新規なワクチン
【課題】皮内経路を介して有効なインフルエンザワクチンを提供する。
【解決手段】真皮への針の侵入を約１．５ｍｍの深さに効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する皮内短針送達デバイス、および、三価非生インフルエンザ抗原調製物を用いて製造され、ヒト集団において３つのインフルエンザ株の全てに対する防御免疫応答を誘導することができる単回用量インフルエンザワクチンを含む、皮内送達用のワクチンキット。
【解決手段】真皮への針の侵入を約１．５ｍｍの深さに効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する皮内短針送達デバイス、および、三価非生インフルエンザ抗原調製物を用いて製造され、ヒト集団において３つのインフルエンザ株の全てに対する防御免疫応答を誘導することができる単回用量インフルエンザワクチンを含む、皮内送達用のワクチンキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮内送達用のインフルエンザワクチン製剤、その調製方法、および予防または治療におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、単回用量で皮内投与することにより法的規制を満たすのに十分な免疫応答を達成することが可能なインフルエンザワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も遍在的なウイルスの１つであり、ヒトと家畜の両方に影響を及ぼす。インフルエンザの経済的影響は顕著である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、直径約１２５ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスである。それは、基本的には、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。表面糖タンパク質のノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）は、粒子の表面で長さ１０〜１２ｎｍのスパイクのように見える。インフルエンザのサブタイプの抗原特異性を確定するのは、これらの表面タンパク質、とくにヘマグルチニンである。
【０００４】
典型的なインフルエンザ流行病は、入院率または死亡率の増加により立証されるように、肺炎または下気道疾患の発生率の増加を引き起こす。高齢者または根源的慢性疾患を有する者は、そのような合併症にかなり罹患し易いと考えられるが、乳児もまた重篤な疾患にかかる可能性がある。したがって、これらの人々をとくに防御する必要がある。
【０００５】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチンまたは生の弱毒化インフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、３つのタイプの抗原調製物、すなわち、不活化全ウイルス、脂質エンベロープを可溶化させるように精製ウイルス粒子が界面活性剤もしくは他の試薬で分割されたサブビリオン（いわゆる「ウイルス成分」ワクチン；split vaccine）、または精製ＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）のうちの１つを含む。これらの不活化ワクチンは、一般的には、筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与される。
【０００６】
インフルエンザワクチンは、いずれのタイプであっても、通常は三価ワクチンである。それらは、一般的には、２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型株に由来する抗原を含有する。ほとんどの場合、標準的な０．５ｍｌ注射用量には、単純放射状免疫拡散法（ＳＲＤ）により測定したときに各株に由来する１５μｇのヘマグルチニン抗原成分が含まれる（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：インフルエンザヘマグルチニン抗原をアッセイするための改良された単純放射状免疫拡散法：不活化全ウイルスおよびサブユニットワクチンの効力決定のための適応化（An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines）J. Biol. Stand. 5(1977)237-247；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：インフルエンザウイルスのヘマグルチニン抗原をアッセイするための免疫電気泳動法および単純放射状拡散法に関する国際的共同研究（International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis technique for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus）J. Biol. Stand. 9(1981)317-330）。
【０００７】
汎流行性インフルエンザ株が発生した場合のような特定の状況では、その単一株だけを含有するワクチンを得ることが望ましいこともある。これは汎流行状況への対処を速めるうえで役立つであろう。
【０００８】
各シーズンにインフルエンザワクチンに組入れられるインフルエンザウイルス株は、国立保健機関およびワクチン製造業者と共同して世界保健機構により決定される。
【０００９】
インフルエンザの毎年の流行に関連した罹患率および死亡率を抑えようとする現在の取組みは、筋肉内投与される不活化インフルエンザワクチンの使用に基づいている。呼吸器疾患およびインフルエンザ合併症を防止するそのようなワクチンの効力は、健常成人の場合の７５％から高齢者の場合の５０％未満までの範囲にわたる。
【００１０】
インフルエンザワクチンの代替投与法、とくに、痛みがないかまたは筋肉内注射よりも痛みが少なくかつ「針恐怖」に起因して患者のコンプライアンスにマイナスの影響を及ぼすことのない方法を提供することが望ましいであろう。また、たとえば、皮膚（とくに真皮）に存在する樹状細胞およびランゲルハンス細胞に抗原をターゲッティングすることにより、細胞媒介性免疫系を標的にすることも望ましいであろう。細胞媒介性免疫は、ウイルスのクリアランスおよび疾病からの回復を支援するように思われ、抗体間よりもインフルエンザ株間で良好な干渉効果をもたらす可能性がある。皮内投与により粘膜免疫が粘膜表面のレベルで誘発される可能性があることも、文献に記載されている。これは、ウイルスの侵入口が経鼻経路につながるインフルエンザのような病原体に対するワクチンの非経口経路と比較して利点がある。かくして、粘膜表面、初期では上気道の粘膜表面が、防御の最前線となる。
【００１１】
さらに、インフルエンザワクチンの用量に必要な抗原の量を減らすことも望ましいであろう。インフルエンザワクチンは、供給不足になることが多いからである。
【００１２】
ヒトに不活化インフルエンザワクチンが実験的に皮内投与されたのは、１９４０年代が最初である。皮内ワクチン接種の利点は長期にわたり認識されてきたが、現在までのところ、皮内経路を介する規則的なワクチン接種がインフルエンザに有効でありかつ実行可能であるという一致した見解は得られていない。
【００１３】
Crowe (1965) Am J Medical Technology 31,387-396には、インフルエンザウイルス成分ワクチンを用いて皮内ワクチン接種と皮下ワクチン接種とを比較する研究が記載されている。１４日間隔で０．１ｍｌのワクチンを皮内に２回投与した。皮内送達で得られた結果は、１回投与後および２回投与後のいずれについても、試験した３種の株のうちの２種に対して設定された基準を満たさなかった。
【００１４】
McElroy (1969) New Eng J of Medicine, 6 November, page 1076には、皮内への一価Ａ型株ワクチンの２回投与についての記載があり、ワクチンが不足した場合、たとえば、新しい予想外の株が発生した場合には、皮内経路が検討対象になりうるとの提案がなされている。
【００１５】
Taurasoら(1969) Bull Wld Hlth Org 41,507-516には、皮下（０．２５ｍｌもしくは０．５ｍｌ）または皮内（０．１ｍｌ）に投与される一価全不活化インフルエンザワクチンを用いる研究が記載されている。追加免疫接種が行われている。その結果から、皮内送達は皮下送達の適切な代替経路になることが示唆されるが、著者は、２回投与が必要であるとの提案を行っている。
【００１６】
Foy (1970) letter to JAMA, 6/7/70, vol 213 page 130には、天然免疫感作下で皮内投与されるインフルエンザワクチンを試験する実験について論じられている。３〜４週間間隔でワクチンを２回接種した。見かけ上、皮内ワクチン接種により病気が予防されることがデータから示唆されたが、決定的なものではなかった。
【００１７】
letter to the British Medical Journal, 29/10/77 page 1152には、ジェットガンを用いて０．１５ｍｌの一価インフルエンザワクチンを皮内送達する実験が記載されているが、結果は好ましくなかった。皮内投与を行うにはさらなる研究が必要であると記載されている。
【００１８】
他の著者は、皮下注射のときと同様に皮内注射には漏れのリスクがあることを指摘した。しかしながら、皮内投与に使用されるワクチンの体積は小さいので、漏れを生じると、ほとんどまたはまったく防御されない可能性がある。
【００１９】
Brooksら(1977) Annals of Allergy 39, 110-112には、２種のＡ型株（それぞれ４０ＣＣＡ単位）および別にＢ型株（１００ＣＣＡ単位）を含有する死滅インフルエンザワクチンを０．１ｍｌ容量で皮内投与する研究が記載されている。皮内経路は免疫感作に利用可能かつ有効であるが、ある種の株では皮内投与しうる用量よりも多くの量が必要になることもあると著者は結論付けている。
【００２０】
Brownら(1977) J Infectious Disease 136, 466-471には、ホルマリン不活化全一価インフルエンザＡ型株ワクチンの皮内投与についての記載がある。４０ＣＣＡが０．１ｍｌの容量で使用された。これが０．５ｍｌ（２００ＣＣＡ）の筋肉内投与と比較された。皮内ワクチン接種に対する応答は、年齢依存性であり、すでに抗体が存在するときは筋肉内ワクチン接種よりも低いことが見いだされた。この研究で使用したワクチン接種量では、皮内ワクチン接種は特殊な状況下でのみ使用すべきであるというのが結論であった。
【００２１】
Halperinら(1979) AJPH 89,1247-1252には、二価ウイルス成分ワクチンを用いるインフルエンザワクチン接種の皮内経路と皮下経路との比較についての記載がある。４０ＣＣＡの各株を含有する０．１ｍｌのワクチンが皮内ワクチン接種に使用された。
【００２２】
HerbertおよびLarke (1979) J Infectious Diseases 140, 234-238には、二価全ウイルスワクチンを用いる皮内および皮下インフルエンザワクチン接種の比較についての記載がある。ワクチン株にほとんどまたはまったく暴露されていない場合に、皮内経路は皮下経路ほど有効ではないことが見いだされた。また、著者の観測によれば、反応原性に関して、皮内接種量中の抗原量を減少させても利点は見られない。なぜなら、より高用量の皮下免疫感作により生じるワクチンの副作用を減少させるとは考えられなかった。
【００２３】
Bader (1980) letter to AJPH, vol. 70 no. 5には、インフルエンザワクチンの皮内送達による種々の試みの結果が論じられており、２週間間隔で２回投与した場合には、皮内送達の潜在的価値がみとめられる。
【００２４】
Niculescuら(1981) Arch Roum Path Exp Microbiol, 40, 67-70には、「ガンジェット注射器」を用いるウイルス成分三価ワクチンの皮内投与についての記載がある。１ヵ月間隔で２回投与された。この投与方法を用いると、インフルエンザの流行時に疾患率を低下させることができると著者は結論している。
【００２５】
したがって、文献によれば、６０年代半ば（またはそれ以前）〜１９８０年代初めに皮内ワクチン接種に関心が払われた。しかしながら、ワクチンの２回投与が必要であるという考えが有力であるようにみえる。また、投与が難しく、小容量のワクチンを所望の領域に良好に局在化できる見込みがなかったので、たとえば、広範な流行に対処すべく、迅速かつ大量にワクチン接種が必要とされる場合のみ、皮内送達経路の使用が検討対象となるという考えが広く普及していた。興味深いことに、８０年代初期においては皮内インフルエンザワクチン接種が文献に記載されることがほとんどなかった。８０年代初め以来、文献には、タンパク質抗原法を用いる皮内インフルエンザワクチン接種についての言及がほとんどなされていない。タンパク質を用いる取組みは、興味の対象にならなくなったように見える。その代わりに、ＤＮＡワクチン接種が注目されるようになった。Webster R.G. (1999) Clin Infect Dis, 28, 225-229に記載のレビュー、およびDeganoら(1999) Vaccine 18,623-32；Haenslerら(1999) Vaccine 17, 628-638；Deganoら(1998) Vaccine 16, 394-398のような刊行物を参照されたい。
【００２６】
したがって、市販のインフルエンザワクチンは、依然として、筋肉内投与されるウイルス成分またはサブユニット筋肉内投与用ワクチンである。これらのワクチンは、一般的には有機溶媒または界面活性剤を用いて、ウイルス粒子を分割し、さまざまな程度までウイルスタンパク質を分離または精製することにより調製される。ウイルス成分ワクチンは、可溶化濃度の有機溶媒または界面活性剤を用いて感染性または不活化全インフルエンザウイルスを断片化してから、可溶化剤といくつかのまたはほとんどのウイルス脂質物質を除去することにより、調製される。ウイルス成分ワクチンは、一般的には、夾雑マトリックスタンパク質および核タンパク質ならびに時として脂質や膜エンベロープタンパク質を含有する。ウイルス成分ワクチンは、通常、ウイルス構造タンパク質のほとんどまたはすべてを含有するであろうが、全ウイルスで見られる比率と必ずしも同じ比率で含有するわけではない。一方、サブユニットワクチンは、本質的には、高精製ウイルス表面タンパク質、ヘマグルチニン、およびノイラミニダーゼからなり、これらのタンパク質は、ワクチン接種時に所望のウイルス中和抗体を誘導する働きを担う表面タンパク質である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
インフルエンザワクチンの効力を測定するための基準が国際的に適用される。インフルエンザに有効なワクチンに関する欧州連合公式判定基準を以下の表に示す。理論的には、欧州連合要件を満たすためには、インフルエンザワクチンは、ワクチン中に含まれるインフルエンザ株すべてについて、表中の判定基準のうちの１つだけは満たさねばならない。しかしながら、実際上、とくに、新しいワクチン、たとえば、新しい皮内ワクチンについては、少なくとも２つまたはより一般的には３つすべての判定基準が全株で満たされる必要があろう。いくつかの状況下では、２つの判定基準で十分なこともある。たとえば、３つの判定基準のうちの２つはすべての株で満たされることが、第３の判定基準は、すべてではなくいくつかの株（たとえば、３種の株のうちの２種）で満たされる場合が許容されることもある。要件は、成人集団（１８〜６０歳）と高齢者集団（＞６０歳）とでは異なる。
【００２８】
＊ セロコンバージョン率は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）と定義される
＊＊ コンバージョン係数は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ＨＩ幾何平均力価（ＧＭＴ）の増加倍率と定義される
＊＊＊ 防御率は、（各ワクチン株について）ワクチン接種後に１：４０に等しいかまたはそれよりも大きい血清ＨＩ力価を有するワクチン被接種者の割合（％）と定義され、防御を示すものとして一般に認められている。
【００２９】
皮内インフルエンザワクチンを商業的に有用なものとするには、これらの基準を満たすことが必要なだけでなく、実際に、現在利用可能な皮内ワクチンと少なくとも同程度に有効である必要があろう。許容しうる方法で製造される必要もあり、もちろん所要の抗原量および投与回数に関して商業的に利用可能であることも必要であろう。さらに、医療スタッフが確実かつ簡単に実施しうる手順を用いて投与される必要もあろう。
【００３０】
不活化ウイルスをベースとした皮内インフルエンザワクチンについてこれまでに研究はなされたが、現在のところ皮内インフルエンザワクチンが市場に出荷されていないという事実は、この経路を介して有効なワクチン接種を行うことが困難であることを示している。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明においては、特定の三価インフルエンザワクチンがとりわけ良好な市販用皮内ワクチンとなることを見いだした。とくに、そのようなインフルエンザウイルスワクチン調製物の単回皮内投与を行うと、低用量の抗原でかつ防御レベルで全身的免疫が刺激される。さらに、有効なインフルエンザワクチンに対する国際的判定基準が満たされる。より特定的には、低抗原用量ワクチンの皮内投与により、同一ワクチンの皮下投与により得られるものと等価な全身的セロコンバージョン（抗ＨＡ力価の４倍増加）を得ることができる。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「皮内送達」という用語は、皮膚の真皮へのワクチンの送達を意味する。しかしながら、ワクチンは、必ずしも真皮だけに局在するわけではないであろう。真皮は、ヒト皮膚の表面から約１．０〜約２．０ｍｍの位置にある皮膚の層であるが、個体間でいくらか差異が見られ、身体の部位によっても異なる。一般的には、皮膚の表面下１．５ｍｍの位置であれば、真皮に達すると予想することができる。真皮は、表面の角質層および表皮と、その下の皮下層との間に位置する。送達形態に依存して、ワクチンは、最終的に真皮内だけにもしくは主に真皮内に位置するか、または表皮内および真皮内に最終的に分布する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】株特異的ＥＬＩＳＡの読取値を用いた免疫原性試験から得られた結果を示す。
【００３４】
グループ１：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＭ １５μｇ ＨＡ
グループ２：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＤ ３μｇ ＨＡ
グループ３：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；ＰＢＳ ＩＤ
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、第１の態様において、皮内送達用の単回用量インフルエンザワクチンの製造における三価の非生インフルエンザ抗原調製物の使用を提供する。インフルエンザ抗原調製物は、本明細書に記載の特定の方法を含む種々の既知の方法に従って作製可能である。好ましくは、該非生抗原調製物は、生ウイルスから調製したインフルエンザウイルス成分調製物またはサブユニット抗原調製物である。最も好ましくは、該抗原は、ウイルス成分調製物である。
【００３６】
本発明に係る三価ワクチンは、先に本明細書に記載したように、インフルエンザワクチンのＥＵ判定基準の一部分または全部を満たすので、ワクチンはヨーロッパの市場において認可されうる。好ましくは、ワクチン中に提供されるインフルエンザ株はすべて、３つのＥＵ判定基準のうちの少なくとも２つを満たす。より好ましくは、すべての株が少なくとも２つの判定基準を満たし、かつすべての株またはすべてではないが少なくとも１種の株が第３の判定基準を満たす。最も好ましくは、存在するすべての株が３つの判定基準すべてを満たす。
【００３７】
好ましくは、本明細書に記載する皮内ワクチンは、以下からなる群より選択されうる少なくとも１種の非イオン性サーファクタントを含有する：すなわち、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（たとえば、市販品のＴｒｉｔｏｎＴＭシリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＴｗｅｅｎＴＭシリーズ）、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ） ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
〔式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。〕
で示されるポリオキシエチレンエーテルまたはエステル、ならびにこれらのうちの２種以上の組み合わせ。
【００３８】
オクチルフェノキシポリオキシエタノール類およびポリオキシエチレンソルビタンエステル類の各々から１種を組み合わせた２種の非イオン性サーファクタント、特にＴｗｅｅｎ８０とＴｒｉｔｏｎＸ−１００との組み合わせが好ましい。可能でかつ好ましい界面活性剤の組み合わせについてさらに以下に説明する。
【００３９】
本発明に係るワクチンは、従来のワクチンよりも少量のヘマグルチニンを有し、かつより少ない容量で投与される。好ましくは、インフルエンザ１株あたりのヘマグルチニンの量は、約１〜７．５μｇまたは１〜５μｇ、より好ましくは約３μｇまたは約５μｇであり、これは、それぞれ、筋肉内投与用の従来のワクチンで使用されるヘマグルチニンの用量の約１／５または１／３である。インフルエンザ１株あたり６μｇのヘマグルチニンもまたきわめて好ましく、したがって、２〜６．５μｇもまた好ましい範囲である。
【００４０】
好ましくは、本発明に係るワクチンの１用量の容量は、０．０２５ｍｌ〜２．５ｍｌ、より好ましくは約０．１ｍｌまたは約０．２ｍｌである。５０μｌの投与量もまた検討対象になりうる。０．１ｍｌ用量は、従来の筋肉内インフルエンザワクチン用量の容量の約１／５である。皮内に投与することのできる液体の容量は、部分的には、注射の部位に依存する。たとえば、三角筋部への注射では、０．１ｍｌが最大の好ましい容量であるが、腰部では、大量に、たとえば約０．２ｍｌを投与することができる。
【００４１】
本発明において使用するための好適な非生インフルエンザ抗原調製物としては、以下の方法により取得可能なインフルエンザ抗原調製物が挙げられる：
（ｉ） 培養物からのウイルス含有物質の採取；
（ｉｉ） 採取した物質の清澄化による非ウイルス物質の除去；
（ｉｉｉ） 採取したウイルスの濃縮；
（ｉｖ） 非ウイルス物質から全ウイルスを分離するさらなるステップ；
（ｖ） 密度勾配遠心ステップにおける好適な分割剤を用いた全ウイルスの分割；
（ｖｉ） 濾過による望ましくない物質の除去；
ここで、上記ステップは、記載順に行われるが、必ずしも連続的である必要はない。
【００４２】
好ましくは、ウイルスは、卵を用いて、より具体的には発育鶏卵を用いて増殖させる。その場合、採取する物質は尿膜液である。
【００４３】
