新規なコレステロールエステラーゼの製造方法
【課題】広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、安定性が高く、至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、比活性が高いコレステロールエステラーゼを効率よく製造する方法の提供。
【解決手段】Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株）を培養し、コレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
【解決手段】Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株）を培養し、コレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコレステロールエステラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは人体の各臓器および各器官に広く分布している。高コレステロール血症は、動脈硬化、心筋梗塞等と関連し、低コレステロール血症は悪液質、甲状腺機能昂進等と関連するので、特に血中コレステロール濃度の把握は臨床医学的に重要である。
従来、血中コレステロールを測定する酵素法は、コレステロールオキシダーゼを用いた方法（例えば、非特許文献１参照）と、コレステロールデヒドロゲナーゼを用いた方法（例えば特許文献１又は特許文献２参照）が報告されている。
血中コレステロールとしては、遊離コレステロールと脂肪酸コレステロールエステルが存在する。コレステロールオキシダーゼ（以下ＣＯＤと略する場合がある）とコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下ＣＤＨと略する場合がある）は、遊離のコレステロールのみに作用して酸化或いは還元するため、酵素法を用いて血中コレステロールを測定する場合には、コレステロールエステラーゼ（以下ＣＥと略する場合がある）でコレステロールエステルを加水分解してコレステロールを遊離させなければならない。
ＣＥは、これまでにシュードモナス属（特許文献３〜６など参照）、ストレプトミセス属（特許文献７参照）、ノカルディア属（特許文献８参照）、カワラタケ（特許文献９参照）、スエヒロタケ（特許文献１０参照）、ブルクホルデリア属（特許文献１１参照）、キサントモナス属（特許文献１１参照）などを由来とするものが知られている。
ＣＥを、血中コレステロールの測定などの臨床診断試薬用酵素として利用する場合、ＣＥが以下の性質を持つと有利である。
１）広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質。
２）液体中での高い保存安定性。
３）広い至適ｐＨと高いｐＨ安定性。
４）微生物の単位培養当たりの酵素生産量が大きい事とともに、単位タンパク質当たりの酵素活性（比活性）が高い事。
これらの性質が有利な理由は、順に、
１）被験対象液中、例えば血中のコレステロールエステルの脂肪酸成分は、リノール酸、オレイン酸、及びパルミチン酸を中心として、他にもアラキドン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、及びミリスチン酸などの広範な種類が含まれており、これらを加水分解する必要がある為。
２）臨床診断試薬は液状で長期間保存できると利便性が高い為。
３）臨床診断試薬組成の検討に際して、原料や試薬組成条件の選択の幅が広がる為。
４）経済性が良い為。特に、比活性が高い性質は製造上、例えば、イ）不要な混在物質の割合を減らす事が容易である、ロ）カラムクロマトグラフィーに用いる樹脂が少なくて済み精製が容易である、ハ）遺伝子組み換え体にした場合、高い酵素の発現量が期待できる、など有利である。
例えば、非特許文献２には、シュードモナス属エルギノーサ由来ＣＥの比活性は８．５Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献６には、シュードモナス属フルオレッセンス由来ＣＥは０．１０１Ｕ／ｍｇ、シュードモナス属ストゥッツェリー属由来ＣＥの比活性は７９６Ｕ／ｍｇ以上との報告があり、特許文献５には、シュードモナス属由来ＣＥは０．２４Ｕ／ｍｇとの報告がある一方で非特許文献３には、１５．２Ｕ／ｍｇとの報告がある。又、特許文献７には、ストレプトミセス属由来ＣＥの比活性は５Ｕ／ｍｇとの報告がある一方で非特許文献４には、７８．８Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献９には、カワラタケ由来ＣＥの比活性は５．５１Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献１０には、スエヒロタケ由来ＣＥの比活性は２．５Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献１１には、ブルクホルデリア属由来ＣＥの比活性は５１Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献１２には、キサントモナス属由来ＣＥの比活性は８５．６Ｕ／ｍｇとの報告がある。
これらのうち、比活性が比較的高いストレプトミセス属由来ＣＥは培養力価が０．０５Ｕ／ｍｌ以下である（非特許文献４）ために高い経済性があるとは言えない。キサントモナス属由来ＣＥは、キサントモナス属細菌は斑点細菌病、黒腐病、又は褐班細菌病などの植物病原細菌である場合が多い事を考慮すれば容易に産業利用できるとは言い難い。シュードモナス属ストゥッツェリー属由来ＣＥは３５℃から失活が認められ、４５℃で約４０％失活する（特許文献６）という産業利用しづらい性質を有する。
すなわち、従来のＣＥはその性質上或いは生産上何らかの問題がある。
【特許文献１】特公平２−４９７２０号公報
【特許文献２】特公平５−１７６７９７号公報
【特許文献３】特開昭５０−１５７５８８号公報
【特許文献４】特開昭５６−４２５８６号公報
【特許文献５】特開昭５２−７４８３ 号公報
【特許文献６】特開平９−２５１号公報
【特許文献７】特開昭５３−１０９９９２号公報
【特許文献８】特開昭５７−４３６８６号公報
【特許文献９】特開昭５５−１１４２８８号公報
【特許文献１０】特開昭５３−９３９１号公報
【特許文献１１】特開平１０−１２７２７８号公報
【特許文献１２】特開平１１−５６３５５号公報
【非特許文献１】Charles C. Allain、 Lucy S. Poon、 Cicely S. G. Chan、 W. Richmond、 C. Fu、Enzymatic Determination of Total Serum Cholesterol、Clin. Chem.、20巻、470頁、1974年
【非特許文献２】Akio SUGIHARA、Yuji SHIMADA、Atsuo NOMURA、Tadamasa TERAI、Masaki IMAYASU、Yusuke NAGAI、Toshihiro NAGAO、Yomi WATANABE、Yoshio TOMINAGA、Purification and Characterization of a Novel Cholesterol Esterase from Pseudomonas aeruginosa, with Its Application to Cleaning Lipid-stained Contact Lenses、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry、６６巻、２３４７頁、２００２年
【非特許文献３】Noriyuki Doukyu、Rikizo Aono、Purification of Extracellular Cholesterol Oxidase with High Activity in the Presence of Organic Solvents from Pseudomonas sp. Strain ST-200、Applied and Environmental Microbiology、６４巻、１９２９頁、１９９８年
【非特許文献４】Hongyu Xiang、Naoki Takaya、Takayuki Hoshino、Novel Cholesterol Esterase Secreted by Streptomyces Persists during Aqueous Long-Term Storage、Journal of Bioscience and Bioengineering、１０１巻、１９頁、２００６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、１）広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、２）液体中での保存安定性が高く、３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、且つ４）比活性が高いコレステロールエステラーゼを効率よく製造する方法を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、土壌より分離したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株）から生産されるコレステロールエステラーゼが、所望の性質を有する事を見出した。さらに、その効率的な工業的規模の製造方法を確立して本発明を完成に至った。即ち、本発明は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを培養し、その培養物から広範囲の脂肪酸エステルを加水分解可能な、安定性が高く、至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、比活性が高いＣＥを採取する事を特徴とするＣＥの製造方法に関し、具体的には以下に関する。
〔１〕Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを培養し、培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
〔２〕Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株である上記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕コレステロールエステラーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載のコレステロールエステラーゼの製造方法。
〔４〕配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを宿主に移入し、該宿主を培養し、該培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
〔５〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の製造方法により得られるコレステロールエステラーゼ。
〔６〕下記（ａ）又は（ｂ）のコレステロールエステラーゼをコードするＤＮＡを含有する組み換えベクター。
（ａ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有するコレステロールエステラーゼ。
（ｂ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記特性を有するコレステロールエステラーゼ。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
〔７〕上記〔６〕に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
〔８〕Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株。
〔９〕下記特性を有するコレステロールエステラーゼを製造するための、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４）株の使用。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、１）広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、２）安定性が高く、３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、且つ４）比活性が高いコレステロールエステラーゼを効率よく製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの菌学的性質を以下に示す。＋は陽性、−は陰性、wは反応弱い、を示す。
１．形態学的性質
培養条件： Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
細胞の形態： 桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）
細胞の多様性の有無：−
運動性（鞭毛の着生状態）：＋（極毛）
胞子の有無：−
２．培養的性質
（ａ）培養条件： Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
色：淡黄色
光沢：＋
色素産生：−
（ｂ）培養条件： Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ培地 ３０℃
表面発育の有無：−
培地の混濁の有無：＋
（ｃ）培養条件： ゼラチン穿刺培養 ３０℃
生育状態：＋
ゼラチン液化：−
（ｄ）培養条件： リトマスミルク ３０℃
凝固：−
液化：−
３．生理学的性質
グラム染色性：−
硝酸塩の還元：＋
脱窒反応：−
ＭＲテスト：−
ＶＰテスト：−
インドール産生：−
硫化水素の生成：−
