新規なヌクレオシド若しくはヌクレオチド誘導体及びその利用
【課題】本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド、並びにそれらの利用方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、一態様において、前記塩基の5位に、5−FAM、6−FAM、5−TAMRA、6−TAMRA、DANSYL、5−HEX、6−HEX、5−TET、6−TET、5−ROX、及び6−ROXからなるグループから選択される蛍光色素、あるいは、DABCYL、BHQ1及びBHQ2からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【解決手段】本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、一態様において、前記塩基の5位に、5−FAM、6−FAM、5−TAMRA、6−TAMRA、DANSYL、5−HEX、6−HEX、5−TET、6−TET、5−ROX、及び6−ROXからなるグループから選択される蛍光色素、あるいは、DABCYL、BHQ1及びBHQ2からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
生体高分子である核酸(DNA,RNA)は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か4種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を鋳型としてDNAポリメラーゼにより自己複製し、さらにRNAポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、DNAからDNAへ、DNAからRNAへ、RNAからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成(A−T/U、G−C)のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、in vitroセレクション法によって、アプタマーやリボザイムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかってきたこともその一つである。
【0003】
しかし、20種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には4種類の塩基(2種類の塩基対)しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中のtRNA、rRNA、mRNA等の機能性RNAは自分自身の構造を安定化したり、RNA−RNA間、RNA−タンパク質間相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基(対)のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。
【0004】
核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基(もしくは非天然型塩基)を導入する手法として、1)化学合成により直接導入する方法、2)核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。1)の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。2)の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅・調製が可能となるが、そのような基質や塩基対(非天然型ヌクレオチド)も開発途中である。
【0005】
人工塩基対の背景
天然の二本鎖DNA中のAとT及びGとCは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している。近年、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出の研究が行われている。例えば、Ohtsuki et al.,2001及びHirao et al.,2002では、プリンの6位にかさ高い置換基を導入した2−アミノ−6−ジメチルアミノプリン(x)と2−アミノ−6−チエニルプリン(s)、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもった2−オキソ(1H)ピリジン(y)をデザインし、このx−y、s−y塩基対形成をKlenowフラグメントによるDNA中への取り込み効率により調べた。その結果、鋳型中のxに対するyの取り込みは低い選択性しか示さなかったが、sに対するyの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されていた(図1)。
【0006】
上記s−y塩基対の開発によって、RNA中に選択的にyを導入することが可能になった。本発明者らはさらに、yに機能性の置換基が結合した物質が得られれば、アプタマーやリボザイム等の新規機能性分子が創製可能にある、と考えた。そこで、5位がヨウ素等で置換されている5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを有する核酸を開発した。人工塩基対の開発の経緯、並びに5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド及びヌクレオチドについては、WO2004/007713(2004年1月22日公開)に詳述されている。
【0007】
核酸の標識及び検出
従来より、放射性元素、蛍光色素等を用い核酸を標識することが行われている。しかし、天然型の塩基を含む核酸の場合は、核酸の末端のみが標識されるか、あるいは天然型塩基(A、T、G、C)のいずれか標識されたものを核酸内部に取り込む場合は、標識核酸が多数ランダムに取り込まれる、という本質的な問題がある。核酸の内部を、例えば蛍光色素を用いて、部位特異的に標識する方法が希求される。
【0008】
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】WO2004/007713
【非特許文献】
【0010】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、一態様において、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。本明細書においては、5−FAM及び6−FAM、5−TAMRA及び6−TAMRA、5−HEX及び6−HEX、5−TET及び6−TET、ならびに、5−ROX及び6−ROX、の各々を特に区別する必要のない場合は単に、それぞれ、FAM、TAMRA、HEX、TET、及びROXと記載することがある。
【0012】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、別の態様において、前記塩基の5位が、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【0013】
本発明はさらに、本発明の前記5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた、核酸を提供する。本発明の核酸中のヌクレオチドは、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドと塩基対を形成しうる。本発明の核酸は、一態様において、前記5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する。
【0014】
本発明はさらにまた、標的タンパク質の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、一態様において
1)本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
【0015】
本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程3)及び4)に代えて
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
【0016】
本発明はまた、本発明のヌクレオチドを利用して核酸の二本鎖形成を検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法I又はIIの方法を用いて行うことができる。
【0017】
方法I
I−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、5位が消光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【0018】
方法II
II−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、2種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、前記2種類の核酸をハイブリダイズさせ、
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明者らは上記問題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、転写で選択的に機能する人工塩基対の開発に成功し、これを用いてRNA中に部位特異的に修飾ヌクレオチドを導入することを可能にした。本発明の修飾ヌクレオチドは、転写によりRNA中に取り込まれ、核酸の部位特異的な蛍光標識を可能にした。本発明者はさらに、標識核酸と相互作用する分子(核酸、タンパク質)などを検出するシステムを作り出すことに成功した。
【0020】
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の5位置換ピリジン塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合していることを特徴とする。
【0021】
本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基に相当する塩基や、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基に相当する塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、2’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を2’位に有する2’−置換リボフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チオリン酸であってもよい。つまり、糖部分及びリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはRNAの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはDNAの構成成分となる。
【0022】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基に相当する塩基の5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【0023】
蛍光色素は、公知の蛍光色素を利用可能であるが、好ましくは、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される。フルオレセイン及びローダミンは、一般的に開環型及びスピロ型の二通りで表記される。例えば、5−カルボキシフルオレセインを開環型で表記すると、
【0024】
【化1】
【0025】
となり、そしてスピロ型で表記すると、
【0026】
【化2】
【0027】
となる。図1及び図3ではこれらの蛍光色素は開環型で示しているが、スピロ型で表記したものも本発明に含まれる。これらの蛍光色素については、例えば Tuschl et al.,1994;Misra et al.,2004;Gibson et al.,1996及び、Chehab et al.,1989に詳述されている。
【0028】
例えば、FAMの吸収極大波長は493nm、蛍光極大波長は522nmである。また、TAMRAの吸収極大波長は553nm、蛍光極大波長は578nmである。DANSYLの吸収極大波長は335nm、蛍光極大波長は518nmである。HEXの吸収極大波長は535nm、蛍光極大波長は556nmである。TETの吸収極大波長は521nm、蛍光極大波長は536nmである。5−ROXの吸収極大波長は567nm、蛍光極大波長は591nmである。6−ROXの吸収極大波長は570nm、蛍光極大波長は590nmである。
【0029】
本発明のヌクレオチドは5位置換基として蛍光分子を有するため、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。また、各蛍光色素によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。
【0030】
消光色素は、公知の消光色素を利用可能であるが、好ましくは、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される。これらの消光色素の存在により、蛍光色素の蛍光放出が消光色素へのエネルギー転移により抑制され、蛍光色素の蛍光が検出できなくなる。具体的には、DABCYLは、 FAM、TET、JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン)、HEX、Cy3(Amersham Biosciences社)、TAMRA、Cy3.5(Amersham Biosciences社)、ROX、Texas Redなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し;BHQ1は、FAM、Oregon Green 514(Molecular Probes社)、TET、Bodipy R6G−X(Molecular Probes社)、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red−X(Molecular Probes社、TAMRAなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し;そして、BHQ2は、HEX、Cy3、Rhodamine Red−X、TAMRA、Cy3.5、ROX、Texas Red−X、Bodipy TR−X(Molecular Probes社)、LightCycler 640(Roche社)、Boidipy 630/650−X(Molecular Probes社)、Cy5(Amersham Biosciences社)などの蛍光色素の蛍光放出を消光する。
【0031】
これらの消光色素については、例えばTyagi et al.,1996及びBoguszewska−Chachulska et al.,2004、に詳述されている。
【0032】
本明細書中、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基の5位に直接又はリンカーを介して結合している、蛍光色素及び/又は消光色素を、便宜上必要に応じ5位の「置換基」と呼称することがある。また、上記蛍光色素及び消光色素は、例えば、プロリゴ・ジャパン株式会社、Insitech INC.、Invitrogen、Sigma−Aldrich、Biosearch Technologies、Amersham Biosciences等から購入することが可能である。
【0033】
本発明の蛍光色素又は消光色素は、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基の5位に直接結合させても、あるいはリンカーを介して結合させてもよい。リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、下記の化学式I−III
【0034】
【化3】
【0035】
[式I中、nは1ないし5の整数から選択される]
【0036】
【化4】
【0037】
[式II中、m及びlは、1ないし5の整数から各々独立に選択される]
及び
【0038】
【化5】
【0039】
からなるグループから選択される。
上記n、m及びlは独立に選択され、好ましくは1ないし5、最も好ましくは、5である。リンカーが短いものは、転写反応において取り込まれる効率が僅かに落ちる。よって、長いリンカーである化学式I又はIIのリンカーが好ましい。また、化学式I−IIIのアミノアルキニル基部分は、三重結合部分が、単結合又は二重結合の対応するアミノアルキル基、又はアミノアルケニル基であってもよい。
【0040】
その他、リンカーとしては、例えば、ジアミノエトキシエーテル型の
−NH−(CH2CH2O)n−NH−
(Barnacchi et al.,2001参照)、又は、
−[PO3]−(CH2)6−S−CH2−CO−、もしくは
−[PO3]−(CH2)7−NH−
(Tyagi et al.,1996参照)、のような構造のものが利用できる。
【0041】
本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることはない。3−(β−D−リボフラノシル)−ピリジン−2(1H)−オンに、先ず5位に置換基を導入し、次いで、三リン酸を導入してもよい。あるいは、3−(β−D−リボフラノシル)−ピリジン−2(1H)−オンに、先ず三リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。特に、リンカー等の大きな基を導入する場合、先ず、ヨード等の光反応性基を導入して活性化してから、置換してもよい。好ましくは、反応基による活性化、リンカーの導入、三リン酸の導入、最後に置換基を導入する、また、置換基を導入する際の反応条件などは、ピリジンにこれら置換基を導入する反応の場合を参照して行うことができる。
【0042】
本発明の一態様として、蛍光色素又はアミノ基を化学式Iの長いリンカーを介して5位に導入したyTPの合成を図2に示した。さらに、化学式IIIの短いリンカーでFAMを結合したyTP(short FAM−yTP)の合成を図3に示した。まず、yのヌクレオシドの5位をヨウ素化し、これにリンカーを結合し、三リン酸化、保護基の除去を行いアミノ基を導入したyTP(NH2−yTP)を合成した。このNH2−yTPを、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、あるいは、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)のコハク酸イミドエステル体で処理することにより、これらの色素を導入したFAM−yTPとTAMRA−yTPが得られた(実施例1−9)。
【0043】
あるいは、本発明における蛍光色素又は消光色素による、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドの修飾は、単独のヌクレオチド合成時ではなく、当該ヌクレオチドを含む核酸を転写等によって合成した後に行うことも可能である。実際、本願明細書の実施例13では、転写によるRNA分子の合成後、蛍光基を導入することに成功した(図7)。好ましくは、大過剰量の蛍光分子のコハク酸イミドエステル誘導体を使用する。5位にリンカーを結合させた2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、核酸分子の内側(中央側)に位置するより、末端に存在する方が導入効率が高いと期待される。
【0044】
あるいは、単独のヌクレオチド合成時、又は、転写もしくは複製等によって核酸合成された後の蛍光分子又は消光分子による修飾には、上述の蛍光分子又は消光分子のコハク酸イミドエステル誘導体の他に、蛍光分子又は消光分子のイソチオシアナート誘導体(例えば、FAMのイソチオシアナート誘導体)又はスルホニルクロリド誘導体(例えば、DANSYL−クロリド)を用いることによって行うことも可能である。
【0045】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、1より多くのヌクレオチドが、5’→3’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAを含む。二本鎖は、DNA/DNA、RNA/RNA、又はDNA/RNAであってもよい。また、DNAには、RNAを鋳型として逆転写してなるcDNAも含まれる。あるいは、核酸は3本鎖、4本鎖等も形成しうる。
【0046】
本発明者らは、核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製へ取り組んでいる。新たに開発された人工塩基対の態様として、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン(sと命名)と2−オキソ(1H)ピリジン(yと命名)との塩基対、並びに2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン(vと命名)とyとの塩基対が含まれる。(図1)。従来技術に対して、蛍光色素(及び消光色素)を結合した第5番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれば、核酸の標識、そして、それによる核酸の検出が非常に簡便になる。本発明ではs−yという人工塩基対を用いて、これを可能にした。
【0047】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドとが塩基対を形成することが可能である。図1にyとs(2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基)、あるいは、yとv(2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基)と例示されているように、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基と、2箇所で水素結合を生じる。本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、立体構造上、天然型プリン塩基A(アデニン)及びG(グアニン)とは塩基対を形成できない。そして、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基は立体障害のため、天然型T(チミン)、U(ウラシル)及びC(シトシン)とは塩基対を形成できない。よって、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基と特異的に塩基対を形成することが可能である。
【0048】
よって、本発明の核酸は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、態様を含む。6位置換された2−アミノプリン−9−イル基は、好ましくは2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)又は2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基(v)である。後述の実施例で示されたようにvの方がsよりも転写によるyの取り込む効率がよいため、より好ましくは、vである。
【0049】
本発明において、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは、異なる2本の核酸上に存在して塩基対により二本鎖を形成しうる。あるいは、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは同一の一本の核酸上に存在してもよい。この場合、塩基対により、一本鎖はループ構造を形成してもよい。
【0050】
後述するように、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はRNAi(RNA干渉)に用いられるRNAとして使用されうる。あるいは、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれたDNA又はRNAは、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。
【0051】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸の合成
本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、DNA又はRNA等の核酸に取り込むことが可能である。具体的には、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、sあるいはvを含む鋳型DNAを用いてT7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行うと、yの基質(yTP)が部位特異的に、sあるいはvに相補して、RNA中に取り込まれる。yは、その5位を化学的に修飾することができるので、種々の機能性のy誘導体をRNA中の特定の部位に取り込ませることが出来る。
【0052】
よって、限定されるわけではないが、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、本発明の核酸を組み込む、ことを含む、方法によって調製することが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってDNA又はRNAに取り込んでもよい。
【0053】
例えば、5位に蛍光色素をもつ標識ウリジン(U)を転写反応によりRNA中に導入する場合には、UTPと標識UTPの存在比を変えて転写反応を行い、Uの位置をランダムに標識Uで置換するか、あるいはUTPの代わりに標識UTPだけを転写反応に用いてUの位置を全て標識Uに置換するしかない。この場合、標識Uの導入によってRNAの高次構造が変化してしまったり、RNAの機能に支障をきたすこともある[Jensen et al.,1995]。
【0054】
これに対し、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基と特異的に塩基対を形成する。よって、所望の位置に6位置換−2−アミノプリン−9−イル基が導入されているDNA又はRNAを鋳型として、転写、複製又は逆転写反応を行うことにより、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的(部位特異的)に導入することが可能となった。
【0055】
転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はT7 RNAポリメラーゼ(Takara等)、複製反応は、クレノウフラグメント(KF)、逆転写反応はAMV Reverse Transcriptase XL (AMV−RT)(Life Science社)を使用することが可能である。複製反応は、反応中に6位置換された2−アミノプリン−9−イル基が除去されてしまうのを防ぐために、例えば、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性をもたないTaq DNAポリメラーゼ(Takara TaqTM)を用いてs又はvを含むプライマーによる鋳型DNAのPCR増幅も可能である。
【0056】
なお、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、公知の方法、例えば、[Fujiwara et al.,2001]に記載の方法で合成可能である。
【0057】
