新規な葉酸依存性酵素阻害剤
【課題】本来の基質が葉酸又は葉酸誘導体（葉酸塩）である酵素を阻害し、癌のような疾患の治療に用いられる新規化合物の提供。
【解決手段】下式の化合物、またはその製薬上許容されうる塩に関する：
（式中、Ｚは、ＯまたはＳであり；ｎは、１〜３であり；Ｒ３は、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ等であり；Ｒ４は、水素原子、ＣＯＯＨ等、Ａはプテリジン環等）。
【解決手段】下式の化合物、またはその製薬上許容されうる塩に関する：
（式中、Ｚは、ＯまたはＳであり；ｎは、１〜３であり；Ｒ３は、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ等であり；Ｒ４は、水素原子、ＣＯＯＨ等、Ａはプテリジン環等）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書
本発明は、新規な一連の化合物に関する。特に本発明は、本来の基質が葉酸または葉酸誘導体（葉酸塩）である酵素を阻害し、癌のような疾患の治療に用いられうる新規な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は他の多くの細胞よりも急速に複製することから、より多くのヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の前駆体）を必要とする。全ての細胞が常に剰余のヌクレオチド（アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を除く）を貯蔵しているわけではないため、ヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡの合成の間、継続的に合成される必要がある。従って、癌細胞の複製はヌクレオチド生合成の阻害に対して健常な細胞の複製よりも感受性が高くなりがちであり、このため、かような阻害が可能な治療剤が関心を集めつつある。
【０００３】
ヌクレオチドは、基本的な代謝前駆体からデノボ経路を経て、あるいは、核酸分解の生成物である遊離塩基およびヌクレオシドが再利用されるサルベージ経路を経て、生物学的に合成されうる。新規な化学治療剤の探索に関して主に関心を集めているのは、デノボ経路である。
【０００４】
ヌクレオチドである２’−デオキシアデノシン−５’−一リン酸（ｄＡＭＰ）および２’−デオキシグアノシン−５’−一リン酸（ｄＧＭＰ）はともに、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）から新たに合成され、このＩＭＰは５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸（ＰＰＲＰ）由来である。このＰＰＲＰとＩＭＰとの間の生合成経路に関与している２つの酵素は、ＧＡＲトランスホルミラーゼおよびＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼである。以下に示すように、ＧＡＲトランスホルミラーゼは、Ｎ１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸を用いてグリシンアミドリボヌクレオチド（ＧＡＲ）をホルミルグリシンアミドリボヌクレオチド（ＦＧＡＲ）に変換する。一方、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼは、同じ化合物を用いて５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）をＮ−ホルミルアミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＦＡＩＣＡＲ）に変換する。
【０００５】
【化１】
【０００６】
これに対し、ヌクレオチドである２’−デオキシチミジン−５’−一リン酸（ｄＴＭＰ）は、２’−デオキシウリジン−５’−一リン酸（ｄＵＭＰ）からデノボ合成により製造される。これは、酵素であるチミジル酸シンターゼにより触媒される変換反応である。この変換反応において、Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は７，８−ジヒドロ葉酸へと還元される。そして、Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は、酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを用いてテトラヒドロ葉酸を経由して再生される。これらのプロセスを以下に図示する。
【０００７】
【化２】
【０００８】
これらのメカニズムの阻害が、癌の治療に利用されている。例えば、米国特許第２，５１２，５７２号には、「葉酸拮抗薬」に分類され、本来の基質よりも約１００倍高い親和性で結合してジヒドロ葉酸レダクターゼを競合的に阻害し、ｄＴＭＰの合成に必須のテトラヒドロ葉酸の再生を阻害することによりＤＮＡ合成を阻害する、強力な化学治療剤であるメトトレキサートを含む多くの置換プテリジン類が開示されている。これにより、癌細胞においていわゆる「チミン欠乏死」が誘導される。メトトレキサートはまた、程度は小さいものの、ＧＡＲトランスホルミラーゼ、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼおよびチミジル酸シンターゼをも阻害する。メトトレキサートおよび他の関連する抗葉酸剤の構造を以下に示す。
【０００９】
【表１】
【００１０】
米国特許第４，６８４，６５３号には、式：
【００１１】
【化３】
【００１２】
式中、Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２であり、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基である、
の化合物およびその対応する５，６，７，８−テトラヒドロ誘導体が開示されている。これらの化合物は、葉酸およびその代謝誘導体を基質として利用する１または２以上の酵素に対して効果を有することが開示されている。
【００１３】
米国特許第５，３４４，９３２号には、式：
【００１４】
【化４】
【００１５】
式中、Ｒ５は、水素原子またはＮＨ２であり、Ｒ４は、水素原子またはメトキシ基であり、Ｒ２は、水素原子または製薬上許容されうるカチオンである、
のグルタミン酸誘導体が開示されており、これらの化合物が、葉酸およびその代謝誘導体を基質として利用する１または２以上の酵素に対して阻害効果を有することが開示されている。
【００１６】
米国特許４，０７７，９５７号には：
【００１７】
【化５】
【００１８】
を含む種々のプテリジン化合物の合成方法が開示されている。
【００１９】
かような化合物は、癌治療のための新たな治療戦略の開発に有用であることが判明しているが、効果が小さい、ある患者ではかような薬物に対してもともと耐性がある、または後天的に耐性となる、毒性や好ましくない副作用があるといった、使用に関連した多くの問題が依然として存在する。従って、癌の治療に用いられることができ、上述した問題の１または２以上を解消しうる代替化合物に対する要求は依然として残っている。
【発明の開示】
【００２０】
従って、本発明の第１の形態によれば、式Ｉの化合物、またはその製薬上許容されうる塩：
【００２１】
【化６】
【００２２】
式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり；
ｎは、１〜３であり；
Ｒ３は、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ８、−Ｃ（ＮＨ）ＳＲ８、または−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は水素原子もしくはアルキル基である）であり；
Ｒ４は、水素原子、−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５（ここで、Ｒ５は、それぞれ独立してＲ３の定義のいずれかを有する）であり；
Ｂは、−ＮＲ２−、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−（ここで、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、Ｒ７は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基もしくはアルコキシ基である）であり；
Ａは：
【００２３】
【化７】
【００２４】
式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
ＣおよびＤは、それぞれ独立して、１または２以上のヘテロ原子を含んでもよい、５員または６員の、置換されたまたは非置換の、芳香族環または非芳香族環であり、Ｃは任意の可能な位置で基Ｂと結合している、
である、
が提供される。
【００２５】
本発明の第２の形態によれば、治療に使用される、本発明の第１の形態の化合物が提供される。
【００２６】
本発明の第３の形態によれば、本発明の第１または第２の形態の化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明の第４の形態によれば、葉酸または葉酸誘導体に依存性の酵素の阻害に応答性の症状の治療に用いられる医薬の製造のための、本発明の第１または第２の形態の化合物の使用が提供される。
【００２８】
本発明の第５の形態によれば、癌の治療に用いられる医薬の製造のための、本発明の第１または第２の形態の化合物の使用が提供される。
【００２９】
本発明の第６の形態によれば、以下の段階：
（ａ）式ＩＩの化合物：
【００３０】
【化８】
【００３１】
式中、Ａは上記と同様の定義であり、ｍは、０、１または２であり、Ｘは脱離基である、
を、式ＩＩＩの化合物：
【００３２】
【化９】
【００３３】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は上記と同様の定義である、
と反応させる段階；
（ｂ）式ＩＶの化合物：
【００３４】
【化１０】
【００３５】
式中、Ａは上記と同様の定義であり、Ｘは脱離基である、
を、式Ｖの化合物：
【００３６】
【化１１】
【００３７】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ３およびＲ４は上記と同様の定義である、
と反応させる段階；あるいは、
（ｃ）以下の化合物ＶＩまたはＶＩＩ：
【００３８】
【化１２】
【００３９】
式中、Ａ、Ｚ、ｎ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は上記と同様の定義であり、いずれの場合においても、Ｙは独立してハロゲン原子である、
の一方を、対応する有機金属試薬に変換させ、前記有機金属試薬を化合物ＶＩまたはＶＩＩの他方と反応させる段階、
を有する、本発明の第１または第２の形態の化合物の製造方法が提供される。
【００４０】
本発明の第７の形態によれば、式ＩＩ−Ａの化合物：
【００４１】
【化１３】
【００４２】
式中、Ｘは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
を、式ＩＩＩ−Ａの化合物：
【００４３】
【化１４】
【００４４】
と反応させる段階を有する、式Ｉ−Ａ：
【００４５】
【化１５】