デンプンの加水分解：−
クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：＋
クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：＋
無機窒素源の利用 硝酸塩：＋ｗ
無機窒素源の利用 アンモニウム塩：＋
ウレアーゼ活性：−
カタラーゼ：＋
オキシダーゼ：−
生育の範囲ｐＨ ５：＋
生育の範囲ｐＨ ８：＋
生育の範囲ｐＨ ９：＋
生育の範囲温度２０℃：＋
生育の範囲温度２５℃：＋
生育の範囲温度３７℃：＋
生育の範囲温度４５℃：−
嫌気的生育性：−
Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
４．糖類からの酸産生／ガス産生
Ｌ−アラビノース：＋／−
Ｄ−グルコース：＋／−
Ｄ−フラクトース：＋ｗ／−
マルトース：＋／−
ラクトース：＋／−
Ｄ−ソルビトール：−／−
イノシトール：＋ｗ／−
Ｄ−キシロース：＋／−
Ｄ−マンノース：−／−
Ｄ−ガラクトース：＋／−
シュークロース：＋／−
トレハロース：＋／−
Ｄ−マンニトール：＋ｗ／−
グリセリン：−／−
５．その他の生理学的性質
β−ガラクトシダーゼ活性：＋
アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
リジンデカルボキシラーゼ活性：−
トリプトファンデアミナーゼ活性：−
ゼラチナーゼ活性：−
【０００７】
ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、本菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ由来の１６ＳｒＤＮＡに高い相同性を示し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＬＭＧ１４２９４株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．９％、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ ＬＭＧ１４１９１株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．７％の相同性を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果においても、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＬＭＧ１４２９４株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．９％の相同性を示した。また、本菌株の１６ＳｒＤＮＡと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位３０株の１６ＳｒＤＮＡをもちいて行った簡易分子系統樹解析の結果、本菌株はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの１６ＳｒＤＮＡとほぼ同一の系統枝を形成し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａにも近縁である事が示された。
【０００８】
本菌株は、硝酸塩を還元し、インドールを産生せず、ウレアーゼ活性を示さず、β−ガラクトシダーゼ活性を示した。さらに、４２℃で生育せず、リパーゼ活性およびレシチナーゼ活性を示し、リジンデカルボキシラーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼ活性を示さず、クリステンセンのクエン酸を利用した。また、グリセリンを酸化せず、アラビノース等を酸化した。これらの性状は１６SｒDNA塩基配列において近縁性が示唆されたＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａと類似するが、β−ガラクトシダーゼ活性を示す点においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓと異なり、硝酸塩を還元する点および硫化水素を産生しない点においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａと異なった。
【０００９】
以上の事から、本菌株はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に含まれ、既知種ではＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａに近縁であるが、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析および生理生化学性状試験の結果からはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａよりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓにより近縁であるために本菌株はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓと同定した。
このＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓは、独立行政法人産業技術総合研究所特許性物寄託センターに平成１８年８月３１日付けで寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４を得た。
【００１０】
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、通常の栄養培地を使用でき、炭素源、窒素源、無機塩類等を適当に含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれも使用できる。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、シュークロース、糖蜜、澱粉などの糖質、アルコール類、有機酸類、オリーブ油、大豆油等の油脂、及びこれらの組み合わせを用いることができるが、オレイン酸とミルクカゼインの組み合わせが好ましい。窒素源としてはコーンスティープリカー（ＣＳＬ）、大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の有機態窒素、硫安、硝酸アンモニウム、尿素などの無機態窒素を用いることができるが、酵母エキスが好ましい。無機塩類としては、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄などが使用できるが、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウムの組み合わせが好ましい。更に生育を促進し、酵素生産能を高めるためにエマルゲン、トリトン、ツイーン、スパンなどの適当な界面活性剤を添加してもよい。
【００１１】
培養温度は、微生物が発育し、ＣＥを生産する範囲で適宜変更し得るが、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの場合、好ましくは、１０から４２℃程度、さらに好ましくは２５から３８℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ＣＥが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの場合、通常は２０から５６時間程度である。
【００１２】
培地ｐＨは、菌が発育し、ＣＥを生産する範囲で適宜変更し得るが、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００１３】
また、本発明のＣＥを製造するに当たっては、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを栄養培地で培養して菌体内、培養液中またはその両方にＣＥを産生せしめることができるが、菌体内に産生させる製造方法が好ましい。
通常微生物由来のＣＥやリパーゼなどのエステラーゼ類は菌体外に分泌される分泌型の酵素である。これは、エステラーゼ活性により自らの細胞膜を分解する事を防ぐためと考えられる。したがって、特許文献５〜７、９〜１２、及び非特許文献２〜４には全て菌体外に分泌されたＣＥを培養液中からＣＥを精製し製造する方法が記載されている。
また、ＣＥを菌体内と菌体外に同時に産生する例も報告されているが（特許文献３〜４）、これらも菌体内より菌体外の方がＣＥの生産量が多い為、菌体外に分泌されたＣＥを培養液中から精製し製造する方法が記載されている。
【００１４】
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓは栄養培地で培養して菌体内に蓄積したＣＥを精製して製造する事ができるが、菌体外に分泌されたＣＥを培養液中から精製し製造する方法に比べて次のような利点がある。
１）培地成分がＣＥの製造に影響を与えない。
２）培養液を濃縮するための減圧濃縮装置や濾過濃縮装置などの特別な設備が必要ない。
３）ＣＥを培養液中から沈澱分離するために培養スケールに見合った大量の硫安、アセトン、またはアルコールの使用の必要がない。
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを栄養培地で培養して菌体内にＣＥを産生させた場合、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法、リゾチームなどの酵素的方法、またはアセトンや界面活性剤を用いた化学的な方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤やアセトンなどを添加して本発明のＣＥの抽出液を得る。
【００１５】
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを栄養培地で培養して菌体外にＣＥを産生させた場合、培養液にアセトン、硫安、エタノール、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤などを添加して本発明のＣＥを濃縮するか、もしくは濃縮する事なく精製する。
【００１６】
菌体内から得られた本発明のＣＥの抽出液または菌体外のＣＥは硫安分画、アセトン分画、アルコール分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い本発明のＣＥを得ることができる。
【００１７】
本発明のＣＥは、比活性が高いため、経済性に優れ製造上有利である。好ましい比活性はコレステロールエステルを基質とした場合１００Ｕ／ｍｇ以上であるが、更に好ましくは１２０Ｕ／ｍｇ以上で、最適には１５０Ｕ／ｍｇ以上である。なお、比活性はＣＥの精製純度によって変動する場合がある事は言うまでもない。
以下に、本発明のＣＥの理化学的性質を示す。尚、本発明の実験に使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業社製、国産化学社製、シグマアルドリッチ社製など市販で容易に入手できるものを使用した。また、組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限りタカラバイオ株式会社より購入したものである。
【００１８】
＜作用＞
本発明のＣＥの作用は（式１）の通りであり、１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
コレステロールエステル ＋ Ｈ２Ｏ → コレステロール ＋ 脂肪酸 （式１）
この作用を示す酵素は、ステロールエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１３）に分類される。ステロールエステラーゼの作用は（式２）の通りであり、１分子の水の存在下、１分子のステロールエステルを１分子のステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
ステロールエステル ＋ Ｈ２Ｏ → ステロール ＋ 脂肪酸 （式２）
【００１９】
＜酵素活性測定法＞
反応試薬混合液組成
０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ６．８ ０．６０ｍｌ
０．３５％ ４−アミノアンチピリン溶液 ０．３０ｍｌ
０．２％ フェノール溶液 ０．３０ｍｌ
１００Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ溶液 ０．３０ｍｌ
３％ トリトンＸ−１００溶液 ０．３０ｍｌ
１０Ｕ／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ溶液 ０．６０ｍｌ
基質溶液（仔牛血清液） ０．３０ｍｌ
精製水 ０．３０ｍｌ
小試験管に上記組成の反応試薬混合液を３．０ｍｌ量り、３７℃で予備加温する。１０分後適当に希釈したＣＥ溶液を０．０５ｍｌ加えて混和し３７℃で反応を開始する。反応開始後４９３ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光度変化を求める。求められた吸光度変化をＡｓ／ｍｉｎ、ＣＥ溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は（式３）で算出する。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝［｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／１２｝×１／２］×３．０５／０．０５ （式３）
【００２０】
＜タンパク質濃度測定法＞
タンパク質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）をスタンダードとして算出した。
