新規な抗酸菌生育阻害剤
【課題】抗酸菌生育阻害剤を提供する。
【解決手段】
なお、Ｘ１は、−ＣＨ２−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）２、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）２、Ｘ２は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）２、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）２、Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基り、Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ２である。
【解決手段】
なお、Ｘ１は、−ＣＨ２−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）２、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）２、Ｘ２は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）２、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）２、Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基り、Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ２である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗酸菌生育阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌は、マイコバクテリウム科マイコバクテリウム属に属する真正細菌の総称であり、その呼称は、細胞壁に多量の脂肪酸を含むためグラム染色法等の通常の染色法に対し難染性を示すが、強力に染色された後は、酸アルコール処理による脱色に抵抗性を示すことに因んでいる。抗酸菌の中には、ヒトや動物に対する病原性を有するものが多数存在し、その代表例としては、結核菌（Mycobaterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、非結核性抗酸菌（病原性のものとしては、Mycobacterium avium、Mycobacterium kansasii等）が挙げられる。抗酸菌により引き起こされる疾患には、根治が困難なものや、最悪の場合には死に至るものも多いため、有効な薬剤の開発が重要な課題である。
【０００３】
従来、結核の治療には、ストレプトマイシン、カナマイシン等の抗結核薬が用いられている。非結核性抗酸菌感染症の治療には、抗結核薬と、クラリスロマイシン、ニューキノロン等の一般抗菌薬とを組み合わせた多剤併用療法が用いられている。しかし、これらの薬剤療法には、薬剤耐性の発現、副作用等の問題がある。また、適用可能な薬剤の種類が限定されているため、副作用が生じた場合に代替可能な薬剤がなく、減感作を行いながら投与を続行せざるを得ないという問題が生じる場合もある。
【０００４】
抗酸菌の細胞壁の構成成分であるリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）ならびにその前駆体であるホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が、抗酸菌の生育や宿主への感染の成立において重要な役割を果たしていることが近年の研究で明らかになった（例えば、非特許文献１および２参照）。そこで、抗酸菌におけるこれらの細胞壁構成リン脂質の生合成を阻害する化合物が、抗酸菌に由来する疾患の新規な治療薬として注目を集めている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、抗酸菌の細胞壁の構成成分であるリポマンナン（ＬＭ）および／またはリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の生合成を阻害する物質のスクリーニング方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８５１６３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Morita, Y. S., Patterson, J. H., Billman-Jacobe, H., and McConville, M. J. Biochem J 378, 589-597 (2004)
【非特許文献２】Morita, Y. S., Velasquez, R., Taig, E., Waller, R. F., Patterson, J. H., Tull, D., Williams, S. J., Billman-Jacobe, H., and McConville, M. J. J Biol Chem 280, 21645-21652 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＬＭおよび／またはＬＡＭの生合成経路は複数の反応からなるが、特許文献１記載のスクリーニング方法では、特定の反応に限定せず、そのいずれかを阻害する物質全般を広くスクリーニング対象としているため、スクリーニング効率が低いという課題が存在する。 また、ＬＭおよびＬＡＭの前駆体であるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の生合成経路には、抗酸菌と真核生物に共通する反応も存在するため、特許文献１記載のスクリーニング方法で得られる化合物の中には、治療対象である真核生物の生理機能にも悪影響を及ぼすものが含まれるおそれがある。
【０００９】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、抗酸菌の生育を選択的に阻害し、ヒト等の真核生物に対しては無害である抗酸菌生育阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、抗酸菌におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路について鋭意検討を行った結果、真核生物におけるそれとは一部異なる反応経路を有することを新たに見いだし、その反応をターゲットとすることにより、真核生物の生理機能に悪影響を与えることなく抗酸菌の生育を選択的に阻害する抗酸菌生育阻害剤の候補化合物を高効率でスクリーニングする方法を確立し、これを用いて新規な抗酸菌生育阻害剤を発見するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、次の態様に係るものである。
［１］ 下記の一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、並びに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有する抗酸菌生育阻害剤。
【００１２】
【化１】
【００１３】
なお、上記式（Ｉ）においてＸ1は、−ＣＨ2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
上記式（II）においてＸ2は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基であり、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ2である。
【００１４】
［２］ 下記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有する上記［１］記載の抗酸菌生育阻害剤。
【００１５】
【化２】
［３］ 上記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物ならびに該化合物のエナンチオマーの炭素数１以上１０以下の直鎖または分岐鎖アルキル基、あるいはシクロアルキル基を有する一級アンモニウム塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有する上記［２］記載の抗酸菌生育阻害剤。
［４］ 前記一級アンモニウム塩がシクロヘキシルアンモニウム塩である上記［３］記載の抗酸菌生育阻害剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒト等の真核生物に対しては無害であり、抗酸菌の生育を選択的に阻害する抗酸菌生育阻害剤およびそれを有効成分とする医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Mycobacterium smegmatisの増殖能に及ぼす抗酸菌生育阻害剤の効果を検討するために行ったコロニー増殖試験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
次に、本発明の第１の実施の形態に係る抗酸菌生育阻害剤（以下、「抗酸菌生育阻害剤」と略称する場合がある。）について説明する。
本実施の形態に係る抗酸菌生育阻害剤は、下記の一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有している。
【００１９】
【化３】
【００２０】
なお、上記式（Ｉ）においてＸ1は、−ＣＨ2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
上記式（II）においてＸ2は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基、好ましくはＨ、メチル基またはエチル基であり、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ2、好ましくはＯまたはＣＨ2である。
【００２１】
抗酸菌生育阻害剤として、上記一般式（Ｉ）または（II）で表される化合物、またはそれらのエナンチオマーの、医薬として許容される塩であってもよい。塩の具体例としては、ＮＨ4塩、一級、二級、三級または四級アンモニウム塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が挙げられるが、抗酸菌の細胞膜透過性を向上させるために、疎水性を有し、あまり嵩高くないシクロヘキシルアンモニウム塩等の、炭素数１以上１０以下の直鎖または分岐鎖アルキル基、あるいはシクロアルキル基を有する一級アンモニウム塩が好ましく用いられる。
【００２２】
従来、抗酸菌におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路は、真核生物におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路と同様、下記の（１）〜（３）の反応（化４参照）からなると考えられていた（例えば、Salman, M., Lonsdale, J. T., Besra, G. S., and Brennan, P. J., Biochim. Biophys. Acta 1436, 437-450 (1999)参照）。
（１）グルコース６−リン酸 → １Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸
