新規な機能性ペプチド核酸およびその製法
機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法において保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｂｏｃリジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む方法によって、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することが可能となり、しかも、当該方法によって合成される化合物および前駆体的ＰＮＡモノマーユニットとして機能するＢｏｃリジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、リジンを使用した機能性ペプチド核酸オリゴマーおよびその中間体の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
核酸は生物の遺伝情報を司るＤＮＡおよびＲＮＡである。これに対して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、核酸の糖リン酸骨格をＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図１）。ＤＮＡ／ＲＮＡの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのためＰＮＡは従来の核酸と４比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらにＰＮＡは生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。
従来のＤＮＡを媒体にしていた技術をＰＮＡ化することにより、これまで克服できなかったＤＮＡの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「ＤＮＡマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいＤＮＡを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
一方ＰＮＡは酔素に対し完全な耐性を持つので、ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてＰＮＡをＤＮＡに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもＰＮＡ化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはＰＮＡの効率的な機能化、すなわちＰＮＡモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なＰＮＡモノマーの設計が必要である。
ＰＮＡオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡの背骨構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットとＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの２種類が含まれる（図２）。
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なＤＮＡ自動合成機によって可能であるため、下記のルート
【化４】
（Ｘはグアニン、チミン、シトシンまたはアデニンを表す）
によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
なお、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＢｏｃとはｔＢｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＡｌｌｏｃとはＡｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを指す。
当初ＰＮＡには下記のようなＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化５】
が採用され、その後より効率のよい合成方法
【化６】
が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易なＦｍｏｃ型が開発されたため、Ｂｏｃ型の使用頻度は減少している。
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光機能性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
これ以外にも、光機能性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（Ｐｅｔｅｒ Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｇｅｒａｌｄ Ｈａａｉｍａｎ，Ａｎｎｅ Ｂ．Ｅｌｄｒｕｐ ＰＣＴ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（１９９８）ＷＯ ９８５２９５ Ａ１ １９９８１１２６，Ｔ．Ａ．Ｔｒａｎ，Ｒ．−Ｈ．Ｍａｔｔｅｒｎ，Ｂ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ（１９９９）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ，５３，１３４−１４５，Ｊｅｓｐｅｒ Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８，５０３−５０９，Ｈａｎｓ−ｇｅｏｒｇ Ｂａｔｚ，Ｈｅｎｒｉｋ Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄ Ｈａｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｃｔ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（１９９８）ＷＯ ９８３７２３２ Ａ２ １９９８０８２７，Ｂｒｕｃｅ Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｔｒｏｅｌｓ Ｋｏｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６，７１５−７２０）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化７】
【化８】
では効率良く合成できないと予想された。
したがって、一般に光機能性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合目的的な機能性ＰＮＡの合成方法、すなわち、▲１▼機能性ＰＮＡモノマーユニットの設計における、機能性分子のＰＮＡ背骨構造への効率的な導入、▲２▼コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および▲３▼遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化９】
に示すように、ＰＮＡ背骨構造にｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６を用いて１のペンタフルオロフェニル基を含む活性エステル体５と縮合してほぼ定量的に光機能性ＰＮＡモノマー４を合成する方法を見出した。
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってＰＮＡブロープとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡを合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（Ｏｌｉｖｅｒ Ｓｅｉｔｚ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９９，４０，４１６１−４１６４．）。
【化１０】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
例えば、下図に示すように、市販されている光機能性分子のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを導入することはできず、導入するためにはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化１１】
ところが、本発明者らは、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの構造を最適化することによって、驚くべきことに、従来法における前記課題を克服し、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、極めて広範にわたる機能性ＰＮＡを合成できることを見出した。
すなわち、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、下図に示すＦｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（ＩＶ）と反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子をポスト合成的に導入することに成功した。
【化１２】
（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）
前記合成方法は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことができる。また、導入される機能性分子が、、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする。
また、導入する機能性分子として市販のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できるので、前記合成方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
さらに、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを機能性ＰＮＡオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができるので、極めて高速な機能性ＰＮＡオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
この方法によって効率的な合成が可能になる機能性ＰＮＡオリゴマーの例として、下記一般式（Ｖ）
【化１３】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
ところで、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでＤＮＡオリゴマー・ＲＮＡオリゴマー・ＰＮＡオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
一方ＰＮＡオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、ＰＮＡオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
しかし、そのような処理を施してＰＮＡオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞１個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの開発が有用であると考えられている。
なお、膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブは既に存在する。例えば、▲１▼膜透過性機能を有するオリゴペプチドをＰＮＡに結合させたもの、▲２▼膜透過性機能を有するリン脂質をＰＮＡに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりＰＮＡ以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なＰＮＡプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