【００２１】
＜熱安定性＞
酵素を０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解し、各温度で１０分間熱処理した後のＣＥの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。図１に示すとおり、本発明のＣＥは５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
【００２２】
＜至適ｐH＞
上記酵素活性測定法の緩衝液をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０から８．０、図中○印）とトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５から８．５、図中●印）として酵素活性を求めた。最大活性を１００％とした相対活性を図２に示した。本発明のＣＥに対する至適ｐＨはｐＨ６．５±０．５であった。
【００２３】
＜ｐＨ安定性＞
酵素を０．１ｍｇ／ｍｌになるように１００ｍＭの３，３−ジメチルグルタル酸ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０から６．５、図中○印）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５から８．０、図中●印）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５から９．０、図中□印）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０から１０．０、図中△印）に溶解して３７℃で６０分間加温処理した後のＣＥの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。図３に示すとおり、本発明のＣＥは３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
【００２４】
＜分子量＞
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００であった。
【００２５】
＜分子量＞
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００であった。
【００２６】
＜等電点＞
キャリアーアンホラインを用いた電気泳動法にてｐＨ４．２５±０．５であった。
【００２７】
＜基質特異性＞
上記酵素活性測定法にて、表１に示した基質に対する相対活性を、コレステロールオレートを１００％として測定した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
＜Ｋｍ＞
上記酵素活性測定法にて、Ｋｍ値の１／１０倍から１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように基質濃度を調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより見かけのＫｍ値を算出した。その結果、コレステロールリノレートに対して１．０〜１．５ｍＭであった。仔牛血清液を用いた場合０．５〜１．５ｍＭであった。なお、仔牛血清液のロット差は考慮していない。
【００３０】
＜Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４のマウス毒力試験＞
（材料と方法）
１．マウス：Ｓｌｃ：ＩＣＲ系、４週齢、雄、体重約２０ｇを用いた。白血球減少マウスモデルはサイクロフォスファマイド（ＣＹ）１５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ感染の４日前、１日前に投与した。
２．菌液：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ培地にて培養したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４（表中、Ｂ．ｓｔａｂｉｌｉｓと示す）を２５００rpm５分間で遠心集菌し、ＰＢＳで懸濁して用いた。対照菌株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ０８４４株（表中、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａと示す。バイオセーフティレベル２）を用いた。
３．試験菌接種
第一試験群：正常マウスに５％ムチンを加えたＰＢＳ懸濁菌液を腹腔内接種した。
第二試験群：ＣＹ処置白血球減少マウスにＰＢＳ懸濁菌液を腹腔内接種した。
第三試験群：ＣＹ処置白血球減少マウスにＰＢＳ懸濁菌液を静脈内接種した。
４．判定：菌接種５日後までの死亡数によった。
（結果）
結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４の正常マウスに対する毒力は殆ど認められなかった。白血球減少マウスに対する毒力は認められるがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ０８４４株に比べて弱かった。日和見感染症菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ０８４４株と比較してＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４の毒力は弱いと考えられた。
【００３３】
＜比活性＞
上記酵素活性測定法にて、色々なエステラーゼの比活性を比較した。結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
＜アミノ酸配列＞
本発明におけるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４のＣＥを構成するアミノ酸配列は、具体的には、配列表配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０で表されるが、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や、酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したもの、及びその均等物も含まれる。
付加するアミノ酸残基としてはシグナルペプチドまたはＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｎｕｓタグなど通常用いられるタグも挙げられる。これらは構造遺伝子のＮ末端側或いはＣ末端側に単独、或いは複数付加する事ができる。
【００３６】
＜塩基配列＞
配列表配列番号１の塩基配列１〜１０８０で表されるＤＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。また、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異等により欠失、置換もしくは付加したもの、及びその均等物をコードするＤＮＡも、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。
ＤＮＡの供与体である微生物としては、好ましくはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４が挙げられるが、ＣＥの機能や製造上の利点を向上するために、他の微生物由来のＤＮＡや合成オリゴヌクレオチドを構造遺伝子の５’末端側或いは３’末端側に単独、或いは複数付加する事ができる。
【００３７】
＜ベクター＞
本発明におけるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４のＣＥをコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。
また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。他にもロドコッカス属やシュードモナス属に移入できるベクターも使用できる。
本発明の組み換えベクターは、上記ベクターに配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＣＥ或いは該アミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ同様の酵素活性を有するＣＥをコードするＤＮＡを組み込むことによって得ることができ、この組み換えベクターを下記に示す宿主に移入して発現させることによって本発明の形質転換体を得ることができる。
【００３８】
＜宿主＞
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。
また、宿主微生物がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。他にもロドコッカス属やシュードモナス属も宿主微生物として用いる事ができる。
また、ファージベクターを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。
【実施例】
【００３９】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されることはない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００４０】
［実施例１］
＜培養１＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、ビール酵母エキス３％、グリセロール３％、ＣＳＬ２％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウム０．２％及びトライトンＸ−１００ ０．５％からなる液体培地を入れ、ｐＨを７に調製した後１２１℃で２０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３６時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は４〜６Ｕ／ｍｌであった。
【００４１】
［実施例２］
＜培養２＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、大豆油２％、スキムミルク１％、ビール酵母エキス０．５％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％からなる液体培地を入れ、ｐＨを６．７に調製した後１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３６時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は８〜１０Ｕ／ｍｌであった。
【００４２】
［実施例３］
＜培養３＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、オレイン酸２％、ミルクカゼイン１％、ビール酵母エキス０．５％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％からなる液体培地を入れ、１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３０時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は１０〜１２Ｕ／ｍｌであった。
【００４３】
［実施例４］
＜培養４＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、ビール酵母エキス３％、ソルビトール１．５％、グリセロール１．５％からなる液体培地を入れ、１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３０時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は１〜２Ｕ／ｍｌであった。
【００４４】
［実施例５］
＜培養５＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、ビール酵母エキス３％、オリーブ油１．５％、グリセロール１．５％からなる液体培地を入れ、１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３０時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は５〜７Ｕ／ｍｌであった。
【００４５】
［実施例６］
＜精製１＞
実施例１〜３で得られたそれぞれの菌体に０．１％リゾチーム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００からなる可溶化液１Ｌ（ｐＨ８）で３７℃３時間可溶化した後、５Ｌのアセトンを加えて５℃で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。次に、得られた溶液に硫安を最終濃度３５％になるように加えて室温で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。各精製収率は５０％であった。得られた精製ＣＥの比活性はいずれも１５０〜１６０Ｕ／ｍｇであった。
【００４６】
［実施例７］
＜精製２＞
実施例１〜３で得られた菌体を１０％トリトンＸ−１００で４５℃１７時間可溶化した後、５Ｌのアセトンを加えて５℃で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液に硫安を最終濃度３５％になるように加えて室温で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は４０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１５０〜１７０Ｕ／ｍｇであった。