（２）１Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸 →
ｍｙｏ−イノシトール＋リン酸
（３）ｍｙｏ−イノシトール＋ＣＤＰ−ジアシルグリセロール →
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）＋ＣＭＰ
【００２３】
【化４】
【００２４】
なお、式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ飽和または不飽和炭化水素基を表す。生体内において、ジアシルグリセロールはホスファチジン酸を経由して合成されるため、通常、Ｒ1は飽和炭化水素基であり、Ｒ2は不飽和炭化水素基である。
【００２５】
しかしながら、本発明者は、抗酸菌におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路について再検討を行った結果、正しくは、下記の（１）、（２’）および（３’）の反応（化５参照）からなることを見いだした。
（１）グルコース６−リン酸 → １Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸
（２’）１Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸＋ＣＤＰ−ジアシルグリセロール → ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）＋ＣＭＰ
（３’）ＰＩＰ → ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）＋リン酸
【００２６】
【化５】
【００２７】
上記の一般式（Ｉ）または（II）で表される化合物は、上記（２’）の反応（ＰＩＰの合成）を選択的に阻害するため、抗酸菌の宿主となる真核生物のＰＩの生合成に悪影響を与えることなく、抗酸菌におけるＰＩＰの生合成を選択的に阻害することで、抗酸菌の生育を阻害できる。ＰＩＰの合成の阻害機構については必ずしも明らかではないが、上記の化合物が、ＰＩＰ合成酵素（抗酸菌に特有なもので、真核生物には存在しない。）の基質である１Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸と構造が類似することから、これらの化合物がＰＩＰ合成酵素の阻害剤として作用していると考えられる。真核生物に存在し、上記の反応（３）を触媒するＣＤＰ−ジアシルグリセロール−イノシトール３−ホスファチジルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．８．１１）はＰＩＰ合成酵素とは異なるものである。
【００２８】
上記の一般式（Ｉ）または（II）で表される化合物のうち、抗酸菌生育阻害剤として好ましく用いることができる化合物としては、下記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物が挙げられる。
【００２９】
【化６】
【００３０】
これらの化合物は、任意の方法を用いて合成できるが、例えば、上記の式（Ｉ）−１および（Ｉ）−２で表される化合物は、下記のスキームに従い合成することができる。なお、これらの化合物は１−Ｄ体および１−Ｌ体の混合物として得られるが、下記のスキームでは一方の異性体のみ記載している（以下同様である）。
【００３１】
【化７】
【００３２】
抗酸菌生育阻害剤の標的となる抗酸菌の種類について特に制限はないが、好ましくは、ヒトや動物に対し病原性を有するものであり、その具体例としては、結核菌（Mycobaterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、非結核性抗酸菌（Mycobacterium avium、Mycobacterium kansasii等）が挙げられる。
【００３３】
抗酸菌生育阻害剤におけるＰＩＰ合成酵素阻害活性を評価する方法としては、抗酸菌生育阻害剤の存在下および非存在下でＰＩＰ合成酵素の活性を測定し、それぞれの場合における酵素活性の比から阻害活性を評価する方法が挙げられる。抗酸菌生育阻害剤におけるＰＩＰ合成酵素阻害活性をin vitroで評価するための評価系（アッセイ系）に用いられるＰＩＰ合成酵素は、抗酸菌の菌体から単離精製したものであってもよく、菌体をホモジナイズしたものをそのまま用いてもよく、あるいは、ＰＩＰ合成酵素をコードする遺伝子を大腸菌等に導入し発現させたものを用いてもよい。
抗酸菌としては、治療対象となる疾患の原因となる抗酸菌を用いてもよいが、M. smegmatis等の病原性を有しない抗酸菌を用いてもよい。
【００３４】
酵素活性（反応速度）または被検化合物の阻害活性は、一定時間後に反応液中に含まれる基質濃度または生成物（ＰＩＰ）濃度により求めることができる。被検化合物の存在下および非存在下にLineweaver-Burkプロットの比較より、被検化合物の阻害機構を判定することもできる。
基質濃度または生成物濃度は、基質にラジオアイソトープを用いた生成物の放射能測定、高速液体クロマトグラフィー等の任意の公知の手段を用いて行うことができる。
【実施例】
【００３５】
本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
【００３６】
［１］１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトールおよび１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール
上記のスキーム（化７参照）にしたがって標記化合物を合成した。
【００３７】
１，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００３８】
【化８】
【００３９】
窒素雰囲気下、室温でｍｙｏ−イノシトール（２５ｇ、１３８．８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液に２，２−ジメトキシプロパン（７５ｍＬ、６１２．１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で２時間攪拌した。溶液を氷浴で冷やし、トリエチルアミン（５ｍＬ）を加えた。濾過した後、トルエン（１２．５ｍＬ）を加え、４０℃で減圧濃縮し低沸点溶媒を取り除いた。そのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液にピリジン（７５ｍＬ、９２９．２ｍｍｏｌ）を加えた後、氷浴で冷やしながら塩化ベンゾイル（１００ｍＬ、８６０．８ｍｍｏｌ）を１５分かけて一滴ずつ滴下し２時間攪拌した。析出した固体を吸引濾過し、ピリジン、水、アセトン、ジエチルエーテルの順で洗浄することで１，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール１を白色固体１６．２ｇ（収率２５％）で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.30 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 3.73 (dd, J = 11.0, 9.4Hz, 1H), 4.36-4.41 (m, 2H), 4.79 (dd, J = 4.6, 4.6Hz, 1H), 5.43 (dd, J = 10.6, 4.4Hz, 1H), 5.61(dd, J = 11.1, 6.7Hz, 1H), 7.43-7.49(m, 4H), 7.55-7.62 (m, 2H), 8.09-8.16 (m, 4H)
【００４０】
２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００４１】
【化９】
【００４２】
窒素雰囲気下、室温で水酸化ナトリウム（０．４１ｇ、１０．１７ｍｍｏｌ）のメタノール（２１．７ｍＬ）溶液に１，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール１（１．０２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を加え、５時間過熱還流した。溶液を氷浴で冷やし、緩衝溶液を加えて反応を止めた。ジクロロメタンで１０回抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をヘキサンと酢酸エチルを用いて再結晶することで２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール２を結晶４３４．４ｍｇ（収率７７％）で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 1.38 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 2.34 (d, J = 8.9Hz, 1H), 2.40(d, J = 3.0Hz, 1H), 3.33 (dd, J = 10.6, 9.4Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 9.9, 9.6Hz, 1H), 3.88-3.93 (m, 1H), 4.01-4.09 (m, 2H), 4.49 (dd, J = 4.8, 4.8Hz, 1H)
【００４３】
１−Ｏ−ベンジル-２，３：５，６-ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ-イノシトール
【００４４】
【化１０】
【００４５】
窒素雰囲気下、室温で２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール２（３．１３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）溶液に水素化ナトリウム（０．５８ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌した。その溶液にベンジルブロミド（１．４４ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌し、緩衝溶液を加えて反応を止めた。酢酸エチルで２回抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで１−Ｏ−ベンジル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール３を白色固体２．２１ｇ（収率５３％）で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 1.34 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.49 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 2.38 (d, J = 2.8Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 9.9, 9.7Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 10.2, 4.2Hz, 1H), 3.87-3.90 (m, 1H), 3.91-3.95 (m, 1H), 4.05 (dd, J = 9.8, 9.6Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 4.4, 4.4Hz, 1H), 4.81 (d, J = 12.6Hz, 1H), 4.89 (d, J = 12.6Hz, 1H), 7.26-7.43 (m, 5H)