ところが、本発明者らは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを含有した前駆体的ＰＮＡオリゴマーを用いて、膜透過性機能を有するアミノ酸誘導体をポスト合成的に導入することにより、煩雑な前処理・後処理を含まない、すなわち生きた細胞をそのまま用いて遺伝子発現系を正確に分析できる新規蛍光ＰＮＡプローブの設計に成功した。
しかし、この前駆体的ＰＮＡオリゴマーはＦｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨのみが有効であるわけでなく、必須アミノ酸であるリジン誘導体でもその役割を代行することが可能で、扱いやすさ・入手のしやすさを考慮に入れた新規蛍光ＰＮＡプローブの設計が今後必要になってくると予想される。
したがって、本発明は、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡの新規合成方法およびそれに用いる化合物、ならびに新規機能性ＰＮＡを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの構造を最適化することによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつ極めて広範にわたる機能性ＰＮＡを合成できることを見出し、以下のような本発明を完成するに至った。
（１）．機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、一般式（Ｉ）によるＢｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）、或いは下記の一般式（ＩＩ）によるＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＢｏｃとはｔＢｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＡｌｌｏｃとはＡｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）と反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む、前記方法。
（２）．機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする前記（１）の方法。
（３）．導入される機能性分子が、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする前記（１）の方法。
（４）．導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする前記（２）、（３）の方法。
（５）．光機能性分子が、下記のＣｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、ｐｙｒｅｎｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸誘導体であることを特徴とする前記（４）の方法。
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
（６）．アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを保護する保護基が、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）．ＰＮＡオリゴマーの合成が、Ｂｏｃ法用及びＦｍｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含むことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）．Ｂｏｃ法用固相担体が固相Ｂｏｃ法でペプチド合成に使用するｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ樹脂（ＭＢＨＡ）であることを特徴とする、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）．Ｆｍｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡ、ポリスチレンをクロロメチル化した樹脂（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂）、４−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、Ｂｏｃ−アミノ酸−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メトキシ−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（Ｗｅｉｎｒｅｂ樹脂）、ポリスチレンにｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムを結合させた樹脂（Ｏｘｉｍｅ樹脂）、ポリスチレンを利用してトリチル化した樹脂（Ｔｒｉｔｙｌ樹脂）であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）．遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Ｂｏｃ法におけるＦｍｏｃ基をピペリジン処理によって或いはＦｍｏｃ法におけるＡｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって、選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）．下記ａ）〜ｄ）：
ａ）Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；
ｂ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むこと；
ｃ）Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；および
ｄ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ａｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むことを特徴とする前記（２）記載の方法。
（１２）．下記一般式（ＩＩＩ）
【化２４】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物。
（１３）．Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝３であり、Ｙ１＋Ｙ２＝１５であることを特徴とする、前記（１２）記載の化合物。
（１４）．Ｘ１＝３であり、Ｙ１＝１５であることを特徴とする、前記（１３）記載の化合物。
（１５）．ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能分子誘導体であることを特徴とする、前記（１４）記載の化合物。
（１６）．Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記（１５）記載の化合物。
（１７）．Ｘ１＝Ｚ１＝１であることを特徴とする、前記（１５）または（１６）記載の化合物。
（１８）．Ｙ１≧２であり、Ｚ２＝１であることを特徴とする、前記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の化合物。
（１９）．ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、前記（１５）〜（１８）のいずれかに記載の化合物。
（２０）．Ｒ１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記（１５）〜（１９）のいずれかに記載の化合物。
本発明は、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマーに導入した後、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に光機能性ＰＮＡオリゴマーを合成できることに成功したものである。
尚、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ａｌｌｏｃの各趣旨については、証拠を説明する前記（１）において示した通りである。
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。そのため、本発明による製造方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
また、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを機能性ＰＮＡオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができる。したがって、本発明による製造方法によれば、極めて高速な機能性ＰＮＡオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
本発明の方法によって効率的な合成が可能になる機能性ＰＮＡオリゴマーの例として、下記一般式（ＩＩＩ）
【化２５】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
本発明によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において同一または異なる機能性分子を、任意の複数の位置に導入することも可能となる。すなわち、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットｓを用いてＰＮＡオリゴマーを導入した後、ピペリジン処理或いは亜鉛酢酸溶液処理のいずれかと機能性分子のポスト合成的導入を一括して行うことによるものであるが、これはＰＮＡオリゴマーの細胞膜透過機能を向上させるアンテナペデイアを高速に設計する上で、欠かせないものである。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
このように製造される化合物の例として、前記一般式（Ｉ）において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＞０であり、Ｒが細胞膜透過性分子誘導体であり、Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であるものが挙げられる。
このプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の３つに分けることができ、それぞれをリンカー部位（Ｚ１〜Ｚ５の添字付きで表される部分）を介して結合させた形をしている。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがＰＣＴ出願を行った新規蛍光標識化ＰＮＡモノマーユニットも用いることができる。
分子認識部位は市販のＰＮＡユニットを用いて合成する。このものの特徴は、機能性分子をポスト合成的に導入するために前駆体ユニットとしてＢｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを膜透過性機能領域部に用いていることである。該前駆体ユニットは市販されており、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子を一括導入できることを特徴としている。
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
このような機能性分子として、Ｃｙ３型、Ｃｙ５型、Ｂｏｄｉｐｙ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ型、Ｆｌａｖｉｎ型、Ｄａｂｃｙｌ型、Ｂｉｏｔｉｎ型、ＦＡＭ型、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ型、ＴＡＭＲＡ型、ＲＯＸ型、ＨＡＢＡ型、Ｐｙｒｅｎｅ型、Ｃｏｕｍａｒｉｎｅ型等の光機能性モノマーユニット、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子等が挙げられる。
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光機能性のみならず、膜透過性、臓器選択性、殺菌性、分子破壊性、癒着性、或いは分子認識性等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