【００４７】
［実施例８］
＜精製３＞
実施例１〜３で得られた菌体に５Ｌのアセトンを加えて室温で１７時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液に硫安を最終濃度３５％になるように加えて室温で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は６０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１６０〜１８０Ｕ／ｍｇであった。
【００４８】
［実施例９］
＜精製４＞
実施例１〜３で得られた菌体に５Ｌのアセトンを加えて室温で１７時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫安を添加し、１５％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着して１５及び０％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は２０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１７０〜１９０Ｕ／ｍｇであった。
【００４９】
［実施例１０］
＜精製５＞
実施例１〜３で得られた菌体に０．１％リゾチーム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００からなる可溶化液１Ｌ（ｐＨ８）で３７℃１７時間可溶化した後、５Ｌのアセトンを加えて５℃で１７時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦに吸着させた。１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫安を添加し、１５％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着して１５及び０％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は１０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１７０〜１９０Ｕ／ｍｇであった。
【００５０】
［実施例１１］
＜ＤＮＡの抽出＞
実施例１〜３で得られた菌体の一部を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品約１ｍｇを得た。
【００５１】
［実施例１２］
＜本発明の酵素の部分アミノ酸配列決定＞
１Ｍのウレア ｐＨ８に溶解した実施例１０で得た本発明の酵素１ｍｇを、アミノペプチダーゼＬｙｓ−ＣもしくはＡｓｐ−Ｎで断片化した（３７℃１７時間）。断片は定法に従い０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水系の逆相カラムクロマトグラフィーで分離精製しエドマン分解法にて部分アミノ酸配列を決定した。
【００５２】
［実施例１３］
＜本発明の酵素遺伝子の部分断片の分離＞
本発明のＣＥの遺伝子を分離するために、データベースに登録されている既知のＣＥ遺伝子のＤＮＡ配列を元に配列番号２および３のＤＮＡ配列を有するＰＣＲ用ＤＮＡプライマーを設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に依頼して合成した。このＤＮＡプライマーを用いて実施例１１で調製したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を外部機関（ＢＭＲ社）に依頼して決定したところ、実施例１２で決定した部分アミノ酸配列の一部をコードする配列を含むことが確認され、本発明のＣＥ遺伝子の一部であることを確認した。
【００５３】
［実施例１４］
＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
実施例１３で取得したＣＥ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を鋳型として３７０ｋＢｑ（キロベクレル）の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社製）存在下、ＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いてランダムプライマー法によりラジオアイソトープ３２Ｐを取り込ませた放射性オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００５４】
［実施例１５］
＜本発明の酵素遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例１１で調製したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル（タカラバイオ社、ＡｇａｒｏｓｅＨ１４（商品名）、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させた。
このメンブレンを風乾後、１平方ｃｍあたり０．０５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のＢＳＡ（シグマ社製）、０．７５Ｍの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭのリン酸３ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、２５０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（フナコシ社製）、３０％のホルムアミド）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーション処理を行った。処理終了後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、実施例１４で作成した放射性ＤＮＡプローブを７４ｋＢｑ添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーション処理を１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを１００平方ｃｍ当り５０ｍｌの洗浄液（７５ｍＭの塩化ナトリウム、７．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）で５０℃下、１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。
その結果、ＥｃｏＲＶによる切断により約６ｋｂのＤＮＡフラグメント上に本発明のＣＥ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＥｃｏＲＶで切断した染色体ＤＮＡの６ｋｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成することとした。
【００５５】
［実施例１６］
＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例１１で調製したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、常法に従い約６ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳｍａＩで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化した１μｇのｐＵＣ１１９と、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔで連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ・ＪＭ１０９（東洋紡績社販売）をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、アンピシリン耐性コロニーを得て遺伝子ライブラリーとした。
【００５６】
［実施例１７］
＜本発明の酵素遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例１６で得られた遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定した。
このＤＮＡを固定したメンブレンを実施例１５に示したハイブリダイゼーション溶液（メンブレン１平方ｃｍ当たり２０μｌ）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーション処理を行った。処理終了後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、実施例１４で作成した放射性ＤＮＡプローブを７４ｋＢｑ添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーション処理を１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを実施例１５に示した５０℃の洗浄液（メンブレン１００平方ｃｍ当り５０ｍｌ）で１０分洗った後、自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルを示すコロニーを確認した。
【００５７】
［実施例１８］
＜組み換えプラスミドの抽出と酵素遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１７で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドに挿入された染色体断片の塩基配列を外部機関（ＢＭＲ社）に依頼して解析したところ、実施例１２で決定した本発明のＣＥの部分アミノ酸配列をコードする構造遺伝子領域の全領域が確認された。この構造遺伝子の塩基配列を決定して本発明の酵素遺伝子の塩基配列とした。本発明の酵素遺伝子の塩基配列とそのコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、安定性が高く、至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、比活性が高いＣＥを効率よく製造する方法を提供する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明によるコレステロールエステラーゼの熱安定性を示す図である。
【図２】本発明によるコレステロールエステラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明によるコレステロールエステラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明によるコレステロールエステラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコレステロールエステラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは人体の各臓器および各器官に広く分布している。高コレステロール血症は、動脈硬化、心筋梗塞等と関連し、低コレステロール血症は悪液質、甲状腺機能昂進等と関連するので、特に血中コレステロール濃度の把握は臨床医学的に重要である。
従来、血中コレステロールを測定する酵素法は、コレステロールオキシダーゼを用いた方法（例えば、非特許文献１参照）と、コレステロールデヒドロゲナーゼを用いた方法（例えば特許文献１又は特許文献２参照）が報告されている。
血中コレステロールとしては、遊離コレステロールと脂肪酸コレステロールエステルが存在する。コレステロールオキシダーゼ（以下ＣＯＤと略する場合がある）とコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下ＣＤＨと略する場合がある）は、遊離のコレステロールのみに作用して酸化或いは還元するため、酵素法を用いて血中コレステロールを測定する場合には、コレステロールエステラーゼ（以下ＣＥと略する場合がある）でコレステロールエステルを加水分解してコレステロールを遊離させなければならない。
ＣＥは、これまでにシュードモナス属（特許文献３〜６など参照）、ストレプトミセス属（特許文献７参照）、ノカルディア属（特許文献８参照）、カワラタケ（特許文献９参照）、スエヒロタケ（特許文献１０参照）、ブルクホルデリア属（特許文献１１参照）、キサントモナス属（特許文献１１参照）などを由来とするものが知られている。
ＣＥを、血中コレステロールの測定などの臨床診断試薬用酵素として利用する場合、ＣＥが以下の性質を持つと有利である。
１）広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質。
２）液体中での高い保存安定性。
３）広い至適ｐＨと高いｐＨ安定性。
４）微生物の単位培養当たりの酵素生産量が大きい事とともに、単位タンパク質当たりの酵素活性（比活性）が高い事。
これらの性質が有利な理由は、順に、
１）被験対象液中、例えば血中のコレステロールエステルの脂肪酸成分は、リノール酸、オレイン酸、及びパルミチン酸を中心として、他にもアラキドン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、及びミリスチン酸などの広範な種類が含まれており、これらを加水分解する必要がある為。
２）臨床診断試薬は液状で長期間保存できると利便性が高い為。
３）臨床診断試薬組成の検討に際して、原料や試薬組成条件の選択の幅が広がる為。
４）経済性が良い為。特に、比活性が高い性質は製造上、例えば、イ）不要な混在物質の割合を減らす事が容易である、ロ）カラムクロマトグラフィーに用いる樹脂が少なくて済み精製が容易である、ハ）遺伝子組み換え体にした場合、高い酵素の発現量が期待できる、など有利である。