【００４６】
１−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００４７】
【化１１】
【００４８】
アルゴン雰囲気下、室温で１−Ｏ−ベンジル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール３（１．３９ｇ、３．９６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン（ＤＢＵ、１．１９ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．０４８ｇ、０．３９６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（０．８９６ｇ、５．９４ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間攪拌した。緩衝溶液を加えて反応を止め、酢酸エチルで２回抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで１−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール４を１．８０ｇ（収率９８％），黄色のオイルで得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H), 0.89 (s, 9H) 1.33 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 3.19 (dd, J = 9.5, 9.4Hz, 1H), 3.72-3.81 (m, 2H), 3.88 (dd, J = 5.0, 4.9Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 9.9, 9.6Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 4.6, 4.5Hz, 1H), 4.80 (d, J = 12.5Hz, 1H), 4.87 (d, J = 12.5Hz, 1H), 7.26-7.42 (m, 5H)
【００４９】
４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００５０】
【化１２】
【００５１】
水素雰囲気下、室温で１−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール４（１．８０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）のエタノール（４．４ｍＬ）溶液に水酸化パラジウム（０．１８０ｇ，１０ｗｔ％），トリエチルアミン（０．６７４、０．４．８４ｍｍｏｌ）を加え、３日間攪拌した。溶液をセライトろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することで４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール５を１．４３ｇ（収率９９％），白色固体で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.10 (s, 3H), 0.11 (s, 3H), 0.91 (s, 9H) 1.36 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 2.30 (d, J = 8.9Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 10.3, 9.5Hz, 1H), 3.76 (dd, J = 9.9, 9.7Hz, 1H), 3.79 (dd, 10.5, 6.1Hz, 1H), 3.95-4.00 (m, 1H), 4.02 (dd, J = 5.8, 5.3Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 4.8, 4.8Hz, 1H)
【００５２】
（２，３，５／４，６）−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン
【００５３】
【化１３】
【００５４】
アルゴン雰囲気下、０℃でＮ−クロロスクシンイミド（１．０１ｇ、７．５６ｍｍｏｌ）のトルエン（８ｍＬ）溶液にジメチルスルフィド（０．５６ｍＬ、７．５６ｍｍｏｌ）を加え、−２５℃まで温度を下げた。−２５℃で混合溶液に４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール５（０．４７０ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）のトルエン（４ｍＬ）溶液を一滴ずつ加え、−２５〜−３５℃で３時間攪拌した。その溶液にトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３０ｍｍｏｌ）を加えた後、冷却浴を外し、室温にもどした。０℃で飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を止め、エーテルで抽出し、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで（２，３，５／４，６）−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン６を３８４．６ｍｇ（収率＜８２％）、ブラウンオイルで得られた。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.14 (s, 3H), 0.16 (s, 3H), 0.93 (s, 9H) 1.34 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 3.64 (dd, J = 11.2, 9.9Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 9.8, 4.3Hz, 1H), 4.24-4.30 (m, 2H), 4.57 (d, J = 11.2Hz, 1H)
【００５５】
４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−ジエトキシホスホリルメチリデン−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−シクロヘキサンペントール
【００５６】
【化１４】
【００５７】
アルゴン雰囲気下、０℃でメチレンジリン酸ジエチル（２．６ｍＬ、４．１２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液にｎ−ブチルリチウム（１．５８Ｍヘキサン溶液、２．６ｍＬ、４．１２ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間攪拌した。その混合溶液に（２，３，５／４，６）−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン６（３８４．６ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液を一滴ずつ加え、０℃で２時間攪拌した。緩衝溶液を加えて反応を止め、酢酸エチルで２回抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−ジエトキシホスホリルメチリデン−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−シクロヘキサンペントール７を３８９．０ｇ（収率７４％），黄色のオイルで得た。
(major isomer) 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.11 (s, 3H), 0.12 (s, 3H), 0.91(s, 9H), 1.30 (dt, J = 7.1,1.0Hz, 6H), 1.36 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.49 (s, 6H), 3.44 (dd, J = 10.1, 10.0Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 10.0, 5.9Hz, 1H), 4.04-4.18 (m, 5H), 4.38-4.42 (m, 1H), 4.46 (d, J = 5.5Hz, 1H), 5.90 (dd, J = 13.9, 1.7 Hz, 1H),
(minor isomer) 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.09 (s, 6H), 0.88(s, 9H), 1.32 (t, J = 7.1Hz, 6H), 1.35 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 3.75 (dd, J = 7.0, 5.5Hz, 1H), 4.04-4.26 (m, 5H), 4.54-4.57 (m, 1H), 4.77 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.22-5.25 (m, 1H), 6.01 (dd, J = 15.2, 1.6Hz, 1H)
【００５８】
４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００５９】
【化１５】
【００６０】
水素雰囲気下、室温で４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−ジエトキシホスホスホリルメチリデン−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−シクロヘキサンペントール７（３５．９ｍｇ、０．０７１）の酢酸エチル（１．０ｍＬ）溶液に酸化白金（７．１８ｍｇ、２０ｗｔ％）を加え、２１時間攪拌した。溶液をセライトろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−1−デオキシ-1−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール８を２９．５ｇ（収率８１％），黄色のオイルで得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.10 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 1.32 (t, J = 7.0Hz, 6H), 1.34 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 1.39 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 2.12-2.19 (m, 2H), 2.26-2.36 (m, 1H), 3.26 (dd, J =10.2, 9.2Hz, 1H), 3.50 (dd, J = 10.7, 9.2Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 10.3, 6.4Hz, 1H), 4.07-4.13 (m, 4H), 4.50 (dd, J = 4.7, 4.6Hz, 1H)