本発明では、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基の、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基との特異的な塩基対を利用して、転写反応の1段階で位置選択的に本発明のヌクレオチドをRNAに取り込むことが可能になった。本発明の非天然型の塩基を含む5種類の塩基からなるRNAを任意に調製出来れば、核酸の特異的な標識が可能になり、その有用性・汎用性は非常に高い。
【0058】
本発明の核酸のアンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム又はアプタマーとしての利用
本発明の一態様において、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はRNAi(RNA干渉)に用いられるRNAとして使用されうる。アンチセンスDNA若しくはRNAとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるDNA又はRNAである。標的とする遺伝子配列(センス鎖)の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスDNA又はRNAは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、RNAを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、in vitroセレクション法によって得られた、特定の分子に結合する機能を有する核酸である。RNAiとは、細胞内で見つかったシステムで、短いRNA断片が翻訳を制御するシステムであり、外部から標的遺伝子に対応した短いRNA断片を細胞内に加えたり、発現させたりすることで、標的遺伝子の発現を抑える手法である。
【0059】
例えば、in vitroセレクションによって得られる、5位置換2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を含むアプタマーは、標的タンパク質と架橋反応する等の新機能を持つRNA分子を創製することも可能となる[Kimoto et al, 2004]。
【0060】
さらに、蛍光分子をRNAアプタマー中に導入してアナライト(analyte)として活用する例も報告されている[Jhaveri et al.,2000;Yamamoto et al.,2000;Fang et al.,2001]。
【0061】
これまでに、修飾塩基として、フルオレセイン−12−ウラシル(F−12−U)[Jhaveri et al.,2000]、5−(1−ペンチニル)ウラシル[Latham et al.,1994]、5−(3’’−アミノプロピニル)ウラシル[Battersby et al.,1999]、5−ヨードウラシル(5IU)[Jensen et al.,1995]、5−ブロモウラシル(5BrU)[Golden et al.,2000]をin vitroセレクションで利用した例が報告されている。しかしながら、これらの例では全て、DNAもしくはRNAプールの調製の段階から修飾塩基を天然型塩基(TもしくはU)と置換している。
【0062】
蛍光分子を含む本発明の核酸(アプタマー)は標的タンパク質を検出するためアナライトとして利用することが可能である。本発明は、本発明の核酸を利用した標的タンパク質の検出方法を含む。本発明の検出方法は、一態様において
1)本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
【0063】
本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程3)及び4)に代えて
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
【0064】
本発明において、標的タンパク質は特に限定されず任意のものを対照とすることができる。結合する核酸分子(アプタマー)の塩基配列が解明されているものは容易に利用可能である。そのような標的タンパク質とアプタマーの組み合わせの例は、本明細書中に参考文献として援用されるWO2004/007713の参考例1に記載のRaf−1タンパク質とRNA 9A(WO2004/007713 図13)及びRNA 9Bである。
【0065】
支持体としては、例えば、ニトロセルロースフィルター等が利用可能である。これらの支持体は標的タンパク質は付着するが、核酸分子は単独では結合しない。核酸はタンパク質に結合した場合のみ、タンパク質を介して支持体に付着する。支持体に付着したタンパク質−核酸の複合体は、核酸に結合した蛍光を測定にすることにより検出することができる。
【0066】
本明細書の実施例14では、FAM−yをRaf−1タンパク質に特異的に結合するRNAアプタマー(抗−Raf−1アプタマー)RNA 9Aの90番目(全長100ヌクレオチド)に導入し、この蛍光色素を導入したRNAアプタマーと種々の濃度のRaf−1タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合したRNAアプタマーの蛍光を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた(図8)。これは、従来のラジオアイソトープでRNAを標識する方法に代わる簡便な方法である
本発明の方法は、標的タンパク質の濃度を好ましくは0pmol−1000pmol、より好ましくは0pmol−500pmol、最も好ましくは1pmol−100pmolの範囲で、定量的に検出することが可能である。
【0067】
支持体を利用する代わりに、限外濾過膜を用いて標的タンパク質を溶液中に選択的に留めてもよい。限外濾過膜を用いた標的タンパク質の検出方法は、前記工程3)及び4)に代えて
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでよい。限外濾過膜は標的タンパク質のサイズに応じて適宜公知のものを使用することが可能である。
【0068】
核酸の二本鎖の検出方法
本発明はさらに、本発明の核酸を利用した核酸の二本鎖の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法I又はIIの方法を用いて行うことができる。
【0069】
方法I
I−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、5位が消光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【0070】
方法II
II−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、2種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、前記2種類の核酸をハイブリダイズさせ、
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【0071】
本発明の方法は、蛍光色素と消光色素、あるいは2種の蛍光色素が各核酸分子に存在する場合に、核酸の二本鎖が形成され色素同士が物理的に近傍に存在すると、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer)が生じて蛍光スペクトルが変化する。本発明の方法は、核酸の二本鎖の形成をFRETによる蛍光スペクトルの変化の測定によって検出するものである。
【0072】
「蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)」は、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴により励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー(供与体)、受け取る分子はアクセプター(受容体)と呼ばれる。FRETが生じると、エネルギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったアクセプターは励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、アクセプターが蛍光分子であればその蛍光が観察される。アクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合には観察されていた蛍光がFRETにより観察されなくなる。FRETによるタンパク質の検出、核酸の検出の一般的な方法は公知であり、例えば、RNAアプタマーに2種類のFRETを起こす色素を導入して、標的タンパク質を検出する方法(Jhaveri et al.,2000)や、ヘアピン型核酸を利用した相補鎖核酸の検出法(Tyagi et al.,1996)が知られている。その他、FRETに関しては、Walter et al.,2001及びKlostermeier et al.,2001に概説されている。
【0073】
FRETが生じるためには、以下の3条件を満たす必要がある。i)ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はない。ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルが30%以上重なっていることが好ましく、50%重なっていることがより好ましい。ii)ドナーとアクセプターが物理的に近距離に存在すること。FRETが50%の確率で生じる距離は1nmないし10nmと考えられており、FRETの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。例えば、方法Iの場合、核酸が二本鎖を形成した場合に、蛍光色素で置換された5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基(y)を塩基として有するヌクレオチドに対し、消光色素で置換されたyを有するヌクレオチドが近接し、蛍光色素と消光色素の色素間の距離が好ましくは30nm以内、より好ましくは10nm以内、最も好ましくは5nm以内である場合に蛍光スペクトルの変化が検出可能である。iii)ドナーとアクセプターの相対的な向きが適切であること。
【0074】
本発明で使用される蛍光色素の最大吸収スペクトルと蛍光スペクトルを以下にまとめた。
【0075】
【表1】
【0076】
よって、方法IIにおいて、アクセプター及びドナーの組み合わせとして使用できる態様は下記の通りである。
【0077】
【表2】
【0078】
一方、方法Iにおいて、消光色素はドナーの種類に限定されず、アクセプターとして一般的に使用することができる。
本発明の方法は、核酸を合成する際、例えば鋳型DNAからRNAを調製する際に、同時にRNAを部位特異的に蛍光標識化することが出来るという利点があり、種々の検出方法、同定方法、診断方法等に応用できるものである。
【0079】
低分子化合物の検出方法
本発明はさらにまた、低分子化合物を検出する方法を提供する。
本発明の検出方法は、
1)本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【0080】
本発明において、好ましくは前記試料は溶液であり、工程2)において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む。本発明において試料が液体試料の場合、例えば、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を含む溶液を、セルに入れて、蛍光スペクトルの装置に装着し、そこに低分子化合物を含むと考えられる液体試料を加えて、そのまま蛍光強度の変化を測定することが可能である。蛍光強度が変化した場合、標的となる低分子化合物の検出と定量が可能である。定量は、例えば、既知の濃度の標的低分子化合物を含む試料を用いて予め作成した蛍光スペクトル、測定試料の蛍光スペクトルを比較することによって行うことが可能である。
【0081】
本発明の方法によって測定される低分子化合物は特に限定されないが、好ましくは1)核酸へ結合する性質を有する、そして、2)核酸が本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを含むものであっても、核酸への結合が影響を受けない、という性質を有する。限定されるものではないが、低分子化合物の分子量は、約500ないし1000である。
【0082】
本発明において、非限定的に、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、アミノ酸からなるグループから選択される(非特許文献49)。
限定されるわけではないが、本発明の検出方法によって、好ましくは約10nMないし約10mM、より好ましくは約100nMないし約1mM、さらにより好ましくは約1μMないし約20μMの低分子化合物を検出することができる。
【0083】
本明細書中、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシドを「5位置換−y」もしくはもしくは「5−修飾y」、特に置換基が蛍光色素の場合には、「蛍光色素−結合y」と記載することがある。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1】図1は、s−yとv−yの人工塩基対と5位を修飾したyの誘導体を示す。
【図2】図2は、蛍光色素又はアミノ基を長いリンカーで結合したyTPの合成スキームを示す。各工程の条件及び収率は下記の通りである。
【0085】
(a)DMTr−Cl、ピリジン、室温、82%;
(b)i)(CH3CO)2O、ピリジン、室温、ii)C2H5OH、還流、84%;
(c)CuI、Pd[P(C6H5)3]4、DMF、(C2H5)3N、室温、次いで、6−(トリフルオロアセタミド)カプロン酸 プロプ−2−イニルアミド、88%;
(d)CHCl2COOH、CH2Cl2、0℃、74%;
(e)2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オン/ジオキサン、トリ−n−ブチルアミン、ビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェート、I2/H2O/ピリジン、ジオキサン、ピリジン、室温、次いでNH4OH;
(f)R−N−スクシンイミジルエステル/DMF、0.1M NaHCO3、aq.、室温、次いでNH4OH。
【図3】図3は、蛍光色素(FAM)を短いリンカーで結合したyTPの合成スキームを示す。
【図4】図4は、FAM−yTPとTAMRA−yTPの蛍光特性を示す。図4aはFAM−yTP及びTAMRA−yTPの吸収スペクトルを示し、図4bはFAM−yTP及びTAMRA−yTPの蛍光スペクトルを示す。ダイヤモンド形は、FAM−yTPの結果を、正方形は、TAMRA−yTPの結果を示す。
【図5a】図5aは、T7 RNAポリメラーゼによるFAM−yTP、TAMRA−yTPのRNAへの導入を示す。鋳型がAの場合を100とする相対収率は、レーン1−9の順に、103、49、100,76、26、100、61、21、100であった。
【図5b】図5bは、T7 RNAポリメラーゼによるshort FAM−yTP、FAM−yTP、TAMRA−yTP、Dansyl−x−yTPのRNAへの導入を示す。鋳型がAで天然型塩基のみの場合を100とする相対収率は、レーン1−9の順に、72、108、80、96、62、110、48、94、100であった。
【図6】図6は、2次元TLCによるRNAリガンド中に取り込まれたNH2−yと天然型ヌクレオチドの組成分析を示す。
【図7】図7は、NH2−yを導入したRNAの転写後の蛍光標識化を示す。標識化の収率は、FAM−SEを×100、×1000使用した場合に各々6%、40%、TAMRA−SEを×10、×100、×1000使用した場合に各々13%、66%、99%であった。
【図8】図8は、FAM−yTPのRNAへの導入のアンチ−(Raf−1)アプタマーへの部位特異的導入とその応用例(Kd測定)を示す。最終のBio−Rad Molecular Imager FxProの測定において、レーザーは488nm、530nm BandPathfilterを使用した。
【図9】図9は、テオフィリン結合性RNAアプタマーの構造を示す。(a)2次構造;(b)テオフィリン結合部位に関与するヌクレオチド間の相互作用(点線は塩基間での水素結合を示す);(c)U6−U23−A28からなる塩基トリプレット構造;(d)U6を5位置換−2−オキソ(1H)ピリジンに置き換えた場合でのトリプレット構造。
【図10】図10は、T7転写による、yまたは5位置換y(5−修飾塩基)のテオフィリン結合性アプタマーの部位特異的導入を示す。
【0086】
(A)U6の部位にyまたは5−修飾塩基を特異的に導入するための転写スキーム
5−修飾塩基の導入部位に対して相補的な位置にsを含む2本鎖鋳型DNAを用いて、yTPまたは5位置換yTP(Ph−yTPおよびI−yTP)存在下で転写を行った。テオフィリン結合性アプタマー(41ヌクレオチド)中の番号付けは、非特許文献43に記載された33ヌクレオチドからなるアプタマーでの番号付けと対応させた。転写は20μlスケールで行い、反応組成は、40mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01%TritonX−100、1mM 天然型ヌクレオチド(NTP)および1mM yTP若しくは1mM Ph−yTP若しくは0.25mM I−yTP、2μCi[α−32P]ATP、2μM 鋳型DNAおよび2.5単位/μlのT7 RNAポリメラーゼである。
【0087】
(B)U6の箇所にI−y若しくはy若しくはPh−yを導入したアプタマー(I−y6−41、y6−41、Ph−y6−41に相当)のゲル電気泳動図。
sを含む鋳型(レーン1−3:temp59s)又はsの代わりにAを含む鋳型(レーン4:temp59)を用いて、上記濃度のyTPもしくは5位置換yTP存在下で転写を行い、その産物をゲル電気泳動で解析した。
【0088】
(C)転写産物のヌクレオチド組成分析。
転写産物を0.75単位のRNaseT2存在下で、15mM 酢酸ナトリウム溶液(pH4.5)中、37℃で90分間消化し、その消化産物をMerck HPTLCプレート(100x100mm)上で2次元に展開して解析した。1次元目、2次元目の展開溶媒はそれぞれ、イソ酪酸−アンモニア−水(体積比66:1:33)、イソプロピルアルコール−塩酸−水(体積比70:15:15)である。TLCプレート上のスポット(各ヌクレオチドに対応)の放射活性をバイオイメージングアナライザーで定量し、その結果をTLCパネルの下に示した。
【0089】
値は以下の式を用いて決定した。
【0090】
【化6】
【0091】
各ヌクレオチドの理論値を括弧内に記載してある。
【図11】図11は、特異的な位置にy又は修飾−yを有するRNAアプタマーの3H−標識テオフィリンとの結合曲線を示す。y又は修飾−yを導入した箇所を括弧内に記載した。
【0092】
緑線:short FAM−y(6); 黄線:FAM−y(6)
ピンク線:TAMRA−y(6); 水色線:Ph−y(6)
うす茶色:I−y(6); 黒色線:y(6)
点線白丸:y(23); 波線×:y(24)
オレンジ線:非修飾
【図12】図12は、本発明の各種非天然型塩基を有するヌクレオチドで部位特異的に標識されたテオフィリン結合性RNAアプタマーの、蛍光スペクトルを示す。
【0093】
RNAアプタマーは、short FAM−y(a)、FAM−y(c)またはTAMRA−y(d)のいずれかで標識し、様々な濃度のテオフィリン(0−20μM)又はカフェイン(20μM)の存在下での蛍光スペクトルを測定した。黒線、青線、水色線、緑線、オレンジ線、赤線は、各々0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、10μM及び20μMのテオフィリンの結果を示す。赤線点線は、20μMのカフェインの結果を示す。図12bは、short FAM−y標識RNAアプタマーのテオフィリン存在下での蛍光強度変化において、522nmにおける蛍光強度をテオフィリン濃度に対してプロットした曲線である。
【実施例】
【0094】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【0095】
以下、実施例1−9は合成実施例を記載する。
実施例1 3−(5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
3−(β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(178mg,505μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(5ml,0.1μM)に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル(183mg,540μmol)を加え、室温で1時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0→100:2)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(272mg,416μmol,収率82%)として得た。
【0096】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6) δ3.09−3.20(m,2H), 3.70−3.86(m,8H), 3.92−3.94(m,1H), 4.73−4.76(m,2H), 5.27(bs,1H), 6.89(d,2H,J=8.9Hz), 7.18−7.43(m,9H), 7.59−7.61(m,2H), 11.9(bs,1H).
実施例2 3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例1で合成した3−(5−O−ジメトキシトリチルl−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(266mg,406μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(4ml,0.1μM)に溶解させ、酢酸無水物 (110μl,1.17mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をエタノール(50ml)に溶解させ、1時間半還流させた。濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:1→100:4)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(253mg,342μmol,収率84%)として得た。
【0097】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6)・δ 1.96(s,3H), 2.04(s,3H), 3.14(m,1H), 3.29−3.31(m,1H), 3.73(s,6H), 4.10−4.15(m,1H), 4.91(d,1H,J=3.6Hz), 5.25−5.33(m,2H), 6.88(d,4H,J=8.9Hz), 7.21−7.39(m,9H), 7.66(d,1H,J=2.3Hz), 7.74(d,1H,J=2.3Hz).
実施例3 3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例2で合成した3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(244mg,330μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を2回行った。ヨウ化銅(13.3mg,69.8μmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(36.4mg,31.5μmol)を加え、これらを無水DMF(2ml)に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン(85μl,610μmol)を加え、遮光下室温で攪拌した。これにN−(2−プロピニル)−6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド(240mg,908μmol)のDMF(1.5ml)溶液を滴下し、室温で3.5時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/ヘキサン(1:1)で希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0.5→100:3)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(255mg,291μmol,収率88%)として得た。
【0098】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6) δ 1.16(m,2H), 1.41−1.49(m,4H), 1.89−2.07(m,8H), 3.13(dd,2H,J=6.6 and 12.9Hz), 3.23−3.24(m,2H), 3.73(s,6H), 3.90−3.92(m,2H), 4.10−4.13(m,1H), 4.88(d,1H,J=3.6Hz), 5.25−5.33(m,2H), 6.87(d,4H,J=8.9Hz), 7.21−7.38(m,9H), 7.56−7.58(m,2H), 8.13(t,1H,J=5.1Hz), 9.38(bs,1H), 12.0(bs,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C46H49F3N3O11 [M+1]+: calcd,876.3319; found,876.3369.
実施例4 3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例3で合成した3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(245mg,279μmol)を無水ジクロロメタン(46ml)に溶解させ、0℃で攪拌させながらジクロロ酢酸(470μl,5.69mmol)を加え、15分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に室温で滴下し、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで20回以上抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0.5→100:4)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(119mg,207μmol,収率74%)として得た。
【0099】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6) δ 1.19−1.27(m,2H), 1.41−1.55(m,4H), 2.00(s,3H), 2.02(s,3H), 2.08(t,2H,J=7.3Hz), 3.14(dd,2H,J=6.8 and 12.9Hz), 3.49−3.68(m,2H), 4.01−4.05(m,3H), 4.85(d,1H,J=5.3Hz), 5.15−5.19(m,2H), 5.24(t,1H,J=5.4Hz), 7.58(d,1H,J=2.5Hz), 7.66(d,1H,J=2.5Hz), 8.26(t,1H,J=5.1Hz), 9.38(bs,1H), 12.1(bs,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C25H31F3N3O9 [M+1]+: calcd,574.2012; found,574.2061.