例えば、非特許文献２には、シュードモナス属エルギノーサ由来ＣＥの比活性は８．５Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献６には、シュードモナス属フルオレッセンス由来ＣＥは０．１０１Ｕ／ｍｇ、シュードモナス属ストゥッツェリー属由来ＣＥの比活性は７９６Ｕ／ｍｇ以上との報告があり、特許文献５には、シュードモナス属由来ＣＥは０．２４Ｕ／ｍｇとの報告がある一方で非特許文献３には、１５．２Ｕ／ｍｇとの報告がある。又、特許文献７には、ストレプトミセス属由来ＣＥの比活性は５Ｕ／ｍｇとの報告がある一方で非特許文献４には、７８．８Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献９には、カワラタケ由来ＣＥの比活性は５．５１Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献１０には、スエヒロタケ由来ＣＥの比活性は２．５Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献１１には、ブルクホルデリア属由来ＣＥの比活性は５１Ｕ／ｍｇとの報告があり、特許文献１２には、キサントモナス属由来ＣＥの比活性は８５．６Ｕ／ｍｇとの報告がある。
これらのうち、比活性が比較的高いストレプトミセス属由来ＣＥは培養力価が０．０５Ｕ／ｍｌ以下である（非特許文献４）ために高い経済性があるとは言えない。キサントモナス属由来ＣＥは、キサントモナス属細菌は斑点細菌病、黒腐病、又は褐班細菌病などの植物病原細菌である場合が多い事を考慮すれば容易に産業利用できるとは言い難い。シュードモナス属ストゥッツェリー属由来ＣＥは３５℃から失活が認められ、４５℃で約４０％失活する（特許文献６）という産業利用しづらい性質を有する。
すなわち、従来のＣＥはその性質上或いは生産上何らかの問題がある。
【特許文献１】特公平２−４９７２０号公報
【特許文献２】特公平５−１７６７９７号公報
【特許文献３】特開昭５０−１５７５８８号公報
【特許文献４】特開昭５６−４２５８６号公報
【特許文献５】特開昭５２−７４８３ 号公報
【特許文献６】特開平９−２５１号公報
【特許文献７】特開昭５３−１０９９９２号公報
【特許文献８】特開昭５７−４３６８６号公報
【特許文献９】特開昭５５−１１４２８８号公報
【特許文献１０】特開昭５３−９３９１号公報
【特許文献１１】特開平１０−１２７２７８号公報
【特許文献１２】特開平１１−５６３５５号公報
【非特許文献１】Charles C. Allain、 Lucy S. Poon、 Cicely S. G. Chan、 W. Richmond、 C. Fu、Enzymatic Determination of Total Serum Cholesterol、Clin. Chem.、20巻、470頁、1974年
【非特許文献２】Akio SUGIHARA、Yuji SHIMADA、Atsuo NOMURA、Tadamasa TERAI、Masaki IMAYASU、Yusuke NAGAI、Toshihiro NAGAO、Yomi WATANABE、Yoshio TOMINAGA、Purification and Characterization of a Novel Cholesterol Esterase from Pseudomonas aeruginosa, with Its Application to Cleaning Lipid-stained Contact Lenses、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry、６６巻、２３４７頁、２００２年
【非特許文献３】Noriyuki Doukyu、Rikizo Aono、Purification of Extracellular Cholesterol Oxidase with High Activity in the Presence of Organic Solvents from Pseudomonas sp. Strain ST-200、Applied and Environmental Microbiology、６４巻、１９２９頁、１９９８年
【非特許文献４】Hongyu Xiang、Naoki Takaya、Takayuki Hoshino、Novel Cholesterol Esterase Secreted by Streptomyces Persists during Aqueous Long-Term Storage、Journal of Bioscience and Bioengineering、１０１巻、１９頁、２００６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、１）広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、２）液体中での保存安定性が高く、３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、且つ４）比活性が高いコレステロールエステラーゼを効率よく製造する方法を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、土壌より分離したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株）から生産されるコレステロールエステラーゼが、所望の性質を有する事を見出した。さらに、その効率的な工業的規模の製造方法を確立して本発明を完成に至った。即ち、本発明は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを培養し、その培養物から広範囲の脂肪酸エステルを加水分解可能な、安定性が高く、至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、比活性が高いＣＥを採取する事を特徴とするＣＥの製造方法に関し、具体的には以下に関する。
〔１〕Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを培養し、培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
〔２〕Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株である上記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕コレステロールエステラーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載のコレステロールエステラーゼの製造方法。
〔４〕配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを宿主に移入し、該宿主を培養し、該培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
〔５〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の製造方法により得られるコレステロールエステラーゼ。
〔６〕下記（ａ）又は（ｂ）のコレステロールエステラーゼをコードするＤＮＡを含有する組み換えベクター。
（ａ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有するコレステロールエステラーゼ。
（ｂ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記特性を有するコレステロールエステラーゼ。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
〔７〕上記〔６〕に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
〔８〕Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株。
〔９〕下記特性を有するコレステロールエステラーゼを製造するための、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４）株の使用。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、１）広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、２）安定性が高く、３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、且つ４）比活性が高いコレステロールエステラーゼを効率よく製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの菌学的性質を以下に示す。＋は陽性、−は陰性、wは反応弱い、を示す。
１．形態学的性質
培養条件： Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
細胞の形態： 桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）
細胞の多様性の有無：−
運動性（鞭毛の着生状態）：＋（極毛）
胞子の有無：−
２．培養的性質
（ａ）培養条件： Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地 ３０℃
色：淡黄色
光沢：＋
色素産生：−
（ｂ）培養条件： Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ培地 ３０℃
表面発育の有無：−
培地の混濁の有無：＋
（ｃ）培養条件： ゼラチン穿刺培養 ３０℃
生育状態：＋
ゼラチン液化：−
（ｄ）培養条件： リトマスミルク ３０℃
凝固：−
液化：−
３．生理学的性質
グラム染色性：−
硝酸塩の還元：＋
脱窒反応：−
ＭＲテスト：−
ＶＰテスト：−
インドール産生：−
硫化水素の生成：−
デンプンの加水分解：−
クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：＋
クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：＋
無機窒素源の利用 硝酸塩：＋ｗ
無機窒素源の利用 アンモニウム塩：＋
ウレアーゼ活性：−
カタラーゼ：＋
オキシダーゼ：−
生育の範囲ｐＨ ５：＋
生育の範囲ｐＨ ８：＋
生育の範囲ｐＨ ９：＋
生育の範囲温度２０℃：＋
生育の範囲温度２５℃：＋
生育の範囲温度３７℃：＋
生育の範囲温度４５℃：−
嫌気的生育性：−
Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／−
４．糖類からの酸産生／ガス産生
Ｌ−アラビノース：＋／−
Ｄ−グルコース：＋／−
Ｄ−フラクトース：＋ｗ／−
マルトース：＋／−
ラクトース：＋／−
Ｄ−ソルビトール：−／−
イノシトール：＋ｗ／−
Ｄ−キシロース：＋／−
Ｄ−マンノース：−／−
Ｄ−ガラクトース：＋／−
シュークロース：＋／−
トレハロース：＋／−
Ｄ−マンニトール：＋ｗ／−
グリセリン：−／−
５．その他の生理学的性質
β−ガラクトシダーゼ活性：＋
アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
リジンデカルボキシラーゼ活性：−
トリプトファンデアミナーゼ活性：−
ゼラチナーゼ活性：−
【０００７】
ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、本菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ由来の１６ＳｒＤＮＡに高い相同性を示し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＬＭＧ１４２９４株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．９％、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ ＬＭＧ１４１９１株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．７％の相同性を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果においても、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＬＭＧ１４２９４株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．９％の相同性を示した。また、本菌株の１６ＳｒＤＮＡと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位３０株の１６ＳｒＤＮＡをもちいて行った簡易分子系統樹解析の結果、本菌株はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの１６ＳｒＤＮＡとほぼ同一の系統枝を形成し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａにも近縁である事が示された。
【０００８】