【００６１】
１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００６２】
【化１６】
【００６３】
アルゴン雰囲気下、０℃で４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール８（１４．９ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１ｍＬ）にテトラブチルアンモンミウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液、０．０８７ｍＬ、０．０８７ｍｍｏｌ）を加え、０℃で０．５時間攪拌した後、室温で５時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止め、酢酸エチルで２回抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルのみ、Ｒｆ＝０．０８）で精製することで１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール９を１０．５ｇ（収率９２％），黄色のオイルで得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 1.34 (t, J = 7.1Hz, 6H), 1.35 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.44 (s, 6H), 1.49 (s, 3H), 2.14-2.20 (m, 2H), 2.33-2.42 (m, 1H), 3.35 (dd, J = 10.5, 9.1Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 10.8, 9.3Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 10.6, 6.7Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 6.6, 5.2Hz, 1H), 4.07-4.16 (m, 4H), 4.56 (dd, J = 4.6, 4.3Hz, 1H)
【００６４】
１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール
【００６５】
【化１７】
【００６６】
窒素雰囲気下、室温で１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール９（１７２．８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４．４ｍＬ）溶液に乾燥させたヨウ化ナトリウム（４２６．７ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）とトリメチルシリルクロリド（０．３６ｍＬ、２．８５ｍｍｏｌ）を加え、遮光して６７時間攪拌した。水を加えて反応を止め、水層をヘキサンとエーテルで洗浄し減圧濃縮し、陽イオン交換カラムを行った。水を凍結乾燥することで１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール１０を４５．０ｍｇ（＜３４％），白色固体で得た。
1H-NMR (400MHz, D2O) δ : 1.80-1.95 (m, 2H), 2.02-2.15 (m, 1H), 3.26-3.37 (m, 2H), 3.51 (dd, J = 9.9, 2.9Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 9.8, 9.0Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 2.5, 2.0, 1H)
【００６７】
１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール
【００６８】
【化１８】
【００６９】
窒素雰囲気下、室温で４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール８（１３５．５ｍｇ、０．２６６ｍｍｏｌ）の溶液（溶媒 トリフルオロ酢酸：水＝２：１）を３時間攪拌し、減圧濃縮し凍結乾燥することで１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール１１を８３．６ｍｇ（収率ｑｕａｎｔ）、白色固体で得た。
1H-NMR (400MHz, D2O) δ : 1.33 (t, J = 7.0Hz, 6H), 1.81-1.90 (m, 1H), 2.06-2.14 (m, 1H), 2.17-2.31 (m, 1H), 3.27-3.38 (m, 2H), 3.56 (dd, J = 9.6, 2.4Hz, 1H), 3.61 (dd, J = 9.3, 9.2Hz, 1H), 4.06-4.22 (m, 5H)
【００７０】
上記の［１］で合成した１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトールおよび１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトールを含む下記の化合物を用いて、ＰＩＰ合成酵素の阻害活性および抗酸菌生育阻害活性を検討した。
【００７１】
【化１９】
【００７２】
［２］ＰＩＰ合成酵素の阻害活性の測定
（１）遺伝子組換え操作によるＰＩＰ合成酵素の発現
結核菌（M.tuberculosis）のＡＩＰ合成酵素と同一のアミノ酸配列を有するＢＣＧ（M.bovis）のＰＩＰ合成酵素の遺伝子を組み込んだプラスミド（pET21a-BCG-PIPS）を構築し、これを大腸菌（E.coli）に導入し、ＰＩＰ合成酵素を発現させた。
【００７３】
（２）酵素活性測定
ＣＤＰ−ジアシルグリセロールと［14Ｃ］イノシトール１−リン酸に緩衝液を加え、酵素として（１）にしたがいＰＩＰ合成酵素を発現させたE.coliのホモジネートを加えて反応させた後、有機溶媒可溶性生成物の放射能を測定した。
【００７４】
（３）ＰＩＰ合成酵素活性測定
０．２ｍＭ ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、０．０４ｍＭ ［14Ｃ］イノシトール１−リン酸（８Ｃｉ／ｍｏｌ）（８ｎｍｏｌ、２３８１Ｂｑ／アッセイ）、５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．０％ＣＨＡＰＳ、酵素溶液（タンパク量２０μｇ）（全容量０．２ｍＬ）を３７℃で１０分間反応させた。（脂質基質は［14Ｃ］イノシトール１−リン酸と１．０％ＣＨＡＰＳと酵素溶液以外の反応溶液中で室温、２０分間超音波処理して懸濁した。）反応後、０．１Ｍ ＨＣｌ／メタノールと１Ｍ ＭｇＣｌ2（ｐＨ２）を加え、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法の比率で水層とクロロホルム層に分画し、クロロホルム可溶性生成物の放射能を測定した。
【００７５】
［３］抗酸菌生育阻害活性の検討
１ウェルに×２普通ブイヨン培地Nutrient broth＋１００μｇ／ｍＬアンピシリンを１００μＬ、２ウェルから１２ウェルまではNutrient broth＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを１００μＬ加える。１ウェルに阻害剤を１００μＬ加え、１０ウェルまで２倍段階希釈した（各ウェルの阻害剤濃度は次のとおりである。１ウェル：１０ｍＭ、２ウェル：５ｍＭ、３ウェル：２．５ｍＭ、４ウェル：１．２５ｍＭ。以下同様。）。Mycobacterium smegmatis mc2155（1%小川培地3日培養菌）をPBSにケン濁後５μｍフィルターを通し単個菌（３．９×１０7ＣＦＵ／ｍＬ）にしたものを菌液とし、１０μＬずつ１〜１１ウェルに加える。これをプレートミキサーに掛け、３７℃で３日間培養後、判定を行った（表１）。
抗酸菌は菌同士が接着しプレートの底に沈むため、９６ウェルマイクロプレートの結果を濁度ＯＤ600で示すことは困難である。そこで、各ウェルの菌液を採取し、寒天培地でのコロニー形成能をみた。具体的には、９６ウェルマイクロプレートでの結果判定後、滅菌つまようじを用い、各ウェルの液を混和後、普通寒天培地へ接種し３７℃で４日間培養した（図１）。
【００７６】
［４］結果
結果を表１および図１に示す。表１は各種化合物のPIP合成酵素相対活性およびM.smegmatisの増殖阻害試験の結果である。「＋」の数は、増殖の程度を、「−」は菌の増殖が認められなかったことを示す。また、図１は、増殖阻害試験に使用したマイクロプレートより、普通寒天培地に菌を接種し、コロニー形成能を検討した結果を示す写真である。図１において明らかなように、マイクロプレート法の増殖阻害試験結果（表１）と同様の結果が得られた。
いずれの化合物についても、in vitroでＰＩＰ合成酵素活性の阻害を示したが、Ｉｎｏ−Ｃ−ＣＯＯＨおよびＤＬ−Ｉｎｏ−Ｃ−Ｐ（ＯＨ）2は、M.smegmatisの増殖を阻害することができなかった。後者については、シクロヘキシルアンモニウム塩とすることで、高い増殖阻害活性を示すことが認められた。シクロヘキシルアンモニウム塩酸塩のみを２０ｍＭ加えてもM.smegmatisの増殖が認められた。従って、疎水性カチオンとの塩にすることにより、ＤＬ−Ｉｎｏ−Ｃ−Ｐ（ＯＨ）2の細胞膜透過性が増大し、菌体内への取り込みが促進されたためと考えられる。
【００７７】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗酸菌生育阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌は、マイコバクテリウム科マイコバクテリウム属に属する真正細菌の総称であり、その呼称は、細胞壁に多量の脂肪酸を含むためグラム染色法等の通常の染色法に対し難染性を示すが、強力に染色された後は、酸アルコール処理による脱色に抵抗性を示すことに因んでいる。抗酸菌の中には、ヒトや動物に対する病原性を有するものが多数存在し、その代表例としては、結核菌（Mycobaterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、非結核性抗酸菌（病原性のものとしては、Mycobacterium avium、Mycobacterium kansasii等）が挙げられる。抗酸菌により引き起こされる疾患には、根治が困難なものや、最悪の場合には死に至るものも多いため、有効な薬剤の開発が重要な課題である。
【０００３】
従来、結核の治療には、ストレプトマイシン、カナマイシン等の抗結核薬が用いられている。非結核性抗酸菌感染症の治療には、抗結核薬と、クラリスロマイシン、ニューキノロン等の一般抗菌薬とを組み合わせた多剤併用療法が用いられている。しかし、これらの薬剤療法には、薬剤耐性の発現、副作用等の問題がある。また、適用可能な薬剤の種類が限定されているため、副作用が生じた場合に代替可能な薬剤がなく、減感作を行いながら投与を続行せざるを得ないという問題が生じる場合もある。
