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記１−１．に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従って、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のＦＧＤＨを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を揚げることができる。
【００８５】
後述するセンサの形態でのグルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして実施することができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８６】
７．グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のＦＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のＦＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００８７】
８．グルコースセンサ
本発明はまた、本発明のＦＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極等を用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー等があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００８８】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８９】
なお、本明細書において「プロダクト」とは、使用者が当該用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むものを意味する。
【００９０】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００９１】
実施例１ 菌株の復元
独立行政法人製品評価技術基盤機構から、シルシネラ属に帰属する幾つかの菌株を入手した。Ｌ−乾燥標品の菌株は、アンプルを開封し、復元水１００μＬを注入し、乾燥菌体を懸濁した後、懸濁液を復元培地に滴下し、２５℃で３日間から７日間、静置培養することで菌株を復元させた。復元水としては、滅菌水（オートクレーブで１２０℃、２０分間処理した蒸留水）使用し、復元培地としては、ＤＰ培地（デキストリン ２．０％、ポリペプトン １．０％、ＫＨ２ＰＯ４ １．０％、アガロース １．５％）を使用した。グリセロールストックされた菌株は、１００μｌをＤＰ寒天培地にプレーティングして復元させた。
【００９２】
実施例２ 培養上清の回収
小麦胚芽２ｇ、水２ｍＬを含む培地をオートクレーブで１２０℃、２０分間、滅菌した固体培地に、実施例１で復元させたＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属の各菌株を一白金耳植菌し、２５℃で３日間から７日間程度、静置培養した。培養後、２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を４ｍＬを添加し、ボルテックスで十分に懸濁した。懸濁液に少量のガラスビーズを加えた後、ビーズショッカー（安井器械（株）製）で３，０００ｒｐｍ、３分間×２回の条件で破砕し、４℃、２，０００×ｇ、５分間の遠心分離して、回収した上清を粗酵素液とした。
【００９３】
実施例３ グルコース脱水素酵素活性の確認
実施例２で得た粗酵素液中のグルコース脱水素酵素活性を、上記１−１．に示したＦＧＤＨ測定方法を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００９４】
【表１】
【００９５】
表１の結果から、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来の粗酵素液にＧＤＨ活性が存在することが確認された。
【００９６】
実施例４ Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来ＦＧＤＨの精製
５０ｍＬのＤＰ液体培地を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地とした。予めＤＰプレート培地で復元したＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２を別個に前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養し、種培養液とした。
【００９７】
次に、６．０Ｌの生産培地（イーストイクストラクト ２．０％、グルコース １％、ｐＨ６．０）を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａで３日間培養した。その後、培養液をろ布でろ過し、菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
【００９８】
懸濁液をフレンチプレス（Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ製）に流速１６０ｍＬ／分で送液し、１０００〜１３００ｂａｒで破砕した。続いて、破砕液に硫酸アンモニウム（住友化学（株）製）を０．２飽和になるように徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に分画分子量１０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株）製）を用いて濃縮し、濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ のゲルを用いて脱塩した。その後、脱塩液に０．５飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、予め０．５飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した４００ｍＬのＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。そして、溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮後、ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、精製酵素を得た。得られた精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐｈａｓｔ Ｇｅｌ １０−１５％ Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ ＧＥヘルスケア製）に供した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２６７ダルトン）、アルドラーゼ（４２，４００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）を用いた。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２に関する結果を図１に示す。
【００９９】
図１に示されるように、単一のバンドが得られたことから、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨが十分に精製されていることが分かる。また分子量マーカーと比較した移動度から、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨの分子量は９０，０００〜１１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１００】
実施例５ 単離されたＦＧＤＨのペプチド部分の分子量