【００４６】
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、上記と同様の定義である、
を有する、本発明の第１または第２の形態の化合物またはその製薬上許容されうる塩の製造方法が提供される。
【００４７】
本発明の第８の形態によれば、上記で定義され、Ｒ４が−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５である場合を除く、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの化合物が提供される。
【００４８】
本発明の種々の形態のいずれかの発明の好ましい実施形態を以下に記載し、または従属項において規定する。
【００４９】
本発明の種々の形態の全てにおいて、Ｃ＊とマークされた炭素は不斉炭素であってもよく（Ｒ４が水素原子ではない場合）、この場合、式Ｉの化合物は、ラセミ体の形態で存在しても、常法によりその（＋）または（−）光学異性体に分離されてもよいことは当然である。また、いくつかの化合物では、他のキラル中心が存在して１または２以上の別の光学異性体のペアを生じてもよい。例えば、Ｂが−ＣＨ２ＣＨＲ７−であり、Ｒ７がＣ１−３のアルキル基またはアルコキシ基である化合物においては、第２のキラル中心が存在する。かようなラセミ体の形態または光学異性体の形態は全て、本発明の技術的範囲に含まれるものである。さらに、式Ｉの化合物は、１または２以上の互変異性体の形態で存在してもよいことは理解されるであろうし、これらの形態のそれぞれもまた、本発明の技術的範囲に含まれるものである。
【００５０】
以下により詳細に記載される通り、式Ｉの化合物は葉酸の構造類似体であり、インビトロでメトトレキサートに匹敵するレベルで、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のような葉酸または葉酸誘導体（葉酸塩）に依存性の酵素の阻害剤としての作用を有することが判明したのである。式Ｉの化合物はまた、動物モデルにおいてインビボでも腫瘍の増殖を阻害する活性を有することが判明している。ここではメカニズムの詳細は割愛するが、後者の活性は、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬として作用する当該化合物の活性に起因するかもしれないことが予想される。式Ｉの化合物は、癌や、葉酸または葉酸誘導体に依存性の酵素の阻害に応答性の症状の治療に用いられうる。
【００５１】
式Ｉの好ましい化合物は、以下の条件の１または２以上を満たす：
ＺがＯである；
ｎが１である；
Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ４が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ８である；
Ｒ８が、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基であり、好ましくは水素原子、メチル基またはエチル基であり、より好ましくは水素原子である；
Ｂが、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−であり、好ましくは−ＣＨ２ＮＲ２−である；
Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、好ましくは水素原子である；
Ｒ７が、水素原子、メチル基、エチル基またはメトキシ基であり、好ましくは水素原子である。
【００５２】
また、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの好ましい化合物は、上述したＺ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４および／またはＲ７の１または２以上の好ましい規定を有する。
【００５３】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＶまたはＶＩの基Ａにおいて、Ｄは、好ましくは５員のヘテロ芳香族環である。好ましくは、Ａは：
【００５４】
【化１６】
【００５５】
である。
【００５６】
基Ａにおいて、Ｃは、以下の基（隣接する環および基Ｂに結合する点を示す）の１つであってもよい：
【００５７】
【化１７】
【００５８】
式中、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、かつ、ＹがＣであり、Ｒ６が水素原子、メチル基、エチル基またはＨＣＯであるか、ＹがＮであり、Ｒ６が孤立電子対である、のいずれかである。好ましい実施形態において、ＸおよびＹはともにＮであり、Ｒ６は孤立電子対である。
【００５９】
特に好ましい基Ａは、天然のプテリジン類および他のへテロ環塩基に極めて類似した、以下の構造を有する：
【００６０】
【化１８】
【００６１】
特に関心を集めているのは、以下の２つのＡ基である：
【００６２】
【化１９】
【００６３】
上述した２つのＡ基を有し、Ｂが−ＣＨ２ＮＲ２−であり、Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、ＺがＯであり、ｎが１であり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、好ましくは加水分解可能な任意のエステル基である、式Ｉの化合物が特に好ましい。この群の化合物の個別の例としては、以下のものが挙げられる：
【００６４】
【化２０】
【００６５】
式Ｉの化合物は、容易に入手可能で安価な出発物質から、本発明の方法により製造されうる。例えば、Ｂが−ＮＲ２−、−ＣＨ２ＮＲ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ２−である場合に、式Ｉの化合物は、式ＩＩの化合物を式ＩＩＩの化合物とカップリングさせることにより製造されうる。脱離基Ｘは、一般的には塩素、臭素またはヨウ素などのハロゲンであり、特には臭素またはヨウ素である。この反応は、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）などの双極性非プロトン性溶媒中で行われうる。フッ化カリウムなどの塩基性触媒が用いられてもよく、これにより第３級アミンまたは重炭酸ナトリウムと比べて高い収率が得られる。必要であれば、上記の反応前に、本技術分野において公知の適切な保護基を用いて反応性の高い基を保護し、後に、常法により脱保護してもよい。例えば、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈである場合、これらの酸基は、例えばメチルエステル基により保護され、その後にエタノール中での水酸化ナトリウムを用いたアルカリ加水分解などの公知の手法により脱保護され、氷酢酸などの酸の添加により沈殿しうる。従って、式ＩＩおよび式ＩＩＩの化合物のいずれかまたは双方が保護された形態であるこれらの化合物の反応は、本発明の方法に包含されることが理解されうるであろう。
【００６６】
Ｂが−ＣＨ２Ｏ−である場合において、式Ｉの化合物は、例えば、式ＩＶの化合物を、ウィリアムソンエーテル型反応により式Ｖの化合物とカップリングさせることにより製造されうる。この反応において、式Ｖの化合物は一般的に、式ＩＶの化合物との反応前に、例えばＮａＨなどの塩基を用いてアロキシド（ａｒｏｘｉｄｅ）イオンの形態に変換される。Ｘは、任意の適切な脱離基であればよく、特にはハロゲン原子である。
【００６７】
Ｂが−ＣＨ２ＣＨＲ７−である場合において、式Ｉの化合物は、例えば、式ＶＩの化合物を、任意の公知の炭素−炭素結合形成反応により式ＶＩＩの化合物とカップリングさせることにより製造されることができ、特にこれらの反応は、グリニャール試薬やリチウム化合物または銅−リチウム化合物などの有機金属試薬の使用または生成を伴う。例えば、式ＶＩＩの化合物を、対応するグリニャール試薬またはリチウム銅酸化物試薬に変換し、式ＶＩの化合物と反応させてもよい。あるいは、式ＶＩの化合物を、対応するグリニャール試薬またはリチウム銅酸化物試薬に変換し、式ＶＩＩの化合物と反応させてもよい。上述した通り、反応性の置換基のための適切な保護基は、本技術分野の当業者に周知であろう。
【００６８】
中間体ＩＩ〜ＶＩＩは、従来の手法により製造されうる。一例を挙げると、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの化合物は、式：
【００６９】
【化２１】
【００７０】
の化合物を、式：
【００７１】
【化２２】
【００７２】
式中、Ｂ’は、−ＮＨＲ２、−ＯＨまたは−ＣＨＹＲ７であり、Ｘは脱離基である、
の化合物と、塩基の存在下で反応させることにより製造されうる。これに続き、必要であれば適切な保護基を用いて、加水分解および脱炭酸によりシアノ基を除去してもよい。
【００７３】
式Ｉの化合物は、葉酸、特に葉酸の代謝誘導体を基質として利用する１または２以上の酵素に対し、阻害作用を有する。これらの酵素としては、ＧＡＲトランスホルミラーゼ、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼが挙げられる。前記化合物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤として特に活性であるように思われる。前記化合物は、単独でまたは組み合わせて、絨毛癌、白血病、女性乳房の腺癌、頭部および頸部の表層の癌、扁平上皮癌または小細胞癌、および種々のリンパ肉腫などの、従来はメトトレキサートで治療されてきた新生物を治療するために用いられうる。理論に拘束されるわけではないが、式Ｉの化合物の修飾されたケトメチレン性またはチオケトメチレン性の側鎖により、メトトレキサートに比べて腎毒性が低減されるものと考えられる。前記ケトメチレン性またはチオケトメチレン性の基の不安定性はより低いため、加水分解による不活性化は最小限であり、これにより半減期は長くなる。また、式Ｉの化合物においては、従来技術と比較して物理化学的な性質が改善されている。
【００７４】
上述したように、癌細胞は健常な細胞よりも急速に複製するためにより多くのヌクレオチドを必要とすることから、本発明の化合物における主要な関心は、癌の治療における使用に関する。しかしながら、急速に増殖する細胞は全て、ヌクレオチドに対して類似の高い要求性を示すことから、本発明の化合物の治療上の有用性はこれに限られない。例えば、メトトレキサートは乾癬および菌状息肉腫の治療、および子宮外妊娠の患者における流産の誘導に用いられてきた。メトトレキサートはまた、慢性関節リウマチの治療にも用いられてきた。ただし、この例における作用のメカニズムは完全には判明していない。
【００７５】
本発明の化合物は、新生物に罹患して治療を必要としている哺乳動物（好ましくは、ヒト）に対し、単独で、または他の抗癌剤もしくはステロイドなどの他の治療剤と組み合わせて、経口または好ましくは非経口のいずれかで投与されうる。非経口の投与経路としては、筋肉内、髄腔内、静脈内または動脈内が挙げられる。
【実施例】
【００７６】
本発明がより完全に理解されるように、添付の図面を参照しながら実施例により本発明を説明する。ここで、以下の実施例１および２に詳細に記載されるように、図１は本発明による２つの化合物（化合物３および４）の全合成の模式図である。
【００７７】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明をいかようにも制限するものではない。