【０００４】
抗酸菌の細胞壁の構成成分であるリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）ならびにその前駆体であるホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が、抗酸菌の生育や宿主への感染の成立において重要な役割を果たしていることが近年の研究で明らかになった（例えば、非特許文献１および２参照）。そこで、抗酸菌におけるこれらの細胞壁構成リン脂質の生合成を阻害する化合物が、抗酸菌に由来する疾患の新規な治療薬として注目を集めている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、抗酸菌の細胞壁の構成成分であるリポマンナン（ＬＭ）および／またはリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の生合成を阻害する物質のスクリーニング方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８５１６３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Morita, Y. S., Patterson, J. H., Billman-Jacobe, H., and McConville, M. J. Biochem J 378, 589-597 (2004)
【非特許文献２】Morita, Y. S., Velasquez, R., Taig, E., Waller, R. F., Patterson, J. H., Tull, D., Williams, S. J., Billman-Jacobe, H., and McConville, M. J. J Biol Chem 280, 21645-21652 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＬＭおよび／またはＬＡＭの生合成経路は複数の反応からなるが、特許文献１記載のスクリーニング方法では、特定の反応に限定せず、そのいずれかを阻害する物質全般を広くスクリーニング対象としているため、スクリーニング効率が低いという課題が存在する。 また、ＬＭおよびＬＡＭの前駆体であるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の生合成経路には、抗酸菌と真核生物に共通する反応も存在するため、特許文献１記載のスクリーニング方法で得られる化合物の中には、治療対象である真核生物の生理機能にも悪影響を及ぼすものが含まれるおそれがある。
【０００９】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、抗酸菌の生育を選択的に阻害し、ヒト等の真核生物に対しては無害である抗酸菌生育阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、抗酸菌におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路について鋭意検討を行った結果、真核生物におけるそれとは一部異なる反応経路を有することを新たに見いだし、その反応をターゲットとすることにより、真核生物の生理機能に悪影響を与えることなく抗酸菌の生育を選択的に阻害する抗酸菌生育阻害剤の候補化合物を高効率でスクリーニングする方法を確立し、これを用いて新規な抗酸菌生育阻害剤を発見するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、次の態様に係るものである。
［１］ 下記の一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、並びに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有する抗酸菌生育阻害剤。
【００１２】
【化１】
【００１３】
なお、上記式（Ｉ）においてＸ1は、−ＣＨ2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
上記式（II）においてＸ2は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基であり、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ2である。
【００１４】
［２］ 下記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有する上記［１］記載の抗酸菌生育阻害剤。
【００１５】
【化２】
［３］ 上記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物ならびに該化合物のエナンチオマーの炭素数１以上１０以下の直鎖または分岐鎖アルキル基、あるいはシクロアルキル基を有する一級アンモニウム塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有する上記［２］記載の抗酸菌生育阻害剤。
［４］ 前記一級アンモニウム塩がシクロヘキシルアンモニウム塩である上記［３］記載の抗酸菌生育阻害剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒト等の真核生物に対しては無害であり、抗酸菌の生育を選択的に阻害する抗酸菌生育阻害剤およびそれを有効成分とする医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Mycobacterium smegmatisの増殖能に及ぼす抗酸菌生育阻害剤の効果を検討するために行ったコロニー増殖試験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
次に、本発明の第１の実施の形態に係る抗酸菌生育阻害剤（以下、「抗酸菌生育阻害剤」と略称する場合がある。）について説明する。
本実施の形態に係る抗酸菌生育阻害剤は、下記の一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有している。
【００１９】
【化３】
【００２０】
なお、上記式（Ｉ）においてＸ1は、−ＣＨ2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
上記式（II）においてＸ2は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基、好ましくはＨ、メチル基またはエチル基であり、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ2、好ましくはＯまたはＣＨ2である。
【００２１】
抗酸菌生育阻害剤として、上記一般式（Ｉ）または（II）で表される化合物、またはそれらのエナンチオマーの、医薬として許容される塩であってもよい。塩の具体例としては、ＮＨ4塩、一級、二級、三級または四級アンモニウム塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が挙げられるが、抗酸菌の細胞膜透過性を向上させるために、疎水性を有し、あまり嵩高くないシクロヘキシルアンモニウム塩等の、炭素数１以上１０以下の直鎖または分岐鎖アルキル基、あるいはシクロアルキル基を有する一級アンモニウム塩が好ましく用いられる。
【００２２】
従来、抗酸菌におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路は、真核生物におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路と同様、下記の（１）〜（３）の反応（化４参照）からなると考えられていた（例えば、Salman, M., Lonsdale, J. T., Besra, G. S., and Brennan, P. J., Biochim. Biophys. Acta 1436, 437-450 (1999)参照）。
（１）グルコース６−リン酸 → １Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸
（２）１Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸 →
ｍｙｏ−イノシトール＋リン酸
（３）ｍｙｏ−イノシトール＋ＣＤＰ−ジアシルグリセロール →
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）＋ＣＭＰ
【００２３】
【化４】
【００２４】
なお、式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ飽和または不飽和炭化水素基を表す。生体内において、ジアシルグリセロールはホスファチジン酸を経由して合成されるため、通常、Ｒ1は飽和炭化水素基であり、Ｒ2は不飽和炭化水素基である。
【００２５】
しかしながら、本発明者は、抗酸菌におけるホスファチジルイノシトールの生合成経路について再検討を行った結果、正しくは、下記の（１）、（２’）および（３’）の反応（化５参照）からなることを見いだした。
（１）グルコース６−リン酸 → １Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸
（２’）１Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸＋ＣＤＰ−ジアシルグリセロール → ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）＋ＣＭＰ
（３’）ＰＩＰ → ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）＋リン酸
【００２６】
【化５】
【００２７】
上記の一般式（Ｉ）または（II）で表される化合物は、上記（２’）の反応（ＰＩＰの合成）を選択的に阻害するため、抗酸菌の宿主となる真核生物のＰＩの生合成に悪影響を与えることなく、抗酸菌におけるＰＩＰの生合成を選択的に阻害することで、抗酸菌の生育を阻害できる。ＰＩＰの合成の阻害機構については必ずしも明らかではないが、上記の化合物が、ＰＩＰ合成酵素（抗酸菌に特有なもので、真核生物には存在しない。）の基質である１Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール１−リン酸と構造が類似することから、これらの化合物がＰＩＰ合成酵素の阻害剤として作用していると考えられる。真核生物に存在し、上記の反応（３）を触媒するＣＤＰ−ジアシルグリセロール−イノシトール３−ホスファチジルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．８．１１）はＰＩＰ合成酵素とは異なるものである。
【００２８】
上記の一般式（Ｉ）または（II）で表される化合物のうち、抗酸菌生育阻害剤として好ましく用いることができる化合物としては、下記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物が挙げられる。
【００２９】
【化６】
【００３０】