さらに、本発明における「機能性ＰＮＡ」の語は、ＰＮＡモノマー同士が２−（Ｎ−アミノエチル）グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖と機能性分子を導入する前駆体的なリジン骨格等を含むものも意味するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
図２は、２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明によるオリゴＰＮＡを合成するルートは、典型的には、下図
【化２６】
【化２７】
に示すとおりである。
尚、ＭＢＨＡは、固相Ｂｏｃでペプチド合成に使用するｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ樹脂のことであり、Ｗａｎｇは、４−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂のことであり、これらについては、［００３６］、または［００３７］において述べた通りである。
【０００１】
次に、［化２６］に関わる製造工程のうち、下図
【化２８】
に示すように、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを用いて、オリゴマーＩａを合成する。具的には、Ｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）等で保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、Ｂｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めＢｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、Ｂｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＭＢＨＡが好適に用いられる。
次に、［化２６］に関わる製造工程のうち、下図
【化２９】
に示すように、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ基を選択的に脱保護してアミノ基とし、Ｉｂを得て、さらに、下図
【化３０】
に示すように、該Ｉｂの前記アミノ基に遊離カルボン酸を有する機能性分子を脱水縮合してＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
また、ピペリジン処理によるＦｍｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。特に、２０〜４０分が好適であり、最も好適には３０分であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
なお、機能性分子の導入は、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく、あるいは、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい。
最後に、［化２６］に関わる製造工程のうち、下図
【化３１】
に示すように、担体レジンからの切り出しとＺ基の脱保護を同時に行うことによって、目的とするＰＮＡオリゴマーＩｄを得る。
切り出しおよび脱保護は、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ＝６０／２５／１０／１０のような一般的な条件において好適に行われる。
次に、［化２７］に関わる製造工程のうち、下図
【化３２】
に示すように、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを用いて、オリゴマーＩＩａを合成する。具的には、Ｂｏｃ基等で保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、Ｆｍｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めＦｍｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、Ｆｍｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＷａｎｇが好適に用いられる。
次に、［化２７］に関わる製造工程のうち、下図
【化３３】
に示すように、亜鉛酢酸溶液処理によってＦｍｏｃ基を選択的に脱保護してアミノ基とし、ＩＩｂを得て、さらに、下図
【化３４】
に示すように、該ＩＩｂの前記アミノ基に遊離カルボン酸を有する機能性分子を脱水縮合してＩＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
また、亜鉛酢酸溶液処理によるＡｌｌｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。１０分〜１時間が好適であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
なお、機能性分子の導入は、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく、あるいは、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい。
最後に、［化２７］に関わる製造工程のうち、下図
【化３５】
に示すように、担体レジンからの切り出しとＢｏｃ基の脱保護を同時に行うことによって、目的とするＰＮＡオリゴマーＩＩｄを得る。
切り出しおよび脱保護は、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、ＴＦＡ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ＝９５／５のような一般的な条件において好適に行われる。
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また一旦ＩＩａを合成した後に種々の機能性分子が導入可能であるため、従来困難であった高速かつ多様な並列ＰＮＡプローブ合成が可能である。
Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨとＰＮＡ鎖を有する分子との反応を含む本発明による方法によれば、下記一般式（ＩＩＩ）
【化３６】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
また、前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物において、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、Ｒが細胞膜透過性機能分子誘導体等であり、Ｒ１が光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等であるもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。このような化合物は、例えば下記のように模式化することができる。
【化３７】
このような化合物は、例えば前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｘ１＝Ｚ１＝Ｚ２＝１であり、かつＹ１≧２である化合物である。このような化合物は合成のしやすさおよび合成コストの面等において好適である。
上記化合物において、ａ、ｂおよびｆはそれぞれ０〜１０の整数であれば特に限定されないが、例えばａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であるものであっても、合成上および実用上のいずれにおいても支障はない。
リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防そための部位としては、前記リンカー部位のみならず、一般式（ＩＩＩ）におけるｆ〜ｈを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばＫｏｃｈ，Ｔ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．；Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．；Ｂａｔｚ，Ｈ．Ｇ．；Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｋ．；▲Ｏ▼ｒｕｍ，Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１９９７，４９，８０−８８．を利用して好適に合成される。
塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
一般式（ＩＩＩ）の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＣｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、ｐｙｒｅｎｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。このような膜透過性機能部位は、前回特許前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物を用いることにより、同様に導入することができる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リシンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
また、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを利用することによって、複数個のアミノ酸を導入することも可能である。その合成例は実施例１に示した。しかしながら、上記化合物は本発明による膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブのモデル化合物であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
これに対して、今回設計したプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子、Ｎ−メチルヒドロキサム酸等の分子破壊性機能分子等も本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの合成
【化３８】
標準的Ｂｏｃ法（ｃｆ．Ｋｏｃｈ，Ｔ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．；Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．；Ｂａｔｚ，Ｈ．Ｇ．；Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｋ．；▲Ｏ▼ｒｕｍ，Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１９９７，４９，８０−８８．）に従い、まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０ｍｇ）にチミンＰＮＡモノマーユニット（７．７ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍＬ、２０ｍＬ）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω−アミノ酸−Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（５．２ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（１０．０ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）と再度Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄを、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体として天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
これをピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した後、再度天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した。これをもう一度繰り返した（膜透過性機能の追加導入）。