本菌株は、硝酸塩を還元し、インドールを産生せず、ウレアーゼ活性を示さず、β−ガラクトシダーゼ活性を示した。さらに、４２℃で生育せず、リパーゼ活性およびレシチナーゼ活性を示し、リジンデカルボキシラーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼ活性を示さず、クリステンセンのクエン酸を利用した。また、グリセリンを酸化せず、アラビノース等を酸化した。これらの性状は１６SｒDNA塩基配列において近縁性が示唆されたＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａと類似するが、β−ガラクトシダーゼ活性を示す点においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓと異なり、硝酸塩を還元する点および硫化水素を産生しない点においてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａと異なった。
【０００９】
以上の事から、本菌株はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に含まれ、既知種ではＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａに近縁であるが、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析および生理生化学性状試験の結果からはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａよりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓにより近縁であるために本菌株はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓと同定した。
このＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓは、独立行政法人産業技術総合研究所特許性物寄託センターに平成１８年８月３１日付けで寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４を得た。
【００１０】
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、通常の栄養培地を使用でき、炭素源、窒素源、無機塩類等を適当に含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれも使用できる。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、シュークロース、糖蜜、澱粉などの糖質、アルコール類、有機酸類、オリーブ油、大豆油等の油脂、及びこれらの組み合わせを用いることができるが、オレイン酸とミルクカゼインの組み合わせが好ましい。窒素源としてはコーンスティープリカー（ＣＳＬ）、大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の有機態窒素、硫安、硝酸アンモニウム、尿素などの無機態窒素を用いることができるが、酵母エキスが好ましい。無機塩類としては、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄などが使用できるが、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウムの組み合わせが好ましい。更に生育を促進し、酵素生産能を高めるためにエマルゲン、トリトン、ツイーン、スパンなどの適当な界面活性剤を添加してもよい。
【００１１】
培養温度は、微生物が発育し、ＣＥを生産する範囲で適宜変更し得るが、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの場合、好ましくは、１０から４２℃程度、さらに好ましくは２５から３８℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ＣＥが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの場合、通常は２０から５６時間程度である。
【００１２】
培地ｐＨは、菌が発育し、ＣＥを生産する範囲で適宜変更し得るが、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。
【００１３】
また、本発明のＣＥを製造するに当たっては、本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを栄養培地で培養して菌体内、培養液中またはその両方にＣＥを産生せしめることができるが、菌体内に産生させる製造方法が好ましい。
通常微生物由来のＣＥやリパーゼなどのエステラーゼ類は菌体外に分泌される分泌型の酵素である。これは、エステラーゼ活性により自らの細胞膜を分解する事を防ぐためと考えられる。したがって、特許文献５〜７、９〜１２、及び非特許文献２〜４には全て菌体外に分泌されたＣＥを培養液中からＣＥを精製し製造する方法が記載されている。
また、ＣＥを菌体内と菌体外に同時に産生する例も報告されているが（特許文献３〜４）、これらも菌体内より菌体外の方がＣＥの生産量が多い為、菌体外に分泌されたＣＥを培養液中から精製し製造する方法が記載されている。
【００１４】
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓは栄養培地で培養して菌体内に蓄積したＣＥを精製して製造する事ができるが、菌体外に分泌されたＣＥを培養液中から精製し製造する方法に比べて次のような利点がある。
１）培地成分がＣＥの製造に影響を与えない。
２）培養液を濃縮するための減圧濃縮装置や濾過濃縮装置などの特別な設備が必要ない。
３）ＣＥを培養液中から沈澱分離するために培養スケールに見合った大量の硫安、アセトン、またはアルコールの使用の必要がない。
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを栄養培地で培養して菌体内にＣＥを産生させた場合、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法、リゾチームなどの酵素的方法、またはアセトンや界面活性剤を用いた化学的な方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤やアセトンなどを添加して本発明のＣＥの抽出液を得る。
【００１５】
本発明のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを栄養培地で培養して菌体外にＣＥを産生させた場合、培養液にアセトン、硫安、エタノール、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤などを添加して本発明のＣＥを濃縮するか、もしくは濃縮する事なく精製する。
【００１６】
菌体内から得られた本発明のＣＥの抽出液または菌体外のＣＥは硫安分画、アセトン分画、アルコール分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い本発明のＣＥを得ることができる。
【００１７】
本発明のＣＥは、比活性が高いため、経済性に優れ製造上有利である。好ましい比活性はコレステロールエステルを基質とした場合１００Ｕ／ｍｇ以上であるが、更に好ましくは１２０Ｕ／ｍｇ以上で、最適には１５０Ｕ／ｍｇ以上である。なお、比活性はＣＥの精製純度によって変動する場合がある事は言うまでもない。
以下に、本発明のＣＥの理化学的性質を示す。尚、本発明の実験に使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業社製、国産化学社製、シグマアルドリッチ社製など市販で容易に入手できるものを使用した。また、組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限りタカラバイオ株式会社より購入したものである。
【００１８】
＜作用＞
本発明のＣＥの作用は（式１）の通りであり、１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
コレステロールエステル ＋ Ｈ２Ｏ → コレステロール ＋ 脂肪酸 （式１）
この作用を示す酵素は、ステロールエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１３）に分類される。ステロールエステラーゼの作用は（式２）の通りであり、１分子の水の存在下、１分子のステロールエステルを１分子のステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
ステロールエステル ＋ Ｈ２Ｏ → ステロール ＋ 脂肪酸 （式２）
【００１９】
＜酵素活性測定法＞
反応試薬混合液組成
０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ６．８ ０．６０ｍｌ
０．３５％ ４−アミノアンチピリン溶液 ０．３０ｍｌ
０．２％ フェノール溶液 ０．３０ｍｌ
１００Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ溶液 ０．３０ｍｌ
３％ トリトンＸ−１００溶液 ０．３０ｍｌ
１０Ｕ／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ溶液 ０．６０ｍｌ
基質溶液（仔牛血清液） ０．３０ｍｌ
精製水 ０．３０ｍｌ
小試験管に上記組成の反応試薬混合液を３．０ｍｌ量り、３７℃で予備加温する。１０分後適当に希釈したＣＥ溶液を０．０５ｍｌ加えて混和し３７℃で反応を開始する。反応開始後４９３ｎｍにおける吸光度を測定して直線的に反応している１分間当たりの吸光度変化を求める。求められた吸光度変化をＡｓ／ｍｉｎ、ＣＥ溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は（式３）で算出する。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝［｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／１２｝×１／２］×３．０５／０．０５ （式３）
【００２０】
＜タンパク質濃度測定法＞
タンパク質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）をスタンダードとして算出した。
【００２１】
＜熱安定性＞
酵素を０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解し、各温度で１０分間熱処理した後のＣＥの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。図１に示すとおり、本発明のＣＥは５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
【００２２】
＜至適ｐH＞
上記酵素活性測定法の緩衝液をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０から８．０、図中○印）とトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５から８．５、図中●印）として酵素活性を求めた。最大活性を１００％とした相対活性を図２に示した。本発明のＣＥに対する至適ｐＨはｐＨ６．５±０．５であった。
【００２３】
＜ｐＨ安定性＞
酵素を０．１ｍｇ／ｍｌになるように１００ｍＭの３，３−ジメチルグルタル酸ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０から６．５、図中○印）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５から８．０、図中●印）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５から９．０、図中□印）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０から１０．０、図中△印）に溶解して３７℃で６０分間加温処理した後のＣＥの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。図３に示すとおり、本発明のＣＥは３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
【００２４】
＜分子量＞
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００であった。
【００２５】
＜分子量＞
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００であった。
【００２６】
＜等電点＞
キャリアーアンホラインを用いた電気泳動法にてｐＨ４．２５±０．５であった。
【００２７】
＜基質特異性＞
上記酵素活性測定法にて、表１に示した基質に対する相対活性を、コレステロールオレートを１００％として測定した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
＜Ｋｍ＞
上記酵素活性測定法にて、Ｋｍ値の１／１０倍から１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように基質濃度を調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより見かけのＫｍ値を算出した。その結果、コレステロールリノレートに対して１．０〜１．５ｍＭであった。仔牛血清液を用いた場合０．５〜１．５ｍＭであった。なお、仔牛血清液のロット差は考慮していない。
【００３０】
＜Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４のマウス毒力試験＞
（材料と方法）
１．マウス：Ｓｌｃ：ＩＣＲ系、４週齢、雄、体重約２０ｇを用いた。白血球減少マウスモデルはサイクロフォスファマイド（ＣＹ）１５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ感染の４日前、１日前に投与した。
