新規な苦味受容体Ｔ２Ｒ７６の同定
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸、組換え発現Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現の異種発現系、それらを使用するアッセイ方法、及びＴ２Ｒ７６モジュレータを投与することによって味覚を変化させる方法。これらのＴ２２Ｒ７６ポリペプチドは単独発現させることができ、又は別のＴ２Ｒポリペプチド、好ましくは異なるヒトＴ２Ｒポリペプチドと共発現させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年７月２９日出願の米国特許出願第６０／３９８７２７号の優先権を主張する。参照によりこの出願の全体を援用する。
【０００２】
本発明は、一般的には、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド及びＴ２Ｒ７６ポリペプチドが仲介する味覚に関する。より具体的には、本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離された核酸、単離された機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための異種発現系、味覚のモジュレータ、特に苦味を有する化合物又は苦味をブロックする化合物を同定する方法、及びその使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトが認識できる基本的な味覚の１つに苦さがある。苦味化合物は、細胞表面受容体と相互作用することによって苦味を生成すると考えられている。受容体の活性化により、神経伝達物質の放出に至る細胞内シグナリングカスケードが開始する。次いで脳神経節の求心性神経線維はそのシグナルを皮質味覚中枢に伝達し、そこでその情報は味覚として処理される。これらの受容体は、細胞内Ｇタンパク質と相互作用する７回膜貫通ドメイン受容体のファミリーに属し、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）とも呼ばれる。Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３（６８５２）：２１９−２５を参照されたい。
【０００４】
Ｔ２Ｒと称されるＧＰＣＲの新規なファミリーがヒト及び齧歯動物で同定されている（Ａｄｌｅｒら、２０００；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ、２０００；ＰＣＴ国際公報ＷＯ０１／１８０５０及びＷＯ０１／７７６７６）。様々な系列の証拠が、Ｔ２Ｒが苦味化合物の認識を仲介できることを示唆した。第１に、Ｔ２Ｒ遺伝子は、特異的に舌及び口蓋上皮の味覚受容体細胞のサブセットで発現される。第２に、Ｔ２Ｒは、遺伝的にマウス及びヒトの苦さの認識と関連する遺伝子座と結び付いている（Ｃｏｎｎｅａｌｌｙら、１９７６；Ｃａｐｅｌｅｓｓら、１９９２；Ｒｅｅｄら、１９９９；Ａｄｌｅｒら、２０００）。第３に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、Ｔ２Ｒはガストデューシン（味覚細胞で特異的に発現され、苦さ刺激性トランスデューシンと結び付くＧタンパク質）を活性化できること（Ｗｏｎｇら、１９９６）及びＴ２Ｒによるガストデューシンの活性化が、苦味化合物の適用に応答して選択的に生じること（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００）が示されている。これらのデータに基づくと、ｍＴ２Ｒ及びｈＴ２Ｒ受容体ファミリーは、マウス及びヒトのそれぞれで苦味応答を仲介することが提示される。
【０００５】
苦味は、しばしば食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤において望ましくない。苦味は、砂糖などの甘味化合物を加えることにより隠すことができるが、甘味料の添加は食物の風味を望ましくないものに変え、かつカロリー摂取量を増大させることがある。薬剤の場合、経口摂取に際しての苦味を減少させるために、複雑で費用のかかる製剤方法（例えば、コーティング及びカプセル）が開発されてきた。味覚受容体の阻害によって苦味を直接ブロックする方法は記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、苦味覚の阻害剤を開発するための標的として苦味受容体を同定し、かつ機能的に特性決定することが当技術分野で長い間求められていた。
【０００７】
この要求を満たすために、本発明は新規なＴ２Ｒ７６核酸及びポリペプチドを提供する。本発明はまた、味覚を変化させるＴ２Ｒ７６のモジュレータの同定及び使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、単離Ｔ２Ｒ７６核酸及びそれによってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドを提供する。このポリペプチド及び核酸は本明細書で開示した検出方法及びアッセイにおいて有用である。
【０００９】
Ｔ２Ｒ７６核酸は、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子と、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、又は（ｃ）配列番号１と実質的に同様の単離核酸分子とを含むことができる。
【００１０】
Ｔ２Ｒ７６核酸はまた、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、又は（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列において上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸分子と少なくとも１個の機能的に等価なコドンが異なり、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む。好ましくは、単離Ｔ２Ｒ７６核酸は、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、又は（ｂ）配列番号１の単離核酸分子を含む。
【００１１】
単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、（ａ）配列番号２のポリペプチド、（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチドを含むことができる。
【００１２】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはまた、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、（ｃ）高ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、及び（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列において上記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のうちの１つの単離核酸分子と少なくとも１個の機能的に等価なコドンが異なり、上記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子からなる群から選択される単離核酸分子でコードされたポリペプチドを含むことができる。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）核酸材料を有する生物学的試料を入手すること、（ｂ）単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の生物学的試料とハイブリダイズし、それにより単離Ｔ２Ｒ７６核酸と生物学的試料中の核酸との間で二重構造を形成すること、及び（ｃ）（ｂ）の二重構造を検出し、それによりＴ２Ｒ７６核酸分子を検出することを含むＴ２Ｒ７６核酸を検出する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体、及びそれを生成する方法を提供する。この方法の代表的な実施形態は、（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え又は合成で生成すること、（ｂ）（ａ）のポリペプチドを製剤化することにより有効な免疫原とすること、（ｃ）（ｂ）の製剤を動物に投与して、その動物の血清に存在する抗体の産生を含む免疫応答をその動物に生じさせること、及び（ｄ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む血清を（ｃ）の動物から収集することを含む。この開示した方法はさらに、モノクローナル抗体の調製を含むことができる。
【００１５】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの濃度を測定する方法も提供する。代表的な実施形態では、この方法は、（ａ）ペプチド材料を有する生物学的試料を入手すること、（ｂ）本発明の抗体との免疫化学的反応で（ａ）の生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの量を測定することを含む。
【００１６】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現系も提供する。組換え発現系は、（ａ）本発明のＴ２Ｒ７６ポリペプチド（例えば、配列番号２として挙げた代表的な実施形態）、及び（ｂ）当該Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種宿主細胞を含むことができる。さらに、この組換え発現系はＴ２Ｒ７６とは異なるＴ２Ｒポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。特に、この組換え発現系は、２００３年５月６日に発行されたＺｕｋｅｒらの米国特許第６５５８９１０号、２００２年７月１８日に公開されたＡｄｌｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｅｌｌｉｏｔの米国出願公開２００２００９４５５１、及び２００３年１月３０日に公開されたＺｕｋｅｒらの米国出願公開２００３００２２２７８（これらのすべての全体を参照により援用する）に開示されたＴ２Ｒ核酸配列のいずれかを含んでもよい。本明細書に参照により援用したＺｕｋｅｒの出願で開示されている通り、Ｔ２Ｒポリペプチドの別名はＳＦ又はＧＲポリペプチドであることに留意されたい。対象のｈＴ２Ｒ７６は、１つ又は複数の他のＴ２Ｒポリペプチドと共に発現して機能的なヘテロメリック味覚受容体を産生することができる。他のＴ２Ｒポリペプチドとしては、別のヒトＴ２Ｒ又は別の種、例えばラット又はマウスのＴ２Ｒがある。宿主細胞は任意の適切な細胞を含むことができる。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を含む。また好ましくは、宿主細胞は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドとのカップリングが可能なＧタンパク質αサブユニット、例えばＧα１５、ガストデューシン又はトランスデューシンなどのプロミスカスＧタンパク質を含む。
【００１７】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え発現する開示の系を使用して、本発明はさらに、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、この方法は、（ａ）組換え発現系を用意して、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを異種宿主細胞中で発現させること、（ｂ）試験物質を（ａ）の系に与えること、（ｃ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６の機能のレベル又は質をアッセイすること、（ｄ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６の機能のレベル又は質を、Ｔ２Ｒ７６の機能の対照レベル又は質と比較すること、及び（ｅ）Ｔ２Ｒ７６の機能の対照レベル又は質と比較して有意に変化した試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６の機能のレベル又は質を測定することにより試験物質をＴ２Ｒ７６モジュレータとして同定することを含む。このアッセイはＧＴＰγＳ結合の量を測定することを含むことができる。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法は、（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチド又はポリペプチドの組合せを単独で又は１種若しくは複数の他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて１つ又は複数の試験物質に暴露すること（ｅｘｐｒｅｃｉｎｇ）、（ｂ）試験物質の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６を含有するポリペプチドの組合せへの結合をアッセイすること、及び（ｃ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異結合性を示す候補物質を選択することを含む。
【００１９】
開示の方法で同定された、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのアゴニスト及び阻害物質を含むモジュレータも提供される。モジュレータは、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、小分子及びこれらの組合せを含むことができる。モジュレータは、更に苦味覚のモジュレータを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明はさらに、対象中の苦味覚を調節する方法を提供する。対象は哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。同様に、対象で変わる苦味覚はＴ２Ｒ７６機能を含むことが好ましい。
【００２１】
本発明の一実施形態では、対象で苦味覚を調節する方法は、（ａ）開示の方法で同定したＴ２Ｒ７６モジュレータを含む組成物を調製すること、及び（ｂ）対象に有効量の組成物を投与することにより、対象で苦味覚を変化させることを含む。
【００２２】
例えば、本発明は、Ｔ２Ｒ７６阻害物質と苦味化合物とを対象に同時投与することにより苦味化合物の苦味覚を減少させる方法を提供する。本発明は、Ｔ２Ｒ７６アゴニストと化合物とを同時投与することによりその化合物の苦味覚を増強させる方法も提供する。この同時投与は、味を修飾する化合物と混合したＴ２Ｒ７６阻害物質を含む組成物の投与を含むことができる。本発明の好ましい実施形態では、組成物は、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤を含むことができる。
【００２３】
本発明は、Ｔ２Ｒ７６アゴニストと味を修飾する化合物とを同時投与することにより化合物の苦味覚を増強する方法も提供する。このＴ２Ｒ７６アゴニストと化合物とは、単一の組成物として混合することができる。
【００２４】
したがって、本発明の目的は、新規なＴ２Ｒ７６核酸及びポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６核酸を検出する方法、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種発現系、異種Ｔ２Ｒ７６発現系を使用する方法及びアッセイ、並びにＴ２Ｒ７６ポリペプチドを調節及び検出する方法を提供することである。この目的は、全体的又は部分的に本発明で達成される。
【００２５】
上記の本発明の目的、本発明の他の目的及び利点は、以下の本発明の記載及び非限定的な実施例を研究した後、当業者に明らかになるであろう。
【００２６】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１及び２は、それぞれヒトＴ２Ｒ７６ヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
Ｉ．定義
以下の用語は当業者にはよく理解されていると思われるが、本発明の説明を容易にするために以下にその定義を示す。
【００２８】
用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は１つ又は複数を言及する長年の慣用に従って使用する。
【００２９】
配列の同一性のパーセンテージ（例えば、本明細書で以下に記載する通り、ヌクレオチド配列やアミノ酸配列を比較する場合）、ヌクレオチド又はタンパク質の長さ、結合量などの測定できる値に言及するときに本明細書で使用する用語「約」は、開示の方法を実施する又はその他の方法で本発明を実施するのに適切なように、特定の量からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３０】
ＩＩ．Ｔ２Ｒ７６核酸及びポリペプチド
本発明は、新規なＴ２Ｒ７６核酸及び機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを含む新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドを提供する。本発明の代表的なＴ２Ｒ７６核酸は配列番号１として示し、これは配列番号２として示したＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする。
【００３１】
用語「Ｔ２Ｒ７６」及び「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語（例えば、ｈＴ２Ｒ７６）は、一般に単離Ｔ２Ｒ７６核酸、Ｔ２Ｒ７６核酸でコードされた単離ポリペプチド及びそれらの活性について言及する。Ｔ２Ｒ７６核酸及びポリペプチドは任意の生物から得ることができる。用語「Ｔ２Ｒ７６」及び「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語はまた、苦味化合物で活性化される受容体を含むポリペプチド及びそれをコードする核酸を指す。Ｔ２Ｒ７６受容体は他のＴ２Ｒポリペプチドを含んでもよく、ヘテロメリック受容体であってよい。
【００３２】
核酸又はポリペプチドの関係で使用される用語「単離」は、核酸又はポリペプチドがその本来の環境から離れて存在し、天然の産物ではないことを示す。単離核酸又はポリペプチドは、精製形態で存在することができ、又はトランスジェニック宿主細胞などの非本来の環境で存在することができる。
【００３３】
以下の本明細書中でさらに開示する通り、本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの機能的発現の系を提供する。この系は、配列番号１を含む組換えＴ２Ｒ７６核酸を使用し、これは別のＴ２Ｒ核酸と共に発現されてもよい。
【００３４】
ＩＩ．Ａ．Ｔ２Ｒ７６核酸
用語「核酸分子」及び「核酸」はそれぞれ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖、二本鎖又は三本鎖形態のこれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、基準天然核酸と同様の性質を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を有する核酸を包含する。用語「核酸分子」又は「核酸」は、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」又は「ｃＲＮＡ」の代わりに使用することもできる。核酸は合成することができ、又は任意の生物を含む任意の生物学的起源から得ることができる。完全長Ｔ２Ｒ７６ｃＤＮＡをクローニングする代表的な方法は実施例１に記載している。
【００３５】
用語「Ｔ２Ｒ」又は「ＳＦ」は、味覚細胞特異的Ｇタンパク質 受容体のファミリーのメンバーをコードする核酸を指す。これらがコードするこれらの核酸及びポリペプチドは、Ｇタンパク質光学味覚受容体の「Ｔ２Ｒ」、「ＳＦ」、「ＧＲ」又はＴＡＳ２Ｒファミリーとして言及される。このＧＰＣＲの神経系ファミリーには、味覚形質導入ｐ の成分が含まれる。ファミリー では、このファミリーのメンバーは苦味の検出に関与している。味覚受容体のＴ２Ｒ又はＳＦファミリーのメンバーは、米国特許第６５５８９１０号、２００３年１月２０日に公開されたＺｕｒａらの米国出願公開２００３００２２２７８、及び２００２年７月１８日に公開されたＡｄｌｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｅｌｌｉｏｔの米国出願公開２００２００９４５０２で論議されている。この種のＴ２Ｒの例としては、
が挙げられる。
【００３６】
択一的に言及されるこれらのＴ２Ｒ、ＳＦ、ＴＡＳ２Ｒなど又はＧＲは、ヒト、マウス及びラットを含む異なる種由来であってもよく、ヒト由来が好ましい。「実質的に同一」である、又はそれと同一の特異的配列を有する、又は以下で定義する通りのこれらの配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするＴ２Ｒも包含される。
【００３７】
用語「Ｔ２Ｒ７６」及び「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語（例えば、ｈＴ２Ｒ７６）は、本明細書ではＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸に言及するために使用する。したがって、用語「Ｔ２Ｒ７６」は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号１と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む本発明の単離核酸を指す。
【００３８】
ヌクレオチド配列間の類似性を記載するのに本明細書で使用する用語「実質的に同一」とは、一致が最大となるように比較し整列したときに、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査で測定して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％から約９９％、さらにより好ましくは約９５％から約９９％、最も好ましくは約９９％のヌクレオチド同一性を有する２つ以上の配列を指す。実質的同一性は、好ましくは少なくとも約１００残基のヌクレオチド配列で存在するものであり、より好ましくは少なくとも約１５０残基のヌクレオチド配列で存在するものであり、最も好ましくは完全長コード配列を含むヌクレオチド配列で存在するものである。用語「完全長」は、本明細書では以下の本明細書中でさらに記載する機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする完全なオープンリーディングフレームに言及するために使用する。２つのポリペプチド間の同一性の割合を判定する方法は、「ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較」という標題で以下の本明細書中で定義する。
【００３９】
一の態様では、実質的に同一な配列は多型配列であることができる。用語「多型」は、集団に２つ以上の遺伝的に決定された代替配列又は対立遺伝子が出現することを指す。対立遺伝子の差異は、わずか一つの塩基対であることもできる。
【００４０】
別の態様では、実質的に同一な配列は、サイレント突然変異を含む配列を含む、突然変異を起こした配列を含むことができる。突然変異は、１つ以上の残基変化、残基の欠失、又は追加の残基の挿入を含むことができる。
【００４１】
２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であることを示す別のものは、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いに特異的にハイブリダイズする、又は実質的にハイブリダイズするものである。核酸のハイブリダイゼーションにおいては、比較する２つの核酸配列を「プローブ」及び「標的」と呼ぶことができる。「プローブ」は基準核酸分子であり、「標的」は試験核酸分子であり、核酸分子の異種集団中にしばしば見出される。「標的配列」は「試験配列」と同義である。
【００４２】
ハイブリダイゼーション試験又はアッセイに使用するのに好ましいヌクレオチド配列には、本発明の核酸分子の少なくとも約１４から４０ヌクレオチド配列と相補性の又は類似するプローブ配列が含まれる。プローブは、任意の配列番号１の１４から２０ヌクレオチド、所望ならば３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００若しくは５００ヌクレオチド又は完全長までなどのより長いヌクレオチドを含むことが好ましい。このような断片は、例えば断片の化学合成、核酸増幅技術の適用、又は選択した配列を組換え生産用の組換えベクターに導入することにより容易に調製することができる。
【００４３】
語句「に特異的にハイブリダイズする」は、特定のヌクレオチド配列が複雑な核酸混合物（例えば、全細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在するときに、分子がその特定のヌクレオチド配列だけにストリンジェントな条件下で結合、二重鎖形成又はハイブリダイズすることを指す。
【００４４】
語句「に実質的にハイブリダイズする」は、プローブ核酸分子と標的核酸分子との間での相補的ハイブリダイゼーションを指し、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低減することにより所望のハイブリダイゼーションを達成することができる軽微な不整合を包含する。
【００４５】
サザンブロット分析及びノーザンブロット分析などの核酸ハイブリダイゼーション実験の場合には、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、かつ環境依存性である。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの包括的な指針はＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）の「生化学及び分子生物学の実験技術−核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」、第Ｉ部、第２章、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、ニューヨークに記載されている。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５０℃低い温度が選択される。通常、「ストリンジェントな条件」下では、プローブはその標的部分配列に特異的にハイブリダイズし、その他の配列にはハイブリダイズしない。
【００４６】
Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に整合するプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度及びｐＨ下の）温度である。非常にストリンジェントな条件は特定のプローブのＴｍと等しい条件が選択される。相補的な残基を約１００個より多く有する相補的核酸のサザンブロット分析又はノーザンブロット分析用のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃におけるヘパリン１ｍｇを含む５０％ホルムアミドでの終夜のハイブリダイゼーションである。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１×ＳＳＣ中６５℃で１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣバッファ中６５℃で１５分間である。ＳＳＣバッファの説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。高ストリンジェントな洗浄の前に低ストリンジェントな洗浄を実施して背景のプローブシグナルを除去することが多い。約１００よりも多いヌクレオチドの二重鎖形成のための中程度にストリンジェントな洗浄条件の例は、１×ＳＳＣ中４５℃で１５分間である。約１００よりも多いヌクレオチドの二重鎖形成のための低ストリンジェントな洗浄の例は、４×から６×ＳＳＣ中４０℃で１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０から５０ヌクレオチド）では、ストリンジェントな条件は通常、ｐＨ７．０〜８．３で約１Ｍ未満のＮａ＋イオン、通常約０．０１から１ＭのＮａ＋イオン濃度の塩濃度（又はその他の塩）を伴い、温度は通常少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を加えることによっても達成することができる。一般に、特異的ハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブで観察されるシグナル対ノイズ比に対して２倍（以上）のシグナル対ノイズ比が観察される場合には、特異的ハイブリダイゼーションが検出されたことを示している。
【００４７】
以下は、本発明の基準ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するのに使用することができるハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件の例である：プローブヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列に、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、ＩｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄するのが好ましい；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。
【００４８】
さらに、２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すものは、実質的に同一の核酸でコードされたタンパク質が全体的な三次元構造を共有しているか、又は生物学的機能が等価なことである。これらの用語は以下の本明細書中、「Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド」という標題でさらに定義する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子であっても、対応するタンパク質が実質的に同一な場合には、やはり実質的に同一である。これは例えば、２つのヌクレオチド配列が、遺伝コードで認められているような保存的に置換された変異体を含む場合に起こる。
【００４９】
用語「保存的に置換された変異体」は、１個又は複数の選択した（又は全ての）コドンの３番目の位置がゆらぎ塩基（ｍｉｘｅｄ−ｂａｓｅ）及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている縮重コドン置換を有する核酸配列を指す。Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：２６０５−２６０８；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）のＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８を参照されたい。
【００５０】
用語「Ｔ２Ｒ」はまた、Ｔ２Ｒ核酸、好ましくはＴ２Ｒ７６の部分配列及び伸長配列を含む核酸を包含し、これらにはＴ２Ｒ核酸と相補的な核酸、Ｔ２Ｒ ＲＮＡ分子及びＴ２Ｒ ＲＮＡと相補的な核酸（ｃＲＮＡ）が含まれる。
【００５１】
用語「部分配列」は、より長い核酸配列の一部を含む核酸の配列を指す。代表的な部分配列は、上記の本明細書で記載したプローブ、又はプライマーである。本明細書で使用する用語「プライマー」は、選択した核酸分子の約８以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは１０〜２０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドを含む連続配列を指す。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子の重合を開始するのに十分な長さ及び適切な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。
【００５２】
用語「伸長配列」は、核酸に組み込まれるヌクレオチド（又はその他の類似分子）の付加を指す。例えば、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加することができる。さらに、ヌクレオチド配列は、他のＤＮＡ配列、例えばプロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、追加的な制限酵素部位、多数のクローニング部位及びその他のコードセグメントと結合することができる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「相補的配列」は、塩基対間で水素結合が形成されて互いに対合することができる逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を示す。本明細書で使用する用語「相補的配列」は、以下に挙げたものと同じヌクレオチド比較方法で評価することができる、或いは本明細書で記載したような比較的ストリンジェントな条件下で問題の核酸セグメントにハイブリダイズすることができると定義される、実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味する。相補的な核酸セグメントの特別な例はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５４】
本発明は、開示のＴ２Ｒ７６核酸及び組換えＴ２Ｒ７６核酸を含むキメラ遺伝子も提供する。したがって、他のＴ２Ｒ核酸と組み合せて発現されることもあるＴ２Ｒ７６核酸を含む構築体及びベクターも含む。
【００５５】
用語「遺伝子」は生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントを広く指す。遺伝子は、これらだけに限定するものではないが、コード配列、プロモーター領域、シス制御配列、調節タンパク質の特異的認識配列である発現されていないＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する発現されていないＤＮＡセグメント、所望のパラメータを有するように設計されたＤＮＡセグメント、又はこれらの組合せを含む配列を包含する。遺伝子は、生物学的試料からのクローニング、既知の又は予想される配列情報に基づく合成及び既存の配列の組換え誘導を含む種々の方法で得ることができる。
【００５６】
本明細書で使用する用語「キメラ遺伝子」は、Ｔ２Ｒ配列、例えばＴ２Ｒ ｃＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸、三次構造（例えば、ヘアピン構造）を有するＲＮＡをコードするＴ２Ｒ核酸又は二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸に作動可能に結合させたプロモーター領域を指す。用語「キメラ遺伝子」はまた、異種配列に作動可能に結合したＴ２Ｒプロモーター領域も指す。本発明のキメラ遺伝子の調製は実施例２に記載する。Ｔ２ＲはＴ２Ｒ７６であることが好ましい。
【００５７】
本明細書で使用する用語「作動可能に結合した」は、ヌクレオチド配列の転写がプロモーター領域によって制御され調節されるようなプロモーター領域とヌクレオチド配列との機能的な組合せを指す。プロモーター領域をヌクレオチド配列と作動可能に結合させる技術は当技術分野で知られている。
【００５８】
用語「組換え」は、一般に本来の環境ではない環境で複製可能な単離核酸を指す。したがって、組換え核酸は宿主細胞中でその複製を可能にするベクターの核酸など、追加の核酸と共に複製できない核酸を含むことができる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、宿主細胞中でその複製が可能なヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。ベクターは、ヌクレオチド配列のベクター中での連結を可能とするヌクレオチド配列を含むことができ、そのようなヌクレオチド配列はまた、宿主細胞において複製される。代表的なベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルスベクターがある。ベクターはまた、以下の本明細書でさらに記載する通り、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え生成を仲介することができる。
【００６０】
発現構築体を含むあるタイプの構築体を記載するのに本明細書で使用する用語「構築体」は、ヌクレオチド配列が組換え技術によって発現されるようにベクターに作動可能に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含むベクターを指す。
【００６１】
用語「組換え技術によって発現された」又は「組換え技術によって生成した」は同義的に使用され、一般的に組換え核酸でコードされたポリペプチドを生成するプロセスを指す。
【００６２】
したがって、組換えＴ２Ｒ、核酸、すなわちＴ２Ｒ７６核酸は異種核酸を含むことが好ましい。用語「異種核酸」は、対象とする宿主細胞に対し外来の起源に由来する配列、又は同じ起源に由来する場合、その原形を改変した配列を指す。宿主細胞中の異種核酸は、特定の宿主細胞に内因性であるが、例えば突然変異誘発や天然のシス制御配列からの分離によって改変されている核酸を含むことができる。異種核酸はまた、天然のヌクレオチド配列の非天然に生じる多数のコピーを含むことができる。異種核酸はまた、通常はそのような核酸を見出すことができない位置で、宿主細胞の核酸に組み込まれた核酸を含むことができる。
【００６３】
本発明の核酸は、クローニング、合成、変化、突然変異誘起又はこれらの組合せをすることができる。核酸の単離に使用することができる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当技術分野で知られている。塩基対の変化、欠失又は小挿入を引き起こす部位特異的突然変異誘発も当技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）（１９８９）の「分子クローニング実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｉｌｈａｖｙら（１９８４）の「遺伝子融合での実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ＆Ｈａｍｅｓ（１９９５）の「ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）の「分子生物学の短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００６４】
