新規なメチレンジオキシフェノール系化合物および疾患処置のためのそれらの使用
本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して心血管疾患、血管疾患、および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者を治療または予防する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連の優先権出願
[0001] 本出願は米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０８６，４２５、２００８年８月５日出願に基づく優先権を主張し、それの全体を本明細書に援用する。
【０００２】
電子媒体により提出した配列表の説明
[0002] 配列表の公式コピーを電子媒体でＥＦＳ−Ｗｅｂにより、２００９年８月５日にファイル名“604_29993_Sequence_Listing_OSURF-08051.txt”で作成された３キロバイトのサイズをもつＡＳＣＩＩフォーマット処理した配列表として提出し、本明細書と共に出願する。このＡＳＣＩＩフォーマット処理したドキュメントに含まれる配列表は本明細書の一部であり、それの全体を本明細書に援用する。
【０００３】
発明の分野
[0003] 新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体を、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して血管疾患、心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病性血管疾患、および関連状態を治療または予防する方法と共に提供する。
【背景技術】
【０００４】
[0004] 心血管疾患または心疾患は世界中で第１位の致死的疾患であり、関連リスク因子は大幅に増加しつつある。たとえば、心血管疾患および代謝疾患、たとえば糖尿病（２０２５年までに世界中で罹患率が４０％を超えると予想される）、メタボリックシンドローム、高血圧症および異脂肪血症は、罹患および死亡の主因である。さらに、最近の研究は、従来は防御されていた亜集団、たとえば若い女性ですら、心疾患に対する罹患性が増大しつつあることを指摘している。したがって、新規な心血管薬に対する広範な要望が高まり続けている。
【０００５】
[0005] アテローム硬化症の二次疾患である心血管疾患は単一疾患ではない。この疾患に関連する多数のリスク因子がある。これらには、糖尿病、高血圧症、異脂肪血症、喫煙、血栓形成傾向（凝血傾向または血栓症の亢進）、および陽性の家族歴が含まれる。しばしば、患者は多数のリスク因子をもち、多数の薬物で処置される。併用療法が有効であることは立証されているが、診断されていないリスク因子のほか、しばしば薬物−薬物相互作用、一日多数回の投与の不便さなどのため、多方面の研究を行なう必要がある。
【０００６】
[0006] これらのリスク因子間には多数の共通性があるけれども、現在までそれらの多くは別個の疾患として処置されてきた。たとえば、高血圧症に対する薬物は糖尿病に対してはほとんど効果がなく、逆も同じである。最近の研究は、これらの疾患（リスク因子）の多くは、炎症性ストレスおよび酸化的ストレスの増大など、共通の特徴をもつことを示唆している。さらに内皮機能の変化は、これらのリスク因子のほぼすべてと関連する、臨床的に重要な共通の所見である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007] 本発明は、心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延するために有用な医薬の調製における、これらの新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体の使用を提供する。
【０００８】
[0008] 心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病性血管疾患または関連障害の１以上の面または症状を治療または予防することができる１種類以上の薬物を得ることが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0009] 本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延する方法を提供することにより、これらの問題を実質的に緩和する。
【００１０】
[0010] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、アテローム硬化症の進行を阻止する能力をもつ。したがってこれらの化合物は、アテローム硬化症のリスクを伴う個体などにおいてプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用である。これらの化合物はプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用であるので、心臓発作、卒中、死亡、末梢動脈疾患の予防または軽減、および血管再生事象（冠動脈バイパス移植術または下肢バイパス術）のために、それらを投与することができる。
【００１１】
[0011] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子である核因子−カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化の阻止に及ぼす作用によって少なくとも立証されるように、抗炎症特性をもつ。したがってこれらの化合物は種々の炎症性障害において有用であり、これにはアテローム硬化症、糖尿病、炎症性関節炎（リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎）、高血圧症および老化が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、これらの化合物を許容できるキャリヤーと組み合わせて、心臓発作または卒中が最近確認された患者、または冠動脈もしくは末梢動脈への経皮介入を最近受けた患者に投与することができる。これらの組成物は、冠動脈もしくは末梢動脈にステントを施される患者に投与するのにも有用である。
【００１２】
[0012] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、血管のインスリン感受性の改善におけるそれらの効果からみて、糖尿病において、また糖尿病性心疾患、糖尿病性腎疾患および糖尿病性脳血管疾患を含めた糖尿病性血管疾患の予防において、保護効果をもつであろう。
【００１３】
[0013] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子であるステロール調節・結合タンパク質−２（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）（ＳＲＥＢＰ−２）にも作用する。これらの化合物は、ＳＲＥＢＰ−２の転写後活性化剤として作用し、新規クラスの選択的ＳＲＥＢＰ−２活性化剤である。ＳＲＥＢＰ−２の増加は低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を増加させ、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる。したがって、これらの化合物を用いて、ＬＤＬレベルの上昇に関連する高脂血症、たとえばヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症およびホモ接合体性家族性高コレステロール血症、複合高脂血症、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールの増加、ならびに糖尿病性異脂肪血症を処置することができる。
【００１４】
[0014] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体によりアテローム硬化症および炎症において得られる実質的な有益性からみて、それらはアテローム硬化症および炎症に有効なことが当業者に既知である他の療法薬と組み合わせて投与することもできる；これにはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ペルオキシソーム増殖応答性受容体アルファ（ＰＰＡＲα）アゴニストおよびＰＰＡＲガンマアゴニスト、アセチルサリチル酸、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、およびベータ遮断薬が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
[0015] 本発明のメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体を、医薬的に許容できるキャリヤーと組み合わせて、動物またはヒトに投与するための組成物を調製することができる。これらの組成物を用いて、血管疾患、心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病性血管疾患または関連障害、およびそれらの原因である多数のリスク因子を治療または予防することができる。これらの組成物は、単独で、または他の療法用化合物と一緒に投与することができる。そのような本発明組成物および１種類以上の追加の療法用化合物の投与は、個別に行なうことができる。あるいは、本発明組成物と１種類以上の追加の療法用化合物を１つの投与または送達方法において組み合わせることができる；たとえば、１つのカプセル剤、１つのカプレット、または１回の静脈内投与において。
【００１６】
[0016] 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示した態様の下記の詳細な説明および特許請求の範囲をみた後に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】[0017] 図１Ａは、ＩＮＶ−７０６５のプロトンＮＭＲを示す。
【図１Ｂ】[0018] 図１Ｂは、ＩＮＶ−７４６５のプロトンＮＭＲを示す。
【図２】[0019] 図２は、ＩＮＶ−７５に関する細胞ベースの毒性アッセイを示すグラフである。ヒト臍帯静脈内皮細胞をこの実験に用いた。
【図３】[0020] 図３は、ＩＮＶ−７５およびＴＮＦ−αに応答したＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の放出を表わす。
【図４】[0021] 図４は、ＩＮＶ−７５が核カッパ因子であるカッパ−Ｂ（ＮＦκＢ）に及ぼす作用を評価する多数回の実験のまとめを示すグラフである。これは、対照、ＴＮＦ−α、およびＩＮＶ−７５＋ＴＮＦ−α処理細胞に関する、ｐ６５（ＮＦκＢのサブユニット）の核／細胞質比として表わされる。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ａ】[0022] 図５Ａは、ＩＮＶ−７５を用いたステロール調節・結合タンパク質−２（ＳＲＥＢＰ２）活性測定のコースのインビトロタイムコースを示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞をＩＮＶ−７５（０．１ｍＭ）で４時間刺激し、核タンパク質へのＳＲＥＢＰ２の結合活性を電気泳動移動シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）（ＥＭＳＡ）により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】[0023] 図５Ｂは、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ２活性に及ぼす用量依存性作用を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＩＮＶ−７５で１時間刺激し、核タンパク質におけるＳＲＥＢＰ２の結合活性を電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ｃ】[0024] 図５Ｃは、ＳＲＥＢＰ２活性化のインビトロタイムコースを、処理した細胞の細胞質におけるＩＮＶ−７５による成熟形の評価により測定したものを示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞をＩＮＶ−７５（０．１ｍＭ）で４時間刺激し、成熟形および前駆形のＳＲＥＢＰ２をウェスタンブロット分析により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。対応するウェスタンブロットを右に示す。右の時間は時（ｈｏｕｒ）である。
【図５Ｄ】[0025] 図５Ｄは、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ２活性に及ぼす用量依存性作用を、ＩＮＶ−７５による成熟形により評価したものを示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＩＮＶ−７５で１時間刺激し、成熟形および前駆形のＳＲＥＢＰ２をウェスタンブロット分析により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。ＩＮＶ−７５の用量は対数モル濃度である。
【図５Ｅ】[0026] 図５Ｅは、ＩＮＶ−７５による低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のインビトロタイムコースを、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により評価したものを示すグラフである。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ｆ】[0027] 図５Ｆは、ＩＮＶ−７５による低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）測定の用量依存性実験を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＩＮＶ−７５で１時間刺激し、ＬＤＬ ｍＲＮＡの発現を定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。ＩＮＶ−７５の用量は対数モル濃度である。
【図６】[0028] 図６Ａは、ＩＮＶ−７５によるペルオキシソーム増殖応答性受容体アルファ（ＰＰＡＲα）のインビトロ評価を、代替としてアセチル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）を用いて示す。ＡＣＯはＰＰＡＲα調節型遺伝子である。ＨｅｐＧ２細胞をＩＮＶ−７５（１００μＭ）で指示した時間刺激し、ＡＣＯのｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５対０。[0029] 図６Ｂは、ＩＮＶ−７５によるＡＣＯのインビトロ活性化を、ルシフェラーゼレポーターに連結させた全長ヒトＰＰＡＲαによりトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞を用いて示す。細胞をＩＮＶ−７５で４時間刺激し、アセチル補酵素Ａオキシダーゼ（ＡＣＯ）のｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５対−８．５。[0030] 図６Ｃは、ＩＮＶ−７５によるＰＰＡＲα遺伝子活性化のタイムコース実験を、高力価ＰＰＡＲα活性化剤ＷＹ １４６４３による活性化との関係で表わしたものを示す。ＨｅｐＧ２細胞を全長ＰＰＡＲαプロモーターレポーター構築体でトランスフェクションし、ＩＮＶ−７５（１００ｕＭ）で刺激した。Ｃの結果をＷＹ １４６４３と比較した増加率％として表わす。
【図７】[0031] 図７は、ＩＮＶ−７５を用いたインビボＷＨＨＬウサギ実験プロトコルの模式図である。＊は、プラークのイメージングのためのＭＲＩ評価のタイミングを表わす。
【図８】[0032] 図８Ａは、３つの異なる時点で（ベースライン、６週目および１２週目）ＭＲＩにより測定したアテローム硬化プラーク負荷の評価を示す。[0033] 図８Ｂは、代表的なＭＲＩイメージを集めたものであり、対照ＷＨＨＬウサギと比較したＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化負荷の軽減を示す。
【図９】[0034] 図９は、対照グループおよびＩＮＶ−７５グループのＷＨＨＬウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化負荷を表わす棒グラフである。ｎ＝５／グループ。＊、非対合ｔ検定によるｐ＜０．０５−対−対照動物。対照介入を受けたＷＨＨＬグループと比較してＷＨＨＬウサギのアテローム硬化負荷が約６０％軽減。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１０】[0035] 図１０は、ＩＮＶ−７５処理動物におけるワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｒａｂｂｉｔ）（ＷＨＨＬ）の胸部大動脈のマクロファージ浸潤の形態計測分析である。＊、非対合ｔ検定によるｐ＜０．０５−対−対照。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１１】[0036] 図１１は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関して、抗−α−アクチン染色による大動脈壁の平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖の形態計測分析である。＊、非対合ｔ検定によるｐ＜０．０５−対−対照。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１２】[0037] 図１２は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関するＲｅｄ ｏｉｌ Ｏ染色による大動脈壁の脂質沈着の形態計測分析である。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１３】[0038] 図１３は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関するＭａｓｓｏｎトリクロム染色（Ｍａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎ）染色による大動脈壁のコラーゲン沈着の形態計測分析である。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１４Ａ】[0039] 図１４Ａは、ＷＨＨＬウサギにおいて対照と対比してＩＮＶ−７５が総コレステロールに及ぼす作用を表わすグラフである。高脂肪固形飼料（ＨＦＣ）を与える前にベースライン値を求めた。ＨＦＣ後＝高脂肪固形飼料の開始後であって、ただし薬物処理の前に求めた数値。ＩＮＶ−７５／対照後は、対照またはＩＮＶ−７５で処理した後の数値を表わす。Ｎ＝４〜５／グループ。総コレステロール値はグループ間で差がなかった。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。このモデルにおける高レベルの総コレステロールが、総コレステロールに対する有意の作用の観察を妨げたと思われる。
【図１４Ｂ】[0040] 図１４Ｂは、ＷＨＨＬウサギにおいて対照介入と対比してＩＮＶ−７５がＬＤＬコレステロール制御に及ぼす作用を表わすグラフである。高脂肪固形飼料を与える前にベースライン値を求めた。ＨＦＣ後＝高脂肪固形飼料の開始後であって、ただし薬物処理の前に求めた数値。ＩＮＶ−７５／対照後は、対照またはＩＮＶ−７５で処理した後の数値を表わす。Ｎ＝４〜５／グループ。ＬＤＬコレステロール値はグループ間で差がなかった。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。このモデルにおける高レベルのＬＤＬコレステロールが、総コレステロールに対する有意の作用の観察を妨げたと思われる。
【図１５】[0041] 図１５は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関して、血管収縮剤アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）による収縮（塩化カリウムＫＣｌ，１２０ｍＭに対する％）を示すグラフである。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４〜５／グループ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１６】[0042] 図１６は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関して、フェニレフリンに対する胸部大動脈の収縮率％を、塩化カリウム（ＫＣｌ，１２０ｍＭ）へのピーク収縮に対するパーセントとして表わしたものを示すグラフである。Ｎ＝４〜５／グループ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１７】[0043] 図１７は、対照動物−対−ＩＮＶ−７５処理動物の胸部大動脈リングセグメントにおけるアセチルコリン（Ａｃｈ）による弛緩（１μＭフェニレフリンＰＥによる前収縮に対する％）を示すグラフである。対照と対比したＩＮＶ−７５によるピーク弛緩に関する一元ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５／グループ）。＊＊＊、アセチルコリンによるピーク弛緩に関して対照と対比してｐ＜０．００１。ＩＮＶ−７５による処理または対照介入の終了時に屠殺した時点で、胸部大動脈をＷＨＨＬウサギから採取した。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１８】[0044] 図１８は、対照動物およびＩＮＶ−７５処理動物に関して、胸部大動脈リングセグメントにおける緊張のインスリンによる弛緩（１μＭフェニレフリンＰＥによる前収縮に対する％）を示すグラフである。
【図１９】[0045] 図１９は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギにおいて、処理終了時における酸化的ストレスの基礎レベルの尺度としての、ウサギ血漿の血漿８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α（８−イソプロスタン（８−Ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅ））酵素結合イムノアッセイにおける酸化的ストレスを示すグラフである。Ｎ＝４〜５匹のウサギ／グループ。＊＊＊＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１−対−対照。
【図２０】[0046] 図２０は、対照−対−ＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギの胸部大動脈における酸化的ストレスを示すグラフである。対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギにおける処理終了時の酸化的ストレスの尺度としての、大動脈ホモジェネートの８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α（８−イソプロスタン）酵素結合イムノアッセイ。Ｎ＝４〜５匹のウサギ／グループ。＊＊＊＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１−対−対照。
【図２１】[0047] 図２１は、ＩＮＶ−７５または対照がワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（ＷＨＨＬ）大動脈切片における基礎インサイチュースーパーオキシド産生に及ぼす作用を、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色により定量したものを示すグラフである。＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定により、対照と対比してＩＮＶ−７５についてｐ＜０．０１。
【図２２】[0048] 図２２は、ＩＮＶ−７５または対照介入を施したワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（ＷＨＨＬ）からの大動脈組織溶解物における基礎スーパーオキシド産生およびアゴニストＮＡＤＰＨに応答した刺激スーパーオキシド産生に及ぼす作用を、ルシゲニン（Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）化学発光アッセイにより分析したものを示すグラフである。矢印はＮＡＤＰＨ（１００ｍＭ）の添加を示す；ｎ＝５／グループ。＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５−対−対照動物。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図２３】[0049] 図２３は、炎症マーカーとしてのＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、ＭＣＰ−１およびＬ−セレクチンを調べるための遺伝子発現レベルを示すグラフである。ＩＮＶ−７５または対照処理したＷＨＨＬウサギの胸部大動脈から全ＲＮＡを調製した。炎症促進性遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＰＣＲにより分析した。＊、ｐ＜０．０５；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図２４】[0050] 図２４は、ＩＮＶ−７５および対照介入がＷＨＨＬウサギにおいてＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１発現に及ぼす作用を示すグラフである。ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のタンパク質発現レベルをウェスタン分析により分析した。＊、ｐ＜０．０５；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図２５】[0051] 図２５は、炎症の細胞性相関としてのＶＣＡＭ−１タンパク質発現レベルを示すグラフである。ＩＮＶ−７５は、ＨＵＶＥＣにおいてＴＮＦα誘導型ＶＣＡＭ−１発現を阻害する。ＨＵＶＥＣをビヒクル、ＩＮＶ７５、またはＷＹ−１４６４３で２時間、前処理し、次いでＴＮＦαで４時間処理した。ＶＣＡＭ−１発現をウェスタンブロットにより分析した。３つの独立した実験の代表例およびまとめを示す。＊、ｐ＜０．０５−対−対照；＃、ｐ＜０．０５−対−ＴＮＦα。
【図２６】[0052] 図２６は、普通の固形飼料で飼育し、ＩＮＶ−７５または対照により２週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＮＶ−７５が肝ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用を、ＲＴ−ＰＣＲにより測定したものを示すグラフである。対照グループとＩＮＶ ７５処理グループの結果の比較。
【図２７】[0053] 図２７は、ＩＮＶ−７５または対照で２週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＮＶ−７５がＬＤＬレベルを低下させる作用を示すグラフである。＊、ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡ。
【図２８】[0054] 図２８は、普通の固形試料で飼育し、ＩＮＶ−７５または対照で２週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＮＶ−７５が肝ＳＲＥＢＰ２に及ぼす作用を、ＥＭＳＡにより測定したものを示すグラフである。
【図２９】[0055] 図２９は、ニュージーランド白（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）（ＮＺＷ）ウサギモデルのアテローム硬化症におけるＩＮＶ−７０６５の作用を試験するために用いたインビボ実験プロトコルの模式図である。
【図３０】[0056] 図３０Ａは、高脂肪固形試料を与え、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸処理および対照介入したニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、アテローム硬化負荷の軽減を示すＭＲＩ試験のまとめを表わす棒グラフである。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、対照終末点値と対比（ｎ＝４〜５／グループ）。[0057] 図３０Ｂは、２つの異なる時点、ベースライン（Ａ）および終末点（Ｂ）でガドリニウム造影剤を投与した後に得られたインビボＭＲＩイメージを示す（それぞれ、バルーン表皮剥脱術後１週目および１２週目）。各グループからの代表的なイメージを提示する。造影前の腹部大動脈イメージングは、バルーン表皮剥脱動物において１２週後に、対照グループまたはリポ酸処理と比較してＩＮＶ−７０６５が造影剤によるニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギの大動脈の不透明化を低下させることを示す。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図３１Ａ】[0058] 図３１Ａは、対照動物ならびにＩＮＶ−７０６５およびリポ酸処理動物に関して、塩化カリウム（ＫＣｌ，１２０ｍＭ）に対比した収縮の％を示すグラフである。フェニレフリン（ＰＥ）用量応答。ＩＮＶ−７０６５で１４週間処理した後、リポ酸または対照（ｎ＝４〜５／グループ）ウサギを屠殺し、胸部大動脈セグメントをミオグラフチャンバーに固定した。ベースライン緊張３０ｍＮで２時間平衡化した後、大動脈セグメントを種々の濃度のＰＥで収縮させた。収縮を塩化カリウムによる最大収縮との関係で表わす。＊、ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡによりリポ酸または対照ＮＺＷウサギと対比。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図３１Ｂ】[0059] 図３１Ｂは、ＩＮＶ−７０６５処理、リポ酸処理または対照ニュージーランド白ウサギの胸部大動脈セグメントの、インスリンに対する血管弛緩応答を示すグラフである。大動脈セグメントをＰＥ（０．３μＭ）により前収縮させ、そしてインスリンに対する弛緩応答を試験した。＊、ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡによりリポ酸または対照ＮＺＷウサギと対比（ｎ＝４〜５／グループ）。
【図３１Ｃ】[0060] 図３１Ｃは、図３１ｂに記載したように、対照、ＩＮＶ−７０６５処理およびリポ酸処理動物において、アセチルコリンに対する血管弛緩応答を示すグラフである（フェニレフリン ＰＥ（０．３μＭ）による前収縮に対する％）。＊、ｐ＜０．０１、対照ＮＺＷウサギと対比したリポ酸およびＩＮＶ−７０６５に関して、一元ＡＮＯＶＡによる。リポ酸とＩＮＶ−７０６５の間に応答の差はなかった（ｎ＝４〜５／グループ）。
【図３１Ｄ】[0061] 図３１Ｄは、図３１Ｂに記載したように、高脂肪食を与えた対照、ＩＮＶ−７０６５処理およびリポ酸処理ニュージーランド白ウサギにおいて、ニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）による弛緩を示すグラフである（フェニレフリン ＰＥ（０．３μＭ）による前収縮に対する％）（ｎ＝４〜５／グループ）。
【図３２Ａ】[0062] 図３２Ａは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸が総コレステロール（ＴＣ）に及ぼす作用を示すグラフである（ｎ＝４〜５／グループ）。[0063] 正常対照との比較 [0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｂ】[0065] 図３２Ｂは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がトリグリセリド（ＴＧ）に及ぼす作用を示すグラフである。対照処理ＮＺＷウサギと比較して、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸はトリグリセリドレベルを低下させた。ＩＮＶ−７０６５の方がさらにトリグリセリドを減少させる傾向はあったが、これらの結果は有意ではなかった。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｃ】[0066] 図３２Ｃは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がＨＤＬに及ぼす作用を示すグラフである。リポ酸およびＩＮＶ−７０６５の両方について、ベースラインと終末点の間に差はなかった。高脂肪食を与えた対照ＮＺＷウサギにおいて、高脂肪固形試料を与えた後にＨＤＬレベルが低下したが、これは統計的に有意ではなかった。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｄ】[0067] 図３２Ｄは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がＬＤＬに及ぼす作用を示すグラフである。対照ＮＺＷウサギと比較して、リポ酸グループおよびＩＮＶ−７０６５グループのＬＤＬレベルは低かった。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｅ】[0068] 図３２Ｅは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギ（ｎ＝４〜５／グループ）において、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がＶＬＤＬに及ぼす作用を示すグラフである。対照およびリポ酸処理ウサギと比較して、ＩＮＶ−７０６５グループのＶＬＤＬレベルは低下したことが示された。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0069] 本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延する方法を提供することにより、これらの問題を実質的に緩和する。患者という用語は、本明細書において動物およびヒトを表わす。
【００１９】
[0070] 本発明は、心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延するのに有用な医薬の調製における、これらの新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体の使用をも提供する。
【００２０】
[0071] 化学組成
[0072] ある態様において、本発明の化学物質は下記の式Ｉにより記載される化合物を含む。
【００２１】
【化１】
【００２２】
[0073] Ｒ１に関する置換基には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
水素、
【００２３】
【化２】
【００２４】
アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、Ｈ３ＣＯＣ、
【００２５】
【化３】
【００２６】
リポイル（ｌｉｐｏｙｌ）、
【００２７】
【化４】
【００２８】
ジヒドロリポイル、
【００２９】
【化５】
【００３０】
フェルリル（ｆｅｒｕｌｙｌ）、および
【００３１】
【化６】
【００３２】
異性体形フェルリル。
【００３３】
[0074] Ｒ２に関する置換基は存在しないか、あるいは存在することができ、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
【００３４】
【化７】
【００３５】
−メトキシ、−エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、ならびに複素環、たとえばイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリジン、ピペリジン、
【００３６】
【化８】
【００３７】
カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、脂肪族アミド（炭素原子１〜３個）、脂環式アミド、たとえばピロリジン、ピペリジン、ならびに芳香族アミド、たとえばアニリン、置換アニリン、
【００３８】
【化９】
【００３９】
アミン、アルキル化（炭素原子１〜３個）アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸、たとえばフェルラ酸（ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、ケイ皮酸、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、および
【００４０】
【化１０】
【００４１】
ハロゲン置換基、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素。
【００４２】
[0075] Ｒ３に関する置換基は存在しないか、あるいは存在することができ、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
アルキル基；直鎖（炭素原子１〜３個）および分枝鎖（炭素原子３〜５個の鎖）の両方、
下記の官能基を有するアルキル基：遊離カルボン酸、エステルおよびアミド、ならびに遊離ヒドロキシル誘導体およびアルキル化エーテル誘導体、
下記から選択される官能基を有するアルキル基（炭素原子１〜３個の鎖）：アミン、アルキル化アミン、脂肪族、芳香族両方のアミド、および複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリン、チアゾリジンジオン、ピペラジン、ＣＨ２ＣＨ２−チアゾリジンジオン、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３−ＣＯ−リポイルを含むもの、ＣＨ２ＣＨ２−Ｆ、または
ハロゲン化された基、たとえばフッ化アルキル（炭素原子１〜３個の鎖）。
【００４３】
[0076] 本発明の具体的な態様には下記の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
[0077]
【００４５】
【化１１】
【００４６】
ＩＮＶ−７３＝３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート
[0078]
【００４７】
【化１２】
【００４８】
ＩＮＶ−７５＝３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート
[0079]
【００４９】
【化１３】
【００５０】
ＩＮＶ−７４＝３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール
[0080]
【００５１】
【化１４】
【００５２】
ＩＮＶ−７０６５＝３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート
[0081]
【００５３】
【化１５】
【００５４】
ＩＮＶ−７４６５＝３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート
【００５５】
【化１６】
【００５６】
【化１７】
【００５７】
【化１８】
【００５８】
[0097] 医薬組成物
[0098] 動物またはヒトに投与するために、本発明の療法用化合物または分子を許容できるキャリヤーと組み合わせて医薬組成物を調製し、動物またはヒトに投与する。本発明の療法用化合物は、使用または投与の前に医薬的に許容できるいずれかのキャリヤー中に再構成することができる。
【００５９】
[0099] 医薬的に許容できるキャリヤー
[00100] 医薬的に許容できるキャリヤー：本明細書において有用な医薬的に許容できるキャリヤー（ビヒクル）は一般的なものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)に、本明細書に記載する１種類以上の療法用化合物または分子を医薬として送達するのに適切な組成物および配合物が記載されている。
【００６０】
[00101] 一般に、キャリヤーの性質は、採用する個々の投与様式に依存するであろう。たとえば、非経口配合物は通常、注射用流体を含み、これには医薬的および生理的に許容できる流体、たとえば水、生理食塩水、平衡生理食塩水、水性のデキストロース、グリセロールなどのビヒクルが含まれる。固形組成物（たとえば散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）について、一般的な無毒性固体キャリヤーは、たとえば医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。投与される医薬組成物は、生物学的中性キャリヤーのほか、少量の無毒性補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、たとえば酢酸ナトリウムまたはモノステアリン酸ソルビタンを含有することができる。
【００６１】
[00102] 代表的な投与方法、配合物および用量
[00103] 本発明により提供する療法用化合物を、ヒトまたは動物対象に投与するために、医薬的に許容できるキャリヤーまたはビヒクルと組み合わせることができる。ある態様において、療法用化合物以外のものを組み合わせて単一製剤を形成することができる。療法用化合物は、好都合には単位剤形で提供し、一般的な製薬技術を用いて調製することができる。そのような技術には、有効成分と医薬用キャリヤー（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）を混和する工程が含まれる。一般に配合物は、有効成分と液体キャリヤーを均質かつ密に混和することにより調製される。非経口投与に適切な配合物には、下記のものが含まれる：水性および非水性の無菌注射液：これらは抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および配合物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる；ならびに水性および非水性の無菌懸濁液剤：これらは懸濁化剤および増粘剤を含有することができる。配合物を単回量または多数回量の容器、たとえばシールしたアンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で保存することができ、これは使用直前に無菌液体キャリヤー、たとえば注射用水の添加を必要とするにすぎない。即時調合型の注射液剤または懸濁液剤を、当業者が一般に使用する無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００６２】
[00104] 特定の態様において、単位剤形の配合物は、１回量もしくは単位量、またはその適宜な画分の投与成分を含有するものである。本発明に包含される配合物は、特に前記に述べた成分のほか、当業者が一般に使用する他の作用剤を含有することができると解釈すべきである。
【００６３】
[00105] 本発明において提供する医薬組成物は、障害、たとえば心血管障害の処置に使用するためのものを含めて、種々の経路で投与することができる：たとえば経口（頬内および舌下を含む）、直腸、非経口、エアゾール、鼻腔、筋肉内、腹腔内、脈管内、静脈、動脈内、関節内、皮下、皮内、および局所。それらは種々の形態で投与することができ、これには液剤、乳剤および懸濁液剤、マイクロスフェア、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、およびリポソームが含まれるが、これらに限定されない。１態様においては、療法用化合物を許容できるキャリヤーと組み合わせて、丸剤、カプセル剤中においてまたは食物と共に経口投与するための医薬組成物を形成する。
【００６４】
[00106] 他の態様において、医薬組成物を処置の必要な領域に局所投与することが望ましい場合がある。これは、限定ではないが、たとえば外科処置中の局所（ｌｏｃａｌまたはｒｅｇｉｏｎａｌ）注入もしくは潅流、アテローム硬化症血管などの血管への直接潅流、局所適用（たとえば創傷包帯、薬物含有ステント）、注射、カテーテル、坐剤、または埋込み剤（たとえば多孔質、非孔質、またはゼラチン性の材料から形成される埋込み剤；膜、たとえばシリコーン膜、または繊維を含む）などにより達成できる。１態様において投与は、組織、たとえば心臓または末梢血管の処置すべき部位（または前方部位）における直接注射によることができる。他の態様において、医薬組成物を特にリポソームなどのビヒクル中において送達することができる(たとえば、Langer, Science 249: 1527-1533, 1990; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353- 365, 1989を参照)。投与方法の組合わせ、たとえば、本発明の療法用化合物でコートしたステントを配置する前、後または途中での、本発明の療法用化合物の全身または局所注入も採用することができる。
【００６５】
[00107] さらに他の態様において、医薬組成物を制御放出システム中において送達することができる。１態様においては、ポンプを使用できる(たとえば、Langer Science 249: 1527-1533, 1990; Sefton Crit. Rev. Biomed. Eng. 14: 201-240, 1987; Buchwald et al., Surgery 88: 507-516, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574-579, 1989を参照)。他の態様においては、ポリマー材料を使用できる(たとえば、Ranger et al., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61-64, 1983; Levy et al., Science 228: 190-192, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25: 351-356, 1989; およびHoward et al., J. Neurosurg. 71: 105-112, 1989を参照)。他の制御放出システム、たとえばLanger (Science 249: 1527-1533, 1990)に述べられたものも使用できる。
【００６６】