【００７８】
実施例１
化合物３の合成
出発物質の入手源
３−クロロプロパノイルクロライドおよびエチルシアノアセテートは、シグマ−アルドリッチ カンパニー リミテッド（ジ オールド ブリックヤード、ニュー ロード、ジリンガム、ドルセット ＳＰ８ ４ＸＴ、イギリス）より購入し、または常法により合成した。α−ブロモ−ｐ−ニトロ−アセトフェノン（７）は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で臭素を用いたｐ−ニトロアセトフェノンの臭素化により得た。２，４−ジアミノ−６−ブロモメチルプテリジン（２）は、常法により得た（例えば、米国特許第４，０７７，９５７号および米国特許第４，２２４，４４６号を参照）。
【００７９】
段階Ａ：
化合物６の合成
ピリジンまたはトリエチルアセテートの存在下で、エタノールを用いて３−クロロプロパノイルクロライドをエステル化して、３−クロロプロピオン酸エチル（５）を製造した。Ｌ．Ｒｕｚｉｃｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １７，１８３−２００（１９３４），ＣＡ ２８：２５８４，またはＫｏｅｌｓｃｈ，Ｃ．Ｆ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．６５，２４５８−９（１９４３）の手法に従い、３−クロロプロピオン酸エチル（５）をエチルシアノアセテートと縮合させて、α−シアノグルタル酸ジエチル（６）を形成した。１Ｈ−ＮＭＲにより予想される構造を確認した。ＧＣ：純度９７％。
【００８０】
段階Ｂ：
化合物８の合成
０〜５℃にて、１７５ｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のα−ブロモ−ｐ−ニトロ−アセトフェノン（７）を、１７５ｇ（０．８２ｍｍｏｌ）のα−シアノグルタル酸ジエチル（６）および１７５ｇ（３ｍｍｏｌ）のＫＦの５００ｍＬ ＤＭＦ中の懸濁液に分割して添加した。この反応を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によりモニターした。４時間後、０．１％の酢酸を含有するｐＨ５の水２Ｌに反応混合物を懸濁させた。水をデカンテーションした後、水（２×７５０ｍＬ）で粘着性の沈殿物を洗浄し、次いでメタノール３００ｍＬで練和した。結晶化が完了したら、沈殿物を濾過し、過剰のメタノールおよびエーテルで連続的に洗浄し、融点９２．１℃の黄色固体である、化合物８を２１０ｇ得た（収率６８％）。シリカゲルでのクロマトグラフィ（ベンゼン：シクロヘキサン：エタノール＝５０：５０：５）後、生成物の融点は９９．７℃であった。
【００８１】
シリカゲルプレート上でのＴＬＣ（ベンゼン：エタノール：シクロヘキサン：石油エーテル：酢酸＝５：１：３：１０：０．１）ではＲｆ（保持因子）０．３８の単一のスポットが確認された。ＨＰＬＣ：純度９７％。
【００８２】
段階Ｃ：
化合物９の合成
３０ｇ（０．０８ｍｍｏｌ）の化合物（８）をメタノール４００ｍＬに溶解させ、６ｇの２０％Ｐｄ／Ｃ触媒の存在下、室温にて水素化フラスコ中で水素化した。理論体積の水素（ｃ．６２００ｍＬ；０．２８ｍｍｏｌ）が１時間で吸収された（ＴＬＣコントロール）。白金触媒を濾過し、メタノールを蒸発させた。得られた粗生成物を真空乾燥により固化させて、黄色固体である化合物（９）を２７．６ｇ得て（収率９９％）、これをさらに精製することなく後述する未精製の化合物（１０）への変換に用いた。純度はＴＬＣ分析に使用可能な値であった。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．５の単一のスポットが確認された（４−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの特徴的な反応）。塩酸中で還流後、塩酸塩を単離した。ＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲにより、予想される構造を確認した。ＨＰＬＣ：純度９９％。
【００８３】
段階Ｄ：
化合物１０の合成
メタノール１０００ｍＬ中の５２．２ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）の中間体（９）の溶液を調製した。６Ｎ ＮａＯＨ１８８ｍＬを、室温にて１時間かけて滴下し、その溶液を１２時間静置した。次いで、水３００ｍＬでこの反応混合物を希釈し、高真空下で濃縮した。残渣に３７％塩酸７００ｍＬを添加し、得られた混合物を加熱して４時間還流した。
【００８４】
メタノール１．５Ｌで、得られた混合物を希釈し、塩化ナトリウムの沈殿を濾過により除去した。この濾液を段階Ｅにおいて用いた。希釈前に、懸濁液を濾過し、過剰の水、アセトンおよびエーテルで連続的に沈殿物を洗浄することにより少量の二塩基酸（１０）を単離した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．２６の単一のスポットが確認された。
【００８５】
段階Ｅ：
化合物１の合成
段階Ｄにおいて得られたジカルボン酸（１０）のメタノール溶液を０〜５℃に冷却し、塩化チオニル１００ｍＬを滴下した。反応混合物を還流下で３時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、溶媒を蒸発留去した。得られた沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄して、融点１１５〜１１６℃の固体である化合物１を２７ｇ得た（収率６３％）。
【００８６】
テトラヒドロフランからの再結晶後、１１６〜１１７℃の融点を有する化合物１の白色結晶１７．５ｇを得た。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．７３の単一のスポットが確認された。ＵＶスペクトル：２３４、３１９ｎｍ（メタノール）。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：２．０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），２．５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），３．１（２Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２），３．５（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２ＣＨ），３．７５（６Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），７．６−８．０（４Ｈ，ｍ，ＣＨ原子）。ＨＰＬＣ：純度９９％
段階Ｆ：
Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］シュードグルタミン酸エステル（化合物３）の合成
７ｇ（２７．４ｍｍｏｌ）の２，４−ジアミノ−６−ブロモメチルプテリジン（２）および７ｇ（２３．４ｍｍｏｌ）のＮ−［（４−メチルアミノ）ベンゾイル］シュードグルタミン酸ジメチル（１）の７０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中での混合物を７０℃にて３０分間撹拌し、次いで室温にて一晩、遮光下で静置し、次いで１００℃に１０分間再度加熱した。この反応をＴＬＣにより制御した。冷却後、酢酸でｐＨ４に酸性化された水（１０００ｍＬ）に反応混合物を注いだ。生成した黄褐色の沈殿物を濾過し、水で３回洗浄し、空気乾燥させた。２．６ｇの橙黄色の生成物（３）を得た（融点２００〜２１０℃）。１０％ＮａＨＣＯ３で濾液を処理し、生成した沈殿物を同様に分離して、ジメチルエステル（３）の第２の画分を得た（２ｇ）。合計収率：３６％。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．４８の単一のスポットが確認された。ＵＶスペクトル：２１０、２４２、３３２（０．１Ｎ塩酸）；２３８、３３５（メタノール）。
【００８７】
実施例２
Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］シュードグルタミン酸（化合物４）の合成
１ｇ（２．１ｍｍｏｌ）のジメチルエステル（３）を、２Ｎ ＮａＯＨ１０ｍＬおよびエタノール２５ｍＬの溶液に分割して添加し、混合物を室温にて４時間撹拌した。生成した沈殿物を濾過し、蒸留水に溶解させた。このアルカリ溶液を活性炭で処理し、濾過し、１０％酢酸でｐＨを４．５に調整した。沈殿物を濾過し、ｐＨ４．５の水、次いでアセトンで洗浄して、化合物４を０．８ｇ得た（収率８５％）。茶色の固体である生成物を、分取ＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィ）により精製した。ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ−ＮＨ４ＯＨ（５０：５０：５）で溶離した後、ｐＨ８のＮａＯＨ溶液１００ｍＬでシリカゲルから二塩基酸を抽出した。凍結乾燥により水分を除去した。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＮＨ４ＯＨ＝７：２：１）ではＲｆ０．８０の単一のスポットが確認された。質量スペクトル：ｍ／ｚ １２０（Ｍ＋，１００％）。ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：１６５１（ＣＯＣＨ２）、１５９４（Ｃ＝Ｃ）、１５６３、１４０３（Ｃ＝Ｏ酸）、１１７６（Ｃ−Ｏ）、８２３（ＣＨ）。ＵＶスペクトル：２４２、３３２ｎｍ（０．１Ｎ塩酸）；２３２、２５９、３２５ｎｍ（０．１Ｎ ＮａＯＨ）；２２９、２６２、３１８（メタノール）。１Ｈ−ＮＭＲ：１．６（３Ｈ，ｍ，ＣＨ−ＣＨ２）、２．２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２．９（２Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２）、４．６（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２ＮＨ）、６．８−７．８（４Ｈ，ｍ，ＣＨ原子）、９（１Ｈ，ｓ，７−ＣＨ）。ＨＰＬＣ：純度９７％。
【００８８】
式Ｉの他の化合物は、上述した手法を適宜適応させることにより、製造されうる。例えば、中間体（１）および類似体化合物は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムとの反応により、対応するＮ−メチル誘導体に変換されうる。また、中間体（６）は、常法に従ってシアノ酢酸エチルをアクリル酸エチルと反応させることにより、製造されうる。
【００８９】
実施例３
インビトロでのＤＨＦＲの阻害