好ましくは、中速度の遠心により清澄化ステップを行う。他の選択肢として、たとえば０．２μｍ膜を用いて、濾過ステップを実施してもよい。清澄化ステップでは、培養物に由来する物質、たとえば、卵に由来する物質の大部分を取り除く。
【００４４】
好ましくは、濃縮ステップでは、吸着法を利用し、最も好ましくはＣａＨＰＯ４を用いる。あるいは、例えば限外濾過などの濾過を使用してもよい。
【００４５】
好ましくは、さらなる分離ステップ（ｉｖ）は、ゾーン遠心分離、とくに、スクロース勾配を用いるゾーン遠心分離である。場合により、勾配には、微生物の増殖を防止するための保存剤が含まれる。
【００４６】
好ましくは、分割ステップは、分割剤を含有するさらなるスクロース勾配で行う。
【００４７】
好ましくは、濾過ステップ（ｖｉ）は、ウイルス成分物質を濃縮する限外濾過ステップである。
【００４８】
好ましくは、少なくとも１ステップの滅菌濾過ステップが、場合により上記方法の最後に、存在する。
【００４９】
場合により、最終濾過ステップの前に、不活化ステップが存在する。
【００５０】
好ましくは、本発明に係るワクチンは、皮膚の表面下約１．０〜２．０ｍｍの位置に投与される。より好ましくは、ワクチンは、皮膚の表面下約１．５ｍｍの位置に送達される。
【００５１】
本発明に係るワクチンは、粒子を含むビリオン成分ワクチンである。動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ）を用いて測定した場合、ワクチンは、好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは５０〜１８０ｎｍ、最も好ましくは１００〜１５０ｎｍの平均粒子径を有する粒子を含有する。粒径は、株に依存して、季節ごとに種々の値をとる可能性がある。
【００５２】
本発明において式（Ｉ）の範囲内の好ましいサーファクタントは、ｎが４〜２４、より好ましくは６〜１２、最も好ましくは９であり、Ｒ成分がＣ１〜５０アルキル、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルである分子である。
【００５３】
オクチルフェノキシポリオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、「Surfactant systems」AttwoodおよびFlorence編（1983, ChapmanおよびHall）に記載されている。また、オクチルフェノキシポリオキシエタノール（オクトキシノール類）、たとえばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ）は、Merck Index Entry 6858（第1162頁、第１２版、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）は、Merck Index Entry 7742（第1308頁、第１２版、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。いずれも、上記文献に記載されている方法を用いて製造可能であるかまたはＳｉｇｍａ Ｉｎｃ．などの供給業者から購入可能である。
【００５４】
とくに好ましい非イオン性サーファクタントとしては、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５、ＴｒｉｔｏｎＸ−２０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、ＴｒｉｔｏｎＮ−５７、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＮ−１２８、Ｂｒｅｉｊ３５、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびラウレス９がとくに好ましい。同様にとくに好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）である。
【００５５】
一般式（Ｉ）で示されるさらに適切なポリオキシエチレンエーテルは、次の群から選択される：ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００５６】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに対して用いられる他の用語または名称は、ＣＡＳレジストリーに開示されている。ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルのＣＡＳレジストリー番号は９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテル類は、Merck Index（第１２版：entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより生成され、平均で９個のエチレンオキシド単位を有する。
【００５７】
サーファクタントにおけるポリオキシエチレン部分の長さとアルキル鎖の長さとの比（すなわち、ｎ：アルキル鎖長の比）は、水性媒質中へのこの種のサーファクタントの溶解度に影響を及ぼす。したがって、本発明に係るサーファクタントは、溶解状態で存在するかまたはミセルもしくは小胞のような粒状構造を形成してもよい。溶液であれば、本発明に係るサーファクタントは、安全で、滅菌が容易で、簡単に投与でき、しかも均一粒状構造の形成に伴うＧＭＰおよびＱＣ問題を生じることなく簡単に製造することが可能である。ラウレス９のようないくつかのポリオキシエチレンエーテル類は、非小胞型溶液を生成する可能性がある。しかしながら、ポリオキシエチレン−８パルミトイルエーテル（Ｃ１８Ｅ８）は、小胞を形成しうる。したがって、少なくとも１種の他の非イオン性サーファクタントと組み合わせたポリオキシエチレン−８パルミトイルエーテルの小胞を、本発明の製剤に利用することができる。
【００５８】
好ましくは、本発明の製剤に用いられるポリオキシエチレンエーテルは、溶血活性を有する。ポリオキシエチレンエーテルの溶血活性は、以下のアッセイを参照してｉｎ ｖｉｔｒｏで測定が可能であり、赤血球の溶解を引き起こさないサーファクタントの最高濃度として表される：
１． モルモットから得た新鮮な血液を卓上遠心機においてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄する。もとの容量に再懸濁させた後、血液をＰＢＳでさらに１０倍希釈する
２． この血液懸濁液５０μｌを、２倍希釈の界面活性剤を含有する８００μｌのＰＢＳに添加する
３． ８時間後、目視観測によりまたは上清の光学濃度を測定することにより、溶血を評価する。５７０ｎｍで光を吸収する赤色の上清が存在すれば、溶血を生じたことになる
４． 結果は、もはや溶血を生じない最初の界面活性剤希釈液の濃度で表される。
【００５９】
このような生物学的アッセイに固有の実験的変動の範囲内で、本発明のポリオキシエチレンエーテルまたは一般式（Ｉ）で示されるサーファクタントは、約０．５〜０．０００１％、より好ましくは０．０５〜０．０００１％、さらに好ましくは０．００５〜０．０００１％、最も好ましくは０．００３〜０．０００４％の溶血活性を有する。理想的には、該ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルは、ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルまたはポリオキシエチレン−８ステアリルエーテルの場合と類似した溶血活性（すなわち、１０倍以内の差）を有するものでなければならない。
【００６０】
上記サーファクタントの異なるグループに属する２種以上の非イオン性サーファクタントが、本明細書に記載のワクチン製剤中に存在していてもよい。とくに、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ＴＭのようなオクトキシノールとの組合せが好ましい。非イオン性サーファクタントのこのほかのとくに好ましい組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルもしくはオクトキシノールまたはその両方を含む。
【００６１】
好ましくは、このまたはそれぞれの非イオン性サーファクタントは、０．００１％〜２０％、より好ましくは０．０１〜１０％、最も好ましくは約２％（ｗ／ｖ）までの濃度で最終ワクチン製剤中に存在する。１種または２種のサーファクタントが存在する場合には、これらは一般的にはそれぞれ約２％まで、典型的にはそれぞれ約０．６％までの濃度で最終製剤中に存在する。１種以上の追加のサーファクタントは、一般的にはそれぞれ約１％の濃度まで、典型的にはそれぞれ約０．２％または０．１％までの極微量で存在しうる。サーファクタントの任意の混合物が、本発明のワクチン製剤中に存在し得る。
【００６２】
以上に記載したような非イオン性サーファクタントは、最終ワクチン組成物中で次のような好ましい濃度を有する：ポリオキシエチレンソルビタンエステル、たとえばＴｗｅｅｎ８０ＴＭ：０．０１〜１％、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール、たとえばＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤：０．００１〜０．１％、最も好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）；一般式（Ｉ）で示されるポリオキシエチレンエーテル、たとえばラウレス９：０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％または約０．５％（ｗ／ｖ）。
【００６３】
他の試薬が製剤中に存在していてもよい。そのようなものとして、本発明の製剤は、胆汁酸またはその誘導体を、とくに塩の形態で含有しうる。これらの例としては、コール酸の誘導体およびその塩、とくに、コール酸またはコール酸誘導体のナトリウム塩が挙げられる。胆汁酸およびその誘導体の例としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および誘導体、たとえば、該胆汁酸のグリコ誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸誘導体、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコラミドが挙げられる。とくに好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在しうるデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００６４】
本発明に係るワクチン製剤は、好ましくは、１種以上の非イオン性サーファクタントと組み合わせてインフルエンザウイルス成分調製物を含む。１種以上の非イオン性サーファクタントは、インフルエンザウイルス成分抗原調製物を作製する方法からの残留物であってもよく、かつ／または抗原調製物に後で添加したものであってもよい。このまたはそれぞれの非イオン性サーファクタントの濃度は、分割／精製のプロセスの最後に所望のレベルになるように調整することが可能である。インフルエンザウイルス成分抗原物質は非イオン性サーファクタントの存在下で安定化されうると考えられるが、当然のことながら、本発明は、この考え方が常に成立するか否かに依存しない。
【００６５】
本発明に係るワクチンは、アジュバントまたは免疫刺激剤、たとえば、任意の起源の解毒リピドＡおよびリピドＡの無毒誘導体、サポニンおよびＴＨ１型応答を刺激することのできる他の試薬を含有しうるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）が免疫系に対する強力な刺激剤であることはかなり前から知られていたが、毒性作用があるため、アジュバントに使用されることはなかった。還元末端グルコサミンからコア炭水化物基およびホスフェートを除去することにより生成された無毒のＬＰＳ誘導体モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）については、Ｒｉｂｉら（1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）により報告されており、次の構造を有する：
【化１】
【００６７】
ＭＰＬのさらなる解毒体は、二糖主鎖の３位からアシル鎖を除去することにより得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる。ＧＢ２１２２２０４号Ｂに教示されている方法により、それを精製および調製することができる。この文献には、ジホスホリルリピドＡおよびその３−Ｏ−脱アシル化体の調製についても開示されている。
【００６８】
３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小さい粒径を有するエマルジョンの形態であり、その製造方法については、ＷＯ９４／２１２９２号に開示されている。モノホスホリルリピドＡとサーファクタントとを含む水性製剤については、Ｗ０９８４３６７０号Ａ２に記載されている。
【００６９】
本発明の組成物中に製剤化される細菌リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製および処理されたものであってもよいし、あるいは合成されたものであってもよい。たとえば、精製モノホスホリルリピドＡについては、Ｒｉｂｉら、１９８６（前掲）に記載されており、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．に由来する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡについては、ＧＢ２２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖についても報告されている（Hilgersら, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6；Hilgersら, 1987, Immunology, 60(1): 141-6；およびＥＰ０５４９０７４号Ｂ１）。とくに好ましい細菌リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００７０】
したがって、本発明に使用しうるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬに構造が類似している免疫刺激剤である。本発明の他の態様において、ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの上記構造の一部分であるアシル化単糖であってもよい。
【００７１】
サポニンについては、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H.（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）に教示されている。サポニンは、植物界および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペンのグリコシドである。サポニンは、水に添加するとコロイド溶液を形成し、それを振盪させると泡立つこと、およびコレステロールを沈澱させることで知られている。サポニンが細胞膜近傍に存在すると、細胞膜中に細孔状構造が形成され、細胞膜が破壊される。赤血球の溶血は、この現象の一例である。この現象は、すべてではなくある特定のサポニンの性質である。
【００７２】
サポニンは、全身投与に供されるワクチンのアジュバントとして知られる。アジュバントおよび個々のサポニンの溶血活性については、当技術分野で広く研究されてきた（Lacaille-DuboisおよびWagner、前掲）。たとえば、Ｑｕｉｌ Ａ（南アメリカの木キラハ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する）およびその画分については、米国特許５，０５７，５４０号および「Saponins as vaccine adjuvants」, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12 (1-2): 1-55およびＥＰ０３６２２７９号Ｂ１に記載されている。Ｑｕｉｌ Ａの一部分を含む、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒状構造体は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されてきた（Morein, B., ＥＰ０１０９９４２号Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１号；ＷＯ９６／３３７３９号）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９号Ｂ１中に開示されている。全身性ワクチン接種の研究で使用された他のサポニンとしては、ジプソフィリア（Gypsophila）およびサポナリア（Saponaria）のような他の植物種に由来するサポニンが挙げられる（Bomfordら, Vaccine, 10(9): 572-577, 1992）。
【００７３】
強化された系には、無毒のリピドＡ誘導体とサポニン誘導体との組合せ、とくに、ＷＯ９４／００１５３号に開示されているようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９号に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされているそれほど反応原性のない組成物が含まれる。
【００７４】
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを含むとくに強力なアジュバント製剤については、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されている。これは好ましい製剤である。
【００７５】
したがって、本発明の一実施形態では、解毒されたリピドＡまたはリピドＡの無毒の誘導体をアジュバント添加した、より好ましくはモノホスホリルリピドＡまたはその誘導体をアジュバント添加した本発明のインフルエンザ抗原調製物を含むワクチンが提供される。
【００７６】
好ましくは、ワクチンはさらに、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。
【００７７】
好ましくは、製剤はさらに、水中油型エマルジョンを含む。本発明はまた、３Ｄ−ＭＰＬのような製薬上許容される賦形剤と共に本発明の抗原調製物を混合することを含むワクチン製剤の製造方法を提供する。
【００７８】
本発明に係るアジュバント添加ワクチン製剤中に存在する追加の成分としては、好ましくは非イオン性界面活性剤、たとえば、本明細書に記載されているようなオクトキシノール類およびポリオキシエチレンエステル類、とくに、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）；ならびに本明細書に記載されているような胆汁酸塩またはコール酸誘導体、とくに、デオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。したがって、とくに好ましい製剤は、皮内投与に好適なワクチンを提供すべくインフルエンザウイルス抗原調製物と併用しうる３Ｄ−ＭＰＬ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、およびデオキシコール酸ナトリウムを含む。
【００７９】
本発明の好ましい一実施形態では、皮内インフルエンザワクチンには、小胞アジュバント製剤が含まれる。これに関連して、好ましいアジュバント製剤には、好ましくはジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有するコレステロール含有単ラメラ小胞が含まれる。この場合、サポニンおよびＬＰＳ誘導体は、脂質二重層と会合しているかまたはその内部に包埋されている。より好ましくは、これらのアジュバント製剤には、サポニンとしてＱＳ２１およびＬＰＳ誘導体として３Ｄ−ＭＰＬが含まれ、ＱＳ２１：コレステロールの比は、１：１〜１：１００重量／重量、最も好ましくは１：５重量／重量である。そのようなアジュバント製剤は、ＥＰ０８２２８３１号Ｂに記載されている。該特許の開示内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００８０】
本発明はまた、被験者においてインフルエンザの感染または疾患を予防するための方法を提供する。該方法には、本発明に係るインフルエンザウイルス成分ワクチンを被験者に皮内投与することが含まれる。
【００８１】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載されているように皮内投与デバイスとワクチン製剤とを含む医薬用キットを提供する。デバイスは、好ましくは、ワクチンがすでに充填された形で供給される。好ましくは、ワクチンは、本明細書に記載されているように、従来の筋肉内ワクチンの場合よりも小さい液体容量、とくに約０．０５ｍｌ〜０．２ｍｌの容量である。好ましくは、デバイスは、真皮にワクチンを投与するための短針送達デバイスである。
【００８２】
本明細書に記載の皮内ワクチンを使用するのに好適なデバイスとしては、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているような短針デバイスが挙げられる。参照により本明細書に組み入れられるものとするＷＯ９９／３４８５０号に記載されているように皮膚中への針の有効侵入長を限定するデバイスおよびその機能的等価物により皮内ワクチンを投与することも可能である。同様に好適なのは、液体ジェット式注射器を用いて、または角質層を貫通し真皮に達するジェットを生成する針を用いて、真皮に液体ワクチンを送達するジェット式注射デバイスである。ジェット式注射デバイスについては、たとえば、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５号、およびＷＯ９７／１３５３７号に記載されている。同様に好適なのは、皮膚の外層を通って真皮まで粉末形態のワクチンに加速度を与えるために圧縮ガスを使用するバリスティック粉末／粒子送達デバイスである。このほか、古典的なマントー式皮内投与法で従来型シリンジを使用することも可能である。しかしながら、従来型シリンジを使用するには、かなり熟練したオペレーターが必要である。したがって、かなり熟練したユーザーでなくても正確な送達を行うことのできるデバイスが好ましい。
【００８３】
本発明に係るインフルエンザワクチンは、一般的には、３種のインフルエンザ株を含む三価インフルエンザワクチンであるが、３種未満の株を含むものであってもよい。従来のインフルエンザワクチンは、３種のインフルエンザ株、すなわち２種のＡ株および１種のＢ株を含む。
【００８４】
インフルエンザウイルス調製物は、従来の発育卵法から得るかまたは組織培養を用いてウイルスを増殖させる任意の新しい生成法から得ることが可能である。ウイルスを増殖するための適切な細胞培養基としては、たとえば、イヌ腎臓細胞、具体例としてはＭＤＣＫまたはＭＤＣＫのクローンから得られる細胞、ＭＤＣＫ様細胞、サル腎臓細胞、具体例としてはベロ細胞などのＡＧＭＫ細胞、またはワクチンを目的としたインフルエンザウイルスの産生に適した任意の他のタイプの哺乳動物細胞が挙げられる。適切な細胞培養基としては、このほかに、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞が挙げられる。適切な細胞培養基は細胞系に限定されるものではなく、たとえば、ニワトリ胚繊維芽細胞のような始原細胞も含まれる。