ＩＩＩ．Ｂ．Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド
本発明は、新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドを提供するものであり、その代表的な実施形態は配列番号２に示される。本発明の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含むことが好ましい。また、単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを含むことが好ましい。これらのＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、１つ又は複数の他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて発現されてもよい。
【００６５】
したがって、本発明の方法で有用な新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、（ａ）配列番号２のポリペプチド、（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチドを含む。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはまた、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、及び（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸分子と少なくとも１個の機能的に等価なコドンにおいて異なり、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子を含むことができる。
【００６６】
Ｔ２Ｒとそれと実質的に同一のタンパク質との間の類似性のレベルを記載するのに本明細書で使用する用語「実質的に同一」とは、それと少なくとも３５％同一のタンパク質を指す。例えば、Ｔ２Ｒ７６とこのＴ２Ｒ７６タンパク質と実質的に同一のタンパク質の場合、これはＴ２Ｒ７６タンパク質の完全長にわたって比較したとき、配列番号２と少なくとも約３５％同一の配列を指す。Ｔ２Ｒ７６タンパク質と実質的に同一のタンパク質は、好ましくは配列番号２と少なくとも約３５％から約４５％同一、より好ましくは配列番号２と少なくとも約４５％から約５５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約５５％から約６５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約６５％から約７５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約７５％から約８５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約８５％から約９５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約９５％から約９９％同一である。用語「完全長」は以下の本明細書中でさらに記載する通り、機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを指す。２つのポリペプチド間の同一性の割合を判定する方法はまた、「ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較」という標題で以下の本明細書中で定義する。
【００６７】
ポリペプチドを説明するのに使用する場合、用語「実質的に同一」は保存３次元構造を共有する２つ以上のポリペプチドを包含することもできる。計算手法を使用して構造表現を比較することができ、重要な活性部位やリガンド結合部位の周囲の類似性を同定するように構造モデルを生成し、容易に調整することができる。Ｓａｑｉら（１９９９）のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：５２１−５２２；Ｂａｒｔｏｎ（１９９８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４：１１３９−１１４６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（２０００）のＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１７００−１７０６；及びＨｕａｎｇら（２０００）のＰａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：２３０−２４１を参照されたい。
【００６８】
実質的に同一のタンパク質はまた、配列番号２のアミノ酸と機能的等価物であるアミノ酸を含むタンパク質を含む。アミノ酸の場合の用語「機能的等価物」は当技術分野で知られており、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性に基づいている。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（２０００）のＡｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ ５４：７３−９７を参照されたい。考慮される関連要因としては、側鎖の疎水性、親水性、電荷及びサイズがある。例えば、アルギニン、リジン及びヒスチジンはすべて正に荷電した残基であり、アラニン、グリシン及びセリンはすべて同様のサイズを有し、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはすべて大体同様の形態を有する。以下の本明細書中でさらに記載するこの分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは本明細書において生物学的な機能的等価物と定義する。
【００６９】
生物学的、機能的に等価なアミノ酸を置換するためには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考えることができる。各アミノ酸に、それらの疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てた。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）及びアルギニン（４．５）である。
【００７０】
タンパク質に相互作用による生物機能を与えるときに、アミノ酸の疎水性親水性指標が重要なことは当技術分野で広く理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２）。あるアミノ酸は同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸と置換しても、依然として同様の生物活性を保有できることは知られている。疎水性親水性指標に基づく変更では、疎水性親水性指標が当初アミノ酸の値の±２以内のアミノ酸を置換することが好ましく、当初アミノ酸の値の±１以内のものが特に好ましく、当初アミノ酸の値の±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００７１】
親水性に基づいて効果的に類似のアミノ酸を置換できることも、当技術分野で理解されている。米国特許第４５５４１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性に左右されるタンパク質の最も大きな局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、例えばタンパク質の生物学的性質に相関することを記載している。アミノ酸は同様の親水性値を有する別のものと置換しても、依然として生物学的に等価なタンパク質を得られることは理解されている。
【００７２】
米国特許第４５５４１０１号で詳述されている通り、アミノ酸残基に以下の親水性値を割り当てた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００７３】
同様の親水性値に基づく変更では、親水性値が当初のアミノ酸の値の±２以内のアミノ酸で置換することが好ましく、当初のアミノ酸の値の±１以内で置換することが特に好ましく、当初のアミノ酸の値の±０．５以内で置換することがさらに特に好ましい。
【００７４】
用語「実質的に同一」はまた、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的な機能的等価物であるポリペプチドを包含する。用語「機能的」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの活性、例えば細胞内シグナリング経路を活性化すること（例えば、ガストデューシンとのカップリング）及び味覚を仲介することを含む。このような活性化は、ｉｎ ｖｉｖｏで同起源のＴ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのものと実質的に同じ大きさ及び動態を示すことが好ましい。Ｔ２Ｒ７６活性を評価する代表的な方法は以下の本明細書中で記載する。
【００７５】
本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの機能的断片を提供する。このような機能的部分は、天然のＴ２Ｒ７６遺伝子産物のアミノ酸配列のすべて又は実質的にすべてを含んでいる必要はない。
【００７６】
本発明はまた、天然のＴ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドよりも長い配列である機能性ポリペプチド配列を含む。例えば、１つ又は複数のアミノ酸をＴ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加することができる。このような追加のアミノ酸は、これだけに限定するものではないが、精製用途を含む種々の用途で使用することができる。伸長タンパク質を調製する方法は当技術分野で知られている。
【００７７】
ＩＩ．Ｃ．ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較
２つ以上のヌクレオチド又はポリペプチド配列の場合の用語「同一」又は「同一性の割合」は、本明細書で開示した配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査で測定して、一致が最大となるように比較し整列したときに、同じ、又は特定の割合の同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【００７８】
ヌクレオチド又はポリペプチド配列に関する用語「実質的に同一」は、特定の配列が、天然配列の配列とは１つ又は複数の欠失、置換又は付加で変更されており、その正味の効果としてＴ２Ｒ核酸又はポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６核酸又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的機能が保持されていることを意味する。
【００７９】
２つ以上の配列の比較では、通常、１つの配列は基準配列の役割を果たし、それに対して１つ又は複数の試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータプログラムに入れ、必要ならば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを選択する。次いで、配列比較アルゴリズムは、選択したプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する指定した試験配列の配列同一性の割合を計算する。
【００８０】
比較のための配列の最適な整列は、例えばＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）のＡｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３−４５３の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）のＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法、これらのアルゴリズムの計算機化実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査によって実施することができる。一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）の「分子生物学の短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００８１】
配列同一性の割合及び配列類似性を判定する好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）のＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公式に入手することができる。このアルゴリズムでは、データベース配列の同じ長さのワードと整列したときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、ある正の値の閾値スコアＴを満たす試験配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、まず高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するシード（ｓｅｅｄ）として働く。次いで、累積整列スコアが増大可能な限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対の一致残基の報奨スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基の罰スコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの延長は、累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少し、累積スコアが１つ又は複数の負のスコアの残存整列の累積によりゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に到達したときに停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは整列の感度及び速度を判定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列について）初期値として、ワード長Ｗ＝１１、期待値Ｅ＝１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは初期値として、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１１９９２）のＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい。
【００８２】
配列の同一性の割合を計算する他に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の類似性の統計的分析もする。例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）のＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの基準は最小の確率合計（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の一致が偶然発生する確率を示す。例えば、試験核酸配列と基準核酸配列との比較における最小の確率合計が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合、試験核酸配列は基準配列と類似していると考えられる。
【００８３】
ＩＩＩ Ｔ２Ｒ７６核酸の検出方法
本発明の別の態様では、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸分子を検出する方法を提供する。このような方法はＴ２Ｒ７６遺伝子の変異体又は変化した遺伝子発現を検出するのに使用することができる。例えば、Ｔ２Ｒ７６配列又は発現の変化の検出は、味覚についてのＴ２Ｒ７６に関する差異を診断するために使用することができる。この方法に使用する核酸は配列番号１の配列を含んでいることが好ましい。
【００８４】
本発明の方法で検出された配列は、特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用される任意の方法を使用する当技術分野でよく知られた任意の手段によって検出し、サブクローニングし、配列決定し、さらに評価することができる。したがって、本発明の核酸を使用して、開示の配列を含む遺伝子及びゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。あるいは、本発明の核酸を使用して関連配列からなる遺伝子及びゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。本明細書で開示した核酸配列を使用するこのような方法は当業者に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）の「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。代表的な方法は、実施例１〜４にも開示している。
【００８５】
本発明の一の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６核酸分子のレベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して測定する。Ｃｈｉａｎｇ（１９９８）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８０６：２０９−２１８及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、本発明の核酸分子に基づく遺伝子アッセイを使用して、例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒら、１９８３）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９０）、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａら、１９８９）、ＳＳＣＰ／ヘテロ二本鎖分析、酵素ミスマッチ開裂、増幅したエキソンの直接配列分析（Ｋｅｓｔｉｌａら、１９９８；Ｙｕａｎら、１９９９）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇら、１９９１）及び特定の突然変異を含む増幅したゲノムＤＮＡの制限分析により遺伝子変異体をスクリーニングすることができる。単一のヌクレオチド多型の大規模な特性決定には自動化された方法を適用することもできる（Ｗａｎｇら、１９９８；Ｂｒｏｏｋｅｓ、１９９９）。好ましい検出方法は非電気泳動法であり、例えばＴＡＱＭＡＮ ＴＭ対立遺伝子識別アッセイ、ＰＣＲ−ＯＬＡ、分子標識、パドロックプローブ及びウェル蛍光を含む。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８：７６９−７７６及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００８７】
ＩＶ．Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系
本発明は、さらに、本発明の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドの発現系を提供する。このＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、ヒト又は非ヒトの１つ又は複数の他のＴ２Ｒと共に発現してもよい。このような系はその後の精製及び／又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドの特性決定において使用することができる。例えば、精製したＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、以下の本明細書中でさらに記載するＴ２Ｒ７６抗体を産生するための免疫原として使用することができる。
【００８８】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータの同定に使用することもできる。あるいは、開示のＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、他の試験ポリペプチドの活性化をアッセイするときに対照ポリペプチドとして使用することができる。このような試験ポリペプチドは、味覚に関連した他のＴ２Ｒ、例えばＡｄｌｅｒら（２０００）のＣｅｌｌ １００：６９３−７０２及びＭａｔｓｕｎａｍｉら（２０００）のＮａｔｕｒｅ ６０１−６０３で開示されたポリペプチドの任意の１つを含むことができる。
【００８９】
用語「発現系」は、異種核酸と異種核酸でコードされたポリペプチドとを含む宿主細胞を指す。例えば、異種発現系は、組換えＴ２Ｒ７６核酸を含む構築体でトランスフェクトした宿主細胞、Ｔ２Ｒ７６ ｃＲＮＡでトランスフェクトした宿主細胞、又は異種核酸を宿主細胞ゲノムに導入することによって生成した細胞系を含むことができる。既述の通り、これらの発現系は他のＴ２Ｒ核酸を含んでもよい。
【００９０】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現系は、（ａ）組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド、及び（ｂ）組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む宿主細胞を含むことができる。例えば、Ｔ２Ｒ７６ ｃＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、次いで宿主細胞に導入することにより、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現させることができる。この系は、ｈＴ２Ｒ７６及び別のＴ２Ｒポリペプチドを含むヘテロメリックＴ２Ｒ受容体を生成するために、１つ又は複数の追加のＴ２Ｒポリペプチドをさらに含むことができる。
【００９１】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系はまた、（ａ）ベクターと、異種プロモーターに作動可能に結合したＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸分子とを含む構築体、並びに（ｂ）（ａ）の構築体を含む宿主細胞を含むことができ、これにより宿主細胞はＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する。この系は、１つ又は複数の追加のＴ２Ｒポリペプチドをコードする構築体をさらに含むことができる。さらに、単一の構築体は、それ自体でＴ２Ｒ７６ポリペプチドと、１つ又は複数の追加のＴ２Ｒポリペプチドとをコードすることができる。
【００９２】
単離ポリペプチド及び組換え技術によって生成されたポリペプチドを精製し、当業者に知られている種々の標準的な技術を使用して特性決定することができる。例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ＆Ｌｕｂｋｅ（１９６５）の「ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ＆Ｅｂｅｒｌｅ（１９９３）の「ペプチド、１９９２：第２２回欧州ペプチドシンポジウムの議事録（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９９２：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）」、１９９２年９月１３〜１９日、Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ、スイス国、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）の「ペプチド合成の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２改定版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ／ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）の「分子生物学の短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ）」、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００９３】
組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、機能的味覚受容体を含むことが好ましく、苦味受容体を含むことがより好ましい。したがって、組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、苦味化合物に応答して活性化を示すものが好ましい。また、組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、天然のＴ２Ｒ７６ポリペプチドと同様の活性化応答を示すことが好ましい。Ｔ２Ｒ７６の機能を決定する代表的な方法は以下の本明細書中で記載する。
【００９４】
ＩＶ．Ａ．発現構築体
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する構築体は、ベクターとＴ２Ｒ７６ヌクレオチド配列とを含み、このＴ２Ｒ７６ヌクレオチド配列はプロモーター配列と作動可能に結合している。組換えＴ２Ｒ７６発現のための構築体はまた、転写終止シグナル及びヌクレオチド配列を適切に翻訳するのに必要な配列を含むこともできる。翻訳及び終止シグナル配列の付加を含む発現構築体の調製は当業者に知られている。
【００９５】
Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え体の生成は、構成性プロモーター又は誘導プロモーターを使用して実施することができる。本発明に従って使用することができる代表的なプロモーターとしては、サルウイルス４０初期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復プロモーター、アクチンプロモーター、熱ショックプロモーター及びメタロチエンタンパク質（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）がある。
【００９６】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現するのに使用することができる適切なベクターとしては、これらだけに限定するものではないが、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスなどのウイルス、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）、プラスミド及びコスミドＤＮＡベクター、トランスポゾン仲介形質転換ベクター及びこれらの誘導体がある。
【００９７】
構築体は、使用するベクターと適合するトランスフェクション法を使用して宿主細胞に導入する。標準的なトランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム仲介トランスフェクション、トランスポゾン仲介形質転換、レトロウイルスを使用する注入、粒子仲介遺伝子転移、超速度遺伝子転移及びこれらの組合せがある。
【００９８】
ＩＶ．Ｂ．宿主細胞
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」は、異種核酸分子を導入することができる細胞を指す。これらだけに限定するものではないが、哺乳動物細胞などの真核宿主（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞）、両性動物細胞（例えば、アフリカツメガエル卵母細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、並びに大腸菌及び枯草菌などの原核宿主を含む任意の適切な宿主細胞を使用することができる。好ましい宿主細胞はＴ２Ｒ７６ポリペプチドを実質的に欠いている。
【００９９】
組換え配列の発現を改変するか、所望の特定の方法で遺伝子産物を改変しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。例えば、種々の宿主細胞が、翻訳並びに翻訳後プロセシング及び改変（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）のための特性及び特定の機序を有する。発現した外来タンパク質の所望の改変及びプロセシングを確実に行うために、適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。例えば、細菌系の発現を使用して非グリコシル化コアタンパク質産物を生成することができ、酵母での発現はグリコシル化産物を生成する。
【０１００】
本発明はさらに、安定な細胞系でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現を包含する。異種構築体の宿主細胞への形質転換の後に行われる安定な細胞系を生成する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｊｏｙｎｅｒ（１９９３）の「遺伝子ターネティング：実践的アプローチ（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｎｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。従って、形質転換細胞、組織又は非ヒト生物は、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、トランスジェニック後代又はその繁殖形態を包含すると理解される。
【０１０１】
本発明は、本明細書で開示の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞の凍結保存体をさらに包含する。したがって、一時的にトランスフェクトした細胞およびＴ２Ｒ７６を発現する安定な細胞系の細胞を後で使用するために、凍結し、保存することができる。凍結細胞は離れた場所で使用するために容易に運搬することができる。
【０１０２】
凍結保存培地は一般に、ベース培地、凍結保存剤及びタンパク質源からなる。凍結保存剤及びタンパク質は、凍結解凍プロセスのストレスから細胞を保護する。血清含有培地としては、通常の凍結保存培地は、１０％グリセロールを含む完全培地、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む完全培地、又は１０％グリセロール若しくは１０％ＤＭＳＯを含む５０％新鮮培地を含む５．０％細胞調整培地（ｃｅｌｌ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）として調製する。血清を含まない培地では、通常の凍結保存配合物は、７．５％ＤＭＳＯを含む５０％血清フリー新鮮培地を含む５０％血清フリー細胞調整培地、又は７．５％ＤＭＳＯ及び１０％細胞培養グレードＤＭＳＯを含む血清フリー新鮮培地を含む。１ｍあたり約１０６から約１０７個の細胞を含む細胞懸濁液を凍結保存培地と混合することが好ましい。
【０１０３】
凍結保存に適切なバイアル又はその他の容器、例えばＮＵＮＣ＠ ＣＲＹＯＴＵＢＥＳＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）中で、細胞を凍結保存培地と合わせる。細胞は多ウェルプレート、例えば高スループットアッセイ用に設計した９６ウェルプレートのウェルに等分量ずつ入れ、プレートに入れたまま凍結することもできる。
【０１０４】
細胞は、１分あたり約−１℃の速度で室温から保存温度まで冷却するのが好ましい。冷却速度は、例えば細胞を含むバイアルを、約１リットルの容量を持ち、完全におおわれた満水状態の保存容器に入れ、そのような容器（ｃｕｂｅ）を−７０℃の機械的フリーザーに入れることによって調節することができる。あるいは、細胞冷却の速度は、凍結させる細胞培養物の総体積の１５倍を超える体積の脂肪族アルコールなどの液体冷媒にバイアルを沈め、約−７０℃未満の温度の通常のフリーザーに、沈めた培養物バイアルを入れることにより、１分あたり約−１℃に制御することができる。細胞を凍結させるための市販の装置も入手可能である。例えば、Ｐｌａｎｅｒ Ｍｉｎｉ−Ｆｒｅｅｚｅｒ Ｒ２０２／２０ＯＲ（英国のＰｌａｎｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）及びＢＦ−５ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｒｅｅｚｅｒ（米国コネチカット州ＤａｎｂｕｒｙのＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。凍結細胞は、好ましくは約−７０℃以下から約−８０℃、より好ましくは約−１３０℃以下で保存する。
【０１０５】
最良の細胞生存を得るためには、細胞はできるだけ速やかに解凍しなければならない。凍結細胞を含むバイアル又はその他の保存容器を貯蔵室から取り出したら、３７℃の水浴に直接入れ、完全に解凍するまで穏やかに振盪しなければならない。凍結保存剤に対して細胞が特に感受性の場合は、さらに増殖の前に細胞を遠心分離し、凍結保存剤を除去する。
【０１０６】
凍結細胞の調製及び取扱いのさらなる方法は、特にＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）の「動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及び米国特許第６１７６０８９号；同第６１４０１２３号；同第５６２９１４５号；及び第４４５５８４２号に見出すことができる。
【０１０７】
Ｖ．トランスジェニック動物
本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６遺伝子発現の妨害剤及び任意に別のＴ２Ｒ妨害剤を含むトランスジェニック動物を提供する。変化した遺伝子発現は、Ｔ２Ｒ７６遺伝子の変化したレベル又は突然変異体の発現を含むことができる。本発明は、トランスジェニック動物を作製する構築体を調製するのに使用することができるＴ２Ｒ７６をコードする核酸を提供する。Ｔ２Ｒ７６遺伝子座を標的とする構築体の調製に有用なゲノム位置測定データも提供する。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、トランスジェニック動物はマウスＴ２Ｒ７６遺伝子座を標的改変したマウスを含むことができ、全ての体細胞のＴ２Ｒ７６遺伝子を完全に又は部分的に機能的に不活性化したマウス株をさらに含むことができる。
【０１０９】
他の実施形態において、本発明によるトランスジェニック動物は、アンチセンス又はリボザイムＴ２Ｒ７６構築体を使用して作製し、これを普遍的な又は組織特異的なプロモーターで作動させて、体細胞のＴ２Ｒ７６遺伝子発現レベルを減少させ、それにより「ノックダウン」表現型を実現する。本発明は、Ｔ２Ｒ７６が条件付き又は誘導性に不活性化されたネズミ株の生成も提供する。このようなネズミ株は追加の合成若しくは天然の突然変異、例えば任意の他のＴ２Ｒ遺伝子の突然変異も含むことができる。
【０１１０】
本発明はまた、例えば過剰発現又は優性の負の表現型を作製するために、Ｔ２Ｒ７６遺伝子を特異的に「ノックイン」改変したマウス株も提供する。したがって、「ノックイン」改変は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸の野生型及び突然変異型の両方を発現することを含む。
【０１１１】
トランスジェニック動物を作製する技術は当技術分野で知られている。代表的な技術は、米国特許第５４８９７４２号（トランスジェニックラット）；米国特許第４７３６８６６号、同第５５５０３１６号、同第５６１４３９６号、同第５６２５１２５号及び同第５６４８０６１号（トランスジェニックマウス）；米国特許第５５７３９３３号（トランスジェニックブタ）；同第５１６２２１５号（トリのトランスジェニック種）及び米国特許第５，７４１，９５７（ウシのトランスジェニック種）に記載されており、これらのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０１１２】
例えば、本発明のトランスジェニック動物は、マウスＴ２Ｒ７６を標的改変したマウスを含むことができる。全ての体細胞のＴ２Ｒ７６遺伝子を完全又は部分的に機能的に不活性化したマウス株は、ネズミ胚性幹細胞での部位特異的組換えの標準的な技術を使用して作製することができる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）のＳｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｔｈｏｍａｓ＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９９０）のＮａｔｕｒｅ ３４６：８４７−８５０；及びＤｅｌｐｉｒｅら（１９９９）のＮａｔ Ｇｅｎｅｔ ２２：１９２１９５を参照されたい。
【０１１３】
ＶＩ．Ｔ２Ｒ７６抗体
本発明の別の態様では、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成する方法を提供する。この方法では、完全長の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドが、有効な免疫原として使用され、動物を免疫してその動物で免疫応答が発生できるように調製される。免疫応答は、動物の血清から収集することができる抗体の産生を特徴とする。本発明はまた、配列番号２を含む、本明細書で開示の新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用する方法で生成した抗体を提供する。
【０１１４】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、一本鎖抗体、突然変異させた抗体、ヒト化抗体及び抗原結合部位を含む抗体断片（例えば、Ｆａｂ抗体断片及びＦｖ抗体断片）を含む、免疫グロブリンタンパク質又はその機能的部分を指す。本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６抗体はモノクローナル抗体を含む。したがって、本発明は、抗体及び本明細書で記載したモノクローナル抗体を産生する細胞系も包含する。