[00108] 医薬組成物の有効量は、処置すべき障害または状態の性質、および障害または状態の段階に依存するであろう。有効量は、標準的な臨床技術により決定できる。配合物中に使用すべき厳密な用量は投与経路にも依存し、ヘルスケア専門家の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。そのような用量範囲の一例は、１回量または分割量で０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。他の用量範囲には、１回量または分割量で１．０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ、５．０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０〜７５ｍｇ／ｋｇ（体重）が含まれる。これらの範囲内のいかなる用量も使用できることを理解すべきである。
【００６７】
[00109] いずれか特定の対象についての具体的な用量レベルおよび頻度は異なり、多様な要因に依存するであろう；これには個々の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排出速度、薬物組合わせ、ならびに療法処置を受ける対象の状態の重症度が含まれる。
【００６８】
[00110] 本発明の医薬組成物は、処置期間を通してほぼ同じ用量で、漸増量（ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ ｄｏｓｅ）計画で、または負荷量（ｌｏａｄｉｎｇ−ｄｏｓｅ）計画で（たとえば、この場合、負荷量は維持用量の約２〜５倍である）投与することができる。ある態様においては、処置される対象の状態、疾患もしくは状態の重症度、療法に対する見掛け上の応答、および／または当業者が判断する他の要因に基づいて、処置経過中に用量を変動させる。投与体積は投与経路に応じて異なるであろう。たとえば、筋肉内注射は約０．１ｍｌから約１．０ｍｌまでの範囲であってもよい。当業者には種々の投与経路に適切な体積が分かるであろう。
【００６９】
[00111] 処置すべき疾患または状態
[00112] 本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを用いて血管疾患（心血管疾患、脳血管疾患、末梢血管疾患、および糖尿病性血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症性疾患、または関連障害、およびそれらの原因である多数のリスク因子を治療または予防する方法を提供する。
【００７０】
[00113] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、アテローム硬化症の進行を阻止する能力をもつ。したがってこれらの化合物は、アテローム硬化症のリスクを伴う個体などにおいてプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用である。これらの化合物はプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用であるので、心臓発作、卒中、末梢動脈疾患の予防または軽減、および血管再生事象（冠動脈バイパス移植術または下肢バイパス術）のために、それらを投与することができる。
【００７１】
[00114] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子である核因子−カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化に対する作用によって少なくとも立証されるように、抗炎症特性をもつ。したがってこれらの化合物は種々の炎症性障害において有用であり、これにはアテローム硬化症、糖尿病、炎症性関節炎（リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎）、高血圧症および老化が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、これらの化合物を許容できるキャリヤーと組み合わせて、心臓発作または卒中が最近確認された患者、または冠動脈もしくは末梢動脈への経皮介入を最近受けた患者に投与することができる。これらの組成物は、冠動脈もしくは末梢動脈にステントを施される患者に投与するのにも有用である。
【００７２】
[00115] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、血管のインスリン感受性の改善におけるそれらの効果からみて、糖尿病において、また糖尿病性心疾患、糖尿病性腎疾患および糖尿病性脳血管疾患を含めた糖尿病性血管疾患の予防において、保護効果をもつであろう。
【００７３】
[00116] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子であるステロール調節・結合タンパク質−２（ＳＲＥＢＰ−２）にも作用する。これらの化合物は、ＳＲＥＢＰ−２の転写後活性化剤として作用し、新規クラスの選択的ＳＲＥＢＰ−２活性化剤である。ＳＲＥＢＰ−２の増加はＬＤＬＲを増加させ、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる。したがって、これらの化合物を用いて、ＬＤＬレベルの上昇に関連する高脂血症、たとえばヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症およびホモ接合体性家族性高コレステロール血症、複合高脂血症、ＶＬＤＬコレステロールの増加、ならびに糖尿病性異脂肪血症を処置することができる。
【００７４】
[00117] 併用療法
[00118] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体によりアテローム硬化症および炎症において提供される実質的な有益性からみて、それらはアテローム硬化症および炎症に有効なことが当業者に既知である他の療法薬と組み合わせて投与することもできる；これにはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲアルファアゴニスト（たとえばロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））およびＰＰＡＲガンマアゴニスト（ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）、フェノフィブレート（Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、ベザフィブレート（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ））、アセチルサリチル酸、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬（アナセトラピブ（Ａｎａｃｅｔｒａｐｉｂ））、リポ酸、およびベータ遮断薬ならびにその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
[00119] 本発明のメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、単独で、または他の療法用化合物と一緒に投与することができる。そのような本発明組成物および１種類以上の追加の療法用化合物の投与は、個別に行なうことができる。あるいは、本発明組成物と１種類以上の追加の療法用化合物を１つの投与または送達方法において組み合わせることができる；たとえば、１つのカプセル剤、１つのカプレット、または１回の静脈内投与において。
【００７６】
[00120] ＡＣＥ阻害薬
[00121] ＡＣＥ阻害薬は、酵素であるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）がアンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩに変換するのを阻害する化合物である。アンギオテンシンＩＩは血管が弛緩および拡張するのを阻止することにより血圧を上昇させる。ＡＣＥ阻害薬は、高血圧症を処置するために用いられ、抗高血圧症クラスの医薬に属し、心血管疾患による死亡のリスクを２０％〜４０％低下させることができる。ＡＣＥの阻害により、血管を弛緩させて血圧を降下させることができる。ＡＣＥ阻害薬は動脈抵抗を低下させ、静脈容量を増大させ、心拍出量および心指数、１回心仕事量および１回心拍出量を増大させ、腎血管抵抗を低下させ、かつナトリウム利尿（尿中におけるナトリウム排出）の増大をもたらす。疫学的試験および臨床試験により、ＡＣＥ阻害薬はそれらの血圧降下作用とは独立して糖尿病性腎障害の進行を低下させることが示された。ＡＣＥ阻害薬のこの作用は糖尿病性腎障害の予防に利用されている。
【００７７】
[00122] ＡＣＥ阻害薬は、正常血圧の患者においてすら、高血圧症以外の適応症に有効なことが示された。ＡＣＥ阻害薬はその血圧降下作用とは独立して臨床転帰を改善するので、そのような患者における最大用量のＡＣＥ阻害薬の使用（糖尿病性腎障害、うっ血性心不全の阻止、心血管事象の予防のためのものを含む）が妥当である。
【００７８】
[00123] 低血圧の患者は意外にも十分にしばしばＡＣＥ阻害薬にかなり良好に耐容するが、一般にＡＣＥ阻害薬は腎問題をもつ患者または低血圧の患者には処方されない。ＡＣＥ阻害薬は妊婦に使用すべきではない。あるＡＣＥ阻害薬はうっ血性心不全を処置するために用いられ、あるいは医師が判断する他の状態に使用できる。
【００７９】
[00124] ＡＣＥ阻害薬は、化合物上の官能基の存在に基づいて分類できる。たとえばスルフヒドリル含有化合物には、カプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）（ＣＡＰＯＴＥＮ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が含まれる。ジカルボキシレート含有化合物には、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）（ＶＡＳＯＴＥＣ（登録商標），Ｍｅｒｃｋによる）、キナプリル（ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）（ＡＣＣＵＰＲＩＬ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒによる）、リシノプリル（ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）（ＰＲＨＮＩＶＩＬ（登録商標），Ｍｅｒｃｋによる、またはＺｅｓｔｒｉｌ，Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａによる）、ペリンドプリル（ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ）（ＡＣＥＯＮ（登録商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒによる）、およびラミプリル（ｒａｍｉｐｒｉｌ）（ＡＬＴＡＣＥ（登録商標），Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｋｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる）が含まれる。ホスフェート含有化合物には、ペリンドプリル（ＡＣＥＯＮ（登録商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒによる）が含まれる。
【００８０】
[00125] 他のＡＣＥ阻害薬には、ベナゼプリル（ｂｅｎａｚｅｐｒｉｌ）（ＬＯＴＥＮＳＩＮ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓによる）、ホシノプリル（ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）（ＭＯＮＯＰＲＩＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによる）、モエキシプリル（ｍｏｅｘｉｐｒｉｌ）（ＵＮＩＶＡＳＣ（登録商標），Ｓｃｈｗａｒｚ Ｐｈａｒｍａによる）、トランドラプリル（ｔｒａｎｄｏｌａｐｒｉｌ）（ＭＡＶＩＫ（登録商標），Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＢＡＳＦ）による）などが含まれる。ＡＣＥ阻害薬は、スルフヒドリル、ホスフェートおよびジカルボキシレート化合物に分類できる。
【００８１】
[00126] これらの化合物のうち、幾つかのＡＣＥ阻害薬は抗高血圧症薬として一般に用いられている。これらには、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル（ｃｉｌａｚａｐｒｉｌ）、エナラプリル、エナラプリレート（ｅｎａｌａｐｒｉｌａｔ）、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、およびトランドラプリルが含まれる。
【００８２】
[00127] 幾つかのＡＣＥ阻害薬は、血管拡張薬として、またはうっ血性心不全の処置のために、一般に用いられている。これらには、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリル、およびランドラプリルが含まれる。
【００８３】
[00128] リシノプリル、カプトプリル、ラミプリル、およびトランドラプリルは、ある患者において心臓発作後に用いられる。心臓発作の後、心筋の一部が損傷を受け、脆弱化している。その心筋は時間の経過と共に脆弱化し続ける可能性がある。これは心臓が血液を拍出するのをより困難にする。リシノプリルの使用を心臓発作後２４時間以内に開始して、生存率を高めることができる。カプトプリル、ラミプリル、およびランドラプリルは、心臓のそれ以上の脆弱化を遅らせるのを補助する。
【００８４】
[00129] カプトプリルは、糖尿病の管理のためにインスリンを用いているある糖尿病患者において、腎問題の処置にも使用できる。経時的に、これらの腎問題は増悪する可能性がある。カプトプリルは腎問題のそれ以上の増悪を遅らせるのを補助することができる。
【００８５】
[00130] ラミプリルをＡＣＥ阻害薬と一緒に用いて血管疾患および関連障害を処置する；これには冠動脈疾患、うっ血性心不全、高血圧症を伴う患者、および高血圧症を伴う糖尿病患者が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
[00131] 本明細書に挙げていないけれどもアンギオテンシンＩからアンギオテンシンＩＩへの触媒作用の低下または阻害について効果をもつ他の化合物も、本発明に使用するものとして考慮される。
【００８７】
[00132] １態様において、ＡＣＥ阻害薬の量は約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日である。他の態様においては、ＡＣＥ阻害薬を約１ｍｇ／日〜約８０ｍｇ／日の用量で投与する。さらに他の態様においては、ＡＣＥ阻害薬を約５ｍｇ／日〜約５０ｍｇ／日の用量で投与する。ＡＣＥ阻害薬の用量は、一日５、１０または２０ｍｇの出発用量で投与することができる。
【００８８】
[00133] アルファリポ酸
[00134] アルファ−リポ酸はチオクト酸としても知られ、体内での生命エネルギー産生反応における補因子であるジスルフィド化合物である。それは有効な生体内抗酸化剤でもある。アルファ−リポ酸はかって動物およびヒトのビタミンであると考えられていた。しかし、アルファ−リポ酸が条件的に必須であると思われる特定の状況、たとえば糖尿病性多発神経障害がある。アルファ−リポ酸は植物源および動物源に広く見いだされる。
【００８９】
[00135] アルファ−リポ酸が関与する代謝反応の大部分は、ミトコンドリアにおいて起きる。これらには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体によるピルビン酸（ピルベートとして）の酸化、およびアルファ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体によるアルファ−ケトグルタル酸の酸化が含まれる。それは、分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体による分枝鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）の酸化についての補因子でもある。
【００９０】
[00136] アルファ−リポ酸は、ドイツでは多発神経障害、たとえば糖尿病性およびアルコール性多発神経障害、ならびに肝疾患の処置のための薬物として承認されている。アルファ−リポ酸は、キラル中心をもち、２種類の鏡像異性体、天然Ｒ−またはＤ−鏡像異性体およびＳ−またはＬ−鏡像異性体からなる。アルファ−リポ酸の市販製品は、ラセミ混合物、すなわちＲ−およびＳ−鏡像異性体の５０／５０混合物からなる。
【００９１】
[00137] アルファ−リポ酸とその還元型代謝産物ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）は酸化還元対を形成し、広範な反応性酸素種を捕捉することができる。アルファ−リポ酸およびＤＨＬＡは両方とも、ヒドロキシルラジカル、酸化窒素ラジカル、ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素および次亜塩素酸を捕捉することができる。単一酸素をアルファ−リポ酸は捕捉できるがＤＨＬＡは捕捉できず、スーパーオキシドおよびペルオキシ反応性酸素種をＤＨＬＡは捕捉できるがアルファ−リポ酸は捕捉できない。
【００９２】
[00138] 外因性アルファ−リポ酸は、活動心臓モデルにおいて低酸素状態後の再酸素導入に際してＡＴＰ産生および大動脈血流を増大させることが示された。これは、ミトコンドリアにおいてピルビン酸およびアルファ−ケトグルタル酸が酸化される際のアルファ−リポ酸の役割によるものであって、最終的にエネルギー産生が増大すると考えられる。この活性、およびおそらくそれの抗酸化剤活性により、糖尿病性多発神経障害においてアルファ−リポ酸が有益である可能性を説明できる。
【００９３】
[00139] 大部分の薬物動態試験が動物において実施されている。アルファ−リポ酸は小腸から吸収され、門脈循環により肝臓へ、また全身循環により身体の種々の組織へ分配される。天然Ｒ−鏡像異性体はＳ−鏡像異性体より速やかに吸収され、かつより活性な形態である。アルファ−リポ酸は血液−脳関門を容易に通過する。種々の身体組織へ分配された後、それは細胞内、ミトコンドリア内および細胞外に見いだされる。
【００９４】
[00140] ジヒドロリポ酸
[00141] アルファ−リポ酸はミトコンドリアのリポアミドデヒドロゲナーゼにより代謝されて、それの還元形、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）になる。ＤＨＬＡは、リポ酸と一緒に酸化還元対を形成する。それも代謝されてリポアミドになり、これはピルビン酸およびアルファ−ケトグルタル酸の酸化的脱カルボキシルを触媒する多酵素複合体においてリポ酸補因子として機能する。アルファ−リポ酸は代謝されてジチオールオクタン酸になる場合があり、これが異化作用を受ける可能性がある。
【００９５】
[00142] 現在、一日６００ミリグラムまでの用量のアルファ−リポ酸が十分に耐容されている。糖尿病性神経障害など、ある状態では、一日３００ミリグラムのアルファ−リポ酸を分割量で投与する。
【００９６】
[00143] ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）をアルファ−リポ酸の代わりに前記のＡＣＥ阻害薬と共に使用することもできる。
【００９７】
[00144] 本発明の１態様において、リポ酸またはリポ酸誘導体の投与量は約１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日である。他の態様においては、リポ酸またはリポ酸誘導体を約１０ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日の用量で投与する。さらに他の態様においては、リポ酸またはリポ酸誘導体を約１００ｍｇ／日〜約４００ｍｇ／日の用量で投与する。リポ酸またはリポ酸誘導体の用量は、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇまたは６００ｍｇの出発一日量で投与される。
【００９８】
[00145] スタチン類
[00146] 本発明組成物またはその組合わせと組み合わせることができる他の療法にはスタチン類が含まれる。
【００９９】
[00147] スタチン類（またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬）は、心血管疾患またはそのリスクを伴う者のコレステロールレベルを低下させる医薬として用いられる脂質低下薬のクラスを形成する。それらは酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、すなわちコレステロール合成速度に関係する酵素を阻害することによりコレステロールを低下させる。肝臓においてこの酵素が阻害されるとＬＤＬ−受容体が刺激され、その結果、血流からのＬＤＬのクリアランスが増大し、血中コレステロールレベルが低下する。この初期結果は使用の１週間後に見ることができ、４〜６週間後に効果は最大になる。
【０１００】
[00148] スタチン類には、アトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）、ＴＯＲＶＡＳＴ（登録商標））；フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標））、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標））、メバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（Ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＶＡＬＯ（登録商標）、ＰＩＴＡＶＡ（登録商標））、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）、ＳＥＬＥＫＴＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＴＡＴ（登録商標））、ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標））、およびシンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（ＺＯＣＯＲ（登録商標）、ＬＩＰＥＸ（登録商標））が含まれる。
【０１０１】
[00149] １態様において、スタチンの量は約１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日である。他の態様においては、スタチンを約１０ｍｇ／日〜約８０ｍｇ／日の用量で投与する。さらに他の態様においては、スタチンを約２０ｍｇ／日〜約６０ｍｇ／日の用量で投与する。
【０１０２】
[00150] 他の有用な療法薬
[00151] 本発明の医薬組成物をこの節に示す１種類以上の療法用物質と一緒に投与することもできる。抗炎症薬、たとえばアスピリンを投与できる。脂肪酸取込み阻害薬エゼチミベ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）（Ｚｅｔｉａ（登録商標），ＭＳＰ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ，ニュージャージー州ホワイトハウスステーション）も本発明組成物中に使用できる。エゼチミベをスタチン類と組み合わせて配合剤、たとえばＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標）（ＭＳＰ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ，ニュージャージー州ホワイトハウス・ステーション）を調製することもできる。血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、または血液凝固傾向を低下させる薬物、たとえばヘパリンを投与することもできる。心血管系に対する直接作用または間接作用をもつ薬剤がこのカテゴリーに含まれ、これにはナイアシン、フィブレート類、たとえばフェノフィブレート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、ゲムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）およびチアゾリジンジオン類が含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１０３】
[00152] 以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものである；ただし、同時に本発明の何らかの限定となることはない。むしろ、本明細書の記載を読んだ後に当業者に自明となる、本発明の精神から逸脱しない多様な態様、改変および均等物が本発明に含まれることを明確に理解すべきである。
【０１０４】
[00153] 実施例１
[00154] ３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテートおよび３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノールの合成
[00155] ３，４ メチレンジオキシフェノール（セサモール（Ｓｅｓａｍｏｌ）とも呼ばれる）［＃１］からの３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（Ｏ−アセチルメチレンジオキシフェノールとも呼ばれる）［＃２］の合成
[00156] 工程Ｉにおいて、中間化合物（３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート；本明細書中でＯ−アセチルメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７３とも呼ばれる）を、３，４ メチレンジオキシフェノール［＃１］のアセチル化により製造する。
【０１０５】
[00157] この実施例では、無水酢酸を用いてアセチル化を行なった。このアセチル化生成物は、他の多数の誘導体組成物、たとえばニトロ、アミノおよびカルボキシル誘導体の出発点として用いられる。理論により拘束されたくはないが、このアセチル官能基がアスピリン（アセチルサリチル酸）中のアセチル基と類似の能力で作用することができ、血小板の凝集を阻害する作用をもつことができると本発明者らは考える。
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
[00159] 工程ＩＩにおいて、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート［＃２，ＩＮＶ−７３］からの３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（本明細書中でＯ−アセチルニトロメチレンジオキシフェノールまたはＩＮＶ−７５とも呼ばれる）の合成が下記により達成される。
【０１０８】
【化２０】
【０１０９】
[00161] 工程ＩＩＩにおいて、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート［＃３，ＩＮＶ−７５］からの３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（本明細書中でニトロメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７４とも呼ばれる）［＃４］の合成が下記により達成される。
【０１１０】
【化２１】
【０１１１】
[00164] 実施例２
[00165] ３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（本明細書中でＯ−アセチルニトロメチレンジオキシフェノールまたはＩＮＶ−７５とも呼ばれる）の生物学的検定：インビトロ試験
[00166] 細胞培養：すべての実験を培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−−Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について実施し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、予め１％ゼラチンでコートした組織培養フラスコにより、補充した培養培地（Ｍ１９９；１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２ｍＭのグルタミン，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，ヘパリン１２Ｉ．Ｕ．／ｍｌ，１％のレチナール誘導型増殖因子を含む，Ｓｉｇｍａ）中において、集密状態にまで増殖させた。トリプシン処理後、細胞をフラスコから剥離し、予めゼラチンコートした培養プレートにＨＵＶＥＣを接種し、次いで２４〜４８時間インキュベートして確実に集密状態にすることにより、最終単層を調製した。第４継代までの細胞をすべての実験に用いた。組換えヒトＴＮＦ−αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。
【０１１２】
[00167] 細胞毒性アッセイ：細胞毒性を、細胞生存性の評価のための市販アッセイであるＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイにより評価した。ＩＮＶ−７５をＨＵＶＥＣに２４時間添加し、この期間が終了した時点で毒性アッセイを実施した。ＭＴＴアッセイは、細胞がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによって、正に荷電したテトラゾリウム塩類をそれらの濃色ホルマザン生成物に還元することによる。ホルマザンの生成は、ミトコンドリアの酸化還元機能が損傷した状態およびフリーラジカル生成が増大した状態では低下するので、実験介入に対する細胞生存応答の指標として採用できる。
【０１１３】
[00168] 要約すると、マイクロタイタープレートをインキュベーターから取り出した後、一定体積の再構成ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；最終濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ］を含有する新鮮な培地をウェルに添加し；プレートを３７℃の５％ＣＯ２環境に２時間保持し、次いで製造業者が提供するＭＴＴ可溶化溶液を添加した。正に荷電したテトラゾリウム塩類が還元状態に変換されることにより形成されるホルマザン生成物は、水溶性が低く、紫色結晶として存在する。ホルマザンを可溶化緩衝液（キット中に備えられている）で溶解すると、それの形成を簡便に定量することができる。次いでＯＤ ５７０ｎｍにおける光学濃度を各ウェルについて吸光プレートリーダーで測定する。アッセイ内およびアッセイ間変動性は、それぞれ３および５％であった。種々の濃度のＩＮＶ−７５を、前記のＭＴＴアッセイによる細胞ベースのアッセイで試験した。試験した濃度は１ｍＭから１０ｎＭの範囲であり、細胞を２４時間の期間にわたって曝露した（図２）。
【０１１４】
[00169] これらの結果は、１００ｍＭまでの濃度では、１ｍＭにおける７４％（他のすべての用量と比較して、１ｍＭにつきｐ＝０．００１）と比較して１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭで２％、４％、８％および７％の細胞が毒性を示すことを立証した。これらの結果は、他の化合物ＩＮＶ−７３、ＩＮＶ−７４およびＩＮＶ−７０６５について得られたものと同じであった。これらの結果により、ＩＮＶ−７３、ＩＮＶ−７４、ＩＮＶ−７０６５の安全性が１０ｎＭ〜１００μＭの用量範囲にわたって確認された。
【０１１５】
[00170] 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）：細胞表面接着分子の発現を測定するために、ＥＬＩＳＡ技術を用いた（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）。９６ウェルプレート内の集密ヒト臍帯ＨＵＶＥＣを種々の濃度のＩＮＶ−７５（１ｍＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭおよび１ｎＭ）で２４時間、前処理した後、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激した。
【０１１６】
[00171] 図３に示すＩＮＶ−７５前処理を用いた１実験後の培養培地のＥＬＩＳＡ分析の結果は、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の放出の顕著な低下を示した（統計値は示していない）。その後の実験で、同様にＩＮＶ−７５がＶＣＡＭ−１発現に及ぼす作用をウェスタンブロット法により試験した。これらの結果はＩＮＶ−７５の前処理によるＶＣＡＭ−１タンパク質レベルの低下を示したが、対照（ビヒクル）のみによる処理では示されなかった（セクションおよび図２４を参照）。
【０１１７】
[00172] ＮＦ−κＢトランスロケーションアッセイ：サイトカイン、たとえばＴＮＦ−αおよびインターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）は、内皮細胞における炎症促進応答を活性化する。この応答の初期事象は、ＮＦ−κＢ転写因子の核トランスロケーションである。このトランスロケーションにより、炎症促進遺伝子、たとえば接着分子ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの転写が誘導される。
【０１１８】
[00173] ＮＦ−κＢは、ｐ６５およびｐ５０サブユニットからなるヘテロ二量体である。核トランスロケーションを、固定細胞におけるＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの免疫局在化によりモニターし、核と細胞質のＮＦ−κＢ信号比を測定することにより定量する。したがって、刺激された細胞、たとえば初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＮＦ−κＢの核トランスロケーションは、生物活性化合物が炎症促進刺激に対する内皮の応答性に及ぼす作用を調べるために利用できる読出しを提供する。ＨＵＶＥＣを種々の濃度（１０ｎＭ〜１μＭ）のＩＮＶ−７５または対照（ＩＮＶ−７５を含まない）で２４時間、前処理した。次いで培地を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたは１μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ビヒクル）を含有する培地に交換して６時間おいた。ｐ６５の分布を、関心領域の細胞質および核における強度として計算した。高力価領域につき少なくとも５個の細胞を用い、使用薬物の濃度につき少なくとも５つの高力価領域を用いた。次いで、高力価領域につき少なくとも５個の細胞の核−対−細胞質の染色比として強度を表わした。次いでこのデータを、ＴＮＦ−αを含まない核−対−細胞質の比として表わした。
【０１１９】
[00174] ＮＦ−κＢ活性化を評価する別の実験において、種々の濃度のＩＮＶ−７５で予め６〜２４時間処理した後、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激したＨＵＶＥＣ細胞から、抽出試薬を用いて核および細胞質画分を抽出した。ＴＮＦ−α刺激による６時間の刺激の後、ウェスタンブロット分析によりＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を評価した。次いで、核および細胞質抽出物中のｐ６５レベルを前記に従ってウェスタンブロット法により分析した。ＩＮＶ−７５がＮＦ−κＢトランスロケーションアッセイに及ぼす作用は、ＩＮＶ−７５が１０ｎＭの濃度から核へのｐ６５のトランスロケーションを阻害し始めることを示した。
【０１２０】
[00175] ＩＮＶ−７５を用いた多数の実験のまとめを図４に示す。核−対−細胞質比を、ビヒクルのみで処理した対照細胞と、ＴＮＦ−αに応答したもの、およびＴＮＦ−αに応答したものであるが薬物と共に２４時間インキュベートした後のものとの間で比較した。ＩＮＶ−７５で前処理すると、核ｐ６５発現に顕著な阻害が生じた（ｎ＝３，ｐ＜０．０１，一元ＡＮＯＶＡによる）。
【０１２１】
[00176] ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−２）試験および結果：
[00177] ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と表記される転写因子ファミリーは、コレステロールおよび脂肪酸の合成を調節する。これらのうち、ＳＲＥＢＰ−２は、コレステロール合成酵素およびＬＤＬ受容体発現を変化させることにより、主にコレステロールの生合成を調節する（ＳＲＥＢＰ−１ｃは主に脂肪酸合成を調節する）。ＳＲＥＢＰ−２は、主として転写後機序により調節され、小胞体から転送された後、ゴルジ装置においてプロセシングされて成熟形になる。ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰに及ぼす作用を調べるために、下記のインビトロ実験を実施した：ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞系）細胞をＩＮＶ−７５（０．１ｍＭ）で４時間刺激し、対応するＳＲＥＢＰ２の核結合を電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によりアッセイした。この用量によるタイムコース、および用量依存性を分析した。次いで、細胞質における前駆体および成熟形両方のＳＲＥＢＰ−２の発現をウェスタンブロットにより評価した。成熟形ＳＲＥＢＰ−２のタイムコースおよび用量依存性の両方を分析した。
【０１２２】
[00178] 図５Ａおよび５Ｂは、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ−２の核結合に及ぼす作用を示す。ＩＮＶ−７５は、ＳＲＥＢＰ−２の核結合を処理後＜１時間で増大させた（図５Ａ）。１００ｎＭという低い用量が、核へのＳＲＥＢＰ−２のトランスロケーションを誘導するのに有効であった。図５Ｂは、これら２実験のまとめを提示する。
【０１２３】
[00179] 図５Ｃおよび図５Ｄは、細胞質におけるＳＲＥＢＰ−２のプロセシングに対するＩＮＶ−７５のタイムコースを提示する。これらのデータは、ＩＮＶ−７５が前駆体（未熟形）から成熟形へのＳＲＥＢＰ−２のプロセシングを用量依存性様式で速やかに増大させ、１０ｎＭという低い用量が成熟形ＳＲＥＢＰ−２を増加させる作用をもつことを示唆する。
【０１２４】
[00180] 次いで、同細胞において同様なプロトコルを用いてＬＤＬ受容体発現の調節におけるＩＮＶ−７５の作用を調べて、用量依存性および時間依存性を評価した。図５Ｅおよび５Ｆは、ＩＮＶ−７５に応答したＬＤＬ受容体発現のタイムコースおよび用量依存性を示す。これらの結果は、ＩＮＶ−７５がＬＤＬ受容体発現を時間依存性および用量依存性様式で増大させることを明瞭に示す。これらの結果を合わせると、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ−２依存経路でＬＤＬ受容体発現を増大させることができると示唆される。ＩＮＶ−７５はＳＲＥＢＰ−Ｉ調節に対しては作用をもたない（データを示してはいない）。同時に、コレステロールの合成および調節に関係する多数の遺伝子、アポリポタンパク質遺伝子の発現、ならびにＰＣＳＫ９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９、プロタンパク質変換酵素ズブチリシン／ケキシン９型）の発現を調べた。後者の遺伝子は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子様反復配列Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合してＬＤＬＲ分解を誘導することによりＬＤＬ受容体発現を調節することが知られている。ＰＳＣＫ９機能の阻害は、コレステロールレベルを低下させる手段として現在探求されている。これらの結果により、ＰＣＳＫ９発現に対してＩＮＶ−７５の作用はないことが明らかになった。
【０１２５】
[00181] ＰＰＡＲ活性化アッセイおよび結果
[00182] ＨｅｐＧ２細胞においてレポーター遺伝子アッセイを用いて、ペルオキシソーム増殖応答性受容体のアゴニストをスクリーニングした。ペルオキシソーム増殖応答性受容体（ＰＰＡＲ）および核ホルモン受容体ファミリーの他のメンバーは、代謝疾患の処置のための重要な薬物標的である。ＰＰＡＲ類は、脂質およびグルコースの代謝においてそれぞれ重要な役割を果たす。したがって、これらの受容体の活性化薬を迅速に同定するのに役立つスクリーニング方法はきわめて有用なはずである。ＩＮＶ−７５は古典的なＰＰＡＲα遺伝子、アセチル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）を用量依存性および時間依存性様式で活性化する（図６Ａ）。ＩＮＶ−７５の存在下で最高１５時間、タイムコース実験を実施した。次いで、細胞にヒト全長ＰＰＡＲαプロモーター−レポーター構築体をトランスフェクションし、ＩＮＶ−７５がルシフェラーゼ活性化を増強することを立証した（図６Ｂ）。次の実験で、ＰＰＡＲα活性化のタイムコースを調べ、＜１時間の時間での活性化、および最高１５時間の持続的なＰＰＡＲα活性化作用を立証した（図６Ｃ）。次いで、酵母ＧＡＬ４−ＰＰＡＲα−ＬＢＤプラスミド＋ＵＡＳ−ルシフェラーゼ；ＧＡＬ４−ＰＰＡＲδ−ＬＢＤプラスミド＋ＵＡＳ−ルシフェラーゼ、およびＧＡＬ４−ＰＰＡＲα−ＬＢＤプラスミド＋ＵＡＳ−ルシフェラーゼをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２において実験を実施することにより、ＰＰＡＲαに対するＩＮＶ−７５の特異性を調べた。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγ結合アッセイを、多数の濃度のＩＮＶ−７５（１μＭ、１０μＭ、１００μＭおよび１０００μＭ）を用いて実施した。ルシフェラーゼ活性のレベルは、ＰＰＡＲ活性化度に対応していた。結果を、古典的なＰＰＡＲアゴニスト、たとえばＷＹ−１４６４３（ＰＰＡＲαアゴニスト）、ベンザフィブレート（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ）（ＰＰＡＲδアゴニスト）およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（ＰＰＡＲαアゴニスト）と比較した。これらの結果は、ＩＮＶ−７５がＰＰＡＲαのリガンド結合活性を選択的様式で増大させ、ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγに対しては作用しないことを示した。したがって、ＩＮＶ−７５はＰＰＡＲα活性化に対して選択的ではあるが部分的なアゴニスト特性をもつ。
【０１２６】
[00183] 実施例３
[00184] ３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（本明細書中でＯ−アセチルニトロメチレンジオキシフェノールまたはＩＮＶ−７５とも呼ばれる）の生物学的検定：インビボ試験
[00185] 高コレステロール血症のウサギ（ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｒａｂｂｉｔｓ），ＷＨＨＬ）におけるインビボ実験を、６匹のウサギにおいてＩＮＶ−７５を用いて実施した。４匹のウサギを対照として用いた。
【０１２７】
[00186] 動物モデル：体重約２ｋｇの２か月齢ＷＨＨＬウサギをＢｒｏｗｎ Ｆａｍｉｌｙ（アラバマ州）から購入し、ｔｈｅ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒに収容した。６か月齢のウサギをすべての実験に用いた。ウサギに水を自由に摂取させ、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋａｄ ＴＤ７２５１からの高コレステロール固形飼料（２％のコレステロール）を与えた。動物の飼育および実験プロトコルは国が承認した指針に従った。ウサギに施したプロトコルを図７に概説する。ＩＮＶ−７５を９０％エタノールに溶解し、高脂肪固形飼料に噴霧した。この食餌−薬物混合物を次いで一夜真空乾燥してエタノールを除去し、次いでウサギに与えるために用いた。
【０１２８】
[00187] インビボプロトコル（ウサギ）：
[00188] 各動物に３回のＭＲＩ検査を行なった：１回目は高脂肪を与える前（薬物投与前のベースライン）；２回目は薬物療法の中間点；３回目は１２週間の薬物療法後の最終検査（図７）。ＷＨＨＬウサギを到着後、新しい環境に慣れさせ、続いてベースラインＭＲＩ測定値および血液検査値を求めた後、高コレステロール固形飼料を与えた。高脂肪給餌後４〜６週目に、ＩＮＶ−７５による薬物療法を開始した。中間点測定値は薬物療法の途中で求めた。試験が終了した時点で、すべての動物につきプラーク体積定量のためにＭＲＩ検査を行なった。最終ＭＲＩの直後、ウサギを安楽死させ、大動脈を採取し、以後の分析用に処理した（組織病理、遺伝子およびタンパク質発現）。この試験プロトコルはｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。介入（ＭＲＩ試験）のための麻酔を、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（３０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（２．２ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により誘導した。腹腔動脈上方の腹部大動脈を約５ｃｍ、無菌器具で切除し、高圧蒸気滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、直ちに液体窒素中で凍結し、遺伝子およびタンパク質発現のために処理するまで−８０℃で保存した。すべての動物が“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ”に準拠した思いやりのある世話を受けた。
【０１２９】
[00189] 非侵襲ＭＲＩプロトコルおよび結果