ＴＦＡ処理（９５％ＴＦＡ／５％ｍ−ｃｒｅｓｏｌ）によりＢｏｃ基を脱保護した後、ＦＩＴＣ（９．３ｍｇ、２５ｍｇ）をＤＩＥＡ（１７．４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ）存在下、室温で１２時間攪拌し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（２哨ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｉｎ Ｄ肝、室温３分）して残るＦｍｏｃ基を脱保護した後、常法（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｃａｌｃｄ．６３７３．０２３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
（実施例２）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの合成
【化３９】
標準的Ｂｏｃ法（ｃｆ．Ｋｏｃｈ，Ｔ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．；Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．；Ｂａｔｚ，Ｈ．Ｇ．；Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｋ．；▲Ｏ▼ｒｕｍ，Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１９９７，４９，８０−８８．）に従い、まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０ｍｇ）にチミンＰＮＡモノマーユニット（７．７ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍＬ、２０ｍＬ）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω−アミノ酸−Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（５．２ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（１０．０ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）と再度Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄを、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体として非天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
これをピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した後、再度非天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した。これをもう一度繰り返した（膜透過性機能の追加導入）。
ＴＦＡ処理（９５％ＴＦＡ／５％ｍ−ｃｒｅｓｏｌ）によりＢｏｃ基を脱保護した後、ＦＩＴＣ（９．３ｍｇ、２５ｍｇ）をＤＩＥＡ（１７．４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ）存在下、室温で１２時間攪拌し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（２哨ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｉｎ Ｄ肝、室温３分）して残るＦｍｏｃ基を脱保護した後、常法（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｃａｌｃｄ．６３７３．０２３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、光機能性分子に限定されることない多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易かつ効率的に導入することができ、遺伝子治療などに用いられる種々のＰＮＡの構築が可能になるので、本発明は、広範な医療産業分野において利用することができる。
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、リジンを使用した機能性ペプチド核酸オリゴマーおよびその中間体の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
核酸は生物の遺伝情報を司るＤＮＡおよびＲＮＡである。これに対して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、核酸の糖リン酸骨格をＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図１）。ＤＮＡ／ＲＮＡの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのためＰＮＡは従来の核酸と４比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらにＰＮＡは生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。
従来のＤＮＡを媒体にしていた技術をＰＮＡ化することにより、これまで克服できなかったＤＮＡの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「ＤＮＡマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいＤＮＡを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
一方ＰＮＡは酔素に対し完全な耐性を持つので、ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてＰＮＡをＤＮＡに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもＰＮＡ化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはＰＮＡの効率的な機能化、すなわちＰＮＡモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なＰＮＡモノマーの設計が必要である。
ＰＮＡオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡの背骨構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットとＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの２種類が含まれる（図２）。
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なＤＮＡ自動合成機によって可能であるため、下記のルート
【化４】
（Ｘはグアニン、チミン、シトシンまたはアデニンを表す）
によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
なお、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＢｏｃとはｔＢｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＡｌｌｏｃとはＡｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを指す。
当初ＰＮＡには下記のようなＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化５】
が採用され、その後より効率のよい合成方法
【化６】
が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易なＦｍｏｃ型が開発されたため、Ｂｏｃ型の使用頻度は減少している。
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光機能性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
これ以外にも、光機能性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（Ｐｅｔｅｒ Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｇｅｒａｌｄ Ｈａａｉｍａｎ，Ａｎｎｅ Ｂ．Ｅｌｄｒｕｐ ＰＣＴ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（１９９８）ＷＯ ９８５２９５ Ａ１ １９９８１１２６，Ｔ．Ａ．Ｔｒａｎ，Ｒ．−Ｈ．Ｍａｔｔｅｒｎ，Ｂ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ（１９９９）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ，５３，１３４−１４５，Ｊｅｓｐｅｒ Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８，５０３−５０９，Ｈａｎｓ−ｇｅｏｒｇ Ｂａｔｚ，Ｈｅｎｒｉｋ Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄ Ｈａｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｃｔ Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（１９９８）ＷＯ ９８３７２３２ Ａ２ １９９８０８２７，Ｂｒｕｃｅ Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｔｒｏｅｌｓ Ｋｏｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６，７１５−７２０）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化７】
【化８】
では効率良く合成できないと予想された。
したがって、一般に光機能性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合目的的な機能性ＰＮＡの合成方法、すなわち、▲１▼機能性ＰＮＡモノマーユニットの設計における、機能性分子のＰＮＡ背骨構造への効率的な導入、▲２▼コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および▲３▼遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化９】
に示すように、ＰＮＡ背骨構造にｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６を用いて１のペンタフルオロフェニル基を含む活性エステル体５と縮合してほぼ定量的に光機能性ＰＮＡモノマー４を合成する方法を見出した。
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってＰＮＡブロープとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡを合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（Ｏｌｉｖｅｒ Ｓｅｉｔｚ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９９，４０，４１６１−４１６４．）。
【化１０】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
例えば、下図に示すように、市販されている光機能性分子のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを導入することはできず、導入するためにはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化１１】
ところが、本発明者らは、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの構造を最適化することによって、驚くべきことに、従来法における前記課題を克服し、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、極めて広範にわたる機能性ＰＮＡを合成できることを見出した。