これらの化合物は、任意の方法を用いて合成できるが、例えば、上記の式（Ｉ）−１および（Ｉ）−２で表される化合物は、下記のスキームに従い合成することができる。なお、これらの化合物は１−Ｄ体および１−Ｌ体の混合物として得られるが、下記のスキームでは一方の異性体のみ記載している（以下同様である）。
【００３１】
【化７】
【００３２】
抗酸菌生育阻害剤の標的となる抗酸菌の種類について特に制限はないが、好ましくは、ヒトや動物に対し病原性を有するものであり、その具体例としては、結核菌（Mycobaterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、非結核性抗酸菌（Mycobacterium avium、Mycobacterium kansasii等）が挙げられる。
【００３３】
抗酸菌生育阻害剤におけるＰＩＰ合成酵素阻害活性を評価する方法としては、抗酸菌生育阻害剤の存在下および非存在下でＰＩＰ合成酵素の活性を測定し、それぞれの場合における酵素活性の比から阻害活性を評価する方法が挙げられる。抗酸菌生育阻害剤におけるＰＩＰ合成酵素阻害活性をin vitroで評価するための評価系（アッセイ系）に用いられるＰＩＰ合成酵素は、抗酸菌の菌体から単離精製したものであってもよく、菌体をホモジナイズしたものをそのまま用いてもよく、あるいは、ＰＩＰ合成酵素をコードする遺伝子を大腸菌等に導入し発現させたものを用いてもよい。
抗酸菌としては、治療対象となる疾患の原因となる抗酸菌を用いてもよいが、M. smegmatis等の病原性を有しない抗酸菌を用いてもよい。
【００３４】
酵素活性（反応速度）または被検化合物の阻害活性は、一定時間後に反応液中に含まれる基質濃度または生成物（ＰＩＰ）濃度により求めることができる。被検化合物の存在下および非存在下にLineweaver-Burkプロットの比較より、被検化合物の阻害機構を判定することもできる。
基質濃度または生成物濃度は、基質にラジオアイソトープを用いた生成物の放射能測定、高速液体クロマトグラフィー等の任意の公知の手段を用いて行うことができる。
【実施例】
【００３５】
本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
【００３６】
［１］１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトールおよび１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール
上記のスキーム（化７参照）にしたがって標記化合物を合成した。
【００３７】
１，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００３８】
【化８】
【００３９】
窒素雰囲気下、室温でｍｙｏ−イノシトール（２５ｇ、１３８．８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液に２，２−ジメトキシプロパン（７５ｍＬ、６１２．１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で２時間攪拌した。溶液を氷浴で冷やし、トリエチルアミン（５ｍＬ）を加えた。濾過した後、トルエン（１２．５ｍＬ）を加え、４０℃で減圧濃縮し低沸点溶媒を取り除いた。そのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液にピリジン（７５ｍＬ、９２９．２ｍｍｏｌ）を加えた後、氷浴で冷やしながら塩化ベンゾイル（１００ｍＬ、８６０．８ｍｍｏｌ）を１５分かけて一滴ずつ滴下し２時間攪拌した。析出した固体を吸引濾過し、ピリジン、水、アセトン、ジエチルエーテルの順で洗浄することで１，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール１を白色固体１６．２ｇ（収率２５％）で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.30 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 3.73 (dd, J = 11.0, 9.4Hz, 1H), 4.36-4.41 (m, 2H), 4.79 (dd, J = 4.6, 4.6Hz, 1H), 5.43 (dd, J = 10.6, 4.4Hz, 1H), 5.61(dd, J = 11.1, 6.7Hz, 1H), 7.43-7.49(m, 4H), 7.55-7.62 (m, 2H), 8.09-8.16 (m, 4H)
【００４０】
２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００４１】
【化９】
【００４２】
窒素雰囲気下、室温で水酸化ナトリウム（０．４１ｇ、１０．１７ｍｍｏｌ）のメタノール（２１．７ｍＬ）溶液に１，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール１（１．０２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を加え、５時間過熱還流した。溶液を氷浴で冷やし、緩衝溶液を加えて反応を止めた。ジクロロメタンで１０回抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をヘキサンと酢酸エチルを用いて再結晶することで２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール２を結晶４３４．４ｍｇ（収率７７％）で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 1.38 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 2.34 (d, J = 8.9Hz, 1H), 2.40(d, J = 3.0Hz, 1H), 3.33 (dd, J = 10.6, 9.4Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 9.9, 9.6Hz, 1H), 3.88-3.93 (m, 1H), 4.01-4.09 (m, 2H), 4.49 (dd, J = 4.8, 4.8Hz, 1H)
【００４３】
１−Ｏ−ベンジル-２，３：５，６-ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ-イノシトール
【００４４】
【化１０】
【００４５】
窒素雰囲気下、室温で２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール２（３．１３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）溶液に水素化ナトリウム（０．５８ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌した。その溶液にベンジルブロミド（１．４４ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌し、緩衝溶液を加えて反応を止めた。酢酸エチルで２回抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで１−Ｏ−ベンジル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール３を白色固体２．２１ｇ（収率５３％）で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 1.34 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.49 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 2.38 (d, J = 2.8Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 9.9, 9.7Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 10.2, 4.2Hz, 1H), 3.87-3.90 (m, 1H), 3.91-3.95 (m, 1H), 4.05 (dd, J = 9.8, 9.6Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 4.4, 4.4Hz, 1H), 4.81 (d, J = 12.6Hz, 1H), 4.89 (d, J = 12.6Hz, 1H), 7.26-7.43 (m, 5H)
【００４６】
１−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００４７】
【化１１】
【００４８】
アルゴン雰囲気下、室温で１−Ｏ−ベンジル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール３（１．３９ｇ、３．９６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン（ＤＢＵ、１．１９ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（０．０４８ｇ、０．３９６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（０．８９６ｇ、５．９４ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間攪拌した。緩衝溶液を加えて反応を止め、酢酸エチルで２回抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで１−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール４を１．８０ｇ（収率９８％），黄色のオイルで得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H), 0.89 (s, 9H) 1.33 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 3.19 (dd, J = 9.5, 9.4Hz, 1H), 3.72-3.81 (m, 2H), 3.88 (dd, J = 5.0, 4.9Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 9.9, 9.6Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 4.6, 4.5Hz, 1H), 4.80 (d, J = 12.5Hz, 1H), 4.87 (d, J = 12.5Hz, 1H), 7.26-7.42 (m, 5H)
【００４９】
４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００５０】
【化１２】
【００５１】