式Ｉの化合物のインビトロでのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）阻害能を、標準的なＤＨＦＲ酵素阻害アッセイを用いて測定した。ＤＨＦＲ酵素についてはラット肝から精製し、または、大腸菌での組換え発現により製造された市販のＤＨＦＲを用いた。酵素活性のアッセイは、５０ｍＭ Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７５μＭ ２−メルカプトエタノール、０．１％ウシ血清アルブミン、２０μＭジヒドロ葉酸および１００μＭ ＮＡＤＰＨを含有する溶液の３４０ｎｍでのＵＶ吸光度の変化を、３７℃にてモニターすることにより行った。ジヒドロ葉酸を添加することにより、反応が開始した。各阻害剤の力価を２回ずつ測定し、平均のＤＨＦＲ活性を阻害剤濃度に対してプロットして、ＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０（化合物）／ＩＣ５０（ＭＴＸ）の比を相対ＩＣ５０と定義し、化合物４３８および化合物４９７についての（５つのうちの）１つの代表的な実験のメトトレキサート（ＭＴＸ）と比較した結果を表１に示す。得られた結果を全体的に見ると、試験した式Ｉの化合物の多くがインビトロでＭＴＸに類似の活性を有していることが示唆される。
【００９０】
【表２】
【００９１】
注：化合物４３８は、Ｒ３（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）がＨに置換されていること以外は、図１の化合物４と同一の構造を有する。
【００９２】
実施例４
インビトロでの細胞毒性
薬剤添加後の７２時間までの異なる時点での細胞の生存率を測定することにより、多数の腫瘍細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＫＢ、Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＣＯＬＯ２０５）に対する式１の化合物の細胞毒性を評価し、メトトレキサートおよびペメトレキセド（アリムタ（登録商標）として入手）の対応する細胞毒性と比較した。式Ｉの化合物は、試験した全ての細胞株の増殖に対して強力な阻害効果を示し、最も強い阻害効果はＬ１２１０細胞株に対するものであった。メトトレキサートおよびペメトレキセドと比較すると、式Ｉの化合物は全ての細胞株に対して類似かより強い阻害効果を示し、細胞毒性の発現がより速い場合もあった。さらに、Ｂが−ＣＨ２ＮＨ−である式Ｉの化合物が特に強い細胞毒性を示すことが判明した。
【００９３】
ヒポキサンチンなどのプリン類やアミノイミダゾールカルボキサミドを（非常に高濃度まで）添加しても、細胞毒性は元に戻らなかったが、ロイコボリンを添加すると細胞毒性が元に戻った。これは、細胞毒性が葉酸に関連したメカニズムへの拮抗によるものであることを示す。ＤＨＦＲが主要な標的である提案された作用メカニズムと一致するように、チミジンの添加では高濃度の場合にのみ、式Ｉの化合物により誘導された細胞毒性は元に戻った。これらの効果によれば、プリンのデノボ合成が特異的に阻害され、メトトレキサートの場合よりは顕著であるものの、チミジル酸サイクルはあまり大きく阻害されないことが示される。式Ｉの化合物はまた、メトトレキサートに匹敵する濃度範囲でグリシンアミドリボヌクレオチドトランスフェラーゼをも阻害した。
【００９４】
実施例５
動物モデルにおけるインビボでの腫瘍阻害
式Ｉの化合物のマウスにおける腫瘍増殖阻害能を、以下のようにして試験した。ＤＢＡ／２マウス（８匹のマウス／処理の群）の腋窩部に、５×１０６個のＬ１２１０細胞を皮下注射した。生理食塩水単独、または式Ｉの化合物を含有する生理食塩水を腹腔内投与した後、所定の時間に（生理食塩水のみを投与された）コントロールの腫瘍の長さおよび幅を測定し、試験化合物を投与された動物の値と比較して、阻害百分率を算出した。１日１回６日間の試験化合物含有生理食塩水の腹腔内投与により、６０％で腫瘍が消失して長期間生存に至った（腫瘍重量がゼロ）。生理食塩水処理したコントロール動物および化合物４（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した動物の生存期間の中央値は、それぞれ６．７日および１５．６日であった。化合物の経口投与では高用量の阻害剤が必要とされ、それほど顕著ではないが依然として有意な腫瘍重量の減少および２５％の長期生存が、食塩水処理のコントロール群と比較すると見られた。
【００９５】
式Ｉの化合物はまた、癌腫Ｗ２５６（ＴＧＩ＝２８％）に対してもインビボで活性を示した。これはおそらく、他の抗葉酸剤と比較して高い溶解性とこれに起因する腫瘍への受動輸送による。ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）−２５６ラット腫瘍モデルにおいて、生理食塩水処理したコントロール動物および化合物４（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した動物の生存期間の中央値は、それぞれ２２．５日および４６．３日超であった。
【００９６】
以下の異なる処理計画により腫瘍の進展を評価した。その結果を表２に示す。
【００９７】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明による２つの化合物（化合物３および４）の全合成の模式図である。
【技術分野】
【０００１】
明細書
本発明は、新規な一連の化合物に関する。特に本発明は、本来の基質が葉酸または葉酸誘導体（葉酸塩）である酵素を阻害し、癌のような疾患の治療に用いられうる新規な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は他の多くの細胞よりも急速に複製することから、より多くのヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の前駆体）を必要とする。全ての細胞が常に剰余のヌクレオチド（アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を除く）を貯蔵しているわけではないため、ヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡの合成の間、継続的に合成される必要がある。従って、癌細胞の複製はヌクレオチド生合成の阻害に対して健常な細胞の複製よりも感受性が高くなりがちであり、このため、かような阻害が可能な治療剤が関心を集めつつある。
【０００３】
ヌクレオチドは、基本的な代謝前駆体からデノボ経路を経て、あるいは、核酸分解の生成物である遊離塩基およびヌクレオシドが再利用されるサルベージ経路を経て、生物学的に合成されうる。新規な化学治療剤の探索に関して主に関心を集めているのは、デノボ経路である。
【０００４】
ヌクレオチドである２’−デオキシアデノシン−５’−一リン酸（ｄＡＭＰ）および２’−デオキシグアノシン−５’−一リン酸（ｄＧＭＰ）はともに、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）から新たに合成され、このＩＭＰは５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸（ＰＰＲＰ）由来である。このＰＰＲＰとＩＭＰとの間の生合成経路に関与している２つの酵素は、ＧＡＲトランスホルミラーゼおよびＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼである。以下に示すように、ＧＡＲトランスホルミラーゼは、Ｎ１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸を用いてグリシンアミドリボヌクレオチド（ＧＡＲ）をホルミルグリシンアミドリボヌクレオチド（ＦＧＡＲ）に変換する。一方、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼは、同じ化合物を用いて５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）をＮ−ホルミルアミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＦＡＩＣＡＲ）に変換する。
【０００５】
【化１】
【０００６】
これに対し、ヌクレオチドである２’−デオキシチミジン−５’−一リン酸（ｄＴＭＰ）は、２’−デオキシウリジン−５’−一リン酸（ｄＵＭＰ）からデノボ合成により製造される。これは、酵素であるチミジル酸シンターゼにより触媒される変換反応である。この変換反応において、Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は７，８−ジヒドロ葉酸へと還元される。そして、Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は、酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを用いてテトラヒドロ葉酸を経由して再生される。これらのプロセスを以下に図示する。
【０００７】
【化２】
【０００８】
これらのメカニズムの阻害が、癌の治療に利用されている。例えば、米国特許第２，５１２，５７２号には、「葉酸拮抗薬」に分類され、本来の基質よりも約１００倍高い親和性で結合してジヒドロ葉酸レダクターゼを競合的に阻害し、ｄＴＭＰの合成に必須のテトラヒドロ葉酸の再生を阻害することによりＤＮＡ合成を阻害する、強力な化学治療剤であるメトトレキサートを含む多くの置換プテリジン類が開示されている。これにより、癌細胞においていわゆる「チミン欠乏死」が誘導される。メトトレキサートはまた、程度は小さいものの、ＧＡＲトランスホルミラーゼ、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼおよびチミジル酸シンターゼをも阻害する。メトトレキサートおよび他の関連する抗葉酸剤の構造を以下に示す。
【０００９】
【表１】
【００１０】
米国特許第４，６８４，６５３号には、式：
【００１１】
【化３】
【００１２】
式中、Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２であり、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基である、
の化合物およびその対応する５，６，７，８−テトラヒドロ誘導体が開示されている。これらの化合物は、葉酸およびその代謝誘導体を基質として利用する１または２以上の酵素に対して効果を有することが開示されている。
【００１３】
米国特許第５，３４４，９３２号には、式：
【００１４】
【化４】
【００１５】
式中、Ｒ５は、水素原子またはＮＨ２であり、Ｒ４は、水素原子またはメトキシ基であり、Ｒ２は、水素原子または製薬上許容されうるカチオンである、
のグルタミン酸誘導体が開示されており、これらの化合物が、葉酸およびその代謝誘導体を基質として利用する１または２以上の酵素に対して阻害効果を有することが開示されている。
【００１６】
米国特許４，０７７，９５７号には：
【００１７】
【化５】
【００１８】
を含む種々のプテリジン化合物の合成方法が開示されている。
【００１９】
かような化合物は、癌治療のための新たな治療戦略の開発に有用であることが判明しているが、効果が小さい、ある患者ではかような薬物に対してもともと耐性がある、または後天的に耐性となる、毒性や好ましくない副作用があるといった、使用に関連した多くの問題が依然として存在する。従って、癌の治療に用いられることができ、上述した問題の１または２以上を解消しうる代替化合物に対する要求は依然として残っている。
【発明の開示】
【００２０】
従って、本発明の第１の形態によれば、式Ｉの化合物、またはその製薬上許容されうる塩：
【００２１】
【化６】
【００２２】