すなわち、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、下図に示すＦｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（ＩＶ）と反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子をポスト合成的に導入することに成功した。
【化１２】
（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）
前記合成方法は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことができる。また、導入される機能性分子が、、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする。
また、導入する機能性分子として市販のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できるので、前記合成方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
さらに、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを機能性ＰＮＡオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができるので、極めて高速な機能性ＰＮＡオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
この方法によって効率的な合成が可能になる機能性ＰＮＡオリゴマーの例として、下記一般式（Ｖ）
【化１３】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ５はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
ところで、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでＤＮＡオリゴマー・ＲＮＡオリゴマー・ＰＮＡオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
一方ＰＮＡオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、ＰＮＡオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
しかし、そのような処理を施してＰＮＡオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞１個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの開発が有用であると考えられている。
なお、膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブは既に存在する。例えば、▲１▼膜透過性機能を有するオリゴペプチドをＰＮＡに結合させたもの、▲２▼膜透過性機能を有するリン脂質をＰＮＡに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりＰＮＡ以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なＰＮＡプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
ところが、本発明者らは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを含有した前駆体的ＰＮＡオリゴマーを用いて、膜透過性機能を有するアミノ酸誘導体をポスト合成的に導入することにより、煩雑な前処理・後処理を含まない、すなわち生きた細胞をそのまま用いて遺伝子発現系を正確に分析できる新規蛍光ＰＮＡプローブの設計に成功した。
しかし、この前駆体的ＰＮＡオリゴマーはＦｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨのみが有効であるわけでなく、必須アミノ酸であるリジン誘導体でもその役割を代行することが可能で、扱いやすさ・入手のしやすさを考慮に入れた新規蛍光ＰＮＡプローブの設計が今後必要になってくると予想される。
したがって、本発明は、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡの新規合成方法およびそれに用いる化合物、ならびに新規機能性ＰＮＡを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの構造を最適化することによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつ極めて広範にわたる機能性ＰＮＡを合成できることを見出し、以下のような本発明を完成するに至った。
（１）．機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、一般式（Ｉ）によるＢｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）、或いは下記の一般式（ＩＩ）によるＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＢｏｃとはｔＢｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＡｌｌｏｃとはＡｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）と反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む、前記方法。
（２）．機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする前記（１）の方法。
（３）．導入される機能性分子が、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする前記（１）の方法。
（４）．導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする前記（２）、（３）の方法。
（５）．光機能性分子が、下記のＣｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、ｐｙｒｅｎｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸誘導体であることを特徴とする前記（４）の方法。
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
（６）．アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを保護する保護基が、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）．ＰＮＡオリゴマーの合成が、Ｂｏｃ法用及びＦｍｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含むことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）．Ｂｏｃ法用固相担体が固相Ｂｏｃ法でペプチド合成に使用するｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ樹脂（ＭＢＨＡ）であることを特徴とする、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）．Ｆｍｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡ、ポリスチレンをクロロメチル化した樹脂（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂）、４−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、Ｂｏｃ−アミノ酸−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メトキシ−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（Ｗｅｉｎｒｅｂ樹脂）、ポリスチレンにｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムを結合させた樹脂（Ｏｘｉｍｅ樹脂）、ポリスチレンを利用してトリチル化した樹脂（Ｔｒｉｔｙｌ樹脂）であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）．遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Ｂｏｃ法におけるＦｍｏｃ基をピペリジン処理によって或いはＦｍｏｃ法におけるＡｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって、選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）．下記ａ）〜ｄ）：
ａ）Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；
ｂ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むこと；
ｃ）Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；および
ｄ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ａｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むことを特徴とする前記（２）記載の方法。
（１２）．下記一般式（ＩＩＩ）
【化２４】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物。
（１３）．Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝３であり、Ｙ１＋Ｙ２＝１５であることを特徴とする、前記（１２）記載の化合物。
（１４）．Ｘ１＝３であり、Ｙ１＝１５であることを特徴とする、前記（１３）記載の化合物。
（１５）．ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能分子誘導体であることを特徴とする、前記（１４）記載の化合物。
（１６）．Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記（１５）記載の化合物。
（１７）．Ｘ１＝Ｚ１＝１であることを特徴とする、前記（１５）または（１６）記載の化合物。
（１８）．Ｙ１≧２であり、Ｚ２＝１であることを特徴とする、前記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の化合物。
（１９）．ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、前記（１５）〜（１８）のいずれかに記載の化合物。
（２０）．Ｒ１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記（１５）〜（１９）のいずれかに記載の化合物。
本発明は、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマーに導入した後、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に光機能性ＰＮＡオリゴマーを合成できることに成功したものである。
尚、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ａｌｌｏｃの各趣旨については、証拠を説明する前記（１）において示した通りである。
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。そのため、本発明による製造方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
また、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを機能性ＰＮＡオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができる。したがって、本発明による製造方法によれば、極めて高速な機能性ＰＮＡオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