【０１１５】
抗体のＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合を記載するのに使用する用語「特異的に結合する」は、他のポリペプチドの異種混合物中でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合を指す。
【０１１６】
抗体と対照ポリペプチド又は試料との結合を記載するのに本明細書で使用する語句「結合を実質的に欠く」又は「結合が実質的にない」は、非特異的又はバックグラウンド結合を包含するが、特異結合を含まない結合のレベルを指す。
【０１１７】
抗体を調製及び特性決定する技術は当技術分野で知られている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）の「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及び米国特許第４１９６２６５号、同第４９４６７７８号、同第５０９１５１３号、同第５１３２４０５号、同第５２６０２０３号、同第５６７７４２７号、同第５８９２０１９号、同第５９８５２７９号及び同第６０５４５６１号を参照されたい。
【０１１８】
本明細書の開示の通りに調製したＴ２Ｒ７６抗体は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの局在性及び活性に関連する技術分野で知られる、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸のクローニング、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの免疫精製、生物学的試料中でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドのイメージング、及び適切な生物学的試料中でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドのレベル測定のための方法で使用することができる。このような方法を実施するために、本発明の抗体は、これらだけに限定するものではないが、放射性標識、蛍光標識、エピトープ標識及びｉｎ ｖｉｖｏで検出可能な標識を含む検出可能な標識をさらに含むことができる。特定の検出技術に適切な標識を選択する方法、検出可能な標識を抗体と複合又は結合させる方法は当業者に知られている。
【０１１９】
ＶＩＩＩ．Ｔ２Ｒ７６モジュレータ
本発明は、Ｔ２Ｒ７６活性のモジュレータを同定するアッセイをさらに開示する。アッセイは、上記の本明細書中で開示したような、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する系、又はそのような系で産生された単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを使用することができ、そのようなＴ２Ｒポリペプチドは、他のＴ２Ｒポリペプチドと共に発現されるものでもよい。本発明は、開示の方法を使用して同定したＴ２Ｒ７６活性のモジュレータも提供する。
【０１２０】
用語「調節する」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの任意又は全ての化学的及び生物学的活性又は特性の増加、減少又はその他の変化を意味する。したがって、モジュレータを同定する方法は、Ｔ２Ｒ７６の機能のレベル又は質をアッセイすることも含む。
【０１２１】
Ｔ２Ｒ７６機能のモジュレータを同定する方法は、（ａ）組換え発現系を用意して、それによりＴ２Ｒ７６ポリペプチドを宿主細胞中で発現させること（Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む）、（ｂ）試験物質を（ａ）の系に与えること、（ｃ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をアッセイすること、（ｄ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をＴ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較すること、及び（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較して有意に変化した試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質を測定することによって試験物質をＴ２Ｒ７６モジュレータとして同定することを含むことができる。いくつかの実施形態では、発現系は、少なくとも１つの他のＴ２Ｒと共発現するＴ２Ｒ７６も提供する。
【０１２２】
Ｔ２Ｒ７６活性の制御レベル又は質は、野生型Ｔ２Ｒ７６活性のレベル又は質を指す。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系は配列番号２を含むことが好ましい。試験物質の調節能力を評価する場合、Ｔ２Ｒ７６活性の制御レベル又は質は試験物質の不存在下での活性のレベル又は質を含む。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「有意に変化した」は、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの変化したレベル又は活性を指し、測定技術に固有の誤差の範囲よりも大きい測定可能な質の定量化した変化、好ましくは対照測定値に対して約２倍以上の増加又は減少、より好ましくは約５倍以上の増加又は減少、最も好ましくは約１０倍以上の増加又は減少を指す。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイは、Ｔ２Ｒ７６遺伝子発現のレベルを判定することを含む。
【０１２５】
本発明の別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイは、組換え発現Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの結合活性のアッセイを含む。例えば、Ｔ２Ｒ７６活性は、モジュレータのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合の量又は強さを含むことができる。
【０１２６】
本発明のさらに別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの活性立体構造のアッセイを含むことができる。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６の機能のアッセイは、リガンド又はモジュレータのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合に応答した細胞内シグナリング事象の活性化のアッセイを含む。例えば、Ｇタンパク質交換活性のリガンド仲介刺激は、以下の本明細書及び実施例３でさらに記載する通り、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合量を測定することによってアッセイすることができる。
【０１２８】
開示の方法で同定したモジュレータは、アゴニスト及びアンタゴニストを含むことができる。本明細書で使用する用語「アゴニスト」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的活性を活性化し、生物学的活性を助け、又は生物学的活性を増強する物質を意味する。本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的活性を妨げ、又は緩和する物質を指す。モジュレータは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合するリガンド又は物質も含むことができる。Ｔ２Ｒ７６モジュレータの判定のための活性アッセイ及び結合アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。
【０１２９】
本発明の一実施形態では、このようなアッセイは、これらだけに限定するものではないが、「用途」という標題で以下の明細書でさらに記載する食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤を含む経口使用する組成物の味覚を変化させるための添加剤として開発できるＴ２Ｒ７６モジュレータの同定に有用である。例えば、Ｔ２Ｒ７６の阻害剤は苦味を減少させるのに使用することができる。
【０１３０】
本発明の別の実施形態では、このようなアッセイは、経口使用が可能だが望ましくない化合物、例えば家庭用洗剤、毒などの味覚を変化させる添加剤として開発することができるＴ２Ｒ７６モジュレータの同定に有用である。したがって、Ｔ２Ｒ７６のアゴニストを使用して、組成物に苦味を導入し又は組成物の苦味を増大させることによってその経口使用を阻止することができる。
【０１３１】
本発明のさらに別の実施形態において、組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用するアッセイは、Ｔ２Ｒ７６との相互作用が望ましくない生物活性剤を事前にスクリーニングする目的で実施することができる。例えば、対象に投与することを意図した薬物は、望ましくない苦味となり得るＴ２Ｒ７６調節活性について試験することができる。
【０１３２】
本発明のさらに別の実施形態では、本明細書で開示のアッセイを使用して、突然変異Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、例えば苦味覚の差異と結び付いている突然変異ポリペプチドの特性決定をすることができる。突然変異Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現は、障害関連（ｄｉｓｏｒｄｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ）のＴ２Ｒ７６ポリペプチドのさらなる分析を可能にする。
【０１３３】
本発明は、本明細書で記載した方法を利用する迅速な高スループットスクリーニング法も提供する。このスクリーニング法は、個々にＴ２Ｒ７６ポリペプチドを多数の試験物質と接触させることを含む。このようなスクリーニング法において、多数の標的物質は、好ましくは約１０４種を超える試料、より好ましくは約１０５種を超える試料、さらに好ましくは約１０６種を超える試料を含む。
【０１３４】
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞アッセイは、溶液アッセイを含むことができ、又はアッセイの１種若しくは複数の成分を固定する固相基質をさらに含むことができる。例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞、及び任意により別のＴ２Ｒポリペプチドを、共有結合又は非共有結合により固体状態の成分に直接結合することができる。さらに場合により、この結合は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの基質への間接結合を仲介するリンカー分子又はタグを含むことができる。
【０１３５】
代表的なリンカーとしては、既知の結合対（例えば、ビオチンとアビジン）、既知の抗原を認識する抗体、合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド及びポリアセテート）、ペプチド、エーテルがある。リンカーは、フレキシブルなリンカー、例えばポリ（エチレングリコール）リンカー（米国アラバマ州ＨｕｎｔｓｖｉｌｌｅのＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．から入手可能）を任意に含むことができる。リンカーは、さらにアミド、スルフヒドリル又はヘテロ官能性結合部位を任意に含むことができる。
【０１３６】
リンカーは、任意の種々の最新の方法を使用して固体基質に付加させることができる。この最新の方法には、基質の誘導体化（これにより基質はリンカーと反応する）又は熱若しくは紫外線架橋を使用する非化学的手法が含まれる。代表的なプロトコルは、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）のＪ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（例えばペプチドの固相合成を記載している）；Ｇｅｙｓｅｎら（１１９８７）のＪ Ｉｍｍｕｎ Ｍｅｔｈ １０２：２５９−２７４（ピン上での固相成分の合成を記載している）；Ｆｒａｎｋ＆ｂｏｒｉｎｇ（１９８８）のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）のＳｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７；及びＫｏｚａｌら（１９９６）のＮａｔ Ｍｅｄ ２（７）：７５３７５９（固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）のＪ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（例えばペプチドの固相合成を記載している）；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７）のＪ Ｉｍｍｕｎ Ｍｅｔｈ １０２：２５９−２７４（ピン上での固相成分の合成を記載している）；Ｆｒａｎｋ＆Ｄｏｒｉｎｇ（１９８８）のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）のＳｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７；及びＫｏｚａｌら（１９９６）のＮａｔ Ｍｅｄ ２（７）：７５３７５９（固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）に特に見い出すことができる。
【０１３７】
ＶＩＩ．Ａ．試験物質
本発明の方法を使用してアッセイした潜在的モジュレータは候補物質を含む。本明細書で使用する用語「候補物質」及び「試験物質」は同義的に使用され、いずれも任意の合成、組換え若しくは天然の生成物又は組成物を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドと相互作用すると思われる物質を指す。ポリペプチドと相互作用すると思われる試験物質は、本明細書で開示の方法を使用してそのような相互作用について評価することができる。
【０１３８】
代表的な試験物質としては、これらだけに限定するものではないが、ペプチド、オリゴマー、核酸（例えば、アプタマー）、小分子（例えば、化合物）、抗体又はその断片、核酸−タンパク質融合物、任意の他の親和剤、それらの組合せがある。試験物質はさらに、炭水化物、ビタミン又はその誘導体、ホルモン、神経伝達物質、ウイルス又はその受容体結合ドメイン、オプス又はロドプシン、着臭剤、フェロモン、毒素、成長因子、血小板活性化因子、神経刺激性ペプチド又は神経ホルモンを含むことができる。候補物質は苦味覚を引き出すことが好ましい。試験される候補物質は精製された分子、均質な試料、又は分子若しくは化合物の混合物であることができる。
【０１３９】
本明細書で使用する用語「小分子」は、約１０００ダルトン未満、より好ましくは約７５０ダルトン未満、さらに好ましくは約６００ダルトン未満、さらに好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を有する化合物、例えば有機化合物を指す。小分子はまた、約−４から約＋１４の範囲、より好ましくは約−２から約＋７．５の範囲の計算されたｌｏｇオクタノール／水分配係数を有することが好ましい。
【０１４０】
試験物質はライブラリーとして得る又は調製することができる。本明細書で使用する用語「ライブラリー」は分子の集団を意味する。ライブラリーは、約１０個の分子から数１０億個以上の分子まで変化する少数又は多数の異なる分子を含むことができる。分子は天然分子、組換え分子又は合成分子を含むことができる。ライブラリーの複数の試験物質は同時にアッセイすることができる。異なるライブラリー由来の試験物質は同時に評価するために、場合によってプールすることができる。
【０１４１】
代表的なライブラリーとしては、これらだけに限定するものではないが、ペプチドライブラリー（米国特許第６１５６５１１号、同第６１０７０５９号、同第５９２２５４５号及び同第５２２３４０９号）、オリゴマーライブラリー（米国特許第５６５０４８９号及び同第５８５８６７０号）、アプタマーライブラリー（米国特許第６１８０３４８号及び同第５７５６２９１号）、小分子ライブラリー（米国特許第６１６８９１２号及び同第５７３８９９６号）、抗体又は抗体断片のライブラリー（米国特許第６１７４７０８号、同第６０５７０９８号、同第５９２２２５４号、同第５８４０４７９号、同第５７８０２２５号、同第５７０２８９２号及び同第５６６７９８８号）、核酸−タンパク質融合物のライブラリー（米国特許第６２１４５５３号）及びＴ２Ｒ７６ポリペプチドに潜在的に結合することができる任意の他の親和剤のライブラリー（例えば、米国特許第５９４８６３５号、同第５７４７３３４号及び同第５４９８５３８号）がある。
【０１４２】
ライブラリーは分子の無作為集団を含むことができる。あるいはライブラリーは、特定の配列、構造又は立体構造について偏りを有する分子の集団を含むことができる。例えば、米国特許第５２６４５６３号及び同第５８２４４８３号を参照されたい。種々のタイプの分子の多様な集団を含むライブラリーを調製する方法は、例えば上記の本明細書で挙げた米国特許に記載されている通り、当技術分野で知られている。多くのライブラリーは市販もされている。
【０１４３】
ＶＩＩ．Ｂ．結合アッセイ
本発明の別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６モジュレータを同定する方法は、試験物質のＴ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドと１つ若しくは複数の他のＴ２Ｒポリペプチドとを含むヘテロメリック受容体への特異結合を判定することを含む。用語「結合」は２つの分子間の親和性を指す。特異結合はまた、一つのタンパク質又は化合物の別のタンパク質への活性が阻害的（阻害剤又はアンタゴニストの場合）又は増強的（活性剤又はアゴニストの場合）な相互作用の質又は状態を包含することが好ましい。
【０１４４】
候補モジュレータの結合能力に言及する場合、語句「特異的に（又は選択的に）結合する」は、タンパク質及び他の生物学的材料の異種集団中にタンパク質が存在することを決定する結合反応を指す。モジュレータのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合は、その結合親和性が約１×１０４Ｍ−１から約１×１０６Ｍ−１以上である場合、特異的であると考えることができる。語句「特異的に結合する」は、飽和可能結合も指す。試験物質のＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの飽和可能結合を証明するために、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析は、例えばＭａｋら（１９８９）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：２１６１３−２１６１８によって記載されている通りに実施することができる。
【０１４５】
モジュレータの対照ポリペプチド又は試料への結合を説明するために本明細書で使用する語句「結合を実質的に欠く」又は「結合が実質的にない」は、非特異的又はバックグラウンド結合を包含するが、特異結合を含まない結合のレベルを指す。
【０１４６】
いくつかの技術を使用して、既知の競合モジュレータを用いることなくＴ２Ｒ７６ポリペプチドと試験物質との間の相互作用を検出することができる。代表的な方法としては、これらだけに限定するものではないが、蛍光相関分光法、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間分光法及びＢｉａｃｏｒｅ技術があるが、各技術は以下の本明細書で記載する。これらの方法により自動化高スループットスクリーニングを容易にできる。
【０１４７】
蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）は、小体積の試料中の蛍光分子の蛍光の散乱の平均速度を測定する（Ｔａｌｌｇｒｅｎ、１９８０）。試料のサイズはわずか１０３個の蛍光分子、試料の体積はわずか細菌１つの細胞質であることができる。散乱速度は分子の質量の関数であり、質量が増大すると減少する。したがってＦＣＳは、質量、つまり結合時の分子の散乱速度の変化を測定することによってポリペプチド−リガンド相互作用分析に適用することができる。通常の実験では、分析する標的（例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド）は、Ｎ末端又はＣ末端に挿入されたポリヒスチジン配列などの配列タグを有する組換えポリペプチドとして発現される。この発現は、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル卵母細胞又は哺乳動物細胞などの宿主細胞中で仲介される。ポリペプチドはクロマトグラフィー法を使用して精製する。例えば、ポリヒスチジンタグを使用して発現されたポリペプチドをイミノ二酢酸アガロースにキレートしたＮｉ２＋などの金属キレートカラムに結合させることができる。次いでポリペプチドをカルボキシテトラメチルローダミン又はＢＯＤＩＰＹＴｍ試薬（オレゴン州ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）などの蛍光タグで標識する。次いでポリペプチドを溶液中で潜在的リガンドに曝露し、その散乱速度をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ニューヨーク）から入手可能な器具を使用してＦＣＳにより測定する。リガンド結合はポリペプチドの散乱速度の変化によって判定する。
【０１４８】
表面増強レーザ脱離／イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＳＥＬＤＩ）はＨｕｔｃｈｅｎｓ＆Ｙｉｐ（１９９３）のＲａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ７：５７６−５８０によって開発された。飛行時間質量分光計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＴＯＦ）と合わせると、ＳＥＬＤＩはチップ上に保持された分子を迅速に分析する技術を提供する。これは標的タンパク質又はその部分をチップに共有結合させ、このタンパク質に結合する小分子を質量分析で分析することによってリガンド−タンパク質相互作用分析に適用することができる（Ｗｏｒｒａｌｌら、１９９８）。通常の実験では、標的ポリペプチド（例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド）は組換え発現させ、精製する。標的ポリペプチドは、ポリヒスチジンタグを利用するか、イオン交換又は疎水性相互作用などのその他の相互作用によりＳＥＬＤＩチップに結合させる。例えばリガンドを連続的にピペットで量り入れることができる供給システム（オートサンプラー）を介して、このように調製したチップを潜在的リガンドに曝露する。次いで、例えばイオン強度が増大するバッファ溶液での一連の洗浄などの増大するストリンジェンシーの溶液中で洗浄する。各洗浄後、チップをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにかけることにより結合した材料を分析する。標的ポリペプチドを特異的に結合するリガンドは、それを溶離するのに必要な洗浄のストリンジェンシーで同定する。
【０１４９】
Ｂｉａｃｏｒｅは、層に固定した標的ポリペプチド（例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド）にリガンドが結合した際の表面層での屈折率の変化に依存する。このシステムでは、小リガンドの集団を２〜５マイクロリットルの細胞に連続的に注入し、ここで標的ポリペプチドは細胞内に固定する。結合は、表面から屈折するレーザ光を記録することによって表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により検出する。一般に、表面層での質量濃度の所与の変化についての屈折率変化は、すべてのタンパク質及びペプチドで実質的に同じであり、単一の方法を任意のタンパク質に適用することができる（Ｌｉｅｄｂｅｒｇら、１９８３。通常の実験では、標的タンパク質は組換え発現させ、精製し、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合させる。結合は、ポリヒスチジンタグを利用することにより、又はイオン交換＊や疎水性相互作用などのその他の相互作用により促進することができる。次いで、このように調製したチップをＢｉａｃｏｒｅ（スウェーデン国、Ｕｐｐｓａｌａ）から販売されている器具に組み込まれた供給システムを介して１つ又は複数の潜在的リガンドに曝露し、そのリガンドをピペットで連続的に量り入れる（オートサンプラー）。チップ上のＳＰＲシグナルを記録し、屈折率の変化は固定化した標的とリガンドとの相互作用を示す。オンレート及びオフレートのシグナル動態を分析することにより、非特異的相互作用と特異的相互作用とを区別することができる。Ｈｏｍｏｌａら（１９９９）のＳｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ５４：３−１５及びその中の引例も参照されたい。
【０１５０】
ＶＩＩ．Ｃ．立体構造アッセイ
本発明はまた、単独で発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド、或いはＴ２Ｒ７６モジュレータが結合した、又はＴ２Ｒ７６モジュレータと相互作用した場合に別のＴ２Ｒポリペプチドと合わせたＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造の変化に依存するＴ２Ｒ７６モジュレータを同定する方法を提供する。
【０１５１】
円偏光二色性を高分子の溶液に適用することにより、これらの高分子の立体構造の状態が明らかになる。この技術により、ランダムコイル、αへリックス及びβ鎖の立体構造の状態を区別することができる。
【０１５２】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定するために、組換え発現させたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用して円偏光二色性分析を実施することができる。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを、例えばイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、試験物質と混合する。この混合物を円偏光二色性にかける。試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造を、試験物質不存在下でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造と比較する。試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造状態の変化をこのように使用してＴ２Ｒ７６モジュレータを同定することができる。代表的な方法は米国特許第５７７６８５９号及び同第５７８０２４２号に記載されている。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは別のＴ２Ｒポリペプチドを含むヘテロメリック受容体に含まれていてもよい。
【０１５３】
ＶＩＩ．Ｄ．受容体活性化アッセイ
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６モジュレータを同定する方法は機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを使用する。本明細書で開示の新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドは配列番号２を含む。Ｔ２Ｒ７６の機能を判定する代表的な方法は以下の本明細書で記載する通り、細胞内シグナリング事象のリガンド仲介活性化をアッセイすることを含む。
【０１５４】
試験物質のＴ２Ｒ７６の機能への効果は、これらだけに限定するものではないが、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのリン酸化、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに結合するＧタンパク質、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞中のイオン流束、遺伝子転写の変化、細胞代謝の変化（例えば、細胞増殖）、細胞内第２メッセンジャー（例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ）の変化及び伝達物質又はホルモン放出の変化を含むＴ２Ｒ７６活性によって引き出される任意の生理学的変化のアッセイを含むことができる。ＧＰＣＲシグナル形質導入及びそれをアッセイする方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅｓ ２３７及び２３８（１９９４）に記載されている。Ｂｅｒｒｉｄｇｅ＆Ｉｒｖｉｎｅ（１９８４）のＮａｔｕｒｅ ３１２：３１５−３２１；Ｂｏｕｒｎｅら（１９９１）のＮａｔｕｒｅ １０：３４９：１１７−２７；Ｂｏｕｒｎｅら（１９９０）のＮａｔｕｒｅ ３４８：１２５−３２；Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏら（１９９４）のＡｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｅｌｌ及びＭｏｌ Ｂｉｏｌ １１：１５９−１６４；Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ（１９９７）のＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：９６１−９６４；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ（１９９５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１５１７５−１５１８０；Ｐｉｔｃｈｅｒら（１９９８）のＡｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：６５３−９２；並びに米国特許第４１１５５３８号；同第５４３６１２８号；同第６００４８０８号、同第６４０３３０５号及び同第６２５５０５９号も参照されたい。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６の機能のアッセイは、組換え発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド単独又は別のＴ２Ｒポリペプチドと合わせて組換え発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドのガストデューシン又はＧｑ若しくはトランスデューシンなどの種々のＧタンパク質へのカップリングをアッセイすることも含む。したがってＴ２Ｒ７６活性の代表的レベルは、実施例３で記載の通り、ガストデューシンでのＧＤＰのＧＴＰγＳへの交換量を含むことができる。Ｔ２Ｒ７６活性の代表的な質は、例えばサブユニット１つあたりのＧタンパク質の選択的活性化を含むことができる。
【０１５６】
この方法に従って、Ｔ２Ｒ７６を発現する細胞はＴ２Ｒ７６の機能をアッセイするのに有用なキットの形態で供給することができる。したがって、細胞は上記の本明細書で記載の通りに凍結させ、凍結している間にアッセイを実施する他の場所へ輸送することができる。例えば、本発明の一実施形態では、Ｔ２Ｒ７６モジュレータを検出するために試験キットを用意する。このキットは、（ａ）完全長Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードするＤＮＡでトランスフェクトした凍結細胞及び（ｂ）この細胞を増殖させるための培地を含む。
【０１５７】
このようなアッセイで使用する細胞は、本来のＴ２Ｒ７６及びＴ２Ｒ７６と実質的に同様のポリペプチドを実質的に欠いている細胞を含むことが好ましい。好ましい細胞は真核生物細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞を含む。
【０１５８】
宿主細胞又は対照細胞を記載するために本明細書で使用する用語「実質的に欠いている」は、本来のＴ２Ｒ７６のレベル、Ｔ２Ｒ７６と実質的に同様のポリペプチドのレベル又はそれらの活性レベルを有し、バックグラウンドレベルを含む質を指す。用語「バックグラウンドレベル」は、Ｔ２Ｒ７６を含まず、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと実質的に同様のポリペプチドを含まない細胞で通常検出される発現又は活性の非特異的測定値を包含する。
【０１５９】
本発明のアッセイで使用した細胞は、Ｔ２Ｒ７６受容体を細胞内シグナリング経路にカップリングすることができる機能性Ｇタンパク質を含むことが好ましい。本発明の一実施形態では、機能性Ｇタンパク質は種々のカップリング、例えばＧα１５及びＧα１６を示すＧタンパク質を含むことができる。Ｗｉｌｋｉｅら（１９９１）のＰｒｏｃ Ｎａｄ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１００４９−１００５３及び米国特許第６００４８０８号を参照されたい。
【０１６０】
組換えＴ２Ｒ７６を発現する細胞を使用するすべてのアッセイは、本来のＴ２Ｒ７６及びＴ２Ｒ７６ポリペプチドと実質的に同様のポリペプチドを実質的に欠いている対照細胞をさらに使用することも好ましい。一時的にトランスフェクトした細胞を使用する場合、対照細胞は、例えばトランスフェクトしていない宿主細胞を含むことができる。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する安定な細胞系を使用する場合、対照細胞は、例えばＴ２Ｒ７６を発現する細胞系を誘導するのに使用した親細胞系を含むことができる。
【０１６１】
一時的にトランスフェクトした細胞を使用するＴ２Ｒ７６活性のアッセイは、トランスフェクトした細胞をトランスフェクトしていない細胞から区別するマーカーを含んでいることが好ましい。用語「マーカー」は、Ｔ２Ｒ７６を組換え発現させる細胞をＴ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え発現させない細胞から区別するのに使用することができる任意の検出可能な分子を指す。細胞がＴ２Ｒ７６をコードする核酸分子とマーカーとで同時にトランスフェクトされるように、マーカーはＴ２Ｒ７６発現のための構築体でコードされているか、Ｔ２Ｒ７６発現のための構築体と合わされていることが好ましい。マーカーとして有用な代表的な検出できる分子としては、これらだけに限定するものではないが、異種核酸、トランスフェクトされた構築体でコードされたポリペプチド（例えば、酵素又は蛍光ポリペプチド）、結合タンパク質及び抗原がある。例えば、マーカーは実施例２で記載の通り、免疫学的に検出することができるロドプソンタグを含むことができる。
【０１６２】
マーカーとして有用な酵素の例としては、ホスファターゼ（例えば、酸ホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）がある。
【０１６３】
酵素を含むマーカーは、酵素の活性に基づいて検出することができる。したがって、基質を加え、例えば分光光度計、ルミノメーター又は蛍光分光計を使用して、その最終生成物が検出可能な反応を触媒する。上記の酵素による、検出可能な反応生成物を生成する反応のための基質は当業者に知られている。
【０１６４】
好ましいマーカーは、基質を加えることなく検出することができるコードされたポリペプチドを含む。直接検出できる代表的なポリペプチドとしては、ＧＦＰ及びＥＧＦＰがある。蛍光、例えばＧＦＰ又はＥＧＦＰ蛍光の高スループット検出を実施するための一般的な研究装置が開発されている。それには、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（米国マサチューセッツ州Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ）、Ａｍｅｒｓｈａｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（米国カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．（米国ワシントン州Ｉｓｓａｕａｈ）及びＧｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（米国ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）製の器具が含まれる。市販のシステムの殆どは、光電子増倍管検出を伴う、ある形態の走査技術を使用する。
【０１６５】
ＶＩＩ．Ｅ．理論的設計
本来のＴ２Ｒ７６ポリペプチド構造の知識により、モジュレータ及び診断剤の理論的設計の手法が得られる。簡単に言えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの構造は、Ｘ線結晶学により及び／又は三次元画像を生成する計算アルゴリズムにより決定することができる。Ｓａｑｉら（１９９９）のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：５２１−５２２；Ｈｕａｎｇら（２０００）のＰａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：２３０−２４１；及びＰＣＴ国際公報番号ＷＯ９９／２６９６６を参照されたい。あるいは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド構造のワーキングモデルは相同性モデルから導出することができる（Ｍａａｌｏｕｆら、１９９８）。コンピュータモデルは、上記の本明細書で記載のアッセイを使用して合成及び試験することができる種々の基質分子へのタンパク質構造の結合をさらに予測することができる。さらなる化合物設計技術は、米国特許第５８３４２２８号及び同第５８７２０１１号に記載されている。
【０１６６】