式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり；
ｎは、１〜３であり；
Ｒ３は、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ８、−Ｃ（ＮＨ）ＳＲ８、または−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は水素原子もしくはアルキル基である）であり；
Ｒ４は、水素原子、−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５（ここで、Ｒ５は、それぞれ独立してＲ３の定義のいずれかを有する）であり；
Ｂは、−ＮＲ２−、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−（ここで、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、Ｒ７は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基もしくはアルコキシ基である）であり；
Ａは：
【００２３】
【化７】
【００２４】
式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
ＣおよびＤは、それぞれ独立して、１または２以上のヘテロ原子を含んでもよい、５員または６員の、置換されたまたは非置換の、芳香族環または非芳香族環であり、Ｃは任意の可能な位置で基Ｂと結合している、
である、
が提供される。
【００２５】
本発明の第２の形態によれば、治療に使用される、本発明の第１の形態の化合物が提供される。
【００２６】
本発明の第３の形態によれば、本発明の第１または第２の形態の化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明の第４の形態によれば、葉酸または葉酸誘導体に依存性の酵素の阻害に応答性の症状の治療に用いられる医薬の製造のための、本発明の第１または第２の形態の化合物の使用が提供される。
【００２８】
本発明の第５の形態によれば、癌の治療に用いられる医薬の製造のための、本発明の第１または第２の形態の化合物の使用が提供される。
【００２９】
本発明の第６の形態によれば、以下の段階：
（ａ）式ＩＩの化合物：
【００３０】
【化８】
【００３１】
式中、Ａは上記と同様の定義であり、ｍは、０、１または２であり、Ｘは脱離基である、
を、式ＩＩＩの化合物：
【００３２】
【化９】
【００３３】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は上記と同様の定義である、
と反応させる段階；
（ｂ）式ＩＶの化合物：
【００３４】
【化１０】
【００３５】
式中、Ａは上記と同様の定義であり、Ｘは脱離基である、
を、式Ｖの化合物：
【００３６】
【化１１】
【００３７】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ３およびＲ４は上記と同様の定義である、
と反応させる段階；あるいは、
（ｃ）以下の化合物ＶＩまたはＶＩＩ：
【００３８】
【化１２】
【００３９】
式中、Ａ、Ｚ、ｎ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は上記と同様の定義であり、いずれの場合においても、Ｙは独立してハロゲン原子である、
の一方を、対応する有機金属試薬に変換させ、前記有機金属試薬を化合物ＶＩまたはＶＩＩの他方と反応させる段階、
を有する、本発明の第１または第２の形態の化合物の製造方法が提供される。
【００４０】
本発明の第７の形態によれば、式ＩＩ−Ａの化合物：
【００４１】
【化１３】
【００４２】
式中、Ｘは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
を、式ＩＩＩ−Ａの化合物：
【００４３】
【化１４】
【００４４】
と反応させる段階を有する、式Ｉ−Ａ：
【００４５】
【化１５】
【００４６】
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、上記と同様の定義である、
を有する、本発明の第１または第２の形態の化合物またはその製薬上許容されうる塩の製造方法が提供される。
【００４７】
本発明の第８の形態によれば、上記で定義され、Ｒ４が−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５である場合を除く、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの化合物が提供される。
【００４８】
本発明の種々の形態のいずれかの発明の好ましい実施形態を以下に記載し、または従属項において規定する。
【００４９】
本発明の種々の形態の全てにおいて、Ｃ＊とマークされた炭素は不斉炭素であってもよく（Ｒ４が水素原子ではない場合）、この場合、式Ｉの化合物は、ラセミ体の形態で存在しても、常法によりその（＋）または（−）光学異性体に分離されてもよいことは当然である。また、いくつかの化合物では、他のキラル中心が存在して１または２以上の別の光学異性体のペアを生じてもよい。例えば、Ｂが−ＣＨ２ＣＨＲ７−であり、Ｒ７がＣ１−３のアルキル基またはアルコキシ基である化合物においては、第２のキラル中心が存在する。かようなラセミ体の形態または光学異性体の形態は全て、本発明の技術的範囲に含まれるものである。さらに、式Ｉの化合物は、１または２以上の互変異性体の形態で存在してもよいことは理解されるであろうし、これらの形態のそれぞれもまた、本発明の技術的範囲に含まれるものである。
【００５０】
以下により詳細に記載される通り、式Ｉの化合物は葉酸の構造類似体であり、インビトロでメトトレキサートに匹敵するレベルで、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のような葉酸または葉酸誘導体（葉酸塩）に依存性の酵素の阻害剤としての作用を有することが判明したのである。式Ｉの化合物はまた、動物モデルにおいてインビボでも腫瘍の増殖を阻害する活性を有することが判明している。ここではメカニズムの詳細は割愛するが、後者の活性は、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬として作用する当該化合物の活性に起因するかもしれないことが予想される。式Ｉの化合物は、癌や、葉酸または葉酸誘導体に依存性の酵素の阻害に応答性の症状の治療に用いられうる。
【００５１】
式Ｉの好ましい化合物は、以下の条件の１または２以上を満たす：
ＺがＯである；
ｎが１である；
Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ４が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ８である；
Ｒ８が、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基であり、好ましくは水素原子、メチル基またはエチル基であり、より好ましくは水素原子である；
Ｂが、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−であり、好ましくは−ＣＨ２ＮＲ２−である；
Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、好ましくは水素原子である；
Ｒ７が、水素原子、メチル基、エチル基またはメトキシ基であり、好ましくは水素原子である。
【００５２】
また、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの好ましい化合物は、上述したＺ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４および／またはＲ７の１または２以上の好ましい規定を有する。
【００５３】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＶまたはＶＩの基Ａにおいて、Ｄは、好ましくは５員のヘテロ芳香族環である。好ましくは、Ａは：
【００５４】
【化１６】
【００５５】
である。
【００５６】
基Ａにおいて、Ｃは、以下の基（隣接する環および基Ｂに結合する点を示す）の１つであってもよい：
【００５７】
【化１７】
【００５８】
式中、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、かつ、ＹがＣであり、Ｒ６が水素原子、メチル基、エチル基またはＨＣＯであるか、ＹがＮであり、Ｒ６が孤立電子対である、のいずれかである。好ましい実施形態において、ＸおよびＹはともにＮであり、Ｒ６は孤立電子対である。
【００５９】
特に好ましい基Ａは、天然のプテリジン類および他のへテロ環塩基に極めて類似した、以下の構造を有する：
【００６０】
【化１８】
【００６１】
特に関心を集めているのは、以下の２つのＡ基である：
【００６２】
【化１９】
【００６３】
上述した２つのＡ基を有し、Ｂが−ＣＨ２ＮＲ２−であり、Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、ＺがＯであり、ｎが１であり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、好ましくは加水分解可能な任意のエステル基である、式Ｉの化合物が特に好ましい。この群の化合物の個別の例としては、以下のものが挙げられる：
【００６４】
【化２０】
【００６５】
式Ｉの化合物は、容易に入手可能で安価な出発物質から、本発明の方法により製造されうる。例えば、Ｂが−ＮＲ２−、−ＣＨ２ＮＲ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ２−である場合に、式Ｉの化合物は、式ＩＩの化合物を式ＩＩＩの化合物とカップリングさせることにより製造されうる。脱離基Ｘは、一般的には塩素、臭素またはヨウ素などのハロゲンであり、特には臭素またはヨウ素である。この反応は、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）などの双極性非プロトン性溶媒中で行われうる。フッ化カリウムなどの塩基性触媒が用いられてもよく、これにより第３級アミンまたは重炭酸ナトリウムと比べて高い収率が得られる。必要であれば、上記の反応前に、本技術分野において公知の適切な保護基を用いて反応性の高い基を保護し、後に、常法により脱保護してもよい。例えば、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈである場合、これらの酸基は、例えばメチルエステル基により保護され、その後にエタノール中での水酸化ナトリウムを用いたアルカリ加水分解などの公知の手法により脱保護され、氷酢酸などの酸の添加により沈殿しうる。従って、式ＩＩおよび式ＩＩＩの化合物のいずれかまたは双方が保護された形態であるこれらの化合物の反応は、本発明の方法に包含されることが理解されうるであろう。
【００６６】
Ｂが−ＣＨ２Ｏ−である場合において、式Ｉの化合物は、例えば、式ＩＶの化合物を、ウィリアムソンエーテル型反応により式Ｖの化合物とカップリングさせることにより製造されうる。この反応において、式Ｖの化合物は一般的に、式ＩＶの化合物との反応前に、例えばＮａＨなどの塩基を用いてアロキシド（ａｒｏｘｉｄｅ）イオンの形態に変換される。Ｘは、任意の適切な脱離基であればよく、特にはハロゲン原子である。