本発明の方法によって効率的な合成が可能になる機能性ＰＮＡオリゴマーの例として、下記一般式（ＩＩＩ）
【化２５】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
本発明によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において同一または異なる機能性分子を、任意の複数の位置に導入することも可能となる。すなわち、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットｓを用いてＰＮＡオリゴマーを導入した後、ピペリジン処理或いは亜鉛酢酸溶液処理のいずれかと機能性分子のポスト合成的導入を一括して行うことによるものであるが、これはＰＮＡオリゴマーの細胞膜透過機能を向上させるアンテナペデイアを高速に設計する上で、欠かせないものである。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
このように製造される化合物の例として、前記一般式（Ｉ）において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＞０であり、Ｒが細胞膜透過性分子誘導体であり、Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であるものが挙げられる。
このプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の３つに分けることができ、それぞれをリンカー部位（Ｚ１〜Ｚ５の添字付きで表される部分）を介して結合させた形をしている。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがＰＣＴ出願を行った新規蛍光標識化ＰＮＡモノマーユニットも用いることができる。
分子認識部位は市販のＰＮＡユニットを用いて合成する。このものの特徴は、機能性分子をポスト合成的に導入するために前駆体ユニットとしてＢｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを膜透過性機能領域部に用いていることである。該前駆体ユニットは市販されており、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子を一括導入できることを特徴としている。
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
このような機能性分子として、Ｃｙ３型、Ｃｙ５型、Ｂｏｄｉｐｙ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ型、Ｆｌａｖｉｎ型、Ｄａｂｃｙｌ型、Ｂｉｏｔｉｎ型、ＦＡＭ型、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ型、ＴＡＭＲＡ型、ＲＯＸ型、ＨＡＢＡ型、Ｐｙｒｅｎｅ型、Ｃｏｕｍａｒｉｎｅ型等の光機能性モノマーユニット、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子等が挙げられる。
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光機能性のみならず、膜透過性、臓器選択性、殺菌性、分子破壊性、癒着性、或いは分子認識性等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
さらに、本発明における「機能性ＰＮＡ」の語は、ＰＮＡモノマー同士が２−（Ｎ−アミノエチル）グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖と機能性分子を導入する前駆体的なリジン骨格等を含むものも意味するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
図２は、２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明によるオリゴＰＮＡを合成するルートは、典型的には、下図
【化２６】
【化２７】
に示すとおりである。
尚、ＭＢＨＡは、固相Ｂｏｃでペプチド合成に使用するｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ樹脂のことであり、Ｗａｎｇは、４−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂のことであり、これらについては、［００３６］、または［００３７］において述べた通りである。
【０００１】
次に、［化２６］に関わる製造工程のうち、下図
【化２８】
に示すように、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを用いて、オリゴマーＩａを合成する。具的には、Ｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）等で保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、Ｂｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めＢｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、Ｂｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＭＢＨＡが好適に用いられる。
次に、［化２６］に関わる製造工程のうち、下図
【化２９】
に示すように、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ基を選択的に脱保護してアミノ基とし、Ｉｂを得て、さらに、下図
【化３０】
に示すように、該Ｉｂの前記アミノ基に遊離カルボン酸を有する機能性分子を脱水縮合してＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
また、ピペリジン処理によるＦｍｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。特に、２０〜４０分が好適であり、最も好適には３０分であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
なお、機能性分子の導入は、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく、あるいは、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい。
最後に、［化２６］に関わる製造工程のうち、下図
【化３１】
に示すように、担体レジンからの切り出しとＺ基の脱保護を同時に行うことによって、目的とするＰＮＡオリゴマーＩｄを得る。
切り出しおよび脱保護は、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ＝６０／２５／１０／１０のような一般的な条件において好適に行われる。
次に、［化２７］に関わる製造工程のうち、下図
【化３２】
に示すように、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを用いて、オリゴマーＩＩａを合成する。具的には、Ｂｏｃ基等で保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、Ｆｍｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めＦｍｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、Ｆｍｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＷａｎｇが好適に用いられる。
次に、［化２７］に関わる製造工程のうち、下図
【化３３】
に示すように、亜鉛酢酸溶液処理によってＦｍｏｃ基を選択的に脱保護してアミノ基とし、ＩＩｂを得て、さらに、下図
【化３４】
に示すように、該ＩＩｂの前記アミノ基に遊離カルボン酸を有する機能性分子を脱水縮合してＩＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
また、亜鉛酢酸溶液処理によるＡｌｌｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。１０分〜１時間が好適であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
なお、機能性分子の導入は、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく、あるいは、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい。
最後に、［化２７］に関わる製造工程のうち、下図
【化３５】
に示すように、担体レジンからの切り出しとＢｏｃ基の脱保護を同時に行うことによって、目的とするＰＮＡオリゴマーＩＩｄを得る。
切り出しおよび脱保護は、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、ＴＦＡ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ＝９５／５のような一般的な条件において好適に行われる。
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また一旦ＩＩａを合成した後に種々の機能性分子が導入可能であるため、従来困難であった高速かつ多様な並列ＰＮＡプローブ合成が可能である。
Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨとＰＮＡ鎖を有する分子との反応を含む本発明による方法によれば、下記一般式（ＩＩＩ）
【化３６】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物において、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
また、前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物において、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、Ｒが細胞膜透過性機能分子誘導体等であり、Ｒ１が光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等であるもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。このような化合物は、例えば下記のように模式化することができる。
【化３７】
このような化合物は、例えば前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｘ１＝Ｚ１＝Ｚ２＝１であり、かつＹ１≧２である化合物である。このような化合物は合成のしやすさおよび合成コストの面等において好適である。
上記化合物において、ａ、ｂおよびｆはそれぞれ０〜１０の整数であれば特に限定されないが、例えばａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であるものであっても、合成上および実用上のいずれにおいても支障はない。
リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防そための部位としては、前記リンカー部位のみならず、一般式（ＩＩＩ）におけるｆ〜ｈを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばＫｏｃｈ，Ｔ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．；Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．；Ｂａｔｚ，Ｈ．Ｇ．；Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｋ．；▲Ｏ▼ｒｕｍ，Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１９９７，４９，８０−８８．を利用して好適に合成される。
塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