実施例5 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (NH2−yTP)の合成
実施例4で合成した、3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(58.3mg,102μmol)を50mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μl)及び無水ジオキサン(300μl)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μl,110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μl)及びビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(300μl)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)を加えて3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水に溶解させて室温で3時間攪拌した後に、凍結乾燥させた。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―15% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
【0100】
1H NMR (270MHz,D2O) δ 1.13(t,18H,J=7.3Hz), 1.21−1.32(m,2H), 1.48−1.61(m,4H), 2.19(t,2H,J=7.3Hz), 2.83(t,2H,J=7.3Hz), 3.05(q,12H,J=7.3Hz), 3.95−4.20(m,7H), 4.88(d,1H,J=3.0Hz), 7.49(d,1H,J=2.0Hz), 7.83(d,1H,J=2.0Hz).
31P NMR(109MHz,D2O) δ −22.19(t,1H,J=20.1Hz), −10.60(d,1H,J=20.1Hz), −8.84(d,1H,J=20.1Hz).
MS(ESI) for C19H29N3O15P3 [M−1]−: calcd,632.08 ; found,631.84.
実施例6 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (FAM−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(10μmol)を5mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,1.5ml)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(5.5mg,11.6μmol)のDMF溶液(200μl)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で3.5時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(3.0μmol,30%)を得た。
【0101】
1H NMR(270MHz,D2O) δ 1.14(t,27H,J=7.3Hz), 1.20−1.40(m,2H), 1.45−1.65(m,4H), 2.10−2.35(m,2H), 2.90−3.60(m,22H), 3.70−4.20(m,5H), 6.55−6.85(m,4H), 7.00−7.40(m,4H), 7.50−7.70(m,1H), 7.90−8.05(m,1H), 8.10−8.20(m,1H).
31P NMR (109MHz,D2O) δ −21.75, −10.40, −9.38.
MS(ESI) for C40H39N3O21P3 [M−1]−: calcd,990.13; found,989.98.
実施例7 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−(テトラメチルローダミン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (TAMRA−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(8μmol)を5mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,1.2ml)に溶解させ、5−カルボキシテトラメチルローダミン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(5mg,9.5μmol)のDMF/水混合溶液(150/150μl)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で3.5時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液) 及びC18−HPLC (濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(4.0μmol,50%)を得た。
【0102】
1H NMR(270MHz,D2O) δ 1.13(t,27H,J=7.3Hz), 1.25−1.40(m,2H), 1.50−1.65(m,4H), 2.10−2.35(m,2H), 3.00−3.22(m,32H), 3.40−4.00(m,7H), 4.80−4.85(m,1H), 6.55−6.60(m,1H), 6.65−6.75(m,2H), 6.80−6.90(m,1H), 6.98−7.05(m,1H), 7.05−7.20(m,2H), 7.40−7.50(m,2H), 7.95−8.05(m,1H), 8.08−8.15(m,1H).
31P NMR (109MHz, D2O) δ −23.00− −22.00(m,1H), −11.50− −10.50(m,1H), −10.50− −9.50(m,1H).
MS(ESI) for C44H49N5O19P3 [M−1]−: calcd,1044.22; found,1043.90.
実施例8 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−[6−[(5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルフォニル)アミノ]ヘキサンアミド]ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (Dansyl−x−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(9μmol)を50mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M ホウ酸ナトリウム水溶液(pH8.5, 1.8ml)に溶解させ、6−[(5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルフォニル)アミノ]ヘキサン酸 N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(20mg,44μmol)のDMF溶液(1.8ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で48時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら1時間反応させた。これを減圧濃縮させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(6.2μmol,68%)を得た。
【0103】
1H NMR(270MHz,D2O) δ 0.75−0.90(m,2H), 0.92−1.10(m,4H), 1.08−1.26(m,29H), 1.26−1.40(m,2H), 1.40−1.52(m,2H), 1.66(t,2H,J=7.3Hz), 2.14(t,2H,J=7.3Hz), 2.72−2.86(m,8H), 2.95(t,2H,J=6.6Hz), 3.06(q,18H,J=7.3 Hz), 3.85−4.20(m,7H), 4.75(d,1H,J=3.0Hz),7.25−7.32(m,2H), 7.52−7.65(m,3H), 8.10(d,1H,J=7.3Hz), 8.15(d,1H,J=8.9Hz), 8.33(d,1H,J=8.9Hz).
31P NMR(109MHz,D2O) δ −22.56, −10.54, −10.09. MS (ESI) for C37H51N5O18P3S1 [M−1]−: calcd,978.22; found,978.34.
実施例9 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (short FAM−yTP) の合成
1)3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン
実施例2で合成した、3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(268mg、362μmol)を、CH3CN中に溶解し、乾燥するまで真空内で2回蒸発させた。残渣をDMF(2ml中)に、Cu(I)I(12.4mg、65.2μmol)及びPd[P(C6H5)3]4(37.7mg、32.6μmol)と共に溶解した。トリエチルアミン(91μl、652μmol)を加えた後、暗がりで、室温で攪拌した。溶液に、DMF(1,5ml)中の2,2−ジクロロ−N−プロプ−2−イニル−アセタミド(162mg、978μmol)を滴下して加え、溶液を室温で3.5時間攪拌した。反応混合物をEtOAcで希釈した。溶液をH2O及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の0.5−3%CH3OH)によって、3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(251mg、89%)を精製した。ジクロロメタン(32ml)中の3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(251mg、323μmol)に、ジクロロ酢酸(323μl、3.92mmol)を加え、そして、0℃で15分間攪拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液に注ぎ、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで5回抽出した。混合した有機層をMgSO4で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の2−10%CH3OH)によって、産物(136mg、88%)を精製した。
【0104】
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 2.01(s,3H), 2.04(s,3H), 3.50−3.70(m,2H), 4.00−4.05(m,1H), 4.18(d,2H,J=5.4Hz), 4.87(d,1H,J=5.6Hz), 5.10−5.30(m,3H), 6.48(s,1H), 7.63(d,1H,J=2.3Hz), 7.68(d,1H,J=2.0Hz), 9.10(t,1H,J=5.0Hz), 12.08(brs,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C19H21Cl2N2O8 (M+1): calcd, 475.0675; found, 475.0689.
2)3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (short FAM−yTP)
3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(47.5mg,100μmol)を50ml ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μl)及び無水ジオキサン(300μl)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μl,110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μl)及びビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(300μl)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)を加えて3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水(3ml)に溶解させて55℃で3時間攪拌した後に、減圧濃縮した。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)にて精製し、3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−アミノ−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸を得た。これを50mlの滅菌済みチューブに移し、0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,4ml)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(14.5mg,30.6μmol)のDMF溶液(1ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で12時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら30分反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(10.1μmol,10%)を得た。
【0105】
1H NMR (270MHz, D2O) δ 1.14(t,32H,J=7.3Hz), 3.06(q,21H,J=7.3Hz), 4.00−4.35(m,7H), 4.80−4.90(m,1H), 6.65−6.88(m,4H), 6.92−7.06(m,2H), 7.25−7.38(m,1H), 7.48−7.58(m,1H), 7.73−7.85(m,1H), 7.95−8.10(m,1H), 8.24−8.32(m,1H).
31P NMR (109MHz, D2O) δ −22.40, −10.38, −10.38.
MS (ESI) for C34H28N2O20P3 [M−1]−: calcd,877.04; found,877.07.
実施例10 yTP誘導体の量子収率測定
蛍光スペクトルは、FAM−yTP(1.0μM)、TAMRA−yTP(1.0μM)、short FAM−yTP(1.0μM)及びDansyl−x−yTP(1.0μM)の10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)の溶液を25℃で、FP−6500蛍光測定装置(日本分光)により測定した。測定には3x3mmセルを用い、レスポンス 1.0s、感度low、スリットは励起側・蛍光側ともに3nmに固定してスペクトル測定を行った。結果を図4に示す。
【0106】
量子収率(φ)は以下に示す式から算出し、標準物質としてはフルオレセイン(1.0μM in 0.1N NaOH, φs=0.90)を用いた。
φ = (F・As・η2・φs)/(A・Fs・η02)
F; 蛍光スペクトルの面積
A; 励起波長での吸光度
η; 屈折率(水: 1.33)
s; 標準物質
【0107】
【表3】
【0108】
図4及び表3に示されたように、FAM−yTPの定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の493nmで励起すると、522nmに極大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率(φ)は、0.55(pH7.0水溶液中)であった。また、TAMRA−yTPの定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の553nmで励起すると、578nmに極大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率(φ)は、0.50(pH7.0水溶液中)であった。
【0109】
以下、実施例11−13は転写反応実施例を示す。
実施例11 T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応
NH2−yTP、FAM−yTP、TAMRA−yTPのそれぞれを用いて、T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行った。
【0110】
具体的には、二本鎖の鋳型DNA(10μM)のアニーリングを10mM NaClを含む10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.6)中で、95℃、3分→50℃、3分→4℃の徐冷操作で行った。T7転写反応は、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、2μCi[γ−32P]GTP、1mM NTPs、1mM 修飾yTP、2μM 鋳型DNA、及び50単位 T7 RNAポリメラーゼ(Takara)の反応溶液(20μl)で行った。
【0111】
鋳型DNAには、T7プロモーターを含む35量体(35−mer)の鋳型鎖とT7プロモーターの非鋳型鎖21−merとを二本鎖化したものを用いた。そして、鋳型中の一箇所には、s、あるいは、vを導入してある。
【0112】
T7プロモーターを含む35量体(35−mer)(配列番号1)
5’−CACTNCTCGGGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT−3’
N(5)=v(本発明)、s(本発明)又はA(対照)
T7プロモーターの非鋳型鎖21−mer(配列番号2)
5’−ATAATACGACTCACTATAGGG−3’
転写物(配列番号3)
5’−GGGAAUCCCGAGN’AGUG−3’
N’(13)=NH2−y、FAM−y又はTAMRA−y
天然型の基質と等量の修飾基質を加え、37℃、3時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液(20μl)を加えて反応を停止させた。反応溶液を75℃で3分間加熱後、20% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動を行い、転写物をバイオイメージアナライザーで解析した。
【0113】
結果を図5に示す。図5に示されたように、それぞれの修飾基質がRNA中に取り込まれることがわかった。それぞれの修飾基質が取り込まれるとRNA断片17−merのゲル中での移動度が遅くなることから、それらの取り込みが確認された。さらに、それぞれのレーンに天然型の17−merのバンドがほとんど見えないこと、さらに、天然型の鋳型を用いた場合には、移動度の遅いバンドが認められないことから、それぞれの修飾基質が効率よく部位特異的に取り込まれたことがわかった。また、鋳型塩基にsを用いるよりも、vを用いたほうが、転写効率が良かった。天然型の鋳型・基質のみの転写反応と比較すると、NH2−yが取り込まれたRNAは、同程度の収率で得られ、FAM−y、あるいは、TAMRA−yが取り込まれたRNAの収率は、それぞれ、76%、61%であり、非常に効率がよいことが判明した。
【0114】
実施例12 T7 RNAポリメラーゼによる転写反応生成物の塩基組成分析
実施例11に次いで、NH2−yが取り込まれたRNAについて、ヌクレオチドの組成分析を行った。
【0115】
実施例11と同様のT7 RNAポリメラーゼによる転写反応を、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、2μCi[γ−32P]ATP、1mM NTPs、1mM 修飾−yTP、2μM 鋳型DNA、及び50単位 T7 RNAポリメラーゼ(Takara)の反応溶液で行った。転写物を、15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルによる電気泳動後、ゲルからの溶出を行った後、tRNA(0.25OD)を加えてエタノール沈殿を行い回収した。
【0116】
このtRNAを含む溶液(8.5μl)に、RNase T2(1.5μl,1単位/μl)を加えて、37℃で一晩反応を行った。この溶液の0.3μlをTLC (Merck,10cmx10cm)にスポットし、二次元展開を行った。展開液として、一次元目はイソ酪酸:濃アンモニア水:水=66:1:33(v/v/v)、二次元目は2−プロパノール:塩酸:水=65:10:25(v/v/v)を用いた。展開後のスポットをバイオイメージアナライザーで検出し、解析を行った。
【0117】
結果を図6に示す。図6のイメージアナライザーの図には、32Pで標識されたGp×2、Ap×1と、N’p×1が検出される。鋳型のNの位置にvが存在する場合には、対応するN’としてNH2−yが検出され、Upが見出されない。一方、鋳型のNの位置にAが存在する場合には、対応するN’としてUpが検出され、NH2−yが見出されない。ヌクレオチドの組成分析の結果、vに対するNH2−yの特異的な取り込みが確認された。
【0118】
実施例13 NH2−yを含むRNA 17−merの転写後修飾による蛍光基の導入
NH2−yが取り込まれたRNAを用いて、RNA転写後にFAM、あるいは、TAMRAによる修飾も行った。
【0119】
具体的には、実施例11と同様のT7 RNAポリメラーゼによる転写反応で生成したNH2−yを含むRNA17−mer(配列番号3)を、電気泳動(15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲル)で精製した後、ゲルからの溶出、及び、エタノール沈殿により回収した。修飾反応は、RNA17−mer(20μM,2.5μl)を、FAM、又は、TAMRAのコハク酸イミドのエステル体(FAM−SE又はTAMRA−SE)のDMSO溶液(0もしくは0.2-20mM,2.5μl)、0.1M テトラホウ酸ナトリウム−HCl緩衝液(pH8.3)(15μl)と混ぜて、37℃、12時間行った。
【0120】
10M尿素を含む電気泳動用色素溶液(20μl)を加えて反応を停止させ、75℃で3分間加熱後、20% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルで電気泳動を行った後、生成物をバイオイメージアナライザーで解析した。
【0121】
結果を図7に示す。図7に示されたように、大過剰のそれぞれのコハク酸イミドエステル誘導体を用いることにより、それぞれのRNA断片を蛍光標識できることがわかった。このRNA断片では、NH2−yが配列の中央に位置しているが、末端に導入すれば、修飾効率はさらに高くなると期待される。また、NH2−yを導入したRNAは、蛍光色素以外にもいろいろな修飾が可能である。
【0122】
実施例14 フィルター結合法によるタンパク質と部位特異的に蛍光標識したRNAの結合実験