【００６７】
Ｂが−ＣＨ２ＣＨＲ７−である場合において、式Ｉの化合物は、例えば、式ＶＩの化合物を、任意の公知の炭素−炭素結合形成反応により式ＶＩＩの化合物とカップリングさせることにより製造されることができ、特にこれらの反応は、グリニャール試薬やリチウム化合物または銅−リチウム化合物などの有機金属試薬の使用または生成を伴う。例えば、式ＶＩＩの化合物を、対応するグリニャール試薬またはリチウム銅酸化物試薬に変換し、式ＶＩの化合物と反応させてもよい。あるいは、式ＶＩの化合物を、対応するグリニャール試薬またはリチウム銅酸化物試薬に変換し、式ＶＩＩの化合物と反応させてもよい。上述した通り、反応性の置換基のための適切な保護基は、本技術分野の当業者に周知であろう。
【００６８】
中間体ＩＩ〜ＶＩＩは、従来の手法により製造されうる。一例を挙げると、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの化合物は、式：
【００６９】
【化２１】
【００７０】
の化合物を、式：
【００７１】
【化２２】
【００７２】
式中、Ｂ’は、−ＮＨＲ２、−ＯＨまたは−ＣＨＹＲ７であり、Ｘは脱離基である、
の化合物と、塩基の存在下で反応させることにより製造されうる。これに続き、必要であれば適切な保護基を用いて、加水分解および脱炭酸によりシアノ基を除去してもよい。
【００７３】
式Ｉの化合物は、葉酸、特に葉酸の代謝誘導体を基質として利用する１または２以上の酵素に対し、阻害作用を有する。これらの酵素としては、ＧＡＲトランスホルミラーゼ、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼが挙げられる。前記化合物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤として特に活性であるように思われる。前記化合物は、単独でまたは組み合わせて、絨毛癌、白血病、女性乳房の腺癌、頭部および頸部の表層の癌、扁平上皮癌または小細胞癌、および種々のリンパ肉腫などの、従来はメトトレキサートで治療されてきた新生物を治療するために用いられうる。理論に拘束されるわけではないが、式Ｉの化合物の修飾されたケトメチレン性またはチオケトメチレン性の側鎖により、メトトレキサートに比べて腎毒性が低減されるものと考えられる。前記ケトメチレン性またはチオケトメチレン性の基の不安定性はより低いため、加水分解による不活性化は最小限であり、これにより半減期は長くなる。また、式Ｉの化合物においては、従来技術と比較して物理化学的な性質が改善されている。
【００７４】
上述したように、癌細胞は健常な細胞よりも急速に複製するためにより多くのヌクレオチドを必要とすることから、本発明の化合物における主要な関心は、癌の治療における使用に関する。しかしながら、急速に増殖する細胞は全て、ヌクレオチドに対して類似の高い要求性を示すことから、本発明の化合物の治療上の有用性はこれに限られない。例えば、メトトレキサートは乾癬および菌状息肉腫の治療、および子宮外妊娠の患者における流産の誘導に用いられてきた。メトトレキサートはまた、慢性関節リウマチの治療にも用いられてきた。ただし、この例における作用のメカニズムは完全には判明していない。
【００７５】
本発明の化合物は、新生物に罹患して治療を必要としている哺乳動物（好ましくは、ヒト）に対し、単独で、または他の抗癌剤もしくはステロイドなどの他の治療剤と組み合わせて、経口または好ましくは非経口のいずれかで投与されうる。非経口の投与経路としては、筋肉内、髄腔内、静脈内または動脈内が挙げられる。
【実施例】
【００７６】
本発明がより完全に理解されるように、添付の図面を参照しながら実施例により本発明を説明する。ここで、以下の実施例１および２に詳細に記載されるように、図１は本発明による２つの化合物（化合物３および４）の全合成の模式図である。
【００７７】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明をいかようにも制限するものではない。
【００７８】
実施例１
化合物３の合成
出発物質の入手源
３−クロロプロパノイルクロライドおよびエチルシアノアセテートは、シグマ−アルドリッチ カンパニー リミテッド（ジ オールド ブリックヤード、ニュー ロード、ジリンガム、ドルセット ＳＰ８ ４ＸＴ、イギリス）より購入し、または常法により合成した。α−ブロモ−ｐ−ニトロ−アセトフェノン（７）は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で臭素を用いたｐ−ニトロアセトフェノンの臭素化により得た。２，４−ジアミノ−６−ブロモメチルプテリジン（２）は、常法により得た（例えば、米国特許第４，０７７，９５７号および米国特許第４，２２４，４４６号を参照）。
【００７９】
段階Ａ：
化合物６の合成
ピリジンまたはトリエチルアセテートの存在下で、エタノールを用いて３−クロロプロパノイルクロライドをエステル化して、３−クロロプロピオン酸エチル（５）を製造した。Ｌ．Ｒｕｚｉｃｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １７，１８３−２００（１９３４），ＣＡ ２８：２５８４，またはＫｏｅｌｓｃｈ，Ｃ．Ｆ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．６５，２４５８−９（１９４３）の手法に従い、３−クロロプロピオン酸エチル（５）をエチルシアノアセテートと縮合させて、α−シアノグルタル酸ジエチル（６）を形成した。１Ｈ−ＮＭＲにより予想される構造を確認した。ＧＣ：純度９７％。
【００８０】
段階Ｂ：
化合物８の合成
０〜５℃にて、１７５ｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のα−ブロモ−ｐ−ニトロ−アセトフェノン（７）を、１７５ｇ（０．８２ｍｍｏｌ）のα−シアノグルタル酸ジエチル（６）および１７５ｇ（３ｍｍｏｌ）のＫＦの５００ｍＬ ＤＭＦ中の懸濁液に分割して添加した。この反応を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によりモニターした。４時間後、０．１％の酢酸を含有するｐＨ５の水２Ｌに反応混合物を懸濁させた。水をデカンテーションした後、水（２×７５０ｍＬ）で粘着性の沈殿物を洗浄し、次いでメタノール３００ｍＬで練和した。結晶化が完了したら、沈殿物を濾過し、過剰のメタノールおよびエーテルで連続的に洗浄し、融点９２．１℃の黄色固体である、化合物８を２１０ｇ得た（収率６８％）。シリカゲルでのクロマトグラフィ（ベンゼン：シクロヘキサン：エタノール＝５０：５０：５）後、生成物の融点は９９．７℃であった。
【００８１】
シリカゲルプレート上でのＴＬＣ（ベンゼン：エタノール：シクロヘキサン：石油エーテル：酢酸＝５：１：３：１０：０．１）ではＲｆ（保持因子）０．３８の単一のスポットが確認された。ＨＰＬＣ：純度９７％。
【００８２】
段階Ｃ：
化合物９の合成
３０ｇ（０．０８ｍｍｏｌ）の化合物（８）をメタノール４００ｍＬに溶解させ、６ｇの２０％Ｐｄ／Ｃ触媒の存在下、室温にて水素化フラスコ中で水素化した。理論体積の水素（ｃ．６２００ｍＬ；０．２８ｍｍｏｌ）が１時間で吸収された（ＴＬＣコントロール）。白金触媒を濾過し、メタノールを蒸発させた。得られた粗生成物を真空乾燥により固化させて、黄色固体である化合物（９）を２７．６ｇ得て（収率９９％）、これをさらに精製することなく後述する未精製の化合物（１０）への変換に用いた。純度はＴＬＣ分析に使用可能な値であった。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．５の単一のスポットが確認された（４−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの特徴的な反応）。塩酸中で還流後、塩酸塩を単離した。ＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲにより、予想される構造を確認した。ＨＰＬＣ：純度９９％。
【００８３】
段階Ｄ：
化合物１０の合成
メタノール１０００ｍＬ中の５２．２ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）の中間体（９）の溶液を調製した。６Ｎ ＮａＯＨ１８８ｍＬを、室温にて１時間かけて滴下し、その溶液を１２時間静置した。次いで、水３００ｍＬでこの反応混合物を希釈し、高真空下で濃縮した。残渣に３７％塩酸７００ｍＬを添加し、得られた混合物を加熱して４時間還流した。
【００８４】
メタノール１．５Ｌで、得られた混合物を希釈し、塩化ナトリウムの沈殿を濾過により除去した。この濾液を段階Ｅにおいて用いた。希釈前に、懸濁液を濾過し、過剰の水、アセトンおよびエーテルで連続的に沈殿物を洗浄することにより少量の二塩基酸（１０）を単離した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．２６の単一のスポットが確認された。
【００８５】
段階Ｅ：
化合物１の合成
段階Ｄにおいて得られたジカルボン酸（１０）のメタノール溶液を０〜５℃に冷却し、塩化チオニル１００ｍＬを滴下した。反応混合物を還流下で３時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、溶媒を蒸発留去した。得られた沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄して、融点１１５〜１１６℃の固体である化合物１を２７ｇ得た（収率６３％）。
【００８６】
テトラヒドロフランからの再結晶後、１１６〜１１７℃の融点を有する化合物１の白色結晶１７．５ｇを得た。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．７３の単一のスポットが確認された。ＵＶスペクトル：２３４、３１９ｎｍ（メタノール）。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：２．０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），２．５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），３．１（２Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２），３．５（１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２ＣＨ），３．７５（６Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），７．６−８．０（４Ｈ，ｍ，ＣＨ原子）。ＨＰＬＣ：純度９９％
段階Ｆ：
Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］シュードグルタミン酸エステル（化合物３）の合成