[00190] 高分解能非侵襲ＭＲＩを用いて、対応する処理の前と後にアテローム硬化症の程度を評価した。ＷＨＨＬウサギの腹部大動脈のアテローム硬化性プラークを、指示した時点でインビボＭＲＩスキャンにより分析した（図７）。この実験計画により、各動物をそれ自身の対照として使用でき、プラークの進行／退縮に関して真の連続データを得ることができ、かつ処理グループ間の比較が可能になる。ＭＲＩ試験は、１．５−Ｔの磁石（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｓｏｎａｔａ，Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ドイツ、エルランゲン）を用い、動物に巻きつけた位相配列心臓コイルを用いて実施された。勾配エコー冠状面および矢状面イメージを用いて腹部大動脈の位置を判定し、ＴＵＲＢＯ Ｆｌａｓｈシーケンスを用いて腹腔動脈上方から腸骨分岐部までの腹部大動脈の連続横断イメージ（ギャップなしの３−ｍｍ厚さのセグメント）を得た。ほぼ腸骨分岐部から腎最上極までにわたる４８の４ｍｍ厚さの軸スライスを、Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ ｔｕｒｂｏ ＦＬＡＳＨプロトコルにより得た（ＴＲ／ＴＥ ２３０／５．０、３平均、スライス厚さ４．０ｍｍ、スライス間ギャップ５．２ｍｍ、および取得時間約１１分）。腹部大動脈は運動アーチファクトが比較的少ないので、呼吸または心臓ゲーティングは必要なかった。外弾性膜（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅｌａｓｔｉｃ ｌａｍｉｎａ（ＥＥＭ））および管腔縁（ｌｕｍｉｎａｌ ｂｏｒｄｅｒ（Ｌ））を手動でトレースし、それぞれの境界内の面積をＳｉｅｍｅｎｓ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアにより測定することによって、プラーク負荷を測定した。スライス体積（Ｖ）をＶ＝（ＥＥＭ−Ｌ）＊４．０として計算し、動物当たりの全壁体積（ｔｏｔａｌ ｗａｌｌ ｖｏｌｕｍｅ）を方程式ＴＷＶ＝Σ［（ＥＥＭ−Ｌ）＊４］により計算し、ｍｍ３で表わした。各時点の各動物についてのＴＷＶを多様な数の可読スライスについて方程式ＮＷＶ＝（ＴＷＶ／ｎ）＊ｍにより正規化した；ｎ＝各動物における可読スライス数、およびｍ＝全時点にわたる全動物における可読スライス数の平均。すべての正規化した壁体積をｍｍ３で報告した。アテローム硬化プラークの指標であるウサギ腹部大動脈の壁体積を連続インビボＭＲＩスキャンにより分析した。高コレステロール固形飼料を４〜６週間与えた後、ＷＨＨＬウサギは同齢の普通固形飼料を与えたニュージーランドウサギより大きな腹部大動脈壁をもち、これはアテローム硬化症が樹立したことを支持する。
【０１３０】
[00191] 図８Ａは、ＩＮＶ−７５による処理がプラークの進行に及ぼす作用をＭＲＩにより評価したものを示す。ＭＲＩ測定を、ベースライン（ＨＦＣ開始後であって、ただしＩＮＶ−７５開始前）、薬物処理中の中間点、および屠殺直前に実施した。ＭＲＩ試験を、分析のためにＰＣへ移し、プラーク体積をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアにより分析した。アテローム硬化症変化に関する真の連続データを得ることができるように、腎動脈および腸骨分岐部からの距離を用いてイメージを解剖学的位置に一致させた。腹腔動脈に対してすぐ末端側にある大動脈を血管壁測定のために選択した。すべてのＭＲＩイメージを試験アームまたは組織病理データに対してブラインドで取得および分析した。ベースラインの対照グループおよびＩＮＶ−７５グループ（すなわちＩＮＶ−７５補充前）の平均（ＳＥＭ）正規化壁体積（ＮＷＶ）は、それぞれ０．２７ｃｍ３（０．０２１ｃｍ３）および０．２４ｃｍ３（０．００９９ｃｍ３）であった。これらには有意差がなかった（ｐ＝０．２７７５、一元ＡＮＯＶＡによる）。
【０１３１】
[00192] ＩＮＶ−７５を６週間、食事に補充した後、腹部大動脈の壁体積は対照アームと比較して有意に減少した。ＩＮＶ−７５処理後、試験の中間点で、対照グループおよびＩＮＶ−７５グループの平均（ＳＥＭ）プラーク体積（ＮＷＶ）は、それぞれ０．６０ｃｍ３（０．０３７ｃｍ３）および０．３５ｃｍ３（０．０１９ｃｍ３）であった。これらには有意差があった（ｐ＝０．０００４、一元ＡＮＯＶＡによる）。１２週後、ＩＮＶ−７５処理を受けたグループではより顕著なプラーク進行速度低下がみられ、対照グループおよびＩＮＶ−７５グループの壁体積（ＳＥＭ）は、１２週目にそれぞれ０．６６ｃｍ３（０．０２９ｃｍ３）および０．３７ｃｍ３（０．０２５ｃｍ３）であった。これらには有意差があった（ｐ＝０．０００１、一元ＡＮＯＶＡによる）。より早い６週目の時点も、対照処理と比較して統計的に有意であった。図８Ｂは、対照またはＩＮＶ−７５を施した腹部大動脈プラークの種々の時点の代表的なＭＲＩイメージを示す。
【０１３２】
[00193] ＩＮＶ−７５の抗アテローム硬化症作用を評価するための形態分析
[00194] 下行胸部大動脈のセグメントをＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ，カリフォルニア州トランス）に埋包し、ドライアイスで凍結させた。次いで正面切片を調製した。アテローム硬化症負荷を分析するために、８つの切片（４μｍの厚さ）を２０μｍ間隔で採取した。Ｈ＆Ｅ染色後、顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｓｐｏｔ Ｉディジタルカメラ付き、ドイツ、イエナ）を米国国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）Ｉｍａｇｅソフトウェア、バージョン１．６１と共に用いて、各切片をディジタルカメラでディジタル化し、分析した。結果をｍｍ２で表わした。１２週目の終了時における胸部大動脈のプラーク負荷の形態計測評価は、腹部大動脈についてのＭＲＩによるＩＮＶ−７５の抗アテローム硬化症作用を裏付けた。対照グループおよびＩＮＶ−７５グループのＷＨＨＬウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化症負荷のまとめを提示する。ｎ＝５／グループ。＊，対照動物と対比してｐ＜０．０５、ｎ＝４、非対合ｔ検定を採用。ＷＨＨＬウサギにおいて対照グループと比較して約６０％のアテローム硬化症負荷低下がみられた（図９）。
【０１３３】
[00195] 免疫組織化学的方法および結果：
[00196] 炎症性含有物を評価するために、一次抗体（１：２００の濃度）および検出システム（イムノペルオキシダーゼ二次検出システム（Ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ））；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州テメキュラ）を用いて免疫組織化学的染色を実施し、イメージをカメラシステム（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｓｐｏｔ Ｉディジタルカメラ付き）でディジタル化した後、ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）で定量した。ＣＤ６８に対する抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入した。ポリクローナル抗−α−アクチン抗体をＵｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ニューヨーク州レイクプラシッド）から購入した。Ｔ細胞受容体β抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。染色を定量するために、４つの陰性対照（一次抗体を含まない）切片の平均濃度を閾値と設定し、陽性面積をソフトウェアにより取得した。最終的に、膜境界までの外弾性膜で囲まれる面積または内膜−内側体積により結果を正規化した。対照グループと比較してＩＮＶ−７５がマクロファージおよび平滑筋細胞に及ぼす作用を、それぞれＣＤ６８およびα−アクチン免疫組織化学的分析により評価した。ＩＮＶ−７５は対照と対比してマクロファージ数を減少させ、全グループのまとめを図１０の棒グラフにより表わす（ｎ＝４〜５匹の動物／グループ）。＊ｐ＜０．０５、対照動物と対比、非対合ｔ検定を採用）。ＩＮＶ−７５処理グループは、図１０に示すように有意のマクロファージ浸潤阻害を示した。ＩＮＶ−７５は対照と対比して平滑筋含量（全面積に対する％）を増大させ、合わせた結果を棒グラフとして表わした；ｎ＝５／グループ（ｎ＝グループ当たり使用した動物数）。＊ｐ＜０．０５、対照動物と対比。
【０１３４】
[00197] ｐ＜０．０５は、３以上のマッチした数値がガウス分布であり、数値が統計的限界内にあることを表わす。胸部大動脈切片の免疫組織化学的分析は、アテローム硬化プラーク中のＣＤ６８＋細胞は減少したけれども平滑筋の増殖は増大したことを明らかにした（図１０および図１１）。
【０１３５】
[00198] 薬物で合計１４週間処理し、ウサギを屠殺し、腹部大動脈を４％パラホルムアルデヒド中で固定した後、大動脈における脂質沈着を確認した。その際、大動脈壁の脂質沈着をオイルレッド染色により視覚化した。腹部大動脈のオイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色は、対照グループと比較したＩＮＶ−７５処理動物の腹部大動脈切片の閾値面積パーセントとして計算したプラーク領域の脂質含量の低下を示した。ＩＮＶ−７５は、対照と対比して脂質成分を有意に低下させた（図１２）。腹部大動脈のＭａｓｓｏｎトリクロム染色は、対照グループと比較したＩＮＶ−７５処理動物の腹部大動脈切片の閾値面積パーセントとして計算したプラーク領域のコラーゲン含量の低下を示した（図１３）。
【０１３６】
[00199] 脂質プロフィール：ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ
[00200] 高コレステロール血症および酸化的ストレスは、アテローム硬化症の進行に際して重要な機能を占める。血中の脂質（コレステロールおよびＬＤＬ）を、ベースラインと終末点測定の両方において血液試料の分析により評価した。高コレステロール食の開始時と再び屠殺時点で、耳朶静脈からの１ｍｌの血液をＫ ＥＤＴＡ試験管に入れた。すべての数値を平均±ＳＤとして表わした。高脂肪固形飼料開始前のベースライン、高脂肪固形飼料開始後であってただし介入前、ならびにＩＮＶ−７５および対照による介入の終了時の総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールについて、各グループの棒グラフを提示する（図１４ Ａおよび図１４Ｂ）。ＩＮＶ−７５処理の終了時に、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールに差がなかった。作用がなかったのは、極度に高い脂質値およびＬＤＬ受容体の変異をもつ遺伝的モデル（ＷＨＨＬ）に関係する可能性がある。ＩＮＶ−７５はＬＤＬ受容体発現の増大によりＬＤＬクリアランスを増大させることによって機能すると考えられるので、ＬＤＬコレステロールおよび総コレステロール（このモデルにおいてベースラインおよび高脂肪固形飼料の給餌に対する応答における主要なリポタンパク質画分）に対する作用がないのは、理解できる。
【０１３７】
[00201] 内皮機能：血管の生理的作用を調べるための臓器チャンバー実験
[00202] ウサギを致死量のペントバルビタール注射により安楽死させた。上行大動脈を摘出し、２ｍｍの胸部大動脈リングを、生理食塩水緩衝液（塩化ナトリウム，１３０ｍＥｑ／Ｌ；塩化カリウム，４．７ｍＥｑ／Ｌ；二塩化カルシウム，１．６ｍＥｑ／Ｌ；硫酸マグネシウム，１．１７ｍＥｑ／Ｌ；二リン酸カリウム，１．１８ｍＥｑ／Ｌ；炭酸水素ナトリウム，１４．９ｍＥｑ／Ｌ；ＥＤＴＡ，０．０２６ｍＥｑ／Ｌ；およびグルコース，９９．１ｍｇ／ｄＬ［５．５ｍｍｏｌ／Ｌ］；ｐＨ，７．４）を充填した個別の臓器チャンバー内に吊るし、酸素中５％二酸化炭素を３７℃で連続通気した。血管を少なくとも１時間、３０ｍＮの静止張力で平衡化させた後、前記のように段階的用量のアゴニストで処理した。血管収縮アゴニストには、フェニレフリン（ＰＥ）、エンドセリン−１（ＥＴ−Ｉ）、またはアンギオテンシンＩＩが含まれていた。応答を１２０ｍＥｑ／Ｌの塩化カリウムへのピーク応答に対するパーセントとして表わした。ＰＥで処理した血管を十分に洗浄し、１時間平衡化させた後、アセチルコリン、ニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）またはインスリンによる実験を開始した。ＰＥ（０．１μＭ）で安定収縮プラトーに達した後、リングを段階的用量の内皮依存性アゴニストであるアセチルコリン、インスリン、または内皮非依存性アゴニストであるＳＮＰに曝露した。結果をＰＥ（０．１μＭ）による前収縮に対するパーセントとして表わした。アセチルコリンに曝露したリングを十分に洗浄し、１時間平衡化させた。ＰＥ（０．１μＭ）で安定収縮プラトーに達した後、次いでインスリンを累積式で添加し、続いて洗浄し、ＳＮＰに対する用量応答を調べた。結果をＰＥ（０．１μＭ）による前収縮に対するパーセントとして表わした。ＩＮＶ−７５は、アンギオテンシンＩＩによる大動脈収縮を低下させたが、フェニレフリンに対しては作用しなかった（図１５および図１６）。
【０１３８】
[00203] ＩＮＶ−７５は、アンギオテンシンＩＩに対する応答に有意に作用したのと対照的に、ＰＥ、エンドセリン−１に対する応答には作用しなかった。ＩＮＶ ７５はアセチルコリン依存性血管弛緩には有意の作用をもち、インスリンに対しては境界領域（有意ではない）の作用をもっていた（図１７および図１８）。ＩＮＶ−７５はＳＮＰ、すなわち内皮非依存性血管収縮物質に対しては作用をもたなかった（結果は示していない）。ＩＮＶ−７５ウサギにおけるアンギオテンシンＩＩに対する応答の低下は、アンギオテンシンＩＩ １型受容体のｍＲＮＡ発現低下と平行していた（データは示していない）。表１は、ＷＨＨＬウサギの胸部大動脈における種々のアゴニストに対する応答のまとめを示す。
【０１３９】
【表１】
【０１４０】
[00204] 酸化的ストレス計測：８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α（８−イソプロスタン）酵素結合イムノアッセイ
[00205] 血漿および肝臓試料をＷＨＨＬウサギから屠殺時に得た。肝臓溶解物をＰＢＳ中でのホモジナイゼーションにより調製した。両試料をアフィニティー精製し（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンハーバー）、次いで８−イソプロスタンをＳｔａｔ−８−イソプロスタンＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンハーバー）で測定した。肝臓中のレベルをタンパク質に対して調整した。肝臓溶解物中のタンパク質レベルをＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ， イリノイ州ロックフォード）により測定した。
【０１４１】
[00206] 血漿および大動脈ホモジェネート中の８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α （８−イソプロスタン）産生は、対照グループと比較してＩＮＶ−７５グループでは有意に低かった（図１９，図２０）。
【０１４２】
[00207] ジヒドロエチジウム染色によるスーパーオキシド（Ｏ２●−）の検出
[00208] スーパーオキシド（Ｏ２●−）のインサイチュー検出は、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標），Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ，カリフォルニア州トランス）に埋包した大動脈組織を瞬間凍結したものにおいて実施された。組織試料を２０μｍの厚さに凍結薄切し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルベニア州ピッツバーグ）上に採集し、必要になるまで−８０℃に保存した。各ラット（組織塊）からランダムに選択した４つのスライドをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）上に室温で３０分間乗せ、次いでＰＢＳ中のジヒドロエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ）（ＤＨＥ，１０μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，オレゴン州ユージーン）により湿潤チャンバー内で暗所において２０分間染色した。スライドをＰＢＳで徹底的にすすぎ、カバーガラスを乗せ、顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｓｐｏｔ Ｉディジタルカメラ付き、ドイツ、イエナ）でディジタルイメージにした。ＤＨＥは細胞に自由に透過でき、Ｏ２●−の存在下で２電子酸化を受けてＤＮＡ結合性蛍光体である臭化エチジウムを形成することができ、これがＤＮＡ内へのインターカレーションにより細胞内にトラップされる。この反応はＯ２●−に相対的に特異性であり、細胞性ペルオキシダーゼおよび過酸化水素により誘発される酸化は最小限であった。阻害薬試験のためにスライドを３００μＭのアポサイニン（ａｐｏｃｙｎｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１０μＭのジフェニルヨージニウム（ＤＰＩ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＰＥＧ−ＳＯＤ（２５０Ｕ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした後、ＤＨＥで染色した。棒グラフで表わした全グループの結果のまとめ、＊ｐ＜０．０１、は、３以上のマッチした数値がガウス分布であり、数値が統計的限界内にあることを表わす。
【０１４３】
[00209] これらの結果は、大動脈における基礎スーパーオキシド産生がＩＮＶ−７５処理グループで低下したことを明らかにした（図２１）。
【０１４４】
[00210] ＮＡＤＰＨ誘導スーパーオキシド（Ｏ２●−）の検出のためのルシゲニン化学発光：ＩＮＶ−７５の作用
[00211] アテローム硬化症における酸化的ストレスの関与が示唆されている。ＮＡＤＰＨから誘導されるスーパーオキシド（Ｏ２●−）はフリーラジカル連鎖反応を誘発する可能性があり、これがアテローム硬化プラーク形成を触媒する可能性をもつ。ウサギ大動脈をＰＢＳ中でホモジナイズし、タンパク質濃度を５μｇ／μｌに調整した。２０ｕｌ／ウェルの細胞溶解物を９６ウェルマイクロプレート内でＫｒｅｐｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．４；最初に９５％ Ｏ２および５％ ＣＯ２を通気）に播種した。ベースラインＯ２●−産生を５μＭルシゲニンで測定した。ＮＡＤＰＨ誘導によるＯ２●−産生を、ＮＡＤＰＨ（１００μＭ）の添加により測定した。測定はＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＢ ９６０により実施された。ルミノメーター設定は０．１秒の測定および３０秒の反応動態であった。
【０１４５】
[00212] 大動脈溶解物における基礎および刺激スーパーオキシド産生は、対照と比較して低いことが認められ、ｎ＝５／グループに基づいて統計分析を行なった。スーパーオキシド産生について対照動物と対比して＊ｐ＜０．０５（図２２）。
【０１４６】
[00213] ＩＮＶ−７５および対照に応答した炎症遺伝子およびタンパク質の発現
[00214] アテローム硬化症においては血管炎症がきわめて重要な役割を果たすので、炎症促進性の遺伝子発現およびタンパク質発現の評価は、ＩＮＶ−７５の抗炎症作用に関する追加情報を提供する。
【０１４７】
[00215] 定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
[00216] 全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。４マイクログラムの全ＲＮＡをランダムヘキサマーおよびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５でＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて実施した。ＧＡＰＤＨと比較した相対発現レベルを求めた。この実験に用いたプライマーは下記の表に示され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入された。
【０１４８】
【表２】
【０１４９】
[00217] ウェスタンブロット分析
[00218] 試料をホモジナイズし、放射免疫沈降アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド：０．２５％のデオキシコール酸ナトリウムおよび１．０％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含む）に可溶化し、１０，０００ｇおよび４℃で３０分間、遠心した。上清を採集し、ウェスタンブロット分析を行なった。要約すると、４０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、続いてニトロセルロース膜へ移した。次いで膜を下記のものと共にインキュベートした：モノクローナル抗−β−アクチン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）、モノクローナル抗−ＶＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）、モノクローナル抗−ＩＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）、モノクローナル抗−ホスホ−ｅＮＯＳ（ｐＳ１１７７）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチュセッツ州ビレリカ）、ウサギ抗−ｅＮＯＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カリフォルニア州サンタクルーズ）、ウサギ抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マサチュセッツ州ダンバース）、ヤギ抗−Ａｋｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カリフォルニア州サンタクルーズ）、およびウサギ抗−ｐ６５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マサチュセッツ州ダンバース）。最後に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合した二次抗体と共にインキュベートし、増強化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ピスカッタウェイ）で視覚化した。バンド濃度を、ＩｍａｇｅＪを用いるデンシトメトリー分析により定量した。
【０１５０】
[00219] ＩＮＶ−７５は、胸部大動脈におけるＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＭＣＰ−Ｉ、およびＬ−セレクチンのｍＲＮＡ発現を低下させた（図２３）。これらの接着分子の発現をタンパク質レベルで測定することにより、ＩＮＶ−７５が大動脈におけるＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ遺伝子発現に及ぼす作用を裏付けた。図２４は、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現に関するウェスタンブロット分析のまとめを示す。ＩＮＶ−７５はＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のタンパク質発現を顕著に低下させた。
【０１５１】
[00220] ＩＮＶ−７５が接着分子ＶＣＡＭ−１の調節に及ぼす作用を理解するために、細胞培養におけるＩＮＶ−７５の作用も調べた。本発明者らは先に、ｉＮＶ−７５がＮＦ−ｋＢ活性化ならびにＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を低下させることをＨＵＶＥＣ細胞において示した（参照：図３および図４）。本発明者らはこれらの所見を再確認したが、さらにこれらの結果が先に図６において立証したＰＰＡＲαの活性化と関係があるかどうかという疑問が生じた；図６では、ＩＮＶ−７５がＰＰＡＲα受容体およびＰＰＡＲα調節型遺伝子、たとえばＡＣＯを活性化することを示した。ＨＵＶＥＣをビヒクル、ＩＮＶ−７５、またはＷＹ−１４６４３で２時間、前処理し、次いでＴＮＦαで４時間処理した。この期間の終了時にＶＣＡＭ−１発現を分析した。３つの独立した実験の代表例およびまとめを示す。＊、ｐ＜０．０５−対−対照；＃、ｐ＜０．０５−対−ＴＮＦα（図２５）。これらの実験は、ＩＮＶ−７５によりみられたＶＣＡＭ−１減少はおそらくＰＰＡＲα活性化に対するＩＮＶ−７５の作用に関係するという可能性を示唆する。
【０１５２】
[00221] ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−２）活性：インビボ実験
[00222] 本発明者らは先に、ＳＲＥＢＰ−２およびＬＤＬ受容体の調節におけるＩＮＶ−７５の作用を細胞培養において示したので、次ぎにこれらの結果をインビボでマウスモデル（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）において確認した。ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ活性に及ぼす作用を調べるために、下記のインビボ実験を実施した：Ｃ５７ｂｌ／６マウス（６／グループ）にＩＮＶ−７５（２０ｍｇ／ｋｇ／日、２週間）を腹腔内注射した。肝ホモジェネートの核タンパク質中のＳＲＥＢＰ２の結合活性を電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により測定した。同時に、肝臓において、コレステロールの合成および調節に関係する多数の遺伝子、アポリポタンパク質遺伝子の発現、ならびにＰＣＳＫ９（プロタンパク質変換酵素ズブチリシン／ケキシン９型）の発現も調べた。ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子様反復配列Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合してＬＤＬＲ分解を誘導することによりＬＤＬ受容体発現を調節することが知られている。
【０１５３】
[00223] 結果は、ＩＮＶ−７５が他のリポタンパク質を低下させないけれどもＬＤＬを有意に低下させたことを立証した（図２７）。これに平行して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（図２６）およびウェスタンブロット（データは示していない）により測定した肝臓におけるＬＤＬ受容体発現が増大した。ＩＮＶ−７５は、電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により測定したＳＲＥＢＰ２、すなわちＬＤＬＲを調節する重要な転写因子も、劇的に活性化した（図２８）。
【０１５４】
[00224] これらの結果から、ＩＮＶ−７５はＳＲＥＢＰ２の活性化によりＬＤＬＲをアップレギュレートすることができ、これによりＬＤＬコレステロールレベルを低下させることが確認される。これらの結果は、ＩＮＶ−７５がＬＤＬ低下に対して卓越した有益な作用をもつという本発明者らの所見をさらに強化する。
【０１５５】
[00225] 実施例４
[00226] メチレンジオキシフェノールおよびｄｌ−リポ酸からの３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（Ｏ−リポイルメチレンジオキシフェノール）（ＩＮＶ−７０６５）の合成
[00227] 化合物３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４Ｓ２）（本明細書中でＯ−リポイルメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７０６５とも呼ばれる）は３２６．４３の分子量（ＭＷ）をもち、Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４Ｓ２の式をもつ。ＩＮＶ ７０−６５は、ハロゲン化溶媒を用いて窒素雰囲気下でリポ酸とメチレンジオキシフェノールを処理することにより製造された。
【０１５６】
[00228] ２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、４．５ｇ（０．０３３ｍｏｌｅ）の３，４−メチレンジオキシフェノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃ Ｓ３００３−２５Ｇ−Ａ）および５ｇ（０．４ｍｏｌｅ）のジメチルアミノピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃ ５２２８２１）および１２０ｍＬのジクロロメタンを、室温で１５分間、十分に撹拌した。７．４ｇ（０．０３６ｍｏｌｅ）のアルファリポ酸（Ｇｅｒｏｎｏｖａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）を少量ずつ１０分間かけて添加した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃：Ｅ７７５０）８．６ｇ（０．８ｍｏｌｅ）を４５分間かけて添加し、一夜撹拌し続けた。すべての溶媒が商業用グレードのものであり、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉから購入された。他のハロゲン化溶媒を使用できることを理解すべきであり、これにはクロロホルムおよび四塩化炭素が含まれるが、これらに限定されない。他の結合剤を使用できることを理解すべきであり、これにはジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
[00229] 約２４時間の反応時間後、粗生成物を出発物質について薄層クロマトグラフィー（３：１ ヘキサン：酢酸エチル溶媒系）検査して、生成物の形成および出発物質３，４−メチレンジオキシフェノールの消失を検査した。反応の完了後、ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた。粘稠な黄色素材が得られ、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーにより３：１ ヘキサン：酢酸エチル溶媒系で直接精製した。より高純度の生成物を得るためには、カラムクロマトグラフから低速での溶媒溶離が必要である。得られた黄色の羽毛状固体を結晶化法で再精製した。結晶化は９０％エタノールを用いて実施され、その操作は化合物ＩＮＶ−７０６５（約２ｇ）を１０分間かけて温エタノール（約３５ｍＬ）に連続撹拌しながら添加することを伴う。化合物が完全に溶解した後、淡黄色溶液を速やかに濾過し、徐々に結晶化させるために一夜放置した。光沢のある羽毛状固体を濾過し、真空乾燥器を用いて乾燥させた。全収率は６５％〜７３％であった。結晶化した生成物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析した。下記はこの反応の模式図である。
【０１５８】
【化２２】
【０１５９】
[00230] ＮＭＲ特性分析：結晶化した化合物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析し、生成物の代表的なプロトン化学シフト値は下記のとおりである：(CDCl3) : 6.77-6.75 (1H, doublet), 6.59 - 6.58 (1H, doublet), 6.52 - 6.49 (1H, doublet of doublet), 5.97 (2H, singlet), 3.61-3.57 (1H, multiplet), 3.19-3.10 (2H, multiplet), 2.56 - 2.52 (2H, triplet), 2.51 - 2.45 (2H, multiplet), 1.95 - 1.86 (2H, multiplet), 1.79-1.73 (4H, multiplet), 1.58 - 1.53 (2H, multiplet). 図１Ｂ；
singlet：一重線，doublet：二重線，doublet of doublet：二重の二重線，multiplet：多重線。
【０１６０】
[00231] 実施例５
[00232] ３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ ７０−６５）の生物活性
[00233] ＩＮＶ ７０−６５をリポ酸とメチレンジオキシフェノールの処理により製造したので、それの作用を特にリポ酸単独の作用と比較して理解することを試み、リポ酸の作用とメチレンジオキシフェノールの作用を区別する補助とした。したがって、インビボ試験を伴う本発明者らの実験において、比較グループのひとつはリポ酸であった。
【０１６１】
[00234] 動物モデル：１５匹の雄ニュージーランド白ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，マサチュセッツ州）に高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄウサギ飼料，０．５％のコレステロールを含有，ＴＤ ８７２５１）を与えた。４週間の高脂肪食の後、ウサギをランダムに３つの異なる処理グループに分けた：正常な対照（ｎ＝５）、リポ酸（１００ｍｇ／ｋｇ／日）（ｎ＝５）、ＩＮＶ ７０−６５（１００ｍｇ／ｋｇ／日）（ｎ＝５）。これらの薬物は動物にそれらの固形飼料を介して、薬物を高脂肪食と混合することにより投与された。各ウサギの飼料摂取量を慎重に計算した後、一定量の固形飼料と固形飼料中に混合した薬物をすべての動物に毎日与えた。薬物を１００％エタノールに溶解し、飼料に噴霧し、エタノールを蒸発させるために一夜真空下に保持した。薬物または対照を混合したＨＦＤを２週間与えた後、すべてのウサギに大動脈バルーン表皮剥脱術を施し、続いて、混合したＨＦＤと薬物または対照を連続１２週間投与した。図２９にこの実験計画の概要を提示する。
【０１６２】
[00235] アテローム硬化症の評価のための磁気共鳴イメージングプロトコル
[00236] ＭＲＩ実験を２時点で実施した：バルーン表皮剥脱術後、１週目および１２週目（図２９）。ＭＲＩ取得に先立って、ウサギをキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（４０ ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔し、後に造影剤を投与するために静脈内カテーテル（Ｓｕｒｆｌｏ ２４Ｇｘ３／４”，ＴＥＲＵＭＯ（登録商標） Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，メリーランド州エルクトン）を耳縁静脈に挿入した。アテローム硬化症を評価するためのｄｏｕｂｌｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ ｔｕｒｂｏ ＦＬＡＳＨシーケンスを用いた前および後ＭＲＩイメージを、１．５Ｔ ３２−チャンネル全身ＭＲシステム（ＭＡＧＮＥＴＯＭ Ａｖａｎｔｏ，Ｓｉｅｍｅｎｓ，ドイツ）により得た。イメージングのために、ウサギを腹臥位に置き、柔軟な６エレメント位相アレイボディーコイルを巻きつけた。ほぼ腸骨分岐部から腎最上極までにわたる下行大動脈に対して垂直な３０の４ｍｍ厚さの横断スライス（スライス間ギャップ４．６ｍｍ）を取得した：ＴＲ／ＴＥ＝２６０／５ｍｓ、３１２ｘ３１２μｍの平面内解像、バンド幅１２０ ｋＨｚ、３信号の平均、および全スキャン時間１２分２９秒。造影前取得の後、７〜１０ｍｌの０．１ｍｍｏｌ／Ｋｇ Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ溶液（Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ウェイン）をカテーテルにより注入し、２ｍｌの生理食塩水でフラッシュした。造影剤投与後、約６分３０秒で造影前暗血液スキャン（ｐｒｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｄａｒｋ ｂｌｏｏｄ ｓｃａｎ）の反復を開始した。造影後スキャンの後、ウサギを回復させた。ＭＲイメージをＳｉｅｍｅｎｓ Ｌｅｏｎａｒｄｏ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｎｃ．，ドイツ）により分析した。
【０１６３】
[00237] 各ウサギグループについてアテローム硬化プラーク進行速度の差を評価するために、大動脈壁を両ＭＲＩ時点の造影前イメージで確認した。各動物について１０〜２２のイメージにおいて、関心領域（ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＲＯＩ）を血管壁の内縁および外縁の周りにフリーハンドで描いた。各スライスにおいて、血管壁の外縁で囲まれた面積から管腔面積を差し引くことにより、血管壁面積を求めた。スライス厚さ（４．６ｍｍ）を全血管面積（ｍｍ）に掛けることにより、各動物について全血管壁体積を求めた。スライス数の変動を考慮するために、各ウサギについて正規化した大動脈壁体積を計算した。
【０１６４】
[00238] 異なる処理グループにおけるプラーク血管新生の進行を評価するために、バルーン表皮剥脱術後１２週目のＭＲＩイメージのみを用いた。大動脈壁を含む同じＲＯＩを、７〜１１の造影前および造影後ＭＲＩイメージ中に手で描いた。各スライスについての信号−対−ノイズ比（ＳＮＲ）を、血管壁から得られた平均信号を身体の外側領域からのノイズの標準偏差で割ったものとして計算した。各ウサギについてのＳＮＲ比増強を、造影後および造影前ＳＮＲ計算値で割ることにより求めた。
【０１６５】
[00239] 図３０Ａは、種々のグループにおけるプラーク負荷のＭＲＩ評価を示す。ＩＮＶ ７０−６５は、１２週間の処理後に対照動物と比較してプラーク負荷を顕著に減弱させた。この実験ではリポ酸処理とＩＮＶ ７０−６５処理の間に差がなかった。ＨＦＤを与えた対照動物はアテローム硬化プラーク負荷が増大し続けた。
【０１６６】
[00240] 図３０Ｂは、種々の処理グループにおけるガドリニウム投与後の大動脈のコントラスト増強を示す。図３０Ｂは、対照およびリポ酸処理と比較してＩＮＶ ７０−６５処理後にガドリニウム増強が低下したことを示す。
【０１６７】
[00241] 血管機能：対照およびリポ酸処理と比較したＩＮＶ ７０−６５の血管に対する生理的作用を調べるためのミオグラフ実験
[00242] ウサギを致死量のペントバルビタール注射により安楽死させた。胸部大動脈をミオグラフ試験のために採取した。２ｍｍの胸部大動脈リングを、生理食塩水緩衝液（塩化ナトリウム，１３０ｍＥｑ／Ｌ；塩化カリウム，４．７ｍＥｑ／Ｌ；二塩化カルシウム，１．６ｍＥｑ／Ｌ；硫酸マグネシウム，１．１７ｍＥｑ／Ｌ；二リン酸カリウム，１．１８ｍＥｑ／Ｌ；炭酸水素ナトリウム，１４．９ｍＥｑ／Ｌ；ＥＤＴＡ，０．０２６ｍＥｑ／Ｌ；およびグルコース，９９．１ｍｇ／ｄＬ［５．５ｍｍｏｌ／Ｌ］；ｐＨ，７．４）を充填した個別の臓器チャンバー内に吊るし、酸素中５％二酸化炭素を３７℃で連続通気した。血管を少なくとも１時間、３０ｍＮの静止張力で平衡化させた後、段階的用量のアゴニストで処理した。血管収縮アゴニスト、フェニレフリン（ＰＥ）を用い、応答を１２０ｍＥｑ／Ｌの塩化カリウムへのピーク応答に対するパーセントとして表わした。ＰＥで処理した血管を十分に洗浄し、１時間平衡化させた後、アセチルコリンまたはニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）による実験を開始した。ＰＥ（０．１μＭ）で安定収縮プラトーに達した後、リングを段階的用量の血管弛緩物質に曝露した；これには、内皮依存性アゴニストであるアセチルコリンおよびインスリン、または内皮非依存性アゴニストであるＳＮＰが含まれていた。これらの血管収縮物質についての結果をＰＥ（０．１μＭ）による前収縮に対するパーセントとして表わした。表３に血管応答をまとめ、図３１Ａ〜３１Ｄに結果を示す。
【０１６８】
[00243] 表３．ＩＮＶ ７０−６５の１２週目の終了時における胸部大動脈の血管応答のまとめ
【０１６９】
【表３】
【０１７０】
[00244] 図３１Ａおよび図３１Ｂは、フェニレフリンおよびインスリンに対する応答へのＩＮＶ ７０−６５の作用の相異を示す。ＩＮＶ ７０−６５は、リポ酸と比較してピーク用量のインスリンに対する弛緩を改善したが、ＥＣ５０用量には作用しなかった。
【０１７１】
[00245] これに対し、ＩＮＶ ７０−６５はアセチルコリンに対する応答の改善において、対照と比較した場合、リポ酸と差がなかった（図３１Ｃ）。これに対し、内皮非依存性アゴニストであるニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）に対する応答には、いずれのグループにも差がなかった。これらの結果は、ＩＮＶ ７０−６５がアルファ受容体アゴニストに対する血管収縮性を低下させ、血管のインスリン感受性を増大させることを示唆する。
【０１７２】
[00246] 免疫組織化学的方法および結果
[00247] 高コレステロール血症および酸化的ストレスは、アテローム硬化症の発症に重要な役割を果たす。ウサギを屠殺し、腹部大動脈を４％ ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）中で固定した。次いで大動脈壁の脂質沈着をオイルレッド染色により視覚化した。腹部大動脈のオイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色は、プラーク領域の脂質含量の低下を示した；対照グループと比較した３，４−メチレンジオキシフェニルリポエートおよびリポ酸処理動物の腹部大動脈切片の閾値面積パーセントとして計算。＊，ｐ＜０．０５，一元ＡＮＯＶＡ。
【０１７３】
[00248] ＩＮＶ−７０６５処理動物の大動脈壁における脂質沈着に、対照と比較して約８０％の低下、リポ酸と比較した場合には約４０％の低下がみられた。
【０１７４】
[00249] 血漿脂質プロフィール試験
[00250] 脂質プロフィール(コレステロール、トリグリセリド、直接ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）を、合計１２週間の薬物処理後に調べた。高コレステロール食の開始時および再び屠殺時点で、Ｋ ＥＤＴＡを入れた試験管に耳朶静脈からの１ｍｌの血液を入れた。すべての数値を平均±ＳＤとして表わした。ベースラインおよび終末点測定の両方の各グループの棒グラフを提示する。一元ＡＮＯＶＡにより統計分析を行なった。正常対照と比較してＩＮＶ−７５およびリポ酸で処理したグループの終末点で、ＴＣおよびＬＤＬのレベルが中等度に低下した。図３２Ａおよび図３２Ｄ。
【０１７５】
[00251] これに対し、対照と比較してＩＮＶ−７０６５およびリポ酸のグループでトリグリセリド（ＴＧ）レベルは有意に低下した；図３２Ｂ。ＨＤＬレベルはリポ酸グループで中等度に増大し、一方、ＩＮＶ−７０６５は有意ではない変化を示した；図３２Ｃ。対照と比較して、ＩＮＶ−７０６５処理動物はわずかなＶＬＤＬ低下を示し、これに対しリポ酸処理動物はＶＬＤＬレベルの変化を示さなかった；図３２Ｅ。これらの結果は、ＩＮＶ−７０６５が対照およびリポ酸と比較して脂質プロフィールの制御に中等度に有効であることを示唆する。
【０１７６】
[00252] 実施例６
[00253] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（Ｏ−リポイルニトロメチレンジオキシフェノール（ＩＮＶ−７４６５）の合成および精製
[00254] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートは、３７１．４３の分子量およびＣ１５Ｈ１７ＮＯ６Ｓ２の式をもつ。３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートは、本明細書中でＯ−リポイルニトロメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７４６５とも呼ばれる。
【０１７７】
[00255] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの合成法および精製法，方法−Ｉ
[00256] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの合成は、ニトロメチレンジオキシフェノール（３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノール）とアルファリポ酸の反応により達成され、下記に模式的に示される。ニトロメチレンジオキシフェノール（ＩＮＶ−７４）の合成は、本明細書中で先に記載した。
【０１７８】
【化２３】
【０１７９】
[00257] １００ｍＬ丸底フラスコ内で、０．１７ｇ（０．００ｌｍｏｌｅ）の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノールおよび０．１ｇ（１４０μＬ）（０．２ｍｏｌｅ）のトリエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃：４７１２８３）および５０ｍＬのジクロロメタンを、室温で１０分間、十分に撹拌した。溶液は赤橙色になった。アルファリポ酸０．２５ｇ（０．００１５ｍｏｌｅ，Ｇｅｒｏｎｏｖａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）を５分間かけて添加した。それにＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃：Ｅ７７５０）０．４ｇ（０．００２ｍｏｌｅ）を１５分間かけて添加し、一夜撹拌し続けた。すべての溶媒が商業用グレードのものであり、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。他のハロゲン化溶媒を使用できることを理解すべきであり、これにはクロロホルムおよび四塩化炭素が含まれるが、これらに限定されない。他の結合剤を使用できることを理解すべきであり、これにはジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
[00258] 約３６時間の反応時間後、粗生成物を出発物質について薄層クロマトグラフィー（２０％ヘキサン：酢酸エチル溶媒系）検査して、生成物の形成および出発物質３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノールの消失を検査した。反応の完了後、ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた。粘稠な黄色素材が得られ、これを調製用薄層クロマトグラフィーにより２０％ヘキサン：酢酸エチル溶媒系で直接精製した。適宜なバンドをプレートから掻き取り、酢酸エチルで慎重に溶離した。淡黄色固体が得られ、これを結晶化法で再精製した。結晶化は９５％エタノールを用いて実施され、その操作は化合物（ＩＮＶ−７４６５）（約５０ｇ）を５分間かけて温エタノール（６０〜６５Ｃ）（約１０ｍＬ）に連続撹拌しながら添加することを伴う。化合物が完全に溶解した後、得られた溶液を速やかに濾過し、徐々に結晶化させるために一夜放置した。黄色固体を濾過し、真空乾燥器を用いて乾燥させた。全収率は４２％であった。結晶化した生成物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析した。