一般に、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは膜タンパク質であり、界面活性剤又はその他の適切な両親媒性分子を使用して可溶性形態に精製することができる。得られるＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、結晶化に十分な純度及び濃度である。精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは還元又は非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＰＡＧＥ）で単一バンドとして表れることが好ましい。精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、ｐＨ、バッファタイプ、バッファ濃度、塩タイプ、ポリマータイプ、ポリマー濃度、他の沈殿リガンド及び精製Ｔ２Ｒ７６の濃度の少なくとも１つが変化する条件下で結晶化させることができる。結晶性ポリペプチドを生成する方法は当技術分野で知られており、本明細書で開示のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの判定に合理的に使用することができる。例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら（１９８４）のＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８０：３８５−３９８；Ｗｅｉｓｓら（１９９０）のＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２６７：２６８−２７２；又はＣＲＹＳＴＡＬ ＳＣＲＥＥＮ（商標）キット（米国カリフォルニア州ＲｉｖｅｒｓｉｄｅのＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能）などの市販のキットに提供されている方法を参照されたい。
【０１６７】
結晶化したＴ２Ｒ７６ポリペプチドは機能活性について試験することができ、異なるサイズや形状の結晶は、Ｘ線回折で適性をさらに試験する。一般に、より大きい結晶はより小さい結晶よりも良好な結晶学を提供し、より厚い結晶はより薄い結晶よりも良好な結晶学を提供する。Ｔ２Ｒ７６の結晶は０．１〜１．５ｍｍの範囲のサイズであることが好ましい。これらの結晶はＸ線を少なくとも１０Ａの分解能まで、例えば１．５〜１０．０Ａ又はその範囲の任意の値、例えば１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５若しくは３まで回折する。最高の分解能としては３．５Ａ以下が好ましい。
【０１６８】
ＶＩＩＩ．Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する方法
本発明はさらに、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する方法を提供する。開示の方法は、味覚についてのＴ２Ｒ７６関連の差異と結び付いたＴ２Ｒ７６発現の変化レベルを判定するのに使用することができる。
【０１６９】
本発明の一実施形態では、この方法は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体との免疫化学反応を実施することを含む。この抗体は、このような抗体を生成するための本発明の方法により調製した。したがって、この方法は、（ａ）ペプチド性材料を含む生物学的試料を入手すること、（ｂ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと特異的に結合し、開示の方法で生成した抗体と生物学的試料を接触させること（抗体は検出可能な標識を含む）、及び（ｃ）検出可能な標識を検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することを含む。
【０１７０】
このような抗体抗原コンジュゲート又は複合体を検出する技術は当技術分野で知られており、これらだけに限定するものではないが、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィー及びその他の免疫化学方法がある。例えば、Ｍａｎｓｏｎ（１９９２）の「免疫化学プロトコル（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、米国ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ；Ｉｓｈｉｋａｗａ（１９９９）の「超感受性及び迅速な酵素イムノアッセイ（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム／米国ニューヨーク；Ｌａｗ（１９９６）の「イムノアッセイ：実践的指針（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ）」、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、ロンドン／米国ペンシルバニア州Ｂｒｉｓｔｏｌ；Ｃｈａｎ（１９９６）の「イムノアッセイの自動化：システムの最新の指針（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｌｉｄｄｅｌｌ＆Ｗｅｅｋｓ（１９９５）の「抗体技術（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、英国オックスフォード；Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら（１９９３）の「免疫学的分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ／ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、独国ワインハイム／米国Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｋｅｒ＆Ｒａｐｌｅｙ（１９９３）の「診断における分子プローブ及び抗体プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、Ｗｉｌｅｙ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク；Ｗｙｃｋｏｆｆら（１９８５）の「生物学的高分子の回折方法（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国フロリダ州Ｏｒｌａｎｄｏ；及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【０１７１】
本発明の別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異結合を示すモジュレータを使用してＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する。抗体を使用するＴ２Ｒ７６ポリペプチドの検出と同様に、この方法は、（ａ）ペプチド性材料を含む生物学的試料を入手すること、（ｂ）生物学的試料をＴ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータと接触させること（モジュレータは検出可能な標識を含む）、及び（ｃ）検出可能な標識を検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することを含む。例えば蛍光体又はエピトープ標識などの任意の適切な検出可能な標識を使用することができる。
【０１７２】
ＩＸ．用途
本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法を提供する。本発明のモジュレータは、例えば苦味覚を抑制又は強化するために、苦味覚を変化させるのに有用である。
【０１７３】
ＩＸ．Ａ．対象
本明細書で使用する用語「対象」は、任意の脊椎動物種、好ましくは哺乳動物及び鳥類などの温血脊椎動物を含む。より具体的には、本発明の方法は、ヒト、並びにヒトにとって、絶滅の危機に瀕しているために重要な（例えば、シベリアトラ）、経済的に重要な（ヒトが消費するために飼育場で飼育されている動物）及び／又は社会的に重要な（ペットとして又は動物園で飼われている動物）哺乳動物、例えばヒト以外の肉食動物（例えば、ネコ及びイヌ）、豚（ブタ、食用豚及びイノシシ）、反芻動物及び家畜（例えば、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ）並びにウマなどの哺乳動物の腫瘍の治療を意図する。絶滅の危機に瀕した、又は動物園で飼育されている種類の鳥類、並びに家禽、より具体的には家蓄化した家禽若しくは飼い鳥類、例えばシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどを含む鳥類もヒトにとって経済的に重要なので、その治療も意図する。
【０１７４】
ＩＸ．Ｂ．組成物
本発明の方法によれば、対象の味覚を変化させるために投与する組成物は有効量のＴ２Ｒ７６モジュレータを含む。Ｔ２Ｒ７６モジュレータは上記の本明細書で記載したタイプの試験物質のいずれか１つを含むことができる。本明細書で開示の通りに同定したＴ２Ｒ７６モジュレータを使用して、これらだけに限定するものではないが、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤、例えば以下の本明細書で挙げた化合物のいずれかを含む経口使用のための組成物を調製することができる。Ｔ２Ｒ７６モジュレータは、経口使用が可能だが望ましくない化合物、例えば家庭用洗剤、毒などの味覚を変化させる添加剤として使用することもできる。
【０１７５】
望ましくない又は苦味を有する代表的な化合物としては、これらだけに限定するものではないが、グレープフルーツ、オレンジ及びレモンなどの柑橘類；トマト、ピーマン、セロリ、メロン、ニンジン、ジャガイモ及びアスパラガスなどの野菜；香味、ソース、醤油及び赤トウガラシなどの調味料又は薬味；大豆由来の食物；クリーム、ドレッシング、マヨネーズ及びマーガリンなどの食品エマルジョン；魚肉、魚のすり身、魚卵などの加工海産物；ピーナッツなどのナッツ類；納豆などの発酵食品；肉及び加工肉；漬物；ヌードル；粉末スープを含むスープ；チーズなどの乳製品；パン及びケーキ；キャンディー、チューイングガム及びチョコレートなどの菓子；並びに健康用に特別に調製した食物がある。
【０１７６】
苦味を表出する代表的な化粧品（例えば、化粧水、クリーム、美顔用パック、口紅、ファンデーション、ひげ剃り用製剤、アフターシェーブローション、クレンジングフォーム及びクレンジングジェル）としては、これらだけに限定するものではないが、アルキル硫酸ナトリウム及びモノアルキルリン酸ナトリウムなどの界面活性剤を含む組成物；メントール、リナロール、フェニルエチルアルコール、プロピオン酸エチル、ゲラニオール、酢酸リナリル及び酢酸ベンジルなどの香料；メチルパラベン、プロピルパラベン及びブチルパラベンなどの抗菌物質；乳酸及び乳酸ナトリウムなどの湿潤剤；オクタ酢酸スクロース及びブルシンなどのアルコール変性剤；並びに乳酸アルミニウムなどの収斂剤がある。
【０１７７】
苦味を有する代表的な薬剤としては、アセトアミノフェン、テルフェナジン、グアイフェネシン、トリメトプリム、プレドニゾロン、イブプロフェン、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、メタコリン、ネオスチグミン、エピネフリン、アルブテロール、塩酸プソイドエフェドリン、ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、フェノチアジン、クロルプロマジン、クロルジアゼポキシド、アミトリプチリン、バルビツレート、ジフェニルヒダントイン、カフェイン、モルヒネ、デメロール、コデイン、ロモチル、リドカイン、サリチル酸、スルホンアミド、クロロキン、ビタミン製剤、鉱物及びペニシリンがある。
【０１７８】
モジュレータは、調製した食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬物の一部として投与することもできる。対象に投与するための組成物を調製するために、その味覚を調節する化合物にＴ２Ｒ７６モジュレータを約０．００１重量％から約１０重量％、好ましくは約０．０１重量％から約８重量％、より好ましくは約０．１重量％から約５重量％、最も好ましくは約０．５重量％から約２重量％含む量で混合することができる。
【０１７９】
適切な配合物としては、溶液、エッセンス、エリキシル、アルコール剤、シロップ剤、懸濁液、粉剤、顆粒、カプセル剤、ペレット剤、錠剤及びエアゾルがある。場合により、配合物は、薬剤として許容できる担体、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、着香料、着色料、甘味料、香料又はこれらの組合せを含む。Ｔ２Ｒ７６モジュレータ及び組成物は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は多用量密封容器に提供することができる。
【０１８０】
ＩＸ．Ｃ．投与
Ｔ２Ｒ７６モジュレータは味覚を調節するために対象に直接投与することができる。本発明のモジュレータは経口的又は経鼻的に投与することが好ましい。
【０１８１】
本発明の方法に従って、有効量のＴ２Ｒ７６モジュレータを対象に投与する。用語「有効量」はＴ２Ｒ７６の活性化を調節及び／又は苦味覚を調節するのに十分な組成物の量を指す。
【０１８２】
有効量は、所望の味覚を達成するのに有効な量のＴ２Ｒ７６モジュレータを投与するように変化させることができる。選択する投与レベルは、Ｔ２Ｒ７６モジュレータの活性、配合、他の組成物との組合せ（例えば、食物、薬物など）、対象とする使用（例えば、食品添加物、歯磨剤などとして）並びに治療する対象の生理的状態及び以前の病歴を含む種々の要因に左右される。
【０１８３】
有効量又は投与量は、当技術分野で知られている通りの味覚のｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して容易に決定することができる。味覚をアッセイする代表的な方法は実施例４に記載している。
【０１８４】
実施例
本発明の方法を説明するために以下の実施例を記載する。以下の実施例のある態様は、本発明を良好に実施するために本発明者らが見出し又は意図した技術及び手順について記載している。これらの実施例は、本発明者らの標準的な実習を説明する。本開示及び当技術分野の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図しており、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更、修正及び改変が可能なことは理解されよう。
【実施例１】
【０１８５】
ヒトＴ２Ｒ７６のクローニング
ヒト苦味受容体をコードする新規な遺伝子がヒトゲノム配列データベースで同定された。新規なｈＴ２ＲメンバーであるｈＴ２Ｒ７６はヒトの第７染色体に位置している。Ｔ２Ｒ７６ＤＮＡ配列の染色体上の位置は、カリフォルニア大学（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）のＧｅｎｏｍｉｃｓウェブサイトをスクリーニングすることによって決定した。この分析により、Ｔ２Ｒ７６は領域１４４０６２６９２−１４４０６３６４８の第７染色体に位置することが示された。ある化合物、例えばフェニルチオカルバルネートの苦味は第５染色体及び第７染色体に遺伝的に関連している。（Ｇｕｏら（２００１）のＡｎｎ Ｈｕｍ Ｂｉｏｌ ２８：１１１−４２）。したがって、Ｔ２Ｒ７６はある苦味物質の結合及び認識に関与していると予想される。
【０１８６】
ヒトＴ２Ｒ７６は、上記のｈＴ２Ｒ配列を有するＤＮＡ配列データベースの反復配列検索によって最初同定された。次いで、ｈＴ２Ｒ７６をコードする完全長オープンリーディングフレームはゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離された。ｈＴ２Ｒ７６のアミノ酸配列は、対応するオープンリーディングフレームを概念的に翻訳することによって導出した。ｈＴ２Ｒ７６ヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１及び配列番号２として挙げる。
【０１８７】
ｈＴ２Ｒ７６のイントロンを含まないオープンリーディングフレームは、長さが３１８アミノ酸残基の推定受容体タンパク質をコードする。ｈＴ２Ｒ７６タンパク質配列を一般の配列データベースの既知のタンパク質すべてとＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して比較すると、哺乳動物苦味受容体ファミリーのメンバーと強い相同性が示された。
【実施例２】
【０１８８】
ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６の構造
ブリッジオーバーラップＰＣＲ伸長技術を使用して、Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら（２０００）のＣｅｌｌ １００：７０３−７１１に記載の通り、ヒトＴ２Ｒ７６コード配列を有するフレームにウシロドプシンの最初の３８アミノ酸を含むｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６キメラを生成した。次いで、キメラｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ−１ベクターにクローニングし、ロドプシン標識したｈＴ２Ｒ７６を含むバキュロウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（米国カリフォルニア州ＣａｒｌｓｂａｄのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して生成した。ｈＴ２Ｒ７６の発現は、抗ロドプシンタグ抗体（１３６−３０）を使用する免疫ブロッティングにより確認した。ｈＴ２Ｒ７６型バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞は、予想した分子量（約３５ｋＤａ）のタンパク質を生成した。
【実施例３】
【０１８９】
Ｔ２Ｒ７６のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧタンパク質カップリング
ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６をコードする感染性バクミドを実施例２に記載の通りに調製する。昆虫の幼虫の細胞を６０時間、組換えバクミドに感染させ、Ｒｙｂａ＆Ｔｒｉｎｄｅｌｌｉ（１９９５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：６７５７−６７６７で記載の通りに膜を調製する。５Ｍ尿素で処理して周囲のタンパク質を除去し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴに膜を再懸濁する。モノクローナル抗体Ｂ６−３０を使用するウェスタンブロッティングにより、ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６の発現を評価することができる。
【０１９０】
例えばＨｏｏｎら（１９９５）のＣｅｌｌ ９６ ６２９−６３６及びＲｙｂａ＆Ｔｒｉｎｄｅｌｌｉ（１９９５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：６７５７−６７６７で記載の通りに、Ｇタンパク質を単離する。ガストデューシンでのＧＤＰのＧＴＰγＳへの受容体触媒交換は、１０ｎＭ ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６、１００μｔＭ ＧＤＰ及び２０μＭ Ｇβ１γ８の存在下で測定する。種々のＧタンパク質（例えば、Ｇα５又はトランスデューシン）でのＧＤＰ−ＧＴＰγＳ交換は、米国特許出願第６０／３７２０８９号に記載の通りに実施する。約１５〜６０分の時点での測定値はＧＴＰγＳ結合の初速度を反映する。
【実施例４】
【０１９１】
味覚試験
本明細書で開示の通りに同定したＴ２Ｒ７６モジュレータを含む試験組成物を使用して香味受入れ研究を実施する。Ｔ２Ｒ７６モジュレータを欠くが、それ以外は試験組成物と実質的に同様であるか同一の対照組成物も使用する。この試験は、対象すべてが、１回又は複数回同量又は同用量を投与する両方の組成物を評価する二重交差設計を用いる。試験組成物及び対照組成物は単一の試験日に評価する。試験組成物及び対照組成物を投与する順序は対象間で無作為化する。参加した対象すべては、試験プロトコルのすべての態様を完了する。対象は、通常の味覚スコア（例えば、１＝非常に苦い、２＝苦い、３＝並、４＝それほど苦くない、５＝全く苦くない）を使用して試験組成物及び対照組成物のそれぞれについて反応する。有害事象は記録する。対照組成物と比較したときの試験組成物の美味性の有意差を測定することにより、Ｔ２Ｒ７６モジュレータの有効性を判定する。
【実施例５】
【０１９２】
苦味化合物に対するｈＴ２Ｒ７６の応答
ｈＴ２Ｒ７６を発現する哺乳動物細胞系（ＨＥＫ２９３）並びに異なるｈＴ２Ｒ（ｈＴ２Ｒ６４）を発現する対照細胞系を使用してＧＴＰγＳ結合アッセイを実施する。これらの細胞系を、６−ｎ−プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）、オクタ酢酸スクロース、ウンデカ酢酸ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ｕｎｄｅｃａａｃｅｔａｔｅ）、（ＲＵＡ）、グリシン酸銅、デナトニウム及びキニーネを０．５から２ｍｍの範囲の種々の濃度で含む苦味化合物と接触させる。このアッセイの結果を使用して、ｈＴ２Ｒ７６は既知の苦味刺激で特異的に活性化される苦味受容体であることが確認される。このＧＴＰγＳ結合アッセイでは、活性は特定の濃度の既知の苦味化合物の存在下又は不存在下のいずれかで判定する。
【実施例６】
【０１９３】
高スループットスクリーニングアッセイ
ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用して、１５０００種を超える化合物のライブラリーをスクリーニングしてｈＴ２Ｒ７６を特異的に活性化する他の化合物を同定する。このアッセイでｈＴ２７６を活性化する特定の化合物の構造を比較して、ｈＴ２Ｒ７６を強力に活性化する同様の構造を有する化合物を予想する。次いで、同じＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて異なる濃度でこれらの同様の構造を有する化合物のライブラリーを評価して、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する他の化合物を同定する。
【実施例７】
【０１９４】
ヒト味覚試験
ＧＴＰγＳ結合アッセイでｈＴ２Ｒ７６を活性化する化合物を、ヒト味覚試験で評価する。これらのヒト味覚試験は同意した成人で実施し、これらの成人には同定した化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＴ２Ｒ７６を活性化する濃度で経口投与する。これらの味覚試験では、（ｈＴ２Ｒ７６活性化する）同定した化合物を水に溶解して、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＴＰγＳ結合アッセイでｈＴ２Ｒ７６を活性化する化合物濃度を得る。
【０１９５】
この味覚試験では、少なくとも５人のサンプルが、苦味化合物を含む一連の水溶液を味覚する。（好ましい実施例では、苦味化合物はＴ２Ｒ７６アゴニストである）。各人は、０から１００（０は「ほとんど検出できない」であり、１００は「最も強いとイメージできる」である）の範囲に分類した等級尺度で苦さの度合をランク付けする。次に、各人は苦味化合物とＴ２Ｒ７６阻害剤を含む一連の水溶液の味を調べ、各試料について苦さの度合をランク付けする。苦さの度合の低下によってＴ２Ｒ７６阻害剤の有効性を測定する。比較手段として、各対象は既知の苦味化合物（硫酸キニーネ）も味覚し、評価する。味覚試験の結果は、対象すべての平均評点として表す。
【実施例８】
【０１９６】
既知の苦味化合物に対するｈＴ２Ｒ７６の応答
このアッセイの結果を使用して、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する苦味化合物を同定する。これに基づいて、このような苦味化合物によるｈＴ２Ｒ７６の活性化をブロックする化合物を同定するアッセイを開発することができる。
【０１９７】
結論
これらのアッセイの結果は、ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用して苦味化合物を同定することができること、及びｈＴ２Ｒ７６１がヒト苦味受容体として機能することを証明する。同定した化合物を使用して、食物及び飲料に苦味を与えることができる。あるいは、これらの化合物は、苦味遮断剤及びモジュレータ並びに他の苦味化合物を同定するためのアッセイでのアゴニストとして使用することができる。
【０１９８】
参考文献
以下に挙げた参考文献並びに本明細書に引用したすべての参照文献は、本明細書で使用した方法、技術及び／又は組成物を補足し、説明し、それらに背景を与え、又は教示する範囲において本明細書に援用する。
（参考文献）
【０１９９】
本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の種々の詳細を変更できることは理解されよう。さらに、上記の記載は説明することのみを目的とし、本明細書に添付した特許請求の範囲で定義した本発明を制限する目的はない。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年７月２９日出願の米国特許出願第６０／３９８７２７号の優先権を主張する。参照によりこの出願の全体を援用する。
【０００２】
本発明は、一般的には、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド及びＴ２Ｒ７６ポリペプチドが仲介する味覚に関する。より具体的には、本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離された核酸、単離された機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための異種発現系、味覚のモジュレータ、特に苦味を有する化合物又は苦味をブロックする化合物を同定する方法、及びその使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトが認識できる基本的な味覚の１つに苦さがある。苦味化合物は、細胞表面受容体と相互作用することによって苦味を生成すると考えられている。受容体の活性化により、神経伝達物質の放出に至る細胞内シグナリングカスケードが開始する。次いで脳神経節の求心性神経線維はそのシグナルを皮質味覚中枢に伝達し、そこでその情報は味覚として処理される。これらの受容体は、細胞内Ｇタンパク質と相互作用する７回膜貫通ドメイン受容体のファミリーに属し、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）とも呼ばれる。Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３（６８５２）：２１９−２５を参照されたい。
【０００４】
Ｔ２Ｒと称されるＧＰＣＲの新規なファミリーがヒト及び齧歯動物で同定されている（Ａｄｌｅｒら、２０００；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ、２０００；ＰＣＴ国際公報ＷＯ０１／１８０５０及びＷＯ０１／７７６７６）。様々な系列の証拠が、Ｔ２Ｒが苦味化合物の認識を仲介できることを示唆した。第１に、Ｔ２Ｒ遺伝子は、特異的に舌及び口蓋上皮の味覚受容体細胞のサブセットで発現される。第２に、Ｔ２Ｒは、遺伝的にマウス及びヒトの苦さの認識と関連する遺伝子座と結び付いている（Ｃｏｎｎｅａｌｌｙら、１９７６；Ｃａｐｅｌｅｓｓら、１９９２；Ｒｅｅｄら、１９９９；Ａｄｌｅｒら、２０００）。第３に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、Ｔ２Ｒはガストデューシン（味覚細胞で特異的に発現され、苦さ刺激性トランスデューシンと結び付くＧタンパク質）を活性化できること（Ｗｏｎｇら、１９９６）及びＴ２Ｒによるガストデューシンの活性化が、苦味化合物の適用に応答して選択的に生じること（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００）が示されている。これらのデータに基づくと、ｍＴ２Ｒ及びｈＴ２Ｒ受容体ファミリーは、マウス及びヒトのそれぞれで苦味応答を仲介することが提示される。
【０００５】
苦味は、しばしば食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤において望ましくない。苦味は、砂糖などの甘味化合物を加えることにより隠すことができるが、甘味料の添加は食物の風味を望ましくないものに変え、かつカロリー摂取量を増大させることがある。薬剤の場合、経口摂取に際しての苦味を減少させるために、複雑で費用のかかる製剤方法（例えば、コーティング及びカプセル）が開発されてきた。味覚受容体の阻害によって苦味を直接ブロックする方法は記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、苦味覚の阻害剤を開発するための標的として苦味受容体を同定し、かつ機能的に特性決定することが当技術分野で長い間求められていた。
【０００７】
この要求を満たすために、本発明は新規なＴ２Ｒ７６核酸及びポリペプチドを提供する。本発明はまた、味覚を変化させるＴ２Ｒ７６のモジュレータの同定及び使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、単離Ｔ２Ｒ７６核酸及びそれによってコードされるＴ２Ｒ７６ポリペプチドを提供する。このポリペプチド及び核酸は本明細書で開示した検出方法及びアッセイにおいて有用である。
【０００９】
Ｔ２Ｒ７６核酸は、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子と、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、又は（ｃ）配列番号１と実質的に同様の単離核酸分子とを含むことができる。
【００１０】
Ｔ２Ｒ７６核酸はまた、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、又は（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列において上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸分子と少なくとも１個の機能的に等価なコドンが異なり、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む。好ましくは、単離Ｔ２Ｒ７６核酸は、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、又は（ｂ）配列番号１の単離核酸分子を含む。
【００１１】
単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、（ａ）配列番号２のポリペプチド、（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチドを含むことができる。
【００１２】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはまた、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、（ｃ）高ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、及び（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列において上記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のうちの１つの単離核酸分子と少なくとも１個の機能的に等価なコドンが異なり、上記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子からなる群から選択される単離核酸分子でコードされたポリペプチドを含むことができる。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）核酸材料を有する生物学的試料を入手すること、（ｂ）単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の生物学的試料とハイブリダイズし、それにより単離Ｔ２Ｒ７６核酸と生物学的試料中の核酸との間で二重構造を形成すること、及び（ｃ）（ｂ）の二重構造を検出し、それによりＴ２Ｒ７６核酸分子を検出することを含むＴ２Ｒ７６核酸を検出する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体、及びそれを生成する方法を提供する。この方法の代表的な実施形態は、（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え又は合成で生成すること、（ｂ）（ａ）のポリペプチドを製剤化することにより有効な免疫原とすること、（ｃ）（ｂ）の製剤を動物に投与して、その動物の血清に存在する抗体の産生を含む免疫応答をその動物に生じさせること、及び（ｄ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む血清を（ｃ）の動物から収集することを含む。この開示した方法はさらに、モノクローナル抗体の調製を含むことができる。
【００１５】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの濃度を測定する方法も提供する。代表的な実施形態では、この方法は、（ａ）ペプチド材料を有する生物学的試料を入手すること、（ｂ）本発明の抗体との免疫化学的反応で（ａ）の生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの量を測定することを含む。
【００１６】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現系も提供する。組換え発現系は、（ａ）本発明のＴ２Ｒ７６ポリペプチド（例えば、配列番号２として挙げた代表的な実施形態）、及び（ｂ）当該Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種宿主細胞を含むことができる。さらに、この組換え発現系はＴ２Ｒ７６とは異なるＴ２Ｒポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。特に、この組換え発現系は、２００３年５月６日に発行されたＺｕｋｅｒらの米国特許第６５５８９１０号、２００２年７月１８日に公開されたＡｄｌｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｅｌｌｉｏｔの米国出願公開２００２００９４５５１、及び２００３年１月３０日に公開されたＺｕｋｅｒらの米国出願公開２００３００２２２７８（これらのすべての全体を参照により援用する）に開示されたＴ２Ｒ核酸配列のいずれかを含んでもよい。本明細書に参照により援用したＺｕｋｅｒの出願で開示されている通り、Ｔ２Ｒポリペプチドの別名はＳＦ又はＧＲポリペプチドであることに留意されたい。対象のｈＴ２Ｒ７６は、１つ又は複数の他のＴ２Ｒポリペプチドと共に発現して機能的なヘテロメリック味覚受容体を産生することができる。他のＴ２Ｒポリペプチドとしては、別のヒトＴ２Ｒ又は別の種、例えばラット又はマウスのＴ２Ｒがある。宿主細胞は任意の適切な細胞を含むことができる。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を含む。また好ましくは、宿主細胞は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドとのカップリングが可能なＧタンパク質αサブユニット、例えばＧα１５、ガストデューシン又はトランスデューシンなどのプロミスカスＧタンパク質を含む。
【００１７】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え発現する開示の系を使用して、本発明はさらに、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、この方法は、（ａ）組換え発現系を用意して、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを異種宿主細胞中で発現させること、（ｂ）試験物質を（ａ）の系に与えること、（ｃ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６の機能のレベル又は質をアッセイすること、（ｄ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６の機能のレベル又は質を、Ｔ２Ｒ７６の機能の対照レベル又は質と比較すること、及び（ｅ）Ｔ２Ｒ７６の機能の対照レベル又は質と比較して有意に変化した試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６の機能のレベル又は質を測定することにより試験物質をＴ２Ｒ７６モジュレータとして同定することを含む。このアッセイはＧＴＰγＳ結合の量を測定することを含むことができる。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法は、（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチド又はポリペプチドの組合せを単独で又は１種若しくは複数の他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて１つ又は複数の試験物質に暴露すること（ｅｘｐｒｅｃｉｎｇ）、（ｂ）試験物質の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６を含有するポリペプチドの組合せへの結合をアッセイすること、及び（ｃ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異結合性を示す候補物質を選択することを含む。
【００１９】
開示の方法で同定された、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのアゴニスト及び阻害物質を含むモジュレータも提供される。モジュレータは、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、小分子及びこれらの組合せを含むことができる。モジュレータは、更に苦味覚のモジュレータを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明はさらに、対象中の苦味覚を調節する方法を提供する。対象は哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。同様に、対象で変わる苦味覚はＴ２Ｒ７６機能を含むことが好ましい。
【００２１】
本発明の一実施形態では、対象で苦味覚を調節する方法は、（ａ）開示の方法で同定したＴ２Ｒ７６モジュレータを含む組成物を調製すること、及び（ｂ）対象に有効量の組成物を投与することにより、対象で苦味覚を変化させることを含む。
【００２２】