A)転写反応用鋳型の調製
本実施例に使用するRaf−1タンパク質及びRNAアプタマーについては、本明細書中に参考文献として援用されるWO2004/007713の参考例1を参照されたい。
【0123】
転写反応用の鋳型は、以下のPCR反応により調製された。PCR反応の鋳型にはanti−(Raf−1) アプタマー9Aの遺伝子(配列番号4)がサブクローニングされたベクター(TOPO 9A)を用い、また、PCR反応の酵素には、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性がないTaq DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。
【0124】
反応組成は、10mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTPs、1μM プライマー対[39.45 (39−mer);5’−GGTAATACGACTCACTATAGGGAGTGGAGGAATTCATCG(配列番号5)、29.45v90 (29−mer);5’−GCAGAAGCTTvCTGTCGCTAAGGCATATG(配列番号6)]、1ng/μl TOPO 9A、0.025単位/μl Taq DNAポリメラーゼである。
【0125】
反応はPTC−100TM Program Thermal Controller(MJ Research)を用いて、[94℃ 15秒−50℃ 30秒−72℃ 1分]×15サイクル − 72℃ 5分、の条件で行われた。反応溶液をマイクロピュア−EZ(ミリポア)に通して酵素を除去した後、溶液をエタノール沈澱してPCR産物を回収した。サンプルは、滅菌水に溶かして保存し、T7転写反応の鋳型とした。
【0126】
B)T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応(FAM−yを90残基目に含むRNA 9Aの調製)
T7転写反応は、40mM Tris−HCl 緩衝液(pH8.0)、8mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、1mM natural NTPs、1mM FAM−yTP、25ng/μl 鋳型DNA、及び2.5U/μl T7 RNAポリメラーゼ(TaKaRa)を含む溶液で行った。37℃、6時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液を反応溶液と等量加えて反応を停止させた。反応溶液を75℃で3分間加熱後、10% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動を行い、目的の転写反応産物(9A90F;100−mer)が含まれるゲルを切り出した。目的産物を滅菌水でゲルから溶出した後、エタノール沈殿を行い、RNA 9A90Fを回収した。
【0127】
C)フィルター結合法によるタンパク質とRNAの結合実験
結合実験には、human Raf−1のRBD(アミノ酸残基51−131番)のGST融合タンパク質(Raf−1タンパク質)を用いた。本手法では、ニトロセルロースフィルターがタンパク質を吸着する一方、FAM標識されたRNA 9Aは吸着しない性質を利用し、タンパク質−RNA複合体をニトロセルロースフィルターにより単離した。
【0128】
RNA 9A90F、60μl(最終濃度 10nM)を、さまざまな濃度のRaf−1タンパク質、2μl(最終濃度50−800nM)と緩衝液P(PBS、5mM MgCl2)中で混合し、室温(22℃)で30分間インキュベートした。その反応溶液50μlをニトロセルロースフィルター(ミリポア,catalog# HAWP01300)に通し、200μlの緩衝液Pで洗浄した後、フィルター上に吸着したRNAの蛍光量を蛍光スキャナ(Molecular Imager FX Pro、BIO−RAD)により測定した。測定条件は、フィルターが530nm BP(BandPath)、レーザー波長が488nm、PMTセッティングが80%である。カレイダグラフ(Albelbeck Software)を用いて、測定した蛍光量をy、タンパク質濃度をM0として、計算式y=M0×M1/(M0+M2)にあてはめ、最小二乗法によるデータフィッテングを行って解離定数Kd(M2に相当)を求めた。同時に求まるM0は、RNAとタンパク質の結合が飽和した場合(タンパク質量が無限大)でのフィルター上に吸着されるRNAの蛍光量に相当する。結果を図8に示す。
【0129】
本実施例では、本研究の応用例として、FAM−yTPをRaf−1タンパク質に特異的に結合するRNAアプタマー(抗−Raf−1アプタマー)の90番目(全長100ヌクレオチド)に導入し、この蛍光色素を導入したRNAアプタマーと種々の濃度のRaf−1タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合したRNAアプタマーの蛍光を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた。これは、従来のラジオアイソトープでRNAを標識する方法に代わる簡便な方法である。
【0130】
実施例15 テオフィリンに特異的に結合するアプタマーへの蛍光色素−結合yの導入
1)本実施例では、本発明の部位特異的な蛍光標識の可能性を調べるために、気管支拡張剤テオフィリン(非特許文献37、41−46)に特異的に結合する別のアプタマーに、蛍光色素−結合yを導入した(図9a)。RNA分子中の特異的な位置の蛍光色素は、蛍光強度における変化を測定することによって立体構造の変化を検出するために、あるいは、標的分子を検出するために有用である。
【0131】
テオフィリンの結合により、RNAアプタマー中に特有の構造モチーフが生じる(図9b)。複合体では、2組のトリプレット、即ち、U6−U23−A28(図9c)及びA7−C8−G26、並びに2組の独立した塩基、即ち、C22及びU24が、テオフィリンを囲み、高度に特異的なリガンド結合部位を形成する。しかしながら、この部位は、リガンドが存在しない場合、安定しては形成されない(非特許文献37、41−46)。非特許文献37は、蛍光アデニン類似体、2−アミノプリンをアプタマーのC27に導入し、アプタマーとテオフィリンとの結合様式について、ストップトフロー蛍光スペクトルによる解析を報告している。
【0132】
本発明者らは、アプタマー配列内の適当な部位を蛍光色素−結合yで置換し、蛍光強度における変化をモニターすることで、テオフィリンとの結合を検出した。以下、具体的に説明する。
【0133】
2)先ず、蛍光色素−結合yの導入のための、テオフィリン結合性アプタマー内の適当な部位を決定するために、アプタマーの結合モチーフ内のU6、U23又はU24をそれぞれ、非修飾yで置換した場合の効果を調べた。yを有する各アプタマー(41ヌクレオチド)は、sを含む鋳型DNAを用いて、yTP存在下でT7転写を行い、調製された。(図10a)。アプタマーへのyの部位特異的な導入は、2次元TLCを用いたヌクレオチド組成分析により確認された(図10c)。
【0134】
アプタマーのテオフィリン結合に関する解離定数(Kd)を、公知の平衡濾過アッセイ法(非特許文献41)によって、100mM HEPES(pH7.3)、50mM NaCl及び5mM MgCl2を含む溶液中で、3H−標識テオフィリンを用いて測定した。U23及びU24でのyによる置換は、元のアプタマーの結合能力(Kd=331±16nM)と比較して、アプタマーの結合能力を有意に減少させた(Kd>1500nM)。U23の置換については、U23の4−ケト基が、塩基のトリプレットにおいてU6とA28の双方と水素結合を形成する。非天然型塩基yはUの4−ケト基を欠くため、U23をyで置換すると、結合に好ましくない影響を与えうると考えられる。一方、U24の4−ケト基が他の塩基やテオフィリンと直接相互作用していることはNMRによる解析では観察されなかったが、U24の3位の窒素原子は、テオフィリンと水素結合を形成している。したがって、U24の4−ケト基が結合モチーフの形成に重要な役割を果たしており、そして、U24が実際に、アプタマー構造における金属結合及びU−ターン形成(非特許文献42、44)に関与していることが、U24をyに置換することにより、示唆された。
【0135】
一方、U6をyで置換したアプタマーは、解離定数217±13nMで、元のアプタマーに遜色なく、テオフィリンに結合した。このことは、U6の4−ケト基を除いても、アプタマーの結合能力には悪い影響を与えないことを示唆する。実際、この4−ケト基はアプタマー中のU6−U23−A28塩基のトリプレットに関与していない(非特許文献42,43)。さらに、5−フェニルエチニル−2−オキソ(1H)ピリジン(Ph−y)(非特許文献38)及び5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(I−y)(非特許文献22)などの、5−修飾yを、U6の代わりに導入しても、アプタマーは結合能力を維持した(Ph−y置換について、Kd=536±42nM、そして、I−y置換について、Kd=551±68nM、表4及び図11)。
【0136】
表4 修飾−yを有するRNAアプタマーのテオフィリン結合能
【0137】
【表4】
【0138】
a: テオフィリン結合の解離定数は、3H−標識テオフィリン(20nM)及び種々のRNA濃度(25−1500nM)を用いた平衡濾過アッセイで測定した。
b: 蛍光強度変化から求めたテオフィリン結合の平衡定数は、種々のテオフィリン濃度(0−20μM)での、蛍光色素−結合yを有するRNAアプタマー(100nM)の蛍光測定により決定された。
【0139】
U6をyで置換したアプタマーのKd値(Kd=217±13nM)は、非修飾アプタマーのKd値(Kd=331±16nM)よりも若干低かった。従って、U6をyで置換してもテオフィリンを結合するために必須な塩基トリプレットの形成が可能であり、U6は、蛍光色素−結合yの導入のために適した部位である。
【0140】
3)本発明者は、sを有する鋳型DNAを用いT7転写によって、U6の部位にshort FAM−y、FAM−y、又はTAMRA−yを有するアプタマーを調製し、テオフィリンの結合を調べた。short FAM−y及びFAM−yを有するアプタマーの3H−標識テオフィリンへの結合のKd値は、約200nM(表4)であり、これは、元のアプタマーやU6をyで置換したアプタマーのそれと同一である。
【0141】
本発明者らは次いで、FP−6500蛍光測定装置を用いて、テオフィリンの存在下又は非存在下でのアプタマーの蛍光強度を測定した。short FAM−y、FAM−y又はTAMRA−yを有するアプタマーの蛍光強度は、テオフィリンの量に依存して増加し、そして、テオフィリンの飽和濃度(5−20μM)の添加によって倍増した(図12)。
【0142】
TAMRA−yを有するアプタマーの3H−標識テオフィリンへの結合のKd値は非常に高く、テオフィリンとの結合が弱いことが示唆されたが、テオフィリンの濃度を増加させるにつれて、アプタマーの蛍光強度は増加した(図12d)。これらの蛍光強度の変化は、標的物質であるテオフィリンとの結合により、アプタマーの構造変化が生じたためと考えられる。テオフィリンの非存在下において、蛍光残基はアプタマーの構造の内部に存在して、近傍の塩基との重なりなどにより、蛍光強度が減少していると考えられる。テオフィリン存在下では、アプタマーがテオフィリンと結合することにより、蛍光残基が外部に押し出され、溶媒にさらされて塩基による消光作用が減少し、蛍光強度が増加したと考えられる。
【0143】
アプタマーの蛍光強度変化から得られる平衡定数(「Kf」によって表す)(図12及び表4)は、3H−標識テオフィリンを用いて得られる解離定数(Kd)と若干相違した。short FAM−y及びFAM−yを有するアプタマーの場合、Kf値は、対応するKd値よりも大きかった。このことは、約0.2−0.5μMの濃度でテオフィリンが結合した場合、蛍光色素はまだ構造の内部で近傍の塩基と重なっていることを示唆する。対照的に、TAMRA−yを有するアプタマーのKf値はKd値の2分の1であった。理論に束縛されるわけではないが、これは、TAMRAのジメチルアミノ基が立体障害となり、テオフィリンとの弱い相互作用によってもTAMRA残基がアプタマーの構造の内部から外部へ押し出されやすくなり、また同時にテオフィリン結合能力の低下を引き起こしたことによると考えられる。いずれの場合も、アプタマーのKf値は、テオフィリンの特定の濃度によって誘導される蛍光残基の環境変化に依存する。よって、Kf値もアプタマーのセンサーとしての検出感度を評価するに、実際に有用である。
【0144】
蛍光標識アプタマーは、テオフィリンに対するその高い特異性を保持している。アプタマーの蛍光強度は、構造的にテオフィリンと類似するカフェイン(20μM)の存在下でも増加されない(図12a、c及びd)。特に、short FAM−yで標識したアプタマーは、20μMカフェインの添加によっても蛍光強度の有意な変化は観察されなかった(図12a)。
【0145】
本発明の方法の感度は、従来のモジュラーアプタマーセンサー及び蛍光分子スイッチ(非特許文献47−48)よりも、非常に高いものである。従来技術において、テオフィリン結合性アプタマーのC27の部位へ、別の蛍光色素、2−アミノプリンを導入した場合も、プローブとして有用であった(非特許文献37)が、2−アミノプリンを有するアプタマーの調製は、化学合成を必要とする。本発明の、非天然型塩基対を利用した転写系は、所望の位置に蛍光プローブを有するRNA分子を調製するための簡便な方法である。そして、本発明によって提供される、部位特異的に標識された蛍光色素−結合y塩基は、その標的分子の選択的かつ効率的な検出を可能にするものである。
【0146】
本実施例において、「T7転写による、yまたはその5−修飾塩基(類)のテオフィリン結合性アプタマーへの部位特異的導入」、「平衡濾過アッセイ」及び「蛍光測定」は、具体的には以下のように行った。
【0147】
T7転写による、yまたはその5−修飾塩基(類)のテオフィリン結合性アプタマーへの部位特異的導入
sを有する化学的に合成された二本鎖鋳型DNAを用いて、y又はその修飾塩基(Ph−y、I−y及び蛍光色素−結合y)を、6U、23U又は24Uの代わりに導入した。
【0148】
sを含む鋳型の配列は、図10A及び配列番号7に記載した通りである。
図10AにおけるRNAアプタマー(41ヌクレオチド)(配列番号8)中の番号付けは、非特許文献43に記載された33ヌクレオチドからなるアプタマーの番号付けと対応させた。鋳型(59ヌクレオチド コードDNA及び59ヌクレオチド非コードDNAの10μM)を、10mM Tris−HCl(pH7.6)及び10mM NaClを含む緩衝液中で、95℃で加熱し、そしてゆっくりと4℃まで冷却することによってアニールさせた。
【0149】
転写は20μlスケールで行い、反応組成は、40mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01%TritonX−100、1mM 天然型ヌクレオチド(NTP)および1mM yTP若しくは1mM Ph−yTP若しくは0.25mM I−yTP、2μCi[α−32P]ATP、2μM 鋳型DNAおよび2.5単位/μlのT7 RNAポリメラーゼ(Takara、Kyoto)である。
【0150】
37℃で6時間インキュベーションの後、等量の染色溶液の添加によって反応を終了させた。反応混合物を75℃で3分加熱し、そして、41ヌクレオチドの転写産物をゲル電気泳動によって精製した。
【0151】
平衡濾過アッセイ
特定部位にy又はその5−修飾塩基を有するRNAアプタマーによるテオフィリンとの結合を、平衡濾過アッセイ(非特許文献41)によって分析した。種々の濃度のアプタマーを含む溶液(54μl、100mM Hepes(pH7.3)、50mM NaCl及び5mM MgCl2中、25−1500nM)を、6μlの200nM 3H−標識テオフィリン溶液(Moravek)と混合し、そして混合物を25℃で5分間インキュベートした。次いで、混合物をMicrocon YM−10濾過装置(Amicon)に装填し、そして濃縮した。濾液の10μl試料を回収し、そして、シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。各RNAアプタマーに対するテオフィリン結合の比率は、RNAの存在下及び非存在下で得られた濾液中のテオフィリンの濃度の差から決定された。テオフィリン結合に関する解離定数(Kd)は、以下の式を用いたKALEIDAGRAPHプログラムによって決定した。
【0152】
式: y=M0×M1/(M0+M2)
[ここにおいて、
yは、テオフィリン結合の比率であり;
M0は、RNA濃度であり;
M1は、テオフィリンの結合容量であり;そして、
M2は、Kdである]。
【0153】
蛍光測定
U6の代わりにshort FMA−y、FAM−y又はTAMRA−yを有する各テオフィリン結合性アプタマーの蛍光プロフィールは、テオフィリン(0−20μM)又はカフェイン(20μM)の存在下で、FP−6500蛍光測定装置(JASCO)を用いて25℃で測定された。蛍光スペクトル測定では、100nMの濃度のアプタマーも用い、励起波長は5nmスペクトルバンド幅で434nm(short FAM−y若しくはFAM−yを有するアプタマー)、又は500nm(TAMRA−yを有するアプタマー)に設定した。
【0154】
各修飾アプタマーの平衡蛍光強度から決定される、Kf値は、以下の式を用いたKALEIDAGRAPHプログラムによって得られた。
式: y=1+C0×C1/(C0+C2)
[ここにおいて、
yは、FAMについては522nmであり、そしてTAMRAについては578nmにおける相対蛍光強度(テオフィリン非存在下での蛍光強度を「1」と設定する)であり;
C0は、テオフィリン濃度であり;
C1は、テオフィリンの飽和濃度における相対的増加値に該当し;そして、
C2は、Kfである]。
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
生体高分子である核酸(DNA,RNA)は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か4種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を鋳型としてDNAポリメラーゼにより自己複製し、さらにRNAポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、DNAからDNAへ、DNAからRNAへ、RNAからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成(A−T/U、G−C)のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、in vitroセレクション法によって、アプタマーやリボザイムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかってきたこともその一つである。
【0003】
しかし、20種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には4種類の塩基(2種類の塩基対)しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中のtRNA、rRNA、mRNA等の機能性RNAは自分自身の構造を安定化したり、RNA−RNA間、RNA−タンパク質間相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基(対)のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。
【0004】
核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基(もしくは非天然型塩基)を導入する手法として、1)化学合成により直接導入する方法、2)核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。1)の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。2)の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅・調製が可能となるが、そのような基質や塩基対(非天然型ヌクレオチド)も開発途中である。
【0005】
人工塩基対の背景
天然の二本鎖DNA中のAとT及びGとCは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している。近年、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出の研究が行われている。例えば、Ohtsuki et al.,2001及びHirao et al.,2002では、プリンの6位にかさ高い置換基を導入した2−アミノ−6−ジメチルアミノプリン(x)と2−アミノ−6−チエニルプリン(s)、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもった2−オキソ(1H)ピリジン(y)をデザインし、このx−y、s−y塩基対形成をKlenowフラグメントによるDNA中への取り込み効率により調べた。その結果、鋳型中のxに対するyの取り込みは低い選択性しか示さなかったが、sに対するyの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されていた(図1)。
【0006】
上記s−y塩基対の開発によって、RNA中に選択的にyを導入することが可能になった。本発明者らはさらに、yに機能性の置換基が結合した物質が得られれば、アプタマーやリボザイム等の新規機能性分子が創製可能にある、と考えた。そこで、5位がヨウ素等で置換されている5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを有する核酸を開発した。人工塩基対の開発の経緯、並びに5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド及びヌクレオチドについては、WO2004/007713(2004年1月22日公開)に詳述されている。
【0007】
核酸の標識及び検出
従来より、放射性元素、蛍光色素等を用い核酸を標識することが行われている。しかし、天然型の塩基を含む核酸の場合は、核酸の末端のみが標識されるか、あるいは天然型塩基(A、T、G、C)のいずれか標識されたものを核酸内部に取り込む場合は、標識核酸が多数ランダムに取り込まれる、という本質的な問題がある。核酸の内部を、例えば蛍光色素を用いて、部位特異的に標識する方法が希求される。
【0008】
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】WO2004/007713
【非特許文献】
【0010】
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【非特許文献6】Hirao, I., Madin, K., Endo, Y., Yokoyama, S. & Ellington, A.D. (2000) RNA aptamers That Bind to and Inhibit the Ribosome-inactivating Protein, Pepocin., J. Biol. Chem., 275, 4943-4948.