【０１８１】
[00259] ＮＭＲ特性分析：結晶化した化合物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析し、生成物の代表的なプロトン化学シフト値は下記のとおりである：(CDCl3) : 7.59 (1H, singlet), 6.45 (1H, singlet), 6.15 (2H, singlet), 3.68-3.60 (1H, multiplet), 3.21-3.13 (2H, multiplet), 2.66-2.64 (2H, triplet), 2.52 - 2.47 (2H, multiplet), 1.97 - 1.92 (2H, multiplet), 1.84 - 1.75 (4H, multiplet), 1.74-1.58 (2H, multiplet). 図１Ｂ；
singlet：一重線，multiplet：多重線，triplet：三重線。
【０１８２】
[00260] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの合成，方法−ＩＩ
[00261] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートを合成する別法は、３，４−メチレンジオキシリポエートにニトロ基を導入することを伴い、合成スキームを下記に示す。３，４−メチレンジオキシフェニルリポエートの合成は、本明細書中でＩＮＶ−７０６５に関して先に示した。
【０１８３】
【化２４】
【０１８４】
１００ｍＬのコニカルフラスコ内で、０．３ｇ（０．００１ｍｏｌｅ）の３，４−メチレンジオキシフェニルリポエートを２０ｍＬの氷酢酸に入れ、室温で３０分間、連続撹拌し、氷冷浴で冷却した。撹拌しながら、氷酢酸１０ｍＬ中の濃硝酸（４ｍＬ）を４５分間かけて徐々に化合物混合物に添加した。反応混合物は明かるい黄色に変化し、３時間撹拌を続けた。得られた溶液を連続撹拌しながら砕き氷に直接注いだ。フラスコの底に沈降した淡黄色の半固体をジクロロメタン（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出液を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた黄色素材を調製用薄層クロマトグラフィーで精製した。最終生成物を、９５％エタノールを用いる再結晶により再精製した。この反応の全収率は３６％である。それを基準試料と比較して薄層クロマトグラフィーにより特性分析した。
【０１８５】
[00262] 実施例７
[00263] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（本明細書内でＯ−リポイルニトロメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ ７４６５とも呼ばれる）の生物活性
[00264] ＩＮＶ ７４−６５によるｐ６５の核トランスロケーションの阻害：インビトロ細胞培養実験
[00265] 細胞培養：すべての実験を培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について実施し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内において、予め１％ゼラチンでコートした組織培養フラスコで、補充した培養培地（Ｍ１９９；１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２ｍＭのグルタミン，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，ヘパリン１２Ｉ．Ｕ．／ｍｌ，１％のレチナール誘導型増殖因子を含む，Ｓｉｇｍａ）中において、集密状態にまで増殖させた。トリプシン処理後、細胞をフラスコから剥離し、予めゼラチンコートした培養プレートにＨＵＶＥＣを接種し、次いで２４〜４８時間インキュベートして確実に集密状態にすることにより、最終単層を調製した。第４継代までの細胞をすべての実験に用いた。組換えヒトＴＮＦ−αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１８６】
[00266] ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、３つの１７ｋＤａサブユニットからなり、約５１ｋＤａの分子量をもつホモ三量体として存在する。それは、好中球、好酸球、ならびにＴおよびＢリンパ球の活性を調節し、かつ血管内皮の特性を改変する、炎症促進性、アポトーシス促進性サイトカインである。炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）に対する３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの生物学的役割を調べるために、インビトロ細胞培養実験を実施した。
【０１８７】
[00267] 細胞培養：すべての実験を培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について実施した；３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内において、予め１％ゼラチンでコートした組織培養フラスコで、補充した培養培地（Ｍ１９９；１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００ｎｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２ｍＭのグルタミン，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，ヘパリン１２Ｉ．Ｕ．／ｍｌ，１％のレチナール誘導型増殖因子を含む，Ｓｉｇｍａ）中において、集密状態にまで増殖させたもの。トリプシン処理後、細胞をフラスコから剥離し、予めゼラチンコートした培養プレートにＨＵＶＥＣを接種し、次いで２４〜４８時間インキュベートして確実に集密状態にすることにより、最終単層を調製した。第４継代までの細胞をすべての実験に用いた。組換えヒトＴＮＦ−αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１８８】
[00268] 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および結果：細胞表面接着分子の発現を測定するために、ＥＬＩＳＡ技術を用いた。９６ウェルプレート内の集密ＨＵＶＥＣを種々の濃度のＩＮＶ−７４６５（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭおよび１０μＭ）で２４時間、前処理した後、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激した。６時間のＴＮＦ−α刺激後、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を評価した。ＩＮＶ−７４６５でヒトＨＵＶＥＣ細胞を１２〜２４時間、前処理し、続いて２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激した後の培養培地のＥＬＩＳＡ分析結果は、ＶＣＡＭおよびＩＣＡＭ−１の放出の顕著な低下を示した。
【０１８９】
[00269] 試験したすべての濃度で、ＩＮＶ−７４６５は炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの作用を阻害し、これは核−対−細胞質ｐ６５染色比の低下として観察された。３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）は、有効な抗炎症作用をもち、炎症性分子ＴＮＦ−αの作用に拮抗した。
【０１９０】
[00270] 実施例８
[00271] 心血管患者の処置
[00272] 胸部中央ならびに肩、腕、首、顎および背に不快な圧迫感、締付け感および痛みを伴って、５５歳の男性が来院している。彼は、息切れおよび血圧上昇など他の症状を示す。血管造影法で評価した後、彼は冠動脈のプラーク形成を伴うアテローム硬化症に罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。別療法には、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）が含まれる。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、スタチン類、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９１】
[00273] 実施例９
[00274] 胸痛を伴う心血管患者（狭心症）の処置
[00275] 胸部中央に不快な圧迫感、締付け感および痛みを３０分未満伴う、５５歳の男性が来院している。不安定狭心症の疑いのため、彼を心臓血管造影特別室に収容した。彼は、息切れおよび不規則な心拍など他の症状を示す。血管造影法で評価した後、彼は冠動脈のプラーク形成を伴うアテローム硬化症に罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、エゼチミベ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）、リポ酸、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９２】
[00276] 実施例１０
[00277] 胸痛を伴う心血管患者（狭心症）の処置
[00278] 胸部中央に不快な圧迫感、締付け感および痛みを３０分未満伴う、５５歳の男性が来院している。不安定狭心症の疑いのため、彼を心臓血管造影特別室に収容した。彼は、息切れおよび不規則な心拍など他の症状を示す。血管造影法で評価した後、彼は冠動脈のプラーク形成を伴うアテローム硬化症に罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、エゼチミベ、リポ酸、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９３】
[00279] 実施例１１
[00280] 急性非ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う心血管患者の処置
[00281] 胸部中央ならびに肩、腕、首、顎および背に不快な圧迫感、締付け感および痛みを４時間以上伴う、５５歳の男性が来院している。彼は息切れも訴えている。彼を救急室で評価して、トロポニンＩが上昇していることが分かり、彼のＥＫＧは心筋虚血と一致した変化を立証する。彼にアスピリン、クロピドグレル、ナイトレート類および静脈内ヘパリンを投与し、カテーテル導入検査室へ収容した。血管造影法で評価した後、彼は左冠動脈前下行枝の＜９０％閉塞を生じていると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物をカテーテル導入検査室で投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９４】
[00282] 実施例１２
[00283] 急性−非ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う心血管患者の処置
[00284] 胸部中央ならびに肩、腕、首、顎および背に不快な圧迫感、締付け感および痛みを４時間以上伴う、５５歳の男性が来院している。彼は息切れも訴えている。彼を救急室で評価して、トロポニンＩが上昇していることが分かり、彼のＥＫＧは心筋虚血と一致した変化を立証する。彼にアスピリン、クロピドグレル、ナイトレート類および静脈内ヘパリンを投与し、カテーテル導入検査室へ収容した。血管造影法で評価した後、彼は左冠動脈前下行枝の＜９０％閉塞を生じていると診断された。この患者に、有効量のＩＮＶ−７５（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物をカテーテル導入検査室で投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９５】
[00285] 実施例１３
[00286] 急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う患者の処置
[00287] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を静脈内投与する。この組成物を場合により、血栓溶解薬、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼなどの療法、ならびにアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れおよび動悸の改善を報告している。
【０１９６】
[00288] 実施例１４
[00289] 急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う患者の処置
[00290] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を静脈内投与する。この組成物を場合により、血栓溶解薬、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼなどの療法、ならびにアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れおよび動悸の改善を報告している。
【０１９７】
[00291] 実施例１５
[00292] 急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う患者の処置
[00293] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７０６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を静脈内投与する。この組成物を場合により、血栓溶解薬、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼなどの療法、ならびにアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れおよび動悸の改善を報告している。
【０１９８】
[00294] 実施例１６
[00295] 最近の心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00296] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、アスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、静脈内ヘパリンなどの療法を施し、カテーテル導入検査室へ収容して、そこで冠動脈のステント挿入を受けさせた。彼を１２〜２４時間回復させた。３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）による経口療法を開始し、少なくとも１年間続ける。経過観察来院中、１カ月後に、患者は症状の改善を報告している。
【０１９９】
[00297] 実施例１７
[00298] 最近の心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00299] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、アスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、静脈内ヘパリンなどの療法を施し、カテーテル導入検査室へ収容して、そこで冠動脈のステント挿入を受けさせた。彼を１２〜２４時間回復させた。３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７０６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）による経口療法を開始し、少なくとも１年間続ける。経過観察来院中、１カ月後に、患者は症状の改善を報告している。
【０２００】
[00300] 実施例１８
[00301] 最近の心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00302] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、アスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、静脈内ヘパリンなどの療法を施し、カテーテル導入検査室へ収容して、そこで冠動脈のステント挿入を受けさせた。彼を１２〜２４時間回復させた。３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）による経口療法を開始し、少なくとも１年間続ける。経過観察来院中、１カ月後に、患者は症状の改善を報告している。
【０２０１】
[00303] 実施例１９
[00304] 慢性心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00305] １年前の心臓発作（心筋梗塞）の前歴をもつ５０歳の男性が、評価のために来院している。彼は無症状である。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。別療法には、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）が含まれる。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、スタチン類、エゼチミベ、アンギオテンシン変換酵素阻害薬またはアンギオテンシン受容体遮断薬、および他の抗高血圧症薬、たとえばベータ遮断薬（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者には、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールにおける追加の有益性、ならびに炎症マーカー、たとえばＣ反応性タンパク質の減少が認められる。
【０２０２】
[00306] 実施例２０
[00307] 慢性安定狭心症を伴う慢性心筋梗塞患者の処置
[00308] １０年前の心臓発作（心筋梗塞）の前歴をもつ５０歳の男性が、評価のために来院している。彼は、舌下ニトログリセリン１錠で軽減する狭心症性胸痛を訴えており、これらの痛みを慢性的に伴う。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。別療法には、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）が含まれる。患者には、投薬を２週間受けた後、この計画により胸痛における追加の有益性が認められる。
【０２０３】
[00309] 実施例２１
[00310] ヒトにおける定着したアテローム硬化症を治療するための本発明化合物の投与
[00311] 冠動脈、頚動脈または末梢動脈にプラークの証拠がある定着したアテローム硬化症を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作および卒中のリスクがあることが知られている。これらの個体を、スタチン類、および抗高血圧症薬、たとえばＡＣＥ阻害薬、利尿薬またはカルシウムチャンネル遮断薬で治療する。彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）をこれらの個体に投与する。治療期間の終了時に再びＩＶＵＳ測定を行なって、標的血管における冠動脈アテローム硬化症に対する本発明組成物の注入効果を評価する。治療後にアテローム硬化症の冠動脈においてプラークが減少し、アテローム硬化症に対するこれらの本発明化合物の有効性が立証されている。
【０２０４】
[00312] 実施例２２
[00313] ヒトにおけるアテローム硬化症を処置するための本発明化合物の投与（一次予防）
[00314] アテローム硬化症のリスク因子、たとえば家族歴、高血圧症および高コレステロール血症を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作および卒中のリスクがあることが知られている。これらの個体に、一次予防処置、たとえば脂質低下薬療法、たとえばスタチン類、アスピリン、および抗高血圧症薬、たとえばＡＣＥ阻害薬、利尿薬またはカルシウムチャンネル遮断薬を施す。彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）をこれらの個体に投与する。治療期間の終了時に再びＩＶＵＳ測定を行なって、標的血管における冠動脈アテローム硬化症に対する本発明組成物の注入効果を評価する。治療後にアテローム硬化症の冠動脈においてプラークが減少し、アテローム硬化症に対するこれらの本発明化合物の有効性が立証される。
【０２０５】
[00315] 実施例２３
[00316] ヒトにおけるアテローム硬化症の発症を予防または遅延するための本発明化合物の投与
[00317] アテローム硬化症のリスク因子が立証され、高い血漿コレステロールレベルをもつ個体の冠動脈の超音波分析（ＩＶＵＳ）、頸動脈の超音波分析（ＩＭＴ）または膝窩動脈の超音波分析を行なって、ベースライン測定値を確立する。これらの個体の一部に、許容できるキャリヤー中の本発明化合物を含む組成物を１日１回、２ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内（ｉｖ）または筋肉内（ｉｍ）に週１〜３回、約１〜６カ月の期間にわたって投与する。下記の化合物をこれらの個体に投与する：３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）。他の個体にはキャリヤーのみを投与する。処置期間の終了時に行なった新たな超音波分析は、キャリヤーを投与された個体の血管においてプラークのレベルがより高いことを示す。この例は、本発明の個々の化合物が、アテローム硬化症を発症するリスクのある個体においてアテローム硬化症を予防または軽減し、かつ冠動脈、頸動脈または膝窩動脈におけるプラーク蓄積を低下させるのに有効であることを示す。
【０２０６】
[00318] 実施例２４
[00319] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う患者を処置するための本発明化合物の投与
[00320] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作、卒中および腎疾患のリスクがある。これらの個体に予防処置、たとえば脂質低下薬療法、たとえばスタチン類、および抗高血圧症薬、たとえばＡＣＥ阻害薬を施す。彼らは既に血糖低下療法、たとえばインスリン、ＰＰＡＲγ薬、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）またはスルホニル尿素療法を受けている。彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）をこれらの個体に投与する。患者は下記の測定を受ける：血糖管理を評価するためのＨｂＡ１Ｃ、尿ミクロアルブミン尿、血圧および脂質の測定。１２カ月の処置の終了時に、ＨｂＡ１Ｃおよび尿ミクログロブリン尿が低下している。これらのいずれの処置によってもＶＬＤＬコレステロールが改善し、トリグリセリドが減少する［（３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）］。
【０２０７】
[00321] 実施例２５
[00322] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う患者において異脂肪血症を処置するための本発明化合物の投与
[00323] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作、卒中および腎疾患のリスクがある。これらの個体はしばしば脂質異常、たとえばトリグリセリドおよびＶＬＤＬコレステロールの増加がある。彼らを、血糖低下療法、たとえばインスリン、ＰＰＡＲγ薬、メトホルミンまたはスルホニル尿素療法と併せて、コレステロールレベル低下のための脂質低下薬療法、たとえばスタチン類およびフィブレート類（ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）またはフェノフィブレート（Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ））などで処置する。これらの処置のほかに、彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、（３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）をこれらの個体に投与する。患者は、ベースラインおよび１２カ月の処置の終了時に脂質測定を受ける。１２カ月の処置の終了時には、ＶＬＤＬコレステロールが低下し、トリグリセリドが減少する。
【０２０８】
[00324] 実施例２６
[00325] 炎症性関節炎を処置するための本発明化合物の投与
[00326] リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎および全身性エリテマトーデスを伴う個体は、炎症性関節炎の再発がある。彼らは、通常は非ステロイド系薬剤、たとえばシクロオキシゲナーゼ阻害薬、抗ＴＮＦα処置および他のタイプの免疫療法で処置される。これらの処置のほかに、彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、６カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）をこれらの個体に投与する。患者は、関節痛、および炎症マーカー、たとえばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および赤血球沈降速度の評価を受ける。６カ月の処置終了時には、関節痛および炎症マーカーが顕著に改善されている。
【０２０９】
[00327] 前記に引用したすべての特許、刊行物および抄録の全体を本明細書に援用する。以上の記載は本発明の好ましい態様にすぎず、特許請求の範囲に定めた本発明の精神および範囲から逸脱することなく多数の改変または変更をなしうることを理解すべきである。
【技術分野】
【０００１】
関連の優先権出願
[0001] 本出願は米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０８６，４２５、２００８年８月５日出願に基づく優先権を主張し、それの全体を本明細書に援用する。
【０００２】
電子媒体により提出した配列表の説明
[0002] 配列表の公式コピーを電子媒体でＥＦＳ−Ｗｅｂにより、２００９年８月５日にファイル名“604_29993_Sequence_Listing_OSURF-08051.txt”で作成された３キロバイトのサイズをもつＡＳＣＩＩフォーマット処理した配列表として提出し、本明細書と共に出願する。このＡＳＣＩＩフォーマット処理したドキュメントに含まれる配列表は本明細書の一部であり、それの全体を本明細書に援用する。
【０００３】
発明の分野
[0003] 新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体を、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して血管疾患、心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病性血管疾患、および関連状態を治療または予防する方法と共に提供する。
【背景技術】
【０００４】
[0004] 心血管疾患または心疾患は世界中で第１位の致死的疾患であり、関連リスク因子は大幅に増加しつつある。たとえば、心血管疾患および代謝疾患、たとえば糖尿病（２０２５年までに世界中で罹患率が４０％を超えると予想される）、メタボリックシンドローム、高血圧症および異脂肪血症は、罹患および死亡の主因である。さらに、最近の研究は、従来は防御されていた亜集団、たとえば若い女性ですら、心疾患に対する罹患性が増大しつつあることを指摘している。したがって、新規な心血管薬に対する広範な要望が高まり続けている。
【０００５】
[0005] アテローム硬化症の二次疾患である心血管疾患は単一疾患ではない。この疾患に関連する多数のリスク因子がある。これらには、糖尿病、高血圧症、異脂肪血症、喫煙、血栓形成傾向（凝血傾向または血栓症の亢進）、および陽性の家族歴が含まれる。しばしば、患者は多数のリスク因子をもち、多数の薬物で処置される。併用療法が有効であることは立証されているが、診断されていないリスク因子のほか、しばしば薬物−薬物相互作用、一日多数回の投与の不便さなどのため、多方面の研究を行なう必要がある。
【０００６】
[0006] これらのリスク因子間には多数の共通性があるけれども、現在までそれらの多くは別個の疾患として処置されてきた。たとえば、高血圧症に対する薬物は糖尿病に対してはほとんど効果がなく、逆も同じである。最近の研究は、これらの疾患（リスク因子）の多くは、炎症性ストレスおよび酸化的ストレスの増大など、共通の特徴をもつことを示唆している。さらに内皮機能の変化は、これらのリスク因子のほぼすべてと関連する、臨床的に重要な共通の所見である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007] 本発明は、心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延するために有用な医薬の調製における、これらの新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体の使用を提供する。
【０００８】
[0008] 心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病性血管疾患または関連障害の１以上の面または症状を治療または予防することができる１種類以上の薬物を得ることが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0009] 本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延する方法を提供することにより、これらの問題を実質的に緩和する。
【００１０】
[0010] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、アテローム硬化症の進行を阻止する能力をもつ。したがってこれらの化合物は、アテローム硬化症のリスクを伴う個体などにおいてプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用である。これらの化合物はプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用であるので、心臓発作、卒中、死亡、末梢動脈疾患の予防または軽減、および血管再生事象（冠動脈バイパス移植術または下肢バイパス術）のために、それらを投与することができる。
【００１１】
[0011] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子である核因子−カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化の阻止に及ぼす作用によって少なくとも立証されるように、抗炎症特性をもつ。したがってこれらの化合物は種々の炎症性障害において有用であり、これにはアテローム硬化症、糖尿病、炎症性関節炎（リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎）、高血圧症および老化が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、これらの化合物を許容できるキャリヤーと組み合わせて、心臓発作または卒中が最近確認された患者、または冠動脈もしくは末梢動脈への経皮介入を最近受けた患者に投与することができる。これらの組成物は、冠動脈もしくは末梢動脈にステントを施される患者に投与するのにも有用である。
【００１２】
[0012] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、血管のインスリン感受性の改善におけるそれらの効果からみて、糖尿病において、また糖尿病性心疾患、糖尿病性腎疾患および糖尿病性脳血管疾患を含めた糖尿病性血管疾患の予防において、保護効果をもつであろう。
【００１３】
[0013] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子であるステロール調節・結合タンパク質−２（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）（ＳＲＥＢＰ−２）にも作用する。これらの化合物は、ＳＲＥＢＰ−２の転写後活性化剤として作用し、新規クラスの選択的ＳＲＥＢＰ−２活性化剤である。ＳＲＥＢＰ−２の増加は低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を増加させ、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる。したがって、これらの化合物を用いて、ＬＤＬレベルの上昇に関連する高脂血症、たとえばヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症およびホモ接合体性家族性高コレステロール血症、複合高脂血症、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールの増加、ならびに糖尿病性異脂肪血症を処置することができる。
【００１４】
[0014] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体によりアテローム硬化症および炎症において得られる実質的な有益性からみて、それらはアテローム硬化症および炎症に有効なことが当業者に既知である他の療法薬と組み合わせて投与することもできる；これにはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ペルオキシソーム増殖応答性受容体アルファ（ＰＰＡＲα）アゴニストおよびＰＰＡＲガンマアゴニスト、アセチルサリチル酸、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、およびベータ遮断薬が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
[0015] 本発明のメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体を、医薬的に許容できるキャリヤーと組み合わせて、動物またはヒトに投与するための組成物を調製することができる。これらの組成物を用いて、血管疾患、心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病性血管疾患または関連障害、およびそれらの原因である多数のリスク因子を治療または予防することができる。これらの組成物は、単独で、または他の療法用化合物と一緒に投与することができる。そのような本発明組成物および１種類以上の追加の療法用化合物の投与は、個別に行なうことができる。あるいは、本発明組成物と１種類以上の追加の療法用化合物を１つの投与または送達方法において組み合わせることができる；たとえば、１つのカプセル剤、１つのカプレット、または１回の静脈内投与において。
【００１６】
[0016] 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示した態様の下記の詳細な説明および特許請求の範囲をみた後に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】[0017] 図１Ａは、ＩＮＶ−７０６５のプロトンＮＭＲを示す。
【図１Ｂ】[0018] 図１Ｂは、ＩＮＶ−７４６５のプロトンＮＭＲを示す。
【図２】[0019] 図２は、ＩＮＶ−７５に関する細胞ベースの毒性アッセイを示すグラフである。ヒト臍帯静脈内皮細胞をこの実験に用いた。
【図３】[0020] 図３は、ＩＮＶ−７５およびＴＮＦ−αに応答したＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の放出を表わす。
【図４】[0021] 図４は、ＩＮＶ−７５が核カッパ因子であるカッパ−Ｂ（ＮＦκＢ）に及ぼす作用を評価する多数回の実験のまとめを示すグラフである。これは、対照、ＴＮＦ−α、およびＩＮＶ−７５＋ＴＮＦ−α処理細胞に関する、ｐ６５（ＮＦκＢのサブユニット）の核／細胞質比として表わされる。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ａ】[0022] 図５Ａは、ＩＮＶ−７５を用いたステロール調節・結合タンパク質−２（ＳＲＥＢＰ２）活性測定のコースのインビトロタイムコースを示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞をＩＮＶ−７５（０．１ｍＭ）で４時間刺激し、核タンパク質へのＳＲＥＢＰ２の結合活性を電気泳動移動シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）（ＥＭＳＡ）により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】[0023] 図５Ｂは、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ２活性に及ぼす用量依存性作用を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＩＮＶ−７５で１時間刺激し、核タンパク質におけるＳＲＥＢＰ２の結合活性を電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ｃ】[0024] 図５Ｃは、ＳＲＥＢＰ２活性化のインビトロタイムコースを、処理した細胞の細胞質におけるＩＮＶ−７５による成熟形の評価により測定したものを示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞をＩＮＶ−７５（０．１ｍＭ）で４時間刺激し、成熟形および前駆形のＳＲＥＢＰ２をウェスタンブロット分析により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。対応するウェスタンブロットを右に示す。右の時間は時（ｈｏｕｒ）である。
【図５Ｄ】[0025] 図５Ｄは、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ２活性に及ぼす用量依存性作用を、ＩＮＶ−７５による成熟形により評価したものを示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＩＮＶ−７５で１時間刺激し、成熟形および前駆形のＳＲＥＢＰ２をウェスタンブロット分析により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。ＩＮＶ−７５の用量は対数モル濃度である。
【図５Ｅ】[0026] 図５Ｅは、ＩＮＶ−７５による低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のインビトロタイムコースを、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により評価したものを示すグラフである。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。
【図５Ｆ】[0027] 図５Ｆは、ＩＮＶ−７５による低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）測定の用量依存性実験を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＩＮＶ−７５で１時間刺激し、ＬＤＬ ｍＲＮＡの発現を定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。合計３回の実験を行なった。＊、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと比較してｐ＜０．０１。ＩＮＶ−７５の用量は対数モル濃度である。
【図６】[0028] 図６Ａは、ＩＮＶ−７５によるペルオキシソーム増殖応答性受容体アルファ（ＰＰＡＲα）のインビトロ評価を、代替としてアセチル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）を用いて示す。ＡＣＯはＰＰＡＲα調節型遺伝子である。ＨｅｐＧ２細胞をＩＮＶ−７５（１００μＭ）で指示した時間刺激し、ＡＣＯのｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５対０。[0029] 図６Ｂは、ＩＮＶ−７５によるＡＣＯのインビトロ活性化を、ルシフェラーゼレポーターに連結させた全長ヒトＰＰＡＲαによりトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞を用いて示す。細胞をＩＮＶ−７５で４時間刺激し、アセチル補酵素Ａオキシダーゼ（ＡＣＯ）のｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５対−８．５。[0030] 図６Ｃは、ＩＮＶ−７５によるＰＰＡＲα遺伝子活性化のタイムコース実験を、高力価ＰＰＡＲα活性化剤ＷＹ １４６４３による活性化との関係で表わしたものを示す。ＨｅｐＧ２細胞を全長ＰＰＡＲαプロモーターレポーター構築体でトランスフェクションし、ＩＮＶ−７５（１００ｕＭ）で刺激した。Ｃの結果をＷＹ １４６４３と比較した増加率％として表わす。
【図７】[0031] 図７は、ＩＮＶ−７５を用いたインビボＷＨＨＬウサギ実験プロトコルの模式図である。＊は、プラークのイメージングのためのＭＲＩ評価のタイミングを表わす。
【図８】[0032] 図８Ａは、３つの異なる時点で（ベースライン、６週目および１２週目）ＭＲＩにより測定したアテローム硬化プラーク負荷の評価を示す。[0033] 図８Ｂは、代表的なＭＲＩイメージを集めたものであり、対照ＷＨＨＬウサギと比較したＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化負荷の軽減を示す。
【図９】[0034] 図９は、対照グループおよびＩＮＶ−７５グループのＷＨＨＬウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化負荷を表わす棒グラフである。ｎ＝５／グループ。＊、非対合ｔ検定によるｐ＜０．０５−対−対照動物。対照介入を受けたＷＨＨＬグループと比較してＷＨＨＬウサギのアテローム硬化負荷が約６０％軽減。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１０】[0035] 図１０は、ＩＮＶ−７５処理動物におけるワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｒａｂｂｉｔ）（ＷＨＨＬ）の胸部大動脈のマクロファージ浸潤の形態計測分析である。＊、非対合ｔ検定によるｐ＜０．０５−対−対照。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１１】[0036] 図１１は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関して、抗−α−アクチン染色による大動脈壁の平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖の形態計測分析である。＊、非対合ｔ検定によるｐ＜０．０５−対−対照。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１２】[0037] 図１２は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関するＲｅｄ ｏｉｌ Ｏ染色による大動脈壁の脂質沈着の形態計測分析である。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１３】[0038] 図１３は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関するＭａｓｓｏｎトリクロム染色（Ｍａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎ）染色による大動脈壁のコラーゲン沈着の形態計測分析である。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１４Ａ】[0039] 図１４Ａは、ＷＨＨＬウサギにおいて対照と対比してＩＮＶ−７５が総コレステロールに及ぼす作用を表わすグラフである。高脂肪固形飼料（ＨＦＣ）を与える前にベースライン値を求めた。ＨＦＣ後＝高脂肪固形飼料の開始後であって、ただし薬物処理の前に求めた数値。ＩＮＶ−７５／対照後は、対照またはＩＮＶ−７５で処理した後の数値を表わす。Ｎ＝４〜５／グループ。総コレステロール値はグループ間で差がなかった。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。このモデルにおける高レベルの総コレステロールが、総コレステロールに対する有意の作用の観察を妨げたと思われる。
【図１４Ｂ】[0040] 図１４Ｂは、ＷＨＨＬウサギにおいて対照介入と対比してＩＮＶ−７５がＬＤＬコレステロール制御に及ぼす作用を表わすグラフである。高脂肪固形飼料を与える前にベースライン値を求めた。ＨＦＣ後＝高脂肪固形飼料の開始後であって、ただし薬物処理の前に求めた数値。ＩＮＶ−７５／対照後は、対照またはＩＮＶ−７５で処理した後の数値を表わす。Ｎ＝４〜５／グループ。ＬＤＬコレステロール値はグループ間で差がなかった。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。このモデルにおける高レベルのＬＤＬコレステロールが、総コレステロールに対する有意の作用の観察を妨げたと思われる。
【図１５】[0041] 図１５は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関して、血管収縮剤アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）による収縮（塩化カリウムＫＣｌ，１２０ｍＭに対する％）を示すグラフである。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４〜５／グループ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１６】[0042] 図１６は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬ動物に関して、フェニレフリンに対する胸部大動脈の収縮率％を、塩化カリウム（ＫＣｌ，１２０ｍＭ）へのピーク収縮に対するパーセントとして表わしたものを示すグラフである。Ｎ＝４〜５／グループ。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１７】[0043] 図１７は、対照動物−対−ＩＮＶ−７５処理動物の胸部大動脈リングセグメントにおけるアセチルコリン（Ａｃｈ）による弛緩（１μＭフェニレフリンＰＥによる前収縮に対する％）を示すグラフである。対照と対比したＩＮＶ−７５によるピーク弛緩に関する一元ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５／グループ）。＊＊＊、アセチルコリンによるピーク弛緩に関して対照と対比してｐ＜０．００１。ＩＮＶ−７５による処理または対照介入の終了時に屠殺した時点で、胸部大動脈をＷＨＨＬウサギから採取した。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図１８】[0044] 図１８は、対照動物およびＩＮＶ−７５処理動物に関して、胸部大動脈リングセグメントにおける緊張のインスリンによる弛緩（１μＭフェニレフリンＰＥによる前収縮に対する％）を示すグラフである。