例えば、本発明は、Ｔ２Ｒ７６阻害物質と苦味化合物とを対象に同時投与することにより苦味化合物の苦味覚を減少させる方法を提供する。本発明は、Ｔ２Ｒ７６アゴニストと化合物とを同時投与することによりその化合物の苦味覚を増強させる方法も提供する。この同時投与は、味を修飾する化合物と混合したＴ２Ｒ７６阻害物質を含む組成物の投与を含むことができる。本発明の好ましい実施形態では、組成物は、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤を含むことができる。
【００２３】
本発明は、Ｔ２Ｒ７６アゴニストと味を修飾する化合物とを同時投与することにより化合物の苦味覚を増強する方法も提供する。このＴ２Ｒ７６アゴニストと化合物とは、単一の組成物として混合することができる。
【００２４】
したがって、本発明の目的は、新規なＴ２Ｒ７６核酸及びポリペプチド、Ｔ２Ｒ７６核酸を検出する方法、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種発現系、異種Ｔ２Ｒ７６発現系を使用する方法及びアッセイ、並びにＴ２Ｒ７６ポリペプチドを調節及び検出する方法を提供することである。この目的は、全体的又は部分的に本発明で達成される。
【００２５】
上記の本発明の目的、本発明の他の目的及び利点は、以下の本発明の記載及び非限定的な実施例を研究した後、当業者に明らかになるであろう。
【００２６】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１及び２は、それぞれヒトＴ２Ｒ７６ヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
Ｉ．定義
以下の用語は当業者にはよく理解されていると思われるが、本発明の説明を容易にするために以下にその定義を示す。
【００２８】
用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は１つ又は複数を言及する長年の慣用に従って使用する。
【００２９】
配列の同一性のパーセンテージ（例えば、本明細書で以下に記載する通り、ヌクレオチド配列やアミノ酸配列を比較する場合）、ヌクレオチド又はタンパク質の長さ、結合量などの測定できる値に言及するときに本明細書で使用する用語「約」は、開示の方法を実施する又はその他の方法で本発明を実施するのに適切なように、特定の量からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３０】
ＩＩ．Ｔ２Ｒ７６核酸及びポリペプチド
本発明は、新規なＴ２Ｒ７６核酸及び機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを含む新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドを提供する。本発明の代表的なＴ２Ｒ７６核酸は配列番号１として示し、これは配列番号２として示したＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする。
【００３１】
用語「Ｔ２Ｒ７６」及び「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語（例えば、ｈＴ２Ｒ７６）は、一般に単離Ｔ２Ｒ７６核酸、Ｔ２Ｒ７６核酸でコードされた単離ポリペプチド及びそれらの活性について言及する。Ｔ２Ｒ７６核酸及びポリペプチドは任意の生物から得ることができる。用語「Ｔ２Ｒ７６」及び「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語はまた、苦味化合物で活性化される受容体を含むポリペプチド及びそれをコードする核酸を指す。Ｔ２Ｒ７６受容体は他のＴ２Ｒポリペプチドを含んでもよく、ヘテロメリック受容体であってよい。
【００３２】
核酸又はポリペプチドの関係で使用される用語「単離」は、核酸又はポリペプチドがその本来の環境から離れて存在し、天然の産物ではないことを示す。単離核酸又はポリペプチドは、精製形態で存在することができ、又はトランスジェニック宿主細胞などの非本来の環境で存在することができる。
【００３３】
以下の本明細書中でさらに開示する通り、本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの機能的発現の系を提供する。この系は、配列番号１を含む組換えＴ２Ｒ７６核酸を使用し、これは別のＴ２Ｒ核酸と共に発現されてもよい。
【００３４】
ＩＩ．Ａ．Ｔ２Ｒ７６核酸
用語「核酸分子」及び「核酸」はそれぞれ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖、二本鎖又は三本鎖形態のこれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、基準天然核酸と同様の性質を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を有する核酸を包含する。用語「核酸分子」又は「核酸」は、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」又は「ｃＲＮＡ」の代わりに使用することもできる。核酸は合成することができ、又は任意の生物を含む任意の生物学的起源から得ることができる。完全長Ｔ２Ｒ７６ｃＤＮＡをクローニングする代表的な方法は実施例１に記載している。
【００３５】
用語「Ｔ２Ｒ」又は「ＳＦ」は、味覚細胞特異的Ｇタンパク質 受容体のファミリーのメンバーをコードする核酸を指す。これらがコードするこれらの核酸及びポリペプチドは、Ｇタンパク質光学味覚受容体の「Ｔ２Ｒ」、「ＳＦ」、「ＧＲ」又はＴＡＳ２Ｒファミリーとして言及される。このＧＰＣＲの神経系ファミリーには、味覚形質導入ｐ の成分が含まれる。ファミリー では、このファミリーのメンバーは苦味の検出に関与している。味覚受容体のＴ２Ｒ又はＳＦファミリーのメンバーは、米国特許第６５５８９１０号、２００３年１月２０日に公開されたＺｕｒａらの米国出願公開２００３００２２２７８、及び２００２年７月１８日に公開されたＡｄｌｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｅｌｌｉｏｔの米国出願公開２００２００９４５０２で論議されている。この種のＴ２Ｒの例としては、
が挙げられる。
【００３６】
択一的に言及されるこれらのＴ２Ｒ、ＳＦ、ＴＡＳ２Ｒなど又はＧＲは、ヒト、マウス及びラットを含む異なる種由来であってもよく、ヒト由来が好ましい。「実質的に同一」である、又はそれと同一の特異的配列を有する、又は以下で定義する通りのこれらの配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするＴ２Ｒも包含される。
【００３７】
用語「Ｔ２Ｒ７６」及び「Ｔ２Ｒ７６」を含む用語（例えば、ｈＴ２Ｒ７６）は、本明細書ではＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸に言及するために使用する。したがって、用語「Ｔ２Ｒ７６」は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号１と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む本発明の単離核酸を指す。
【００３８】
ヌクレオチド配列間の類似性を記載するのに本明細書で使用する用語「実質的に同一」とは、一致が最大となるように比較し整列したときに、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査で測定して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％から約９９％、さらにより好ましくは約９５％から約９９％、最も好ましくは約９９％のヌクレオチド同一性を有する２つ以上の配列を指す。実質的同一性は、好ましくは少なくとも約１００残基のヌクレオチド配列で存在するものであり、より好ましくは少なくとも約１５０残基のヌクレオチド配列で存在するものであり、最も好ましくは完全長コード配列を含むヌクレオチド配列で存在するものである。用語「完全長」は、本明細書では以下の本明細書中でさらに記載する機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする完全なオープンリーディングフレームに言及するために使用する。２つのポリペプチド間の同一性の割合を判定する方法は、「ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較」という標題で以下の本明細書中で定義する。
【００３９】
一の態様では、実質的に同一な配列は多型配列であることができる。用語「多型」は、集団に２つ以上の遺伝的に決定された代替配列又は対立遺伝子が出現することを指す。対立遺伝子の差異は、わずか一つの塩基対であることもできる。
【００４０】
別の態様では、実質的に同一な配列は、サイレント突然変異を含む配列を含む、突然変異を起こした配列を含むことができる。突然変異は、１つ以上の残基変化、残基の欠失、又は追加の残基の挿入を含むことができる。
【００４１】
２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であることを示す別のものは、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いに特異的にハイブリダイズする、又は実質的にハイブリダイズするものである。核酸のハイブリダイゼーションにおいては、比較する２つの核酸配列を「プローブ」及び「標的」と呼ぶことができる。「プローブ」は基準核酸分子であり、「標的」は試験核酸分子であり、核酸分子の異種集団中にしばしば見出される。「標的配列」は「試験配列」と同義である。
【００４２】
ハイブリダイゼーション試験又はアッセイに使用するのに好ましいヌクレオチド配列には、本発明の核酸分子の少なくとも約１４から４０ヌクレオチド配列と相補性の又は類似するプローブ配列が含まれる。プローブは、任意の配列番号１の１４から２０ヌクレオチド、所望ならば３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００若しくは５００ヌクレオチド又は完全長までなどのより長いヌクレオチドを含むことが好ましい。このような断片は、例えば断片の化学合成、核酸増幅技術の適用、又は選択した配列を組換え生産用の組換えベクターに導入することにより容易に調製することができる。
【００４３】
語句「に特異的にハイブリダイズする」は、特定のヌクレオチド配列が複雑な核酸混合物（例えば、全細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在するときに、分子がその特定のヌクレオチド配列だけにストリンジェントな条件下で結合、二重鎖形成又はハイブリダイズすることを指す。
【００４４】
語句「に実質的にハイブリダイズする」は、プローブ核酸分子と標的核酸分子との間での相補的ハイブリダイゼーションを指し、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低減することにより所望のハイブリダイゼーションを達成することができる軽微な不整合を包含する。
【００４５】
サザンブロット分析及びノーザンブロット分析などの核酸ハイブリダイゼーション実験の場合には、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、かつ環境依存性である。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの包括的な指針はＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）の「生化学及び分子生物学の実験技術−核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」、第Ｉ部、第２章、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、ニューヨークに記載されている。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５０℃低い温度が選択される。通常、「ストリンジェントな条件」下では、プローブはその標的部分配列に特異的にハイブリダイズし、その他の配列にはハイブリダイズしない。
【００４６】
Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に整合するプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度及びｐＨ下の）温度である。非常にストリンジェントな条件は特定のプローブのＴｍと等しい条件が選択される。相補的な残基を約１００個より多く有する相補的核酸のサザンブロット分析又はノーザンブロット分析用のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃におけるヘパリン１ｍｇを含む５０％ホルムアミドでの終夜のハイブリダイゼーションである。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１×ＳＳＣ中６５℃で１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣバッファ中６５℃で１５分間である。ＳＳＣバッファの説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。高ストリンジェントな洗浄の前に低ストリンジェントな洗浄を実施して背景のプローブシグナルを除去することが多い。約１００よりも多いヌクレオチドの二重鎖形成のための中程度にストリンジェントな洗浄条件の例は、１×ＳＳＣ中４５℃で１５分間である。約１００よりも多いヌクレオチドの二重鎖形成のための低ストリンジェントな洗浄の例は、４×から６×ＳＳＣ中４０℃で１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０から５０ヌクレオチド）では、ストリンジェントな条件は通常、ｐＨ７．０〜８．３で約１Ｍ未満のＮａ＋イオン、通常約０．０１から１ＭのＮａ＋イオン濃度の塩濃度（又はその他の塩）を伴い、温度は通常少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を加えることによっても達成することができる。一般に、特異的ハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブで観察されるシグナル対ノイズ比に対して２倍（以上）のシグナル対ノイズ比が観察される場合には、特異的ハイブリダイゼーションが検出されたことを示している。
【００４７】
以下は、本発明の基準ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するのに使用することができるハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件の例である：プローブヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列に、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、ＩｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄するのが好ましい；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する；より好ましくは、プローブと標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。
【００４８】
さらに、２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すものは、実質的に同一の核酸でコードされたタンパク質が全体的な三次元構造を共有しているか、又は生物学的機能が等価なことである。これらの用語は以下の本明細書中、「Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド」という標題でさらに定義する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子であっても、対応するタンパク質が実質的に同一な場合には、やはり実質的に同一である。これは例えば、２つのヌクレオチド配列が、遺伝コードで認められているような保存的に置換された変異体を含む場合に起こる。
【００４９】
用語「保存的に置換された変異体」は、１個又は複数の選択した（又は全ての）コドンの３番目の位置がゆらぎ塩基（ｍｉｘｅｄ−ｂａｓｅ）及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている縮重コドン置換を有する核酸配列を指す。Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：２６０５−２６０８；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）のＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８を参照されたい。
【００５０】
用語「Ｔ２Ｒ」はまた、Ｔ２Ｒ核酸、好ましくはＴ２Ｒ７６の部分配列及び伸長配列を含む核酸を包含し、これらにはＴ２Ｒ核酸と相補的な核酸、Ｔ２Ｒ ＲＮＡ分子及びＴ２Ｒ ＲＮＡと相補的な核酸（ｃＲＮＡ）が含まれる。
【００５１】
用語「部分配列」は、より長い核酸配列の一部を含む核酸の配列を指す。代表的な部分配列は、上記の本明細書で記載したプローブ、又はプライマーである。本明細書で使用する用語「プライマー」は、選択した核酸分子の約８以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは１０〜２０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドを含む連続配列を指す。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子の重合を開始するのに十分な長さ及び適切な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。
【００５２】
用語「伸長配列」は、核酸に組み込まれるヌクレオチド（又はその他の類似分子）の付加を指す。例えば、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加することができる。さらに、ヌクレオチド配列は、他のＤＮＡ配列、例えばプロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、追加的な制限酵素部位、多数のクローニング部位及びその他のコードセグメントと結合することができる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「相補的配列」は、塩基対間で水素結合が形成されて互いに対合することができる逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を示す。本明細書で使用する用語「相補的配列」は、以下に挙げたものと同じヌクレオチド比較方法で評価することができる、或いは本明細書で記載したような比較的ストリンジェントな条件下で問題の核酸セグメントにハイブリダイズすることができると定義される、実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味する。相補的な核酸セグメントの特別な例はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５４】
本発明は、開示のＴ２Ｒ７６核酸及び組換えＴ２Ｒ７６核酸を含むキメラ遺伝子も提供する。したがって、他のＴ２Ｒ核酸と組み合せて発現されることもあるＴ２Ｒ７６核酸を含む構築体及びベクターも含む。
【００５５】
用語「遺伝子」は生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントを広く指す。遺伝子は、これらだけに限定するものではないが、コード配列、プロモーター領域、シス制御配列、調節タンパク質の特異的認識配列である発現されていないＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する発現されていないＤＮＡセグメント、所望のパラメータを有するように設計されたＤＮＡセグメント、又はこれらの組合せを含む配列を包含する。遺伝子は、生物学的試料からのクローニング、既知の又は予想される配列情報に基づく合成及び既存の配列の組換え誘導を含む種々の方法で得ることができる。
【００５６】
本明細書で使用する用語「キメラ遺伝子」は、Ｔ２Ｒ配列、例えばＴ２Ｒ ｃＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸、三次構造（例えば、ヘアピン構造）を有するＲＮＡをコードするＴ２Ｒ核酸又は二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＴ２Ｒ核酸に作動可能に結合させたプロモーター領域を指す。用語「キメラ遺伝子」はまた、異種配列に作動可能に結合したＴ２Ｒプロモーター領域も指す。本発明のキメラ遺伝子の調製は実施例２に記載する。Ｔ２ＲはＴ２Ｒ７６であることが好ましい。
【００５７】
本明細書で使用する用語「作動可能に結合した」は、ヌクレオチド配列の転写がプロモーター領域によって制御され調節されるようなプロモーター領域とヌクレオチド配列との機能的な組合せを指す。プロモーター領域をヌクレオチド配列と作動可能に結合させる技術は当技術分野で知られている。
【００５８】
用語「組換え」は、一般に本来の環境ではない環境で複製可能な単離核酸を指す。したがって、組換え核酸は宿主細胞中でその複製を可能にするベクターの核酸など、追加の核酸と共に複製できない核酸を含むことができる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、宿主細胞中でその複製が可能なヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。ベクターは、ヌクレオチド配列のベクター中での連結を可能とするヌクレオチド配列を含むことができ、そのようなヌクレオチド配列はまた、宿主細胞において複製される。代表的なベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルスベクターがある。ベクターはまた、以下の本明細書でさらに記載する通り、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え生成を仲介することができる。
【００６０】
発現構築体を含むあるタイプの構築体を記載するのに本明細書で使用する用語「構築体」は、ヌクレオチド配列が組換え技術によって発現されるようにベクターに作動可能に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含むベクターを指す。
【００６１】
用語「組換え技術によって発現された」又は「組換え技術によって生成した」は同義的に使用され、一般的に組換え核酸でコードされたポリペプチドを生成するプロセスを指す。
【００６２】
したがって、組換えＴ２Ｒ、核酸、すなわちＴ２Ｒ７６核酸は異種核酸を含むことが好ましい。用語「異種核酸」は、対象とする宿主細胞に対し外来の起源に由来する配列、又は同じ起源に由来する場合、その原形を改変した配列を指す。宿主細胞中の異種核酸は、特定の宿主細胞に内因性であるが、例えば突然変異誘発や天然のシス制御配列からの分離によって改変されている核酸を含むことができる。異種核酸はまた、天然のヌクレオチド配列の非天然に生じる多数のコピーを含むことができる。異種核酸はまた、通常はそのような核酸を見出すことができない位置で、宿主細胞の核酸に組み込まれた核酸を含むことができる。
【００６３】
本発明の核酸は、クローニング、合成、変化、突然変異誘起又はこれらの組合せをすることができる。核酸の単離に使用することができる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当技術分野で知られている。塩基対の変化、欠失又は小挿入を引き起こす部位特異的突然変異誘発も当技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）（１９８９）の「分子クローニング実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｉｌｈａｖｙら（１９８４）の「遺伝子融合での実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ＆Ｈａｍｅｓ（１９９５）の「ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）の「分子生物学の短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００６４】
ＩＩＩ．Ｂ．Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド
本発明は、新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドを提供するものであり、その代表的な実施形態は配列番号２に示される。本発明の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含むことが好ましい。また、単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを含むことが好ましい。これらのＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、１つ又は複数の他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて発現されてもよい。
【００６５】
したがって、本発明の方法で有用な新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、（ａ）配列番号２のポリペプチド、（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチドを含む。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはまた、（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、及び（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸分子と少なくとも１個の機能的に等価なコドンにおいて異なり、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つの単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子を含むことができる。
【００６６】
Ｔ２Ｒとそれと実質的に同一のタンパク質との間の類似性のレベルを記載するのに本明細書で使用する用語「実質的に同一」とは、それと少なくとも３５％同一のタンパク質を指す。例えば、Ｔ２Ｒ７６とこのＴ２Ｒ７６タンパク質と実質的に同一のタンパク質の場合、これはＴ２Ｒ７６タンパク質の完全長にわたって比較したとき、配列番号２と少なくとも約３５％同一の配列を指す。Ｔ２Ｒ７６タンパク質と実質的に同一のタンパク質は、好ましくは配列番号２と少なくとも約３５％から約４５％同一、より好ましくは配列番号２と少なくとも約４５％から約５５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約５５％から約６５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約６５％から約７５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約７５％から約８５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約８５％から約９５％同一、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも約９５％から約９９％同一である。用語「完全長」は以下の本明細書中でさらに記載する通り、機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを指す。２つのポリペプチド間の同一性の割合を判定する方法はまた、「ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較」という標題で以下の本明細書中で定義する。
【００６７】
ポリペプチドを説明するのに使用する場合、用語「実質的に同一」は保存３次元構造を共有する２つ以上のポリペプチドを包含することもできる。計算手法を使用して構造表現を比較することができ、重要な活性部位やリガンド結合部位の周囲の類似性を同定するように構造モデルを生成し、容易に調整することができる。Ｓａｑｉら（１９９９）のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：５２１−５２２；Ｂａｒｔｏｎ（１９９８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４：１１３９−１１４６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（２０００）のＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１７００−１７０６；及びＨｕａｎｇら（２０００）のＰａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：２３０−２４１を参照されたい。
【００６８】
実質的に同一のタンパク質はまた、配列番号２のアミノ酸と機能的等価物であるアミノ酸を含むタンパク質を含む。アミノ酸の場合の用語「機能的等価物」は当技術分野で知られており、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性に基づいている。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（２０００）のＡｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ ５４：７３−９７を参照されたい。考慮される関連要因としては、側鎖の疎水性、親水性、電荷及びサイズがある。例えば、アルギニン、リジン及びヒスチジンはすべて正に荷電した残基であり、アラニン、グリシン及びセリンはすべて同様のサイズを有し、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはすべて大体同様の形態を有する。以下の本明細書中でさらに記載するこの分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは本明細書において生物学的な機能的等価物と定義する。
【００６９】
生物学的、機能的に等価なアミノ酸を置換するためには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考えることができる。各アミノ酸に、それらの疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てた。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）及びアルギニン（４．５）である。
【００７０】
タンパク質に相互作用による生物機能を与えるときに、アミノ酸の疎水性親水性指標が重要なことは当技術分野で広く理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２）。あるアミノ酸は同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸と置換しても、依然として同様の生物活性を保有できることは知られている。疎水性親水性指標に基づく変更では、疎水性親水性指標が当初アミノ酸の値の±２以内のアミノ酸を置換することが好ましく、当初アミノ酸の値の±１以内のものが特に好ましく、当初アミノ酸の値の±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００７１】
親水性に基づいて効果的に類似のアミノ酸を置換できることも、当技術分野で理解されている。米国特許第４５５４１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性に左右されるタンパク質の最も大きな局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、例えばタンパク質の生物学的性質に相関することを記載している。アミノ酸は同様の親水性値を有する別のものと置換しても、依然として生物学的に等価なタンパク質を得られることは理解されている。
【００７２】
米国特許第４５５４１０１号で詳述されている通り、アミノ酸残基に以下の親水性値を割り当てた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００７３】
同様の親水性値に基づく変更では、親水性値が当初のアミノ酸の値の±２以内のアミノ酸で置換することが好ましく、当初のアミノ酸の値の±１以内で置換することが特に好ましく、当初のアミノ酸の値の±０．５以内で置換することがさらに特に好ましい。
【００７４】
用語「実質的に同一」はまた、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的な機能的等価物であるポリペプチドを包含する。用語「機能的」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの活性、例えば細胞内シグナリング経路を活性化すること（例えば、ガストデューシンとのカップリング）及び味覚を仲介することを含む。このような活性化は、ｉｎ ｖｉｖｏで同起源のＴ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのものと実質的に同じ大きさ及び動態を示すことが好ましい。Ｔ２Ｒ７６活性を評価する代表的な方法は以下の本明細書中で記載する。
【００７５】
本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの機能的断片を提供する。このような機能的部分は、天然のＴ２Ｒ７６遺伝子産物のアミノ酸配列のすべて又は実質的にすべてを含んでいる必要はない。
【００７６】
本発明はまた、天然のＴ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドよりも長い配列である機能性ポリペプチド配列を含む。例えば、１つ又は複数のアミノ酸をＴ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加することができる。このような追加のアミノ酸は、これだけに限定するものではないが、精製用途を含む種々の用途で使用することができる。伸長タンパク質を調製する方法は当技術分野で知られている。
【００７７】
ＩＩ．Ｃ．ヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較
２つ以上のヌクレオチド又はポリペプチド配列の場合の用語「同一」又は「同一性の割合」は、本明細書で開示した配列比較アルゴリズムの１つを使用して、又は目視検査で測定して、一致が最大となるように比較し整列したときに、同じ、又は特定の割合の同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【００７８】
ヌクレオチド又はポリペプチド配列に関する用語「実質的に同一」は、特定の配列が、天然配列の配列とは１つ又は複数の欠失、置換又は付加で変更されており、その正味の効果としてＴ２Ｒ核酸又はポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６核酸又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的機能が保持されていることを意味する。
【００７９】
２つ以上の配列の比較では、通常、１つの配列は基準配列の役割を果たし、それに対して１つ又は複数の試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータプログラムに入れ、必要ならば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを選択する。次いで、配列比較アルゴリズムは、選択したプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する指定した試験配列の配列同一性の割合を計算する。
【００８０】
比較のための配列の最適な整列は、例えばＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）のＡｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３−４５３の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）のＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法、これらのアルゴリズムの計算機化実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査によって実施することができる。一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）の「分子生物学の短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００８１】
配列同一性の割合及び配列類似性を判定する好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）のＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公式に入手することができる。このアルゴリズムでは、データベース配列の同じ長さのワードと整列したときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、ある正の値の閾値スコアＴを満たす試験配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、まず高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するシード（ｓｅｅｄ）として働く。次いで、累積整列スコアが増大可能な限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対の一致残基の報奨スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基の罰スコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの延長は、累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少し、累積スコアが１つ又は複数の負のスコアの残存整列の累積によりゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に到達したときに停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは整列の感度及び速度を判定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列について）初期値として、ワード長Ｗ＝１１、期待値Ｅ＝１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは初期値として、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１１９９２）のＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい。