【００８５】
伝統的には、インフルエンザウイルス成分は、溶媒／界面活性剤処理を用いて、たとえば、トリ−ｎ−ブチルホスフェートまたはＴｗｅｅｎＴＭと組合せたジエチルエーテル（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割として知られる）を用いて生産された。この方法は、依然として、いくつかの生産設備で使用されている。現在利用されている他の分割剤としては、界面活性剤またはタンパク質分解酵素または胆汁酸塩、たとえば、参照により本明細書に組み入れられるものとする特許Ｄ１５５８７５号に記載されているようなデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。分割剤として使用することのできる界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、たとえば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、たとえば、ラウリルスルフェート、タウロデオキシコレート、もしくは非イオン性界面活性剤、たとえば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（たとえば、Linaら, 2000, Biologicals 28, 95-103に記載の方法を用いる）およびＴｒｉｔｏｎＮ−１０１などの先に記載のもの、または任意の２種以上の界面活性剤の組合せが挙げられる。
【００８６】
インフルエンザウイルス成分調製物を生成するために使用することのできるさらなる好適な分割剤としては、以下のものが挙げられる。
【００８７】
１． 胆汁酸およびその誘導体、たとえば：コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および誘導体（たとえば、以上に記載の胆汁酸のグリコ誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸誘導体、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体）、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコラミド。具体例としては、最終ワクチン用量中に極微量で存在しうるデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００８８】
２． アルキルグリコシドまたはアルキルチオグルコシド。この場合、アルキル鎖は、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１４であり、糖部分は、１→６、１→５、１→４、１→３、１→２のようなさまざまな結合を有する任意のペントースもしくはヘキソースまたはそれらの組合せである。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。
【００８９】
３． 上記の２の誘導体。この場合、１個以上のヒドロキシル基、好ましくは６個のヒドロキシル基は、たとえば、エステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第四級アンモニウム化合物のように修飾される。
【００９０】
４． アシル糖。この場合、アシル鎖は、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２であり、糖部分は、１→６、１→５、１→４、１→３、１→２のようなさまざまな結合を有する任意のペントースもしくはヘキソースまたはそれらの組合せである。アシル鎖は、飽和もしくは不飽和、および／または分枝、環状もしくは非環状であってもよく、Ｎ、Ｓ、Ｐ、またはＯなどの１個以上のヘテロ原子を有していてもよいし有していなくてもよい。
【００９１】
５． 構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−３−アミノ−１−プロパンスルホネートを有するスルホベタイン。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６の任意のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Ｒは、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖であり、またはＲ１、Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成することができる。
【００９２】
６． 構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−グリシンを有するベタイン。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖であり、またはＲ１、Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成することができる。
【００９３】
７． 構造Ｒ−（Ｎ−Ｒ１）−グルカミドを有するＮ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝、または環状であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６、典型的にはＣ１のアルキル鎖である。糖部分は、ペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい。
【００９４】
８． 構造Ｒ，−Ｎ＋（−Ｒ１，−Ｒ２，−Ｒ３）を有する第四級アンモニウム化合物。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ２０、典型的にはＣ２０の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、好ましくはＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖であり、またはＲ１、Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成することができる。具体例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）である。
【００９５】
ウイルス成分ワクチンの製造方法には、いくつかの異なる濾過ステップおよび／または他の分離ステップ、たとえば、種々の組合せで、超遠心ステップ、限外濾過ステップ、ゾーン遠心ステップ、およびクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー）ステップ、ならびに場合により、ホルムアルデヒドもしくはβ−プロピオラクトンまたはＵＶを用いる不活化ステップが含まれてもよいが、これらは分割の前または後に実行可能である。分割法は、バッチ法、連続法、または半連続法として実行可能である。
【００９６】
好ましくは、デオキシコール酸ナトリウムのような胆汁酸塩は、本発明に係るウイルス成分ワクチン製剤中に、極微量で、好ましくは０．０５％以下、または約０．０１％以下、より好ましくは約０．００４５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【００９７】
本発明に係る好ましいインフルエンザウイルス成分ワクチン抗原調製物は、製造方法で残存した残留量のＴｗｅｅｎ８０および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むが、ウイルス成分抗原の調製後に、これらを添加してもよいし、それらの濃度を調整してもよい。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の両方が存在する。ワクチン用量中のこれらの非イオン性サーファクタントの最終濃度の好ましい範囲は以下のとおりである：
Ｔｗｅｅｎ８０：０．０１〜１％、好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：０．００１〜０．１（％ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）。
【００９８】
これらの２種のサーファクタントを組み合わせて低濃度で存在させると、溶解状態の抗原の安定性が向上することが判明した。この強化された安定性により、従来の製剤よりも皮内投与でより免疫原性が増大した抗原となる可能性がある。このような強化は、小さな抗原凝集体が大部分を占めるかまたは抗原の天然のコンホメーションが強化されることが原因で生じる可能性がある。本発明は、この理論的解釈が正しいか否かに依存しない。
【００９９】
特定の実施態様では、好ましいウイルス成分調製物は、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％（ｗ／ｖ）の範囲でラウレス９をも含有する。
【０１００】
本発明に係るワクチンは、一般的には２５％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１５％未満、最も好ましくは約２％以下の界面活性剤またはサーファクタントを含有する。
【０１０１】
本発明は、別の態様において、皮内投与用のインフルエンザワクチンの製造方法を提供し、該方法は、以下のステップを含むものである：
（ｉ）従来の注射用（例えば筋肉内）インフルエンザワクチンと本質的に同じように製造されたインフルエンザウイルス成分調製物を準備し、少なくとも１種の非イオン性サーファクタントを含有させるステップ；
（ｉｉ）場合により、上記調製物中のヘマグルチニン濃度および／または非イオン性サーファクタント濃度を調整するステップ；
（ｉｉｉ）上記インフルエンザウイルス成分調製物からのワクチン用量を皮内送達デバイスに充填するステップであって、該用量が、皮内投与に適した量、好ましくは液状ワクチン約０．０５ｍｌ〜０．２ｍｌである、上記ステップ。
【０１０２】
本発明の上記態様の方法におけるさらなる任意ステップとしては、吸収促進サーファクタント（例えばラウレス９など）の添加、および／またはアジュバント（例えば無毒リピドＡ誘導体、特に３Ｄ−ＭＰＬ）の添加が挙げられる。
【０１０３】
従来の注射用不活化インフルエンザワクチンの製造方法は周知であり、文献に記載されている。かかる方法は、本発明において使用するための単回用量皮内ワクチンを製造するために改変を加えても良く、例えば、他の成分（非イオン性サーファクタント）の濃度を本発明の皮内ワクチンに適した割合（％（ｗ／ｖ））に調整するステップを導入してもよい。しかしながら、ワクチンの有効成分、すなわちインフルエンザ抗原は、従来の筋肉内ワクチン及び本発明の単回用量皮内ワクチンで本質的に同じものとすることができる。
【０１０４】
好ましくは、本発明のワクチン製剤は、単回用量ワクチンとして投与する場合には、全ての株についてＥＵ基準の少なくとも２つをみたさない製剤を含むものではない。
【０１０５】
次に、以下の実施例で本発明についてさらに説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０６】
インフルエンザウイルス成分ワクチンの調製
以下の手順にしたがって、ウイルス成分ワクチン用の各株を調製した。
【０１０７】
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【０１０８】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【０１０９】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。場合により、粗製一価ウイルスバルクに０．１００ｍｇ／ｍｌのチオメルサールを添加する。
【０１１０】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【０１１１】
２．吸着ステップ
ＣａＨＰＯ４ゲルを含有する清澄化ウイルスプールを得るために、ＣａＨＰＯ４の最終濃度がウイルス株に応じて１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルになるように０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４溶液および０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２溶液を添加する。
【０１１２】
少なくとも８時間かけて沈降させた後、上清を除去し、ＣａＨＰＯ４の使用量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することにより、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を再び可溶化させる。
【０１１３】
３．濾過
再懸濁させた沈降物を６μｍ濾過膜で濾過する。
【０１１４】
４．スクロース勾配遠心
１００μｇ／ｍｌのチオメルサールを含有する線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１１５】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１ ５５〜５２％スクロース
・画分２ 約５２〜３８％スクロース
・画分３ ３８〜２０％スクロース＊
・画分４ ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【０１１６】
さらなるワクチン調製では、画分２および３のみを使用する。
【０１１７】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【０１１８】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットルの体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１１９】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させる。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１２０】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１２１】
６．滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１２２】
７．不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を添加する。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１２３】
８．限外濾過
２０ｋＤａ ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化スプリットウイルス物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。
【０１２４】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。ＳＲＤ（ＷＨＯが推奨する方法）により測定されるヘマグルチニンの最終濃度は、４５０μｇ／ｍｌを超えるようにしなければならない。
【０１２５】
１０．保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【０１２６】
純度
クーマシー染色したポリアクリルアミドゲルをＯ．Ｄ．走査することにより、半定量的に純度を決定した。手作業でピークを決定した。サンプルの結果を表１に示す。
【０１２７】
【０１２８】
株の特定の組合せとしては、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０／９９（Ｈ３Ｎ２）、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８が挙げられる。
【実施例２】
【０１２９】
バルクワクチンからのワクチン用量の調製
所要により界面活性剤濃度を調整して、一価バルクから三価ワクチンを製剤化することにより、最終ワクチンを調製する。
【０１３０】
ＰＢＳ（ｐＨ７．２±０．２）、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００を混合して、所要の最終濃度（ＰＢＳ１倍濃縮、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．１５％、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０２％）を得る。以下の３種の不活化ビリオン成分を、１０分間撹拌しながら添加する：
１５μｇ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）
１５μｇ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０／９９（Ｈ３Ｎ２）
１５μｇ Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８
【０１３１】
１５分間撹拌後、ｐＨを７．２±０．２に調整する。投与量は５００μｌである。滅菌アンプル中にその用量を充填する。ワクチンを投与する直前に、皮内投与デバイスを用いて０．１ｍｌ用量をアンプルから取出す。
【実施例３】
【０１３２】
抗体応答の測定に使用される方法
１．ＥＬＩＳＡによるヒト鼻分泌物中の特異的抗インフルエンザおよび全ＩｇＡの検出
ヒト鼻分泌物の採取方法
適切な方法、たとえば、古典的な鼻洗浄法または鼻吸引法を用いて鼻分泌物を採取する。
【０１３３】
ヒト鼻分泌物の採取および処理を行った後、たとえばＥＬＩＳＡを用いて、全抗インフルエンザＩｇＡおよび特異的抗インフルエンザＩｇＡの検出を行う。
【０１３４】
全ＩｇＡを検出するための捕捉ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート上に固定された抗ヒトＩｇＡポリクローナルアフィニティー精製Ｉｇを用いて全ＩｇＡを捕捉し、続いて、ペルオキシダーゼに結合されたさまざまなポリクローナル抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１３５】
精製ヒトｓＩｇＡを標準として使用し、採取した鼻分泌物中のｓＩｇＡの定量を行う。
【０１３６】
精製ヒトｓＩｇＡの３種の対象標準を、この検定における低、中および高対象標準として用いる。
【０１３７】
特異的抗インフルエンザＩｇＡを検出するための直接ＥＬＩＳＡ
ワクチン製剤中に存在する各インフルエンザ株に対して３つの異なるＥＬＩＳＡを実施する。
【０１３８】
マイクロタイタープレート上にコーティングされたスプリット不活化インフルエンザ抗原を用いて特異的抗インフルエンザＩｇＡを捕捉し、続いて、全ＩｇＡ ＥＬＩＳＡに用いたＩｇと同じようにペルオキシダーゼに結合されたさまざまなポリクローナル抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１３９】
結果−表現および計算
全ＩｇＡの発現
Ｓｏｆｔｍａｘｐｒｏプログラムを用いて、鼻汁１ｍｌ中の全ＩｇＡのμｇとして結果を表す。
【０１４０】
特異的抗インフルエンザＩｇＡの発現
終点単位の力価として結果を表す。これは、カットオフ値を上回るＯＤ４５０ｎｍを示す最終希釈度の逆数として計算される。
【０１４１】
サンプルの最終結果を次のように表す：
特異的応答と全ＩｇＡ濃度との比を計算することにより特異的応答を正規化する：終点単位／μｇ全ＩｇＡ（文献中で最も一般的に用いられる計算方法）。
【０１４２】
２．インフルエンザ特異的血清抗体の血球凝集阻害（ＨＡＩ）活性
２００μｌのＲＤＥ（受容体破壊酵素）を用いて血清（５０μｌ）を３７℃で１６時間処理する。１５０μｌの２．５％クエン酸ナトリウムを用いて反応を停止させ、５６℃で３０分間かけて血清を不活化させる。１００μｌのＰＢＳを添加することにより、１：１０希釈液を調製する。次に、２５μｌの血清（１：１０）を２５μｌのＰＢＳで希釈することにより、９６ウェルプレート（Ｖ底）中に２倍希釈系列を調製する。２５μｌの参照抗原を２５μｌあたり４血球凝集単位の濃度で各ウエルに添加する。マイクロタイタープレート振盪器を用いて抗原と抗血清希釈液とを混合し、室温で６０分間インキュベートする。次に、５０μｌのニワトリ赤血球（ＲＢＣ）（０．５％）を添加し、室温で１時間かけてＲＢＣを沈降させる。ＨＡＩ力価は、ウイルス誘発血球凝集を完全に阻害する最終血清希釈度の逆数に相当する。
【実施例４】
【０１４３】
皮内インフルエンザワクチン（ＦｌｕＩＤ）の免疫原性および反応原性
皮内送達される本発明のインフルエンザワクチンの効力を評価するために、ヒト被験者に対して臨床試験を行った。この試験に使用したワクチン（ＦｌｕａｒｉｘＴＭ）は、実施例１および２に従って作製したものである。
【０１４４】
１００名の健常な男性および女性ボランティア（年齢１８〜６０歳）を登録し、無作為に２つのグループ（１グループあたり５０名の被験者）に分けた。２つの投与経路によりワクチンを投与した。
【０１４５】
・三価インフルエンザウイルス成分ワクチン（ＦｌｕａｒｉｘＴＭ）の筋肉内投与：
１用量→０日目
利き腕でない腕の三角筋部に筋肉内注射すべく、充填済みシリンジとしてワクチンを供給した。試験ワクチンの適切な筋肉内注射が行えるように、少なくとも２３Ｇ（２．２ｃｍ／１インチ）の長さの針を使用した。
【０１４６】
・三価インフルエンザウイルス成分ワクチン（ＦｌｕａｒｉｘＴＭ）の皮内投与：
１／５用量→０日目
０．５ｍｌのアンプル用量としてワクチンを供給した。ＥＰ１０９２４４４号に開示されているようなデバイスを用いて、全用量（１００μｌ）の１／５を皮内に注射した。該特許の全内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。このデバイスは、真皮への針の侵入具合を効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する。有効な針の長さは約１．５ｍｍであった。本明細書中では、このデバイスをＩＤ送達デバイスまたは「ＩＤＤ」と記す。
【０１４７】
試験の継続時間は、約２１日間であり、被験者１名あたりワクチン１用量だけをグループに応じて筋肉内または皮内に投与した。０日目および２１日目に血液をサンプリングした。
【０１４８】
試験集団は次のとおりであった：
【０１４９】
ワクチン接種を受けた２グループの被験者の集団統計学的プロフィールは、平均年齢、性別、および人種の分布に関して同等であった。
【０１５０】
免疫原性
それぞれの処置グループに対して、免疫原性の次のパラメーターを計算した：
・ｌｏｇ力価の平均値の真数を求める変換を行うことにより、０日目および２１日目におけるＨＩ抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）（９５％信頼区間を有する）を計算した（計算の都合上、カットオフ値未満の力価については、任意値としてカットオフの半分の値を与えた）
・アッセイカットオフよりも大きいかまたはそれに等しい力価を有する被験者の割合（％）として定義される０日目および２１日目におけるＨＩ抗体力価の血清反応陽性（Ｓ＋）率