【図１９】[0045] 図１９は、対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギにおいて、処理終了時における酸化的ストレスの基礎レベルの尺度としての、ウサギ血漿の血漿８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α（８−イソプロスタン（８−Ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅ））酵素結合イムノアッセイにおける酸化的ストレスを示すグラフである。Ｎ＝４〜５匹のウサギ／グループ。＊＊＊＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１−対−対照。
【図２０】[0046] 図２０は、対照−対−ＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギの胸部大動脈における酸化的ストレスを示すグラフである。対照およびＩＮＶ−７５処理ＷＨＨＬウサギにおける処理終了時の酸化的ストレスの尺度としての、大動脈ホモジェネートの８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α（８−イソプロスタン）酵素結合イムノアッセイ。Ｎ＝４〜５匹のウサギ／グループ。＊＊＊＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１−対−対照。
【図２１】[0047] 図２１は、ＩＮＶ−７５または対照がワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（ＷＨＨＬ）大動脈切片における基礎インサイチュースーパーオキシド産生に及ぼす作用を、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色により定量したものを示すグラフである。＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定により、対照と対比してＩＮＶ−７５についてｐ＜０．０１。
【図２２】[0048] 図２２は、ＩＮＶ−７５または対照介入を施したワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（ＷＨＨＬ）からの大動脈組織溶解物における基礎スーパーオキシド産生およびアゴニストＮＡＤＰＨに応答した刺激スーパーオキシド産生に及ぼす作用を、ルシゲニン（Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）化学発光アッセイにより分析したものを示すグラフである。矢印はＮＡＤＰＨ（１００ｍＭ）の添加を示す；ｎ＝５／グループ。＊、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５−対−対照動物。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図２３】[0049] 図２３は、炎症マーカーとしてのＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、ＭＣＰ−１およびＬ−セレクチンを調べるための遺伝子発現レベルを示すグラフである。ＩＮＶ−７５または対照処理したＷＨＨＬウサギの胸部大動脈から全ＲＮＡを調製した。炎症促進性遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＰＣＲにより分析した。＊、ｐ＜０．０５；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図２４】[0050] 図２４は、ＩＮＶ−７５および対照介入がＷＨＨＬウサギにおいてＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１発現に及ぼす作用を示すグラフである。ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のタンパク質発現レベルをウェスタン分析により分析した。＊、ｐ＜０．０５；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正により調整したスチューデントのｔ検定。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図２５】[0051] 図２５は、炎症の細胞性相関としてのＶＣＡＭ−１タンパク質発現レベルを示すグラフである。ＩＮＶ−７５は、ＨＵＶＥＣにおいてＴＮＦα誘導型ＶＣＡＭ−１発現を阻害する。ＨＵＶＥＣをビヒクル、ＩＮＶ７５、またはＷＹ−１４６４３で２時間、前処理し、次いでＴＮＦαで４時間処理した。ＶＣＡＭ−１発現をウェスタンブロットにより分析した。３つの独立した実験の代表例およびまとめを示す。＊、ｐ＜０．０５−対−対照；＃、ｐ＜０．０５−対−ＴＮＦα。
【図２６】[0052] 図２６は、普通の固形飼料で飼育し、ＩＮＶ−７５または対照により２週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＮＶ−７５が肝ＬＤＬＲ ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用を、ＲＴ−ＰＣＲにより測定したものを示すグラフである。対照グループとＩＮＶ ７５処理グループの結果の比較。
【図２７】[0053] 図２７は、ＩＮＶ−７５または対照で２週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＮＶ−７５がＬＤＬレベルを低下させる作用を示すグラフである。＊、ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡ。
【図２８】[0054] 図２８は、普通の固形試料で飼育し、ＩＮＶ−７５または対照で２週間処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＮＶ−７５が肝ＳＲＥＢＰ２に及ぼす作用を、ＥＭＳＡにより測定したものを示すグラフである。
【図２９】[0055] 図２９は、ニュージーランド白（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）（ＮＺＷ）ウサギモデルのアテローム硬化症におけるＩＮＶ−７０６５の作用を試験するために用いたインビボ実験プロトコルの模式図である。
【図３０】[0056] 図３０Ａは、高脂肪固形試料を与え、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸処理および対照介入したニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、アテローム硬化負荷の軽減を示すＭＲＩ試験のまとめを表わす棒グラフである。＊、ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ、対照終末点値と対比（ｎ＝４〜５／グループ）。[0057] 図３０Ｂは、２つの異なる時点、ベースライン（Ａ）および終末点（Ｂ）でガドリニウム造影剤を投与した後に得られたインビボＭＲＩイメージを示す（それぞれ、バルーン表皮剥脱術後１週目および１２週目）。各グループからの代表的なイメージを提示する。造影前の腹部大動脈イメージングは、バルーン表皮剥脱動物において１２週後に、対照グループまたはリポ酸処理と比較してＩＮＶ−７０６５が造影剤によるニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギの大動脈の不透明化を低下させることを示す。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図３１Ａ】[0058] 図３１Ａは、対照動物ならびにＩＮＶ−７０６５およびリポ酸処理動物に関して、塩化カリウム（ＫＣｌ，１２０ｍＭ）に対比した収縮の％を示すグラフである。フェニレフリン（ＰＥ）用量応答。ＩＮＶ−７０６５で１４週間処理した後、リポ酸または対照（ｎ＝４〜５／グループ）ウサギを屠殺し、胸部大動脈セグメントをミオグラフチャンバーに固定した。ベースライン緊張３０ｍＮで２時間平衡化した後、大動脈セグメントを種々の濃度のＰＥで収縮させた。収縮を塩化カリウムによる最大収縮との関係で表わす。＊、ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡによりリポ酸または対照ＮＺＷウサギと対比。すべての動物に高脂肪固形飼料を与えた。
【図３１Ｂ】[0059] 図３１Ｂは、ＩＮＶ−７０６５処理、リポ酸処理または対照ニュージーランド白ウサギの胸部大動脈セグメントの、インスリンに対する血管弛緩応答を示すグラフである。大動脈セグメントをＰＥ（０．３μＭ）により前収縮させ、そしてインスリンに対する弛緩応答を試験した。＊、ｐ＜０．０１、一元ＡＮＯＶＡによりリポ酸または対照ＮＺＷウサギと対比（ｎ＝４〜５／グループ）。
【図３１Ｃ】[0060] 図３１Ｃは、図３１ｂに記載したように、対照、ＩＮＶ−７０６５処理およびリポ酸処理動物において、アセチルコリンに対する血管弛緩応答を示すグラフである（フェニレフリン ＰＥ（０．３μＭ）による前収縮に対する％）。＊、ｐ＜０．０１、対照ＮＺＷウサギと対比したリポ酸およびＩＮＶ−７０６５に関して、一元ＡＮＯＶＡによる。リポ酸とＩＮＶ−７０６５の間に応答の差はなかった（ｎ＝４〜５／グループ）。
【図３１Ｄ】[0061] 図３１Ｄは、図３１Ｂに記載したように、高脂肪食を与えた対照、ＩＮＶ−７０６５処理およびリポ酸処理ニュージーランド白ウサギにおいて、ニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）による弛緩を示すグラフである（フェニレフリン ＰＥ（０．３μＭ）による前収縮に対する％）（ｎ＝４〜５／グループ）。
【図３２Ａ】[0062] 図３２Ａは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸が総コレステロール（ＴＣ）に及ぼす作用を示すグラフである（ｎ＝４〜５／グループ）。[0063] 正常対照との比較 [0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｂ】[0065] 図３２Ｂは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がトリグリセリド（ＴＧ）に及ぼす作用を示すグラフである。対照処理ＮＺＷウサギと比較して、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸はトリグリセリドレベルを低下させた。ＩＮＶ−７０６５の方がさらにトリグリセリドを減少させる傾向はあったが、これらの結果は有意ではなかった。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｃ】[0066] 図３２Ｃは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がＨＤＬに及ぼす作用を示すグラフである。リポ酸およびＩＮＶ−７０６５の両方について、ベースラインと終末点の間に差はなかった。高脂肪食を与えた対照ＮＺＷウサギにおいて、高脂肪固形試料を与えた後にＨＤＬレベルが低下したが、これは統計的に有意ではなかった。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｄ】[0067] 図３２Ｄは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギにおいて、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がＬＤＬに及ぼす作用を示すグラフである。対照ＮＺＷウサギと比較して、リポ酸グループおよびＩＮＶ−７０６５グループのＬＤＬレベルは低かった。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【図３２Ｅ】[0068] 図３２Ｅは、ＩＮＶ−７０６５、リポ酸または対照を補充した高脂肪食を与えたニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギ（ｎ＝４〜５／グループ）において、ＩＮＶ−７０６５およびリポ酸がＶＬＤＬに及ぼす作用を示すグラフである。対照およびリポ酸処理ウサギと比較して、ＩＮＶ−７０６５グループのＶＬＤＬレベルは低下したことが示された。[0064] 図３２Ａ、ならびに図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄおよび３２Ｅにおいて、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計学的検定法を用いた；＊により示すｐ値は＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0069] 本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを使用して心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延する方法を提供することにより、これらの問題を実質的に緩和する。患者という用語は、本明細書において動物およびヒトを表わす。
【００１９】
[0070] 本発明は、心血管疾患、血管疾患および／または炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者の発症および進行を治療、予防または遅延するのに有用な医薬の調製における、これらの新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体の使用をも提供する。
【００２０】
[0071] 化学組成
[0072] ある態様において、本発明の化学物質は下記の式Ｉにより記載される化合物を含む。
【００２１】
【化１】
【００２２】
[0073] Ｒ１に関する置換基には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
水素、
【００２３】
【化２】
【００２４】
アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、Ｈ３ＣＯＣ、
【００２５】
【化３】
【００２６】
リポイル（ｌｉｐｏｙｌ）、
【００２７】
【化４】
【００２８】
ジヒドロリポイル、
【００２９】
【化５】
【００３０】
フェルリル（ｆｅｒｕｌｙｌ）、および
【００３１】
【化６】
【００３２】
異性体形フェルリル。
【００３３】
[0074] Ｒ２に関する置換基は存在しないか、あるいは存在することができ、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
【００３４】
【化７】
【００３５】
−メトキシ、−エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、ならびに複素環、たとえばイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリジン、ピペリジン、
【００３６】
【化８】
【００３７】
カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、脂肪族アミド（炭素原子１〜３個）、脂環式アミド、たとえばピロリジン、ピペリジン、ならびに芳香族アミド、たとえばアニリン、置換アニリン、
【００３８】
【化９】
【００３９】
アミン、アルキル化（炭素原子１〜３個）アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸、たとえばフェルラ酸（ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、ケイ皮酸、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、および
【００４０】
【化１０】
【００４１】
ハロゲン置換基、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素。
【００４２】
[0075] Ｒ３に関する置換基は存在しないか、あるいは存在することができ、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
アルキル基；直鎖（炭素原子１〜３個）および分枝鎖（炭素原子３〜５個の鎖）の両方、
下記の官能基を有するアルキル基：遊離カルボン酸、エステルおよびアミド、ならびに遊離ヒドロキシル誘導体およびアルキル化エーテル誘導体、
下記から選択される官能基を有するアルキル基（炭素原子１〜３個の鎖）：アミン、アルキル化アミン、脂肪族、芳香族両方のアミド、および複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリン、チアゾリジンジオン、ピペラジン、ＣＨ２ＣＨ２−チアゾリジンジオン、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３−ＣＯ−リポイルを含むもの、ＣＨ２ＣＨ２−Ｆ、または
ハロゲン化された基、たとえばフッ化アルキル（炭素原子１〜３個の鎖）。
【００４３】
[0076] 本発明の具体的な態様には下記の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
[0077]
【００４５】
【化１１】
【００４６】
ＩＮＶ−７３＝３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート
[0078]
【００４７】
【化１２】
【００４８】
ＩＮＶ−７５＝３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート
[0079]
【００４９】
【化１３】
【００５０】
ＩＮＶ−７４＝３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール
[0080]
【００５１】
【化１４】
【００５２】
ＩＮＶ−７０６５＝３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート
[0081]
【００５３】
【化１５】
【００５４】
ＩＮＶ−７４６５＝３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート
【００５５】
【化１６】
【００５６】
【化１７】
【００５７】
【化１８】
【００５８】
[0097] 医薬組成物
[0098] 動物またはヒトに投与するために、本発明の療法用化合物または分子を許容できるキャリヤーと組み合わせて医薬組成物を調製し、動物またはヒトに投与する。本発明の療法用化合物は、使用または投与の前に医薬的に許容できるいずれかのキャリヤー中に再構成することができる。
【００５９】
[0099] 医薬的に許容できるキャリヤー
[00100] 医薬的に許容できるキャリヤー：本明細書において有用な医薬的に許容できるキャリヤー（ビヒクル）は一般的なものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)に、本明細書に記載する１種類以上の療法用化合物または分子を医薬として送達するのに適切な組成物および配合物が記載されている。
【００６０】
[00101] 一般に、キャリヤーの性質は、採用する個々の投与様式に依存するであろう。たとえば、非経口配合物は通常、注射用流体を含み、これには医薬的および生理的に許容できる流体、たとえば水、生理食塩水、平衡生理食塩水、水性のデキストロース、グリセロールなどのビヒクルが含まれる。固形組成物（たとえば散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）について、一般的な無毒性固体キャリヤーは、たとえば医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。投与される医薬組成物は、生物学的中性キャリヤーのほか、少量の無毒性補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、たとえば酢酸ナトリウムまたはモノステアリン酸ソルビタンを含有することができる。
【００６１】
[00102] 代表的な投与方法、配合物および用量
[00103] 本発明により提供する療法用化合物を、ヒトまたは動物対象に投与するために、医薬的に許容できるキャリヤーまたはビヒクルと組み合わせることができる。ある態様において、療法用化合物以外のものを組み合わせて単一製剤を形成することができる。療法用化合物は、好都合には単位剤形で提供し、一般的な製薬技術を用いて調製することができる。そのような技術には、有効成分と医薬用キャリヤー（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）を混和する工程が含まれる。一般に配合物は、有効成分と液体キャリヤーを均質かつ密に混和することにより調製される。非経口投与に適切な配合物には、下記のものが含まれる：水性および非水性の無菌注射液：これらは抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および配合物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる；ならびに水性および非水性の無菌懸濁液剤：これらは懸濁化剤および増粘剤を含有することができる。配合物を単回量または多数回量の容器、たとえばシールしたアンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で保存することができ、これは使用直前に無菌液体キャリヤー、たとえば注射用水の添加を必要とするにすぎない。即時調合型の注射液剤または懸濁液剤を、当業者が一般に使用する無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００６２】
[00104] 特定の態様において、単位剤形の配合物は、１回量もしくは単位量、またはその適宜な画分の投与成分を含有するものである。本発明に包含される配合物は、特に前記に述べた成分のほか、当業者が一般に使用する他の作用剤を含有することができると解釈すべきである。
【００６３】
[00105] 本発明において提供する医薬組成物は、障害、たとえば心血管障害の処置に使用するためのものを含めて、種々の経路で投与することができる：たとえば経口（頬内および舌下を含む）、直腸、非経口、エアゾール、鼻腔、筋肉内、腹腔内、脈管内、静脈、動脈内、関節内、皮下、皮内、および局所。それらは種々の形態で投与することができ、これには液剤、乳剤および懸濁液剤、マイクロスフェア、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、およびリポソームが含まれるが、これらに限定されない。１態様においては、療法用化合物を許容できるキャリヤーと組み合わせて、丸剤、カプセル剤中においてまたは食物と共に経口投与するための医薬組成物を形成する。
【００６４】
[00106] 他の態様において、医薬組成物を処置の必要な領域に局所投与することが望ましい場合がある。これは、限定ではないが、たとえば外科処置中の局所（ｌｏｃａｌまたはｒｅｇｉｏｎａｌ）注入もしくは潅流、アテローム硬化症血管などの血管への直接潅流、局所適用（たとえば創傷包帯、薬物含有ステント）、注射、カテーテル、坐剤、または埋込み剤（たとえば多孔質、非孔質、またはゼラチン性の材料から形成される埋込み剤；膜、たとえばシリコーン膜、または繊維を含む）などにより達成できる。１態様において投与は、組織、たとえば心臓または末梢血管の処置すべき部位（または前方部位）における直接注射によることができる。他の態様において、医薬組成物を特にリポソームなどのビヒクル中において送達することができる(たとえば、Langer, Science 249: 1527-1533, 1990; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353- 365, 1989を参照)。投与方法の組合わせ、たとえば、本発明の療法用化合物でコートしたステントを配置する前、後または途中での、本発明の療法用化合物の全身または局所注入も採用することができる。
【００６５】
[00107] さらに他の態様において、医薬組成物を制御放出システム中において送達することができる。１態様においては、ポンプを使用できる(たとえば、Langer Science 249: 1527-1533, 1990; Sefton Crit. Rev. Biomed. Eng. 14: 201-240, 1987; Buchwald et al., Surgery 88: 507-516, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574-579, 1989を参照)。他の態様においては、ポリマー材料を使用できる(たとえば、Ranger et al., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61-64, 1983; Levy et al., Science 228: 190-192, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25: 351-356, 1989; およびHoward et al., J. Neurosurg. 71: 105-112, 1989を参照)。他の制御放出システム、たとえばLanger (Science 249: 1527-1533, 1990)に述べられたものも使用できる。
【００６６】
[00108] 医薬組成物の有効量は、処置すべき障害または状態の性質、および障害または状態の段階に依存するであろう。有効量は、標準的な臨床技術により決定できる。配合物中に使用すべき厳密な用量は投与経路にも依存し、ヘルスケア専門家の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。そのような用量範囲の一例は、１回量または分割量で０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。他の用量範囲には、１回量または分割量で１．０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ、５．０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０〜７５ｍｇ／ｋｇ（体重）が含まれる。これらの範囲内のいかなる用量も使用できることを理解すべきである。
【００６７】
[00109] いずれか特定の対象についての具体的な用量レベルおよび頻度は異なり、多様な要因に依存するであろう；これには個々の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排出速度、薬物組合わせ、ならびに療法処置を受ける対象の状態の重症度が含まれる。
【００６８】
[00110] 本発明の医薬組成物は、処置期間を通してほぼ同じ用量で、漸増量（ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ ｄｏｓｅ）計画で、または負荷量（ｌｏａｄｉｎｇ−ｄｏｓｅ）計画で（たとえば、この場合、負荷量は維持用量の約２〜５倍である）投与することができる。ある態様においては、処置される対象の状態、疾患もしくは状態の重症度、療法に対する見掛け上の応答、および／または当業者が判断する他の要因に基づいて、処置経過中に用量を変動させる。投与体積は投与経路に応じて異なるであろう。たとえば、筋肉内注射は約０．１ｍｌから約１．０ｍｌまでの範囲であってもよい。当業者には種々の投与経路に適切な体積が分かるであろう。
【００６９】
[00111] 処置すべき疾患または状態
[00112] 本発明は、新規なメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体、それらの製造方法、ならびにそれらを用いて血管疾患（心血管疾患、脳血管疾患、末梢血管疾患、および糖尿病性血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症性疾患、または関連障害、およびそれらの原因である多数のリスク因子を治療または予防する方法を提供する。
【００７０】
[00113] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、アテローム硬化症の進行を阻止する能力をもつ。したがってこれらの化合物は、アテローム硬化症のリスクを伴う個体などにおいてプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用である。これらの化合物はプラークの蓄積を阻止しかつアテローム硬化症を遅延または予防するのに有用であるので、心臓発作、卒中、末梢動脈疾患の予防または軽減、および血管再生事象（冠動脈バイパス移植術または下肢バイパス術）のために、それらを投与することができる。
【００７１】
[00114] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子である核因子−カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化に対する作用によって少なくとも立証されるように、抗炎症特性をもつ。したがってこれらの化合物は種々の炎症性障害において有用であり、これにはアテローム硬化症、糖尿病、炎症性関節炎（リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎）、高血圧症および老化が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、これらの化合物を許容できるキャリヤーと組み合わせて、心臓発作または卒中が最近確認された患者、または冠動脈もしくは末梢動脈への経皮介入を最近受けた患者に投与することができる。これらの組成物は、冠動脈もしくは末梢動脈にステントを施される患者に投与するのにも有用である。
【００７２】
[00115] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、血管のインスリン感受性の改善におけるそれらの効果からみて、糖尿病において、また糖尿病性心疾患、糖尿病性腎疾患および糖尿病性脳血管疾患を含めた糖尿病性血管疾患の予防において、保護効果をもつであろう。
【００７３】
[00116] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、転写因子であるステロール調節・結合タンパク質−２（ＳＲＥＢＰ−２）にも作用する。これらの化合物は、ＳＲＥＢＰ−２の転写後活性化剤として作用し、新規クラスの選択的ＳＲＥＢＰ−２活性化剤である。ＳＲＥＢＰ−２の増加はＬＤＬＲを増加させ、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる。したがって、これらの化合物を用いて、ＬＤＬレベルの上昇に関連する高脂血症、たとえばヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症およびホモ接合体性家族性高コレステロール血症、複合高脂血症、ＶＬＤＬコレステロールの増加、ならびに糖尿病性異脂肪血症を処置することができる。
【００７４】
[00117] 併用療法
[00118] これらのメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体によりアテローム硬化症および炎症において提供される実質的な有益性からみて、それらはアテローム硬化症および炎症に有効なことが当業者に既知である他の療法薬と組み合わせて投与することもできる；これにはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲアルファアゴニスト（たとえばロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））およびＰＰＡＲガンマアゴニスト（ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）、フェノフィブレート（Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、ベザフィブレート（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ））、アセチルサリチル酸、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬（アナセトラピブ（Ａｎａｃｅｔｒａｐｉｂ））、リポ酸、およびベータ遮断薬ならびにその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
[00119] 本発明のメチレンジオキシフェノール系化合物およびそれらの誘導体は、単独で、または他の療法用化合物と一緒に投与することができる。そのような本発明組成物および１種類以上の追加の療法用化合物の投与は、個別に行なうことができる。あるいは、本発明組成物と１種類以上の追加の療法用化合物を１つの投与または送達方法において組み合わせることができる；たとえば、１つのカプセル剤、１つのカプレット、または１回の静脈内投与において。
【００７６】
[00120] ＡＣＥ阻害薬
[00121] ＡＣＥ阻害薬は、酵素であるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）がアンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩに変換するのを阻害する化合物である。アンギオテンシンＩＩは血管が弛緩および拡張するのを阻止することにより血圧を上昇させる。ＡＣＥ阻害薬は、高血圧症を処置するために用いられ、抗高血圧症クラスの医薬に属し、心血管疾患による死亡のリスクを２０％〜４０％低下させることができる。ＡＣＥの阻害により、血管を弛緩させて血圧を降下させることができる。ＡＣＥ阻害薬は動脈抵抗を低下させ、静脈容量を増大させ、心拍出量および心指数、１回心仕事量および１回心拍出量を増大させ、腎血管抵抗を低下させ、かつナトリウム利尿（尿中におけるナトリウム排出）の増大をもたらす。疫学的試験および臨床試験により、ＡＣＥ阻害薬はそれらの血圧降下作用とは独立して糖尿病性腎障害の進行を低下させることが示された。ＡＣＥ阻害薬のこの作用は糖尿病性腎障害の予防に利用されている。
【００７７】
[00122] ＡＣＥ阻害薬は、正常血圧の患者においてすら、高血圧症以外の適応症に有効なことが示された。ＡＣＥ阻害薬はその血圧降下作用とは独立して臨床転帰を改善するので、そのような患者における最大用量のＡＣＥ阻害薬の使用（糖尿病性腎障害、うっ血性心不全の阻止、心血管事象の予防のためのものを含む）が妥当である。
【００７８】
[00123] 低血圧の患者は意外にも十分にしばしばＡＣＥ阻害薬にかなり良好に耐容するが、一般にＡＣＥ阻害薬は腎問題をもつ患者または低血圧の患者には処方されない。ＡＣＥ阻害薬は妊婦に使用すべきではない。あるＡＣＥ阻害薬はうっ血性心不全を処置するために用いられ、あるいは医師が判断する他の状態に使用できる。
【００７９】
[00124] ＡＣＥ阻害薬は、化合物上の官能基の存在に基づいて分類できる。たとえばスルフヒドリル含有化合物には、カプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）（ＣＡＰＯＴＥＮ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が含まれる。ジカルボキシレート含有化合物には、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）（ＶＡＳＯＴＥＣ（登録商標），Ｍｅｒｃｋによる）、キナプリル（ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）（ＡＣＣＵＰＲＩＬ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒによる）、リシノプリル（ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）（ＰＲＨＮＩＶＩＬ（登録商標），Ｍｅｒｃｋによる、またはＺｅｓｔｒｉｌ，Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａによる）、ペリンドプリル（ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ）（ＡＣＥＯＮ（登録商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒによる）、およびラミプリル（ｒａｍｉｐｒｉｌ）（ＡＬＴＡＣＥ（登録商標），Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｋｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる）が含まれる。ホスフェート含有化合物には、ペリンドプリル（ＡＣＥＯＮ（登録商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒによる）が含まれる。
【００８０】
[00125] 他のＡＣＥ阻害薬には、ベナゼプリル（ｂｅｎａｚｅｐｒｉｌ）（ＬＯＴＥＮＳＩＮ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓによる）、ホシノプリル（ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）（ＭＯＮＯＰＲＩＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによる）、モエキシプリル（ｍｏｅｘｉｐｒｉｌ）（ＵＮＩＶＡＳＣ（登録商標），Ｓｃｈｗａｒｚ Ｐｈａｒｍａによる）、トランドラプリル（ｔｒａｎｄｏｌａｐｒｉｌ）（ＭＡＶＩＫ（登録商標），Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＢＡＳＦ）による）などが含まれる。ＡＣＥ阻害薬は、スルフヒドリル、ホスフェートおよびジカルボキシレート化合物に分類できる。
【００８１】
[00126] これらの化合物のうち、幾つかのＡＣＥ阻害薬は抗高血圧症薬として一般に用いられている。これらには、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル（ｃｉｌａｚａｐｒｉｌ）、エナラプリル、エナラプリレート（ｅｎａｌａｐｒｉｌａｔ）、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、およびトランドラプリルが含まれる。
【００８２】
[00127] 幾つかのＡＣＥ阻害薬は、血管拡張薬として、またはうっ血性心不全の処置のために、一般に用いられている。これらには、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリル、およびランドラプリルが含まれる。
【００８３】
[00128] リシノプリル、カプトプリル、ラミプリル、およびトランドラプリルは、ある患者において心臓発作後に用いられる。心臓発作の後、心筋の一部が損傷を受け、脆弱化している。その心筋は時間の経過と共に脆弱化し続ける可能性がある。これは心臓が血液を拍出するのをより困難にする。リシノプリルの使用を心臓発作後２４時間以内に開始して、生存率を高めることができる。カプトプリル、ラミプリル、およびランドラプリルは、心臓のそれ以上の脆弱化を遅らせるのを補助する。
【００８４】
[00129] カプトプリルは、糖尿病の管理のためにインスリンを用いているある糖尿病患者において、腎問題の処置にも使用できる。経時的に、これらの腎問題は増悪する可能性がある。カプトプリルは腎問題のそれ以上の増悪を遅らせるのを補助することができる。
【００８５】
[00130] ラミプリルをＡＣＥ阻害薬と一緒に用いて血管疾患および関連障害を処置する；これには冠動脈疾患、うっ血性心不全、高血圧症を伴う患者、および高血圧症を伴う糖尿病患者が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
[00131] 本明細書に挙げていないけれどもアンギオテンシンＩからアンギオテンシンＩＩへの触媒作用の低下または阻害について効果をもつ他の化合物も、本発明に使用するものとして考慮される。
【００８７】
[00132] １態様において、ＡＣＥ阻害薬の量は約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日である。他の態様においては、ＡＣＥ阻害薬を約１ｍｇ／日〜約８０ｍｇ／日の用量で投与する。さらに他の態様においては、ＡＣＥ阻害薬を約５ｍｇ／日〜約５０ｍｇ／日の用量で投与する。ＡＣＥ阻害薬の用量は、一日５、１０または２０ｍｇの出発用量で投与することができる。
【００８８】
[00133] アルファリポ酸
[00134] アルファ−リポ酸はチオクト酸としても知られ、体内での生命エネルギー産生反応における補因子であるジスルフィド化合物である。それは有効な生体内抗酸化剤でもある。アルファ−リポ酸はかって動物およびヒトのビタミンであると考えられていた。しかし、アルファ−リポ酸が条件的に必須であると思われる特定の状況、たとえば糖尿病性多発神経障害がある。アルファ−リポ酸は植物源および動物源に広く見いだされる。
【００８９】
[00135] アルファ−リポ酸が関与する代謝反応の大部分は、ミトコンドリアにおいて起きる。これらには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体によるピルビン酸（ピルベートとして）の酸化、およびアルファ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体によるアルファ−ケトグルタル酸の酸化が含まれる。それは、分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体による分枝鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）の酸化についての補因子でもある。
【００９０】
[00136] アルファ−リポ酸は、ドイツでは多発神経障害、たとえば糖尿病性およびアルコール性多発神経障害、ならびに肝疾患の処置のための薬物として承認されている。アルファ−リポ酸は、キラル中心をもち、２種類の鏡像異性体、天然Ｒ−またはＤ−鏡像異性体およびＳ−またはＬ−鏡像異性体からなる。アルファ−リポ酸の市販製品は、ラセミ混合物、すなわちＲ−およびＳ−鏡像異性体の５０／５０混合物からなる。
【００９１】
[00137] アルファ−リポ酸とその還元型代謝産物ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）は酸化還元対を形成し、広範な反応性酸素種を捕捉することができる。アルファ−リポ酸およびＤＨＬＡは両方とも、ヒドロキシルラジカル、酸化窒素ラジカル、ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素および次亜塩素酸を捕捉することができる。単一酸素をアルファ−リポ酸は捕捉できるがＤＨＬＡは捕捉できず、スーパーオキシドおよびペルオキシ反応性酸素種をＤＨＬＡは捕捉できるがアルファ−リポ酸は捕捉できない。
【００９２】
[00138] 外因性アルファ−リポ酸は、活動心臓モデルにおいて低酸素状態後の再酸素導入に際してＡＴＰ産生および大動脈血流を増大させることが示された。これは、ミトコンドリアにおいてピルビン酸およびアルファ−ケトグルタル酸が酸化される際のアルファ−リポ酸の役割によるものであって、最終的にエネルギー産生が増大すると考えられる。この活性、およびおそらくそれの抗酸化剤活性により、糖尿病性多発神経障害においてアルファ−リポ酸が有益である可能性を説明できる。
【００９３】
[00139] 大部分の薬物動態試験が動物において実施されている。アルファ−リポ酸は小腸から吸収され、門脈循環により肝臓へ、また全身循環により身体の種々の組織へ分配される。天然Ｒ−鏡像異性体はＳ−鏡像異性体より速やかに吸収され、かつより活性な形態である。アルファ−リポ酸は血液−脳関門を容易に通過する。種々の身体組織へ分配された後、それは細胞内、ミトコンドリア内および細胞外に見いだされる。
【００９４】
[00140] ジヒドロリポ酸
[00141] アルファ−リポ酸はミトコンドリアのリポアミドデヒドロゲナーゼにより代謝されて、それの還元形、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）になる。ＤＨＬＡは、リポ酸と一緒に酸化還元対を形成する。それも代謝されてリポアミドになり、これはピルビン酸およびアルファ−ケトグルタル酸の酸化的脱カルボキシルを触媒する多酵素複合体においてリポ酸補因子として機能する。アルファ−リポ酸は代謝されてジチオールオクタン酸になる場合があり、これが異化作用を受ける可能性がある。
【００９５】
[00142] 現在、一日６００ミリグラムまでの用量のアルファ−リポ酸が十分に耐容されている。糖尿病性神経障害など、ある状態では、一日３００ミリグラムのアルファ−リポ酸を分割量で投与する。
【００９６】
[00143] ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）をアルファ−リポ酸の代わりに前記のＡＣＥ阻害薬と共に使用することもできる。
【００９７】
[00144] 本発明の１態様において、リポ酸またはリポ酸誘導体の投与量は約１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日である。他の態様においては、リポ酸またはリポ酸誘導体を約１０ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日の用量で投与する。さらに他の態様においては、リポ酸またはリポ酸誘導体を約１００ｍｇ／日〜約４００ｍｇ／日の用量で投与する。リポ酸またはリポ酸誘導体の用量は、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇまたは６００ｍｇの出発一日量で投与される。
【００９８】
[00145] スタチン類
[00146] 本発明組成物またはその組合わせと組み合わせることができる他の療法にはスタチン類が含まれる。
【００９９】