実施例４で精製したＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨを１００℃、１０分間、加熱処理して変性させた後、５ＵのＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス製）で３７℃、１時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。その後、実施例４と同様の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定を行った。分子量マーカーは、実施例４と同じものを使用した（図２）。図２に示される結果から、精製したＦＧＤＨのポリペプチド部分の分子量は約７０，０００ダルトンであることが判明した。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨについても、後述するように、そのアミノ酸配列が、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨのアミノ酸配列と１アミノ酸のみで相違することから、分子量は約７０，０００ダルトンである。
【０１０１】
実施例６ 基質特異性
上述したＦＧＤＨの活性測定法に従い、基質としてＤ−グルコースを用いたときの活性と、比較対象の糖を用いたときの見かけの活性とを比較することにより、精製酵素の基質特異性を調査した。比較対象の糖としてはマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースをそれぞれ使用した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表２に示す。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
表２の結果から、本発明のＦＧＤＨの基質特異性は、Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する見かけの活性は、いずれも２％以下であり、本発明のＦＧＤＨは基質特異性に優れていることが示された。
【０１０４】
実施例７ 至適活性ｐＨ
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを調べた。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨの至適ｐＨは、緩衝溶液として５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ７．５）を用いて測定した。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨの至適ｐＨは、緩衝液として５０ｍＭの酢酸カリウム（ｐＨ５〜５．５）、ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５〜６．５）、リン酸カリウム（ｐＨ６．０〜８．０）を用いて測定した。結果を図３−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び図３−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１０５】
その結果、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ６．５で最も高い見かけの活性値を示し、ｐＨ６．０及び７．０における活性よりもｐＨ６．５における活性の方が高いことから、ｐＨ６．５付近が至適ｐＨであることが示された。
【０１０６】
実施例８ 至適活性温度
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（０．１Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適温度を調べた。緩衝溶液には４２ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃における見かけの活性を求めた。結果を図４−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び４−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１０７】
その結果、本発明のＦＧＤＨは、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃で比較検討した中において、３７℃〜４５℃で最も高い見かけの活性値を示し、５０℃における活性よりも４５℃における活性の方が高かったことから、至適温度は凡そ３７℃〜４５℃付近である。
【０１０８】
実施例９ ｐＨ安定性
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（１０Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ 酢酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０−ｐＨ５．５図中四角黒色印でプロット）、１００ｍＭ リン酸−カリウム緩衝液（ｐＨ５．５−ｐＨ７．５図中四角白色印でプロット）、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０図中三角白色印でプロット）、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５−ｐＨ７．５図中三角黒色印でプロット）を用い、２５℃、１６時間処理した後の見かけの活性の残存率を測定した。結果を図５−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び５−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１０９】
その結果、見かけの活性が最大の残存率を示したｐＨ６．５の残存率を１００％とした場合、相対値で８０％以上の残存率を示したｐＨ範囲は、ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨではｐＨ５．３〜ｐＨ７．２の範囲であり、ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨでは、ｐＨ３．５〜８．０であることが判明した。
【０１１０】
実施例１０ 熱安定性
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて、熱安定性を調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、ＦＧＤＨ酵素液を各温度（４℃、３０℃、４０℃、５０℃）で１５分間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した。結果を図６−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び６−２（ＲＤ０５５４２２）に示す。
【０１１１】
その結果、本発明のＦＧＤＨは４０℃に９８％（ＮＢＲＣ６４１２）及び９４％（ＲＤ０５５４２２）の残存率を示していた。このことから、４０℃以下で安定であることが示された。
【０１１２】
実施例１１ Ｋｍ値の測定
上述したＦＧＤＨの活性測定法において、基質であるＤ−グルコースの濃度を変化させて見かけの活性測定を行い、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを作成し（図７−１（ＮＢＲＣ６４１２）及び図７−２（ＲＤ０５５４２２））Ｋｍ値を算出した。その結果、本発明のＦＧＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、１２．５ｍＭ（ＮＢＲＣ６４１２）及び８．３ｍＭ（ＲＤ０５５４２２）であることが判明した。
【０１１３】
実施例１２ ＦＧＤＨをコードするＤＮＡの単離
（１）染色体ＤＮＡの抽出