【００８２】
配列の同一性の割合を計算する他に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の類似性の統計的分析もする。例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）のＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの基準は最小の確率合計（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の一致が偶然発生する確率を示す。例えば、試験核酸配列と基準核酸配列との比較における最小の確率合計が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合、試験核酸配列は基準配列と類似していると考えられる。
【００８３】
ＩＩＩ Ｔ２Ｒ７６核酸の検出方法
本発明の別の態様では、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸分子を検出する方法を提供する。このような方法はＴ２Ｒ７６遺伝子の変異体又は変化した遺伝子発現を検出するのに使用することができる。例えば、Ｔ２Ｒ７６配列又は発現の変化の検出は、味覚についてのＴ２Ｒ７６に関する差異を診断するために使用することができる。この方法に使用する核酸は配列番号１の配列を含んでいることが好ましい。
【００８４】
本発明の方法で検出された配列は、特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用される任意の方法を使用する当技術分野でよく知られた任意の手段によって検出し、サブクローニングし、配列決定し、さらに評価することができる。したがって、本発明の核酸を使用して、開示の配列を含む遺伝子及びゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。あるいは、本発明の核酸を使用して関連配列からなる遺伝子及びゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。本明細書で開示した核酸配列を使用するこのような方法は当業者に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）の「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。代表的な方法は、実施例１〜４にも開示している。
【００８５】
本発明の一の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６核酸分子のレベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して測定する。Ｃｈｉａｎｇ（１９９８）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８０６：２０９−２１８及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、本発明の核酸分子に基づく遺伝子アッセイを使用して、例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒら、１９８３）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９０）、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａら、１９８９）、ＳＳＣＰ／ヘテロ二本鎖分析、酵素ミスマッチ開裂、増幅したエキソンの直接配列分析（Ｋｅｓｔｉｌａら、１９９８；Ｙｕａｎら、１９９９）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇら、１９９１）及び特定の突然変異を含む増幅したゲノムＤＮＡの制限分析により遺伝子変異体をスクリーニングすることができる。単一のヌクレオチド多型の大規模な特性決定には自動化された方法を適用することもできる（Ｗａｎｇら、１９９８；Ｂｒｏｏｋｅｓ、１９９９）。好ましい検出方法は非電気泳動法であり、例えばＴＡＱＭＡＮ ＴＭ対立遺伝子識別アッセイ、ＰＣＲ−ＯＬＡ、分子標識、パドロックプローブ及びウェル蛍光を含む。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８：７６９−７７６及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００８７】
ＩＶ．Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系
本発明は、さらに、本発明の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドの発現系を提供する。このＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、ヒト又は非ヒトの１つ又は複数の他のＴ２Ｒと共に発現してもよい。このような系はその後の精製及び／又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドの特性決定において使用することができる。例えば、精製したＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、以下の本明細書中でさらに記載するＴ２Ｒ７６抗体を産生するための免疫原として使用することができる。
【００８８】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータの同定に使用することもできる。あるいは、開示のＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、他の試験ポリペプチドの活性化をアッセイするときに対照ポリペプチドとして使用することができる。このような試験ポリペプチドは、味覚に関連した他のＴ２Ｒ、例えばＡｄｌｅｒら（２０００）のＣｅｌｌ １００：６９３−７０２及びＭａｔｓｕｎａｍｉら（２０００）のＮａｔｕｒｅ ６０１−６０３で開示されたポリペプチドの任意の１つを含むことができる。
【００８９】
用語「発現系」は、異種核酸と異種核酸でコードされたポリペプチドとを含む宿主細胞を指す。例えば、異種発現系は、組換えＴ２Ｒ７６核酸を含む構築体でトランスフェクトした宿主細胞、Ｔ２Ｒ７６ ｃＲＮＡでトランスフェクトした宿主細胞、又は異種核酸を宿主細胞ゲノムに導入することによって生成した細胞系を含むことができる。既述の通り、これらの発現系は他のＴ２Ｒ核酸を含んでもよい。
【００９０】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現系は、（ａ）組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド、及び（ｂ）組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む宿主細胞を含むことができる。例えば、Ｔ２Ｒ７６ ｃＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、次いで宿主細胞に導入することにより、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現させることができる。この系は、ｈＴ２Ｒ７６及び別のＴ２Ｒポリペプチドを含むヘテロメリックＴ２Ｒ受容体を生成するために、１つ又は複数の追加のＴ２Ｒポリペプチドをさらに含むことができる。
【００９１】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系はまた、（ａ）ベクターと、異種プロモーターに作動可能に結合したＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸分子とを含む構築体、並びに（ｂ）（ａ）の構築体を含む宿主細胞を含むことができ、これにより宿主細胞はＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する。この系は、１つ又は複数の追加のＴ２Ｒポリペプチドをコードする構築体をさらに含むことができる。さらに、単一の構築体は、それ自体でＴ２Ｒ７６ポリペプチドと、１つ又は複数の追加のＴ２Ｒポリペプチドとをコードすることができる。
【００９２】
単離ポリペプチド及び組換え技術によって生成されたポリペプチドを精製し、当業者に知られている種々の標準的な技術を使用して特性決定することができる。例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ＆Ｌｕｂｋｅ（１９６５）の「ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ＆Ｅｂｅｒｌｅ（１９９３）の「ペプチド、１９９２：第２２回欧州ペプチドシンポジウムの議事録（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９９２：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）」、１９９２年９月１３〜１９日、Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ、スイス国、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）の「ペプチド合成の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２改定版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ／ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）の「分子生物学の短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ）」、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００９３】
組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、機能的味覚受容体を含むことが好ましく、苦味受容体を含むことがより好ましい。したがって、組換え技術によって発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、苦味化合物に応答して活性化を示すものが好ましい。また、組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、天然のＴ２Ｒ７６ポリペプチドと同様の活性化応答を示すことが好ましい。Ｔ２Ｒ７６の機能を決定する代表的な方法は以下の本明細書中で記載する。
【００９４】
ＩＶ．Ａ．発現構築体
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する構築体は、ベクターとＴ２Ｒ７６ヌクレオチド配列とを含み、このＴ２Ｒ７６ヌクレオチド配列はプロモーター配列と作動可能に結合している。組換えＴ２Ｒ７６発現のための構築体はまた、転写終止シグナル及びヌクレオチド配列を適切に翻訳するのに必要な配列を含むこともできる。翻訳及び終止シグナル配列の付加を含む発現構築体の調製は当業者に知られている。
【００９５】
Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え体の生成は、構成性プロモーター又は誘導プロモーターを使用して実施することができる。本発明に従って使用することができる代表的なプロモーターとしては、サルウイルス４０初期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復プロモーター、アクチンプロモーター、熱ショックプロモーター及びメタロチエンタンパク質（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）がある。
【００９６】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現するのに使用することができる適切なベクターとしては、これらだけに限定するものではないが、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスなどのウイルス、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）、プラスミド及びコスミドＤＮＡベクター、トランスポゾン仲介形質転換ベクター及びこれらの誘導体がある。
【００９７】
構築体は、使用するベクターと適合するトランスフェクション法を使用して宿主細胞に導入する。標準的なトランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム仲介トランスフェクション、トランスポゾン仲介形質転換、レトロウイルスを使用する注入、粒子仲介遺伝子転移、超速度遺伝子転移及びこれらの組合せがある。
【００９８】
ＩＶ．Ｂ．宿主細胞
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」は、異種核酸分子を導入することができる細胞を指す。これらだけに限定するものではないが、哺乳動物細胞などの真核宿主（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞）、両性動物細胞（例えば、アフリカツメガエル卵母細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、並びに大腸菌及び枯草菌などの原核宿主を含む任意の適切な宿主細胞を使用することができる。好ましい宿主細胞はＴ２Ｒ７６ポリペプチドを実質的に欠いている。
【００９９】
組換え配列の発現を改変するか、所望の特定の方法で遺伝子産物を改変しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。例えば、種々の宿主細胞が、翻訳並びに翻訳後プロセシング及び改変（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）のための特性及び特定の機序を有する。発現した外来タンパク質の所望の改変及びプロセシングを確実に行うために、適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。例えば、細菌系の発現を使用して非グリコシル化コアタンパク質産物を生成することができ、酵母での発現はグリコシル化産物を生成する。
【０１００】
本発明はさらに、安定な細胞系でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現を包含する。異種構築体の宿主細胞への形質転換の後に行われる安定な細胞系を生成する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｊｏｙｎｅｒ（１９９３）の「遺伝子ターネティング：実践的アプローチ（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｎｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。従って、形質転換細胞、組織又は非ヒト生物は、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、トランスジェニック後代又はその繁殖形態を包含すると理解される。
【０１０１】
本発明は、本明細書で開示の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞の凍結保存体をさらに包含する。したがって、一時的にトランスフェクトした細胞およびＴ２Ｒ７６を発現する安定な細胞系の細胞を後で使用するために、凍結し、保存することができる。凍結細胞は離れた場所で使用するために容易に運搬することができる。
【０１０２】
凍結保存培地は一般に、ベース培地、凍結保存剤及びタンパク質源からなる。凍結保存剤及びタンパク質は、凍結解凍プロセスのストレスから細胞を保護する。血清含有培地としては、通常の凍結保存培地は、１０％グリセロールを含む完全培地、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む完全培地、又は１０％グリセロール若しくは１０％ＤＭＳＯを含む５０％新鮮培地を含む５．０％細胞調整培地（ｃｅｌｌ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）として調製する。血清を含まない培地では、通常の凍結保存配合物は、７．５％ＤＭＳＯを含む５０％血清フリー新鮮培地を含む５０％血清フリー細胞調整培地、又は７．５％ＤＭＳＯ及び１０％細胞培養グレードＤＭＳＯを含む血清フリー新鮮培地を含む。１ｍあたり約１０６から約１０７個の細胞を含む細胞懸濁液を凍結保存培地と混合することが好ましい。
【０１０３】
凍結保存に適切なバイアル又はその他の容器、例えばＮＵＮＣ＠ ＣＲＹＯＴＵＢＥＳＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）中で、細胞を凍結保存培地と合わせる。細胞は多ウェルプレート、例えば高スループットアッセイ用に設計した９６ウェルプレートのウェルに等分量ずつ入れ、プレートに入れたまま凍結することもできる。
【０１０４】
細胞は、１分あたり約−１℃の速度で室温から保存温度まで冷却するのが好ましい。冷却速度は、例えば細胞を含むバイアルを、約１リットルの容量を持ち、完全におおわれた満水状態の保存容器に入れ、そのような容器（ｃｕｂｅ）を−７０℃の機械的フリーザーに入れることによって調節することができる。あるいは、細胞冷却の速度は、凍結させる細胞培養物の総体積の１５倍を超える体積の脂肪族アルコールなどの液体冷媒にバイアルを沈め、約−７０℃未満の温度の通常のフリーザーに、沈めた培養物バイアルを入れることにより、１分あたり約−１℃に制御することができる。細胞を凍結させるための市販の装置も入手可能である。例えば、Ｐｌａｎｅｒ Ｍｉｎｉ−Ｆｒｅｅｚｅｒ Ｒ２０２／２０ＯＲ（英国のＰｌａｎｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）及びＢＦ−５ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｒｅｅｚｅｒ（米国コネチカット州ＤａｎｂｕｒｙのＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。凍結細胞は、好ましくは約−７０℃以下から約−８０℃、より好ましくは約−１３０℃以下で保存する。
【０１０５】
最良の細胞生存を得るためには、細胞はできるだけ速やかに解凍しなければならない。凍結細胞を含むバイアル又はその他の保存容器を貯蔵室から取り出したら、３７℃の水浴に直接入れ、完全に解凍するまで穏やかに振盪しなければならない。凍結保存剤に対して細胞が特に感受性の場合は、さらに増殖の前に細胞を遠心分離し、凍結保存剤を除去する。
【０１０６】
凍結細胞の調製及び取扱いのさらなる方法は、特にＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）の「動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及び米国特許第６１７６０８９号；同第６１４０１２３号；同第５６２９１４５号；及び第４４５５８４２号に見出すことができる。
【０１０７】
Ｖ．トランスジェニック動物
本発明はまた、Ｔ２Ｒ７６遺伝子発現の妨害剤及び任意に別のＴ２Ｒ妨害剤を含むトランスジェニック動物を提供する。変化した遺伝子発現は、Ｔ２Ｒ７６遺伝子の変化したレベル又は突然変異体の発現を含むことができる。本発明は、トランスジェニック動物を作製する構築体を調製するのに使用することができるＴ２Ｒ７６をコードする核酸を提供する。Ｔ２Ｒ７６遺伝子座を標的とする構築体の調製に有用なゲノム位置測定データも提供する。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、トランスジェニック動物はマウスＴ２Ｒ７６遺伝子座を標的改変したマウスを含むことができ、全ての体細胞のＴ２Ｒ７６遺伝子を完全に又は部分的に機能的に不活性化したマウス株をさらに含むことができる。
【０１０９】
他の実施形態において、本発明によるトランスジェニック動物は、アンチセンス又はリボザイムＴ２Ｒ７６構築体を使用して作製し、これを普遍的な又は組織特異的なプロモーターで作動させて、体細胞のＴ２Ｒ７６遺伝子発現レベルを減少させ、それにより「ノックダウン」表現型を実現する。本発明は、Ｔ２Ｒ７６が条件付き又は誘導性に不活性化されたネズミ株の生成も提供する。このようなネズミ株は追加の合成若しくは天然の突然変異、例えば任意の他のＴ２Ｒ遺伝子の突然変異も含むことができる。
【０１１０】
本発明はまた、例えば過剰発現又は優性の負の表現型を作製するために、Ｔ２Ｒ７６遺伝子を特異的に「ノックイン」改変したマウス株も提供する。したがって、「ノックイン」改変は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸の野生型及び突然変異型の両方を発現することを含む。
【０１１１】
トランスジェニック動物を作製する技術は当技術分野で知られている。代表的な技術は、米国特許第５４８９７４２号（トランスジェニックラット）；米国特許第４７３６８６６号、同第５５５０３１６号、同第５６１４３９６号、同第５６２５１２５号及び同第５６４８０６１号（トランスジェニックマウス）；米国特許第５５７３９３３号（トランスジェニックブタ）；同第５１６２２１５号（トリのトランスジェニック種）及び米国特許第５，７４１，９５７（ウシのトランスジェニック種）に記載されており、これらのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０１１２】
例えば、本発明のトランスジェニック動物は、マウスＴ２Ｒ７６を標的改変したマウスを含むことができる。全ての体細胞のＴ２Ｒ７６遺伝子を完全又は部分的に機能的に不活性化したマウス株は、ネズミ胚性幹細胞での部位特異的組換えの標準的な技術を使用して作製することができる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）のＳｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｔｈｏｍａｓ＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９９０）のＮａｔｕｒｅ ３４６：８４７−８５０；及びＤｅｌｐｉｒｅら（１９９９）のＮａｔ Ｇｅｎｅｔ ２２：１９２１９５を参照されたい。
【０１１３】
ＶＩ．Ｔ２Ｒ７６抗体
本発明の別の態様では、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成する方法を提供する。この方法では、完全長の組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドが、有効な免疫原として使用され、動物を免疫してその動物で免疫応答が発生できるように調製される。免疫応答は、動物の血清から収集することができる抗体の産生を特徴とする。本発明はまた、配列番号２を含む、本明細書で開示の新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用する方法で生成した抗体を提供する。
【０１１４】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、一本鎖抗体、突然変異させた抗体、ヒト化抗体及び抗原結合部位を含む抗体断片（例えば、Ｆａｂ抗体断片及びＦｖ抗体断片）を含む、免疫グロブリンタンパク質又はその機能的部分を指す。本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６抗体はモノクローナル抗体を含む。したがって、本発明は、抗体及び本明細書で記載したモノクローナル抗体を産生する細胞系も包含する。
【０１１５】
抗体のＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合を記載するのに使用する用語「特異的に結合する」は、他のポリペプチドの異種混合物中でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合を指す。
【０１１６】
抗体と対照ポリペプチド又は試料との結合を記載するのに本明細書で使用する語句「結合を実質的に欠く」又は「結合が実質的にない」は、非特異的又はバックグラウンド結合を包含するが、特異結合を含まない結合のレベルを指す。
【０１１７】
抗体を調製及び特性決定する技術は当技術分野で知られている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）の「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及び米国特許第４１９６２６５号、同第４９４６７７８号、同第５０９１５１３号、同第５１３２４０５号、同第５２６０２０３号、同第５６７７４２７号、同第５８９２０１９号、同第５９８５２７９号及び同第６０５４５６１号を参照されたい。
【０１１８】
本明細書の開示の通りに調製したＴ２Ｒ７６抗体は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの局在性及び活性に関連する技術分野で知られる、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする核酸のクローニング、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの免疫精製、生物学的試料中でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドのイメージング、及び適切な生物学的試料中でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドのレベル測定のための方法で使用することができる。このような方法を実施するために、本発明の抗体は、これらだけに限定するものではないが、放射性標識、蛍光標識、エピトープ標識及びｉｎ ｖｉｖｏで検出可能な標識を含む検出可能な標識をさらに含むことができる。特定の検出技術に適切な標識を選択する方法、検出可能な標識を抗体と複合又は結合させる方法は当業者に知られている。
【０１１９】
ＶＩＩＩ．Ｔ２Ｒ７６モジュレータ
本発明は、Ｔ２Ｒ７６活性のモジュレータを同定するアッセイをさらに開示する。アッセイは、上記の本明細書中で開示したような、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する系、又はそのような系で産生された単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを使用することができ、そのようなＴ２Ｒポリペプチドは、他のＴ２Ｒポリペプチドと共に発現されるものでもよい。本発明は、開示の方法を使用して同定したＴ２Ｒ７６活性のモジュレータも提供する。
【０１２０】
用語「調節する」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの任意又は全ての化学的及び生物学的活性又は特性の増加、減少又はその他の変化を意味する。したがって、モジュレータを同定する方法は、Ｔ２Ｒ７６の機能のレベル又は質をアッセイすることも含む。
【０１２１】
Ｔ２Ｒ７６機能のモジュレータを同定する方法は、（ａ）組換え発現系を用意して、それによりＴ２Ｒ７６ポリペプチドを宿主細胞中で発現させること（Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドはＴ２Ｒ７６ポリペプチドを含む）、（ｂ）試験物質を（ａ）の系に与えること、（ｃ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をアッセイすること、（ｄ）試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をＴ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較すること、及び（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較して有意に変化した試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質を測定することによって試験物質をＴ２Ｒ７６モジュレータとして同定することを含むことができる。いくつかの実施形態では、発現系は、少なくとも１つの他のＴ２Ｒと共発現するＴ２Ｒ７６も提供する。
【０１２２】
Ｔ２Ｒ７６活性の制御レベル又は質は、野生型Ｔ２Ｒ７６活性のレベル又は質を指す。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現のための系は配列番号２を含むことが好ましい。試験物質の調節能力を評価する場合、Ｔ２Ｒ７６活性の制御レベル又は質は試験物質の不存在下での活性のレベル又は質を含む。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「有意に変化した」は、Ｔ２Ｒポリペプチド、例えばＴ２Ｒ７６ポリペプチドの変化したレベル又は活性を指し、測定技術に固有の誤差の範囲よりも大きい測定可能な質の定量化した変化、好ましくは対照測定値に対して約２倍以上の増加又は減少、より好ましくは約５倍以上の増加又は減少、最も好ましくは約１０倍以上の増加又は減少を指す。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイは、Ｔ２Ｒ７６遺伝子発現のレベルを判定することを含む。
【０１２５】
本発明の別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイは、組換え発現Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの結合活性のアッセイを含む。例えば、Ｔ２Ｒ７６活性は、モジュレータのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合の量又は強さを含むことができる。
【０１２６】
本発明のさらに別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６機能のアッセイは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの活性立体構造のアッセイを含むことができる。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６の機能のアッセイは、リガンド又はモジュレータのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合に応答した細胞内シグナリング事象の活性化のアッセイを含む。例えば、Ｇタンパク質交換活性のリガンド仲介刺激は、以下の本明細書及び実施例３でさらに記載する通り、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合量を測定することによってアッセイすることができる。
【０１２８】
開示の方法で同定したモジュレータは、アゴニスト及びアンタゴニストを含むことができる。本明細書で使用する用語「アゴニスト」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的活性を活性化し、生物学的活性を助け、又は生物学的活性を増強する物質を意味する。本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの生物学的活性を妨げ、又は緩和する物質を指す。モジュレータは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに特異的に結合するリガンド又は物質も含むことができる。Ｔ２Ｒ７６モジュレータの判定のための活性アッセイ及び結合アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。
【０１２９】
本発明の一実施形態では、このようなアッセイは、これらだけに限定するものではないが、「用途」という標題で以下の明細書でさらに記載する食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤を含む経口使用する組成物の味覚を変化させるための添加剤として開発できるＴ２Ｒ７６モジュレータの同定に有用である。例えば、Ｔ２Ｒ７６の阻害剤は苦味を減少させるのに使用することができる。
【０１３０】
本発明の別の実施形態では、このようなアッセイは、経口使用が可能だが望ましくない化合物、例えば家庭用洗剤、毒などの味覚を変化させる添加剤として開発することができるＴ２Ｒ７６モジュレータの同定に有用である。したがって、Ｔ２Ｒ７６のアゴニストを使用して、組成物に苦味を導入し又は組成物の苦味を増大させることによってその経口使用を阻止することができる。
【０１３１】
本発明のさらに別の実施形態において、組換えＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用するアッセイは、Ｔ２Ｒ７６との相互作用が望ましくない生物活性剤を事前にスクリーニングする目的で実施することができる。例えば、対象に投与することを意図した薬物は、望ましくない苦味となり得るＴ２Ｒ７６調節活性について試験することができる。
【０１３２】
本発明のさらに別の実施形態では、本明細書で開示のアッセイを使用して、突然変異Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド、例えば苦味覚の差異と結び付いている突然変異ポリペプチドの特性決定をすることができる。突然変異Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの組換え発現は、障害関連（ｄｉｓｏｒｄｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ）のＴ２Ｒ７６ポリペプチドのさらなる分析を可能にする。
【０１３３】
本発明は、本明細書で記載した方法を利用する迅速な高スループットスクリーニング法も提供する。このスクリーニング法は、個々にＴ２Ｒ７６ポリペプチドを多数の試験物質と接触させることを含む。このようなスクリーニング法において、多数の標的物質は、好ましくは約１０４種を超える試料、より好ましくは約１０５種を超える試料、さらに好ましくは約１０６種を超える試料を含む。
【０１３４】
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞アッセイは、溶液アッセイを含むことができ、又はアッセイの１種若しくは複数の成分を固定する固相基質をさらに含むことができる。例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞、及び任意により別のＴ２Ｒポリペプチドを、共有結合又は非共有結合により固体状態の成分に直接結合することができる。さらに場合により、この結合は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの基質への間接結合を仲介するリンカー分子又はタグを含むことができる。
【０１３５】
代表的なリンカーとしては、既知の結合対（例えば、ビオチンとアビジン）、既知の抗原を認識する抗体、合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド及びポリアセテート）、ペプチド、エーテルがある。リンカーは、フレキシブルなリンカー、例えばポリ（エチレングリコール）リンカー（米国アラバマ州ＨｕｎｔｓｖｉｌｌｅのＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．から入手可能）を任意に含むことができる。リンカーは、さらにアミド、スルフヒドリル又はヘテロ官能性結合部位を任意に含むことができる。
【０１３６】
リンカーは、任意の種々の最新の方法を使用して固体基質に付加させることができる。この最新の方法には、基質の誘導体化（これにより基質はリンカーと反応する）又は熱若しくは紫外線架橋を使用する非化学的手法が含まれる。代表的なプロトコルは、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）のＪ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（例えばペプチドの固相合成を記載している）；Ｇｅｙｓｅｎら（１１９８７）のＪ Ｉｍｍｕｎ Ｍｅｔｈ １０２：２５９−２７４（ピン上での固相成分の合成を記載している）；Ｆｒａｎｋ＆ｂｏｒｉｎｇ（１９８８）のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）のＳｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７；及びＫｏｚａｌら（１９９６）のＮａｔ Ｍｅｄ ２（７）：７５３７５９（固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）のＪ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（例えばペプチドの固相合成を記載している）；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７）のＪ Ｉｍｍｕｎ Ｍｅｔｈ １０２：２５９−２７４（ピン上での固相成分の合成を記載している）；Ｆｒａｎｋ＆Ｄｏｒｉｎｇ（１９８８）のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）のＳｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７；及びＫｏｚａｌら（１９９６）のＮａｔ Ｍｅｄ ２（７）：７５３７５９（固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）に特に見い出すことができる。
【０１３７】
ＶＩＩ．Ａ．試験物質
本発明の方法を使用してアッセイした潜在的モジュレータは候補物質を含む。本明細書で使用する用語「候補物質」及び「試験物質」は同義的に使用され、いずれも任意の合成、組換え若しくは天然の生成物又は組成物を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドと相互作用すると思われる物質を指す。ポリペプチドと相互作用すると思われる試験物質は、本明細書で開示の方法を使用してそのような相互作用について評価することができる。
【０１３８】