[00147] スタチン類（またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬）は、心血管疾患またはそのリスクを伴う者のコレステロールレベルを低下させる医薬として用いられる脂質低下薬のクラスを形成する。それらは酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、すなわちコレステロール合成速度に関係する酵素を阻害することによりコレステロールを低下させる。肝臓においてこの酵素が阻害されるとＬＤＬ−受容体が刺激され、その結果、血流からのＬＤＬのクリアランスが増大し、血中コレステロールレベルが低下する。この初期結果は使用の１週間後に見ることができ、４〜６週間後に効果は最大になる。
【０１００】
[00148] スタチン類には、アトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）、ＴＯＲＶＡＳＴ（登録商標））；フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標））、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標））、メバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（Ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＶＡＬＯ（登録商標）、ＰＩＴＡＶＡ（登録商標））、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）、ＳＥＬＥＫＴＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＴＡＴ（登録商標））、ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標））、およびシンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（ＺＯＣＯＲ（登録商標）、ＬＩＰＥＸ（登録商標））が含まれる。
【０１０１】
[00149] １態様において、スタチンの量は約１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日である。他の態様においては、スタチンを約１０ｍｇ／日〜約８０ｍｇ／日の用量で投与する。さらに他の態様においては、スタチンを約２０ｍｇ／日〜約６０ｍｇ／日の用量で投与する。
【０１０２】
[00150] 他の有用な療法薬
[00151] 本発明の医薬組成物をこの節に示す１種類以上の療法用物質と一緒に投与することもできる。抗炎症薬、たとえばアスピリンを投与できる。脂肪酸取込み阻害薬エゼチミベ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）（Ｚｅｔｉａ（登録商標），ＭＳＰ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ，ニュージャージー州ホワイトハウスステーション）も本発明組成物中に使用できる。エゼチミベをスタチン類と組み合わせて配合剤、たとえばＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標）（ＭＳＰ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ，ニュージャージー州ホワイトハウス・ステーション）を調製することもできる。血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、または血液凝固傾向を低下させる薬物、たとえばヘパリンを投与することもできる。心血管系に対する直接作用または間接作用をもつ薬剤がこのカテゴリーに含まれ、これにはナイアシン、フィブレート類、たとえばフェノフィブレート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、ゲムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）およびチアゾリジンジオン類が含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１０３】
[00152] 以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものである；ただし、同時に本発明の何らかの限定となることはない。むしろ、本明細書の記載を読んだ後に当業者に自明となる、本発明の精神から逸脱しない多様な態様、改変および均等物が本発明に含まれることを明確に理解すべきである。
【０１０４】
[00153] 実施例１
[00154] ３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテートおよび３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノールの合成
[00155] ３，４ メチレンジオキシフェノール（セサモール（Ｓｅｓａｍｏｌ）とも呼ばれる）［＃１］からの３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（Ｏ−アセチルメチレンジオキシフェノールとも呼ばれる）［＃２］の合成
[00156] 工程Ｉにおいて、中間化合物（３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート；本明細書中でＯ−アセチルメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７３とも呼ばれる）を、３，４ メチレンジオキシフェノール［＃１］のアセチル化により製造する。
【０１０５】
[00157] この実施例では、無水酢酸を用いてアセチル化を行なった。このアセチル化生成物は、他の多数の誘導体組成物、たとえばニトロ、アミノおよびカルボキシル誘導体の出発点として用いられる。理論により拘束されたくはないが、このアセチル官能基がアスピリン（アセチルサリチル酸）中のアセチル基と類似の能力で作用することができ、血小板の凝集を阻害する作用をもつことができると本発明者らは考える。
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
[00159] 工程ＩＩにおいて、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート［＃２，ＩＮＶ−７３］からの３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（本明細書中でＯ−アセチルニトロメチレンジオキシフェノールまたはＩＮＶ−７５とも呼ばれる）の合成が下記により達成される。
【０１０８】
【化２０】
【０１０９】
[00161] 工程ＩＩＩにおいて、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート［＃３，ＩＮＶ−７５］からの３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（本明細書中でニトロメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７４とも呼ばれる）［＃４］の合成が下記により達成される。
【０１１０】
【化２１】
【０１１１】
[00164] 実施例２
[00165] ３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（本明細書中でＯ−アセチルニトロメチレンジオキシフェノールまたはＩＮＶ−７５とも呼ばれる）の生物学的検定：インビトロ試験
[00166] 細胞培養：すべての実験を培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−−Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について実施し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、予め１％ゼラチンでコートした組織培養フラスコにより、補充した培養培地（Ｍ１９９；１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２ｍＭのグルタミン，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，ヘパリン１２Ｉ．Ｕ．／ｍｌ，１％のレチナール誘導型増殖因子を含む，Ｓｉｇｍａ）中において、集密状態にまで増殖させた。トリプシン処理後、細胞をフラスコから剥離し、予めゼラチンコートした培養プレートにＨＵＶＥＣを接種し、次いで２４〜４８時間インキュベートして確実に集密状態にすることにより、最終単層を調製した。第４継代までの細胞をすべての実験に用いた。組換えヒトＴＮＦ−αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。
【０１１２】
[00167] 細胞毒性アッセイ：細胞毒性を、細胞生存性の評価のための市販アッセイであるＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイにより評価した。ＩＮＶ−７５をＨＵＶＥＣに２４時間添加し、この期間が終了した時点で毒性アッセイを実施した。ＭＴＴアッセイは、細胞がミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによって、正に荷電したテトラゾリウム塩類をそれらの濃色ホルマザン生成物に還元することによる。ホルマザンの生成は、ミトコンドリアの酸化還元機能が損傷した状態およびフリーラジカル生成が増大した状態では低下するので、実験介入に対する細胞生存応答の指標として採用できる。
【０１１３】
[00168] 要約すると、マイクロタイタープレートをインキュベーターから取り出した後、一定体積の再構成ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；最終濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ］を含有する新鮮な培地をウェルに添加し；プレートを３７℃の５％ＣＯ２環境に２時間保持し、次いで製造業者が提供するＭＴＴ可溶化溶液を添加した。正に荷電したテトラゾリウム塩類が還元状態に変換されることにより形成されるホルマザン生成物は、水溶性が低く、紫色結晶として存在する。ホルマザンを可溶化緩衝液（キット中に備えられている）で溶解すると、それの形成を簡便に定量することができる。次いでＯＤ ５７０ｎｍにおける光学濃度を各ウェルについて吸光プレートリーダーで測定する。アッセイ内およびアッセイ間変動性は、それぞれ３および５％であった。種々の濃度のＩＮＶ−７５を、前記のＭＴＴアッセイによる細胞ベースのアッセイで試験した。試験した濃度は１ｍＭから１０ｎＭの範囲であり、細胞を２４時間の期間にわたって曝露した（図２）。
【０１１４】
[00169] これらの結果は、１００ｍＭまでの濃度では、１ｍＭにおける７４％（他のすべての用量と比較して、１ｍＭにつきｐ＝０．００１）と比較して１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭで２％、４％、８％および７％の細胞が毒性を示すことを立証した。これらの結果は、他の化合物ＩＮＶ−７３、ＩＮＶ−７４およびＩＮＶ−７０６５について得られたものと同じであった。これらの結果により、ＩＮＶ−７３、ＩＮＶ−７４、ＩＮＶ−７０６５の安全性が１０ｎＭ〜１００μＭの用量範囲にわたって確認された。
【０１１５】
[00170] 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）：細胞表面接着分子の発現を測定するために、ＥＬＩＳＡ技術を用いた（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）。９６ウェルプレート内の集密ヒト臍帯ＨＵＶＥＣを種々の濃度のＩＮＶ−７５（１ｍＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭおよび１ｎＭ）で２４時間、前処理した後、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激した。
【０１１６】
[00171] 図３に示すＩＮＶ−７５前処理を用いた１実験後の培養培地のＥＬＩＳＡ分析の結果は、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の放出の顕著な低下を示した（統計値は示していない）。その後の実験で、同様にＩＮＶ−７５がＶＣＡＭ−１発現に及ぼす作用をウェスタンブロット法により試験した。これらの結果はＩＮＶ−７５の前処理によるＶＣＡＭ−１タンパク質レベルの低下を示したが、対照（ビヒクル）のみによる処理では示されなかった（セクションおよび図２４を参照）。
【０１１７】
[00172] ＮＦ−κＢトランスロケーションアッセイ：サイトカイン、たとえばＴＮＦ−αおよびインターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）は、内皮細胞における炎症促進応答を活性化する。この応答の初期事象は、ＮＦ−κＢ転写因子の核トランスロケーションである。このトランスロケーションにより、炎症促進遺伝子、たとえば接着分子ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの転写が誘導される。
【０１１８】
[00173] ＮＦ−κＢは、ｐ６５およびｐ５０サブユニットからなるヘテロ二量体である。核トランスロケーションを、固定細胞におけるＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの免疫局在化によりモニターし、核と細胞質のＮＦ−κＢ信号比を測定することにより定量する。したがって、刺激された細胞、たとえば初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＮＦ−κＢの核トランスロケーションは、生物活性化合物が炎症促進刺激に対する内皮の応答性に及ぼす作用を調べるために利用できる読出しを提供する。ＨＵＶＥＣを種々の濃度（１０ｎＭ〜１μＭ）のＩＮＶ−７５または対照（ＩＮＶ−７５を含まない）で２４時間、前処理した。次いで培地を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたは１μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ビヒクル）を含有する培地に交換して６時間おいた。ｐ６５の分布を、関心領域の細胞質および核における強度として計算した。高力価領域につき少なくとも５個の細胞を用い、使用薬物の濃度につき少なくとも５つの高力価領域を用いた。次いで、高力価領域につき少なくとも５個の細胞の核−対−細胞質の染色比として強度を表わした。次いでこのデータを、ＴＮＦ−αを含まない核−対−細胞質の比として表わした。
【０１１９】
[00174] ＮＦ−κＢ活性化を評価する別の実験において、種々の濃度のＩＮＶ−７５で予め６〜２４時間処理した後、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激したＨＵＶＥＣ細胞から、抽出試薬を用いて核および細胞質画分を抽出した。ＴＮＦ−α刺激による６時間の刺激の後、ウェスタンブロット分析によりＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を評価した。次いで、核および細胞質抽出物中のｐ６５レベルを前記に従ってウェスタンブロット法により分析した。ＩＮＶ−７５がＮＦ−κＢトランスロケーションアッセイに及ぼす作用は、ＩＮＶ−７５が１０ｎＭの濃度から核へのｐ６５のトランスロケーションを阻害し始めることを示した。
【０１２０】
[00175] ＩＮＶ−７５を用いた多数の実験のまとめを図４に示す。核−対−細胞質比を、ビヒクルのみで処理した対照細胞と、ＴＮＦ−αに応答したもの、およびＴＮＦ−αに応答したものであるが薬物と共に２４時間インキュベートした後のものとの間で比較した。ＩＮＶ−７５で前処理すると、核ｐ６５発現に顕著な阻害が生じた（ｎ＝３，ｐ＜０．０１，一元ＡＮＯＶＡによる）。
【０１２１】
[00176] ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−２）試験および結果：
[00177] ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と表記される転写因子ファミリーは、コレステロールおよび脂肪酸の合成を調節する。これらのうち、ＳＲＥＢＰ−２は、コレステロール合成酵素およびＬＤＬ受容体発現を変化させることにより、主にコレステロールの生合成を調節する（ＳＲＥＢＰ−１ｃは主に脂肪酸合成を調節する）。ＳＲＥＢＰ−２は、主として転写後機序により調節され、小胞体から転送された後、ゴルジ装置においてプロセシングされて成熟形になる。ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰに及ぼす作用を調べるために、下記のインビトロ実験を実施した：ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞系）細胞をＩＮＶ−７５（０．１ｍＭ）で４時間刺激し、対応するＳＲＥＢＰ２の核結合を電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によりアッセイした。この用量によるタイムコース、および用量依存性を分析した。次いで、細胞質における前駆体および成熟形両方のＳＲＥＢＰ−２の発現をウェスタンブロットにより評価した。成熟形ＳＲＥＢＰ−２のタイムコースおよび用量依存性の両方を分析した。
【０１２２】
[00178] 図５Ａおよび５Ｂは、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ−２の核結合に及ぼす作用を示す。ＩＮＶ−７５は、ＳＲＥＢＰ−２の核結合を処理後＜１時間で増大させた（図５Ａ）。１００ｎＭという低い用量が、核へのＳＲＥＢＰ−２のトランスロケーションを誘導するのに有効であった。図５Ｂは、これら２実験のまとめを提示する。
【０１２３】
[00179] 図５Ｃおよび図５Ｄは、細胞質におけるＳＲＥＢＰ−２のプロセシングに対するＩＮＶ−７５のタイムコースを提示する。これらのデータは、ＩＮＶ−７５が前駆体（未熟形）から成熟形へのＳＲＥＢＰ−２のプロセシングを用量依存性様式で速やかに増大させ、１０ｎＭという低い用量が成熟形ＳＲＥＢＰ−２を増加させる作用をもつことを示唆する。
【０１２４】
[00180] 次いで、同細胞において同様なプロトコルを用いてＬＤＬ受容体発現の調節におけるＩＮＶ−７５の作用を調べて、用量依存性および時間依存性を評価した。図５Ｅおよび５Ｆは、ＩＮＶ−７５に応答したＬＤＬ受容体発現のタイムコースおよび用量依存性を示す。これらの結果は、ＩＮＶ−７５がＬＤＬ受容体発現を時間依存性および用量依存性様式で増大させることを明瞭に示す。これらの結果を合わせると、ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ−２依存経路でＬＤＬ受容体発現を増大させることができると示唆される。ＩＮＶ−７５はＳＲＥＢＰ−Ｉ調節に対しては作用をもたない（データを示してはいない）。同時に、コレステロールの合成および調節に関係する多数の遺伝子、アポリポタンパク質遺伝子の発現、ならびにＰＣＳＫ９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９、プロタンパク質変換酵素ズブチリシン／ケキシン９型）の発現を調べた。後者の遺伝子は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子様反復配列Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合してＬＤＬＲ分解を誘導することによりＬＤＬ受容体発現を調節することが知られている。ＰＳＣＫ９機能の阻害は、コレステロールレベルを低下させる手段として現在探求されている。これらの結果により、ＰＣＳＫ９発現に対してＩＮＶ−７５の作用はないことが明らかになった。
【０１２５】
[00181] ＰＰＡＲ活性化アッセイおよび結果
[00182] ＨｅｐＧ２細胞においてレポーター遺伝子アッセイを用いて、ペルオキシソーム増殖応答性受容体のアゴニストをスクリーニングした。ペルオキシソーム増殖応答性受容体（ＰＰＡＲ）および核ホルモン受容体ファミリーの他のメンバーは、代謝疾患の処置のための重要な薬物標的である。ＰＰＡＲ類は、脂質およびグルコースの代謝においてそれぞれ重要な役割を果たす。したがって、これらの受容体の活性化薬を迅速に同定するのに役立つスクリーニング方法はきわめて有用なはずである。ＩＮＶ−７５は古典的なＰＰＡＲα遺伝子、アセチル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯ）を用量依存性および時間依存性様式で活性化する（図６Ａ）。ＩＮＶ−７５の存在下で最高１５時間、タイムコース実験を実施した。次いで、細胞にヒト全長ＰＰＡＲαプロモーター−レポーター構築体をトランスフェクションし、ＩＮＶ−７５がルシフェラーゼ活性化を増強することを立証した（図６Ｂ）。次の実験で、ＰＰＡＲα活性化のタイムコースを調べ、＜１時間の時間での活性化、および最高１５時間の持続的なＰＰＡＲα活性化作用を立証した（図６Ｃ）。次いで、酵母ＧＡＬ４−ＰＰＡＲα−ＬＢＤプラスミド＋ＵＡＳ−ルシフェラーゼ；ＧＡＬ４−ＰＰＡＲδ−ＬＢＤプラスミド＋ＵＡＳ−ルシフェラーゼ、およびＧＡＬ４−ＰＰＡＲα−ＬＢＤプラスミド＋ＵＡＳ−ルシフェラーゼをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２において実験を実施することにより、ＰＰＡＲαに対するＩＮＶ−７５の特異性を調べた。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγ結合アッセイを、多数の濃度のＩＮＶ−７５（１μＭ、１０μＭ、１００μＭおよび１０００μＭ）を用いて実施した。ルシフェラーゼ活性のレベルは、ＰＰＡＲ活性化度に対応していた。結果を、古典的なＰＰＡＲアゴニスト、たとえばＷＹ−１４６４３（ＰＰＡＲαアゴニスト）、ベンザフィブレート（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ）（ＰＰＡＲδアゴニスト）およびロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（ＰＰＡＲαアゴニスト）と比較した。これらの結果は、ＩＮＶ−７５がＰＰＡＲαのリガンド結合活性を選択的様式で増大させ、ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγに対しては作用しないことを示した。したがって、ＩＮＶ−７５はＰＰＡＲα活性化に対して選択的ではあるが部分的なアゴニスト特性をもつ。
【０１２６】
[00183] 実施例３
[00184] ３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（本明細書中でＯ−アセチルニトロメチレンジオキシフェノールまたはＩＮＶ−７５とも呼ばれる）の生物学的検定：インビボ試験
[00185] 高コレステロール血症のウサギ（ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｒａｂｂｉｔｓ），ＷＨＨＬ）におけるインビボ実験を、６匹のウサギにおいてＩＮＶ−７５を用いて実施した。４匹のウサギを対照として用いた。
【０１２７】
[00186] 動物モデル：体重約２ｋｇの２か月齢ＷＨＨＬウサギをＢｒｏｗｎ Ｆａｍｉｌｙ（アラバマ州）から購入し、ｔｈｅ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒに収容した。６か月齢のウサギをすべての実験に用いた。ウサギに水を自由に摂取させ、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋａｄ ＴＤ７２５１からの高コレステロール固形飼料（２％のコレステロール）を与えた。動物の飼育および実験プロトコルは国が承認した指針に従った。ウサギに施したプロトコルを図７に概説する。ＩＮＶ−７５を９０％エタノールに溶解し、高脂肪固形飼料に噴霧した。この食餌−薬物混合物を次いで一夜真空乾燥してエタノールを除去し、次いでウサギに与えるために用いた。
【０１２８】
[00187] インビボプロトコル（ウサギ）：
[00188] 各動物に３回のＭＲＩ検査を行なった：１回目は高脂肪を与える前（薬物投与前のベースライン）；２回目は薬物療法の中間点；３回目は１２週間の薬物療法後の最終検査（図７）。ＷＨＨＬウサギを到着後、新しい環境に慣れさせ、続いてベースラインＭＲＩ測定値および血液検査値を求めた後、高コレステロール固形飼料を与えた。高脂肪給餌後４〜６週目に、ＩＮＶ−７５による薬物療法を開始した。中間点測定値は薬物療法の途中で求めた。試験が終了した時点で、すべての動物につきプラーク体積定量のためにＭＲＩ検査を行なった。最終ＭＲＩの直後、ウサギを安楽死させ、大動脈を採取し、以後の分析用に処理した（組織病理、遺伝子およびタンパク質発現）。この試験プロトコルはｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。介入（ＭＲＩ試験）のための麻酔を、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（３０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（２．２ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により誘導した。腹腔動脈上方の腹部大動脈を約５ｃｍ、無菌器具で切除し、高圧蒸気滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、直ちに液体窒素中で凍結し、遺伝子およびタンパク質発現のために処理するまで−８０℃で保存した。すべての動物が“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ”に準拠した思いやりのある世話を受けた。
【０１２９】
[00189] 非侵襲ＭＲＩプロトコルおよび結果
[00190] 高分解能非侵襲ＭＲＩを用いて、対応する処理の前と後にアテローム硬化症の程度を評価した。ＷＨＨＬウサギの腹部大動脈のアテローム硬化性プラークを、指示した時点でインビボＭＲＩスキャンにより分析した（図７）。この実験計画により、各動物をそれ自身の対照として使用でき、プラークの進行／退縮に関して真の連続データを得ることができ、かつ処理グループ間の比較が可能になる。ＭＲＩ試験は、１．５−Ｔの磁石（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｓｏｎａｔａ，Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ドイツ、エルランゲン）を用い、動物に巻きつけた位相配列心臓コイルを用いて実施された。勾配エコー冠状面および矢状面イメージを用いて腹部大動脈の位置を判定し、ＴＵＲＢＯ Ｆｌａｓｈシーケンスを用いて腹腔動脈上方から腸骨分岐部までの腹部大動脈の連続横断イメージ（ギャップなしの３−ｍｍ厚さのセグメント）を得た。ほぼ腸骨分岐部から腎最上極までにわたる４８の４ｍｍ厚さの軸スライスを、Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ ｔｕｒｂｏ ＦＬＡＳＨプロトコルにより得た（ＴＲ／ＴＥ ２３０／５．０、３平均、スライス厚さ４．０ｍｍ、スライス間ギャップ５．２ｍｍ、および取得時間約１１分）。腹部大動脈は運動アーチファクトが比較的少ないので、呼吸または心臓ゲーティングは必要なかった。外弾性膜（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅｌａｓｔｉｃ ｌａｍｉｎａ（ＥＥＭ））および管腔縁（ｌｕｍｉｎａｌ ｂｏｒｄｅｒ（Ｌ））を手動でトレースし、それぞれの境界内の面積をＳｉｅｍｅｎｓ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアにより測定することによって、プラーク負荷を測定した。スライス体積（Ｖ）をＶ＝（ＥＥＭ−Ｌ）＊４．０として計算し、動物当たりの全壁体積（ｔｏｔａｌ ｗａｌｌ ｖｏｌｕｍｅ）を方程式ＴＷＶ＝Σ［（ＥＥＭ−Ｌ）＊４］により計算し、ｍｍ３で表わした。各時点の各動物についてのＴＷＶを多様な数の可読スライスについて方程式ＮＷＶ＝（ＴＷＶ／ｎ）＊ｍにより正規化した；ｎ＝各動物における可読スライス数、およびｍ＝全時点にわたる全動物における可読スライス数の平均。すべての正規化した壁体積をｍｍ３で報告した。アテローム硬化プラークの指標であるウサギ腹部大動脈の壁体積を連続インビボＭＲＩスキャンにより分析した。高コレステロール固形飼料を４〜６週間与えた後、ＷＨＨＬウサギは同齢の普通固形飼料を与えたニュージーランドウサギより大きな腹部大動脈壁をもち、これはアテローム硬化症が樹立したことを支持する。
【０１３０】
[00191] 図８Ａは、ＩＮＶ−７５による処理がプラークの進行に及ぼす作用をＭＲＩにより評価したものを示す。ＭＲＩ測定を、ベースライン（ＨＦＣ開始後であって、ただしＩＮＶ−７５開始前）、薬物処理中の中間点、および屠殺直前に実施した。ＭＲＩ試験を、分析のためにＰＣへ移し、プラーク体積をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアにより分析した。アテローム硬化症変化に関する真の連続データを得ることができるように、腎動脈および腸骨分岐部からの距離を用いてイメージを解剖学的位置に一致させた。腹腔動脈に対してすぐ末端側にある大動脈を血管壁測定のために選択した。すべてのＭＲＩイメージを試験アームまたは組織病理データに対してブラインドで取得および分析した。ベースラインの対照グループおよびＩＮＶ−７５グループ（すなわちＩＮＶ−７５補充前）の平均（ＳＥＭ）正規化壁体積（ＮＷＶ）は、それぞれ０．２７ｃｍ３（０．０２１ｃｍ３）および０．２４ｃｍ３（０．００９９ｃｍ３）であった。これらには有意差がなかった（ｐ＝０．２７７５、一元ＡＮＯＶＡによる）。
【０１３１】
[00192] ＩＮＶ−７５を６週間、食事に補充した後、腹部大動脈の壁体積は対照アームと比較して有意に減少した。ＩＮＶ−７５処理後、試験の中間点で、対照グループおよびＩＮＶ−７５グループの平均（ＳＥＭ）プラーク体積（ＮＷＶ）は、それぞれ０．６０ｃｍ３（０．０３７ｃｍ３）および０．３５ｃｍ３（０．０１９ｃｍ３）であった。これらには有意差があった（ｐ＝０．０００４、一元ＡＮＯＶＡによる）。１２週後、ＩＮＶ−７５処理を受けたグループではより顕著なプラーク進行速度低下がみられ、対照グループおよびＩＮＶ−７５グループの壁体積（ＳＥＭ）は、１２週目にそれぞれ０．６６ｃｍ３（０．０２９ｃｍ３）および０．３７ｃｍ３（０．０２５ｃｍ３）であった。これらには有意差があった（ｐ＝０．０００１、一元ＡＮＯＶＡによる）。より早い６週目の時点も、対照処理と比較して統計的に有意であった。図８Ｂは、対照またはＩＮＶ−７５を施した腹部大動脈プラークの種々の時点の代表的なＭＲＩイメージを示す。
【０１３２】
[00193] ＩＮＶ−７５の抗アテローム硬化症作用を評価するための形態分析
[00194] 下行胸部大動脈のセグメントをＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ，カリフォルニア州トランス）に埋包し、ドライアイスで凍結させた。次いで正面切片を調製した。アテローム硬化症負荷を分析するために、８つの切片（４μｍの厚さ）を２０μｍ間隔で採取した。Ｈ＆Ｅ染色後、顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｓｐｏｔ Ｉディジタルカメラ付き、ドイツ、イエナ）を米国国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）Ｉｍａｇｅソフトウェア、バージョン１．６１と共に用いて、各切片をディジタルカメラでディジタル化し、分析した。結果をｍｍ２で表わした。１２週目の終了時における胸部大動脈のプラーク負荷の形態計測評価は、腹部大動脈についてのＭＲＩによるＩＮＶ−７５の抗アテローム硬化症作用を裏付けた。対照グループおよびＩＮＶ−７５グループのＷＨＨＬウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化症負荷のまとめを提示する。ｎ＝５／グループ。＊，対照動物と対比してｐ＜０．０５、ｎ＝４、非対合ｔ検定を採用。ＷＨＨＬウサギにおいて対照グループと比較して約６０％のアテローム硬化症負荷低下がみられた（図９）。
【０１３３】
[00195] 免疫組織化学的方法および結果：
[00196] 炎症性含有物を評価するために、一次抗体（１：２００の濃度）および検出システム（イムノペルオキシダーゼ二次検出システム（Ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ））；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州テメキュラ）を用いて免疫組織化学的染色を実施し、イメージをカメラシステム（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｓｐｏｔ Ｉディジタルカメラ付き）でディジタル化した後、ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）で定量した。ＣＤ６８に対する抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入した。ポリクローナル抗−α−アクチン抗体をＵｐｓｔａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ニューヨーク州レイクプラシッド）から購入した。Ｔ細胞受容体β抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。染色を定量するために、４つの陰性対照（一次抗体を含まない）切片の平均濃度を閾値と設定し、陽性面積をソフトウェアにより取得した。最終的に、膜境界までの外弾性膜で囲まれる面積または内膜−内側体積により結果を正規化した。対照グループと比較してＩＮＶ−７５がマクロファージおよび平滑筋細胞に及ぼす作用を、それぞれＣＤ６８およびα−アクチン免疫組織化学的分析により評価した。ＩＮＶ−７５は対照と対比してマクロファージ数を減少させ、全グループのまとめを図１０の棒グラフにより表わす（ｎ＝４〜５匹の動物／グループ）。＊ｐ＜０．０５、対照動物と対比、非対合ｔ検定を採用）。ＩＮＶ−７５処理グループは、図１０に示すように有意のマクロファージ浸潤阻害を示した。ＩＮＶ−７５は対照と対比して平滑筋含量（全面積に対する％）を増大させ、合わせた結果を棒グラフとして表わした；ｎ＝５／グループ（ｎ＝グループ当たり使用した動物数）。＊ｐ＜０．０５、対照動物と対比。
【０１３４】
[00197] ｐ＜０．０５は、３以上のマッチした数値がガウス分布であり、数値が統計的限界内にあることを表わす。胸部大動脈切片の免疫組織化学的分析は、アテローム硬化プラーク中のＣＤ６８＋細胞は減少したけれども平滑筋の増殖は増大したことを明らかにした（図１０および図１１）。
【０１３５】
[00198] 薬物で合計１４週間処理し、ウサギを屠殺し、腹部大動脈を４％パラホルムアルデヒド中で固定した後、大動脈における脂質沈着を確認した。その際、大動脈壁の脂質沈着をオイルレッド染色により視覚化した。腹部大動脈のオイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色は、対照グループと比較したＩＮＶ−７５処理動物の腹部大動脈切片の閾値面積パーセントとして計算したプラーク領域の脂質含量の低下を示した。ＩＮＶ−７５は、対照と対比して脂質成分を有意に低下させた（図１２）。腹部大動脈のＭａｓｓｏｎトリクロム染色は、対照グループと比較したＩＮＶ−７５処理動物の腹部大動脈切片の閾値面積パーセントとして計算したプラーク領域のコラーゲン含量の低下を示した（図１３）。
【０１３６】
[00199] 脂質プロフィール：ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ
[00200] 高コレステロール血症および酸化的ストレスは、アテローム硬化症の進行に際して重要な機能を占める。血中の脂質（コレステロールおよびＬＤＬ）を、ベースラインと終末点測定の両方において血液試料の分析により評価した。高コレステロール食の開始時と再び屠殺時点で、耳朶静脈からの１ｍｌの血液をＫ ＥＤＴＡ試験管に入れた。すべての数値を平均±ＳＤとして表わした。高脂肪固形飼料開始前のベースライン、高脂肪固形飼料開始後であってただし介入前、ならびにＩＮＶ−７５および対照による介入の終了時の総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールについて、各グループの棒グラフを提示する（図１４ Ａおよび図１４Ｂ）。ＩＮＶ−７５処理の終了時に、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールに差がなかった。作用がなかったのは、極度に高い脂質値およびＬＤＬ受容体の変異をもつ遺伝的モデル（ＷＨＨＬ）に関係する可能性がある。ＩＮＶ−７５はＬＤＬ受容体発現の増大によりＬＤＬクリアランスを増大させることによって機能すると考えられるので、ＬＤＬコレステロールおよび総コレステロール（このモデルにおいてベースラインおよび高脂肪固形飼料の給餌に対する応答における主要なリポタンパク質画分）に対する作用がないのは、理解できる。
【０１３７】
[00201] 内皮機能：血管の生理的作用を調べるための臓器チャンバー実験
[00202] ウサギを致死量のペントバルビタール注射により安楽死させた。上行大動脈を摘出し、２ｍｍの胸部大動脈リングを、生理食塩水緩衝液（塩化ナトリウム，１３０ｍＥｑ／Ｌ；塩化カリウム，４．７ｍＥｑ／Ｌ；二塩化カルシウム，１．６ｍＥｑ／Ｌ；硫酸マグネシウム，１．１７ｍＥｑ／Ｌ；二リン酸カリウム，１．１８ｍＥｑ／Ｌ；炭酸水素ナトリウム，１４．９ｍＥｑ／Ｌ；ＥＤＴＡ，０．０２６ｍＥｑ／Ｌ；およびグルコース，９９．１ｍｇ／ｄＬ［５．５ｍｍｏｌ／Ｌ］；ｐＨ，７．４）を充填した個別の臓器チャンバー内に吊るし、酸素中５％二酸化炭素を３７℃で連続通気した。血管を少なくとも１時間、３０ｍＮの静止張力で平衡化させた後、前記のように段階的用量のアゴニストで処理した。血管収縮アゴニストには、フェニレフリン（ＰＥ）、エンドセリン−１（ＥＴ−Ｉ）、またはアンギオテンシンＩＩが含まれていた。応答を１２０ｍＥｑ／Ｌの塩化カリウムへのピーク応答に対するパーセントとして表わした。ＰＥで処理した血管を十分に洗浄し、１時間平衡化させた後、アセチルコリン、ニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）またはインスリンによる実験を開始した。ＰＥ（０．１μＭ）で安定収縮プラトーに達した後、リングを段階的用量の内皮依存性アゴニストであるアセチルコリン、インスリン、または内皮非依存性アゴニストであるＳＮＰに曝露した。結果をＰＥ（０．１μＭ）による前収縮に対するパーセントとして表わした。アセチルコリンに曝露したリングを十分に洗浄し、１時間平衡化させた。ＰＥ（０．１μＭ）で安定収縮プラトーに達した後、次いでインスリンを累積式で添加し、続いて洗浄し、ＳＮＰに対する用量応答を調べた。結果をＰＥ（０．１μＭ）による前収縮に対するパーセントとして表わした。ＩＮＶ−７５は、アンギオテンシンＩＩによる大動脈収縮を低下させたが、フェニレフリンに対しては作用しなかった（図１５および図１６）。
【０１３８】
[00203] ＩＮＶ−７５は、アンギオテンシンＩＩに対する応答に有意に作用したのと対照的に、ＰＥ、エンドセリン−１に対する応答には作用しなかった。ＩＮＶ ７５はアセチルコリン依存性血管弛緩には有意の作用をもち、インスリンに対しては境界領域（有意ではない）の作用をもっていた（図１７および図１８）。ＩＮＶ−７５はＳＮＰ、すなわち内皮非依存性血管収縮物質に対しては作用をもたなかった（結果は示していない）。ＩＮＶ−７５ウサギにおけるアンギオテンシンＩＩに対する応答の低下は、アンギオテンシンＩＩ １型受容体のｍＲＮＡ発現低下と平行していた（データは示していない）。表１は、ＷＨＨＬウサギの胸部大動脈における種々のアゴニストに対する応答のまとめを示す。
【０１３９】
【表１】
【０１４０】
[00204] 酸化的ストレス計測：８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α（８−イソプロスタン）酵素結合イムノアッセイ
[00205] 血漿および肝臓試料をＷＨＨＬウサギから屠殺時に得た。肝臓溶解物をＰＢＳ中でのホモジナイゼーションにより調製した。両試料をアフィニティー精製し（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンハーバー）、次いで８−イソプロスタンをＳｔａｔ−８−イソプロスタンＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミシガン州アンハーバー）で測定した。肝臓中のレベルをタンパク質に対して調整した。肝臓溶解物中のタンパク質レベルをＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ， イリノイ州ロックフォード）により測定した。
【０１４１】
[00206] 血漿および大動脈ホモジェネート中の８−ｅｐｉプロスタグランジンＦ２α （８−イソプロスタン）産生は、対照グループと比較してＩＮＶ−７５グループでは有意に低かった（図１９，図２０）。
【０１４２】
[00207] ジヒドロエチジウム染色によるスーパーオキシド（Ｏ２●−）の検出
[00208] スーパーオキシド（Ｏ２●−）のインサイチュー検出は、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標），Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ，カリフォルニア州トランス）に埋包した大動脈組織を瞬間凍結したものにおいて実施された。組織試料を２０μｍの厚さに凍結薄切し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルベニア州ピッツバーグ）上に採集し、必要になるまで−８０℃に保存した。各ラット（組織塊）からランダムに選択した４つのスライドをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）上に室温で３０分間乗せ、次いでＰＢＳ中のジヒドロエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ）（ＤＨＥ，１０μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，オレゴン州ユージーン）により湿潤チャンバー内で暗所において２０分間染色した。スライドをＰＢＳで徹底的にすすぎ、カバーガラスを乗せ、顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｓｐｏｔ Ｉディジタルカメラ付き、ドイツ、イエナ）でディジタルイメージにした。ＤＨＥは細胞に自由に透過でき、Ｏ２●−の存在下で２電子酸化を受けてＤＮＡ結合性蛍光体である臭化エチジウムを形成することができ、これがＤＮＡ内へのインターカレーションにより細胞内にトラップされる。この反応はＯ２●−に相対的に特異性であり、細胞性ペルオキシダーゼおよび過酸化水素により誘発される酸化は最小限であった。阻害薬試験のためにスライドを３００μＭのアポサイニン（ａｐｏｃｙｎｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１０μＭのジフェニルヨージニウム（ＤＰＩ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＰＥＧ−ＳＯＤ（２５０Ｕ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした後、ＤＨＥで染色した。棒グラフで表わした全グループの結果のまとめ、＊ｐ＜０．０１、は、３以上のマッチした数値がガウス分布であり、数値が統計的限界内にあることを表わす。
【０１４３】
[00209] これらの結果は、大動脈における基礎スーパーオキシド産生がＩＮＶ−７５処理グループで低下したことを明らかにした（図２１）。
【０１４４】
[00210] ＮＡＤＰＨ誘導スーパーオキシド（Ｏ２●−）の検出のためのルシゲニン化学発光：ＩＮＶ−７５の作用
[00211] アテローム硬化症における酸化的ストレスの関与が示唆されている。ＮＡＤＰＨから誘導されるスーパーオキシド（Ｏ２●−）はフリーラジカル連鎖反応を誘発する可能性があり、これがアテローム硬化プラーク形成を触媒する可能性をもつ。ウサギ大動脈をＰＢＳ中でホモジナイズし、タンパク質濃度を５μｇ／μｌに調整した。２０ｕｌ／ウェルの細胞溶解物を９６ウェルマイクロプレート内でＫｒｅｐｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．４；最初に９５％ Ｏ２および５％ ＣＯ２を通気）に播種した。ベースラインＯ２●−産生を５μＭルシゲニンで測定した。ＮＡＤＰＨ誘導によるＯ２●−産生を、ＮＡＤＰＨ（１００μＭ）の添加により測定した。測定はＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＢ ９６０により実施された。ルミノメーター設定は０．１秒の測定および３０秒の反応動態であった。
【０１４５】
[00212] 大動脈溶解物における基礎および刺激スーパーオキシド産生は、対照と比較して低いことが認められ、ｎ＝５／グループに基づいて統計分析を行なった。スーパーオキシド産生について対照動物と対比して＊ｐ＜０．０５（図２２）。
【０１４６】
[00213] ＩＮＶ−７５および対照に応答した炎症遺伝子およびタンパク質の発現
[00214] アテローム硬化症においては血管炎症がきわめて重要な役割を果たすので、炎症促進性の遺伝子発現およびタンパク質発現の評価は、ＩＮＶ−７５の抗炎症作用に関する追加情報を提供する。
【０１４７】
[00215] 定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
[00216] 全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。４マイクログラムの全ＲＮＡをランダムヘキサマーおよびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５でＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて実施した。ＧＡＰＤＨと比較した相対発現レベルを求めた。この実験に用いたプライマーは下記の表に示され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入された。
【０１４８】
【表２】
【０１４９】
[00217] ウェスタンブロット分析