・０日目と比較して２１日目の血清ＨＩ ＧＭＴの増加倍率として定義される２１日目におけるコンバージョン係数
・０日目と比較して２１日目に血清ＨＩ力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）として定義される２１日目におけるセロコンバージョン率（ＳＣ）
・ワクチン接種後、血清ＨＩ力価≧１：４０を有するワクチン被接種者の割合（％）として定義される２１日目における防御率。
【０１５１】
実験室アッセイおよび時間点
すべての血清サンプルを−２０℃に保持し、適切な手段を講じて、サンプルがいかなる時点でも解凍しなかったことを確認した。通院するたびに、ＨＩ抗体応答の測定に供すべく血液を採取した。
【０１５２】
WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Diseases Control, Atlanta, USA (1991)により記載された血球凝集阻害試験を用いて測定された血球凝集阻害抗体（ＨＡＩ）の力価により免疫応答を測定した。
【０１５３】
Saechsisches Serumwerk GmbH（SSW）, Dresden, Germanyで凍結血清サンプルを入手し、そして解凍後、４血球凝集単位（４ＨＩＵ）の適切な抗原および０．５％家禽赤血球懸濁液を用いて、標準化されかつ総合的に有効性が実証された測微法により、サンプルの抗体測定を行った。発育鶏卵の尿膜液から抗原Ａ（Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１）を全ウイルス抗原として得た。感度を増大させるために、Ｂ抗原を、エーテルとＴｗｅｅｎ ８０との混合物による分解処理に付した。熱処理および受容体破壊酵素により非特異的血清阻害剤を除去した。
【０１５４】
得られた血清のＨＩ抗体値を評価する。初期希釈度１：１０から始めて、最終希釈度１：２０４８０までの希釈系列（２倍希釈系列）を調製する。血球凝集の完全阻害（１００％）を示す最大希釈ステップを力価測定の終点とする。すべてのアッセイを２重反復試験方式で行う。
【０１５５】
結果
ＡＴＰ免疫原性コホートの被験者の数と全コホートの被験者の数とが同一になるように、包括解析（ＩＴＴ）方式（すなわち、全コホート）で免疫原性分析を行った。
【０１５６】
ＨＩ力価およびコンバージョン係数
３グループに対する０日目および２１日目におけるＨＩ抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）（９５％信頼区間を有する）を以下の表に示す：
【０１５７】
０日目に、３種の株（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ａ／Ｐａｎａｍａ、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ）に関してグループ間の差は有意でなかった（ｐ＞０．０５）。２１日目には、皮内（ＩＤ）グループと筋肉内（ＩＭ）グループとの間に有意差（ｐ＜０．０００１）が観測された。
【０１５８】
しかしながら、０日目から２１日目までの力価の増加を比較したとき（コンバージョン係数、下記の表を参照されたい）、グループ間で有意差は測定されなかった（ｐ＞０．０５）。このことは、増加が全体的に同等であったことを意味する。
【０１５９】
ＨＩの結果では、皮内（ＩＤ）ワクチングループとＦｌｕａｒｉｘＴＭ筋肉内（ＩＭ）ワクチングループとを識別できない。
【０１６０】
【０１６１】
コンバージョン係数（０日目と比較した２１日目の血清ＨＩ ＧＭＴの増加倍率）は、ウイルス株および投与経路に応じて８．５〜１０．９の範囲で種々の値をとる（上記の表を参照されたい）。このコンバージョン係数は、欧州関係機関により要求されるＧＭＴの２．５倍増加よりも優れている。
【０１６２】
分類の判定基準として因子分析を含む分散分析を用いて、コンバージョン係数を比較した。処置グループ間の有意差（ｐ＞０．０５）は測定されなかった。
【０１６３】
血清防御率
以下の表に示される血清防御率は、ワクチン接種後、血清ＨＩ力価≧４０を有するワクチン被接種者の割合（％）として定義される。
【０１６４】
【０１６５】
２１日目に、グループの血清防御率は、異なるウイルス株に対して９６％〜１００％の範囲であった。防御に関して、このことは、ワクチン接種後に９５％を超える被験者（投与経路に依らない）が血清ＨＩ力価≧４０を有し、３種の株から防御されたとみなされることを意味する。この率は、欧州関係機関により１８〜６０歳集団に要求される７０％の血清防御率よりも優れている。
【０１６６】
セロコンバージョン率
以下の表に示されるセロコンバージョン因子は、ワクチン接種後に血清ＨＩ力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）として定義される。
【０１６７】
【０１６８】
効果がありかつ欧州関係機関の要求基準に適合するとみなされるためには、ワクチンは、１８〜６０歳集団で４０％を超えるセロコンバージョン率を誘導するものでなければならない。本試験では、グループのセロコンバージョン率は６５％を上回った。
【０１６９】
反応原性
ワクチンの皮内投与は安全であり（深刻な有害事象は報告されなかった）、ワクチン接種に関連した全身症状についての報告はほとんどなく、臨床的に十分許容されるものであった。
【０１７０】
結論
・ＦｌｕａｒｉｘＴＭは、投与経路（ＩＤまたはＩＭ）に依らず単回用量投与後に高いセロコンバージョン率で各株に対して良好な免疫応答を誘発した
・ＦｌｕａｒｉｘＴＭの１／５用量を皮内投与して誘導された免疫応答と、全用量をＩＭ経路で投与して誘導された免疫応答との間には、有意差がなかった
・いずれのワクチン接種でも、以下のように、１８〜６０歳集団におけるインフルエンザ不活化ワクチンに対する欧州関係機関の要求基準が満たされた：すなわち、
・４０％を超えるセロコンバージョン率が得られる
・幾何平均力価が２．５倍よりも増大する
・７０％の血清防御率が得られる。
【実施例５】
【０１７１】
皮内インフルエンザワクチン（ＦｌｕＩＤ）の免疫原性および反応原性：試験２
インフルエンザウイルス抗原調製物の調製
以下の手順にしたがって、一価ウイルス成分ワクチンを調製した。
【０１７２】
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【０１７３】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【０１７４】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。
【０１７５】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【０１７６】
２．吸着ステップ
ＣａＨＰＯ４ゲルを含有する清澄化ウイルスプールを得るために、ＣａＨＰＯ４の最終濃度がウイルス株に応じて１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルになるように０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４溶液および０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２溶液を添加する。
【０１７７】
少なくとも８時間かけて沈降させた後、上清を除去し、ＣａＨＰＯ４の使用量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することにより、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を再び可溶化させる。
【０１７８】
３．濾過
再懸濁させた沈降物を６μｍ濾過膜で濾過する。
【０１７９】
４．スクロース勾配遠心
１００μｇ／ｍｌのチオメルサールを含有する線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１８０】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１ ５５〜５２％スクロース
・画分２ 約５２〜３８％スクロース
・画分３ ３８〜２０％スクロース＊
・画分４ ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【０１８１】
さらなるワクチン調製では、画分２および３のみを使用する。
【０１８２】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【０１８３】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットル（卵１２，０００個／バッチに適した体積）の体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１８４】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させ、Ｂ株ウイルスに対して０．５ｍＭまでのトコフェロールスクシネートを添加する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１８５】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１８６】
６．滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ株ウイルスに対しては０．５ｍＭトコフェロールスクシネート）を含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１８７】
７．不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を添加する。Ｂ株ウイルスについては、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸緩衝食塩水を希釈に利用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１８８】
８．限外濾過
２０ｋＤａ ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化スプリットウイルス物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。Ｂ株ウイルスについては、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸緩衝食塩水を用いて洗浄する。
【０１８９】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、所要により、タンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌを超えないようにかつヘマグルチニン濃度が１８０μｇ／ｍｌを超えるように、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ株ウイルスに対しては）０．１ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸塩緩衝食塩水で物質を希釈する。
【０１９０】
１０．保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【実施例６】
【０１９１】
インフルエンザワクチンの調製
３種の株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９ （Ｈ１Ｎ１） ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ （Ｈ３Ｎ２） Ｒｅｓｖｉｒ−１７、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価最終バルクを、実施例５に記載の方法に従って作製した。
【０１９２】
プーリング
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７についてはそれぞれ６０μｇ／ｍｌ、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９については６８μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度になるように、適切な量の一価最終バルクをプールした。Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびトコフェロールスクシネートを、それぞれ１，０００μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌに調整した。リン酸塩緩衝食塩水を用いて最終体積を３Ｌに調整した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜で完了する濾過を行い、三価最終バルクを得た。少なくとも０．１６５ｍＬの三価最終バルクをそれぞれのシリンジに充填した。
【０１９３】
ワクチン投与
充填済みシリンジでワクチンを供給し、三角筋部に皮内投与した。皮内（ＩＤ）針は、ＥＰ１０９２４４４号に記載のものであり、適切な皮内注射が行えるように皮膚侵入リミッターを備えていた。注射部位に膨疹（丘疹）が形成されればＩＤ投与の質が良くなるので、試験者は、ワクチン接種の３０分後に被験者の膨疹の正確なサイズを測定した。
【０１９４】
単回用量（１００μｌ）は以下の成分を含んだ：
【０１９５】
上記のワクチンを標準的な三価インフルエンザウイルス成分ワクチンＦｌｕａｒｉｘＴＭと比較した。Ｆｌｕａｒｉｘワクチンを充填済みシリンジで供給し、三角筋に筋肉内投与した。適切な皮内注射が行えるように、少なくとも２．５ｃｍ／１インチの長さの針（２３ゲージ）を使用した。
【０１９６】
単回用量（０．５ｍｌ）は以下の成分を含んだ：
【０１９７】
結果
ワクチン投与時における全コホートの平均年齢は、７０．４±６．２（標準偏差（Ｓ．Ｄ．））歳であり、女性／男性の比は１．７：１であった。
【０１９８】
【０１９９】
注射部位疼痛が６５名中１０名（１５．４％）のワクチン被接種者により報告されたが、これはＦｌｕａｒｉｘＴＭのＩＭ投与後のごく一般的な症状であった。ＩＤグループでは、６５名中３名（４．６％）のワクチン被接種者により疼痛が報告された。この差は統計的に有意であった（ｐ＝０．０３８；フィッシャーの精密検定）。したがって、ＩＤ投与を用いた場合、疼痛の頻度は減少する。
【０２００】
結論
インフルエンザワクチンのＩＤ投与により、高齢者集団において、等価な（１００％）血清防御が達成される。
【０２０１】
幾何平均力価、血清防御率、セロコンバージョン率、およびコンバージョン係数に関して、ＩＭおよびＩＤワクチン接種された個体で、ワクチン接種に対する同等の応答が見いだされた。ただし、ＩＤグループには１／２．５の抗原を接種した。
【０２０２】
２つの処置グループには、ワクチンに関連した応答型／非応答型全身症状の全体的な発生率に関して識別可能な差は見られなかった。
【実施例７】
【０２０３】
標準的針を用いる皮内送達
ブタにおいて標準的針を用いてＩＤ送達を行うことにより、インフルエンザウイルス成分ワクチンの免疫原性を評価した。
【０２０４】
ブタは、ヒトとの重要な生理学的類似性を示し、とくに、ブタ皮膚は、外観、解剖学的構造、および生理機能の点でヒト皮膚ときわめてよく類似している。したがって、皮膚の性質が重要となる試験は、ブタを用いれば最も適切に評価することが可能である。ブタはまた、インフルエンザ感染（Ａ株だけ）の自然宿主であるという利点をもつので、ブタを用いたワクチン候補の試験は適切なものである。
【０２０５】
４週齢のブタを用いて行った最初の免疫原性試験では、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ鼻腔内デバイス（たとえば、ＷＯ９１／１３２８１号、ＥＰ３１１８６３号Ｂ、およびＥＰ５１６６３６号Ｂに記載され、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍｂＨから市販されている）を用いて全不活化三価インフルエンザ（５０μｇの各ＨＡを含み、０．５％ラウレス−９でアジュバント添加されている）をそれぞれの鼻孔に２００μｌ〜１００μｌの全投与量で鼻腔内投与することにより、それぞれ６匹のブタからなる３つのグループに初回抗原刺激を行った。１１日目に２回目の抗原刺激用量を投与した。
【０２０６】
３９日目にＩＤ経路（ＦｌｕａｒｉｘＴＭもしくはＰＢＳ対照）またはＩＭ経路（ＦｌｕａｒｉｘＴＭのみ）のいずれかで動物にワクチン接種を行った。ＩＭワクチン接種を受けた動物は、０．５ｍｌの三価ＦｌｕａｒｉｘＴＭ（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｐａｎａｍａ Ｈ３Ｎ２株、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ株に由来するＨＡがそれぞれ１５μｇずつ含まれる）を前脚に投与することにより免疫感作した。ＩＤワクチン接種を受けた動物は、標準的針を用いて０．１ｍｌの三価ＦｌｕａｒｉｘＴＭ（各ＨＡが３μｇずつ含まれる）またはＰＢＳを投与することにより免疫感作した。
【０２０７】
５３日目に血液サンプルを取得し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗インフルエンザ活性に関する試験を行った。
【０２０８】
この最初の免疫原性試験の結果を図１に示す。この図には、株特異的ＥＬＩＳＡの読取値を用いたこの試験から得られた結果が示されている。
【０２０９】
図１の説明：
グループ１：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＭ １５μｇ ＨＡ
グループ２：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＤ ３μｇ ＨＡ
グループ３：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；ＰＢＳ ＩＤ
【０２１０】
この結果から、ＩＭまたはＩＤ経路のいずれを用いても、抗原刺激されたブタに投与された三価インフルエンザワクチンの免疫原性が確証される。
【実施例８】
【０２１１】
アジュバント添加インフルエンザワクチンの皮内送達
プロトコール
０日目に２００μ１中の５μｇの三価全不活化インフルエンザウイルスを用いてモルモットに鼻腔内抗原刺激を行った。
【０２１２】
ワクチン接種（２８日目）
プーリング（実施例６）により得られた各抗原の最終濃度が、実施例６では６０μｇ／ｍｌであるのに対して１００μｌ中０．１μｇの用量になるよう１．０μｇ／ｍｌにしたこと以外は、実施例５および６に記載されているように、三価インフルエンザウイルス成分ワクチン１株あたりそれぞれ０．１μｇのＨＡを含有するワクチンを調製した。ツベルクリンシリンジを用いて、１００μｌのアジュバント添加またはアジュバント非添加の最終三価製剤を皮内投与した。
【０２１３】
採血（４２日目）
ＨＩアッセイにより抗体応答を測定することにより、アジュバント添加の効果を評価した（０、２８、４２日目）。
【０２１４】
ＩＤ実験はすべて、標準的針を用いて行った。
【０２１５】
結果
Ｇ１〜Ｇ５は、１グループあたり５匹のモルモットからなる５つのグループを表す：
Ｇ１ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ
Ｇ２ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ ５０μｇ
Ｇ３ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ １０μｇ
Ｇ４ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ ５０μｇ＋ＱＳ２１ ５０μｇ
Ｇ５ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ １０μｇ＋ＱＳ２１ １０μｇ
【０２１６】
注記）３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１は、コレステロールを含む単ラメラ小胞を備えたアジュバント製剤であって、該単ラメラ小胞は、ジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有し、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、脂質二重層と会合しているかまたはその中に包埋されているものである。そのようなアジュバント製剤については、ＥＰ０８２２８３１号Ｂに記載されている。その開示内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２１７】
【０２１８】
この実施例に提示されたデータから、ブタを用いて先の実施例で得られた結果が確証および拡張される。三価インフルエンザワクチンのＩＤ投与を行うと、抗原刺激された動物（ブタのほかにモルモットにおいても）で強力な免疫応答が誘発される。このほか、アジュバントがこの免疫応答をさらに増大させる可能性があることが例証される。２つの異なる用量の３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１では、アジュバント非添加三価インフルエンザウイルス成分抗原でワクチン接種することにより誘発される抗体力価が著しく増大することがわかった。したがって、インフルエンザＩＤワクチンを良好に増強（アジュバント）することができ、得られた生成物により、ワクチン接種を受けた個体において増強された免疫応答を誘発することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮内送達用のインフルエンザワクチン製剤、その調製方法、および予防または治療におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、単回用量で皮内投与することにより法的規制を満たすのに十分な免疫応答を達成することが可能なインフルエンザワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も遍在的なウイルスの１つであり、ヒトと家畜の両方に影響を及ぼす。インフルエンザの経済的影響は顕著である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、直径約１２５ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスである。それは、基本的には、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。表面糖タンパク質のノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）は、粒子の表面で長さ１０〜１２ｎｍのスパイクのように見える。インフルエンザのサブタイプの抗原特異性を確定するのは、これらの表面タンパク質、とくにヘマグルチニンである。
【０００４】
典型的なインフルエンザ流行病は、入院率または死亡率の増加により立証されるように、肺炎または下気道疾患の発生率の増加を引き起こす。高齢者または根源的慢性疾患を有する者は、そのような合併症にかなり罹患し易いと考えられるが、乳児もまた重篤な疾患にかかる可能性がある。したがって、これらの人々をとくに防御する必要がある。