代表的な試験物質としては、これらだけに限定するものではないが、ペプチド、オリゴマー、核酸（例えば、アプタマー）、小分子（例えば、化合物）、抗体又はその断片、核酸−タンパク質融合物、任意の他の親和剤、それらの組合せがある。試験物質はさらに、炭水化物、ビタミン又はその誘導体、ホルモン、神経伝達物質、ウイルス又はその受容体結合ドメイン、オプス又はロドプシン、着臭剤、フェロモン、毒素、成長因子、血小板活性化因子、神経刺激性ペプチド又は神経ホルモンを含むことができる。候補物質は苦味覚を引き出すことが好ましい。試験される候補物質は精製された分子、均質な試料、又は分子若しくは化合物の混合物であることができる。
【０１３９】
本明細書で使用する用語「小分子」は、約１０００ダルトン未満、より好ましくは約７５０ダルトン未満、さらに好ましくは約６００ダルトン未満、さらに好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を有する化合物、例えば有機化合物を指す。小分子はまた、約−４から約＋１４の範囲、より好ましくは約−２から約＋７．５の範囲の計算されたｌｏｇオクタノール／水分配係数を有することが好ましい。
【０１４０】
試験物質はライブラリーとして得る又は調製することができる。本明細書で使用する用語「ライブラリー」は分子の集団を意味する。ライブラリーは、約１０個の分子から数１０億個以上の分子まで変化する少数又は多数の異なる分子を含むことができる。分子は天然分子、組換え分子又は合成分子を含むことができる。ライブラリーの複数の試験物質は同時にアッセイすることができる。異なるライブラリー由来の試験物質は同時に評価するために、場合によってプールすることができる。
【０１４１】
代表的なライブラリーとしては、これらだけに限定するものではないが、ペプチドライブラリー（米国特許第６１５６５１１号、同第６１０７０５９号、同第５９２２５４５号及び同第５２２３４０９号）、オリゴマーライブラリー（米国特許第５６５０４８９号及び同第５８５８６７０号）、アプタマーライブラリー（米国特許第６１８０３４８号及び同第５７５６２９１号）、小分子ライブラリー（米国特許第６１６８９１２号及び同第５７３８９９６号）、抗体又は抗体断片のライブラリー（米国特許第６１７４７０８号、同第６０５７０９８号、同第５９２２２５４号、同第５８４０４７９号、同第５７８０２２５号、同第５７０２８９２号及び同第５６６７９８８号）、核酸−タンパク質融合物のライブラリー（米国特許第６２１４５５３号）及びＴ２Ｒ７６ポリペプチドに潜在的に結合することができる任意の他の親和剤のライブラリー（例えば、米国特許第５９４８６３５号、同第５７４７３３４号及び同第５４９８５３８号）がある。
【０１４２】
ライブラリーは分子の無作為集団を含むことができる。あるいはライブラリーは、特定の配列、構造又は立体構造について偏りを有する分子の集団を含むことができる。例えば、米国特許第５２６４５６３号及び同第５８２４４８３号を参照されたい。種々のタイプの分子の多様な集団を含むライブラリーを調製する方法は、例えば上記の本明細書で挙げた米国特許に記載されている通り、当技術分野で知られている。多くのライブラリーは市販もされている。
【０１４３】
ＶＩＩ．Ｂ．結合アッセイ
本発明の別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６モジュレータを同定する方法は、試験物質のＴ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドと１つ若しくは複数の他のＴ２Ｒポリペプチドとを含むヘテロメリック受容体への特異結合を判定することを含む。用語「結合」は２つの分子間の親和性を指す。特異結合はまた、一つのタンパク質又は化合物の別のタンパク質への活性が阻害的（阻害剤又はアンタゴニストの場合）又は増強的（活性剤又はアゴニストの場合）な相互作用の質又は状態を包含することが好ましい。
【０１４４】
候補モジュレータの結合能力に言及する場合、語句「特異的に（又は選択的に）結合する」は、タンパク質及び他の生物学的材料の異種集団中にタンパク質が存在することを決定する結合反応を指す。モジュレータのＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの結合は、その結合親和性が約１×１０４Ｍ−１から約１×１０６Ｍ−１以上である場合、特異的であると考えることができる。語句「特異的に結合する」は、飽和可能結合も指す。試験物質のＴ２Ｒ７６ポリペプチドへの飽和可能結合を証明するために、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析は、例えばＭａｋら（１９８９）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：２１６１３−２１６１８によって記載されている通りに実施することができる。
【０１４５】
モジュレータの対照ポリペプチド又は試料への結合を説明するために本明細書で使用する語句「結合を実質的に欠く」又は「結合が実質的にない」は、非特異的又はバックグラウンド結合を包含するが、特異結合を含まない結合のレベルを指す。
【０１４６】
いくつかの技術を使用して、既知の競合モジュレータを用いることなくＴ２Ｒ７６ポリペプチドと試験物質との間の相互作用を検出することができる。代表的な方法としては、これらだけに限定するものではないが、蛍光相関分光法、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間分光法及びＢｉａｃｏｒｅ技術があるが、各技術は以下の本明細書で記載する。これらの方法により自動化高スループットスクリーニングを容易にできる。
【０１４７】
蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）は、小体積の試料中の蛍光分子の蛍光の散乱の平均速度を測定する（Ｔａｌｌｇｒｅｎ、１９８０）。試料のサイズはわずか１０３個の蛍光分子、試料の体積はわずか細菌１つの細胞質であることができる。散乱速度は分子の質量の関数であり、質量が増大すると減少する。したがってＦＣＳは、質量、つまり結合時の分子の散乱速度の変化を測定することによってポリペプチド−リガンド相互作用分析に適用することができる。通常の実験では、分析する標的（例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド）は、Ｎ末端又はＣ末端に挿入されたポリヒスチジン配列などの配列タグを有する組換えポリペプチドとして発現される。この発現は、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル卵母細胞又は哺乳動物細胞などの宿主細胞中で仲介される。ポリペプチドはクロマトグラフィー法を使用して精製する。例えば、ポリヒスチジンタグを使用して発現されたポリペプチドをイミノ二酢酸アガロースにキレートしたＮｉ２＋などの金属キレートカラムに結合させることができる。次いでポリペプチドをカルボキシテトラメチルローダミン又はＢＯＤＩＰＹＴｍ試薬（オレゴン州ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）などの蛍光タグで標識する。次いでポリペプチドを溶液中で潜在的リガンドに曝露し、その散乱速度をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ニューヨーク）から入手可能な器具を使用してＦＣＳにより測定する。リガンド結合はポリペプチドの散乱速度の変化によって判定する。
【０１４８】
表面増強レーザ脱離／イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＳＥＬＤＩ）はＨｕｔｃｈｅｎｓ＆Ｙｉｐ（１９９３）のＲａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ７：５７６−５８０によって開発された。飛行時間質量分光計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＴＯＦ）と合わせると、ＳＥＬＤＩはチップ上に保持された分子を迅速に分析する技術を提供する。これは標的タンパク質又はその部分をチップに共有結合させ、このタンパク質に結合する小分子を質量分析で分析することによってリガンド−タンパク質相互作用分析に適用することができる（Ｗｏｒｒａｌｌら、１９９８）。通常の実験では、標的ポリペプチド（例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド）は組換え発現させ、精製する。標的ポリペプチドは、ポリヒスチジンタグを利用するか、イオン交換又は疎水性相互作用などのその他の相互作用によりＳＥＬＤＩチップに結合させる。例えばリガンドを連続的にピペットで量り入れることができる供給システム（オートサンプラー）を介して、このように調製したチップを潜在的リガンドに曝露する。次いで、例えばイオン強度が増大するバッファ溶液での一連の洗浄などの増大するストリンジェンシーの溶液中で洗浄する。各洗浄後、チップをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにかけることにより結合した材料を分析する。標的ポリペプチドを特異的に結合するリガンドは、それを溶離するのに必要な洗浄のストリンジェンシーで同定する。
【０１４９】
Ｂｉａｃｏｒｅは、層に固定した標的ポリペプチド（例えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド）にリガンドが結合した際の表面層での屈折率の変化に依存する。このシステムでは、小リガンドの集団を２〜５マイクロリットルの細胞に連続的に注入し、ここで標的ポリペプチドは細胞内に固定する。結合は、表面から屈折するレーザ光を記録することによって表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により検出する。一般に、表面層での質量濃度の所与の変化についての屈折率変化は、すべてのタンパク質及びペプチドで実質的に同じであり、単一の方法を任意のタンパク質に適用することができる（Ｌｉｅｄｂｅｒｇら、１９８３。通常の実験では、標的タンパク質は組換え発現させ、精製し、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合させる。結合は、ポリヒスチジンタグを利用することにより、又はイオン交換＊や疎水性相互作用などのその他の相互作用により促進することができる。次いで、このように調製したチップをＢｉａｃｏｒｅ（スウェーデン国、Ｕｐｐｓａｌａ）から販売されている器具に組み込まれた供給システムを介して１つ又は複数の潜在的リガンドに曝露し、そのリガンドをピペットで連続的に量り入れる（オートサンプラー）。チップ上のＳＰＲシグナルを記録し、屈折率の変化は固定化した標的とリガンドとの相互作用を示す。オンレート及びオフレートのシグナル動態を分析することにより、非特異的相互作用と特異的相互作用とを区別することができる。Ｈｏｍｏｌａら（１９９９）のＳｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ５４：３−１５及びその中の引例も参照されたい。
【０１５０】
ＶＩＩ．Ｃ．立体構造アッセイ
本発明はまた、単独で発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド、或いはＴ２Ｒ７６モジュレータが結合した、又はＴ２Ｒ７６モジュレータと相互作用した場合に別のＴ２Ｒポリペプチドと合わせたＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造の変化に依存するＴ２Ｒ７６モジュレータを同定する方法を提供する。
【０１５１】
円偏光二色性を高分子の溶液に適用することにより、これらの高分子の立体構造の状態が明らかになる。この技術により、ランダムコイル、αへリックス及びβ鎖の立体構造の状態を区別することができる。
【０１５２】
Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定するために、組換え発現させたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを使用して円偏光二色性分析を実施することができる。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを、例えばイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、試験物質と混合する。この混合物を円偏光二色性にかける。試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造を、試験物質不存在下でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造と比較する。試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６ポリペプチドの立体構造状態の変化をこのように使用してＴ２Ｒ７６モジュレータを同定することができる。代表的な方法は米国特許第５７７６８５９号及び同第５７８０２４２号に記載されている。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは別のＴ２Ｒポリペプチドを含むヘテロメリック受容体に含まれていてもよい。
【０１５３】
ＶＩＩ．Ｄ．受容体活性化アッセイ
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６モジュレータを同定する方法は機能性Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを使用する。本明細書で開示の新規なＴ２Ｒ７６ポリペプチドは配列番号２を含む。Ｔ２Ｒ７６の機能を判定する代表的な方法は以下の本明細書で記載する通り、細胞内シグナリング事象のリガンド仲介活性化をアッセイすることを含む。
【０１５４】
試験物質のＴ２Ｒ７６の機能への効果は、これらだけに限定するものではないが、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのリン酸化、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドに結合するＧタンパク質、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する細胞中のイオン流束、遺伝子転写の変化、細胞代謝の変化（例えば、細胞増殖）、細胞内第２メッセンジャー（例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ）の変化及び伝達物質又はホルモン放出の変化を含むＴ２Ｒ７６活性によって引き出される任意の生理学的変化のアッセイを含むことができる。ＧＰＣＲシグナル形質導入及びそれをアッセイする方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅｓ ２３７及び２３８（１９９４）に記載されている。Ｂｅｒｒｉｄｇｅ＆Ｉｒｖｉｎｅ（１９８４）のＮａｔｕｒｅ ３１２：３１５−３２１；Ｂｏｕｒｎｅら（１９９１）のＮａｔｕｒｅ １０：３４９：１１７−２７；Ｂｏｕｒｎｅら（１９９０）のＮａｔｕｒｅ ３４８：１２５−３２；Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏら（１９９４）のＡｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｅｌｌ及びＭｏｌ Ｂｉｏｌ １１：１５９−１６４；Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ（１９９７）のＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：９６１−９６４；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ（１９９５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１５１７５−１５１８０；Ｐｉｔｃｈｅｒら（１９９８）のＡｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：６５３−９２；並びに米国特許第４１１５５３８号；同第５４３６１２８号；同第６００４８０８号、同第６４０３３０５号及び同第６２５５０５９号も参照されたい。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ２Ｒ７６の機能のアッセイは、組換え発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチド単独又は別のＴ２Ｒポリペプチドと合わせて組換え発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドのガストデューシン又はＧｑ若しくはトランスデューシンなどの種々のＧタンパク質へのカップリングをアッセイすることも含む。したがってＴ２Ｒ７６活性の代表的レベルは、実施例３で記載の通り、ガストデューシンでのＧＤＰのＧＴＰγＳへの交換量を含むことができる。Ｔ２Ｒ７６活性の代表的な質は、例えばサブユニット１つあたりのＧタンパク質の選択的活性化を含むことができる。
【０１５６】
この方法に従って、Ｔ２Ｒ７６を発現する細胞はＴ２Ｒ７６の機能をアッセイするのに有用なキットの形態で供給することができる。したがって、細胞は上記の本明細書で記載の通りに凍結させ、凍結している間にアッセイを実施する他の場所へ輸送することができる。例えば、本発明の一実施形態では、Ｔ２Ｒ７６モジュレータを検出するために試験キットを用意する。このキットは、（ａ）完全長Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードするＤＮＡでトランスフェクトした凍結細胞及び（ｂ）この細胞を増殖させるための培地を含む。
【０１５７】
このようなアッセイで使用する細胞は、本来のＴ２Ｒ７６及びＴ２Ｒ７６と実質的に同様のポリペプチドを実質的に欠いている細胞を含むことが好ましい。好ましい細胞は真核生物細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞を含む。
【０１５８】
宿主細胞又は対照細胞を記載するために本明細書で使用する用語「実質的に欠いている」は、本来のＴ２Ｒ７６のレベル、Ｔ２Ｒ７６と実質的に同様のポリペプチドのレベル又はそれらの活性レベルを有し、バックグラウンドレベルを含む質を指す。用語「バックグラウンドレベル」は、Ｔ２Ｒ７６を含まず、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと実質的に同様のポリペプチドを含まない細胞で通常検出される発現又は活性の非特異的測定値を包含する。
【０１５９】
本発明のアッセイで使用した細胞は、Ｔ２Ｒ７６受容体を細胞内シグナリング経路にカップリングすることができる機能性Ｇタンパク質を含むことが好ましい。本発明の一実施形態では、機能性Ｇタンパク質は種々のカップリング、例えばＧα１５及びＧα１６を示すＧタンパク質を含むことができる。Ｗｉｌｋｉｅら（１９９１）のＰｒｏｃ Ｎａｄ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１００４９−１００５３及び米国特許第６００４８０８号を参照されたい。
【０１６０】
組換えＴ２Ｒ７６を発現する細胞を使用するすべてのアッセイは、本来のＴ２Ｒ７６及びＴ２Ｒ７６ポリペプチドと実質的に同様のポリペプチドを実質的に欠いている対照細胞をさらに使用することも好ましい。一時的にトランスフェクトした細胞を使用する場合、対照細胞は、例えばトランスフェクトしていない宿主細胞を含むことができる。Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する安定な細胞系を使用する場合、対照細胞は、例えばＴ２Ｒ７６を発現する細胞系を誘導するのに使用した親細胞系を含むことができる。
【０１６１】
一時的にトランスフェクトした細胞を使用するＴ２Ｒ７６活性のアッセイは、トランスフェクトした細胞をトランスフェクトしていない細胞から区別するマーカーを含んでいることが好ましい。用語「マーカー」は、Ｔ２Ｒ７６を組換え発現させる細胞をＴ２Ｒ７６ポリペプチドを組換え発現させない細胞から区別するのに使用することができる任意の検出可能な分子を指す。細胞がＴ２Ｒ７６をコードする核酸分子とマーカーとで同時にトランスフェクトされるように、マーカーはＴ２Ｒ７６発現のための構築体でコードされているか、Ｔ２Ｒ７６発現のための構築体と合わされていることが好ましい。マーカーとして有用な代表的な検出できる分子としては、これらだけに限定するものではないが、異種核酸、トランスフェクトされた構築体でコードされたポリペプチド（例えば、酵素又は蛍光ポリペプチド）、結合タンパク質及び抗原がある。例えば、マーカーは実施例２で記載の通り、免疫学的に検出することができるロドプソンタグを含むことができる。
【０１６２】
マーカーとして有用な酵素の例としては、ホスファターゼ（例えば、酸ホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）がある。
【０１６３】
酵素を含むマーカーは、酵素の活性に基づいて検出することができる。したがって、基質を加え、例えば分光光度計、ルミノメーター又は蛍光分光計を使用して、その最終生成物が検出可能な反応を触媒する。上記の酵素による、検出可能な反応生成物を生成する反応のための基質は当業者に知られている。
【０１６４】
好ましいマーカーは、基質を加えることなく検出することができるコードされたポリペプチドを含む。直接検出できる代表的なポリペプチドとしては、ＧＦＰ及びＥＧＦＰがある。蛍光、例えばＧＦＰ又はＥＧＦＰ蛍光の高スループット検出を実施するための一般的な研究装置が開発されている。それには、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（米国マサチューセッツ州Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ）、Ａｍｅｒｓｈａｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（米国カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．（米国ワシントン州Ｉｓｓａｕａｈ）及びＧｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（米国ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）製の器具が含まれる。市販のシステムの殆どは、光電子増倍管検出を伴う、ある形態の走査技術を使用する。
【０１６５】
ＶＩＩ．Ｅ．理論的設計
本来のＴ２Ｒ７６ポリペプチド構造の知識により、モジュレータ及び診断剤の理論的設計の手法が得られる。簡単に言えば、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドの構造は、Ｘ線結晶学により及び／又は三次元画像を生成する計算アルゴリズムにより決定することができる。Ｓａｑｉら（１９９９）のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：５２１−５２２；Ｈｕａｎｇら（２０００）のＰａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：２３０−２４１；及びＰＣＴ国際公報番号ＷＯ９９／２６９６６を参照されたい。あるいは、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド構造のワーキングモデルは相同性モデルから導出することができる（Ｍａａｌｏｕｆら、１９９８）。コンピュータモデルは、上記の本明細書で記載のアッセイを使用して合成及び試験することができる種々の基質分子へのタンパク質構造の結合をさらに予測することができる。さらなる化合物設計技術は、米国特許第５８３４２２８号及び同第５８７２０１１号に記載されている。
【０１６６】
一般に、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは膜タンパク質であり、界面活性剤又はその他の適切な両親媒性分子を使用して可溶性形態に精製することができる。得られるＴ２Ｒ７６ポリペプチドは、結晶化に十分な純度及び濃度である。精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは還元又は非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＰＡＧＥ）で単一バンドとして表れることが好ましい。精製Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドは、ｐＨ、バッファタイプ、バッファ濃度、塩タイプ、ポリマータイプ、ポリマー濃度、他の沈殿リガンド及び精製Ｔ２Ｒ７６の濃度の少なくとも１つが変化する条件下で結晶化させることができる。結晶性ポリペプチドを生成する方法は当技術分野で知られており、本明細書で開示のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの判定に合理的に使用することができる。例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら（１９８４）のＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８０：３８５−３９８；Ｗｅｉｓｓら（１９９０）のＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２６７：２６８−２７２；又はＣＲＹＳＴＡＬ ＳＣＲＥＥＮ（商標）キット（米国カリフォルニア州ＲｉｖｅｒｓｉｄｅのＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能）などの市販のキットに提供されている方法を参照されたい。
【０１６７】
結晶化したＴ２Ｒ７６ポリペプチドは機能活性について試験することができ、異なるサイズや形状の結晶は、Ｘ線回折で適性をさらに試験する。一般に、より大きい結晶はより小さい結晶よりも良好な結晶学を提供し、より厚い結晶はより薄い結晶よりも良好な結晶学を提供する。Ｔ２Ｒ７６の結晶は０．１〜１．５ｍｍの範囲のサイズであることが好ましい。これらの結晶はＸ線を少なくとも１０Ａの分解能まで、例えば１．５〜１０．０Ａ又はその範囲の任意の値、例えば１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５若しくは３まで回折する。最高の分解能としては３．５Ａ以下が好ましい。
【０１６８】
ＶＩＩＩ．Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する方法
本発明はさらに、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する方法を提供する。開示の方法は、味覚についてのＴ２Ｒ７６関連の差異と結び付いたＴ２Ｒ７６発現の変化レベルを判定するのに使用することができる。
【０１６９】
本発明の一実施形態では、この方法は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体との免疫化学反応を実施することを含む。この抗体は、このような抗体を生成するための本発明の方法により調製した。したがって、この方法は、（ａ）ペプチド性材料を含む生物学的試料を入手すること、（ｂ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと特異的に結合し、開示の方法で生成した抗体と生物学的試料を接触させること（抗体は検出可能な標識を含む）、及び（ｃ）検出可能な標識を検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することを含む。
【０１７０】
このような抗体抗原コンジュゲート又は複合体を検出する技術は当技術分野で知られており、これらだけに限定するものではないが、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィー及びその他の免疫化学方法がある。例えば、Ｍａｎｓｏｎ（１９９２）の「免疫化学プロトコル（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、米国ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ；Ｉｓｈｉｋａｗａ（１９９９）の「超感受性及び迅速な酵素イムノアッセイ（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム／米国ニューヨーク；Ｌａｗ（１９９６）の「イムノアッセイ：実践的指針（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ）」、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、ロンドン／米国ペンシルバニア州Ｂｒｉｓｔｏｌ；Ｃｈａｎ（１９９６）の「イムノアッセイの自動化：システムの最新の指針（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｌｉｄｄｅｌｌ＆Ｗｅｅｋｓ（１９９５）の「抗体技術（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、英国オックスフォード；Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら（１９９３）の「免疫学的分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ／ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、独国ワインハイム／米国Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｋｅｒ＆Ｒａｐｌｅｙ（１９９３）の「診断における分子プローブ及び抗体プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、Ｗｉｌｅｙ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク；Ｗｙｃｋｏｆｆら（１９８５）の「生物学的高分子の回折方法（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国フロリダ州Ｏｒｌａｎｄｏ；及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【０１７１】
本発明の別の実施形態では、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異結合を示すモジュレータを使用してＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出する。抗体を使用するＴ２Ｒ７６ポリペプチドの検出と同様に、この方法は、（ａ）ペプチド性材料を含む生物学的試料を入手すること、（ｂ）生物学的試料をＴ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータと接触させること（モジュレータは検出可能な標識を含む）、及び（ｃ）検出可能な標識を検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することを含む。例えば蛍光体又はエピトープ標識などの任意の適切な検出可能な標識を使用することができる。
【０１７２】
ＩＸ．用途
本発明は、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法を提供する。本発明のモジュレータは、例えば苦味覚を抑制又は強化するために、苦味覚を変化させるのに有用である。
【０１７３】
ＩＸ．Ａ．対象
本明細書で使用する用語「対象」は、任意の脊椎動物種、好ましくは哺乳動物及び鳥類などの温血脊椎動物を含む。より具体的には、本発明の方法は、ヒト、並びにヒトにとって、絶滅の危機に瀕しているために重要な（例えば、シベリアトラ）、経済的に重要な（ヒトが消費するために飼育場で飼育されている動物）及び／又は社会的に重要な（ペットとして又は動物園で飼われている動物）哺乳動物、例えばヒト以外の肉食動物（例えば、ネコ及びイヌ）、豚（ブタ、食用豚及びイノシシ）、反芻動物及び家畜（例えば、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ）並びにウマなどの哺乳動物の腫瘍の治療を意図する。絶滅の危機に瀕した、又は動物園で飼育されている種類の鳥類、並びに家禽、より具体的には家蓄化した家禽若しくは飼い鳥類、例えばシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどを含む鳥類もヒトにとって経済的に重要なので、その治療も意図する。
【０１７４】
ＩＸ．Ｂ．組成物
本発明の方法によれば、対象の味覚を変化させるために投与する組成物は有効量のＴ２Ｒ７６モジュレータを含む。Ｔ２Ｒ７６モジュレータは上記の本明細書で記載したタイプの試験物質のいずれか１つを含むことができる。本明細書で開示の通りに同定したＴ２Ｒ７６モジュレータを使用して、これらだけに限定するものではないが、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤、例えば以下の本明細書で挙げた化合物のいずれかを含む経口使用のための組成物を調製することができる。Ｔ２Ｒ７６モジュレータは、経口使用が可能だが望ましくない化合物、例えば家庭用洗剤、毒などの味覚を変化させる添加剤として使用することもできる。
【０１７５】
望ましくない又は苦味を有する代表的な化合物としては、これらだけに限定するものではないが、グレープフルーツ、オレンジ及びレモンなどの柑橘類；トマト、ピーマン、セロリ、メロン、ニンジン、ジャガイモ及びアスパラガスなどの野菜；香味、ソース、醤油及び赤トウガラシなどの調味料又は薬味；大豆由来の食物；クリーム、ドレッシング、マヨネーズ及びマーガリンなどの食品エマルジョン；魚肉、魚のすり身、魚卵などの加工海産物；ピーナッツなどのナッツ類；納豆などの発酵食品；肉及び加工肉；漬物；ヌードル；粉末スープを含むスープ；チーズなどの乳製品；パン及びケーキ；キャンディー、チューイングガム及びチョコレートなどの菓子；並びに健康用に特別に調製した食物がある。
【０１７６】
苦味を表出する代表的な化粧品（例えば、化粧水、クリーム、美顔用パック、口紅、ファンデーション、ひげ剃り用製剤、アフターシェーブローション、クレンジングフォーム及びクレンジングジェル）としては、これらだけに限定するものではないが、アルキル硫酸ナトリウム及びモノアルキルリン酸ナトリウムなどの界面活性剤を含む組成物；メントール、リナロール、フェニルエチルアルコール、プロピオン酸エチル、ゲラニオール、酢酸リナリル及び酢酸ベンジルなどの香料；メチルパラベン、プロピルパラベン及びブチルパラベンなどの抗菌物質；乳酸及び乳酸ナトリウムなどの湿潤剤；オクタ酢酸スクロース及びブルシンなどのアルコール変性剤；並びに乳酸アルミニウムなどの収斂剤がある。
【０１７７】
苦味を有する代表的な薬剤としては、アセトアミノフェン、テルフェナジン、グアイフェネシン、トリメトプリム、プレドニゾロン、イブプロフェン、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、メタコリン、ネオスチグミン、エピネフリン、アルブテロール、塩酸プソイドエフェドリン、ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、フェノチアジン、クロルプロマジン、クロルジアゼポキシド、アミトリプチリン、バルビツレート、ジフェニルヒダントイン、カフェイン、モルヒネ、デメロール、コデイン、ロモチル、リドカイン、サリチル酸、スルホンアミド、クロロキン、ビタミン製剤、鉱物及びペニシリンがある。
【０１７８】
モジュレータは、調製した食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬物の一部として投与することもできる。対象に投与するための組成物を調製するために、その味覚を調節する化合物にＴ２Ｒ７６モジュレータを約０．００１重量％から約１０重量％、好ましくは約０．０１重量％から約８重量％、より好ましくは約０．１重量％から約５重量％、最も好ましくは約０．５重量％から約２重量％含む量で混合することができる。
【０１７９】
適切な配合物としては、溶液、エッセンス、エリキシル、アルコール剤、シロップ剤、懸濁液、粉剤、顆粒、カプセル剤、ペレット剤、錠剤及びエアゾルがある。場合により、配合物は、薬剤として許容できる担体、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、着香料、着色料、甘味料、香料又はこれらの組合せを含む。Ｔ２Ｒ７６モジュレータ及び組成物は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は多用量密封容器に提供することができる。
【０１８０】
ＩＸ．Ｃ．投与
Ｔ２Ｒ７６モジュレータは味覚を調節するために対象に直接投与することができる。本発明のモジュレータは経口的又は経鼻的に投与することが好ましい。
【０１８１】
本発明の方法に従って、有効量のＴ２Ｒ７６モジュレータを対象に投与する。用語「有効量」はＴ２Ｒ７６の活性化を調節及び／又は苦味覚を調節するのに十分な組成物の量を指す。
【０１８２】
有効量は、所望の味覚を達成するのに有効な量のＴ２Ｒ７６モジュレータを投与するように変化させることができる。選択する投与レベルは、Ｔ２Ｒ７６モジュレータの活性、配合、他の組成物との組合せ（例えば、食物、薬物など）、対象とする使用（例えば、食品添加物、歯磨剤などとして）並びに治療する対象の生理的状態及び以前の病歴を含む種々の要因に左右される。
【０１８３】
有効量又は投与量は、当技術分野で知られている通りの味覚のｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して容易に決定することができる。味覚をアッセイする代表的な方法は実施例４に記載している。
【０１８４】
実施例
本発明の方法を説明するために以下の実施例を記載する。以下の実施例のある態様は、本発明を良好に実施するために本発明者らが見出し又は意図した技術及び手順について記載している。これらの実施例は、本発明者らの標準的な実習を説明する。本開示及び当技術分野の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図しており、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更、修正及び改変が可能なことは理解されよう。
【実施例１】
【０１８５】
ヒトＴ２Ｒ７６のクローニング
ヒト苦味受容体をコードする新規な遺伝子がヒトゲノム配列データベースで同定された。新規なｈＴ２ＲメンバーであるｈＴ２Ｒ７６はヒトの第７染色体に位置している。Ｔ２Ｒ７６ＤＮＡ配列の染色体上の位置は、カリフォルニア大学（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）のＧｅｎｏｍｉｃｓウェブサイトをスクリーニングすることによって決定した。この分析により、Ｔ２Ｒ７６は領域１４４０６２６９２−１４４０６３６４８の第７染色体に位置することが示された。ある化合物、例えばフェニルチオカルバルネートの苦味は第５染色体及び第７染色体に遺伝的に関連している。（Ｇｕｏら（２００１）のＡｎｎ Ｈｕｍ Ｂｉｏｌ ２８：１１１−４２）。したがって、Ｔ２Ｒ７６はある苦味物質の結合及び認識に関与していると予想される。