[00218] 試料をホモジナイズし、放射免疫沈降アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド：０．２５％のデオキシコール酸ナトリウムおよび１．０％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含む）に可溶化し、１０，０００ｇおよび４℃で３０分間、遠心した。上清を採集し、ウェスタンブロット分析を行なった。要約すると、４０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、続いてニトロセルロース膜へ移した。次いで膜を下記のものと共にインキュベートした：モノクローナル抗−β−アクチン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）、モノクローナル抗−ＶＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）、モノクローナル抗−ＩＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）、モノクローナル抗−ホスホ−ｅＮＯＳ（ｐＳ１１７７）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチュセッツ州ビレリカ）、ウサギ抗−ｅＮＯＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カリフォルニア州サンタクルーズ）、ウサギ抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マサチュセッツ州ダンバース）、ヤギ抗−Ａｋｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カリフォルニア州サンタクルーズ）、およびウサギ抗−ｐ６５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マサチュセッツ州ダンバース）。最後に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合した二次抗体と共にインキュベートし、増強化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ピスカッタウェイ）で視覚化した。バンド濃度を、ＩｍａｇｅＪを用いるデンシトメトリー分析により定量した。
【０１５０】
[00219] ＩＮＶ−７５は、胸部大動脈におけるＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＭＣＰ−Ｉ、およびＬ−セレクチンのｍＲＮＡ発現を低下させた（図２３）。これらの接着分子の発現をタンパク質レベルで測定することにより、ＩＮＶ−７５が大動脈におけるＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ遺伝子発現に及ぼす作用を裏付けた。図２４は、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現に関するウェスタンブロット分析のまとめを示す。ＩＮＶ−７５はＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のタンパク質発現を顕著に低下させた。
【０１５１】
[00220] ＩＮＶ−７５が接着分子ＶＣＡＭ−１の調節に及ぼす作用を理解するために、細胞培養におけるＩＮＶ−７５の作用も調べた。本発明者らは先に、ｉＮＶ−７５がＮＦ−ｋＢ活性化ならびにＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を低下させることをＨＵＶＥＣ細胞において示した（参照：図３および図４）。本発明者らはこれらの所見を再確認したが、さらにこれらの結果が先に図６において立証したＰＰＡＲαの活性化と関係があるかどうかという疑問が生じた；図６では、ＩＮＶ−７５がＰＰＡＲα受容体およびＰＰＡＲα調節型遺伝子、たとえばＡＣＯを活性化することを示した。ＨＵＶＥＣをビヒクル、ＩＮＶ−７５、またはＷＹ−１４６４３で２時間、前処理し、次いでＴＮＦαで４時間処理した。この期間の終了時にＶＣＡＭ−１発現を分析した。３つの独立した実験の代表例およびまとめを示す。＊、ｐ＜０．０５−対−対照；＃、ｐ＜０．０５−対−ＴＮＦα（図２５）。これらの実験は、ＩＮＶ−７５によりみられたＶＣＡＭ−１減少はおそらくＰＰＡＲα活性化に対するＩＮＶ−７５の作用に関係するという可能性を示唆する。
【０１５２】
[00221] ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−２）活性：インビボ実験
[00222] 本発明者らは先に、ＳＲＥＢＰ−２およびＬＤＬ受容体の調節におけるＩＮＶ−７５の作用を細胞培養において示したので、次ぎにこれらの結果をインビボでマウスモデル（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）において確認した。ＩＮＶ−７５がＳＲＥＢＰ活性に及ぼす作用を調べるために、下記のインビボ実験を実施した：Ｃ５７ｂｌ／６マウス（６／グループ）にＩＮＶ−７５（２０ｍｇ／ｋｇ／日、２週間）を腹腔内注射した。肝ホモジェネートの核タンパク質中のＳＲＥＢＰ２の結合活性を電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により測定した。同時に、肝臓において、コレステロールの合成および調節に関係する多数の遺伝子、アポリポタンパク質遺伝子の発現、ならびにＰＣＳＫ９（プロタンパク質変換酵素ズブチリシン／ケキシン９型）の発現も調べた。ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子様反復配列Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合してＬＤＬＲ分解を誘導することによりＬＤＬ受容体発現を調節することが知られている。
【０１５３】
[00223] 結果は、ＩＮＶ−７５が他のリポタンパク質を低下させないけれどもＬＤＬを有意に低下させたことを立証した（図２７）。これに平行して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（図２６）およびウェスタンブロット（データは示していない）により測定した肝臓におけるＬＤＬ受容体発現が増大した。ＩＮＶ−７５は、電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により測定したＳＲＥＢＰ２、すなわちＬＤＬＲを調節する重要な転写因子も、劇的に活性化した（図２８）。
【０１５４】
[00224] これらの結果から、ＩＮＶ−７５はＳＲＥＢＰ２の活性化によりＬＤＬＲをアップレギュレートすることができ、これによりＬＤＬコレステロールレベルを低下させることが確認される。これらの結果は、ＩＮＶ−７５がＬＤＬ低下に対して卓越した有益な作用をもつという本発明者らの所見をさらに強化する。
【０１５５】
[00225] 実施例４
[00226] メチレンジオキシフェノールおよびｄｌ−リポ酸からの３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（Ｏ−リポイルメチレンジオキシフェノール）（ＩＮＶ−７０６５）の合成
[00227] 化合物３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４Ｓ２）（本明細書中でＯ−リポイルメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７０６５とも呼ばれる）は３２６．４３の分子量（ＭＷ）をもち、Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４Ｓ２の式をもつ。ＩＮＶ ７０−６５は、ハロゲン化溶媒を用いて窒素雰囲気下でリポ酸とメチレンジオキシフェノールを処理することにより製造された。
【０１５６】
[00228] ２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、４．５ｇ（０．０３３ｍｏｌｅ）の３，４−メチレンジオキシフェノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃ Ｓ３００３−２５Ｇ−Ａ）および５ｇ（０．４ｍｏｌｅ）のジメチルアミノピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃ ５２２８２１）および１２０ｍＬのジクロロメタンを、室温で１５分間、十分に撹拌した。７．４ｇ（０．０３６ｍｏｌｅ）のアルファリポ酸（Ｇｅｒｏｎｏｖａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）を少量ずつ１０分間かけて添加した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃：Ｅ７７５０）８．６ｇ（０．８ｍｏｌｅ）を４５分間かけて添加し、一夜撹拌し続けた。すべての溶媒が商業用グレードのものであり、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉから購入された。他のハロゲン化溶媒を使用できることを理解すべきであり、これにはクロロホルムおよび四塩化炭素が含まれるが、これらに限定されない。他の結合剤を使用できることを理解すべきであり、これにはジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
[00229] 約２４時間の反応時間後、粗生成物を出発物質について薄層クロマトグラフィー（３：１ ヘキサン：酢酸エチル溶媒系）検査して、生成物の形成および出発物質３，４−メチレンジオキシフェノールの消失を検査した。反応の完了後、ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた。粘稠な黄色素材が得られ、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーにより３：１ ヘキサン：酢酸エチル溶媒系で直接精製した。より高純度の生成物を得るためには、カラムクロマトグラフから低速での溶媒溶離が必要である。得られた黄色の羽毛状固体を結晶化法で再精製した。結晶化は９０％エタノールを用いて実施され、その操作は化合物ＩＮＶ−７０６５（約２ｇ）を１０分間かけて温エタノール（約３５ｍＬ）に連続撹拌しながら添加することを伴う。化合物が完全に溶解した後、淡黄色溶液を速やかに濾過し、徐々に結晶化させるために一夜放置した。光沢のある羽毛状固体を濾過し、真空乾燥器を用いて乾燥させた。全収率は６５％〜７３％であった。結晶化した生成物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析した。下記はこの反応の模式図である。
【０１５８】
【化２２】
【０１５９】
[00230] ＮＭＲ特性分析：結晶化した化合物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析し、生成物の代表的なプロトン化学シフト値は下記のとおりである：(CDCl3) : 6.77-6.75 (1H, doublet), 6.59 - 6.58 (1H, doublet), 6.52 - 6.49 (1H, doublet of doublet), 5.97 (2H, singlet), 3.61-3.57 (1H, multiplet), 3.19-3.10 (2H, multiplet), 2.56 - 2.52 (2H, triplet), 2.51 - 2.45 (2H, multiplet), 1.95 - 1.86 (2H, multiplet), 1.79-1.73 (4H, multiplet), 1.58 - 1.53 (2H, multiplet). 図１Ｂ；
singlet：一重線，doublet：二重線，doublet of doublet：二重の二重線，multiplet：多重線。
【０１６０】
[00231] 実施例５
[00232] ３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ ７０−６５）の生物活性
[00233] ＩＮＶ ７０−６５をリポ酸とメチレンジオキシフェノールの処理により製造したので、それの作用を特にリポ酸単独の作用と比較して理解することを試み、リポ酸の作用とメチレンジオキシフェノールの作用を区別する補助とした。したがって、インビボ試験を伴う本発明者らの実験において、比較グループのひとつはリポ酸であった。
【０１６１】
[00234] 動物モデル：１５匹の雄ニュージーランド白ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，マサチュセッツ州）に高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄウサギ飼料，０．５％のコレステロールを含有，ＴＤ ８７２５１）を与えた。４週間の高脂肪食の後、ウサギをランダムに３つの異なる処理グループに分けた：正常な対照（ｎ＝５）、リポ酸（１００ｍｇ／ｋｇ／日）（ｎ＝５）、ＩＮＶ ７０−６５（１００ｍｇ／ｋｇ／日）（ｎ＝５）。これらの薬物は動物にそれらの固形飼料を介して、薬物を高脂肪食と混合することにより投与された。各ウサギの飼料摂取量を慎重に計算した後、一定量の固形飼料と固形飼料中に混合した薬物をすべての動物に毎日与えた。薬物を１００％エタノールに溶解し、飼料に噴霧し、エタノールを蒸発させるために一夜真空下に保持した。薬物または対照を混合したＨＦＤを２週間与えた後、すべてのウサギに大動脈バルーン表皮剥脱術を施し、続いて、混合したＨＦＤと薬物または対照を連続１２週間投与した。図２９にこの実験計画の概要を提示する。
【０１６２】
[00235] アテローム硬化症の評価のための磁気共鳴イメージングプロトコル
[00236] ＭＲＩ実験を２時点で実施した：バルーン表皮剥脱術後、１週目および１２週目（図２９）。ＭＲＩ取得に先立って、ウサギをキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（４０ ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔し、後に造影剤を投与するために静脈内カテーテル（Ｓｕｒｆｌｏ ２４Ｇｘ３／４”，ＴＥＲＵＭＯ（登録商標） Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，メリーランド州エルクトン）を耳縁静脈に挿入した。アテローム硬化症を評価するためのｄｏｕｂｌｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ ｔｕｒｂｏ ＦＬＡＳＨシーケンスを用いた前および後ＭＲＩイメージを、１．５Ｔ ３２−チャンネル全身ＭＲシステム（ＭＡＧＮＥＴＯＭ Ａｖａｎｔｏ，Ｓｉｅｍｅｎｓ，ドイツ）により得た。イメージングのために、ウサギを腹臥位に置き、柔軟な６エレメント位相アレイボディーコイルを巻きつけた。ほぼ腸骨分岐部から腎最上極までにわたる下行大動脈に対して垂直な３０の４ｍｍ厚さの横断スライス（スライス間ギャップ４．６ｍｍ）を取得した：ＴＲ／ＴＥ＝２６０／５ｍｓ、３１２ｘ３１２μｍの平面内解像、バンド幅１２０ ｋＨｚ、３信号の平均、および全スキャン時間１２分２９秒。造影前取得の後、７〜１０ｍｌの０．１ｍｍｏｌ／Ｋｇ Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ溶液（Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ウェイン）をカテーテルにより注入し、２ｍｌの生理食塩水でフラッシュした。造影剤投与後、約６分３０秒で造影前暗血液スキャン（ｐｒｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｄａｒｋ ｂｌｏｏｄ ｓｃａｎ）の反復を開始した。造影後スキャンの後、ウサギを回復させた。ＭＲイメージをＳｉｅｍｅｎｓ Ｌｅｏｎａｒｄｏ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｎｃ．，ドイツ）により分析した。
【０１６３】
[00237] 各ウサギグループについてアテローム硬化プラーク進行速度の差を評価するために、大動脈壁を両ＭＲＩ時点の造影前イメージで確認した。各動物について１０〜２２のイメージにおいて、関心領域（ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＲＯＩ）を血管壁の内縁および外縁の周りにフリーハンドで描いた。各スライスにおいて、血管壁の外縁で囲まれた面積から管腔面積を差し引くことにより、血管壁面積を求めた。スライス厚さ（４．６ｍｍ）を全血管面積（ｍｍ）に掛けることにより、各動物について全血管壁体積を求めた。スライス数の変動を考慮するために、各ウサギについて正規化した大動脈壁体積を計算した。
【０１６４】
[00238] 異なる処理グループにおけるプラーク血管新生の進行を評価するために、バルーン表皮剥脱術後１２週目のＭＲＩイメージのみを用いた。大動脈壁を含む同じＲＯＩを、７〜１１の造影前および造影後ＭＲＩイメージ中に手で描いた。各スライスについての信号−対−ノイズ比（ＳＮＲ）を、血管壁から得られた平均信号を身体の外側領域からのノイズの標準偏差で割ったものとして計算した。各ウサギについてのＳＮＲ比増強を、造影後および造影前ＳＮＲ計算値で割ることにより求めた。
【０１６５】
[00239] 図３０Ａは、種々のグループにおけるプラーク負荷のＭＲＩ評価を示す。ＩＮＶ ７０−６５は、１２週間の処理後に対照動物と比較してプラーク負荷を顕著に減弱させた。この実験ではリポ酸処理とＩＮＶ ７０−６５処理の間に差がなかった。ＨＦＤを与えた対照動物はアテローム硬化プラーク負荷が増大し続けた。
【０１６６】
[00240] 図３０Ｂは、種々の処理グループにおけるガドリニウム投与後の大動脈のコントラスト増強を示す。図３０Ｂは、対照およびリポ酸処理と比較してＩＮＶ ７０−６５処理後にガドリニウム増強が低下したことを示す。
【０１６７】
[00241] 血管機能：対照およびリポ酸処理と比較したＩＮＶ ７０−６５の血管に対する生理的作用を調べるためのミオグラフ実験
[00242] ウサギを致死量のペントバルビタール注射により安楽死させた。胸部大動脈をミオグラフ試験のために採取した。２ｍｍの胸部大動脈リングを、生理食塩水緩衝液（塩化ナトリウム，１３０ｍＥｑ／Ｌ；塩化カリウム，４．７ｍＥｑ／Ｌ；二塩化カルシウム，１．６ｍＥｑ／Ｌ；硫酸マグネシウム，１．１７ｍＥｑ／Ｌ；二リン酸カリウム，１．１８ｍＥｑ／Ｌ；炭酸水素ナトリウム，１４．９ｍＥｑ／Ｌ；ＥＤＴＡ，０．０２６ｍＥｑ／Ｌ；およびグルコース，９９．１ｍｇ／ｄＬ［５．５ｍｍｏｌ／Ｌ］；ｐＨ，７．４）を充填した個別の臓器チャンバー内に吊るし、酸素中５％二酸化炭素を３７℃で連続通気した。血管を少なくとも１時間、３０ｍＮの静止張力で平衡化させた後、段階的用量のアゴニストで処理した。血管収縮アゴニスト、フェニレフリン（ＰＥ）を用い、応答を１２０ｍＥｑ／Ｌの塩化カリウムへのピーク応答に対するパーセントとして表わした。ＰＥで処理した血管を十分に洗浄し、１時間平衡化させた後、アセチルコリンまたはニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）による実験を開始した。ＰＥ（０．１μＭ）で安定収縮プラトーに達した後、リングを段階的用量の血管弛緩物質に曝露した；これには、内皮依存性アゴニストであるアセチルコリンおよびインスリン、または内皮非依存性アゴニストであるＳＮＰが含まれていた。これらの血管収縮物質についての結果をＰＥ（０．１μＭ）による前収縮に対するパーセントとして表わした。表３に血管応答をまとめ、図３１Ａ〜３１Ｄに結果を示す。
【０１６８】
[00243] 表３．ＩＮＶ ７０−６５の１２週目の終了時における胸部大動脈の血管応答のまとめ
【０１６９】
【表３】
【０１７０】
[00244] 図３１Ａおよび図３１Ｂは、フェニレフリンおよびインスリンに対する応答へのＩＮＶ ７０−６５の作用の相異を示す。ＩＮＶ ７０−６５は、リポ酸と比較してピーク用量のインスリンに対する弛緩を改善したが、ＥＣ５０用量には作用しなかった。
【０１７１】
[00245] これに対し、ＩＮＶ ７０−６５はアセチルコリンに対する応答の改善において、対照と比較した場合、リポ酸と差がなかった（図３１Ｃ）。これに対し、内皮非依存性アゴニストであるニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）に対する応答には、いずれのグループにも差がなかった。これらの結果は、ＩＮＶ ７０−６５がアルファ受容体アゴニストに対する血管収縮性を低下させ、血管のインスリン感受性を増大させることを示唆する。
【０１７２】
[00246] 免疫組織化学的方法および結果
[00247] 高コレステロール血症および酸化的ストレスは、アテローム硬化症の発症に重要な役割を果たす。ウサギを屠殺し、腹部大動脈を４％ ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）中で固定した。次いで大動脈壁の脂質沈着をオイルレッド染色により視覚化した。腹部大動脈のオイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色は、プラーク領域の脂質含量の低下を示した；対照グループと比較した３，４−メチレンジオキシフェニルリポエートおよびリポ酸処理動物の腹部大動脈切片の閾値面積パーセントとして計算。＊，ｐ＜０．０５，一元ＡＮＯＶＡ。
【０１７３】
[00248] ＩＮＶ−７０６５処理動物の大動脈壁における脂質沈着に、対照と比較して約８０％の低下、リポ酸と比較した場合には約４０％の低下がみられた。
【０１７４】
[00249] 血漿脂質プロフィール試験
[00250] 脂質プロフィール(コレステロール、トリグリセリド、直接ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）を、合計１２週間の薬物処理後に調べた。高コレステロール食の開始時および再び屠殺時点で、Ｋ ＥＤＴＡを入れた試験管に耳朶静脈からの１ｍｌの血液を入れた。すべての数値を平均±ＳＤとして表わした。ベースラインおよび終末点測定の両方の各グループの棒グラフを提示する。一元ＡＮＯＶＡにより統計分析を行なった。正常対照と比較してＩＮＶ−７５およびリポ酸で処理したグループの終末点で、ＴＣおよびＬＤＬのレベルが中等度に低下した。図３２Ａおよび図３２Ｄ。
【０１７５】
[00251] これに対し、対照と比較してＩＮＶ−７０６５およびリポ酸のグループでトリグリセリド（ＴＧ）レベルは有意に低下した；図３２Ｂ。ＨＤＬレベルはリポ酸グループで中等度に増大し、一方、ＩＮＶ−７０６５は有意ではない変化を示した；図３２Ｃ。対照と比較して、ＩＮＶ−７０６５処理動物はわずかなＶＬＤＬ低下を示し、これに対しリポ酸処理動物はＶＬＤＬレベルの変化を示さなかった；図３２Ｅ。これらの結果は、ＩＮＶ−７０６５が対照およびリポ酸と比較して脂質プロフィールの制御に中等度に有効であることを示唆する。
【０１７６】
[00252] 実施例６
[00253] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（Ｏ−リポイルニトロメチレンジオキシフェノール（ＩＮＶ−７４６５）の合成および精製
[00254] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートは、３７１．４３の分子量およびＣ１５Ｈ１７ＮＯ６Ｓ２の式をもつ。３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートは、本明細書中でＯ−リポイルニトロメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ−７４６５とも呼ばれる。
【０１７７】
[00255] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの合成法および精製法，方法−Ｉ
[00256] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの合成は、ニトロメチレンジオキシフェノール（３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノール）とアルファリポ酸の反応により達成され、下記に模式的に示される。ニトロメチレンジオキシフェノール（ＩＮＶ−７４）の合成は、本明細書中で先に記載した。
【０１７８】
【化２３】
【０１７９】
[00257] １００ｍＬ丸底フラスコ内で、０．１７ｇ（０．００ｌｍｏｌｅ）の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノールおよび０．１ｇ（１４０μＬ）（０．２ｍｏｌｅ）のトリエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃：４７１２８３）および５０ｍＬのジクロロメタンを、室温で１０分間、十分に撹拌した。溶液は赤橙色になった。アルファリポ酸０．２５ｇ（０．００１５ｍｏｌｅ，Ｇｅｒｏｎｏｖａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）を５分間かけて添加した。それにＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃：Ｅ７７５０）０．４ｇ（０．００２ｍｏｌｅ）を１５分間かけて添加し、一夜撹拌し続けた。すべての溶媒が商業用グレードのものであり、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。他のハロゲン化溶媒を使用できることを理解すべきであり、これにはクロロホルムおよび四塩化炭素が含まれるが、これらに限定されない。他の結合剤を使用できることを理解すべきであり、これにはジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
[00258] 約３６時間の反応時間後、粗生成物を出発物質について薄層クロマトグラフィー（２０％ヘキサン：酢酸エチル溶媒系）検査して、生成物の形成および出発物質３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノールの消失を検査した。反応の完了後、ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた。粘稠な黄色素材が得られ、これを調製用薄層クロマトグラフィーにより２０％ヘキサン：酢酸エチル溶媒系で直接精製した。適宜なバンドをプレートから掻き取り、酢酸エチルで慎重に溶離した。淡黄色固体が得られ、これを結晶化法で再精製した。結晶化は９５％エタノールを用いて実施され、その操作は化合物（ＩＮＶ−７４６５）（約５０ｇ）を５分間かけて温エタノール（６０〜６５Ｃ）（約１０ｍＬ）に連続撹拌しながら添加することを伴う。化合物が完全に溶解した後、得られた溶液を速やかに濾過し、徐々に結晶化させるために一夜放置した。黄色固体を濾過し、真空乾燥器を用いて乾燥させた。全収率は４２％であった。結晶化した生成物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析した。
【０１８１】
[00259] ＮＭＲ特性分析：結晶化した化合物を高分解能プロトンＮＭＲにより特性分析し、生成物の代表的なプロトン化学シフト値は下記のとおりである：(CDCl3) : 7.59 (1H, singlet), 6.45 (1H, singlet), 6.15 (2H, singlet), 3.68-3.60 (1H, multiplet), 3.21-3.13 (2H, multiplet), 2.66-2.64 (2H, triplet), 2.52 - 2.47 (2H, multiplet), 1.97 - 1.92 (2H, multiplet), 1.84 - 1.75 (4H, multiplet), 1.74-1.58 (2H, multiplet). 図１Ｂ；
singlet：一重線，multiplet：多重線，triplet：三重線。
【０１８２】
[00260] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの合成，方法−ＩＩ
[00261] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートを合成する別法は、３，４−メチレンジオキシリポエートにニトロ基を導入することを伴い、合成スキームを下記に示す。３，４−メチレンジオキシフェニルリポエートの合成は、本明細書中でＩＮＶ−７０６５に関して先に示した。
【０１８３】
【化２４】
【０１８４】
１００ｍＬのコニカルフラスコ内で、０．３ｇ（０．００１ｍｏｌｅ）の３，４−メチレンジオキシフェニルリポエートを２０ｍＬの氷酢酸に入れ、室温で３０分間、連続撹拌し、氷冷浴で冷却した。撹拌しながら、氷酢酸１０ｍＬ中の濃硝酸（４ｍＬ）を４５分間かけて徐々に化合物混合物に添加した。反応混合物は明かるい黄色に変化し、３時間撹拌を続けた。得られた溶液を連続撹拌しながら砕き氷に直接注いだ。フラスコの底に沈降した淡黄色の半固体をジクロロメタン（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出液を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた黄色素材を調製用薄層クロマトグラフィーで精製した。最終生成物を、９５％エタノールを用いる再結晶により再精製した。この反応の全収率は３６％である。それを基準試料と比較して薄層クロマトグラフィーにより特性分析した。
【０１８５】
[00262] 実施例７
[00263] ３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（本明細書内でＯ−リポイルニトロメチレンジオキシフェノールおよびＩＮＶ ７４６５とも呼ばれる）の生物活性
[00264] ＩＮＶ ７４−６５によるｐ６５の核トランスロケーションの阻害：インビトロ細胞培養実験
[00265] 細胞培養：すべての実験を培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について実施し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内において、予め１％ゼラチンでコートした組織培養フラスコで、補充した培養培地（Ｍ１９９；１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２ｍＭのグルタミン，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，ヘパリン１２Ｉ．Ｕ．／ｍｌ，１％のレチナール誘導型増殖因子を含む，Ｓｉｇｍａ）中において、集密状態にまで増殖させた。トリプシン処理後、細胞をフラスコから剥離し、予めゼラチンコートした培養プレートにＨＵＶＥＣを接種し、次いで２４〜４８時間インキュベートして確実に集密状態にすることにより、最終単層を調製した。第４継代までの細胞をすべての実験に用いた。組換えヒトＴＮＦ−αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１８６】
[00266] ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、３つの１７ｋＤａサブユニットからなり、約５１ｋＤａの分子量をもつホモ三量体として存在する。それは、好中球、好酸球、ならびにＴおよびＢリンパ球の活性を調節し、かつ血管内皮の特性を改変する、炎症促進性、アポトーシス促進性サイトカインである。炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）に対する３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエートの生物学的役割を調べるために、インビトロ細胞培養実験を実施した。
【０１８７】
[00267] 細胞培養：すべての実験を培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について実施した；３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内において、予め１％ゼラチンでコートした組織培養フラスコで、補充した培養培地（Ｍ１９９；１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清，１００Ｕ／ｍｌのペニシリン，１００ｎｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２ｍＭのグルタミン，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，ヘパリン１２Ｉ．Ｕ．／ｍｌ，１％のレチナール誘導型増殖因子を含む，Ｓｉｇｍａ）中において、集密状態にまで増殖させたもの。トリプシン処理後、細胞をフラスコから剥離し、予めゼラチンコートした培養プレートにＨＵＶＥＣを接種し、次いで２４〜４８時間インキュベートして確実に集密状態にすることにより、最終単層を調製した。第４継代までの細胞をすべての実験に用いた。組換えヒトＴＮＦ−αをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１８８】
[00268] 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および結果：細胞表面接着分子の発現を測定するために、ＥＬＩＳＡ技術を用いた。９６ウェルプレート内の集密ＨＵＶＥＣを種々の濃度のＩＮＶ−７４６５（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭおよび１０μＭ）で２４時間、前処理した後、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激した。６時間のＴＮＦ−α刺激後、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を評価した。ＩＮＶ−７４６５でヒトＨＵＶＥＣ細胞を１２〜２４時間、前処理し、続いて２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで６時間刺激した後の培養培地のＥＬＩＳＡ分析結果は、ＶＣＡＭおよびＩＣＡＭ−１の放出の顕著な低下を示した。
【０１８９】
[00269] 試験したすべての濃度で、ＩＮＶ−７４６５は炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの作用を阻害し、これは核−対−細胞質ｐ６５染色比の低下として観察された。３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）は、有効な抗炎症作用をもち、炎症性分子ＴＮＦ−αの作用に拮抗した。
【０１９０】
[00270] 実施例８
[00271] 心血管患者の処置
[00272] 胸部中央ならびに肩、腕、首、顎および背に不快な圧迫感、締付け感および痛みを伴って、５５歳の男性が来院している。彼は、息切れおよび血圧上昇など他の症状を示す。血管造影法で評価した後、彼は冠動脈のプラーク形成を伴うアテローム硬化症に罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。別療法には、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）が含まれる。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、スタチン類、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９１】
[00273] 実施例９
[00274] 胸痛を伴う心血管患者（狭心症）の処置
[00275] 胸部中央に不快な圧迫感、締付け感および痛みを３０分未満伴う、５５歳の男性が来院している。不安定狭心症の疑いのため、彼を心臓血管造影特別室に収容した。彼は、息切れおよび不規則な心拍など他の症状を示す。血管造影法で評価した後、彼は冠動脈のプラーク形成を伴うアテローム硬化症に罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、エゼチミベ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）、リポ酸、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９２】
[00276] 実施例１０
[00277] 胸痛を伴う心血管患者（狭心症）の処置
[00278] 胸部中央に不快な圧迫感、締付け感および痛みを３０分未満伴う、５５歳の男性が来院している。不安定狭心症の疑いのため、彼を心臓血管造影特別室に収容した。彼は、息切れおよび不規則な心拍など他の症状を示す。血管造影法で評価した後、彼は冠動脈のプラーク形成を伴うアテローム硬化症に罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、エゼチミベ、リポ酸、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９３】
[00279] 実施例１１
[00280] 急性非ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う心血管患者の処置
[00281] 胸部中央ならびに肩、腕、首、顎および背に不快な圧迫感、締付け感および痛みを４時間以上伴う、５５歳の男性が来院している。彼は息切れも訴えている。彼を救急室で評価して、トロポニンＩが上昇していることが分かり、彼のＥＫＧは心筋虚血と一致した変化を立証する。彼にアスピリン、クロピドグレル、ナイトレート類および静脈内ヘパリンを投与し、カテーテル導入検査室へ収容した。血管造影法で評価した後、彼は左冠動脈前下行枝の＜９０％閉塞を生じていると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物をカテーテル導入検査室で投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９４】
[00282] 実施例１２
[00283] 急性−非ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う心血管患者の処置
[00284] 胸部中央ならびに肩、腕、首、顎および背に不快な圧迫感、締付け感および痛みを４時間以上伴う、５５歳の男性が来院している。彼は息切れも訴えている。彼を救急室で評価して、トロポニンＩが上昇していることが分かり、彼のＥＫＧは心筋虚血と一致した変化を立証する。彼にアスピリン、クロピドグレル、ナイトレート類および静脈内ヘパリンを投与し、カテーテル導入検査室へ収容した。血管造影法で評価した後、彼は左冠動脈前下行枝の＜９０％閉塞を生じていると診断された。この患者に、有効量のＩＮＶ−７５（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物をカテーテル導入検査室で投与する。患者は胸痛、息切れの改善を報告している。彼を再び血管造影法で評価して、動脈のプラーク減少が測定されている。
【０１９５】
[00285] 実施例１３
[00286] 急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う患者の処置
[00287] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を静脈内投与する。この組成物を場合により、血栓溶解薬、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼなどの療法、ならびにアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れおよび動悸の改善を報告している。
【０１９６】
[00288] 実施例１４
[00289] 急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う患者の処置
[00290] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を静脈内投与する。この組成物を場合により、血栓溶解薬、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼなどの療法、ならびにアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れおよび動悸の改善を報告している。
【０１９７】
[00291] 実施例１５
[00292] 急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を伴う患者の処置
[00293] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は急性ＳＴ上昇型心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７０６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を静脈内投与する。この組成物を場合により、血栓溶解薬、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼなどの療法、ならびにアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、および／またはヘパリン、あるいはその組合わせの投与（当業者に既知の投与量を使用）と併わせて投与する。患者は胸痛、息切れおよび動悸の改善を報告している。
【０１９８】
[00294] 実施例１６
[00295] 最近の心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00296] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、アスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、静脈内ヘパリンなどの療法を施し、カテーテル導入検査室へ収容して、そこで冠動脈のステント挿入を受けさせた。彼を１２〜２４時間回復させた。３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）による経口療法を開始し、少なくとも１年間続ける。経過観察来院中、１カ月後に、患者は症状の改善を報告している。
【０１９９】
[00297] 実施例１７
[00298] 最近の心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00299] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴う動悸を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、アスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、静脈内ヘパリンなどの療法を施し、カテーテル導入検査室へ収容して、そこで冠動脈のステント挿入を受けさせた。彼を１２〜２４時間回復させた。３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７０６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）による経口療法を開始し、少なくとも１年間続ける。経過観察来院中、１カ月後に、患者は症状の改善を報告している。
【０２００】
[00300] 実施例１８
[00301] 最近の心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00302] 典型的に左腕または首の左側へ放散する突然の胸痛、息切れ、吐き気、および嘔吐と発汗を伴って、５０歳の男性が来院している。心電図（ＥＫＧ、ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および心臓マーカーの上昇を検出するための血液検査（心筋損傷を検出するための血液検査）で評価した後、彼は心筋梗塞を罹患していると診断された。この患者に、アスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル、スタチン類、静脈内ヘパリンなどの療法を施し、カテーテル導入検査室へ収容して、そこで冠動脈のステント挿入を受けさせた。彼を１２〜２４時間回復させた。３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）による経口療法を開始し、少なくとも１年間続ける。経過観察来院中、１カ月後に、患者は症状の改善を報告している。
【０２０１】
[00303] 実施例１９
[00304] 慢性心筋梗塞を伴う患者の処置（二次予防）
[00305] １年前の心臓発作（心筋梗塞）の前歴をもつ５０歳の男性が、評価のために来院している。彼は無症状である。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。別療法には、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）が含まれる。この組成物を場合によりアスピリン、血小板凝集傾向を低下させる薬物、たとえば二硫酸クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、スタチン類、エゼチミベ、アンギオテンシン変換酵素阻害薬またはアンギオテンシン受容体遮断薬、および他の抗高血圧症薬、たとえばベータ遮断薬（当業者に既知の投与量を使用）などの療法と併わせて投与する。患者には、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールにおける追加の有益性、ならびに炎症マーカー、たとえばＣ反応性タンパク質の減少が認められる。
【０２０２】
[00306] 実施例２０
[00307] 慢性安定狭心症を伴う慢性心筋梗塞患者の処置
[00308] １０年前の心臓発作（心筋梗塞）の前歴をもつ５０歳の男性が、評価のために来院している。彼は、舌下ニトログリセリン１錠で軽減する狭心症性胸痛を訴えており、これらの痛みを慢性的に伴う。この患者に、有効量の３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）（１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を含む組成物を投与する。別療法には、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）が含まれる。患者には、投薬を２週間受けた後、この計画により胸痛における追加の有益性が認められる。
【０２０３】
[00309] 実施例２１
[00310] ヒトにおける定着したアテローム硬化症を治療するための本発明化合物の投与
[00311] 冠動脈、頚動脈または末梢動脈にプラークの証拠がある定着したアテローム硬化症を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作および卒中のリスクがあることが知られている。これらの個体を、スタチン類、および抗高血圧症薬、たとえばＡＣＥ阻害薬、利尿薬またはカルシウムチャンネル遮断薬で治療する。彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）をこれらの個体に投与する。治療期間の終了時に再びＩＶＵＳ測定を行なって、標的血管における冠動脈アテローム硬化症に対する本発明組成物の注入効果を評価する。治療後にアテローム硬化症の冠動脈においてプラークが減少し、アテローム硬化症に対するこれらの本発明化合物の有効性が立証されている。
【０２０４】
[00312] 実施例２２