水素雰囲気下、室温で１−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール４（１．８０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）のエタノール（４．４ｍＬ）溶液に水酸化パラジウム（０．１８０ｇ，１０ｗｔ％），トリエチルアミン（０．６７４、０．４．８４ｍｍｏｌ）を加え、３日間攪拌した。溶液をセライトろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することで４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール５を１．４３ｇ（収率９９％），白色固体で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.10 (s, 3H), 0.11 (s, 3H), 0.91 (s, 9H) 1.36 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 2.30 (d, J = 8.9Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 10.3, 9.5Hz, 1H), 3.76 (dd, J = 9.9, 9.7Hz, 1H), 3.79 (dd, 10.5, 6.1Hz, 1H), 3.95-4.00 (m, 1H), 4.02 (dd, J = 5.8, 5.3Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 4.8, 4.8Hz, 1H)
【００５２】
（２，３，５／４，６）−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン
【００５３】
【化１３】
【００５４】
アルゴン雰囲気下、０℃でＮ−クロロスクシンイミド（１．０１ｇ、７．５６ｍｍｏｌ）のトルエン（８ｍＬ）溶液にジメチルスルフィド（０．５６ｍＬ、７．５６ｍｍｏｌ）を加え、−２５℃まで温度を下げた。−２５℃で混合溶液に４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール５（０．４７０ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）のトルエン（４ｍＬ）溶液を一滴ずつ加え、−２５〜−３５℃で３時間攪拌した。その溶液にトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３０ｍｍｏｌ）を加えた後、冷却浴を外し、室温にもどした。０℃で飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を止め、エーテルで抽出し、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで（２，３，５／４，６）−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン６を３８４．６ｍｇ（収率＜８２％）、ブラウンオイルで得られた。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.14 (s, 3H), 0.16 (s, 3H), 0.93 (s, 9H) 1.34 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 3.64 (dd, J = 11.2, 9.9Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 9.8, 4.3Hz, 1H), 4.24-4.30 (m, 2H), 4.57 (d, J = 11.2Hz, 1H)
【００５５】
４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−ジエトキシホスホリルメチリデン−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−シクロヘキサンペントール
【００５６】
【化１４】
【００５７】
アルゴン雰囲気下、０℃でメチレンジリン酸ジエチル（２．６ｍＬ、４．１２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液にｎ−ブチルリチウム（１．５８Ｍヘキサン溶液、２．６ｍＬ、４．１２ｍｍｏｌ）を加え、０．５時間攪拌した。その混合溶液に（２，３，５／４，６）−４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン６（３８４．６ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液を一滴ずつ加え、０℃で２時間攪拌した。緩衝溶液を加えて反応を止め、酢酸エチルで２回抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−ジエトキシホスホリルメチリデン−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−シクロヘキサンペントール７を３８９．０ｇ（収率７４％），黄色のオイルで得た。
(major isomer) 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.11 (s, 3H), 0.12 (s, 3H), 0.91(s, 9H), 1.30 (dt, J = 7.1,1.0Hz, 6H), 1.36 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.49 (s, 6H), 3.44 (dd, J = 10.1, 10.0Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 10.0, 5.9Hz, 1H), 4.04-4.18 (m, 5H), 4.38-4.42 (m, 1H), 4.46 (d, J = 5.5Hz, 1H), 5.90 (dd, J = 13.9, 1.7 Hz, 1H),
(minor isomer) 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.09 (s, 6H), 0.88(s, 9H), 1.32 (t, J = 7.1Hz, 6H), 1.35 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 3.75 (dd, J = 7.0, 5.5Hz, 1H), 4.04-4.26 (m, 5H), 4.54-4.57 (m, 1H), 4.77 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.22-5.25 (m, 1H), 6.01 (dd, J = 15.2, 1.6Hz, 1H)
【００５８】
４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００５９】
【化１５】
【００６０】
水素雰囲気下、室温で４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−ジエトキシホスホスホリルメチリデン−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−２，３，４，５，６−シクロヘキサンペントール７（３５．９ｍｇ、０．０７１）の酢酸エチル（１．０ｍＬ）溶液に酸化白金（７．１８ｍｇ、２０ｗｔ％）を加え、２１時間攪拌した。溶液をセライトろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−1−デオキシ-1−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール８を２９．５ｇ（収率８１％），黄色のオイルで得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 0.10 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 1.32 (t, J = 7.0Hz, 6H), 1.34 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 1.39 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 2.12-2.19 (m, 2H), 2.26-2.36 (m, 1H), 3.26 (dd, J =10.2, 9.2Hz, 1H), 3.50 (dd, J = 10.7, 9.2Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 10.3, 6.4Hz, 1H), 4.07-4.13 (m, 4H), 4.50 (dd, J = 4.7, 4.6Hz, 1H)
【００６１】
１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール
【００６２】
【化１６】
【００６３】
アルゴン雰囲気下、０℃で４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール８（１４．９ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１ｍＬ）にテトラブチルアンモンミウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液、０．０８７ｍＬ、０．０８７ｍｍｏｌ）を加え、０℃で０．５時間攪拌した後、室温で５時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止め、酢酸エチルで２回抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過し、減圧濃縮することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルのみ、Ｒｆ＝０．０８）で精製することで１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール９を１０．５ｇ（収率９２％），黄色のオイルで得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 1.34 (t, J = 7.1Hz, 6H), 1.35 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.44 (s, 6H), 1.49 (s, 3H), 2.14-2.20 (m, 2H), 2.33-2.42 (m, 1H), 3.35 (dd, J = 10.5, 9.1Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 10.8, 9.3Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 10.6, 6.7Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 6.6, 5.2Hz, 1H), 4.07-4.16 (m, 4H), 4.56 (dd, J = 4.6, 4.3Hz, 1H)
【００６４】
１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール
【００６５】
【化１７】
【００６６】