２．菌液：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ培地にて培養したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４（表中、Ｂ．ｓｔａｂｉｌｉｓと示す）を２５００rpm５分間で遠心集菌し、ＰＢＳで懸濁して用いた。対照菌株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ０８４４株（表中、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａと示す。バイオセーフティレベル２）を用いた。
３．試験菌接種
第一試験群：正常マウスに５％ムチンを加えたＰＢＳ懸濁菌液を腹腔内接種した。
第二試験群：ＣＹ処置白血球減少マウスにＰＢＳ懸濁菌液を腹腔内接種した。
第三試験群：ＣＹ処置白血球減少マウスにＰＢＳ懸濁菌液を静脈内接種した。
４．判定：菌接種５日後までの死亡数によった。
（結果）
結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４の正常マウスに対する毒力は殆ど認められなかった。白血球減少マウスに対する毒力は認められるがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ０８４４株に比べて弱かった。日和見感染症菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ０８４４株と比較してＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４の毒力は弱いと考えられた。
【００３３】
＜比活性＞
上記酵素活性測定法にて、色々なエステラーゼの比活性を比較した。結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
＜アミノ酸配列＞
本発明におけるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４のＣＥを構成するアミノ酸配列は、具体的には、配列表配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０で表されるが、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や、酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したもの、及びその均等物も含まれる。
付加するアミノ酸残基としてはシグナルペプチドまたはＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｎｕｓタグなど通常用いられるタグも挙げられる。これらは構造遺伝子のＮ末端側或いはＣ末端側に単独、或いは複数付加する事ができる。
【００３６】
＜塩基配列＞
配列表配列番号１の塩基配列１〜１０８０で表されるＤＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。また、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から３６０のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異等により欠失、置換もしくは付加したもの、及びその均等物をコードするＤＮＡも、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。
ＤＮＡの供与体である微生物としては、好ましくはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４が挙げられるが、ＣＥの機能や製造上の利点を向上するために、他の微生物由来のＤＮＡや合成オリゴヌクレオチドを構造遺伝子の５’末端側或いは３’末端側に単独、或いは複数付加する事ができる。
【００３７】
＜ベクター＞
本発明におけるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４のＣＥをコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。
また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。他にもロドコッカス属やシュードモナス属に移入できるベクターも使用できる。
本発明の組み換えベクターは、上記ベクターに配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＣＥ或いは該アミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ同様の酵素活性を有するＣＥをコードするＤＮＡを組み込むことによって得ることができ、この組み換えベクターを下記に示す宿主に移入して発現させることによって本発明の形質転換体を得ることができる。
【００３８】
＜宿主＞
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。
また、宿主微生物がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。他にもロドコッカス属やシュードモナス属も宿主微生物として用いる事ができる。
また、ファージベクターを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。
【実施例】
【００３９】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されることはない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００４０】
［実施例１］
＜培養１＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、ビール酵母エキス３％、グリセロール３％、ＣＳＬ２％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウム０．２％及びトライトンＸ−１００ ０．５％からなる液体培地を入れ、ｐＨを７に調製した後１２１℃で２０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３６時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は４〜６Ｕ／ｍｌであった。
【００４１】
［実施例２］
＜培養２＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、大豆油２％、スキムミルク１％、ビール酵母エキス０．５％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％からなる液体培地を入れ、ｐＨを６．７に調製した後１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３６時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は８〜１０Ｕ／ｍｌであった。
【００４２】
［実施例３］
＜培養３＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、オレイン酸２％、ミルクカゼイン１％、ビール酵母エキス０．５％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％からなる液体培地を入れ、１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３０時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は１０〜１２Ｕ／ｍｌであった。
【００４３】
［実施例４］
＜培養４＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、ビール酵母エキス３％、ソルビトール１．５％、グリセロール１．５％からなる液体培地を入れ、１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３０時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は１〜２Ｕ／ｍｌであった。
【００４４】
［実施例５］
＜培養５＞
容量５００ｍｌの三角フラスコに、前培養用培地としてＬＢ液体培地１００ｍｌを入れて、蒸気加圧滅菌した後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株を１白金耳接種した。次いで２８℃で２４時間振とう培養することにより、前培養液を得た。容量２リットルのジャーに、ビール酵母エキス３％、オリーブ油１．５％、グリセロール１．５％からなる液体培地を入れ、１１３℃で３０分間蒸気加圧滅菌した後、上記の前培養液を２ｍｌ接種し、２８℃、６００ｒｐｍで３０時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を得た。６基培養を行ったところ、ＣＥの培養力価は５〜７Ｕ／ｍｌであった。
【００４５】
［実施例６］
＜精製１＞
実施例１〜３で得られたそれぞれの菌体に０．１％リゾチーム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００からなる可溶化液１Ｌ（ｐＨ８）で３７℃３時間可溶化した後、５Ｌのアセトンを加えて５℃で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。次に、得られた溶液に硫安を最終濃度３５％になるように加えて室温で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。各精製収率は５０％であった。得られた精製ＣＥの比活性はいずれも１５０〜１６０Ｕ／ｍｇであった。
【００４６】
［実施例７］
＜精製２＞
実施例１〜３で得られた菌体を１０％トリトンＸ−１００で４５℃１７時間可溶化した後、５Ｌのアセトンを加えて５℃で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液に硫安を最終濃度３５％になるように加えて室温で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は４０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１５０〜１７０Ｕ／ｍｇであった。
【００４７】
［実施例８］
＜精製３＞
実施例１〜３で得られた菌体に５Ｌのアセトンを加えて室温で１７時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液に硫安を最終濃度３５％になるように加えて室温で６時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で脱塩した後５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は６０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１６０〜１８０Ｕ／ｍｇであった。
【００４８】
［実施例９］
＜精製４＞
実施例１〜３で得られた菌体に５Ｌのアセトンを加えて室温で１７時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫安を添加し、１５％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着して１５及び０％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は２０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１７０〜１９０Ｕ／ｍｇであった。
【００４９】
［実施例１０］
＜精製５＞
実施例１〜３で得られた菌体に０．１％リゾチーム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００からなる可溶化液１Ｌ（ｐＨ８）で３７℃１７時間可溶化した後、５Ｌのアセトンを加えて５℃で１７時間静置した。生じた沈殿を遠心分離により集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。次に、得られた溶液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦに吸着させた。１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０及び０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５％になるように硫安を添加し、１５％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着して１５及び０％の硫安を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、５０℃で１５分間加熱処理し、生じた沈殿を遠心分離により除去して精製酵素を得た。精製収率は１０％であった。得られた精製ＣＥの比活性は１７０〜１９０Ｕ／ｍｇであった。
【００５０】
［実施例１１］
＜ＤＮＡの抽出＞
実施例１〜３で得られた菌体の一部を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品約１ｍｇを得た。
【００５１】
［実施例１２］
＜本発明の酵素の部分アミノ酸配列決定＞
１Ｍのウレア ｐＨ８に溶解した実施例１０で得た本発明の酵素１ｍｇを、アミノペプチダーゼＬｙｓ−ＣもしくはＡｓｐ−Ｎで断片化した（３７℃１７時間）。断片は定法に従い０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水系の逆相カラムクロマトグラフィーで分離精製しエドマン分解法にて部分アミノ酸配列を決定した。