７ｇ（２７．４ｍｍｏｌ）の２，４−ジアミノ−６−ブロモメチルプテリジン（２）および７ｇ（２３．４ｍｍｏｌ）のＮ−［（４−メチルアミノ）ベンゾイル］シュードグルタミン酸ジメチル（１）の７０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中での混合物を７０℃にて３０分間撹拌し、次いで室温にて一晩、遮光下で静置し、次いで１００℃に１０分間再度加熱した。この反応をＴＬＣにより制御した。冷却後、酢酸でｐＨ４に酸性化された水（１０００ｍＬ）に反応混合物を注いだ。生成した黄褐色の沈殿物を濾過し、水で３回洗浄し、空気乾燥させた。２．６ｇの橙黄色の生成物（３）を得た（融点２００〜２１０℃）。１０％ＮａＨＣＯ３で濾液を処理し、生成した沈殿物を同様に分離して、ジメチルエステル（３）の第２の画分を得た（２ｇ）。合計収率：３６％。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝４：１）ではＲｆ０．４８の単一のスポットが確認された。ＵＶスペクトル：２１０、２４２、３３２（０．１Ｎ塩酸）；２３８、３３５（メタノール）。
【００８７】
実施例２
Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］シュードグルタミン酸（化合物４）の合成
１ｇ（２．１ｍｍｏｌ）のジメチルエステル（３）を、２Ｎ ＮａＯＨ１０ｍＬおよびエタノール２５ｍＬの溶液に分割して添加し、混合物を室温にて４時間撹拌した。生成した沈殿物を濾過し、蒸留水に溶解させた。このアルカリ溶液を活性炭で処理し、濾過し、１０％酢酸でｐＨを４．５に調整した。沈殿物を濾過し、ｐＨ４．５の水、次いでアセトンで洗浄して、化合物４を０．８ｇ得た（収率８５％）。茶色の固体である生成物を、分取ＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィ）により精製した。ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ−ＮＨ４ＯＨ（５０：５０：５）で溶離した後、ｐＨ８のＮａＯＨ溶液１００ｍＬでシリカゲルから二塩基酸を抽出した。凍結乾燥により水分を除去した。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＮＨ４ＯＨ＝７：２：１）ではＲｆ０．８０の単一のスポットが確認された。質量スペクトル：ｍ／ｚ １２０（Ｍ＋，１００％）。ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：１６５１（ＣＯＣＨ２）、１５９４（Ｃ＝Ｃ）、１５６３、１４０３（Ｃ＝Ｏ酸）、１１７６（Ｃ−Ｏ）、８２３（ＣＨ）。ＵＶスペクトル：２４２、３３２ｎｍ（０．１Ｎ塩酸）；２３２、２５９、３２５ｎｍ（０．１Ｎ ＮａＯＨ）；２２９、２６２、３１８（メタノール）。１Ｈ−ＮＭＲ：１．６（３Ｈ，ｍ，ＣＨ−ＣＨ２）、２．２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、２．９（２Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２）、４．６（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２ＮＨ）、６．８−７．８（４Ｈ，ｍ，ＣＨ原子）、９（１Ｈ，ｓ，７−ＣＨ）。ＨＰＬＣ：純度９７％。
【００８８】
式Ｉの他の化合物は、上述した手法を適宜適応させることにより、製造されうる。例えば、中間体（１）および類似体化合物は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムとの反応により、対応するＮ−メチル誘導体に変換されうる。また、中間体（６）は、常法に従ってシアノ酢酸エチルをアクリル酸エチルと反応させることにより、製造されうる。
【００８９】
実施例３
インビトロでのＤＨＦＲの阻害
式Ｉの化合物のインビトロでのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）阻害能を、標準的なＤＨＦＲ酵素阻害アッセイを用いて測定した。ＤＨＦＲ酵素についてはラット肝から精製し、または、大腸菌での組換え発現により製造された市販のＤＨＦＲを用いた。酵素活性のアッセイは、５０ｍＭ Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７５μＭ ２−メルカプトエタノール、０．１％ウシ血清アルブミン、２０μＭジヒドロ葉酸および１００μＭ ＮＡＤＰＨを含有する溶液の３４０ｎｍでのＵＶ吸光度の変化を、３７℃にてモニターすることにより行った。ジヒドロ葉酸を添加することにより、反応が開始した。各阻害剤の力価を２回ずつ測定し、平均のＤＨＦＲ活性を阻害剤濃度に対してプロットして、ＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０（化合物）／ＩＣ５０（ＭＴＸ）の比を相対ＩＣ５０と定義し、化合物４３８および化合物４９７についての（５つのうちの）１つの代表的な実験のメトトレキサート（ＭＴＸ）と比較した結果を表１に示す。得られた結果を全体的に見ると、試験した式Ｉの化合物の多くがインビトロでＭＴＸに類似の活性を有していることが示唆される。
【００９０】
【表２】
【００９１】
注：化合物４３８は、Ｒ３（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）がＨに置換されていること以外は、図１の化合物４と同一の構造を有する。
【００９２】
実施例４
インビトロでの細胞毒性
薬剤添加後の７２時間までの異なる時点での細胞の生存率を測定することにより、多数の腫瘍細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＫＢ、Ｌ１２１０、Ａ５４９およびＣＯＬＯ２０５）に対する式１の化合物の細胞毒性を評価し、メトトレキサートおよびペメトレキセド（アリムタ（登録商標）として入手）の対応する細胞毒性と比較した。式Ｉの化合物は、試験した全ての細胞株の増殖に対して強力な阻害効果を示し、最も強い阻害効果はＬ１２１０細胞株に対するものであった。メトトレキサートおよびペメトレキセドと比較すると、式Ｉの化合物は全ての細胞株に対して類似かより強い阻害効果を示し、細胞毒性の発現がより速い場合もあった。さらに、Ｂが−ＣＨ２ＮＨ−である式Ｉの化合物が特に強い細胞毒性を示すことが判明した。
【００９３】
ヒポキサンチンなどのプリン類やアミノイミダゾールカルボキサミドを（非常に高濃度まで）添加しても、細胞毒性は元に戻らなかったが、ロイコボリンを添加すると細胞毒性が元に戻った。これは、細胞毒性が葉酸に関連したメカニズムへの拮抗によるものであることを示す。ＤＨＦＲが主要な標的である提案された作用メカニズムと一致するように、チミジンの添加では高濃度の場合にのみ、式Ｉの化合物により誘導された細胞毒性は元に戻った。これらの効果によれば、プリンのデノボ合成が特異的に阻害され、メトトレキサートの場合よりは顕著であるものの、チミジル酸サイクルはあまり大きく阻害されないことが示される。式Ｉの化合物はまた、メトトレキサートに匹敵する濃度範囲でグリシンアミドリボヌクレオチドトランスフェラーゼをも阻害した。
【００９４】
実施例５
動物モデルにおけるインビボでの腫瘍阻害
式Ｉの化合物のマウスにおける腫瘍増殖阻害能を、以下のようにして試験した。ＤＢＡ／２マウス（８匹のマウス／処理の群）の腋窩部に、５×１０６個のＬ１２１０細胞を皮下注射した。生理食塩水単独、または式Ｉの化合物を含有する生理食塩水を腹腔内投与した後、所定の時間に（生理食塩水のみを投与された）コントロールの腫瘍の長さおよび幅を測定し、試験化合物を投与された動物の値と比較して、阻害百分率を算出した。１日１回６日間の試験化合物含有生理食塩水の腹腔内投与により、６０％で腫瘍が消失して長期間生存に至った（腫瘍重量がゼロ）。生理食塩水処理したコントロール動物および化合物４（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した動物の生存期間の中央値は、それぞれ６．７日および１５．６日であった。化合物の経口投与では高用量の阻害剤が必要とされ、それほど顕著ではないが依然として有意な腫瘍重量の減少および２５％の長期生存が、食塩水処理のコントロール群と比較すると見られた。
【００９５】
式Ｉの化合物はまた、癌腫Ｗ２５６（ＴＧＩ＝２８％）に対してもインビボで活性を示した。これはおそらく、他の抗葉酸剤と比較して高い溶解性とこれに起因する腫瘍への受動輸送による。ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）−２５６ラット腫瘍モデルにおいて、生理食塩水処理したコントロール動物および化合物４（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した動物の生存期間の中央値は、それぞれ２２．５日および４６．３日超であった。
【００９６】
以下の異なる処理計画により腫瘍の進展を評価した。その結果を表２に示す。
【００９７】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明による２つの化合物（化合物３および４）の全合成の模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物、またはその製薬上許容されうる塩：
【化１】
式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり；
ｎは、１〜３であり；
Ｒ３は、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ８、−Ｃ（ＮＨ）ＳＲ８、または−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は水素原子もしくはアルキル基である）であり；
Ｒ４は、水素原子、−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５（ここで、Ｒ５は、それぞれ独立してＲ３の定義のいずれかを有する）であり；
Ｂは、−ＮＲ２−、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−（ここで、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、Ｒ７は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基もしくはアルコキシ基である）であり；
Ａは：
【化２】
式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
ＣおよびＤは、それぞれ独立して、１または２以上のヘテロ原子を含んでもよい、５員または６員の、置換されたまたは非置換の、芳香族環または非芳香族環であり、Ｃは任意の可能な位置で基Ｂと結合している、
である。
【請求項２】
ＺがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが１である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ８が、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ４が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ８である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ８が、水素原子、メチル基またはエチル基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｂが、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｂが−ＣＨ２ＮＲ２−である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ７が、水素原子、メチル基、エチル基またはメトキシ基である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｄが５員の芳香族環である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａが：