【非特許文献7】Hirao, I., Ohtsuki, T., Fujiwara, T., Mitsui, T., Yokogawa, T., Okuni, T., Nakayama, K., Takio, K., Yabuki, T., Kigawa, T., Kodama, K., Yokogawa, T., Nishikawa, K. & Yokoyama, S. (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs in to proteins., Nat. Biotechnol., 20, 177-182.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、一態様において、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。本明細書においては、5−FAM及び6−FAM、5−TAMRA及び6−TAMRA、5−HEX及び6−HEX、5−TET及び6−TET、ならびに、5−ROX及び6−ROX、の各々を特に区別する必要のない場合は単に、それぞれ、FAM、TAMRA、HEX、TET、及びROXと記載することがある。
【0012】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、別の態様において、前記塩基の5位が、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【0013】
本発明はさらに、本発明の前記5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた、核酸を提供する。本発明の核酸中のヌクレオチドは、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドと塩基対を形成しうる。本発明の核酸は、一態様において、前記5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する。
【0014】
本発明はさらにまた、標的タンパク質の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、一態様において
1)本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
【0015】
本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程3)及び4)に代えて
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
【0016】
本発明はまた、本発明のヌクレオチドを利用して核酸の二本鎖形成を検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法I又はIIの方法を用いて行うことができる。
【0017】
方法I
I−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、5位が消光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【0018】
方法II
II−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、2種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、前記2種類の核酸をハイブリダイズさせ、
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明者らは上記問題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、転写で選択的に機能する人工塩基対の開発に成功し、これを用いてRNA中に部位特異的に修飾ヌクレオチドを導入することを可能にした。本発明の修飾ヌクレオチドは、転写によりRNA中に取り込まれ、核酸の部位特異的な蛍光標識を可能にした。本発明者はさらに、標識核酸と相互作用する分子(核酸、タンパク質)などを検出するシステムを作り出すことに成功した。
【0020】
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の5位置換ピリジン塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合していることを特徴とする。
【0021】
本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基に相当する塩基や、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基に相当する塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、2’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を2’位に有する2’−置換リボフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チオリン酸であってもよい。つまり、糖部分及びリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはRNAの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはDNAの構成成分となる。
【0022】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基に相当する塩基の5位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【0023】
蛍光色素は、公知の蛍光色素を利用可能であるが、好ましくは、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される。フルオレセイン及びローダミンは、一般的に開環型及びスピロ型の二通りで表記される。例えば、5−カルボキシフルオレセインを開環型で表記すると、
【0024】
【化1】
【0025】
となり、そしてスピロ型で表記すると、
【0026】
【化2】
【0027】
となる。図1及び図3ではこれらの蛍光色素は開環型で示しているが、スピロ型で表記したものも本発明に含まれる。これらの蛍光色素については、例えば Tuschl et al.,1994;Misra et al.,2004;Gibson et al.,1996及び、Chehab et al.,1989に詳述されている。
【0028】
例えば、FAMの吸収極大波長は493nm、蛍光極大波長は522nmである。また、TAMRAの吸収極大波長は553nm、蛍光極大波長は578nmである。DANSYLの吸収極大波長は335nm、蛍光極大波長は518nmである。HEXの吸収極大波長は535nm、蛍光極大波長は556nmである。TETの吸収極大波長は521nm、蛍光極大波長は536nmである。5−ROXの吸収極大波長は567nm、蛍光極大波長は591nmである。6−ROXの吸収極大波長は570nm、蛍光極大波長は590nmである。
【0029】
本発明のヌクレオチドは5位置換基として蛍光分子を有するため、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。また、各蛍光色素によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。
【0030】
消光色素は、公知の消光色素を利用可能であるが、好ましくは、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される。これらの消光色素の存在により、蛍光色素の蛍光放出が消光色素へのエネルギー転移により抑制され、蛍光色素の蛍光が検出できなくなる。具体的には、DABCYLは、 FAM、TET、JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン)、HEX、Cy3(Amersham Biosciences社)、TAMRA、Cy3.5(Amersham Biosciences社)、ROX、Texas Redなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し;BHQ1は、FAM、Oregon Green 514(Molecular Probes社)、TET、Bodipy R6G−X(Molecular Probes社)、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red−X(Molecular Probes社、TAMRAなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し;そして、BHQ2は、HEX、Cy3、Rhodamine Red−X、TAMRA、Cy3.5、ROX、Texas Red−X、Bodipy TR−X(Molecular Probes社)、LightCycler 640(Roche社)、Boidipy 630/650−X(Molecular Probes社)、Cy5(Amersham Biosciences社)などの蛍光色素の蛍光放出を消光する。
【0031】
これらの消光色素については、例えばTyagi et al.,1996及びBoguszewska−Chachulska et al.,2004、に詳述されている。
【0032】
本明細書中、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基の5位に直接又はリンカーを介して結合している、蛍光色素及び/又は消光色素を、便宜上必要に応じ5位の「置換基」と呼称することがある。また、上記蛍光色素及び消光色素は、例えば、プロリゴ・ジャパン株式会社、Insitech INC.、Invitrogen、Sigma−Aldrich、Biosearch Technologies、Amersham Biosciences等から購入することが可能である。
【0033】
本発明の蛍光色素又は消光色素は、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基の5位に直接結合させても、あるいはリンカーを介して結合させてもよい。リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、下記の化学式I−III
【0034】
【化3】
【0035】
[式I中、nは1ないし5の整数から選択される]
【0036】
【化4】
【0037】
[式II中、m及びlは、1ないし5の整数から各々独立に選択される]
及び
【0038】
【化5】
【0039】
からなるグループから選択される。
上記n、m及びlは独立に選択され、好ましくは1ないし5、最も好ましくは、5である。リンカーが短いものは、転写反応において取り込まれる効率が僅かに落ちる。よって、長いリンカーである化学式I又はIIのリンカーが好ましい。また、化学式I−IIIのアミノアルキニル基部分は、三重結合部分が、単結合又は二重結合の対応するアミノアルキル基、又はアミノアルケニル基であってもよい。
【0040】
その他、リンカーとしては、例えば、ジアミノエトキシエーテル型の
−NH−(CH2CH2O)n−NH−
(Barnacchi et al.,2001参照)、又は、
−[PO3]−(CH2)6−S−CH2−CO−、もしくは
−[PO3]−(CH2)7−NH−
(Tyagi et al.,1996参照)、のような構造のものが利用できる。
【0041】
本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることはない。3−(β−D−リボフラノシル)−ピリジン−2(1H)−オンに、先ず5位に置換基を導入し、次いで、三リン酸を導入してもよい。あるいは、3−(β−D−リボフラノシル)−ピリジン−2(1H)−オンに、先ず三リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。特に、リンカー等の大きな基を導入する場合、先ず、ヨード等の光反応性基を導入して活性化してから、置換してもよい。好ましくは、反応基による活性化、リンカーの導入、三リン酸の導入、最後に置換基を導入する、また、置換基を導入する際の反応条件などは、ピリジンにこれら置換基を導入する反応の場合を参照して行うことができる。
【0042】
本発明の一態様として、蛍光色素又はアミノ基を化学式Iの長いリンカーを介して5位に導入したyTPの合成を図2に示した。さらに、化学式IIIの短いリンカーでFAMを結合したyTP(short FAM−yTP)の合成を図3に示した。まず、yのヌクレオシドの5位をヨウ素化し、これにリンカーを結合し、三リン酸化、保護基の除去を行いアミノ基を導入したyTP(NH2−yTP)を合成した。このNH2−yTPを、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、あるいは、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)のコハク酸イミドエステル体で処理することにより、これらの色素を導入したFAM−yTPとTAMRA−yTPが得られた(実施例1−9)。
【0043】
あるいは、本発明における蛍光色素又は消光色素による、2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドの修飾は、単独のヌクレオチド合成時ではなく、当該ヌクレオチドを含む核酸を転写等によって合成した後に行うことも可能である。実際、本願明細書の実施例13では、転写によるRNA分子の合成後、蛍光基を導入することに成功した(図7)。好ましくは、大過剰量の蛍光分子のコハク酸イミドエステル誘導体を使用する。5位にリンカーを結合させた2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、核酸分子の内側(中央側)に位置するより、末端に存在する方が導入効率が高いと期待される。
【0044】
あるいは、単独のヌクレオチド合成時、又は、転写もしくは複製等によって核酸合成された後の蛍光分子又は消光分子による修飾には、上述の蛍光分子又は消光分子のコハク酸イミドエステル誘導体の他に、蛍光分子又は消光分子のイソチオシアナート誘導体(例えば、FAMのイソチオシアナート誘導体)又はスルホニルクロリド誘導体(例えば、DANSYL−クロリド)を用いることによって行うことも可能である。
【0045】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸
本発明は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、1より多くのヌクレオチドが、5’→3’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAを含む。二本鎖は、DNA/DNA、RNA/RNA、又はDNA/RNAであってもよい。また、DNAには、RNAを鋳型として逆転写してなるcDNAも含まれる。あるいは、核酸は3本鎖、4本鎖等も形成しうる。
【0046】
本発明者らは、核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製へ取り組んでいる。新たに開発された人工塩基対の態様として、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン(sと命名)と2−オキソ(1H)ピリジン(yと命名)との塩基対、並びに2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン(vと命名)とyとの塩基対が含まれる。(図1)。従来技術に対して、蛍光色素(及び消光色素)を結合した第5番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれば、核酸の標識、そして、それによる核酸の検出が非常に簡便になる。本発明ではs−yという人工塩基対を用いて、これを可能にした。
【0047】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドとが塩基対を形成することが可能である。図1にyとs(2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基)、あるいは、yとv(2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基)と例示されているように、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基と、2箇所で水素結合を生じる。本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、立体構造上、天然型プリン塩基A(アデニン)及びG(グアニン)とは塩基対を形成できない。そして、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基は立体障害のため、天然型T(チミン)、U(ウラシル)及びC(シトシン)とは塩基対を形成できない。よって、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基と特異的に塩基対を形成することが可能である。
【0048】
よって、本発明の核酸は、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、態様を含む。6位置換された2−アミノプリン−9−イル基は、好ましくは2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基(s)又は2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基(v)である。後述の実施例で示されたようにvの方がsよりも転写によるyの取り込む効率がよいため、より好ましくは、vである。
【0049】
本発明において、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは、異なる2本の核酸上に存在して塩基対により二本鎖を形成しうる。あるいは、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは同一の一本の核酸上に存在してもよい。この場合、塩基対により、一本鎖はループ構造を形成してもよい。
【0050】
後述するように、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はRNAi(RNA干渉)に用いられるRNAとして使用されうる。あるいは、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれたDNA又はRNAは、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。
【0051】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸の合成
本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、DNA又はRNA等の核酸に取り込むことが可能である。具体的には、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、sあるいはvを含む鋳型DNAを用いてT7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行うと、yの基質(yTP)が部位特異的に、sあるいはvに相補して、RNA中に取り込まれる。yは、その5位を化学的に修飾することができるので、種々の機能性のy誘導体をRNA中の特定の部位に取り込ませることが出来る。
【0052】
よって、限定されるわけではないが、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、本発明の核酸を組み込む、ことを含む、方法によって調製することが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってDNA又はRNAに取り込んでもよい。
【0053】
例えば、5位に蛍光色素をもつ標識ウリジン(U)を転写反応によりRNA中に導入する場合には、UTPと標識UTPの存在比を変えて転写反応を行い、Uの位置をランダムに標識Uで置換するか、あるいはUTPの代わりに標識UTPだけを転写反応に用いてUの位置を全て標識Uに置換するしかない。この場合、標識Uの導入によってRNAの高次構造が変化してしまったり、RNAの機能に支障をきたすこともある[Jensen et al.,1995]。
【0054】
これに対し、本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基は、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基と特異的に塩基対を形成する。よって、所望の位置に6位置換−2−アミノプリン−9−イル基が導入されているDNA又はRNAを鋳型として、転写、複製又は逆転写反応を行うことにより、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的(部位特異的)に導入することが可能となった。
【0055】
転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はT7 RNAポリメラーゼ(Takara等)、複製反応は、クレノウフラグメント(KF)、逆転写反応はAMV Reverse Transcriptase XL (AMV−RT)(Life Science社)を使用することが可能である。複製反応は、反応中に6位置換された2−アミノプリン−9−イル基が除去されてしまうのを防ぐために、例えば、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性をもたないTaq DNAポリメラーゼ(Takara TaqTM)を用いてs又はvを含むプライマーによる鋳型DNAのPCR増幅も可能である。
【0056】
なお、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、公知の方法、例えば、[Fujiwara et al.,2001]に記載の方法で合成可能である。
【0057】
本発明では、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基の、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基との特異的な塩基対を利用して、転写反応の1段階で位置選択的に本発明のヌクレオチドをRNAに取り込むことが可能になった。本発明の非天然型の塩基を含む5種類の塩基からなるRNAを任意に調製出来れば、核酸の特異的な標識が可能になり、その有用性・汎用性は非常に高い。
【0058】
本発明の核酸のアンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム又はアプタマーとしての利用
本発明の一態様において、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム、アプタマー又はRNAi(RNA干渉)に用いられるRNAとして使用されうる。アンチセンスDNA若しくはRNAとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるDNA又はRNAである。標的とする遺伝子配列(センス鎖)の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスDNA又はRNAは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、RNAを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、in vitroセレクション法によって得られた、特定の分子に結合する機能を有する核酸である。RNAiとは、細胞内で見つかったシステムで、短いRNA断片が翻訳を制御するシステムであり、外部から標的遺伝子に対応した短いRNA断片を細胞内に加えたり、発現させたりすることで、標的遺伝子の発現を抑える手法である。
【0059】
例えば、in vitroセレクションによって得られる、5位置換2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を含むアプタマーは、標的タンパク質と架橋反応する等の新機能を持つRNA分子を創製することも可能となる[Kimoto et al, 2004]。
【0060】
さらに、蛍光分子をRNAアプタマー中に導入してアナライト(analyte)として活用する例も報告されている[Jhaveri et al.,2000;Yamamoto et al.,2000;Fang et al.,2001]。
【0061】
これまでに、修飾塩基として、フルオレセイン−12−ウラシル(F−12−U)[Jhaveri et al.,2000]、5−(1−ペンチニル)ウラシル[Latham et al.,1994]、5−(3’’−アミノプロピニル)ウラシル[Battersby et al.,1999]、5−ヨードウラシル(5IU)[Jensen et al.,1995]、5−ブロモウラシル(5BrU)[Golden et al.,2000]をin vitroセレクションで利用した例が報告されている。しかしながら、これらの例では全て、DNAもしくはRNAプールの調製の段階から修飾塩基を天然型塩基(TもしくはU)と置換している。
【0062】
蛍光分子を含む本発明の核酸(アプタマー)は標的タンパク質を検出するためアナライトとして利用することが可能である。本発明は、本発明の核酸を利用した標的タンパク質の検出方法を含む。本発明の検出方法は、一態様において
1)本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
【0063】
本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程3)及び4)に代えて
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
【0064】
本発明において、標的タンパク質は特に限定されず任意のものを対照とすることができる。結合する核酸分子(アプタマー)の塩基配列が解明されているものは容易に利用可能である。そのような標的タンパク質とアプタマーの組み合わせの例は、本明細書中に参考文献として援用されるWO2004/007713の参考例1に記載のRaf−1タンパク質とRNA 9A(WO2004/007713 図13)及びRNA 9Bである。
【0065】
支持体としては、例えば、ニトロセルロースフィルター等が利用可能である。これらの支持体は標的タンパク質は付着するが、核酸分子は単独では結合しない。核酸はタンパク質に結合した場合のみ、タンパク質を介して支持体に付着する。支持体に付着したタンパク質−核酸の複合体は、核酸に結合した蛍光を測定にすることにより検出することができる。
【0066】