【０１８６】
ヒトＴ２Ｒ７６は、上記のｈＴ２Ｒ配列を有するＤＮＡ配列データベースの反復配列検索によって最初同定された。次いで、ｈＴ２Ｒ７６をコードする完全長オープンリーディングフレームはゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離された。ｈＴ２Ｒ７６のアミノ酸配列は、対応するオープンリーディングフレームを概念的に翻訳することによって導出した。ｈＴ２Ｒ７６ヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１及び配列番号２として挙げる。
【０１８７】
ｈＴ２Ｒ７６のイントロンを含まないオープンリーディングフレームは、長さが３１８アミノ酸残基の推定受容体タンパク質をコードする。ｈＴ２Ｒ７６タンパク質配列を一般の配列データベースの既知のタンパク質すべてとＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して比較すると、哺乳動物苦味受容体ファミリーのメンバーと強い相同性が示された。
【実施例２】
【０１８８】
ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６の構造
ブリッジオーバーラップＰＣＲ伸長技術を使用して、Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら（２０００）のＣｅｌｌ １００：７０３−７１１に記載の通り、ヒトＴ２Ｒ７６コード配列を有するフレームにウシロドプシンの最初の３８アミノ酸を含むｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６キメラを生成した。次いで、キメラｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ−１ベクターにクローニングし、ロドプシン標識したｈＴ２Ｒ７６を含むバキュロウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（米国カリフォルニア州ＣａｒｌｓｂａｄのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して生成した。ｈＴ２Ｒ７６の発現は、抗ロドプシンタグ抗体（１３６−３０）を使用する免疫ブロッティングにより確認した。ｈＴ２Ｒ７６型バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞は、予想した分子量（約３５ｋＤａ）のタンパク質を生成した。
【実施例３】
【０１８９】
Ｔ２Ｒ７６のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧタンパク質カップリング
ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６をコードする感染性バクミドを実施例２に記載の通りに調製する。昆虫の幼虫の細胞を６０時間、組換えバクミドに感染させ、Ｒｙｂａ＆Ｔｒｉｎｄｅｌｌｉ（１９９５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：６７５７−６７６７で記載の通りに膜を調製する。５Ｍ尿素で処理して周囲のタンパク質を除去し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴに膜を再懸濁する。モノクローナル抗体Ｂ６−３０を使用するウェスタンブロッティングにより、ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６の発現を評価することができる。
【０１９０】
例えばＨｏｏｎら（１９９５）のＣｅｌｌ ９６ ６２９−６３６及びＲｙｂａ＆Ｔｒｉｎｄｅｌｌｉ（１９９５）のＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：６７５７−６７６７で記載の通りに、Ｇタンパク質を単離する。ガストデューシンでのＧＤＰのＧＴＰγＳへの受容体触媒交換は、１０ｎＭ ｒｈｏｄ−ｈＴ２Ｒ７６、１００μｔＭ ＧＤＰ及び２０μＭ Ｇβ１γ８の存在下で測定する。種々のＧタンパク質（例えば、Ｇα５又はトランスデューシン）でのＧＤＰ−ＧＴＰγＳ交換は、米国特許出願第６０／３７２０８９号に記載の通りに実施する。約１５〜６０分の時点での測定値はＧＴＰγＳ結合の初速度を反映する。
【実施例４】
【０１９１】
味覚試験
本明細書で開示の通りに同定したＴ２Ｒ７６モジュレータを含む試験組成物を使用して香味受入れ研究を実施する。Ｔ２Ｒ７６モジュレータを欠くが、それ以外は試験組成物と実質的に同様であるか同一の対照組成物も使用する。この試験は、対象すべてが、１回又は複数回同量又は同用量を投与する両方の組成物を評価する二重交差設計を用いる。試験組成物及び対照組成物は単一の試験日に評価する。試験組成物及び対照組成物を投与する順序は対象間で無作為化する。参加した対象すべては、試験プロトコルのすべての態様を完了する。対象は、通常の味覚スコア（例えば、１＝非常に苦い、２＝苦い、３＝並、４＝それほど苦くない、５＝全く苦くない）を使用して試験組成物及び対照組成物のそれぞれについて反応する。有害事象は記録する。対照組成物と比較したときの試験組成物の美味性の有意差を測定することにより、Ｔ２Ｒ７６モジュレータの有効性を判定する。
【実施例５】
【０１９２】
苦味化合物に対するｈＴ２Ｒ７６の応答
ｈＴ２Ｒ７６を発現する哺乳動物細胞系（ＨＥＫ２９３）並びに異なるｈＴ２Ｒ（ｈＴ２Ｒ６４）を発現する対照細胞系を使用してＧＴＰγＳ結合アッセイを実施する。これらの細胞系を、６−ｎ−プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）、オクタ酢酸スクロース、ウンデカ酢酸ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ｕｎｄｅｃａａｃｅｔａｔｅ）、（ＲＵＡ）、グリシン酸銅、デナトニウム及びキニーネを０．５から２ｍｍの範囲の種々の濃度で含む苦味化合物と接触させる。このアッセイの結果を使用して、ｈＴ２Ｒ７６は既知の苦味刺激で特異的に活性化される苦味受容体であることが確認される。このＧＴＰγＳ結合アッセイでは、活性は特定の濃度の既知の苦味化合物の存在下又は不存在下のいずれかで判定する。
【実施例６】
【０１９３】
高スループットスクリーニングアッセイ
ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用して、１５０００種を超える化合物のライブラリーをスクリーニングしてｈＴ２Ｒ７６を特異的に活性化する他の化合物を同定する。このアッセイでｈＴ２７６を活性化する特定の化合物の構造を比較して、ｈＴ２Ｒ７６を強力に活性化する同様の構造を有する化合物を予想する。次いで、同じＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて異なる濃度でこれらの同様の構造を有する化合物のライブラリーを評価して、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する他の化合物を同定する。
【実施例７】
【０１９４】
ヒト味覚試験
ＧＴＰγＳ結合アッセイでｈＴ２Ｒ７６を活性化する化合物を、ヒト味覚試験で評価する。これらのヒト味覚試験は同意した成人で実施し、これらの成人には同定した化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＴ２Ｒ７６を活性化する濃度で経口投与する。これらの味覚試験では、（ｈＴ２Ｒ７６活性化する）同定した化合物を水に溶解して、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＴＰγＳ結合アッセイでｈＴ２Ｒ７６を活性化する化合物濃度を得る。
【０１９５】
この味覚試験では、少なくとも５人のサンプルが、苦味化合物を含む一連の水溶液を味覚する。（好ましい実施例では、苦味化合物はＴ２Ｒ７６アゴニストである）。各人は、０から１００（０は「ほとんど検出できない」であり、１００は「最も強いとイメージできる」である）の範囲に分類した等級尺度で苦さの度合をランク付けする。次に、各人は苦味化合物とＴ２Ｒ７６阻害剤を含む一連の水溶液の味を調べ、各試料について苦さの度合をランク付けする。苦さの度合の低下によってＴ２Ｒ７６阻害剤の有効性を測定する。比較手段として、各対象は既知の苦味化合物（硫酸キニーネ）も味覚し、評価する。味覚試験の結果は、対象すべての平均評点として表す。
【実施例８】
【０１９６】
既知の苦味化合物に対するｈＴ２Ｒ７６の応答
このアッセイの結果を使用して、ｈＴ２Ｒ７６を活性化する苦味化合物を同定する。これに基づいて、このような苦味化合物によるｈＴ２Ｒ７６の活性化をブロックする化合物を同定するアッセイを開発することができる。
【０１９７】
結論
これらのアッセイの結果は、ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用して苦味化合物を同定することができること、及びｈＴ２Ｒ７６１がヒト苦味受容体として機能することを証明する。同定した化合物を使用して、食物及び飲料に苦味を与えることができる。あるいは、これらの化合物は、苦味遮断剤及びモジュレータ並びに他の苦味化合物を同定するためのアッセイでのアゴニストとして使用することができる。
【０１９８】
参考文献
以下に挙げた参考文献並びに本明細書に引用したすべての参照文献は、本明細書で使用した方法、技術及び／又は組成物を補足し、説明し、それらに背景を与え、又は教示する範囲において本明細書に援用する。
（参考文献）
【０１９９】
本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の種々の詳細を変更できることは理解されよう。さらに、上記の記載は説明することのみを目的とし、本明細書に添付した特許請求の範囲で定義した本発明を制限する目的はない。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、又は
（ｃ）配列番号１と実質的に同様の単離核酸分子
を含む単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される請求項１に記載の単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、又は
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子
を含む請求項１に記載の単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項４】
（ａ）核酸材料を有する生物学的試料を入手すること、
（ｂ）単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の生物学的試料とハイブリダイズし、それにより前記単離Ｔ２Ｒ７６核酸と前記生物学的試料中の核酸との間で二重構造を形成すること、及び
（ｃ）（ｂ）の前記二重構造を検出し、それにより前記生物学的試料中のＴ２Ｒ７６核酸分子を検出すること
を含むＴ２Ｒ７６核酸分子を検出する方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項５に記載の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２を含む請求項５に記載の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドを伴う請求項５に記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項９】
前記他のＴ２Ｒポリペプチドが別のヒトＴ２Ｒである請求項８に記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項１０】
前記他のヒトＴ２Ｒが、ヒトＴ２Ｒ５１、Ｔ２Ｒ５４、Ｔ２Ｒ５５、Ｔ２４６１、Ｔ２Ｒ６３、Ｔ２Ｒ６４、Ｔ２Ｒ６５、Ｔ２Ｒ６７、Ｔ２Ｒ７１、Ｔ２Ｒ７５、Ｔ２Ｒ５９及びＴ２Ｒ３３からなる群から選択される請求項９に記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項１１】
上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を生成する方法。
【請求項１２】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
さらにモノクローナル抗体の調製を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法によって生成された抗体。
【請求項１５】
（ａ）ペプチド性材料を有する生物学的試料を入手すること、
（ｂ）請求項１４に記載の抗体との免疫化学的反応で（ａ）の前記生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの量を測定すること
を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドのレベルを検出する方法。
【請求項１６】
（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと、
（ｂ）該Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種宿主細胞
とを含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドを異種発現させる系。
【請求項１７】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む請求項１６に記載の系。
【請求項１８】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項１７に記載の系。
【請求項１９】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項１８に記載の系。
【請求項２０】
別のＴ２Ｒをコードする核酸をさらに含む請求項１８に記載の系。
【請求項２１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞を含む請求項１６に記載の系。
【請求項２２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む請求項２１に記載の系。
【請求項２３】
前記宿主細胞がＴ２Ｒ７６ポリペプチドとのカップリングが可能なＧタンパク質αサブユニットをさらに含む請求項１６に記載の系。
【請求項２４】
前記Ｇタンパク質αサブユニットが混在（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２５】
前記種々のＧタンパク質がＧα１５を含む請求項２４に記載の系。
【請求項２６】
前記混在Ｇタンパク質がトランスデューシン又はガストデューシンを含む請求項２４に記載の系。
【請求項２７】
（ａ）組換え発現系を用意して、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを異種宿主細胞で単独又は少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて発現させること、
（ｂ）試験物質を（ａ）の前記系に与えること、
（ｃ）前記試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をアッセイすること、
（ｄ）前記試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をＴ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較すること、及び
（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較して有意に変化した前記試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質を測定することにより試験物質をＴ２Ｒ７６モジュレータとして同定すること
を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法。
【請求項２８】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、及び
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞がＴ２Ｒ７６ポリペプチドとのカップリングが可能なＧタンパク質αサブユニットをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｇタンパク質αサブユニットが混在（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記混在Ｇタンパク質がＧα１５を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記混在Ｇタンパク質がトランスデューシンを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アッセイがＧＴＰγＳ結合量を測定することを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７に記載の方法で同定されたＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項３９】
タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項３８に記載のＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項４０】
（ａ）請求項３８に記載のモジュレータを含む組成物を調製すること、
（ｂ）対象に有効量の組成物を投与することにより、対象で苦味覚を変化させること
を含む前記対象で苦味覚を調節する方法。
【請求項４１】
前記組成物が、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤をさらに含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
モジュレータを含む前記組成物と、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤からなる群から選択される組成物とを同時投与することをさらに含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が哺乳動物である請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド単独又は少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと共に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを１つ又は複数の試験物質に曝露すること、
（ｂ）試験物質の前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組合せへの結合をアッセイすること、及び
（ｃ）前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異結合を示す候補物質を選択すること
を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法。
【請求項４６】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）前記遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法で同定されたＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項５０】
タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項４９に記載のＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項５１】
（ａ）請求項４９に記載のモジュレータを含む組成物を調製すること、
（ｂ）対象に有効量の組成物を投与することにより、対象で苦味の知覚を変化させること
を含む対象で苦味の知覚を調節する方法。
【請求項５２】
前記組成物が、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤をさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
モジュレータを含む前記組成物と、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤からなる群から選択される組成物とを同時投与することをさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｔ２Ｒ７６モジュレータが、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が哺乳動物である請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物がヒトである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
Ｔ２Ｒ７６阻害物質と苦味化合物とを対象に同時投与することを含む苦味化合物の苦味覚を減少させる方法。
【請求項５８】
前記同時投与が、前記苦味化合物と混合した前記Ｔ２Ｒ７６阻害物質を含む組成物を投与することを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｔ２Ｒ７６阻害物質が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記苦味化合物が、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が哺乳動物である請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物がヒトである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｔ２Ｒ７６アゴニストと化合物とを対象に同時投与することを含む前記化合物の苦味覚を増強させる方法。
【請求項６４】
前記同時投与が、前記化合物と混合した前記Ｔ２Ｒ７６アゴニストを含む組成物を投与することを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｔ２Ｒ７６アゴニストが、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象が哺乳動物である請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物がヒトである請求項６６に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、又は
（ｃ）配列番号１と実質的に同様の単離核酸分子
を含む単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される請求項１に記載の単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、又は
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子
を含む請求項１に記載の単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子。
【請求項４】
（ａ）核酸材料を有する生物学的試料を入手すること、
（ｂ）単離Ｔ２Ｒ７６核酸分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の生物学的試料とハイブリダイズし、それにより前記単離Ｔ２Ｒ７６核酸と前記生物学的試料中の核酸との間で二重構造を形成すること、及び
（ｃ）（ｂ）の前記二重構造を検出し、それにより前記生物学的試料中のＴ２Ｒ７６核酸分子を検出すること
を含むＴ２Ｒ７６核酸分子を検出する方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項５に記載の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２を含む請求項５に記載の単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドを伴う請求項５に記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項９】
前記他のＴ２Ｒポリペプチドが別のヒトＴ２Ｒである請求項８に記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項１０】
前記他のヒトＴ２Ｒが、ヒトＴ２Ｒ５１、Ｔ２Ｒ５４、Ｔ２Ｒ５５、Ｔ２４６１、Ｔ２Ｒ６３、Ｔ２Ｒ６４、Ｔ２Ｒ６５、Ｔ２Ｒ６７、Ｔ２Ｒ７１、Ｔ２Ｒ７５、Ｔ２Ｒ５９及びＴ２Ｒ３３からなる群から選択される請求項９に記載の単離Ｔ２Ｒポリペプチド。
【請求項１１】
上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを特異的に認識する抗体を生成する方法。
【請求項１２】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
さらにモノクローナル抗体の調製を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法によって生成された抗体。
【請求項１５】
（ａ）ペプチド性材料を有する生物学的試料を入手すること、
（ｂ）請求項１４に記載の抗体との免疫化学的反応で（ａ）の前記生物学的試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドを検出することにより、試料中のＴ２Ｒ７６ポリペプチドの量を測定すること
を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドのレベルを検出する方法。
【請求項１６】
（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドと、
（ｂ）該Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを発現する異種宿主細胞
とを含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドを異種発現させる系。
【請求項１７】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む請求項１６に記載の系。
【請求項１８】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項１７に記載の系。
【請求項１９】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項１８に記載の系。
【請求項２０】
別のＴ２Ｒをコードする核酸をさらに含む請求項１８に記載の系。
【請求項２１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞を含む請求項１６に記載の系。
【請求項２２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む請求項２１に記載の系。
【請求項２３】
前記宿主細胞がＴ２Ｒ７６ポリペプチドとのカップリングが可能なＧタンパク質αサブユニットをさらに含む請求項１６に記載の系。
【請求項２４】
前記Ｇタンパク質αサブユニットが混在（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２５】
前記種々のＧタンパク質がＧα１５を含む請求項２４に記載の系。
【請求項２６】
前記混在Ｇタンパク質がトランスデューシン又はガストデューシンを含む請求項２４に記載の系。
【請求項２７】
（ａ）組換え発現系を用意して、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドを異種宿主細胞で単独又は少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと組み合わせて発現させること、
（ｂ）試験物質を（ａ）の前記系に与えること、
（ｃ）前記試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をアッセイすること、
（ｄ）前記試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質をＴ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較すること、及び
（ｅ）Ｔ２Ｒ７６機能の対照レベル又は質と比較して有意に変化した前記試験物質の存在下でのＴ２Ｒ７６機能のレベル又は質を測定することにより試験物質をＴ２Ｒ７６モジュレータとして同定すること
を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法。
【請求項２８】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、及び
（ｄ）遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞がＴ２Ｒ７６ポリペプチドとのカップリングが可能なＧタンパク質αサブユニットをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｇタンパク質αサブユニットが混在（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記混在Ｇタンパク質がＧα１５を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記混在Ｇタンパク質がトランスデューシンを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アッセイがＧＴＰγＳ結合量を測定することを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７に記載の方法で同定されたＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項３９】
タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項３８に記載のＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項４０】
（ａ）請求項３８に記載のモジュレータを含む組成物を調製すること、
（ｂ）対象に有効量の組成物を投与することにより、対象で苦味覚を変化させること
を含む前記対象で苦味覚を調節する方法。
【請求項４１】
前記組成物が、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤をさらに含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
モジュレータを含む前記組成物と、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤からなる群から選択される組成物とを同時投与することをさらに含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が哺乳動物である請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド単独又は少なくとも１つの他のＴ２Ｒポリペプチドと共に発現されたＴ２Ｒ７６ポリペプチドを１つ又は複数の試験物質に曝露すること、
（ｂ）試験物質の前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチド又はＴ２Ｒ７６ポリペプチドの組合せへの結合をアッセイすること、及び
（ｃ）前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドへの特異結合を示す候補物質を選択すること
を含むＴ２Ｒ７６ポリペプチドのモジュレータを同定する方法。
【請求項４６】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２と実質的に同一のポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の核酸分子でコードされたポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号１と実質的に同一の核酸分子でコードされたポリペプチド
を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードする単離核酸分子、
（ｂ）配列番号１の単離核酸分子、
（ｃ）塩濃度が約２００ｍＭ未満の洗浄溶液及び約４５℃より高い洗浄温度で表されるストリンジェントな洗浄条件下でＴ２Ｒ７６核酸配列とハイブリダイズし、Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに
（ｄ）前記遺伝コードの縮重により、核酸配列が上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸分子とは少なくとも１個の機能的に等価なコドンにより異なっており、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１つの前記単離核酸でコードされたＴ２Ｒ７６ポリペプチドをコードする単離核酸分子
からなる群から選択される核酸分子でコードされたポリペプチドをさらに含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離Ｔ２Ｒ７６ポリペプチドが配列番号２を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法で同定されたＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項５０】
タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項４９に記載のＴ２Ｒ７６モジュレータ。
【請求項５１】
（ａ）請求項４９に記載のモジュレータを含む組成物を調製すること、
（ｂ）対象に有効量の組成物を投与することにより、対象で苦味の知覚を変化させること
を含む対象で苦味の知覚を調節する方法。
【請求項５２】
前記組成物が、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤をさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
モジュレータを含む前記組成物と、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品及び薬剤からなる群から選択される組成物とを同時投与することをさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｔ２Ｒ７６モジュレータが、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が哺乳動物である請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物がヒトである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
Ｔ２Ｒ７６阻害物質と苦味化合物とを対象に同時投与することを含む苦味化合物の苦味覚を減少させる方法。
【請求項５８】
前記同時投与が、前記苦味化合物と混合した前記Ｔ２Ｒ７６阻害物質を含む組成物を投与することを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｔ２Ｒ７６阻害物質が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記苦味化合物が、食物、飲料、口腔洗浄液、歯磨剤、化粧品又は薬剤を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が哺乳動物である請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物がヒトである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｔ２Ｒ７６アゴニストと化合物とを対象に同時投与することを含む前記化合物の苦味覚を増強させる方法。
【請求項６４】
前記同時投与が、前記化合物と混合した前記Ｔ２Ｒ７６アゴニストを含む組成物を投与することを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｔ２Ｒ７６アゴニストが、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸及び小分子からなる群から選択されるモジュレータをさらに含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象が哺乳動物である請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物がヒトである請求項６６に記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５１５１５７（Ｐ２００６−５１５１５７Ａ）
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２４９８０（Ｐ２００４−５２４９８０）
【出願日】平成１５年７月２９日（２００３．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２３６０４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１１６１７
【国際公開日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【出願人】（５０２３６２８０６）セノミックス、インコーポレイテッド (9)
【出願人】（３０６００７３０３）
【出願人】（３０６００７３１４）
【出願人】（３０６００７３２５）
【出願人】（３０６００７３３６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月２９日（２００３．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２３６０４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１１６１７
【国際公開日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【出願人】（５０２３６２８０６）セノミックス、インコーポレイテッド (9)
【出願人】（３０６００７３０３）
【出願人】（３０６００７３１４）
【出願人】（３０６００７３２５）
【出願人】（３０６００７３３６）
【Ｆターム（参考）】
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