【０００５】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチンまたは生の弱毒化インフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、３つのタイプの抗原調製物、すなわち、不活化全ウイルス、脂質エンベロープを可溶化させるように精製ウイルス粒子が界面活性剤もしくは他の試薬で分割されたサブビリオン（いわゆる「ウイルス成分」ワクチン；split vaccine）、または精製ＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）のうちの１つを含む。これらの不活化ワクチンは、一般的には、筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与される。
【０００６】
インフルエンザワクチンは、いずれのタイプであっても、通常は三価ワクチンである。それらは、一般的には、２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型株に由来する抗原を含有する。ほとんどの場合、標準的な０．５ｍｌ注射用量には、単純放射状免疫拡散法（ＳＲＤ）により測定したときに各株に由来する１５μｇのヘマグルチニン抗原成分が含まれる（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：インフルエンザヘマグルチニン抗原をアッセイするための改良された単純放射状免疫拡散法：不活化全ウイルスおよびサブユニットワクチンの効力決定のための適応化（An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines）J. Biol. Stand. 5(1977)237-247；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：インフルエンザウイルスのヘマグルチニン抗原をアッセイするための免疫電気泳動法および単純放射状拡散法に関する国際的共同研究（International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis technique for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus）J. Biol. Stand. 9(1981)317-330）。
【０００７】
汎流行性インフルエンザ株が発生した場合のような特定の状況では、その単一株だけを含有するワクチンを得ることが望ましいこともある。これは汎流行状況への対処を速めるうえで役立つであろう。
【０００８】
各シーズンにインフルエンザワクチンに組入れられるインフルエンザウイルス株は、国立保健機関およびワクチン製造業者と共同して世界保健機構により決定される。
【０００９】
インフルエンザの毎年の流行に関連した罹患率および死亡率を抑えようとする現在の取組みは、筋肉内投与される不活化インフルエンザワクチンの使用に基づいている。呼吸器疾患およびインフルエンザ合併症を防止するそのようなワクチンの効力は、健常成人の場合の７５％から高齢者の場合の５０％未満までの範囲にわたる。
【００１０】
インフルエンザワクチンの代替投与法、とくに、痛みがないかまたは筋肉内注射よりも痛みが少なくかつ「針恐怖」に起因して患者のコンプライアンスにマイナスの影響を及ぼすことのない方法を提供することが望ましいであろう。また、たとえば、皮膚（とくに真皮）に存在する樹状細胞およびランゲルハンス細胞に抗原をターゲッティングすることにより、細胞媒介性免疫系を標的にすることも望ましいであろう。細胞媒介性免疫は、ウイルスのクリアランスおよび疾病からの回復を支援するように思われ、抗体間よりもインフルエンザ株間で良好な干渉効果をもたらす可能性がある。皮内投与により粘膜免疫が粘膜表面のレベルで誘発される可能性があることも、文献に記載されている。これは、ウイルスの侵入口が経鼻経路につながるインフルエンザのような病原体に対するワクチンの非経口経路と比較して利点がある。かくして、粘膜表面、初期では上気道の粘膜表面が、防御の最前線となる。
【００１１】
さらに、インフルエンザワクチンの用量に必要な抗原の量を減らすことも望ましいであろう。インフルエンザワクチンは、供給不足になることが多いからである。
【００１２】
ヒトに不活化インフルエンザワクチンが実験的に皮内投与されたのは、１９４０年代が最初である。皮内ワクチン接種の利点は長期にわたり認識されてきたが、現在までのところ、皮内経路を介する規則的なワクチン接種がインフルエンザに有効でありかつ実行可能であるという一致した見解は得られていない。
【００１３】
Crowe (1965) Am J Medical Technology 31,387-396には、インフルエンザウイルス成分ワクチンを用いて皮内ワクチン接種と皮下ワクチン接種とを比較する研究が記載されている。１４日間隔で０．１ｍｌのワクチンを皮内に２回投与した。皮内送達で得られた結果は、１回投与後および２回投与後のいずれについても、試験した３種の株のうちの２種に対して設定された基準を満たさなかった。
【００１４】
McElroy (1969) New Eng J of Medicine, 6 November, page 1076には、皮内への一価Ａ型株ワクチンの２回投与についての記載があり、ワクチンが不足した場合、たとえば、新しい予想外の株が発生した場合には、皮内経路が検討対象になりうるとの提案がなされている。
【００１５】
Taurasoら(1969) Bull Wld Hlth Org 41,507-516には、皮下（０．２５ｍｌもしくは０．５ｍｌ）または皮内（０．１ｍｌ）に投与される一価全不活化インフルエンザワクチンを用いる研究が記載されている。追加免疫接種が行われている。その結果から、皮内送達は皮下送達の適切な代替経路になることが示唆されるが、著者は、２回投与が必要であるとの提案を行っている。
【００１６】
Foy (1970) letter to JAMA, 6/7/70, vol 213 page 130には、天然免疫感作下で皮内投与されるインフルエンザワクチンを試験する実験について論じられている。３〜４週間間隔でワクチンを２回接種した。見かけ上、皮内ワクチン接種により病気が予防されることがデータから示唆されたが、決定的なものではなかった。
【００１７】
letter to the British Medical Journal, 29/10/77 page 1152には、ジェットガンを用いて０．１５ｍｌの一価インフルエンザワクチンを皮内送達する実験が記載されているが、結果は好ましくなかった。皮内投与を行うにはさらなる研究が必要であると記載されている。
【００１８】
他の著者は、皮下注射のときと同様に皮内注射には漏れのリスクがあることを指摘した。しかしながら、皮内投与に使用されるワクチンの体積は小さいので、漏れを生じると、ほとんどまたはまったく防御されない可能性がある。
【００１９】
Brooksら(1977) Annals of Allergy 39, 110-112には、２種のＡ型株（それぞれ４０ＣＣＡ単位）および別にＢ型株（１００ＣＣＡ単位）を含有する死滅インフルエンザワクチンを０．１ｍｌ容量で皮内投与する研究が記載されている。皮内経路は免疫感作に利用可能かつ有効であるが、ある種の株では皮内投与しうる用量よりも多くの量が必要になることもあると著者は結論付けている。
【００２０】
Brownら(1977) J Infectious Disease 136, 466-471には、ホルマリン不活化全一価インフルエンザＡ型株ワクチンの皮内投与についての記載がある。４０ＣＣＡが０．１ｍｌの容量で使用された。これが０．５ｍｌ（２００ＣＣＡ）の筋肉内投与と比較された。皮内ワクチン接種に対する応答は、年齢依存性であり、すでに抗体が存在するときは筋肉内ワクチン接種よりも低いことが見いだされた。この研究で使用したワクチン接種量では、皮内ワクチン接種は特殊な状況下でのみ使用すべきであるというのが結論であった。
【００２１】
Halperinら(1979) AJPH 89,1247-1252には、二価ウイルス成分ワクチンを用いるインフルエンザワクチン接種の皮内経路と皮下経路との比較についての記載がある。４０ＣＣＡの各株を含有する０．１ｍｌのワクチンが皮内ワクチン接種に使用された。
【００２２】
HerbertおよびLarke (1979) J Infectious Diseases 140, 234-238には、二価全ウイルスワクチンを用いる皮内および皮下インフルエンザワクチン接種の比較についての記載がある。ワクチン株にほとんどまたはまったく暴露されていない場合に、皮内経路は皮下経路ほど有効ではないことが見いだされた。また、著者の観測によれば、反応原性に関して、皮内接種量中の抗原量を減少させても利点は見られない。なぜなら、より高用量の皮下免疫感作により生じるワクチンの副作用を減少させるとは考えられなかった。
【００２３】
Bader (1980) letter to AJPH, vol. 70 no. 5には、インフルエンザワクチンの皮内送達による種々の試みの結果が論じられており、２週間間隔で２回投与した場合には、皮内送達の潜在的価値がみとめられる。
【００２４】
Niculescuら(1981) Arch Roum Path Exp Microbiol, 40, 67-70には、「ガンジェット注射器」を用いるウイルス成分三価ワクチンの皮内投与についての記載がある。１ヵ月間隔で２回投与された。この投与方法を用いると、インフルエンザの流行時に疾患率を低下させることができると著者は結論している。
【００２５】
したがって、文献によれば、６０年代半ば（またはそれ以前）〜１９８０年代初めに皮内ワクチン接種に関心が払われた。しかしながら、ワクチンの２回投与が必要であるという考えが有力であるようにみえる。また、投与が難しく、小容量のワクチンを所望の領域に良好に局在化できる見込みがなかったので、たとえば、広範な流行に対処すべく、迅速かつ大量にワクチン接種が必要とされる場合のみ、皮内送達経路の使用が検討対象となるという考えが広く普及していた。興味深いことに、８０年代初期においては皮内インフルエンザワクチン接種が文献に記載されることがほとんどなかった。８０年代初め以来、文献には、タンパク質抗原法を用いる皮内インフルエンザワクチン接種についての言及がほとんどなされていない。タンパク質を用いる取組みは、興味の対象にならなくなったように見える。その代わりに、ＤＮＡワクチン接種が注目されるようになった。Webster R.G. (1999) Clin Infect Dis, 28, 225-229に記載のレビュー、およびDeganoら(1999) Vaccine 18,623-32；Haenslerら(1999) Vaccine 17, 628-638；Deganoら(1998) Vaccine 16, 394-398のような刊行物を参照されたい。
【００２６】
したがって、市販のインフルエンザワクチンは、依然として、筋肉内投与されるウイルス成分またはサブユニット筋肉内投与用ワクチンである。これらのワクチンは、一般的には有機溶媒または界面活性剤を用いて、ウイルス粒子を分割し、さまざまな程度までウイルスタンパク質を分離または精製することにより調製される。ウイルス成分ワクチンは、可溶化濃度の有機溶媒または界面活性剤を用いて感染性または不活化全インフルエンザウイルスを断片化してから、可溶化剤といくつかのまたはほとんどのウイルス脂質物質を除去することにより、調製される。ウイルス成分ワクチンは、一般的には、夾雑マトリックスタンパク質および核タンパク質ならびに時として脂質や膜エンベロープタンパク質を含有する。ウイルス成分ワクチンは、通常、ウイルス構造タンパク質のほとんどまたはすべてを含有するであろうが、全ウイルスで見られる比率と必ずしも同じ比率で含有するわけではない。一方、サブユニットワクチンは、本質的には、高精製ウイルス表面タンパク質、ヘマグルチニン、およびノイラミニダーゼからなり、これらのタンパク質は、ワクチン接種時に所望のウイルス中和抗体を誘導する働きを担う表面タンパク質である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
インフルエンザワクチンの効力を測定するための基準が国際的に適用される。インフルエンザに有効なワクチンに関する欧州連合公式判定基準を以下の表に示す。理論的には、欧州連合要件を満たすためには、インフルエンザワクチンは、ワクチン中に含まれるインフルエンザ株すべてについて、表中の判定基準のうちの１つだけは満たさねばならない。しかしながら、実際上、とくに、新しいワクチン、たとえば、新しい皮内ワクチンについては、少なくとも２つまたはより一般的には３つすべての判定基準が全株で満たされる必要があろう。いくつかの状況下では、２つの判定基準で十分なこともある。たとえば、３つの判定基準のうちの２つはすべての株で満たされることが、第３の判定基準は、すべてではなくいくつかの株（たとえば、３種の株のうちの２種）で満たされる場合が許容されることもある。要件は、成人集団（１８〜６０歳）と高齢者集団（＞６０歳）とでは異なる。
【００２８】
＊ セロコンバージョン率は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）と定義される
＊＊ コンバージョン係数は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ＨＩ幾何平均力価（ＧＭＴ）の増加倍率と定義される
＊＊＊ 防御率は、（各ワクチン株について）ワクチン接種後に１：４０に等しいかまたはそれよりも大きい血清ＨＩ力価を有するワクチン被接種者の割合（％）と定義され、防御を示すものとして一般に認められている。
【００２９】
皮内インフルエンザワクチンを商業的に有用なものとするには、これらの基準を満たすことが必要なだけでなく、実際に、現在利用可能な皮内ワクチンと少なくとも同程度に有効である必要があろう。許容しうる方法で製造される必要もあり、もちろん所要の抗原量および投与回数に関して商業的に利用可能であることも必要であろう。さらに、医療スタッフが確実かつ簡単に実施しうる手順を用いて投与される必要もあろう。
【００３０】
不活化ウイルスをベースとした皮内インフルエンザワクチンについてこれまでに研究はなされたが、現在のところ皮内インフルエンザワクチンが市場に出荷されていないという事実は、この経路を介して有効なワクチン接種を行うことが困難であることを示している。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明においては、特定の三価インフルエンザワクチンがとりわけ良好な市販用皮内ワクチンとなることを見いだした。とくに、そのようなインフルエンザウイルスワクチン調製物の単回皮内投与を行うと、低用量の抗原でかつ防御レベルで全身的免疫が刺激される。さらに、有効なインフルエンザワクチンに対する国際的判定基準が満たされる。より特定的には、低抗原用量ワクチンの皮内投与により、同一ワクチンの皮下投与により得られるものと等価な全身的セロコンバージョン（抗ＨＡ力価の４倍増加）を得ることができる。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「皮内送達」という用語は、皮膚の真皮へのワクチンの送達を意味する。しかしながら、ワクチンは、必ずしも真皮だけに局在するわけではないであろう。真皮は、ヒト皮膚の表面から約１．０〜約２．０ｍｍの位置にある皮膚の層であるが、個体間でいくらか差異が見られ、身体の部位によっても異なる。一般的には、皮膚の表面下１．５ｍｍの位置であれば、真皮に達すると予想することができる。真皮は、表面の角質層および表皮と、その下の皮下層との間に位置する。送達形態に依存して、ワクチンは、最終的に真皮内だけにもしくは主に真皮内に位置するか、または表皮内および真皮内に最終的に分布する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】株特異的ＥＬＩＳＡの読取値を用いた免疫原性試験から得られた結果を示す。
【００３４】
グループ１：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＭ １５μｇ ＨＡ
グループ２：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＤ ３μｇ ＨＡ
グループ３：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；ＰＢＳ ＩＤ
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、第１の態様において、皮内送達用の単回用量インフルエンザワクチンの製造における三価の非生インフルエンザ抗原調製物の使用を提供する。インフルエンザ抗原調製物は、本明細書に記載の特定の方法を含む種々の既知の方法に従って作製可能である。好ましくは、該非生抗原調製物は、生ウイルスから調製したインフルエンザウイルス成分調製物またはサブユニット抗原調製物である。最も好ましくは、該抗原は、ウイルス成分調製物である。
【００３６】
本発明に係る三価ワクチンは、先に本明細書に記載したように、インフルエンザワクチンのＥＵ判定基準の一部分または全部を満たすので、ワクチンはヨーロッパの市場において認可されうる。好ましくは、ワクチン中に提供されるインフルエンザ株はすべて、３つのＥＵ判定基準のうちの少なくとも２つを満たす。より好ましくは、すべての株が少なくとも２つの判定基準を満たし、かつすべての株またはすべてではないが少なくとも１種の株が第３の判定基準を満たす。最も好ましくは、存在するすべての株が３つの判定基準すべてを満たす。
【００３７】
好ましくは、本明細書に記載する皮内ワクチンは、以下からなる群より選択されうる少なくとも１種の非イオン性サーファクタントを含有する：すなわち、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（たとえば、市販品のＴｒｉｔｏｎＴＭシリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＴｗｅｅｎＴＭシリーズ）、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ） ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
〔式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。〕
で示されるポリオキシエチレンエーテルまたはエステル、ならびにこれらのうちの２種以上の組み合わせ。
【００３８】
オクチルフェノキシポリオキシエタノール類およびポリオキシエチレンソルビタンエステル類の各々から１種を組み合わせた２種の非イオン性サーファクタント、特にＴｗｅｅｎ８０とＴｒｉｔｏｎＸ−１００との組み合わせが好ましい。可能でかつ好ましい界面活性剤の組み合わせについてさらに以下に説明する。
【００３９】
本発明に係るワクチンは、従来のワクチンよりも少量のヘマグルチニンを有し、かつより少ない容量で投与される。好ましくは、インフルエンザ１株あたりのヘマグルチニンの量は、約１〜７．５μｇまたは１〜５μｇ、より好ましくは約３μｇまたは約５μｇであり、これは、それぞれ、筋肉内投与用の従来のワクチンで使用されるヘマグルチニンの用量の約１／５または１／３である。インフルエンザ１株あたり６μｇのヘマグルチニンもまたきわめて好ましく、したがって、２〜６．５μｇもまた好ましい範囲である。
【００４０】
好ましくは、本発明に係るワクチンの１用量の容量は、０．０２５ｍｌ〜２．５ｍｌ、より好ましくは約０．１ｍｌまたは約０．２ｍｌである。５０μｌの投与量もまた検討対象になりうる。０．１ｍｌ用量は、従来の筋肉内インフルエンザワクチン用量の容量の約１／５である。皮内に投与することのできる液体の容量は、部分的には、注射の部位に依存する。たとえば、三角筋部への注射では、０．１ｍｌが最大の好ましい容量であるが、腰部では、大量に、たとえば約０．２ｍｌを投与することができる。
【００４１】
本発明において使用するための好適な非生インフルエンザ抗原調製物としては、以下の方法により取得可能なインフルエンザ抗原調製物が挙げられる：
（ｉ） 培養物からのウイルス含有物質の採取；
（ｉｉ） 採取した物質の清澄化による非ウイルス物質の除去；
（ｉｉｉ） 採取したウイルスの濃縮；
（ｉｖ） 非ウイルス物質から全ウイルスを分離するさらなるステップ；
（ｖ） 密度勾配遠心ステップにおける好適な分割剤を用いた全ウイルスの分割；
（ｖｉ） 濾過による望ましくない物質の除去；
ここで、上記ステップは、記載順に行われるが、必ずしも連続的である必要はない。
【００４２】
好ましくは、ウイルスは、卵を用いて、より具体的には発育鶏卵を用いて増殖させる。その場合、採取する物質は尿膜液である。
【００４３】
好ましくは、中速度の遠心により清澄化ステップを行う。他の選択肢として、たとえば０．２μｍ膜を用いて、濾過ステップを実施してもよい。清澄化ステップでは、培養物に由来する物質、たとえば、卵に由来する物質の大部分を取り除く。
【００４４】
好ましくは、濃縮ステップでは、吸着法を利用し、最も好ましくはＣａＨＰＯ４を用いる。あるいは、例えば限外濾過などの濾過を使用してもよい。
【００４５】
好ましくは、さらなる分離ステップ（ｉｖ）は、ゾーン遠心分離、とくに、スクロース勾配を用いるゾーン遠心分離である。場合により、勾配には、微生物の増殖を防止するための保存剤が含まれる。
【００４６】
好ましくは、分割ステップは、分割剤を含有するさらなるスクロース勾配で行う。
【００４７】
好ましくは、濾過ステップ（ｖｉ）は、ウイルス成分物質を濃縮する限外濾過ステップである。
【００４８】
好ましくは、少なくとも１ステップの滅菌濾過ステップが、場合により上記方法の最後に、存在する。
【００４９】
場合により、最終濾過ステップの前に、不活化ステップが存在する。
【００５０】
好ましくは、本発明に係るワクチンは、皮膚の表面下約１．０〜２．０ｍｍの位置に投与される。より好ましくは、ワクチンは、皮膚の表面下約１．５ｍｍの位置に送達される。
【００５１】
本発明に係るワクチンは、粒子を含むビリオン成分ワクチンである。動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ）を用いて測定した場合、ワクチンは、好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは５０〜１８０ｎｍ、最も好ましくは１００〜１５０ｎｍの平均粒子径を有する粒子を含有する。粒径は、株に依存して、季節ごとに種々の値をとる可能性がある。
【００５２】
本発明において式（Ｉ）の範囲内の好ましいサーファクタントは、ｎが４〜２４、より好ましくは６〜１２、最も好ましくは９であり、Ｒ成分がＣ１〜５０アルキル、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルである分子である。
【００５３】
オクチルフェノキシポリオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、「Surfactant systems」AttwoodおよびFlorence編（1983, ChapmanおよびHall）に記載されている。また、オクチルフェノキシポリオキシエタノール（オクトキシノール類）、たとえばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ）は、Merck Index Entry 6858（第1162頁、第１２版、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）は、Merck Index Entry 7742（第1308頁、第１２版、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。いずれも、上記文献に記載されている方法を用いて製造可能であるかまたはＳｉｇｍａ Ｉｎｃ．などの供給業者から購入可能である。