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １％、Ｇｌｕｃｏｓｅ ２％）５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて２５℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約０．３ｇの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕し、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１％ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、０．７Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ メルカプトエタノール）１２ｍｌに懸濁した。室温で３０分回転撹拌を続けた後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えて攪拌、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）して上清を得た。得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に等量のイソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって析出した染色体ＤＮＡを遠心分離（２０，０００ｇ、１０分、４℃）して得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。
【０１１４】
このようにして得られた染色体ＤＮＡを再び４ｍｌのＴＥに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を２００μｌ加えた後、３７℃、３０分間インキュベートした。次いで、２０ｍｇ／ｍｌ のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）溶液４０μｌを加えて３７℃、３０分間インキュベートした後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えた。攪拌後、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）し、上清を得た。この洗浄操作を２回繰り返した後、得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に対して、その１／１０容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）と２．５倍容量のエタノールを加えて遠心処理（２０，０００ｇ、２０分、４℃）を行うことにより回収した。回収された染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に４００μｌのＴＥ溶液に溶解して濃度約１ｍｇ／ｍｌの染色体ＤＮＡ溶液を得た。
【０１１５】
（２）合成プライマーの設計
配列番号３に示すＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＧＤＨのアミノ酸配列（特許４２９２４８６の配列表において配列番号４で示されるアミノ酸配列）やその他公知のアミノ配列を参考にして、比較的アミノ酸配列が保存されていると判断できる領域に基づいて、ミックス塩基を含有する縮重プライマー、ｄｅｇｅＦ１１、ｄｅｇｅＲ１３（配列番号４、５）を合成した。
【０１１６】
（３）ＰＣＲ法によるＦＧＤＨ遺伝子部分配列の取得
上記（１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。プライマーには、上記（２）で作製したプライマー（配列番号４、５）を使用した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１５００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたＤＮＡ断片を精製し、クローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＴＡ２にクローニングし、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、形質転換体を取得した。
【０１１７】
該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、当該酵素遺伝子に相当する領域の塩基配列解析を実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用い、製品の使用説明書に従ってシークエンス反応を行った。解析にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０シークエンサー（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。当該酵素遺伝子の塩基配列解析を実施するためには、配列解析用プライマー、上記で使用したプライマー（配列番号４、５）、Ｐ７（配列番号６）及びＰ８（配列番号７）を使用した。その塩基配列解析の結果、約１５００ｂｐのＦＧＤＨの部分配列を取得した。
【０１１８】
（４）ＦＧＤＨ遺伝子全長配列の取得
上記ようにして得られた、塩基配列に基づき、開始コドンを含むＮ末端方向の遺伝子配列取得のために、遺伝子の外側方向に向けた２種類のプライマー（配列番号８、９）を新たに設計した。このインバースＰＣＲ用プライマーを用い、上記（１）で得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとで、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、開始コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。また、終止コドンを含むＣ末端方向の遺伝子配列取得のためには、上記記載のインバースＰＣＲ用プライマー（配列番号１０、１１）を用い、上記（１）で得たゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型として、上記記載、同様の方法でＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、終止コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。
【０１１９】
（５）Ｎ末端及びＣ末端の決定
Ｎ末端の決定は、公知の情報を最大限に活用し、アミノ酸配列の相同性、塩基配列の長さ等の観点から（４）で得られた配列と多角的な比較を行い、開始コドンを判断した。また、Ｃ末端の決定も同様の方法にて判断した。
【０１２０】
（６）Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＧＤＨ遺伝子全長を増幅させるためのプライマー設計
（５）での判断結果に基づき、開始コドンの上流にアニーリングするプライマー、５ＵＴＲ Ｆ１（配列番号１２）及び終止コドンの下流にアニーリングするプライマー、３ＵＴＲ Ｒ１（配列番号１３）を設計した。
【０１２１】
（７）ｃＤＮＡ配列の決定
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １％、Ｇｌｕｃｏｓｅ ２％）５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて２５℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約０．３ｇの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。続いて、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写のプライマーには、（６）で作製した３ＵＴＲ Ｒ１（配列番号１３）を用いた。続いて、上記で合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。プライマーには、上記（６）で作製したプライマー（配列番号１２、１３）を使用した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２０５０ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたＤＮＡ断片の配列解析を、上記記載と同様にして行った。なお、ここでのｃＤＮＡ配列解析には、３クローンの異なるプラスミド由来の塩基配列を解析した。なお、塩基配列の解析には、配列解析用プライマー（配列番号１４，１５）も使用した。このようにして、配列番号２に示すＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨのｃＤＮＡ配列を決定した。また、当該ｃＤＮＡ配列がコードする当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【０１２２】