一般式（ＩＩＩ）の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＣｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、ｐｙｒｅｎｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。このような膜透過性機能部位は、前回特許前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物を用いることにより、同様に導入することができる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リシンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
また、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ或いはＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを利用することによって、複数個のアミノ酸を導入することも可能である。その合成例は実施例１に示した。しかしながら、上記化合物は本発明による膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブのモデル化合物であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
これに対して、今回設計したプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子、Ｎ−メチルヒドロキサム酸等の分子破壊性機能分子等も本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの合成
【化３８】
標準的Ｂｏｃ法（ｃｆ．Ｋｏｃｈ，Ｔ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．；Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．；Ｂａｔｚ，Ｈ．Ｇ．；Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｋ．；▲Ｏ▼ｒｕｍ，Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１９９７，４９，８０−８８．）に従い、まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０ｍｇ）にチミンＰＮＡモノマーユニット（７．７ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍＬ、２０ｍＬ）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω−アミノ酸−Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（５．２ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（１０．０ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）と再度Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄを、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体として天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
これをピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した後、再度天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した。これをもう一度繰り返した（膜透過性機能の追加導入）。
ＴＦＡ処理（９５％ＴＦＡ／５％ｍ−ｃｒｅｓｏｌ）によりＢｏｃ基を脱保護した後、ＦＩＴＣ（９．３ｍｇ、２５ｍｇ）をＤＩＥＡ（１７．４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ）存在下、室温で１２時間攪拌し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（２哨ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｉｎ Ｄ肝、室温３分）して残るＦｍｏｃ基を脱保護した後、常法（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｃａｌｃｄ．６３７３．０２３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
（実施例２）膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの合成
【化３９】
標準的Ｂｏｃ法（ｃｆ．Ｋｏｃｈ，Ｔ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．；Ｌａｒｓｅｎ，Ｔ．；Ｂａｔｚ，Ｈ．Ｇ．；Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｋ．；▲Ｏ▼ｒｕｍ，Ｈ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１９９７，４９，８０−８８．）に従い、まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０ｍｇ）にチミンＰＮＡモノマーユニット（７．７ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍＬ、２０ｍＬ）を用いて逐次伸長反応を行った（塩基配列認識領域の設計）。
次いで、リンカー用ω−アミノ酸−Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（５．２ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（１０．０ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）と再度Ｂｏｃ−７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄを、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．５ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を用いて順次縮合させた（リンカー部位と膜透過性機能領域の設計）。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体として非天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した（膜透過性機能の導入）。
これをピペリジン処理（２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した後、再度非天然型Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ（２３．１ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）を縮合剤ＨＢＴＵ（１５．２ｍｇ、４０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した。これをもう一度繰り返した（膜透過性機能の追加導入）。
ＴＦＡ処理（９５％ＴＦＡ／５％ｍ−ｃｒｅｓｏｌ）によりＢｏｃ基を脱保護した後、ＦＩＴＣ（９．３ｍｇ、２５ｍｇ）をＤＩＥＡ（１７．４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ）存在下、室温で１２時間攪拌し蛍光標識化した（蛍光標識部位の設計）。
最後にピペリジン処理（２哨ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｉｎ Ｄ肝、室温３分）して残るＦｍｏｃ基を脱保護した後、常法（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｃａｌｃｄ．６３７３．０２３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、光機能性分子に限定されることない多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易かつ効率的に導入することができ、遺伝子治療などに用いられる種々のＰＮＡの構築が可能になるので、本発明は、広範な医療産業分野において利用することができる。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、一般式（Ｉ）によるＢｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）、或いは下記の一般式（ＩＩ）によるＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＢｏｃとはｔＢｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＡｌｌｏｃとはＡｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）と反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む、前記方法。
【化１】
【化２】
【請求項２】
機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
導入される機能性分子が、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする、請求の範囲１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする、請求の範囲２または３に記載の方法。
【請求項５】
光機能性分子が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、ｐｙｒｅｎｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸誘導体であることを特徴とする、請求の範囲４に記載の方法。
【請求項６】
アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを保護する保護基が、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）であることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＰＮＡオリゴマーの合成が、Ｂｏｃ法用及びＦｍｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｂｏｃ法用固相担体が固相Ｂｏｃ法でペプチド合成に使用するｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ（ＭＢＨＡ）であることを特徴とする、請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｆｍｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡ、ポリスチレンをクロロメチル化した樹脂（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂）、４−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、Ｂｏｃ−アミノ酸−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メトキシ−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（Ｗｅｉｎｒｅｂ樹脂）、ポリスチレンにｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムを結合させた樹脂（Ｏｘｉｍｅ樹脂）、ポリスチレンを利用してトリチル化した樹脂（Ｔｒｉｔｙｌ樹脂）であることを特徴とする請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Ｂｏｃ法におけるＦｍｏｃ基をピペリジン処理によって或いはＦｍｏｃ法におけるＡｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって、選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする、請求の範囲１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