【００５４】
とくに好ましい非イオン性サーファクタントとしては、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５、ＴｒｉｔｏｎＸ−２０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、ＴｒｉｔｏｎＮ−５７、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＮ−１２８、Ｂｒｅｉｊ３５、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびラウレス９がとくに好ましい。同様にとくに好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）である。
【００５５】
一般式（Ｉ）で示されるさらに適切なポリオキシエチレンエーテルは、次の群から選択される：ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００５６】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに対して用いられる他の用語または名称は、ＣＡＳレジストリーに開示されている。ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルのＣＡＳレジストリー番号は９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテル類は、Merck Index（第１２版：entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより生成され、平均で９個のエチレンオキシド単位を有する。
【００５７】
サーファクタントにおけるポリオキシエチレン部分の長さとアルキル鎖の長さとの比（すなわち、ｎ：アルキル鎖長の比）は、水性媒質中へのこの種のサーファクタントの溶解度に影響を及ぼす。したがって、本発明に係るサーファクタントは、溶解状態で存在するかまたはミセルもしくは小胞のような粒状構造を形成してもよい。溶液であれば、本発明に係るサーファクタントは、安全で、滅菌が容易で、簡単に投与でき、しかも均一粒状構造の形成に伴うＧＭＰおよびＱＣ問題を生じることなく簡単に製造することが可能である。ラウレス９のようないくつかのポリオキシエチレンエーテル類は、非小胞型溶液を生成する可能性がある。しかしながら、ポリオキシエチレン−８パルミトイルエーテル（Ｃ１８Ｅ８）は、小胞を形成しうる。したがって、少なくとも１種の他の非イオン性サーファクタントと組み合わせたポリオキシエチレン−８パルミトイルエーテルの小胞を、本発明の製剤に利用することができる。
【００５８】
好ましくは、本発明の製剤に用いられるポリオキシエチレンエーテルは、溶血活性を有する。ポリオキシエチレンエーテルの溶血活性は、以下のアッセイを参照してｉｎ ｖｉｔｒｏで測定が可能であり、赤血球の溶解を引き起こさないサーファクタントの最高濃度として表される：
１． モルモットから得た新鮮な血液を卓上遠心機においてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄する。もとの容量に再懸濁させた後、血液をＰＢＳでさらに１０倍希釈する
２． この血液懸濁液５０μｌを、２倍希釈の界面活性剤を含有する８００μｌのＰＢＳに添加する
３． ８時間後、目視観測によりまたは上清の光学濃度を測定することにより、溶血を評価する。５７０ｎｍで光を吸収する赤色の上清が存在すれば、溶血を生じたことになる
４． 結果は、もはや溶血を生じない最初の界面活性剤希釈液の濃度で表される。
【００５９】
このような生物学的アッセイに固有の実験的変動の範囲内で、本発明のポリオキシエチレンエーテルまたは一般式（Ｉ）で示されるサーファクタントは、約０．５〜０．０００１％、より好ましくは０．０５〜０．０００１％、さらに好ましくは０．００５〜０．０００１％、最も好ましくは０．００３〜０．０００４％の溶血活性を有する。理想的には、該ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルは、ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルまたはポリオキシエチレン−８ステアリルエーテルの場合と類似した溶血活性（すなわち、１０倍以内の差）を有するものでなければならない。
【００６０】
上記サーファクタントの異なるグループに属する２種以上の非イオン性サーファクタントが、本明細書に記載のワクチン製剤中に存在していてもよい。とくに、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ＴＭのようなオクトキシノールとの組合せが好ましい。非イオン性サーファクタントのこのほかのとくに好ましい組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルもしくはオクトキシノールまたはその両方を含む。
【００６１】
好ましくは、このまたはそれぞれの非イオン性サーファクタントは、０．００１％〜２０％、より好ましくは０．０１〜１０％、最も好ましくは約２％（ｗ／ｖ）までの濃度で最終ワクチン製剤中に存在する。１種または２種のサーファクタントが存在する場合には、これらは一般的にはそれぞれ約２％まで、典型的にはそれぞれ約０．６％までの濃度で最終製剤中に存在する。１種以上の追加のサーファクタントは、一般的にはそれぞれ約１％の濃度まで、典型的にはそれぞれ約０．２％または０．１％までの極微量で存在しうる。サーファクタントの任意の混合物が、本発明のワクチン製剤中に存在し得る。
【００６２】
以上に記載したような非イオン性サーファクタントは、最終ワクチン組成物中で次のような好ましい濃度を有する：ポリオキシエチレンソルビタンエステル、たとえばＴｗｅｅｎ８０ＴＭ：０．０１〜１％、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール、たとえばＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤：０．００１〜０．１％、最も好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）；一般式（Ｉ）で示されるポリオキシエチレンエーテル、たとえばラウレス９：０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％または約０．５％（ｗ／ｖ）。
【００６３】
他の試薬が製剤中に存在していてもよい。そのようなものとして、本発明の製剤は、胆汁酸またはその誘導体を、とくに塩の形態で含有しうる。これらの例としては、コール酸の誘導体およびその塩、とくに、コール酸またはコール酸誘導体のナトリウム塩が挙げられる。胆汁酸およびその誘導体の例としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および誘導体、たとえば、該胆汁酸のグリコ誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸誘導体、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコラミドが挙げられる。とくに好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在しうるデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００６４】
本発明に係るワクチン製剤は、好ましくは、１種以上の非イオン性サーファクタントと組み合わせてインフルエンザウイルス成分調製物を含む。１種以上の非イオン性サーファクタントは、インフルエンザウイルス成分抗原調製物を作製する方法からの残留物であってもよく、かつ／または抗原調製物に後で添加したものであってもよい。このまたはそれぞれの非イオン性サーファクタントの濃度は、分割／精製のプロセスの最後に所望のレベルになるように調整することが可能である。インフルエンザウイルス成分抗原物質は非イオン性サーファクタントの存在下で安定化されうると考えられるが、当然のことながら、本発明は、この考え方が常に成立するか否かに依存しない。
【００６５】
本発明に係るワクチンは、アジュバントまたは免疫刺激剤、たとえば、任意の起源の解毒リピドＡおよびリピドＡの無毒誘導体、サポニンおよびＴＨ１型応答を刺激することのできる他の試薬を含有しうるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）が免疫系に対する強力な刺激剤であることはかなり前から知られていたが、毒性作用があるため、アジュバントに使用されることはなかった。還元末端グルコサミンからコア炭水化物基およびホスフェートを除去することにより生成された無毒のＬＰＳ誘導体モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）については、Ｒｉｂｉら（1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）により報告されており、次の構造を有する：
【化１】
【００６７】
ＭＰＬのさらなる解毒体は、二糖主鎖の３位からアシル鎖を除去することにより得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる。ＧＢ２１２２２０４号Ｂに教示されている方法により、それを精製および調製することができる。この文献には、ジホスホリルリピドＡおよびその３−Ｏ−脱アシル化体の調製についても開示されている。
【００６８】
３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小さい粒径を有するエマルジョンの形態であり、その製造方法については、ＷＯ９４／２１２９２号に開示されている。モノホスホリルリピドＡとサーファクタントとを含む水性製剤については、Ｗ０９８４３６７０号Ａ２に記載されている。
【００６９】
本発明の組成物中に製剤化される細菌リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製および処理されたものであってもよいし、あるいは合成されたものであってもよい。たとえば、精製モノホスホリルリピドＡについては、Ｒｉｂｉら、１９８６（前掲）に記載されており、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．に由来する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡについては、ＧＢ２２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖についても報告されている（Hilgersら, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6；Hilgersら, 1987, Immunology, 60(1): 141-6；およびＥＰ０５４９０７４号Ｂ１）。とくに好ましい細菌リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００７０】
したがって、本発明に使用しうるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬに構造が類似している免疫刺激剤である。本発明の他の態様において、ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの上記構造の一部分であるアシル化単糖であってもよい。
【００７１】
サポニンについては、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H.（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）に教示されている。サポニンは、植物界および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペンのグリコシドである。サポニンは、水に添加するとコロイド溶液を形成し、それを振盪させると泡立つこと、およびコレステロールを沈澱させることで知られている。サポニンが細胞膜近傍に存在すると、細胞膜中に細孔状構造が形成され、細胞膜が破壊される。赤血球の溶血は、この現象の一例である。この現象は、すべてではなくある特定のサポニンの性質である。
【００７２】
サポニンは、全身投与に供されるワクチンのアジュバントとして知られる。アジュバントおよび個々のサポニンの溶血活性については、当技術分野で広く研究されてきた（Lacaille-DuboisおよびWagner、前掲）。たとえば、Ｑｕｉｌ Ａ（南アメリカの木キラハ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する）およびその画分については、米国特許５，０５７，５４０号および「Saponins as vaccine adjuvants」, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12 (1-2): 1-55およびＥＰ０３６２２７９号Ｂ１に記載されている。Ｑｕｉｌ Ａの一部分を含む、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒状構造体は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されてきた（Morein, B., ＥＰ０１０９９４２号Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１号；ＷＯ９６／３３７３９号）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９号Ｂ１中に開示されている。全身性ワクチン接種の研究で使用された他のサポニンとしては、ジプソフィリア（Gypsophila）およびサポナリア（Saponaria）のような他の植物種に由来するサポニンが挙げられる（Bomfordら, Vaccine, 10(9): 572-577, 1992）。
【００７３】
強化された系には、無毒のリピドＡ誘導体とサポニン誘導体との組合せ、とくに、ＷＯ９４／００１５３号に開示されているようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９号に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされているそれほど反応原性のない組成物が含まれる。
【００７４】
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを含むとくに強力なアジュバント製剤については、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されている。これは好ましい製剤である。
【００７５】
したがって、本発明の一実施形態では、解毒されたリピドＡまたはリピドＡの無毒の誘導体をアジュバント添加した、より好ましくはモノホスホリルリピドＡまたはその誘導体をアジュバント添加した本発明のインフルエンザ抗原調製物を含むワクチンが提供される。
【００７６】
好ましくは、ワクチンはさらに、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。
【００７７】
好ましくは、製剤はさらに、水中油型エマルジョンを含む。本発明はまた、３Ｄ−ＭＰＬのような製薬上許容される賦形剤と共に本発明の抗原調製物を混合することを含むワクチン製剤の製造方法を提供する。
【００７８】
本発明に係るアジュバント添加ワクチン製剤中に存在する追加の成分としては、好ましくは非イオン性界面活性剤、たとえば、本明細書に記載されているようなオクトキシノール類およびポリオキシエチレンエステル類、とくに、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）；ならびに本明細書に記載されているような胆汁酸塩またはコール酸誘導体、とくに、デオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。したがって、とくに好ましい製剤は、皮内投与に好適なワクチンを提供すべくインフルエンザウイルス抗原調製物と併用しうる３Ｄ−ＭＰＬ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、およびデオキシコール酸ナトリウムを含む。
【００７９】
本発明の好ましい一実施形態では、皮内インフルエンザワクチンには、小胞アジュバント製剤が含まれる。これに関連して、好ましいアジュバント製剤には、好ましくはジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有するコレステロール含有単ラメラ小胞が含まれる。この場合、サポニンおよびＬＰＳ誘導体は、脂質二重層と会合しているかまたはその内部に包埋されている。より好ましくは、これらのアジュバント製剤には、サポニンとしてＱＳ２１およびＬＰＳ誘導体として３Ｄ−ＭＰＬが含まれ、ＱＳ２１：コレステロールの比は、１：１〜１：１００重量／重量、最も好ましくは１：５重量／重量である。そのようなアジュバント製剤は、ＥＰ０８２２８３１号Ｂに記載されている。該特許の開示内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００８０】
本発明はまた、被験者においてインフルエンザの感染または疾患を予防するための方法を提供する。該方法には、本発明に係るインフルエンザウイルス成分ワクチンを被験者に皮内投与することが含まれる。
【００８１】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載されているように皮内投与デバイスとワクチン製剤とを含む医薬用キットを提供する。デバイスは、好ましくは、ワクチンがすでに充填された形で供給される。好ましくは、ワクチンは、本明細書に記載されているように、従来の筋肉内ワクチンの場合よりも小さい液体容量、とくに約０．０５ｍｌ〜０．２ｍｌの容量である。好ましくは、デバイスは、真皮にワクチンを投与するための短針送達デバイスである。
【００８２】
本明細書に記載の皮内ワクチンを使用するのに好適なデバイスとしては、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているような短針デバイスが挙げられる。参照により本明細書に組み入れられるものとするＷＯ９９／３４８５０号に記載されているように皮膚中への針の有効侵入長を限定するデバイスおよびその機能的等価物により皮内ワクチンを投与することも可能である。同様に好適なのは、液体ジェット式注射器を用いて、または角質層を貫通し真皮に達するジェットを生成する針を用いて、真皮に液体ワクチンを送達するジェット式注射デバイスである。ジェット式注射デバイスについては、たとえば、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５号、およびＷＯ９７／１３５３７号に記載されている。同様に好適なのは、皮膚の外層を通って真皮まで粉末形態のワクチンに加速度を与えるために圧縮ガスを使用するバリスティック粉末／粒子送達デバイスである。このほか、古典的なマントー式皮内投与法で従来型シリンジを使用することも可能である。しかしながら、従来型シリンジを使用するには、かなり熟練したオペレーターが必要である。したがって、かなり熟練したユーザーでなくても正確な送達を行うことのできるデバイスが好ましい。
【００８３】
本発明に係るインフルエンザワクチンは、一般的には、３種のインフルエンザ株を含む三価インフルエンザワクチンであるが、３種未満の株を含むものであってもよい。従来のインフルエンザワクチンは、３種のインフルエンザ株、すなわち２種のＡ株および１種のＢ株を含む。
【００８４】
インフルエンザウイルス調製物は、従来の発育卵法から得るかまたは組織培養を用いてウイルスを増殖させる任意の新しい生成法から得ることが可能である。ウイルスを増殖するための適切な細胞培養基としては、たとえば、イヌ腎臓細胞、具体例としてはＭＤＣＫまたはＭＤＣＫのクローンから得られる細胞、ＭＤＣＫ様細胞、サル腎臓細胞、具体例としてはベロ細胞などのＡＧＭＫ細胞、またはワクチンを目的としたインフルエンザウイルスの産生に適した任意の他のタイプの哺乳動物細胞が挙げられる。適切な細胞培養基としては、このほかに、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞が挙げられる。適切な細胞培養基は細胞系に限定されるものではなく、たとえば、ニワトリ胚繊維芽細胞のような始原細胞も含まれる。
【００８５】
伝統的には、インフルエンザウイルス成分は、溶媒／界面活性剤処理を用いて、たとえば、トリ−ｎ−ブチルホスフェートまたはＴｗｅｅｎＴＭと組合せたジエチルエーテル（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割として知られる）を用いて生産された。この方法は、依然として、いくつかの生産設備で使用されている。現在利用されている他の分割剤としては、界面活性剤またはタンパク質分解酵素または胆汁酸塩、たとえば、参照により本明細書に組み入れられるものとする特許Ｄ１５５８７５号に記載されているようなデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。分割剤として使用することのできる界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、たとえば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、たとえば、ラウリルスルフェート、タウロデオキシコレート、もしくは非イオン性界面活性剤、たとえば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（たとえば、Linaら, 2000, Biologicals 28, 95-103に記載の方法を用いる）およびＴｒｉｔｏｎＮ−１０１などの先に記載のもの、または任意の２種以上の界面活性剤の組合せが挙げられる。
【００８６】
インフルエンザウイルス成分調製物を生成するために使用することのできるさらなる好適な分割剤としては、以下のものが挙げられる。
【００８７】
１． 胆汁酸およびその誘導体、たとえば：コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および誘導体（たとえば、以上に記載の胆汁酸のグリコ誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸誘導体、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体）、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコラミド。具体例としては、最終ワクチン用量中に極微量で存在しうるデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００８８】