【００５２】
［実施例１３］
＜本発明の酵素遺伝子の部分断片の分離＞
本発明のＣＥの遺伝子を分離するために、データベースに登録されている既知のＣＥ遺伝子のＤＮＡ配列を元に配列番号２および３のＤＮＡ配列を有するＰＣＲ用ＤＮＡプライマーを設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に依頼して合成した。このＤＮＡプライマーを用いて実施例１１で調製したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を外部機関（ＢＭＲ社）に依頼して決定したところ、実施例１２で決定した部分アミノ酸配列の一部をコードする配列を含むことが確認され、本発明のＣＥ遺伝子の一部であることを確認した。
【００５３】
［実施例１４］
＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
実施例１３で取得したＣＥ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を鋳型として３７０ｋＢｑ（キロベクレル）の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社製）存在下、ＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いてランダムプライマー法によりラジオアイソトープ３２Ｐを取り込ませた放射性オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００５４】
［実施例１５］
＜本発明の酵素遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例１１で調製したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル（タカラバイオ社、ＡｇａｒｏｓｅＨ１４（商品名）、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させた。
このメンブレンを風乾後、１平方ｃｍあたり０．０５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のＢＳＡ（シグマ社製）、０．７５Ｍの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭのリン酸３ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、２５０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（フナコシ社製）、３０％のホルムアミド）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーション処理を行った。処理終了後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、実施例１４で作成した放射性ＤＮＡプローブを７４ｋＢｑ添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーション処理を１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを１００平方ｃｍ当り５０ｍｌの洗浄液（７５ｍＭの塩化ナトリウム、７．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）で５０℃下、１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。
その結果、ＥｃｏＲＶによる切断により約６ｋｂのＤＮＡフラグメント上に本発明のＣＥ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＥｃｏＲＶで切断した染色体ＤＮＡの６ｋｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成することとした。
【００５５】
［実施例１６］
＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例１１で調製したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓのＤＮＡ標品１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、常法に従い約６ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳｍａＩで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化した１μｇのｐＵＣ１１９と、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔで連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ・ＪＭ１０９（東洋紡績社販売）をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、アンピシリン耐性コロニーを得て遺伝子ライブラリーとした。
【００５６】
［実施例１７］
＜本発明の酵素遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例１６で得られた遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定した。
このＤＮＡを固定したメンブレンを実施例１５に示したハイブリダイゼーション溶液（メンブレン１平方ｃｍ当たり２０μｌ）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーション処理を行った。処理終了後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、実施例１４で作成した放射性ＤＮＡプローブを７４ｋＢｑ添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーション処理を１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを実施例１５に示した５０℃の洗浄液（メンブレン１００平方ｃｍ当り５０ｍｌ）で１０分洗った後、自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルを示すコロニーを確認した。
【００５７】
［実施例１８］
＜組み換えプラスミドの抽出と酵素遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１７で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドに挿入された染色体断片の塩基配列を外部機関（ＢＭＲ社）に依頼して解析したところ、実施例１２で決定した本発明のＣＥの部分アミノ酸配列をコードする構造遺伝子領域の全領域が確認された。この構造遺伝子の塩基配列を決定して本発明の酵素遺伝子の塩基配列とした。本発明の酵素遺伝子の塩基配列とそのコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、広範囲の脂肪酸エステルを加水分解する性質があり、安定性が高く、至適ｐＨおよびｐＨ安定性の範囲が広く、比活性が高いＣＥを効率よく製造する方法を提供する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明によるコレステロールエステラーゼの熱安定性を示す図である。
【図２】本発明によるコレステロールエステラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明によるコレステロールエステラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明によるコレステロールエステラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを培養し、培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項２】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
コレステロールエステラーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のコレステロールエステラーゼの製造方法。
【請求項４】
配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを宿主に移入し、該宿主を培養し、該培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の製造方法により得られるコレステロールエステラーゼ。
【請求項６】
下記（ａ）又は（ｂ）のコレステロールエステラーゼをコードするＤＮＡを含有する組み換えベクター。
（ａ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有するコレステロールエステラーゼ。
（ｂ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記特性を有するコレステロールエステラーゼ。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株。
【請求項９】
下記特性を有するコレステロールエステラーゼを製造するための、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４）株の使用。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項１】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓを培養し、培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項２】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
コレステロールエステラーゼが、配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のコレステロールエステラーゼの製造方法。
【請求項４】
配列表配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを宿主に移入し、該宿主を培養し、該培養物から下記特性を有するコレステロールエステラーゼを得ることを特徴とするコレステロールエステラーゼの製造方法。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエステルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の製造方法により得られるコレステロールエステラーゼ。
【請求項６】
下記（ａ）又は（ｂ）のコレステロールエステラーゼをコードするＤＮＡを含有する組み換えベクター。
（ａ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を有するコレステロールエステラーゼ。
（ｂ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列から１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記特性を有するコレステロールエステラーゼ。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４株。
【請求項９】
下記特性を有するコレステロールエステラーゼを製造するための、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０１４）株の使用。
（１）作用
１分子の水の存在下、１分子のコレステロールエスルを１分子のコレステロールと１分子の脂肪酸に加水分解する。
（２）熱安定性
５５℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持する。
（３）比活性
コレステロールエステルを基質とした場合、１００Ｕ／ｍｇ以上。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．５±０．５。
（５）ｐＨ安定性
３７℃、６０分間でｐＨ４から１０の範囲で８０％以上の活性を保持する。
（６）分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、２９５００±３０００。
（７）分子量
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００による分子量が、３１０００±３０００。
（８）等電点
ｐＨ４．２５±０．５。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−８６２７７（Ｐ２００８−８６２７７Ａ）
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７２４１４（Ｐ２００６−２７２４１４）
【出願日】平成１８年１０月４日（２００６．１０．４）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月４日（２００６．１０．４）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
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