窒素雰囲気下、室温で１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール９（１７２．８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４．４ｍＬ）溶液に乾燥させたヨウ化ナトリウム（４２６．７ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）とトリメチルシリルクロリド（０．３６ｍＬ、２．８５ｍｍｏｌ）を加え、遮光して６７時間攪拌した。水を加えて反応を止め、水層をヘキサンとエーテルで洗浄し減圧濃縮し、陽イオン交換カラムを行った。水を凍結乾燥することで１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール１０を４５．０ｍｇ（＜３４％），白色固体で得た。
1H-NMR (400MHz, D2O) δ : 1.80-1.95 (m, 2H), 2.02-2.15 (m, 1H), 3.26-3.37 (m, 2H), 3.51 (dd, J = 9.9, 2.9Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 9.8, 9.0Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 2.5, 2.0, 1H)
【００６７】
１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール
【００６８】
【化１８】
【００６９】
窒素雰囲気下、室温で４−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−２，３：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−ｍｙｏ−イノシトール８（１３５．５ｍｇ、０．２６６ｍｍｏｌ）の溶液（溶媒 トリフルオロ酢酸：水＝２：１）を３時間攪拌し、減圧濃縮し凍結乾燥することで１−デオキシ−１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトール１１を８３．６ｍｇ（収率ｑｕａｎｔ）、白色固体で得た。
1H-NMR (400MHz, D2O) δ : 1.33 (t, J = 7.0Hz, 6H), 1.81-1.90 (m, 1H), 2.06-2.14 (m, 1H), 2.17-2.31 (m, 1H), 3.27-3.38 (m, 2H), 3.56 (dd, J = 9.6, 2.4Hz, 1H), 3.61 (dd, J = 9.3, 9.2Hz, 1H), 4.06-4.22 (m, 5H)
【００７０】
上記の［１］で合成した１−デオキシ−１−ジヒドロキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトールおよび１−ジエトキシホスホリルメチル−ｍｙｏ−イノシトールを含む下記の化合物を用いて、ＰＩＰ合成酵素の阻害活性および抗酸菌生育阻害活性を検討した。
【００７１】
【化１９】
【００７２】
［２］ＰＩＰ合成酵素の阻害活性の測定
（１）遺伝子組換え操作によるＰＩＰ合成酵素の発現
結核菌（M.tuberculosis）のＡＩＰ合成酵素と同一のアミノ酸配列を有するＢＣＧ（M.bovis）のＰＩＰ合成酵素の遺伝子を組み込んだプラスミド（pET21a-BCG-PIPS）を構築し、これを大腸菌（E.coli）に導入し、ＰＩＰ合成酵素を発現させた。
【００７３】
（２）酵素活性測定
ＣＤＰ−ジアシルグリセロールと［14Ｃ］イノシトール１−リン酸に緩衝液を加え、酵素として（１）にしたがいＰＩＰ合成酵素を発現させたE.coliのホモジネートを加えて反応させた後、有機溶媒可溶性生成物の放射能を測定した。
【００７４】
（３）ＰＩＰ合成酵素活性測定
０．２ｍＭ ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、０．０４ｍＭ ［14Ｃ］イノシトール１−リン酸（８Ｃｉ／ｍｏｌ）（８ｎｍｏｌ、２３８１Ｂｑ／アッセイ）、５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．０％ＣＨＡＰＳ、酵素溶液（タンパク量２０μｇ）（全容量０．２ｍＬ）を３７℃で１０分間反応させた。（脂質基質は［14Ｃ］イノシトール１−リン酸と１．０％ＣＨＡＰＳと酵素溶液以外の反応溶液中で室温、２０分間超音波処理して懸濁した。）反応後、０．１Ｍ ＨＣｌ／メタノールと１Ｍ ＭｇＣｌ2（ｐＨ２）を加え、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法の比率で水層とクロロホルム層に分画し、クロロホルム可溶性生成物の放射能を測定した。
【００７５】
［３］抗酸菌生育阻害活性の検討
１ウェルに×２普通ブイヨン培地Nutrient broth＋１００μｇ／ｍＬアンピシリンを１００μＬ、２ウェルから１２ウェルまではNutrient broth＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを１００μＬ加える。１ウェルに阻害剤を１００μＬ加え、１０ウェルまで２倍段階希釈した（各ウェルの阻害剤濃度は次のとおりである。１ウェル：１０ｍＭ、２ウェル：５ｍＭ、３ウェル：２．５ｍＭ、４ウェル：１．２５ｍＭ。以下同様。）。Mycobacterium smegmatis mc2155（1%小川培地3日培養菌）をPBSにケン濁後５μｍフィルターを通し単個菌（３．９×１０7ＣＦＵ／ｍＬ）にしたものを菌液とし、１０μＬずつ１〜１１ウェルに加える。これをプレートミキサーに掛け、３７℃で３日間培養後、判定を行った（表１）。
抗酸菌は菌同士が接着しプレートの底に沈むため、９６ウェルマイクロプレートの結果を濁度ＯＤ600で示すことは困難である。そこで、各ウェルの菌液を採取し、寒天培地でのコロニー形成能をみた。具体的には、９６ウェルマイクロプレートでの結果判定後、滅菌つまようじを用い、各ウェルの液を混和後、普通寒天培地へ接種し３７℃で４日間培養した（図１）。
【００７６】
［４］結果
結果を表１および図１に示す。表１は各種化合物のPIP合成酵素相対活性およびM.smegmatisの増殖阻害試験の結果である。「＋」の数は、増殖の程度を、「−」は菌の増殖が認められなかったことを示す。また、図１は、増殖阻害試験に使用したマイクロプレートより、普通寒天培地に菌を接種し、コロニー形成能を検討した結果を示す写真である。図１において明らかなように、マイクロプレート法の増殖阻害試験結果（表１）と同様の結果が得られた。
いずれの化合物についても、in vitroでＰＩＰ合成酵素活性の阻害を示したが、Ｉｎｏ−Ｃ−ＣＯＯＨおよびＤＬ−Ｉｎｏ−Ｃ−Ｐ（ＯＨ）2は、M.smegmatisの増殖を阻害することができなかった。後者については、シクロヘキシルアンモニウム塩とすることで、高い増殖阻害活性を示すことが認められた。シクロヘキシルアンモニウム塩酸塩のみを２０ｍＭ加えてもM.smegmatisの増殖が認められた。従って、疎水性カチオンとの塩にすることにより、ＤＬ−Ｉｎｏ−Ｃ−Ｐ（ＯＨ）2の細胞膜透過性が増大し、菌体内への取り込みが促進されたためと考えられる。
【００７７】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸菌生育阻害剤。
【化１】
なお、上記式（Ｉ）においてＸ1は、−ＣＨ2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
上記式（II）においてＸ2は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基であり、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ2である。
【請求項２】
下記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有することを特徴とする請求項１記載の抗酸菌生育阻害剤。
【化２】
【請求項３】
上記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物ならびに該化合物のエナンチオマーの炭素数１以上１０以下の直鎖または分岐鎖アルキル基、あるいはシクロアルキル基を有する一級アンモニウム塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載の抗酸菌生育阻害剤。
【請求項４】
前記一級アンモニウム塩がシクロヘキシルアンモニウム塩であることを特徴とする請求項３記載の抗酸菌生育阻害剤。
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸菌生育阻害剤。
【化１】
なお、上記式（Ｉ）においてＸ1は、−ＣＨ2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
上記式（II）においてＸ2は、−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＹ）2、−Ｚ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＯＹ、−Ｚ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＹ）2からなる群より選択される基であり、
Ｙは、Ｈまたは炭素数１〜５のアルキル基であり、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ2である。
【請求項２】
下記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物、該化合物のエナンチオマー、ならびに医薬として許容されるそれらの化合物の塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有することを特徴とする請求項１記載の抗酸菌生育阻害剤。
【化２】
【請求項３】
上記の式（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、および（II）−１で表される化合物ならびに該化合物のエナンチオマーの炭素数１以上１０以下の直鎖または分岐鎖アルキル基、あるいはシクロアルキル基を有する一級アンモニウム塩からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載の抗酸菌生育阻害剤。
【請求項４】
前記一級アンモニウム塩がシクロヘキシルアンモニウム塩であることを特徴とする請求項３記載の抗酸菌生育阻害剤。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２４６２５３（Ｐ２０１２−２４６２５３Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１９５０６（Ｐ２０１１−１１９５０６）
【出願日】平成２３年５月２７日（２０１１．５．２７）
【出願人】（５０６０８７７０５）学校法人産業医科大学 (24)
【出願人】（５０４１７４１３５）国立大学法人九州工業大学 (489)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２７日（２０１１．５．２７）
【出願人】（５０６０８７７０５）学校法人産業医科大学 (24)
【出願人】（５０４１７４１３５）国立大学法人九州工業大学 (489)
【Ｆターム（参考）】
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