本明細書の実施例14では、FAM−yをRaf−1タンパク質に特異的に結合するRNAアプタマー(抗−Raf−1アプタマー)RNA 9Aの90番目(全長100ヌクレオチド)に導入し、この蛍光色素を導入したRNAアプタマーと種々の濃度のRaf−1タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合したRNAアプタマーの蛍光を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた(図8)。これは、従来のラジオアイソトープでRNAを標識する方法に代わる簡便な方法である
本発明の方法は、標的タンパク質の濃度を好ましくは0pmol−1000pmol、より好ましくは0pmol−500pmol、最も好ましくは1pmol−100pmolの範囲で、定量的に検出することが可能である。
【0067】
支持体を利用する代わりに、限外濾過膜を用いて標的タンパク質を溶液中に選択的に留めてもよい。限外濾過膜を用いた標的タンパク質の検出方法は、前記工程3)及び4)に代えて
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでよい。限外濾過膜は標的タンパク質のサイズに応じて適宜公知のものを使用することが可能である。
【0068】
核酸の二本鎖の検出方法
本発明はさらに、本発明の核酸を利用した核酸の二本鎖の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法I又はIIの方法を用いて行うことができる。
【0069】
方法I
I−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、5位が消光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【0070】
方法II
II−1)本発明の、5位が蛍光色素で置換された、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、2種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、前記2種類の核酸をハイブリダイズさせ、
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【0071】
本発明の方法は、蛍光色素と消光色素、あるいは2種の蛍光色素が各核酸分子に存在する場合に、核酸の二本鎖が形成され色素同士が物理的に近傍に存在すると、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer)が生じて蛍光スペクトルが変化する。本発明の方法は、核酸の二本鎖の形成をFRETによる蛍光スペクトルの変化の測定によって検出するものである。
【0072】
「蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)」は、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴により励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー(供与体)、受け取る分子はアクセプター(受容体)と呼ばれる。FRETが生じると、エネルギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったアクセプターは励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、アクセプターが蛍光分子であればその蛍光が観察される。アクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合には観察されていた蛍光がFRETにより観察されなくなる。FRETによるタンパク質の検出、核酸の検出の一般的な方法は公知であり、例えば、RNAアプタマーに2種類のFRETを起こす色素を導入して、標的タンパク質を検出する方法(Jhaveri et al.,2000)や、ヘアピン型核酸を利用した相補鎖核酸の検出法(Tyagi et al.,1996)が知られている。その他、FRETに関しては、Walter et al.,2001及びKlostermeier et al.,2001に概説されている。
【0073】
FRETが生じるためには、以下の3条件を満たす必要がある。i)ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はない。ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルが30%以上重なっていることが好ましく、50%重なっていることがより好ましい。ii)ドナーとアクセプターが物理的に近距離に存在すること。FRETが50%の確率で生じる距離は1nmないし10nmと考えられており、FRETの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。例えば、方法Iの場合、核酸が二本鎖を形成した場合に、蛍光色素で置換された5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基(y)を塩基として有するヌクレオチドに対し、消光色素で置換されたyを有するヌクレオチドが近接し、蛍光色素と消光色素の色素間の距離が好ましくは30nm以内、より好ましくは10nm以内、最も好ましくは5nm以内である場合に蛍光スペクトルの変化が検出可能である。iii)ドナーとアクセプターの相対的な向きが適切であること。
【0074】
本発明で使用される蛍光色素の最大吸収スペクトルと蛍光スペクトルを以下にまとめた。
【0075】
【表1】
【0076】
よって、方法IIにおいて、アクセプター及びドナーの組み合わせとして使用できる態様は下記の通りである。
【0077】
【表2】
【0078】
一方、方法Iにおいて、消光色素はドナーの種類に限定されず、アクセプターとして一般的に使用することができる。
本発明の方法は、核酸を合成する際、例えば鋳型DNAからRNAを調製する際に、同時にRNAを部位特異的に蛍光標識化することが出来るという利点があり、種々の検出方法、同定方法、診断方法等に応用できるものである。
【0079】
低分子化合物の検出方法
本発明はさらにまた、低分子化合物を検出する方法を提供する。
本発明の検出方法は、
1)本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【0080】
本発明において、好ましくは前記試料は溶液であり、工程2)において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む。本発明において試料が液体試料の場合、例えば、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を含む溶液を、セルに入れて、蛍光スペクトルの装置に装着し、そこに低分子化合物を含むと考えられる液体試料を加えて、そのまま蛍光強度の変化を測定することが可能である。蛍光強度が変化した場合、標的となる低分子化合物の検出と定量が可能である。定量は、例えば、既知の濃度の標的低分子化合物を含む試料を用いて予め作成した蛍光スペクトル、測定試料の蛍光スペクトルを比較することによって行うことが可能である。
【0081】
本発明の方法によって測定される低分子化合物は特に限定されないが、好ましくは1)核酸へ結合する性質を有する、そして、2)核酸が本発明の5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを含むものであっても、核酸への結合が影響を受けない、という性質を有する。限定されるものではないが、低分子化合物の分子量は、約500ないし1000である。
【0082】
本発明において、非限定的に、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、アミノ酸からなるグループから選択される(非特許文献49)。
限定されるわけではないが、本発明の検出方法によって、好ましくは約10nMないし約10mM、より好ましくは約100nMないし約1mM、さらにより好ましくは約1μMないし約20μMの低分子化合物を検出することができる。
【0083】
本明細書中、5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル基を塩基として有するヌクレオシドを「5位置換−y」もしくはもしくは「5−修飾y」、特に置換基が蛍光色素の場合には、「蛍光色素−結合y」と記載することがある。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1】図1は、s−yとv−yの人工塩基対と5位を修飾したyの誘導体を示す。
【図2】図2は、蛍光色素又はアミノ基を長いリンカーで結合したyTPの合成スキームを示す。各工程の条件及び収率は下記の通りである。
【0085】
(a)DMTr−Cl、ピリジン、室温、82%;
(b)i)(CH3CO)2O、ピリジン、室温、ii)C2H5OH、還流、84%;
(c)CuI、Pd[P(C6H5)3]4、DMF、(C2H5)3N、室温、次いで、6−(トリフルオロアセタミド)カプロン酸 プロプ−2−イニルアミド、88%;
(d)CHCl2COOH、CH2Cl2、0℃、74%;
(e)2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オン/ジオキサン、トリ−n−ブチルアミン、ビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェート、I2/H2O/ピリジン、ジオキサン、ピリジン、室温、次いでNH4OH;
(f)R−N−スクシンイミジルエステル/DMF、0.1M NaHCO3、aq.、室温、次いでNH4OH。
【図3】図3は、蛍光色素(FAM)を短いリンカーで結合したyTPの合成スキームを示す。
【図4】図4は、FAM−yTPとTAMRA−yTPの蛍光特性を示す。図4aはFAM−yTP及びTAMRA−yTPの吸収スペクトルを示し、図4bはFAM−yTP及びTAMRA−yTPの蛍光スペクトルを示す。ダイヤモンド形は、FAM−yTPの結果を、正方形は、TAMRA−yTPの結果を示す。
【図5a】図5aは、T7 RNAポリメラーゼによるFAM−yTP、TAMRA−yTPのRNAへの導入を示す。鋳型がAの場合を100とする相対収率は、レーン1−9の順に、103、49、100,76、26、100、61、21、100であった。
【図5b】図5bは、T7 RNAポリメラーゼによるshort FAM−yTP、FAM−yTP、TAMRA−yTP、Dansyl−x−yTPのRNAへの導入を示す。鋳型がAで天然型塩基のみの場合を100とする相対収率は、レーン1−9の順に、72、108、80、96、62、110、48、94、100であった。
【図6】図6は、2次元TLCによるRNAリガンド中に取り込まれたNH2−yと天然型ヌクレオチドの組成分析を示す。
【図7】図7は、NH2−yを導入したRNAの転写後の蛍光標識化を示す。標識化の収率は、FAM−SEを×100、×1000使用した場合に各々6%、40%、TAMRA−SEを×10、×100、×1000使用した場合に各々13%、66%、99%であった。
【図8】図8は、FAM−yTPのRNAへの導入のアンチ−(Raf−1)アプタマーへの部位特異的導入とその応用例(Kd測定)を示す。最終のBio−Rad Molecular Imager FxProの測定において、レーザーは488nm、530nm BandPathfilterを使用した。
【図9】図9は、テオフィリン結合性RNAアプタマーの構造を示す。(a)2次構造;(b)テオフィリン結合部位に関与するヌクレオチド間の相互作用(点線は塩基間での水素結合を示す);(c)U6−U23−A28からなる塩基トリプレット構造;(d)U6を5位置換−2−オキソ(1H)ピリジンに置き換えた場合でのトリプレット構造。
【図10】図10は、T7転写による、yまたは5位置換y(5−修飾塩基)のテオフィリン結合性アプタマーの部位特異的導入を示す。
【0086】
(A)U6の部位にyまたは5−修飾塩基を特異的に導入するための転写スキーム
5−修飾塩基の導入部位に対して相補的な位置にsを含む2本鎖鋳型DNAを用いて、yTPまたは5位置換yTP(Ph−yTPおよびI−yTP)存在下で転写を行った。テオフィリン結合性アプタマー(41ヌクレオチド)中の番号付けは、非特許文献43に記載された33ヌクレオチドからなるアプタマーでの番号付けと対応させた。転写は20μlスケールで行い、反応組成は、40mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01%TritonX−100、1mM 天然型ヌクレオチド(NTP)および1mM yTP若しくは1mM Ph−yTP若しくは0.25mM I−yTP、2μCi[α−32P]ATP、2μM 鋳型DNAおよび2.5単位/μlのT7 RNAポリメラーゼである。
【0087】
(B)U6の箇所にI−y若しくはy若しくはPh−yを導入したアプタマー(I−y6−41、y6−41、Ph−y6−41に相当)のゲル電気泳動図。
sを含む鋳型(レーン1−3:temp59s)又はsの代わりにAを含む鋳型(レーン4:temp59)を用いて、上記濃度のyTPもしくは5位置換yTP存在下で転写を行い、その産物をゲル電気泳動で解析した。
【0088】
(C)転写産物のヌクレオチド組成分析。
転写産物を0.75単位のRNaseT2存在下で、15mM 酢酸ナトリウム溶液(pH4.5)中、37℃で90分間消化し、その消化産物をMerck HPTLCプレート(100x100mm)上で2次元に展開して解析した。1次元目、2次元目の展開溶媒はそれぞれ、イソ酪酸−アンモニア−水(体積比66:1:33)、イソプロピルアルコール−塩酸−水(体積比70:15:15)である。TLCプレート上のスポット(各ヌクレオチドに対応)の放射活性をバイオイメージングアナライザーで定量し、その結果をTLCパネルの下に示した。
【0089】
値は以下の式を用いて決定した。
【0090】
【化6】
【0091】
各ヌクレオチドの理論値を括弧内に記載してある。
【図11】図11は、特異的な位置にy又は修飾−yを有するRNAアプタマーの3H−標識テオフィリンとの結合曲線を示す。y又は修飾−yを導入した箇所を括弧内に記載した。
【0092】
緑線:short FAM−y(6); 黄線:FAM−y(6)
ピンク線:TAMRA−y(6); 水色線:Ph−y(6)
うす茶色:I−y(6); 黒色線:y(6)
点線白丸:y(23); 波線×:y(24)
オレンジ線:非修飾
【図12】図12は、本発明の各種非天然型塩基を有するヌクレオチドで部位特異的に標識されたテオフィリン結合性RNAアプタマーの、蛍光スペクトルを示す。
【0093】
RNAアプタマーは、short FAM−y(a)、FAM−y(c)またはTAMRA−y(d)のいずれかで標識し、様々な濃度のテオフィリン(0−20μM)又はカフェイン(20μM)の存在下での蛍光スペクトルを測定した。黒線、青線、水色線、緑線、オレンジ線、赤線は、各々0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、10μM及び20μMのテオフィリンの結果を示す。赤線点線は、20μMのカフェインの結果を示す。図12bは、short FAM−y標識RNAアプタマーのテオフィリン存在下での蛍光強度変化において、522nmにおける蛍光強度をテオフィリン濃度に対してプロットした曲線である。
【実施例】
【0094】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【0095】
以下、実施例1−9は合成実施例を記載する。
実施例1 3−(5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
3−(β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(178mg,505μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(5ml,0.1μM)に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル(183mg,540μmol)を加え、室温で1時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0→100:2)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(272mg,416μmol,収率82%)として得た。
【0096】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6) δ3.09−3.20(m,2H), 3.70−3.86(m,8H), 3.92−3.94(m,1H), 4.73−4.76(m,2H), 5.27(bs,1H), 6.89(d,2H,J=8.9Hz), 7.18−7.43(m,9H), 7.59−7.61(m,2H), 11.9(bs,1H).
実施例2 3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例1で合成した3−(5−O−ジメトキシトリチルl−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(266mg,406μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行った。これを無水ピリジン(4ml,0.1μM)に溶解させ、酢酸無水物 (110μl,1.17mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をエタノール(50ml)に溶解させ、1時間半還流させた。濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:1→100:4)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(253mg,342μmol,収率84%)として得た。
【0097】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6)・δ 1.96(s,3H), 2.04(s,3H), 3.14(m,1H), 3.29−3.31(m,1H), 3.73(s,6H), 4.10−4.15(m,1H), 4.91(d,1H,J=3.6Hz), 5.25−5.33(m,2H), 6.88(d,4H,J=8.9Hz), 7.21−7.39(m,9H), 7.66(d,1H,J=2.3Hz), 7.74(d,1H,J=2.3Hz).
実施例3 3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例2で合成した3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(244mg,330μmol)を10mlナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を2回行った。ヨウ化銅(13.3mg,69.8μmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(36.4mg,31.5μmol)を加え、これらを無水DMF(2ml)に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン(85μl,610μmol)を加え、遮光下室温で攪拌した。これにN−(2−プロピニル)−6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド(240mg,908μmol)のDMF(1.5ml)溶液を滴下し、室温で3.5時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル/ヘキサン(1:1)で希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0.5→100:3)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(255mg,291μmol,収率88%)として得た。
【0098】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6) δ 1.16(m,2H), 1.41−1.49(m,4H), 1.89−2.07(m,8H), 3.13(dd,2H,J=6.6 and 12.9Hz), 3.23−3.24(m,2H), 3.73(s,6H), 3.90−3.92(m,2H), 4.10−4.13(m,1H), 4.88(d,1H,J=3.6Hz), 5.25−5.33(m,2H), 6.87(d,4H,J=8.9Hz), 7.21−7.38(m,9H), 7.56−7.58(m,2H), 8.13(t,1H,J=5.1Hz), 9.38(bs,1H), 12.0(bs,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C46H49F3N3O11 [M+1]+: calcd,876.3319; found,876.3369.
実施例4 3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジンの合成
実施例3で合成した3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(245mg,279μmol)を無水ジクロロメタン(46ml)に溶解させ、0℃で攪拌させながらジクロロ酢酸(470μl,5.69mmol)を加え、15分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に室温で滴下し、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで20回以上抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒;ジクロロメタン:メタノール=100:0.5→100:4)で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質(119mg,207μmol,収率74%)として得た。
【0099】
1H NMR (270MHz,DMSO−d6) δ 1.19−1.27(m,2H), 1.41−1.55(m,4H), 2.00(s,3H), 2.02(s,3H), 2.08(t,2H,J=7.3Hz), 3.14(dd,2H,J=6.8 and 12.9Hz), 3.49−3.68(m,2H), 4.01−4.05(m,3H), 4.85(d,1H,J=5.3Hz), 5.15−5.19(m,2H), 5.24(t,1H,J=5.4Hz), 7.58(d,1H,J=2.5Hz), 7.66(d,1H,J=2.5Hz), 8.26(t,1H,J=5.1Hz), 9.38(bs,1H), 12.1(bs,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C25H31F3N3O9 [M+1]+: calcd,574.2012; found,574.2061.
実施例5 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (NH2−yTP)の合成
実施例4で合成した、3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(58.3mg,102μmol)を50mlナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μl)及び無水ジオキサン(300μl)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μl,110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μl)及びビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(300μl)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)を加えて3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水に溶解させて室温で3時間攪拌した後に、凍結乾燥させた。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm,濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―15% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物を得た。
【0100】
1H NMR (270MHz,D2O) δ 1.13(t,18H,J=7.3Hz), 1.21−1.32(m,2H), 1.48−1.61(m,4H), 2.19(t,2H,J=7.3Hz), 2.83(t,2H,J=7.3Hz), 3.05(q,12H,J=7.3Hz), 3.95−4.20(m,7H), 4.88(d,1H,J=3.0Hz), 7.49(d,1H,J=2.0Hz), 7.83(d,1H,J=2.0Hz).
31P NMR(109MHz,D2O) δ −22.19(t,1H,J=20.1Hz), −10.60(d,1H,J=20.1Hz), −8.84(d,1H,J=20.1Hz).
MS(ESI) for C19H29N3O15P3 [M−1]−: calcd,632.08 ; found,631.84.
実施例6 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (FAM−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(10μmol)を5mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,1.5ml)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(5.5mg,11.6μmol)のDMF溶液(200μl)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で3.5時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50% アセトニトリルの0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(3.0μmol,30%)を得た。
【0101】
1H NMR(270MHz,D2O) δ 1.14(t,27H,J=7.3Hz), 1.20−1.40(m,2H), 1.45−1.65(m,4H), 2.10−2.35(m,2H), 2.90−3.60(m,22H), 3.70−4.20(m,5H), 6.55−6.85(m,4H), 7.00−7.40(m,4H), 7.50−7.70(m,1H), 7.90−8.05(m,1H), 8.10−8.20(m,1H).
31P NMR (109MHz,D2O) δ −21.75, −10.40, −9.38.
MS(ESI) for C40H39N3O21P3 [M−1]−: calcd,990.13; found,989.98.