２． アルキルグリコシドまたはアルキルチオグルコシド。この場合、アルキル鎖は、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１４であり、糖部分は、１→６、１→５、１→４、１→３、１→２のようなさまざまな結合を有する任意のペントースもしくはヘキソースまたはそれらの組合せである。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。
【００８９】
３． 上記の２の誘導体。この場合、１個以上のヒドロキシル基、好ましくは６個のヒドロキシル基は、たとえば、エステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第四級アンモニウム化合物のように修飾される。
【００９０】
４． アシル糖。この場合、アシル鎖は、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２であり、糖部分は、１→６、１→５、１→４、１→３、１→２のようなさまざまな結合を有する任意のペントースもしくはヘキソースまたはそれらの組合せである。アシル鎖は、飽和もしくは不飽和、および／または分枝、環状もしくは非環状であってもよく、Ｎ、Ｓ、Ｐ、またはＯなどの１個以上のヘテロ原子を有していてもよいし有していなくてもよい。
【００９１】
５． 構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−３−アミノ−１−プロパンスルホネートを有するスルホベタイン。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６の任意のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Ｒは、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖であり、またはＲ１、Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成することができる。
【００９２】
６． 構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−グリシンを有するベタイン。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖であり、またはＲ１、Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成することができる。
【００９３】
７． 構造Ｒ−（Ｎ−Ｒ１）−グルカミドを有するＮ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝、または環状であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６、典型的にはＣ１のアルキル鎖である。糖部分は、ペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい。
【００９４】
８． 構造Ｒ，−Ｎ＋（−Ｒ１，−Ｒ２，−Ｒ３）を有する第四級アンモニウム化合物。この場合、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ２０、典型的にはＣ２０の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和、および／または分枝であってもよい。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、好ましくはＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖であり、またはＲ１、Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成することができる。具体例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）である。
【００９５】
ウイルス成分ワクチンの製造方法には、いくつかの異なる濾過ステップおよび／または他の分離ステップ、たとえば、種々の組合せで、超遠心ステップ、限外濾過ステップ、ゾーン遠心ステップ、およびクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー）ステップ、ならびに場合により、ホルムアルデヒドもしくはβ−プロピオラクトンまたはＵＶを用いる不活化ステップが含まれてもよいが、これらは分割の前または後に実行可能である。分割法は、バッチ法、連続法、または半連続法として実行可能である。
【００９６】
好ましくは、デオキシコール酸ナトリウムのような胆汁酸塩は、本発明に係るウイルス成分ワクチン製剤中に、極微量で、好ましくは０．０５％以下、または約０．０１％以下、より好ましくは約０．００４５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【００９７】
本発明に係る好ましいインフルエンザウイルス成分ワクチン抗原調製物は、製造方法で残存した残留量のＴｗｅｅｎ８０および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むが、ウイルス成分抗原の調製後に、これらを添加してもよいし、それらの濃度を調整してもよい。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の両方が存在する。ワクチン用量中のこれらの非イオン性サーファクタントの最終濃度の好ましい範囲は以下のとおりである：
Ｔｗｅｅｎ８０：０．０１〜１％、好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：０．００１〜０．１（％ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）。
【００９８】
これらの２種のサーファクタントを組み合わせて低濃度で存在させると、溶解状態の抗原の安定性が向上することが判明した。この強化された安定性により、従来の製剤よりも皮内投与でより免疫原性が増大した抗原となる可能性がある。このような強化は、小さな抗原凝集体が大部分を占めるかまたは抗原の天然のコンホメーションが強化されることが原因で生じる可能性がある。本発明は、この理論的解釈が正しいか否かに依存しない。
【００９９】
特定の実施態様では、好ましいウイルス成分調製物は、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％（ｗ／ｖ）の範囲でラウレス９をも含有する。
【０１００】
本発明に係るワクチンは、一般的には２５％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１５％未満、最も好ましくは約２％以下の界面活性剤またはサーファクタントを含有する。
【０１０１】
本発明は、別の態様において、皮内投与用のインフルエンザワクチンの製造方法を提供し、該方法は、以下のステップを含むものである：
（ｉ）従来の注射用（例えば筋肉内）インフルエンザワクチンと本質的に同じように製造されたインフルエンザウイルス成分調製物を準備し、少なくとも１種の非イオン性サーファクタントを含有させるステップ；
（ｉｉ）場合により、上記調製物中のヘマグルチニン濃度および／または非イオン性サーファクタント濃度を調整するステップ；
（ｉｉｉ）上記インフルエンザウイルス成分調製物からのワクチン用量を皮内送達デバイスに充填するステップであって、該用量が、皮内投与に適した量、好ましくは液状ワクチン約０．０５ｍｌ〜０．２ｍｌである、上記ステップ。
【０１０２】
本発明の上記態様の方法におけるさらなる任意ステップとしては、吸収促進サーファクタント（例えばラウレス９など）の添加、および／またはアジュバント（例えば無毒リピドＡ誘導体、特に３Ｄ−ＭＰＬ）の添加が挙げられる。
【０１０３】
従来の注射用不活化インフルエンザワクチンの製造方法は周知であり、文献に記載されている。かかる方法は、本発明において使用するための単回用量皮内ワクチンを製造するために改変を加えても良く、例えば、他の成分（非イオン性サーファクタント）の濃度を本発明の皮内ワクチンに適した割合（％（ｗ／ｖ））に調整するステップを導入してもよい。しかしながら、ワクチンの有効成分、すなわちインフルエンザ抗原は、従来の筋肉内ワクチン及び本発明の単回用量皮内ワクチンで本質的に同じものとすることができる。
【０１０４】
好ましくは、本発明のワクチン製剤は、単回用量ワクチンとして投与する場合には、全ての株についてＥＵ基準の少なくとも２つをみたさない製剤を含むものではない。
【０１０５】
次に、以下の実施例で本発明についてさらに説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０６】
インフルエンザウイルス成分ワクチンの調製
以下の手順にしたがって、ウイルス成分ワクチン用の各株を調製した。
【０１０７】
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【０１０８】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【０１０９】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。場合により、粗製一価ウイルスバルクに０．１００ｍｇ／ｍｌのチオメルサールを添加する。
【０１１０】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【０１１１】
２．吸着ステップ
ＣａＨＰＯ４ゲルを含有する清澄化ウイルスプールを得るために、ＣａＨＰＯ４の最終濃度がウイルス株に応じて１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルになるように０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４溶液および０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２溶液を添加する。
【０１１２】
少なくとも８時間かけて沈降させた後、上清を除去し、ＣａＨＰＯ４の使用量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することにより、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を再び可溶化させる。
【０１１３】
３．濾過
再懸濁させた沈降物を６μｍ濾過膜で濾過する。
【０１１４】
４．スクロース勾配遠心
１００μｇ／ｍｌのチオメルサールを含有する線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１１５】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１ ５５〜５２％スクロース
・画分２ 約５２〜３８％スクロース
・画分３ ３８〜２０％スクロース＊
・画分４ ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【０１１６】
さらなるワクチン調製では、画分２および３のみを使用する。
【０１１７】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【０１１８】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットルの体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１１９】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させる。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１２０】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１２１】
６．滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１２２】
７．不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を添加する。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１２３】
８．限外濾過
２０ｋＤａ ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化スプリットウイルス物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。
【０１２４】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。ＳＲＤ（ＷＨＯが推奨する方法）により測定されるヘマグルチニンの最終濃度は、４５０μｇ／ｍｌを超えるようにしなければならない。
【０１２５】
１０．保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【０１２６】
純度
クーマシー染色したポリアクリルアミドゲルをＯ．Ｄ．走査することにより、半定量的に純度を決定した。手作業でピークを決定した。サンプルの結果を表１に示す。
【０１２７】
【０１２８】
株の特定の組合せとしては、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０／９９（Ｈ３Ｎ２）、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８が挙げられる。
【実施例２】
【０１２９】
バルクワクチンからのワクチン用量の調製
所要により界面活性剤濃度を調整して、一価バルクから三価ワクチンを製剤化することにより、最終ワクチンを調製する。
【０１３０】
ＰＢＳ（ｐＨ７．２±０．２）、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００を混合して、所要の最終濃度（ＰＢＳ１倍濃縮、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．１５％、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０２％）を得る。以下の３種の不活化ビリオン成分を、１０分間撹拌しながら添加する：
１５μｇ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）
１５μｇ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０／９９（Ｈ３Ｎ２）
１５μｇ Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８
【０１３１】
１５分間撹拌後、ｐＨを７．２±０．２に調整する。投与量は５００μｌである。滅菌アンプル中にその用量を充填する。ワクチンを投与する直前に、皮内投与デバイスを用いて０．１ｍｌ用量をアンプルから取出す。
【実施例３】
【０１３２】
抗体応答の測定に使用される方法
１．ＥＬＩＳＡによるヒト鼻分泌物中の特異的抗インフルエンザおよび全ＩｇＡの検出
ヒト鼻分泌物の採取方法
適切な方法、たとえば、古典的な鼻洗浄法または鼻吸引法を用いて鼻分泌物を採取する。
【０１３３】
ヒト鼻分泌物の採取および処理を行った後、たとえばＥＬＩＳＡを用いて、全抗インフルエンザＩｇＡおよび特異的抗インフルエンザＩｇＡの検出を行う。
【０１３４】
全ＩｇＡを検出するための捕捉ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート上に固定された抗ヒトＩｇＡポリクローナルアフィニティー精製Ｉｇを用いて全ＩｇＡを捕捉し、続いて、ペルオキシダーゼに結合されたさまざまなポリクローナル抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１３５】
精製ヒトｓＩｇＡを標準として使用し、採取した鼻分泌物中のｓＩｇＡの定量を行う。
【０１３６】
精製ヒトｓＩｇＡの３種の対象標準を、この検定における低、中および高対象標準として用いる。
【０１３７】
特異的抗インフルエンザＩｇＡを検出するための直接ＥＬＩＳＡ
ワクチン製剤中に存在する各インフルエンザ株に対して３つの異なるＥＬＩＳＡを実施する。
【０１３８】
マイクロタイタープレート上にコーティングされたスプリット不活化インフルエンザ抗原を用いて特異的抗インフルエンザＩｇＡを捕捉し、続いて、全ＩｇＡ ＥＬＩＳＡに用いたＩｇと同じようにペルオキシダーゼに結合されたさまざまなポリクローナル抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１３９】
結果−表現および計算
全ＩｇＡの発現
Ｓｏｆｔｍａｘｐｒｏプログラムを用いて、鼻汁１ｍｌ中の全ＩｇＡのμｇとして結果を表す。
【０１４０】
特異的抗インフルエンザＩｇＡの発現
終点単位の力価として結果を表す。これは、カットオフ値を上回るＯＤ４５０ｎｍを示す最終希釈度の逆数として計算される。
【０１４１】
サンプルの最終結果を次のように表す：
特異的応答と全ＩｇＡ濃度との比を計算することにより特異的応答を正規化する：終点単位／μｇ全ＩｇＡ（文献中で最も一般的に用いられる計算方法）。
【０１４２】
２．インフルエンザ特異的血清抗体の血球凝集阻害（ＨＡＩ）活性
２００μｌのＲＤＥ（受容体破壊酵素）を用いて血清（５０μｌ）を３７℃で１６時間処理する。１５０μｌの２．５％クエン酸ナトリウムを用いて反応を停止させ、５６℃で３０分間かけて血清を不活化させる。１００μｌのＰＢＳを添加することにより、１：１０希釈液を調製する。次に、２５μｌの血清（１：１０）を２５μｌのＰＢＳで希釈することにより、９６ウェルプレート（Ｖ底）中に２倍希釈系列を調製する。２５μｌの参照抗原を２５μｌあたり４血球凝集単位の濃度で各ウエルに添加する。マイクロタイタープレート振盪器を用いて抗原と抗血清希釈液とを混合し、室温で６０分間インキュベートする。次に、５０μｌのニワトリ赤血球（ＲＢＣ）（０．５％）を添加し、室温で１時間かけてＲＢＣを沈降させる。ＨＡＩ力価は、ウイルス誘発血球凝集を完全に阻害する最終血清希釈度の逆数に相当する。
【実施例４】
【０１４３】
皮内インフルエンザワクチン（ＦｌｕＩＤ）の免疫原性および反応原性
皮内送達される本発明のインフルエンザワクチンの効力を評価するために、ヒト被験者に対して臨床試験を行った。この試験に使用したワクチン（ＦｌｕａｒｉｘＴＭ）は、実施例１および２に従って作製したものである。
【０１４４】
１００名の健常な男性および女性ボランティア（年齢１８〜６０歳）を登録し、無作為に２つのグループ（１グループあたり５０名の被験者）に分けた。２つの投与経路によりワクチンを投与した。
【０１４５】
・三価インフルエンザウイルス成分ワクチン（ＦｌｕａｒｉｘＴＭ）の筋肉内投与：
１用量→０日目
利き腕でない腕の三角筋部に筋肉内注射すべく、充填済みシリンジとしてワクチンを供給した。試験ワクチンの適切な筋肉内注射が行えるように、少なくとも２３Ｇ（２．２ｃｍ／１インチ）の長さの針を使用した。
【０１４６】
・三価インフルエンザウイルス成分ワクチン（ＦｌｕａｒｉｘＴＭ）の皮内投与：
１／５用量→０日目
０．５ｍｌのアンプル用量としてワクチンを供給した。ＥＰ１０９２４４４号に開示されているようなデバイスを用いて、全用量（１００μｌ）の１／５を皮内に注射した。該特許の全内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。このデバイスは、真皮への針の侵入具合を効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する。有効な針の長さは約１．５ｍｍであった。本明細書中では、このデバイスをＩＤ送達デバイスまたは「ＩＤＤ」と記す。
【０１４７】
試験の継続時間は、約２１日間であり、被験者１名あたりワクチン１用量だけをグループに応じて筋肉内または皮内に投与した。０日目および２１日目に血液をサンプリングした。
【０１４８】
試験集団は次のとおりであった：
【０１４９】
ワクチン接種を受けた２グループの被験者の集団統計学的プロフィールは、平均年齢、性別、および人種の分布に関して同等であった。
【０１５０】
免疫原性
それぞれの処置グループに対して、免疫原性の次のパラメーターを計算した：
・ｌｏｇ力価の平均値の真数を求める変換を行うことにより、０日目および２１日目におけるＨＩ抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）（９５％信頼区間を有する）を計算した（計算の都合上、カットオフ値未満の力価については、任意値としてカットオフの半分の値を与えた）
・アッセイカットオフよりも大きいかまたはそれに等しい力価を有する被験者の割合（％）として定義される０日目および２１日目におけるＨＩ抗体力価の血清反応陽性（Ｓ＋）率
・０日目と比較して２１日目の血清ＨＩ ＧＭＴの増加倍率として定義される２１日目におけるコンバージョン係数
・０日目と比較して２１日目に血清ＨＩ力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）として定義される２１日目におけるセロコンバージョン率（ＳＣ）
・ワクチン接種後、血清ＨＩ力価≧１：４０を有するワクチン被接種者の割合（％）として定義される２１日目における防御率。
【０１５１】
実験室アッセイおよび時間点
すべての血清サンプルを−２０℃に保持し、適切な手段を講じて、サンプルがいかなる時点でも解凍しなかったことを確認した。通院するたびに、ＨＩ抗体応答の測定に供すべく血液を採取した。
【０１５２】
WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Diseases Control, Atlanta, USA (1991)により記載された血球凝集阻害試験を用いて測定された血球凝集阻害抗体（ＨＡＩ）の力価により免疫応答を測定した。
【０１５３】
Saechsisches Serumwerk GmbH（SSW）, Dresden, Germanyで凍結血清サンプルを入手し、そして解凍後、４血球凝集単位（４ＨＩＵ）の適切な抗原および０．５％家禽赤血球懸濁液を用いて、標準化されかつ総合的に有効性が実証された測微法により、サンプルの抗体測定を行った。発育鶏卵の尿膜液から抗原Ａ（Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１）を全ウイルス抗原として得た。感度を増大させるために、Ｂ抗原を、エーテルとＴｗｅｅｎ ８０との混合物による分解処理に付した。熱処理および受容体破壊酵素により非特異的血清阻害剤を除去した。
【０１５４】
得られた血清のＨＩ抗体値を評価する。初期希釈度１：１０から始めて、最終希釈度１：２０４８０までの希釈系列（２倍希釈系列）を調製する。血球凝集の完全阻害（１００％）を示す最大希釈ステップを力価測定の終点とする。すべてのアッセイを２重反復試験方式で行う。
【０１５５】
結果
ＡＴＰ免疫原性コホートの被験者の数と全コホートの被験者の数とが同一になるように、包括解析（ＩＴＴ）方式（すなわち、全コホート）で免疫原性分析を行った。
【０１５６】
ＨＩ力価およびコンバージョン係数
３グループに対する０日目および２１日目におけるＨＩ抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）（９５％信頼区間を有する）を以下の表に示す：