[00313] ヒトにおけるアテローム硬化症を処置するための本発明化合物の投与（一次予防）
[00314] アテローム硬化症のリスク因子、たとえば家族歴、高血圧症および高コレステロール血症を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作および卒中のリスクがあることが知られている。これらの個体に、一次予防処置、たとえば脂質低下薬療法、たとえばスタチン類、アスピリン、および抗高血圧症薬、たとえばＡＣＥ阻害薬、利尿薬またはカルシウムチャンネル遮断薬を施す。彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）をこれらの個体に投与する。治療期間の終了時に再びＩＶＵＳ測定を行なって、標的血管における冠動脈アテローム硬化症に対する本発明組成物の注入効果を評価する。治療後にアテローム硬化症の冠動脈においてプラークが減少し、アテローム硬化症に対するこれらの本発明化合物の有効性が立証される。
【０２０５】
[00315] 実施例２３
[00316] ヒトにおけるアテローム硬化症の発症を予防または遅延するための本発明化合物の投与
[00317] アテローム硬化症のリスク因子が立証され、高い血漿コレステロールレベルをもつ個体の冠動脈の超音波分析（ＩＶＵＳ）、頸動脈の超音波分析（ＩＭＴ）または膝窩動脈の超音波分析を行なって、ベースライン測定値を確立する。これらの個体の一部に、許容できるキャリヤー中の本発明化合物を含む組成物を１日１回、２ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内（ｉｖ）または筋肉内（ｉｍ）に週１〜３回、約１〜６カ月の期間にわたって投与する。下記の化合物をこれらの個体に投与する：３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）。他の個体にはキャリヤーのみを投与する。処置期間の終了時に行なった新たな超音波分析は、キャリヤーを投与された個体の血管においてプラークのレベルがより高いことを示す。この例は、本発明の個々の化合物が、アテローム硬化症を発症するリスクのある個体においてアテローム硬化症を予防または軽減し、かつ冠動脈、頸動脈または膝窩動脈におけるプラーク蓄積を低下させるのに有効であることを示す。
【０２０６】
[00318] 実施例２４
[00319] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う患者を処置するための本発明化合物の投与
[00320] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作、卒中および腎疾患のリスクがある。これらの個体に予防処置、たとえば脂質低下薬療法、たとえばスタチン類、および抗高血圧症薬、たとえばＡＣＥ阻害薬を施す。彼らは既に血糖低下療法、たとえばインスリン、ＰＰＡＲγ薬、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）またはスルホニル尿素療法を受けている。彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）をこれらの個体に投与する。患者は下記の測定を受ける：血糖管理を評価するためのＨｂＡ１Ｃ、尿ミクロアルブミン尿、血圧および脂質の測定。１２カ月の処置の終了時に、ＨｂＡ１Ｃおよび尿ミクログロブリン尿が低下している。これらのいずれの処置によってもＶＬＤＬコレステロールが改善し、トリグリセリドが減少する［（３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）；３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）または３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）］。
【０２０７】
[00321] 実施例２５
[00322] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う患者において異脂肪血症を処置するための本発明化合物の投与
[00323] Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を伴う個体は、将来の心血管事象、たとえば心臓発作、卒中および腎疾患のリスクがある。これらの個体はしばしば脂質異常、たとえばトリグリセリドおよびＶＬＤＬコレステロールの増加がある。彼らを、血糖低下療法、たとえばインスリン、ＰＰＡＲγ薬、メトホルミンまたはスルホニル尿素療法と併せて、コレステロールレベル低下のための脂質低下薬療法、たとえばスタチン類およびフィブレート類（ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）またはフェノフィブレート（Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ））などで処置する。これらの処置のほかに、彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、１２カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、（３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ ７３）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ ７４）；３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）をこれらの個体に投与する。患者は、ベースラインおよび１２カ月の処置の終了時に脂質測定を受ける。１２カ月の処置の終了時には、ＶＬＤＬコレステロールが低下し、トリグリセリドが減少する。
【０２０８】
[00324] 実施例２６
[00325] 炎症性関節炎を処置するための本発明化合物の投与
[00326] リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎および全身性エリテマトーデスを伴う個体は、炎症性関節炎の再発がある。彼らは、通常は非ステロイド系薬剤、たとえばシクロオキシゲナーゼ阻害薬、抗ＴＮＦα処置および他のタイプの免疫療法で処置される。これらの処置のほかに、彼らには、許容できるキャリヤー中の許容量の本発明化合物を含む組成物をも、６カ月を超える長期間、経口投与する。ある試験では、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ ７５）をこれらの個体に投与する。患者は、関節痛、および炎症マーカー、たとえばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および赤血球沈降速度の評価を受ける。６カ月の処置終了時には、関節痛および炎症マーカーが顕著に改善されている。
【０２０９】
[00327] 前記に引用したすべての特許、刊行物および抄録の全体を本明細書に援用する。以上の記載は本発明の好ましい態様にすぎず、特許請求の範囲に定めた本発明の精神および範囲から逸脱することなく多数の改変または変更をなしうることを理解すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む化合物：
【化１】
［式中：
Ｒ１は、アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、水素、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、または異性体形フェルリルであり；
Ｒ２は、存在しないか、あるいは下記のものであり：Ｎ２Ｏ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、複素環であってイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、炭素原子１〜３個の脂肪族アミド、脂環式アミドであってピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、芳香族アミドであってアニリンおよび置換アニリンからなる群から選択されるもの、アミン、炭素原子１〜３個のアルキル化アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸であってフェルラ酸およびケイ皮酸からなる群から選択されるもの、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、またはハロゲン；
Ｒ３は、存在しないか、あるいは下記のものである：炭素原子１〜３個の直鎖アルキル基、炭素原子３〜５個の分枝鎖アルキル基、アルキル基であって下記の官能基を有するもの：遊離カルボン酸、エステルもしくはアミド、遊離ヒドロキシル誘導体もしくはアルキル化エーテル誘導体、炭素原子１〜３個のアルキル基であって下記から選択される官能基を有するもの：アミンおよびアルキル化アミン、脂肪族アミド、芳香族アミド、もしくは複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリンおよびピペラジンからなる群から選択されるもの、またはハロゲン化された基］
ただし、化合物は３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ−７３）、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ−７４）、または３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ−７５）ではない。
【請求項２】
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）：
【化２】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）：
【化３】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
【化４】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
【化５】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
【化６】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
【化７】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
【化８】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
【化９】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
【化１０】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
【化１１】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
【化１２】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
【化１３】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
【化１４】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
【化１５】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
【化１６】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
【化１７】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の化合物を含み、さらに、リポ酸、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、アセチルサリチル酸、血小板凝集の阻害薬、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害薬、チアゾリジンジオン、ナイアシン、フィブレート、凝血塊形成の阻害薬もしくはベータ遮断薬、またはその組合わせから選択される１種類以上の療法用化合物を含有する組成物。
【請求項２０】
患者において、心血管疾患、血管疾患、炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者を治療または予防する方法であって、下記を含む化合物：
【化１８】
［式中：
Ｒ１は、アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、水素、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、または異性体形フェルリルであり；
Ｒ２は、存在しないか、あるいは下記のものであり：Ｎ２Ｏ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、複素環であってイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、炭素原子１〜３個の脂肪族アミド、脂環式アミドであってピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、芳香族アミドであってアニリンおよび置換アニリンからなる群から選択されるもの、アミン、炭素原子１〜３個のアルキル化アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸であってフェルラ酸およびケイ皮酸からなる群から選択されるもの、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、またはハロゲン；
Ｒ３は、存在しないか、あるいは下記のものである：炭素原子１〜３個の直鎖アルキル基、炭素原子３〜５個の分枝鎖アルキル基、アルキル基であって下記の官能基を有するもの：遊離カルボン酸、エステルもしくはアミド、遊離ヒドロキシル誘導体もしくはアルキル化エーテル誘導体、炭素原子１〜３個のアルキル基であって下記から選択される官能基を有するもの：アミンおよびアルキル化アミン、脂肪族アミド、芳香族アミド、もしくは複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリン、およびピペラジンからなる群から選択されるもの、またはハロゲン化された基］
を医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む組成物を患者に投与し、
その際、組成物の投与により、患者において、心血管疾患、血管疾患、炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病が、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者が治療または予防される方法。
【請求項２１】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１がアセチルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１がリポイルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
化合物が
３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ−７３）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ−７４）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ−７５）、
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）または
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、リポ酸、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲアルファアゴニスト、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、アセチルサリチル酸、血小板凝集の阻害薬、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害薬、チアゾリジンジオン、ナイアシン、フィブレート、凝血塊形成の阻害薬もしくはベータ遮断薬、またはその組合わせを投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）の製造方法であって、下記の逐次工程を含む方法：
ジメチルアミノピリジンおよび３，４−メチレンジオキシフェノールとハロゲン化溶媒を窒素雰囲気下で混合して混合物を調製し；
アルファリポ酸を混合物に添加し；
結合試薬を混合物に添加し；
混合物を撹拌し；そして
ハロゲン化溶媒を除去する。
【請求項２７】
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）の製造方法であって、下記の逐次工程を含む方法：
トリエチルアミンおよび３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノールとハロゲン化溶媒を混合して混合物を調製し；
アルファリポ酸を混合物に添加し；
結合試薬を混合物に添加し；
混合物を撹拌し；そして
ハロゲン化溶媒を除去する。
【請求項２８】
さらに、３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）を精製することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）を精製することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
その必要がある対象を処置する方法であって、その処置を必要とする対象にＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの発現を調節する薬剤を心血管状態の処置に有効な量で投与し、その際、薬剤が式１の化合物を含む方法。
【請求項３１】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてＬＤＬ受容体発現を増大させるための組成物。
【請求項３２】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象において、ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγに対しては作用しない選択的様式でＰＰＡＲアルファのリガンド結合活性を増大させるための組成物。
【請求項３３】
その必要がある対象において心臓、血管、炎症、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、ならびに／あるいは異脂肪血症の症状を改善するのに十分な有効量のＩＮＶ−７５を含む食事サプリメント。
【請求項３４】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてプラークの進行速度を低下させるための組成物。
【請求項３５】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてマクロファージの浸潤を阻害するための組成物。
【請求項３６】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象において平滑筋含量を増大させるための組成物。
【請求項３７】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてＬＤＬ受容体発現の増大によりＬＤＬクリアランスを増大させるための組成物。
【請求項３８】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてアンギオテンシンＩＩによる大動脈収縮を低下させるための組成物。
【請求項３９】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてアセチルコリン依存性血管拡張を調節するための組成物。
【請求項４０】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、抗炎症組成物。
【請求項４１】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてプラーク負荷を減弱させるための組成物。
【請求項４２】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてアルファ受容体アゴニストに対する血管収縮性を低下させ、および／または血管のインスリン感受性を増大させるための組成物。
【請求項４３】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象において大動脈壁の脂質沈着を低下させるための組成物。
【請求項４４】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてトリグリセリド（ＴＧ）レベルを低下させるための組成物。
【請求項４５】
有効量の少なくとも１種類の請求項１に記載の化合物またはその薬理活性類似体を含む、抗炎症組成物。
【請求項４６】
少なくとも１種類の請求項１に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、その必要がある対象においてヒトの大動脈プラーク形成を処置するための医薬組成物。
【請求項４７】
その必要がある対象においてプラーク形成を低下させるための方法であって、有効量の少なくとも１種類の請求項１に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーを投与する段階を含む方法。
【請求項４８】
患者において、心血管疾患、血管疾患、炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者を治療または予防するために有用な医薬の調製における、下記を含む化合物の使用：
【化１９】
［式中：
Ｒ１は、アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、水素、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、または異性体形フェルリルであり；
Ｒ２は、存在しないか、あるいは下記のものであり：Ｎ２Ｏ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、複素環であってイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、炭素原子１〜３個の脂肪族アミド、脂環式アミドであってピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、芳香族アミドであってアニリンおよび置換アニリンからなる群から選択されるもの、アミン、炭素原子１〜３個のアルキル化アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸であってフェルラ酸およびケイ皮酸からなる群から選択されるもの、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、またはハロゲン；
Ｒ３は、存在しないか、あるいは下記のものである：炭素原子１〜３個の直鎖アルキル基、炭素原子３〜５個の分枝鎖アルキル基、アルキル基であって下記の官能基を有するもの：遊離カルボン酸、エステルもしくはアミド、遊離ヒドロキシル誘導体もしくはアルキル化エーテル誘導体、炭素原子１〜３個のアルキル基であって下記から選択される官能基を有するもの：アミンおよびアルキル化アミン、脂肪族アミド、芳香族アミド、もしくは複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリン、およびピペラジンからなる群から選択されるもの、またはハロゲン化された基］。
【請求項４９】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ１がアセチルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
Ｒ１がリポイルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項３４に記載の使用。
【請求項５２】
化合物が
３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ−７３）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ−７４）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ−７５）、
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）または
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）
である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５３】
さらに、１種類以上の療法用化合物を医薬に添加することを含む、請求項４８に記載の使用。
【請求項５４】
１種類以上の療法用化合物が、リポ酸、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、アセチルサリチル酸、血小板凝集の阻害薬、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害薬、チアゾリジンジオン、ナイアシン、フィブレート、凝血塊形成の阻害薬もしくはベータ遮断薬、またはその組合わせを含む、請求項５３に記載の使用。
【請求項１】
下記を含む化合物：
【化１】
［式中：
Ｒ１は、アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、水素、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、または異性体形フェルリルであり；
Ｒ２は、存在しないか、あるいは下記のものであり：Ｎ２Ｏ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、複素環であってイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、炭素原子１〜３個の脂肪族アミド、脂環式アミドであってピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、芳香族アミドであってアニリンおよび置換アニリンからなる群から選択されるもの、アミン、炭素原子１〜３個のアルキル化アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸であってフェルラ酸およびケイ皮酸からなる群から選択されるもの、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、またはハロゲン；
Ｒ３は、存在しないか、あるいは下記のものである：炭素原子１〜３個の直鎖アルキル基、炭素原子３〜５個の分枝鎖アルキル基、アルキル基であって下記の官能基を有するもの：遊離カルボン酸、エステルもしくはアミド、遊離ヒドロキシル誘導体もしくはアルキル化エーテル誘導体、炭素原子１〜３個のアルキル基であって下記から選択される官能基を有するもの：アミンおよびアルキル化アミン、脂肪族アミド、芳香族アミド、もしくは複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリンおよびピペラジンからなる群から選択されるもの、またはハロゲン化された基］
ただし、化合物は３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ−７３）、３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ−７４）、または３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ−７５）ではない。
【請求項２】
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）：
【化２】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）：
【化３】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
【化４】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
【化５】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
【化６】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
【化７】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
【化８】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
【化９】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
【化１０】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
【化１１】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
【化１２】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
【化１３】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
【化１４】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
【化１５】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
【化１６】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
【化１７】
を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の化合物を含み、さらに、リポ酸、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、アセチルサリチル酸、血小板凝集の阻害薬、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害薬、チアゾリジンジオン、ナイアシン、フィブレート、凝血塊形成の阻害薬もしくはベータ遮断薬、またはその組合わせから選択される１種類以上の療法用化合物を含有する組成物。
【請求項２０】
患者において、心血管疾患、血管疾患、炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者を治療または予防する方法であって、下記を含む化合物：
【化１８】
［式中：
Ｒ１は、アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、水素、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、または異性体形フェルリルであり；
Ｒ２は、存在しないか、あるいは下記のものであり：Ｎ２Ｏ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、複素環であってイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、炭素原子１〜３個の脂肪族アミド、脂環式アミドであってピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、芳香族アミドであってアニリンおよび置換アニリンからなる群から選択されるもの、アミン、炭素原子１〜３個のアルキル化アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸であってフェルラ酸およびケイ皮酸からなる群から選択されるもの、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、またはハロゲン；
Ｒ３は、存在しないか、あるいは下記のものである：炭素原子１〜３個の直鎖アルキル基、炭素原子３〜５個の分枝鎖アルキル基、アルキル基であって下記の官能基を有するもの：遊離カルボン酸、エステルもしくはアミド、遊離ヒドロキシル誘導体もしくはアルキル化エーテル誘導体、炭素原子１〜３個のアルキル基であって下記から選択される官能基を有するもの：アミンおよびアルキル化アミン、脂肪族アミド、芳香族アミド、もしくは複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリン、およびピペラジンからなる群から選択されるもの、またはハロゲン化された基］
を医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む組成物を患者に投与し、
その際、組成物の投与により、患者において、心血管疾患、血管疾患、炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病が、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者が治療または予防される方法。
【請求項２１】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１がアセチルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１がリポイルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
化合物が
３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ−７３）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ−７４）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ−７５）、
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）または
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、リポ酸、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲアルファアゴニスト、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、アセチルサリチル酸、血小板凝集の阻害薬、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害薬、チアゾリジンジオン、ナイアシン、フィブレート、凝血塊形成の阻害薬もしくはベータ遮断薬、またはその組合わせを投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）の製造方法であって、下記の逐次工程を含む方法：
ジメチルアミノピリジンおよび３，４−メチレンジオキシフェノールとハロゲン化溶媒を窒素雰囲気下で混合して混合物を調製し；
アルファリポ酸を混合物に添加し；
結合試薬を混合物に添加し；
混合物を撹拌し；そして
ハロゲン化溶媒を除去する。
【請求項２７】
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）の製造方法であって、下記の逐次工程を含む方法：
トリエチルアミンおよび３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェノールとハロゲン化溶媒を混合して混合物を調製し；
アルファリポ酸を混合物に添加し；
結合試薬を混合物に添加し；
混合物を撹拌し；そして
ハロゲン化溶媒を除去する。
【請求項２８】
さらに、３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）を精製することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）を精製することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
その必要がある対象を処置する方法であって、その処置を必要とする対象にＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの発現を調節する薬剤を心血管状態の処置に有効な量で投与し、その際、薬剤が式１の化合物を含む方法。
【請求項３１】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてＬＤＬ受容体発現を増大させるための組成物。
【請求項３２】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象において、ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγに対しては作用しない選択的様式でＰＰＡＲアルファのリガンド結合活性を増大させるための組成物。
【請求項３３】
その必要がある対象において心臓、血管、炎症、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、ならびに／あるいは異脂肪血症の症状を改善するのに十分な有効量のＩＮＶ−７５を含む食事サプリメント。
【請求項３４】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてプラークの進行速度を低下させるための組成物。
【請求項３５】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてマクロファージの浸潤を阻害するための組成物。
【請求項３６】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象において平滑筋含量を増大させるための組成物。
【請求項３７】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてＬＤＬ受容体発現の増大によりＬＤＬクリアランスを増大させるための組成物。
【請求項３８】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてアンギオテンシンＩＩによる大動脈収縮を低下させるための組成物。
【請求項３９】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてアセチルコリン依存性血管拡張を調節するための組成物。
【請求項４０】
有効量のＩＮＶ−７５またはその薬理活性類似体を含む、抗炎症組成物。
【請求項４１】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてプラーク負荷を減弱させるための組成物。
【請求項４２】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてアルファ受容体アゴニストに対する血管収縮性を低下させ、および／または血管のインスリン感受性を増大させるための組成物。
【請求項４３】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象において大動脈壁の脂質沈着を低下させるための組成物。
【請求項４４】
有効量の請求項３に記載の化合物（ＩＮＶ−７０６５）またはその薬理活性類似体を含む、その必要がある対象においてトリグリセリド（ＴＧ）レベルを低下させるための組成物。
【請求項４５】
有効量の少なくとも１種類の請求項１に記載の化合物またはその薬理活性類似体を含む、抗炎症組成物。
【請求項４６】
少なくとも１種類の請求項１に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、その必要がある対象においてヒトの大動脈プラーク形成を処置するための医薬組成物。
【請求項４７】
その必要がある対象においてプラーク形成を低下させるための方法であって、有効量の少なくとも１種類の請求項１に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーを投与する段階を含む方法。
【請求項４８】
患者において、心血管疾患、血管疾患、炎症性疾患、ならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病を、ならびに高血圧症、卒中、心血管疾患および腎疾患のリスクを伴う異脂肪血症患者を治療または予防するために有用な医薬の調製における、下記を含む化合物の使用：
【化１９】
［式中：
Ｒ１は、アセチル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、水素、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、または異性体形フェルリルであり；
Ｒ２は、存在しないか、あるいは下記のものであり：Ｎ２Ｏ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、炭素原子１〜８個の分枝鎖アルキル、アセチル、リポイル、ジヒドロリポイル、フェルリル、複素環であってイミダゾール、キナリン、イソキナリン、チアゾリジンジオン、ピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、カルボキシル、メチルエステル、エチルエステル、炭素原子１〜３個の脂肪族アミド、脂環式アミドであってピロリドンおよびピペリジンからなる群から選択されるもの、芳香族アミドであってアニリンおよび置換アニリンからなる群から選択されるもの、アミン、炭素原子１〜３個のアルキル化アミン、リポ酸もしくはジヒドロリポ酸を介したアミド官能基、芳香族酸であってフェルラ酸およびケイ皮酸からなる群から選択されるもの、複素環式アミドであってプロリン、置換プロリンもしくはピペコリン酸から誘導されるもの、またはハロゲン；
Ｒ３は、存在しないか、あるいは下記のものである：炭素原子１〜３個の直鎖アルキル基、炭素原子３〜５個の分枝鎖アルキル基、アルキル基であって下記の官能基を有するもの：遊離カルボン酸、エステルもしくはアミド、遊離ヒドロキシル誘導体もしくはアルキル化エーテル誘導体、炭素原子１〜３個のアルキル基であって下記から選択される官能基を有するもの：アミンおよびアルキル化アミン、脂肪族アミド、芳香族アミド、もしくは複素環式アミドであってイミダゾール、キノリン、イソキノリン、チオゾリン、およびピペラジンからなる群から選択されるもの、またはハロゲン化された基］。
【請求項４９】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ１がアセチルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
Ｒ１がリポイルであり、Ｒ２がＮ２Ｏであるかまたは存在しない、請求項３４に記載の使用。
【請求項５２】
化合物が
３，４−メチレンジオキシフェニルアセテート（ＩＮＶ−７３）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェノール（ＩＮＶ−７４）、
３，４−メチレンジオキシ−６−ニトロフェニルアセテート（ＩＮＶ−７５）、
３，４−メチレンジオキシフェニルリポエート（ＩＮＶ−７０６５）または
３，４−メチレンジオキシ ６−ニトロフェニルリポエート（ＩＮＶ−７４６５）
である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５３】
さらに、１種類以上の療法用化合物を医薬に添加することを含む、請求項４８に記載の使用。
【請求項５４】
１種類以上の療法用化合物が、リポ酸、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、脂肪取込み阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、アセチルサリチル酸、血小板凝集の阻害薬、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害薬、チアゾリジンジオン、ナイアシン、フィブレート、凝血塊形成の阻害薬もしくはベータ遮断薬、またはその組合わせを含む、請求項５３に記載の使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３１Ｄ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図８】
【図３０】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３２Ｃ】
【図３２Ｄ】
【図３２Ｅ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３１Ｄ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図８】
【図３０】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３２Ｃ】
【図３２Ｄ】
【図３２Ｅ】
【公表番号】特表２０１１−５３０５２５（Ｐ２０１１−５３０５２５Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２２２２６（Ｐ２０１１−５２２２２６）
【出願日】平成２１年８月５日（２００９．８．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２８９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７３２３
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５１０１４９４６０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (10)
【出願人】（５１１０３３０３６）インバスク・セラピューティック・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月５日（２００９．８．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２８９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７３２３
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５１０１４９４６０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (10)
【出願人】（５１１０３３０３６）インバスク・セラピューティック・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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