下記ａ）〜ｄ）：
ａ）Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；
ｂ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むことを特徴とする、請求の範囲２に記載の方法；
ｃ）Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；および
ｄ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ａｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むことを特徴とする、請求の範囲２に記載の方法。
【請求項１２】
下記の一般式（ＩＩＩ）
【化３】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物。
【請求項１３】
Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝３であり、Ｙ１＋Ｙ２＝１５であることを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ１＝３であり、Ｙ１＝１５であることを特徴とする、請求の範囲１３に記載の化合物。
【請求項１５】
１ ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能分子誘導体であることを特徴とする、請求項１４に記載の化合物
【請求項１６】
Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、請求の範囲１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｘ１＝Ｚ１＝１であることを特徴とする、請求の範囲１５または１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｙ１≧２であり、Ｚ２＝１であることを特徴とする、請求の範囲１５〜１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、請求の範囲１５〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、請求の範囲１５〜１９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１】
機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、一般式（Ｉ）によるＢｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）、或いは下記の一般式（ＩＩ）によるＦｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（尚、Ｆｍｏｃとは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＢｏｃとはｔＢｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＡｌｌｏｃとはＡｌｌｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）と反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む、前記方法。
【化１】
【化２】
【請求項２】
機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
導入される機能性分子が、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする、請求の範囲１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする、請求の範囲２または３に記載の方法。
【請求項５】
光機能性分子が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、ｐｙｒｅｎｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、ｎａｐｈｔｈａｌｄｉｉｍｉｄｅ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸誘導体であることを特徴とする、請求の範囲４に記載の方法。
【請求項６】
アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを保護する保護基が、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）であることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＰＮＡオリゴマーの合成が、Ｂｏｃ法用及びＦｍｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｂｏｃ法用固相担体が固相Ｂｏｃ法でペプチド合成に使用するｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ（ＭＢＨＡ）であることを特徴とする、請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｆｍｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡ、ポリスチレンをクロロメチル化した樹脂（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂）、４−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、Ｂｏｃ−アミノ酸−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メトキシ−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂（Ｗｅｉｎｒｅｂ樹脂）、ポリスチレンにｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムを結合させた樹脂（Ｏｘｉｍｅ樹脂）、ポリスチレンを利用してトリチル化した樹脂（Ｔｒｉｔｙｌ樹脂）であることを特徴とする請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Ｂｏｃ法におけるＦｍｏｃ基をピペリジン処理によって或いはＦｍｏｃ法におけるＡｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって、選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする、請求の範囲１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
下記ａ）〜ｄ）：
ａ）Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｂｏｃ−リジン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；
ｂ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むことを特徴とする、請求の範囲２に記載の方法；
ｃ）Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＮＡオリゴマー中に導入する工程において、ＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−リジン（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを製造すること；および
ｄ）前記ＰＮＡオリゴマーから機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する工程において、ＰＮＡオリゴマーへの機能性分子の導入が、Ａｌｌｏｃ基を亜鉛酢酸溶液処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の１または２以上を含むことを特徴とする、請求の範囲２に記載の方法。
【請求項１２】
下記の一般式（ＩＩＩ）
【化３】
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ１は、水素原子または機能性カルボン酸誘導体であり、Ｒ２は、水素原子、アミノ基、水酸基、チオール基を含む誘導体または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｆは０〜∞の整数であり、Ｘ１〜Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺ１〜Ｚ６はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３≧０であり、Ｙ１＋Ｙ２＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５≧０である。ただし、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３およびＺ１＋Ｚ２＋Ｚ３＋Ｚ４＋Ｚ５が同時に０であることはなく、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝０の場合、Ｒ１は機能性カルボン酸誘導体である。）で表される化合物。
【請求項１３】
Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＝３であり、Ｙ１＋Ｙ２＝１５であることを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ１＝３であり、Ｙ１＝１５であることを特徴とする、請求の範囲１３に記載の化合物。
【請求項１５】
１ ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能分子誘導体であることを特徴とする、請求項１４に記載の化合物
【請求項１６】
Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、請求の範囲１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｘ１＝Ｚ１＝１であることを特徴とする、請求の範囲１５または１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｙ１≧２であり、Ｚ２＝１であることを特徴とする、請求の範囲１５〜１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
ａ≦６であり、ｂ≦４であり、ｆ≦６であることを特徴とする、請求の範囲１５〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、請求の範囲１５〜１９のいずれかに記載の化合物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３７７
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５４５０（Ｐ２００５−５０５４５０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５３９２
【国際出願日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【特許番号】特許第３８００２４５号（Ｐ３８００２４５）
【特許公報発行日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【出願人】（５０３２８０９６１）株式会社クレディアジャパン (10)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５３９２
【国際出願日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【特許番号】特許第３８００２４５号（Ｐ３８００２４５）
【特許公報発行日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【出願人】（５０３２８０９６１）株式会社クレディアジャパン (10)
【Ｆターム（参考）】
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