実施例7 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−(テトラメチルローダミン−5−カルボキサミド)ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (TAMRA−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(8μmol)を5mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,1.2ml)に溶解させ、5−カルボキシテトラメチルローダミン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(5mg,9.5μmol)のDMF/水混合溶液(150/150μl)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で3.5時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら2時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液) 及びC18−HPLC (濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(4.0μmol,50%)を得た。
【0102】
1H NMR(270MHz,D2O) δ 1.13(t,27H,J=7.3Hz), 1.25−1.40(m,2H), 1.50−1.65(m,4H), 2.10−2.35(m,2H), 3.00−3.22(m,32H), 3.40−4.00(m,7H), 4.80−4.85(m,1H), 6.55−6.60(m,1H), 6.65−6.75(m,2H), 6.80−6.90(m,1H), 6.98−7.05(m,1H), 7.05−7.20(m,2H), 7.40−7.50(m,2H), 7.95−8.05(m,1H), 8.08−8.15(m,1H).
31P NMR (109MHz, D2O) δ −23.00− −22.00(m,1H), −11.50− −10.50(m,1H), −10.50− −9.50(m,1H).
MS(ESI) for C44H49N5O19P3 [M−1]−: calcd,1044.22; found,1043.90.
実施例8 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−[6−[6−[(5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルフォニル)アミノ]ヘキサンアミド]ヘキサンアミド]−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (Dansyl−x−yTP) の合成
実施例5で合成した3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(6−アミノヘキサンアミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸(9μmol)を50mlの滅菌済みチューブに移し、これを0.1M ホウ酸ナトリウム水溶液(pH8.5, 1.8ml)に溶解させ、6−[(5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルフォニル)アミノ]ヘキサン酸 N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(20mg,44μmol)のDMF溶液(1.8ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で48時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら1時間反応させた。これを減圧濃縮させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(6.2μmol,68%)を得た。
【0103】
1H NMR(270MHz,D2O) δ 0.75−0.90(m,2H), 0.92−1.10(m,4H), 1.08−1.26(m,29H), 1.26−1.40(m,2H), 1.40−1.52(m,2H), 1.66(t,2H,J=7.3Hz), 2.14(t,2H,J=7.3Hz), 2.72−2.86(m,8H), 2.95(t,2H,J=6.6Hz), 3.06(q,18H,J=7.3 Hz), 3.85−4.20(m,7H), 4.75(d,1H,J=3.0Hz),7.25−7.32(m,2H), 7.52−7.65(m,3H), 8.10(d,1H,J=7.3Hz), 8.15(d,1H,J=8.9Hz), 8.33(d,1H,J=8.9Hz).
31P NMR(109MHz,D2O) δ −22.56, −10.54, −10.09. MS (ESI) for C37H51N5O18P3S1 [M−1]−: calcd,978.22; found,978.34.
実施例9 3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (short FAM−yTP) の合成
1)3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン
実施例2で合成した、3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(268mg、362μmol)を、CH3CN中に溶解し、乾燥するまで真空内で2回蒸発させた。残渣をDMF(2ml中)に、Cu(I)I(12.4mg、65.2μmol)及びPd[P(C6H5)3]4(37.7mg、32.6μmol)と共に溶解した。トリエチルアミン(91μl、652μmol)を加えた後、暗がりで、室温で攪拌した。溶液に、DMF(1,5ml)中の2,2−ジクロロ−N−プロプ−2−イニル−アセタミド(162mg、978μmol)を滴下して加え、溶液を室温で3.5時間攪拌した。反応混合物をEtOAcで希釈した。溶液をH2O及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の0.5−3%CH3OH)によって、3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(251mg、89%)を精製した。ジクロロメタン(32ml)中の3−(2,3−ジ−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(251mg、323μmol)に、ジクロロ酢酸(323μl、3.92mmol)を加え、そして、0℃で15分間攪拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液に注ぎ、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで5回抽出した。混合した有機層をMgSO4で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の2−10%CH3OH)によって、産物(136mg、88%)を精製した。
【0104】
1H NMR(300MHz,DMSO−d6) δ 2.01(s,3H), 2.04(s,3H), 3.50−3.70(m,2H), 4.00−4.05(m,1H), 4.18(d,2H,J=5.4Hz), 4.87(d,1H,J=5.6Hz), 5.10−5.30(m,3H), 6.48(s,1H), 7.63(d,1H,J=2.3Hz), 7.68(d,1H,J=2.0Hz), 9.10(t,1H,J=5.0Hz), 12.08(brs,1H).
HRMS (FAB, 3−NBA matrix) for C19H21Cl2N2O8 (M+1): calcd, 475.0675; found, 475.0689.
2)3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−(フルオレセイン−5−カルボキサミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸 (short FAM−yTP)
3−(2,3−ジ−O−アセチル−β−D−リボフラノシル)−5−[3−(2,2−ジクロロアセタミド)−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン(47.5mg,100μmol)を50ml ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を3回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン(100μl)及び無水ジオキサン(300μl)を加えて溶解させ、2−クロロ−4H−1,3,2−ベンゾジオキサホスフォリン−4−オンの1M ジオキサン溶液(110μl,110μmol)を加えて室温で10分間攪拌したのちに、トリ−n−ブチルアミン(100μl)及びビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロホスフェートの0.5M DMF溶液(300μl)を加えて10分間攪拌した。1% ヨウ素/水/ピリジン溶液(2ml)を加え、室温で15分間攪拌し、5% 亜硫酸水素ナトリウム水溶液(150μl)を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水(10ml)を加え、室温で30分間攪拌した後に濃アンモニア水(12ml)を加えて3時間攪拌した。これを減圧濃縮後、50mlチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水(3ml)に溶解させて55℃で3時間攪拌した後に、減圧濃縮した。これをDEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)にて精製し、3−(β−D−リボフラノシル)−5−[3−アミノ−1−プロピニル]−2−オキソ(1H)ピリジン 5’−三リン酸を得た。これを50mlの滅菌済みチューブに移し、0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.6,4ml)に溶解させ、5−カルボキシフルオレセイン N−ヒドロキシコハク酸イミド エステル(14.5mg,30.6μmol)のDMF溶液(1ml)を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で12時間反応させた。これに濃アンモニア水(1ml)を加え、時々振盪させながら30分反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、DEAE Sephadex A−25カラムクロマトグラフィー(1.5x30cm, 濃度直線勾配;TEABの50mM―1M溶液)及びC18−HPLC(濃度勾配;0%―50%アセトニトリルの0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液,pH7.0)にて精製し、目的物(10.1μmol,10%)を得た。
【0105】
1H NMR (270MHz, D2O) δ 1.14(t,32H,J=7.3Hz), 3.06(q,21H,J=7.3Hz), 4.00−4.35(m,7H), 4.80−4.90(m,1H), 6.65−6.88(m,4H), 6.92−7.06(m,2H), 7.25−7.38(m,1H), 7.48−7.58(m,1H), 7.73−7.85(m,1H), 7.95−8.10(m,1H), 8.24−8.32(m,1H).
31P NMR (109MHz, D2O) δ −22.40, −10.38, −10.38.
MS (ESI) for C34H28N2O20P3 [M−1]−: calcd,877.04; found,877.07.
実施例10 yTP誘導体の量子収率測定
蛍光スペクトルは、FAM−yTP(1.0μM)、TAMRA−yTP(1.0μM)、short FAM−yTP(1.0μM)及びDansyl−x−yTP(1.0μM)の10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)の溶液を25℃で、FP−6500蛍光測定装置(日本分光)により測定した。測定には3x3mmセルを用い、レスポンス 1.0s、感度low、スリットは励起側・蛍光側ともに3nmに固定してスペクトル測定を行った。結果を図4に示す。
【0106】
量子収率(φ)は以下に示す式から算出し、標準物質としてはフルオレセイン(1.0μM in 0.1N NaOH, φs=0.90)を用いた。
φ = (F・As・η2・φs)/(A・Fs・η02)
F; 蛍光スペクトルの面積
A; 励起波長での吸光度
η; 屈折率(水: 1.33)
s; 標準物質
【0107】
【表3】
【0108】
図4及び表3に示されたように、FAM−yTPの定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の493nmで励起すると、522nmに極大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率(φ)は、0.55(pH7.0水溶液中)であった。また、TAMRA−yTPの定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の553nmで励起すると、578nmに極大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率(φ)は、0.50(pH7.0水溶液中)であった。
【0109】
以下、実施例11−13は転写反応実施例を示す。
実施例11 T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応
NH2−yTP、FAM−yTP、TAMRA−yTPのそれぞれを用いて、T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行った。
【0110】
具体的には、二本鎖の鋳型DNA(10μM)のアニーリングを10mM NaClを含む10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.6)中で、95℃、3分→50℃、3分→4℃の徐冷操作で行った。T7転写反応は、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、2μCi[γ−32P]GTP、1mM NTPs、1mM 修飾yTP、2μM 鋳型DNA、及び50単位 T7 RNAポリメラーゼ(Takara)の反応溶液(20μl)で行った。
【0111】
鋳型DNAには、T7プロモーターを含む35量体(35−mer)の鋳型鎖とT7プロモーターの非鋳型鎖21−merとを二本鎖化したものを用いた。そして、鋳型中の一箇所には、s、あるいは、vを導入してある。
【0112】
T7プロモーターを含む35量体(35−mer)(配列番号1)
5’−CACTNCTCGGGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT−3’
N(5)=v(本発明)、s(本発明)又はA(対照)
T7プロモーターの非鋳型鎖21−mer(配列番号2)
5’−ATAATACGACTCACTATAGGG−3’
転写物(配列番号3)
5’−GGGAAUCCCGAGN’AGUG−3’
N’(13)=NH2−y、FAM−y又はTAMRA−y
天然型の基質と等量の修飾基質を加え、37℃、3時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液(20μl)を加えて反応を停止させた。反応溶液を75℃で3分間加熱後、20% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動を行い、転写物をバイオイメージアナライザーで解析した。
【0113】
結果を図5に示す。図5に示されたように、それぞれの修飾基質がRNA中に取り込まれることがわかった。それぞれの修飾基質が取り込まれるとRNA断片17−merのゲル中での移動度が遅くなることから、それらの取り込みが確認された。さらに、それぞれのレーンに天然型の17−merのバンドがほとんど見えないこと、さらに、天然型の鋳型を用いた場合には、移動度の遅いバンドが認められないことから、それぞれの修飾基質が効率よく部位特異的に取り込まれたことがわかった。また、鋳型塩基にsを用いるよりも、vを用いたほうが、転写効率が良かった。天然型の鋳型・基質のみの転写反応と比較すると、NH2−yが取り込まれたRNAは、同程度の収率で得られ、FAM−y、あるいは、TAMRA−yが取り込まれたRNAの収率は、それぞれ、76%、61%であり、非常に効率がよいことが判明した。
【0114】
実施例12 T7 RNAポリメラーゼによる転写反応生成物の塩基組成分析
実施例11に次いで、NH2−yが取り込まれたRNAについて、ヌクレオチドの組成分析を行った。
【0115】
実施例11と同様のT7 RNAポリメラーゼによる転写反応を、40mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、2μCi[γ−32P]ATP、1mM NTPs、1mM 修飾−yTP、2μM 鋳型DNA、及び50単位 T7 RNAポリメラーゼ(Takara)の反応溶液で行った。転写物を、15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルによる電気泳動後、ゲルからの溶出を行った後、tRNA(0.25OD)を加えてエタノール沈殿を行い回収した。
【0116】
このtRNAを含む溶液(8.5μl)に、RNase T2(1.5μl,1単位/μl)を加えて、37℃で一晩反応を行った。この溶液の0.3μlをTLC (Merck,10cmx10cm)にスポットし、二次元展開を行った。展開液として、一次元目はイソ酪酸:濃アンモニア水:水=66:1:33(v/v/v)、二次元目は2−プロパノール:塩酸:水=65:10:25(v/v/v)を用いた。展開後のスポットをバイオイメージアナライザーで検出し、解析を行った。
【0117】
結果を図6に示す。図6のイメージアナライザーの図には、32Pで標識されたGp×2、Ap×1と、N’p×1が検出される。鋳型のNの位置にvが存在する場合には、対応するN’としてNH2−yが検出され、Upが見出されない。一方、鋳型のNの位置にAが存在する場合には、対応するN’としてUpが検出され、NH2−yが見出されない。ヌクレオチドの組成分析の結果、vに対するNH2−yの特異的な取り込みが確認された。
【0118】
実施例13 NH2−yを含むRNA 17−merの転写後修飾による蛍光基の導入
NH2−yが取り込まれたRNAを用いて、RNA転写後にFAM、あるいは、TAMRAによる修飾も行った。
【0119】
具体的には、実施例11と同様のT7 RNAポリメラーゼによる転写反応で生成したNH2−yを含むRNA17−mer(配列番号3)を、電気泳動(15% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲル)で精製した後、ゲルからの溶出、及び、エタノール沈殿により回収した。修飾反応は、RNA17−mer(20μM,2.5μl)を、FAM、又は、TAMRAのコハク酸イミドのエステル体(FAM−SE又はTAMRA−SE)のDMSO溶液(0もしくは0.2-20mM,2.5μl)、0.1M テトラホウ酸ナトリウム−HCl緩衝液(pH8.3)(15μl)と混ぜて、37℃、12時間行った。
【0120】
10M尿素を含む電気泳動用色素溶液(20μl)を加えて反応を停止させ、75℃で3分間加熱後、20% ポリアクリルアミド−7M 尿素ゲルで電気泳動を行った後、生成物をバイオイメージアナライザーで解析した。
【0121】
結果を図7に示す。図7に示されたように、大過剰のそれぞれのコハク酸イミドエステル誘導体を用いることにより、それぞれのRNA断片を蛍光標識できることがわかった。このRNA断片では、NH2−yが配列の中央に位置しているが、末端に導入すれば、修飾効率はさらに高くなると期待される。また、NH2−yを導入したRNAは、蛍光色素以外にもいろいろな修飾が可能である。
【0122】
実施例14 フィルター結合法によるタンパク質と部位特異的に蛍光標識したRNAの結合実験
A)転写反応用鋳型の調製
本実施例に使用するRaf−1タンパク質及びRNAアプタマーについては、本明細書中に参考文献として援用されるWO2004/007713の参考例1を参照されたい。
【0123】
転写反応用の鋳型は、以下のPCR反応により調製された。PCR反応の鋳型にはanti−(Raf−1) アプタマー9Aの遺伝子(配列番号4)がサブクローニングされたベクター(TOPO 9A)を用い、また、PCR反応の酵素には、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性がないTaq DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。
【0124】
反応組成は、10mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTPs、1μM プライマー対[39.45 (39−mer);5’−GGTAATACGACTCACTATAGGGAGTGGAGGAATTCATCG(配列番号5)、29.45v90 (29−mer);5’−GCAGAAGCTTvCTGTCGCTAAGGCATATG(配列番号6)]、1ng/μl TOPO 9A、0.025単位/μl Taq DNAポリメラーゼである。
【0125】
反応はPTC−100TM Program Thermal Controller(MJ Research)を用いて、[94℃ 15秒−50℃ 30秒−72℃ 1分]×15サイクル − 72℃ 5分、の条件で行われた。反応溶液をマイクロピュア−EZ(ミリポア)に通して酵素を除去した後、溶液をエタノール沈澱してPCR産物を回収した。サンプルは、滅菌水に溶かして保存し、T7転写反応の鋳型とした。
【0126】
B)T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応(FAM−yを90残基目に含むRNA 9Aの調製)
T7転写反応は、40mM Tris−HCl 緩衝液(pH8.0)、8mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01% TritonX−100、1mM natural NTPs、1mM FAM−yTP、25ng/μl 鋳型DNA、及び2.5U/μl T7 RNAポリメラーゼ(TaKaRa)を含む溶液で行った。37℃、6時間反応を行った後、10M 尿素を含む電気泳動用色素溶液を反応溶液と等量加えて反応を停止させた。反応溶液を75℃で3分間加熱後、10% ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルで電気泳動を行い、目的の転写反応産物(9A90F;100−mer)が含まれるゲルを切り出した。目的産物を滅菌水でゲルから溶出した後、エタノール沈殿を行い、RNA 9A90Fを回収した。
【0127】
C)フィルター結合法によるタンパク質とRNAの結合実験
結合実験には、human Raf−1のRBD(アミノ酸残基51−131番)のGST融合タンパク質(Raf−1タンパク質)を用いた。本手法では、ニトロセルロースフィルターがタンパク質を吸着する一方、FAM標識されたRNA 9Aは吸着しない性質を利用し、タンパク質−RNA複合体をニトロセルロースフィルターにより単離した。
【0128】