【０１５７】
０日目に、３種の株（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ、Ａ／Ｐａｎａｍａ、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ）に関してグループ間の差は有意でなかった（ｐ＞０．０５）。２１日目には、皮内（ＩＤ）グループと筋肉内（ＩＭ）グループとの間に有意差（ｐ＜０．０００１）が観測された。
【０１５８】
しかしながら、０日目から２１日目までの力価の増加を比較したとき（コンバージョン係数、下記の表を参照されたい）、グループ間で有意差は測定されなかった（ｐ＞０．０５）。このことは、増加が全体的に同等であったことを意味する。
【０１５９】
ＨＩの結果では、皮内（ＩＤ）ワクチングループとＦｌｕａｒｉｘＴＭ筋肉内（ＩＭ）ワクチングループとを識別できない。
【０１６０】
【０１６１】
コンバージョン係数（０日目と比較した２１日目の血清ＨＩ ＧＭＴの増加倍率）は、ウイルス株および投与経路に応じて８．５〜１０．９の範囲で種々の値をとる（上記の表を参照されたい）。このコンバージョン係数は、欧州関係機関により要求されるＧＭＴの２．５倍増加よりも優れている。
【０１６２】
分類の判定基準として因子分析を含む分散分析を用いて、コンバージョン係数を比較した。処置グループ間の有意差（ｐ＞０．０５）は測定されなかった。
【０１６３】
血清防御率
以下の表に示される血清防御率は、ワクチン接種後、血清ＨＩ力価≧４０を有するワクチン被接種者の割合（％）として定義される。
【０１６４】
【０１６５】
２１日目に、グループの血清防御率は、異なるウイルス株に対して９６％〜１００％の範囲であった。防御に関して、このことは、ワクチン接種後に９５％を超える被験者（投与経路に依らない）が血清ＨＩ力価≧４０を有し、３種の株から防御されたとみなされることを意味する。この率は、欧州関係機関により１８〜６０歳集団に要求される７０％の血清防御率よりも優れている。
【０１６６】
セロコンバージョン率
以下の表に示されるセロコンバージョン因子は、ワクチン接種後に血清ＨＩ力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）として定義される。
【０１６７】
【０１６８】
効果がありかつ欧州関係機関の要求基準に適合するとみなされるためには、ワクチンは、１８〜６０歳集団で４０％を超えるセロコンバージョン率を誘導するものでなければならない。本試験では、グループのセロコンバージョン率は６５％を上回った。
【０１６９】
反応原性
ワクチンの皮内投与は安全であり（深刻な有害事象は報告されなかった）、ワクチン接種に関連した全身症状についての報告はほとんどなく、臨床的に十分許容されるものであった。
【０１７０】
結論
・ＦｌｕａｒｉｘＴＭは、投与経路（ＩＤまたはＩＭ）に依らず単回用量投与後に高いセロコンバージョン率で各株に対して良好な免疫応答を誘発した
・ＦｌｕａｒｉｘＴＭの１／５用量を皮内投与して誘導された免疫応答と、全用量をＩＭ経路で投与して誘導された免疫応答との間には、有意差がなかった
・いずれのワクチン接種でも、以下のように、１８〜６０歳集団におけるインフルエンザ不活化ワクチンに対する欧州関係機関の要求基準が満たされた：すなわち、
・４０％を超えるセロコンバージョン率が得られる
・幾何平均力価が２．５倍よりも増大する
・７０％の血清防御率が得られる。
【実施例５】
【０１７１】
皮内インフルエンザワクチン（ＦｌｕＩＤ）の免疫原性および反応原性：試験２
インフルエンザウイルス抗原調製物の調製
以下の手順にしたがって、一価ウイルス成分ワクチンを調製した。
【０１７２】
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【０１７３】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【０１７４】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。
【０１７５】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【０１７６】
２．吸着ステップ
ＣａＨＰＯ４ゲルを含有する清澄化ウイルスプールを得るために、ＣａＨＰＯ４の最終濃度がウイルス株に応じて１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルになるように０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４溶液および０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２溶液を添加する。
【０１７７】
少なくとも８時間かけて沈降させた後、上清を除去し、ＣａＨＰＯ４の使用量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することにより、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を再び可溶化させる。
【０１７８】
３．濾過
再懸濁させた沈降物を６μｍ濾過膜で濾過する。
【０１７９】
４．スクロース勾配遠心
１００μｇ／ｍｌのチオメルサールを含有する線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１８０】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１ ５５〜５２％スクロース
・画分２ 約５２〜３８％スクロース
・画分３ ３８〜２０％スクロース＊
・画分４ ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【０１８１】
さらなるワクチン調製では、画分２および３のみを使用する。
【０１８２】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【０１８３】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットル（卵１２，０００個／バッチに適した体積）の体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１８４】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させ、Ｂ株ウイルスに対して０．５ｍＭまでのトコフェロールスクシネートを添加する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１８５】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１８６】
６．滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ株ウイルスに対しては０．５ｍＭトコフェロールスクシネート）を含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１８７】
７．不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を添加する。Ｂ株ウイルスについては、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸緩衝食塩水を希釈に利用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１８８】
８．限外濾過
２０ｋＤａ ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化スプリットウイルス物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。Ｂ株ウイルスについては、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸緩衝食塩水を用いて洗浄する。
【０１８９】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、所要により、タンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌを超えないようにかつヘマグルチニン濃度が１８０μｇ／ｍｌを超えるように、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ株ウイルスに対しては）０．１ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸塩緩衝食塩水で物質を希釈する。
【０１９０】
１０．保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【実施例６】
【０１９１】
インフルエンザワクチンの調製
３種の株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９ （Ｈ１Ｎ１） ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ （Ｈ３Ｎ２） Ｒｅｓｖｉｒ−１７、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価最終バルクを、実施例５に記載の方法に従って作製した。
【０１９２】
プーリング
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７についてはそれぞれ６０μｇ／ｍｌ、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９については６８μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度になるように、適切な量の一価最終バルクをプールした。Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびトコフェロールスクシネートを、それぞれ１，０００μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌに調整した。リン酸塩緩衝食塩水を用いて最終体積を３Ｌに調整した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜で完了する濾過を行い、三価最終バルクを得た。少なくとも０．１６５ｍＬの三価最終バルクをそれぞれのシリンジに充填した。
【０１９３】
ワクチン投与
充填済みシリンジでワクチンを供給し、三角筋部に皮内投与した。皮内（ＩＤ）針は、ＥＰ１０９２４４４号に記載のものであり、適切な皮内注射が行えるように皮膚侵入リミッターを備えていた。注射部位に膨疹（丘疹）が形成されればＩＤ投与の質が良くなるので、試験者は、ワクチン接種の３０分後に被験者の膨疹の正確なサイズを測定した。
【０１９４】
単回用量（１００μｌ）は以下の成分を含んだ：
【０１９５】
上記のワクチンを標準的な三価インフルエンザウイルス成分ワクチンＦｌｕａｒｉｘＴＭと比較した。Ｆｌｕａｒｉｘワクチンを充填済みシリンジで供給し、三角筋に筋肉内投与した。適切な皮内注射が行えるように、少なくとも２．５ｃｍ／１インチの長さの針（２３ゲージ）を使用した。
【０１９６】
単回用量（０．５ｍｌ）は以下の成分を含んだ：
【０１９７】
結果
ワクチン投与時における全コホートの平均年齢は、７０．４±６．２（標準偏差（Ｓ．Ｄ．））歳であり、女性／男性の比は１．７：１であった。
【０１９８】
【０１９９】
注射部位疼痛が６５名中１０名（１５．４％）のワクチン被接種者により報告されたが、これはＦｌｕａｒｉｘＴＭのＩＭ投与後のごく一般的な症状であった。ＩＤグループでは、６５名中３名（４．６％）のワクチン被接種者により疼痛が報告された。この差は統計的に有意であった（ｐ＝０．０３８；フィッシャーの精密検定）。したがって、ＩＤ投与を用いた場合、疼痛の頻度は減少する。
【０２００】
結論
インフルエンザワクチンのＩＤ投与により、高齢者集団において、等価な（１００％）血清防御が達成される。
【０２０１】
幾何平均力価、血清防御率、セロコンバージョン率、およびコンバージョン係数に関して、ＩＭおよびＩＤワクチン接種された個体で、ワクチン接種に対する同等の応答が見いだされた。ただし、ＩＤグループには１／２．５の抗原を接種した。
【０２０２】
２つの処置グループには、ワクチンに関連した応答型／非応答型全身症状の全体的な発生率に関して識別可能な差は見られなかった。
【実施例７】
【０２０３】
標準的針を用いる皮内送達
ブタにおいて標準的針を用いてＩＤ送達を行うことにより、インフルエンザウイルス成分ワクチンの免疫原性を評価した。
【０２０４】
ブタは、ヒトとの重要な生理学的類似性を示し、とくに、ブタ皮膚は、外観、解剖学的構造、および生理機能の点でヒト皮膚ときわめてよく類似している。したがって、皮膚の性質が重要となる試験は、ブタを用いれば最も適切に評価することが可能である。ブタはまた、インフルエンザ感染（Ａ株だけ）の自然宿主であるという利点をもつので、ブタを用いたワクチン候補の試験は適切なものである。
【０２０５】
４週齢のブタを用いて行った最初の免疫原性試験では、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ鼻腔内デバイス（たとえば、ＷＯ９１／１３２８１号、ＥＰ３１１８６３号Ｂ、およびＥＰ５１６６３６号Ｂに記載され、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍｂＨから市販されている）を用いて全不活化三価インフルエンザ（５０μｇの各ＨＡを含み、０．５％ラウレス−９でアジュバント添加されている）をそれぞれの鼻孔に２００μｌ〜１００μｌの全投与量で鼻腔内投与することにより、それぞれ６匹のブタからなる３つのグループに初回抗原刺激を行った。１１日目に２回目の抗原刺激用量を投与した。
【０２０６】
３９日目にＩＤ経路（ＦｌｕａｒｉｘＴＭもしくはＰＢＳ対照）またはＩＭ経路（ＦｌｕａｒｉｘＴＭのみ）のいずれかで動物にワクチン接種を行った。ＩＭワクチン接種を受けた動物は、０．５ｍｌの三価ＦｌｕａｒｉｘＴＭ（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｐａｎａｍａ Ｈ３Ｎ２株、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ株に由来するＨＡがそれぞれ１５μｇずつ含まれる）を前脚に投与することにより免疫感作した。ＩＤワクチン接種を受けた動物は、標準的針を用いて０．１ｍｌの三価ＦｌｕａｒｉｘＴＭ（各ＨＡが３μｇずつ含まれる）またはＰＢＳを投与することにより免疫感作した。
【０２０７】
５３日目に血液サンプルを取得し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗インフルエンザ活性に関する試験を行った。
【０２０８】
この最初の免疫原性試験の結果を図１に示す。この図には、株特異的ＥＬＩＳＡの読取値を用いたこの試験から得られた結果が示されている。
【０２０９】
図１の説明：
グループ１：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＭ １５μｇ ＨＡ
グループ２：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；三価ワクチンＩＤ ３μｇ ＨＡ
グループ３：２回のＩＮ抗原刺激（三価５０μｇ）；ＰＢＳ ＩＤ
【０２１０】
この結果から、ＩＭまたはＩＤ経路のいずれを用いても、抗原刺激されたブタに投与された三価インフルエンザワクチンの免疫原性が確証される。
【実施例８】
【０２１１】
アジュバント添加インフルエンザワクチンの皮内送達
プロトコール
０日目に２００μ１中の５μｇの三価全不活化インフルエンザウイルスを用いてモルモットに鼻腔内抗原刺激を行った。
【０２１２】
ワクチン接種（２８日目）
プーリング（実施例６）により得られた各抗原の最終濃度が、実施例６では６０μｇ／ｍｌであるのに対して１００μｌ中０．１μｇの用量になるよう１．０μｇ／ｍｌにしたこと以外は、実施例５および６に記載されているように、三価インフルエンザウイルス成分ワクチン１株あたりそれぞれ０．１μｇのＨＡを含有するワクチンを調製した。ツベルクリンシリンジを用いて、１００μｌのアジュバント添加またはアジュバント非添加の最終三価製剤を皮内投与した。
【０２１３】
採血（４２日目）
ＨＩアッセイにより抗体応答を測定することにより、アジュバント添加の効果を評価した（０、２８、４２日目）。
【０２１４】
ＩＤ実験はすべて、標準的針を用いて行った。
【０２１５】
結果
Ｇ１〜Ｇ５は、１グループあたり５匹のモルモットからなる５つのグループを表す：
Ｇ１ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ
Ｇ２ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ ５０μｇ
Ｇ３ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ １０μｇ
Ｇ４ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ ５０μｇ＋ＱＳ２１ ５０μｇ
Ｇ５ ウイルス成分ワクチン 三価 チオメルサール 減量 ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ １０μｇ＋ＱＳ２１ １０μｇ
【０２１６】
注記）３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１は、コレステロールを含む単ラメラ小胞を備えたアジュバント製剤であって、該単ラメラ小胞は、ジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有し、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、脂質二重層と会合しているかまたはその中に包埋されているものである。そのようなアジュバント製剤については、ＥＰ０８２２８３１号Ｂに記載されている。その開示内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２１７】
【０２１８】
この実施例に提示されたデータから、ブタを用いて先の実施例で得られた結果が確証および拡張される。三価インフルエンザワクチンのＩＤ投与を行うと、抗原刺激された動物（ブタのほかにモルモットにおいても）で強力な免疫応答が誘発される。このほか、アジュバントがこの免疫応答をさらに増大させる可能性があることが例証される。２つの異なる用量の３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１では、アジュバント非添加三価インフルエンザウイルス成分抗原でワクチン接種することにより誘発される抗体力価が著しく増大することがわかった。したがって、インフルエンザＩＤワクチンを良好に増強（アジュバント）することができ、得られた生成物により、ワクチン接種を受けた個体において増強された免疫応答を誘発することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮への針の侵入を約１．５ｍｍの深さに効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する皮内短針送達デバイス、および、三価非生インフルエンザ抗原調製物を用いて製造され、ヒト集団において３つのインフルエンザ株の全てに対する防御免疫応答を誘導することができる単回用量インフルエンザワクチンを含む、皮内送達用のワクチンキット。
【請求項２】
真皮への針の侵入を約１．５ｍｍの深さに効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する皮内短針送達デバイス、および、以下の方法により取得される三価インフルエンザ抗原調製物を用いて製造され、ヒト集団において３つのインフルエンザ株の全てに対する防御免疫応答を誘導することができるインフルエンザワクチンを含む、皮内送達用のワクチンキット：
（ｉ） 培養物からのウイルス含有物質の採取；
（ｉｉ） 採取した物質の清澄化による非ウイルス物質の除去；
（ｉｉｉ） 採取したウイルスの濃縮；
（ｉｖ） 非ウイルス物質から全ウイルスを分離するさらなるステップ；
（ｖ） 密度勾配遠心ステップにおける好適な分割剤を用いた全ウイルスの分割；
（ｖｉ） 濾過による望ましくない物質の除去；
ここで、上記ステップは、記載順に行われるが、必ずしも連続的である必要はない。
【請求項３】
ワクチンの容量が０．０５〜０．２ｍｌである、請求項１又は２記載のワクチンキット。
【請求項１】
真皮への針の侵入を約１．５ｍｍの深さに効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する皮内短針送達デバイス、および、三価非生インフルエンザ抗原調製物を用いて製造され、ヒト集団において３つのインフルエンザ株の全てに対する防御免疫応答を誘導することができる単回用量インフルエンザワクチンを含む、皮内送達用のワクチンキット。
【請求項２】
真皮への針の侵入を約１．５ｍｍの深さに効果的に限定する皮膚接触エレメントを有する皮内短針送達デバイス、および、以下の方法により取得される三価インフルエンザ抗原調製物を用いて製造され、ヒト集団において３つのインフルエンザ株の全てに対する防御免疫応答を誘導することができるインフルエンザワクチンを含む、皮内送達用のワクチンキット：
（ｉ） 培養物からのウイルス含有物質の採取；
（ｉｉ） 採取した物質の清澄化による非ウイルス物質の除去；
（ｉｉｉ） 採取したウイルスの濃縮；
（ｉｖ） 非ウイルス物質から全ウイルスを分離するさらなるステップ；
（ｖ） 密度勾配遠心ステップにおける好適な分割剤を用いた全ウイルスの分割；
（ｖｉ） 濾過による望ましくない物質の除去；
ここで、上記ステップは、記載順に行われるが、必ずしも連続的である必要はない。
【請求項３】
ワクチンの容量が０．０５〜０．２ｍｌである、請求項１又は２記載のワクチンキット。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１７３６６４（Ｐ２００９−１７３６６４Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６３８３０（Ｐ２００９−６３８３０）
【出願日】平成２１年３月１７日（２００９．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５７３０４３（Ｐ２００２−５７３０４３）の分割
【原出願日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２１）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１７日（２００９．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５７３０４３（Ｐ２００２−５７３０４３）の分割
【原出願日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２１）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
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