（８）ＲＤ０５５４２２株由来のＦＧＤＨのＤＮＡ及びアミノ酸配列決定
上記（１）〜（７）と同じ作業をＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２株についても実施して、ＲＤ０５５４２２株由来のＦＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１６）及びｃＤＮＡ配列（配列番号１７）を決定した。
【０１２３】
（９）公知のＧＤＨとのアミノ酸配列比較
上記（７）で明らかにしたアミノ酸配列と公知のアスペルギルスオリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨとの同一性は各々３５％及び３４％であった。アミノ酸配列解析は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出した。
【０１２４】
実施例１３ Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２由来のＦＧＤＨ及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２由来のＦＧＤＨのサッカロマイセス・セルビジエでの発現及び酵素活性の確認
【０１２５】
（１）発現ベクターの構築
実施例１２で明らかにしたＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＦＧＤＨ遺伝子（配列番号２）又はＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２株由来のＦＧＤＨ遺伝子(配列番号１７)を含む組み換えプラスミドｐＣＳＧＤＨを鋳型とし、Ｎ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩの切断部位を結合させた配列を有するプライマー（配列番号１８及び配列番号１９）を用いて、オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＹＥＳ３（インビトロジェン社）と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出した。このようにして、サッカロマイセス・セルビジエでの大量発現を可能とするように設計された発現ベクターを構築した。
【０１２６】
（２）形質転換
続いて、サッカロマイセス・セルビジエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）に形質転換した。なお、方法は、ｐＹＥＳ３のマニュアルを参考にした。
【０１２７】
（３）培養
得られた形質転換体は１０Ｌ容ジャーファーメンター（ＢＭＳ１０−ＰＩ／バイオット）を使用して培養した。種培養は、マニュアルに記載の通り、実施し、本培養は（３％ 酵母エキス、１％ ポリペプトン、３％ ガラクトース）培地にて、培地液量６．０Ｌ、攪拌数４００ｒｐｍ、温度２５℃、通気量１．０ｖｖｍの条件で培養した。この培養液を粗酵素液として、ＧＤＨ活性を確認したところ、本発明のＦＧＤＨが発現されていることが確認された。
【０１２８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１２９】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明のＦＧＤＨは基質特異性に優れ、グルコース量をより正確に測定することを可能
にする。従って本発明のＦＧＤＨは血糖値の測定等に好適といえる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特性（１）及び（２）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約７０ｋＤａ
（２）Ｋｍ値： Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
【請求項２】
更に下記の特性（３）を備える、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（３）基質特異性： Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１．７％以下である
【請求項３】
更に下記の特性（４）を備える、請求項１又は２に記載のフラビン結合型グルコース脱水
素酵素。
（４）至適活性温度： ３７〜４５℃
【請求項４】
更に下記の特性（５）〜（７）から成る群より選択される１種以上の特性を備える、請求項１〜３のいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
（５）至適活性ｐＨ： ６．５
（６）ｐＨ安定性： ｐＨ５〜７の範囲で安定
（７）温度安定性： ４０℃以下で安定
【請求項５】
更に下記の特性（８）を備える、請求項１〜４のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（８）由来： シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物に由来する
【請求項６】
シルシネラ属に分類される微生物を培養すること、及びグルコース脱水素酵素を回収することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【請求項１】
下記の特性（１）及び（２）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約７０ｋＤａ
（２）Ｋｍ値： Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
【請求項２】
更に下記の特性（３）を備える、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（３）基質特異性： Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ−キシロースに対する反応性が１．７％以下である
【請求項３】
更に下記の特性（４）を備える、請求項１又は２に記載のフラビン結合型グルコース脱水
素酵素。
（４）至適活性温度： ３７〜４５℃
【請求項４】
更に下記の特性（５）〜（７）から成る群より選択される１種以上の特性を備える、請求項１〜３のいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
（５）至適活性ｐＨ： ６．５
（６）ｐＨ安定性： ｐＨ５〜７の範囲で安定
（７）温度安定性： ４０℃以下で安定
【請求項５】
更に下記の特性（８）を備える、請求項１〜４のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（８）由来： シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に分類される微生物に由来する
【請求項６】
シルシネラ属に分類される微生物を培養すること、及びグルコース脱水素酵素を回収することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【公開番号】特開２０１３−９０６２１（Ｐ２０１３−９０６２１Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７７４９７（Ｐ２０１２−１７７４９７）
【出願日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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