RNA 9A90F、60μl(最終濃度 10nM)を、さまざまな濃度のRaf−1タンパク質、2μl(最終濃度50−800nM)と緩衝液P(PBS、5mM MgCl2)中で混合し、室温(22℃)で30分間インキュベートした。その反応溶液50μlをニトロセルロースフィルター(ミリポア,catalog# HAWP01300)に通し、200μlの緩衝液Pで洗浄した後、フィルター上に吸着したRNAの蛍光量を蛍光スキャナ(Molecular Imager FX Pro、BIO−RAD)により測定した。測定条件は、フィルターが530nm BP(BandPath)、レーザー波長が488nm、PMTセッティングが80%である。カレイダグラフ(Albelbeck Software)を用いて、測定した蛍光量をy、タンパク質濃度をM0として、計算式y=M0×M1/(M0+M2)にあてはめ、最小二乗法によるデータフィッテングを行って解離定数Kd(M2に相当)を求めた。同時に求まるM0は、RNAとタンパク質の結合が飽和した場合(タンパク質量が無限大)でのフィルター上に吸着されるRNAの蛍光量に相当する。結果を図8に示す。
【0129】
本実施例では、本研究の応用例として、FAM−yTPをRaf−1タンパク質に特異的に結合するRNAアプタマー(抗−Raf−1アプタマー)の90番目(全長100ヌクレオチド)に導入し、この蛍光色素を導入したRNAアプタマーと種々の濃度のRaf−1タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合したRNAアプタマーの蛍光を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた。これは、従来のラジオアイソトープでRNAを標識する方法に代わる簡便な方法である。
【0130】
実施例15 テオフィリンに特異的に結合するアプタマーへの蛍光色素−結合yの導入
1)本実施例では、本発明の部位特異的な蛍光標識の可能性を調べるために、気管支拡張剤テオフィリン(非特許文献37、41−46)に特異的に結合する別のアプタマーに、蛍光色素−結合yを導入した(図9a)。RNA分子中の特異的な位置の蛍光色素は、蛍光強度における変化を測定することによって立体構造の変化を検出するために、あるいは、標的分子を検出するために有用である。
【0131】
テオフィリンの結合により、RNAアプタマー中に特有の構造モチーフが生じる(図9b)。複合体では、2組のトリプレット、即ち、U6−U23−A28(図9c)及びA7−C8−G26、並びに2組の独立した塩基、即ち、C22及びU24が、テオフィリンを囲み、高度に特異的なリガンド結合部位を形成する。しかしながら、この部位は、リガンドが存在しない場合、安定しては形成されない(非特許文献37、41−46)。非特許文献37は、蛍光アデニン類似体、2−アミノプリンをアプタマーのC27に導入し、アプタマーとテオフィリンとの結合様式について、ストップトフロー蛍光スペクトルによる解析を報告している。
【0132】
本発明者らは、アプタマー配列内の適当な部位を蛍光色素−結合yで置換し、蛍光強度における変化をモニターすることで、テオフィリンとの結合を検出した。以下、具体的に説明する。
【0133】
2)先ず、蛍光色素−結合yの導入のための、テオフィリン結合性アプタマー内の適当な部位を決定するために、アプタマーの結合モチーフ内のU6、U23又はU24をそれぞれ、非修飾yで置換した場合の効果を調べた。yを有する各アプタマー(41ヌクレオチド)は、sを含む鋳型DNAを用いて、yTP存在下でT7転写を行い、調製された。(図10a)。アプタマーへのyの部位特異的な導入は、2次元TLCを用いたヌクレオチド組成分析により確認された(図10c)。
【0134】
アプタマーのテオフィリン結合に関する解離定数(Kd)を、公知の平衡濾過アッセイ法(非特許文献41)によって、100mM HEPES(pH7.3)、50mM NaCl及び5mM MgCl2を含む溶液中で、3H−標識テオフィリンを用いて測定した。U23及びU24でのyによる置換は、元のアプタマーの結合能力(Kd=331±16nM)と比較して、アプタマーの結合能力を有意に減少させた(Kd>1500nM)。U23の置換については、U23の4−ケト基が、塩基のトリプレットにおいてU6とA28の双方と水素結合を形成する。非天然型塩基yはUの4−ケト基を欠くため、U23をyで置換すると、結合に好ましくない影響を与えうると考えられる。一方、U24の4−ケト基が他の塩基やテオフィリンと直接相互作用していることはNMRによる解析では観察されなかったが、U24の3位の窒素原子は、テオフィリンと水素結合を形成している。したがって、U24の4−ケト基が結合モチーフの形成に重要な役割を果たしており、そして、U24が実際に、アプタマー構造における金属結合及びU−ターン形成(非特許文献42、44)に関与していることが、U24をyに置換することにより、示唆された。
【0135】
一方、U6をyで置換したアプタマーは、解離定数217±13nMで、元のアプタマーに遜色なく、テオフィリンに結合した。このことは、U6の4−ケト基を除いても、アプタマーの結合能力には悪い影響を与えないことを示唆する。実際、この4−ケト基はアプタマー中のU6−U23−A28塩基のトリプレットに関与していない(非特許文献42,43)。さらに、5−フェニルエチニル−2−オキソ(1H)ピリジン(Ph−y)(非特許文献38)及び5−ヨード−2−オキソ(1H)ピリジン(I−y)(非特許文献22)などの、5−修飾yを、U6の代わりに導入しても、アプタマーは結合能力を維持した(Ph−y置換について、Kd=536±42nM、そして、I−y置換について、Kd=551±68nM、表4及び図11)。
【0136】
表4 修飾−yを有するRNAアプタマーのテオフィリン結合能
【0137】
【表4】
【0138】
a: テオフィリン結合の解離定数は、3H−標識テオフィリン(20nM)及び種々のRNA濃度(25−1500nM)を用いた平衡濾過アッセイで測定した。
b: 蛍光強度変化から求めたテオフィリン結合の平衡定数は、種々のテオフィリン濃度(0−20μM)での、蛍光色素−結合yを有するRNAアプタマー(100nM)の蛍光測定により決定された。
【0139】
U6をyで置換したアプタマーのKd値(Kd=217±13nM)は、非修飾アプタマーのKd値(Kd=331±16nM)よりも若干低かった。従って、U6をyで置換してもテオフィリンを結合するために必須な塩基トリプレットの形成が可能であり、U6は、蛍光色素−結合yの導入のために適した部位である。
【0140】
3)本発明者は、sを有する鋳型DNAを用いT7転写によって、U6の部位にshort FAM−y、FAM−y、又はTAMRA−yを有するアプタマーを調製し、テオフィリンの結合を調べた。short FAM−y及びFAM−yを有するアプタマーの3H−標識テオフィリンへの結合のKd値は、約200nM(表4)であり、これは、元のアプタマーやU6をyで置換したアプタマーのそれと同一である。
【0141】
本発明者らは次いで、FP−6500蛍光測定装置を用いて、テオフィリンの存在下又は非存在下でのアプタマーの蛍光強度を測定した。short FAM−y、FAM−y又はTAMRA−yを有するアプタマーの蛍光強度は、テオフィリンの量に依存して増加し、そして、テオフィリンの飽和濃度(5−20μM)の添加によって倍増した(図12)。
【0142】
TAMRA−yを有するアプタマーの3H−標識テオフィリンへの結合のKd値は非常に高く、テオフィリンとの結合が弱いことが示唆されたが、テオフィリンの濃度を増加させるにつれて、アプタマーの蛍光強度は増加した(図12d)。これらの蛍光強度の変化は、標的物質であるテオフィリンとの結合により、アプタマーの構造変化が生じたためと考えられる。テオフィリンの非存在下において、蛍光残基はアプタマーの構造の内部に存在して、近傍の塩基との重なりなどにより、蛍光強度が減少していると考えられる。テオフィリン存在下では、アプタマーがテオフィリンと結合することにより、蛍光残基が外部に押し出され、溶媒にさらされて塩基による消光作用が減少し、蛍光強度が増加したと考えられる。
【0143】
アプタマーの蛍光強度変化から得られる平衡定数(「Kf」によって表す)(図12及び表4)は、3H−標識テオフィリンを用いて得られる解離定数(Kd)と若干相違した。short FAM−y及びFAM−yを有するアプタマーの場合、Kf値は、対応するKd値よりも大きかった。このことは、約0.2−0.5μMの濃度でテオフィリンが結合した場合、蛍光色素はまだ構造の内部で近傍の塩基と重なっていることを示唆する。対照的に、TAMRA−yを有するアプタマーのKf値はKd値の2分の1であった。理論に束縛されるわけではないが、これは、TAMRAのジメチルアミノ基が立体障害となり、テオフィリンとの弱い相互作用によってもTAMRA残基がアプタマーの構造の内部から外部へ押し出されやすくなり、また同時にテオフィリン結合能力の低下を引き起こしたことによると考えられる。いずれの場合も、アプタマーのKf値は、テオフィリンの特定の濃度によって誘導される蛍光残基の環境変化に依存する。よって、Kf値もアプタマーのセンサーとしての検出感度を評価するに、実際に有用である。
【0144】
蛍光標識アプタマーは、テオフィリンに対するその高い特異性を保持している。アプタマーの蛍光強度は、構造的にテオフィリンと類似するカフェイン(20μM)の存在下でも増加されない(図12a、c及びd)。特に、short FAM−yで標識したアプタマーは、20μMカフェインの添加によっても蛍光強度の有意な変化は観察されなかった(図12a)。
【0145】
本発明の方法の感度は、従来のモジュラーアプタマーセンサー及び蛍光分子スイッチ(非特許文献47−48)よりも、非常に高いものである。従来技術において、テオフィリン結合性アプタマーのC27の部位へ、別の蛍光色素、2−アミノプリンを導入した場合も、プローブとして有用であった(非特許文献37)が、2−アミノプリンを有するアプタマーの調製は、化学合成を必要とする。本発明の、非天然型塩基対を利用した転写系は、所望の位置に蛍光プローブを有するRNA分子を調製するための簡便な方法である。そして、本発明によって提供される、部位特異的に標識された蛍光色素−結合y塩基は、その標的分子の選択的かつ効率的な検出を可能にするものである。
【0146】
本実施例において、「T7転写による、yまたはその5−修飾塩基(類)のテオフィリン結合性アプタマーへの部位特異的導入」、「平衡濾過アッセイ」及び「蛍光測定」は、具体的には以下のように行った。
【0147】
T7転写による、yまたはその5−修飾塩基(類)のテオフィリン結合性アプタマーへの部位特異的導入
sを有する化学的に合成された二本鎖鋳型DNAを用いて、y又はその修飾塩基(Ph−y、I−y及び蛍光色素−結合y)を、6U、23U又は24Uの代わりに導入した。
【0148】
sを含む鋳型の配列は、図10A及び配列番号7に記載した通りである。
図10AにおけるRNAアプタマー(41ヌクレオチド)(配列番号8)中の番号付けは、非特許文献43に記載された33ヌクレオチドからなるアプタマーの番号付けと対応させた。鋳型(59ヌクレオチド コードDNA及び59ヌクレオチド非コードDNAの10μM)を、10mM Tris−HCl(pH7.6)及び10mM NaClを含む緩衝液中で、95℃で加熱し、そしてゆっくりと4℃まで冷却することによってアニールさせた。
【0149】
転写は20μlスケールで行い、反応組成は、40mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM スペルミジン、5mM DTT、0.01%TritonX−100、1mM 天然型ヌクレオチド(NTP)および1mM yTP若しくは1mM Ph−yTP若しくは0.25mM I−yTP、2μCi[α−32P]ATP、2μM 鋳型DNAおよび2.5単位/μlのT7 RNAポリメラーゼ(Takara、Kyoto)である。
【0150】
37℃で6時間インキュベーションの後、等量の染色溶液の添加によって反応を終了させた。反応混合物を75℃で3分加熱し、そして、41ヌクレオチドの転写産物をゲル電気泳動によって精製した。
【0151】
平衡濾過アッセイ
特定部位にy又はその5−修飾塩基を有するRNAアプタマーによるテオフィリンとの結合を、平衡濾過アッセイ(非特許文献41)によって分析した。種々の濃度のアプタマーを含む溶液(54μl、100mM Hepes(pH7.3)、50mM NaCl及び5mM MgCl2中、25−1500nM)を、6μlの200nM 3H−標識テオフィリン溶液(Moravek)と混合し、そして混合物を25℃で5分間インキュベートした。次いで、混合物をMicrocon YM−10濾過装置(Amicon)に装填し、そして濃縮した。濾液の10μl試料を回収し、そして、シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。各RNAアプタマーに対するテオフィリン結合の比率は、RNAの存在下及び非存在下で得られた濾液中のテオフィリンの濃度の差から決定された。テオフィリン結合に関する解離定数(Kd)は、以下の式を用いたKALEIDAGRAPHプログラムによって決定した。
【0152】
式: y=M0×M1/(M0+M2)
[ここにおいて、
yは、テオフィリン結合の比率であり;
M0は、RNA濃度であり;
M1は、テオフィリンの結合容量であり;そして、
M2は、Kdである]。
【0153】
蛍光測定
U6の代わりにshort FMA−y、FAM−y又はTAMRA−yを有する各テオフィリン結合性アプタマーの蛍光プロフィールは、テオフィリン(0−20μM)又はカフェイン(20μM)の存在下で、FP−6500蛍光測定装置(JASCO)を用いて25℃で測定された。蛍光スペクトル測定では、100nMの濃度のアプタマーも用い、励起波長は5nmスペクトルバンド幅で434nm(short FAM−y若しくはFAM−yを有するアプタマー)、又は500nm(TAMRA−yを有するアプタマー)に設定した。
【0154】
各修飾アプタマーの平衡蛍光強度から決定される、Kf値は、以下の式を用いたKALEIDAGRAPHプログラムによって得られた。
式: y=1+C0×C1/(C0+C2)
[ここにおいて、
yは、FAMについては522nmであり、そしてTAMRAについては578nmにおける相対蛍光強度(テオフィリン非存在下での蛍光強度を「1」と設定する)であり;
C0は、テオフィリン濃度であり;
C1は、テオフィリンの飽和濃度における相対的増加値に該当し;そして、
C2は、Kfである]。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項2】
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の5位が、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項3】
前記塩基の5位の蛍光色素又は消光色素が、下記の化学式I−III:
【化1】
[式I中、nは1ないし5の整数から選択される]
【化2】
[式II中、m及びlは、1ないし5の整数から各々独立に選択される]
及び
【化3】
からなるグループから選択されるリンカーを介して、塩基の5位に結合している、請求項1又は2に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項4】
前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸。
【請求項5】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項4に記載の核酸。
【請求項6】
前記6位置換された2−アミノプリン−9−イル基が2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基又は2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基である、請求項5に記載の核酸。
【請求項7】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する、請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項8】
アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム又はアプタマーとして使用される、請求項4ないし7のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項9】
1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。
【請求項10】
1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。
【請求項11】
I−1)請求項1に記載のヌクレオチドを含む核酸と、請求項2に記載のヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【請求項12】
II−1)各々異なる蛍光色素であって、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、2種の請求項1に記載の核酸をハイブリダイズさせ、そして
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【請求項13】
1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、低分子化合物の検出方法。
【請求項14】
前記試料が溶液であり、工程2)において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
低分子化合物が、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド及びアミノ酸からなるグループから選択される、請求項13または14に記載の方法。
【請求項1】
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の5位に、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、 5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、及び6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項2】
5位置換−2−オキソ(1H)ピリジン−3−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の5位が、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)及びN−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項3】
前記塩基の5位の蛍光色素又は消光色素が、下記の化学式I−III:
【化1】
[式I中、nは1ないし5の整数から選択される]
【化2】
[式II中、m及びlは、1ないし5の整数から各々独立に選択される]
及び
【化3】
からなるグループから選択されるリンカーを介して、塩基の5位に結合している、請求項1又は2に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項4】
前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸。
【請求項5】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項4に記載の核酸。
【請求項6】
前記6位置換された2−アミノプリン−9−イル基が2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン−9−イル基又は2−アミノ−6−(2−チアゾリル)プリン−9−イル基である、請求項5に記載の核酸。
【請求項7】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドと、6位置換された2−アミノプリン−9−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する、請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項8】
アンチセンスDNA若しくはRNA、リボザイム又はアプタマーとして使用される、請求項4ないし7のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項9】
1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3)標的タンパク質を支持体に付着させ;そして
4)支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。
【請求項10】
1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を標的タンパク質と結合させ;
3’)標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
;そして
4’)溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。
【請求項11】
I−1)請求項1に記載のヌクレオチドを含む核酸と、請求項2に記載のヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
I−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【請求項12】
II−1)各々異なる蛍光色素であって、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を示す2種類の蛍光色素を各々含む、2種の請求項1に記載の核酸をハイブリダイズさせ、そして
II−2)蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【請求項13】
1)前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し;
2)前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ;そして
3)前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、低分子化合物の検出方法。
【請求項14】
前記試料が溶液であり、工程2)において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
低分子化合物が、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド及びアミノ酸からなるグループから選択される、請求項13または14に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図11】
【図12】
【図2】
【図3】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図11】
【図12】
【公開番号】特開2013−67622(P2013−67622A)
【公開日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−238245(P2012−238245)
【出願日】平成24年10月29日(2012.10.29)
【分割の表示】特願2006−542467(P2006−542467)の分割
【原出願日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【出願人】(508098800)タグシクス・バイオ株式会社 (3)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【国際特許分類】
【出願日】平成24年10月29日(2012.10.29)
【分割の表示】特願2006−542467(P2006−542467)の分割
【原出願日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【出願人】(508098800)タグシクス・バイオ株式会社 (3)
【Fターム(参考)】
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