【化３】
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｃが：
【化４】
式中、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、かつ、
ＹがＣであり、Ｒ６が水素原子、メチル基、エチル基またはＨＣＯであるか、
ＹがＮであり、Ｒ６が孤立電子対である、のいずれかである、
である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ａが、式Ａ−ｉまたは式Ａ−ｉｉで表される、請求項１３に記載の化合物。
【化５】
【請求項１５】
Ａが、式Ａ−ｉ−１または式Ａ−ｉｉ−１で表される、請求項１４に記載の化合物。
【化６】
【請求項１６】
Ｂが−ＣＨ２ＮＲ２−であり、Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、ＺがＯであり、ｎが１であり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｂが、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨＣＨ３−または−ＣＨ２Ｏ−であり、Ｒ２が水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、ＺがＯであり、ｎが１であり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ４が、水素原子または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ８が、それぞれ独立して水素原子、メチル基またはエチル基であり、ＡがＡ−ｉでありＹがＣである場合に、Ｒ６は水素原子であり、ＡがＡ−ｉｉである場合にＲ１は−ＯＨである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
治療に使用される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
葉酸または葉酸誘導体に依存性の酵素の阻害に応答性の症状の治療に用いられる医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
癌の治療に用いられる医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
以下の段階：
（ａ）式ＩＩの化合物：
【化７】
式中、Ａは請求項１と同様の定義であり、ｍは、０、１または２であり、Ｘは脱離基である、
を、式ＩＩＩの化合物：
【化８】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は請求項１と同様の定義である、
と反応させる段階；
（ｂ）式ＩＶの化合物：
【化９】
式中、Ａは請求項１と同様の定義であり、Ｘは脱離基である、
を、式Ｖの化合物：
【化１０】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ３およびＲ４は請求項１と同様の定義である、
と反応させる段階；あるいは、
（ｃ）以下の化合物ＶＩまたはＶＩＩ：
【化１１】
式中、Ａ、Ｚ、ｎ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は請求項１と同様の定義であり、いずれの場合においても、Ｙは独立してハロゲン原子である、
の一方を、対応する有機金属試薬に変換させ、前記有機金属試薬を化合物ＶＩまたはＶＩＩの他方と反応させる段階、
を有する、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項２３】
式ＩＩ−Ａの化合物：
【化１２】
式中、Ｘは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
を、式ＩＩＩ−Ａの化合物：
【化１３】
と反応させる段階を有する、式Ｉ−Ａ：
【化１４】
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、請求項１と同様の定義である、
を有する、請求項１に記載の化合物またはその製薬上許容されうる塩の製造方法。
【請求項２４】
請求項２２において定義され、Ｒ４が−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５である、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの化合物。
【請求項１】
式Ｉの化合物、またはその製薬上許容されうる塩：
【化１】
式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり；
ｎは、１〜３であり；
Ｒ３は、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ８、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ８、−Ｃ（ＮＨ）ＳＲ８、または−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は水素原子もしくはアルキル基である）であり；
Ｒ４は、水素原子、−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５（ここで、Ｒ５は、それぞれ独立してＲ３の定義のいずれかを有する）であり；
Ｂは、−ＮＲ２−、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−（ここで、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、Ｒ７は、水素原子またはＣ１−３のアルキル基もしくはアルコキシ基である）であり；
Ａは：
【化２】
式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２または−ＯＨであり；
ＣおよびＤは、それぞれ独立して、１または２以上のヘテロ原子を含んでもよい、５員または６員の、置換されたまたは非置換の、芳香族環または非芳香族環であり、Ｃは任意の可能な位置で基Ｂと結合している、
である。
【請求項２】
ＺがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが１である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ８が、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ４が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ８である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ８が、水素原子、メチル基またはエチル基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｂが、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨＲ７−または−ＣＨ２Ｏ−である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｂが−ＣＨ２ＮＲ２−である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ７が、水素原子、メチル基、エチル基またはメトキシ基である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｄが５員の芳香族環である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａが：
【化３】
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｃが：
【化４】
式中、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、かつ、
ＹがＣであり、Ｒ６が水素原子、メチル基、エチル基またはＨＣＯであるか、
ＹがＮであり、Ｒ６が孤立電子対である、のいずれかである、
である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ａが、式Ａ−ｉまたは式Ａ−ｉｉで表される、請求項１３に記載の化合物。
【化５】
【請求項１５】
Ａが、式Ａ−ｉ−１または式Ａ−ｉｉ−１で表される、請求項１４に記載の化合物。
【化６】
【請求項１６】
Ｂが−ＣＨ２ＮＲ２−であり、Ｒ２が、水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、ＺがＯであり、ｎが１であり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｂが、−ＣＨ２ＮＲ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨＣＨ３−または−ＣＨ２Ｏ−であり、Ｒ２が水素原子、メチル基、エチル基または−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨであり、ＺがＯであり、ｎが１であり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ４が、水素原子または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ８であり、Ｒ８が、それぞれ独立して水素原子、メチル基またはエチル基であり、ＡがＡ−ｉでありＹがＣである場合に、Ｒ６は水素原子であり、ＡがＡ−ｉｉである場合にＲ１は−ＯＨである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
治療に使用される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
葉酸または葉酸誘導体に依存性の酵素の阻害に応答性の症状の治療に用いられる医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
癌の治療に用いられる医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
以下の段階：
（ａ）式ＩＩの化合物：
【化７】
式中、Ａは請求項１と同様の定義であり、ｍは、０、１または２であり、Ｘは脱離基である、
を、式ＩＩＩの化合物：
【化８】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は請求項１と同様の定義である、
と反応させる段階；
（ｂ）式ＩＶの化合物：
【化９】
式中、Ａは請求項１と同様の定義であり、Ｘは脱離基である、
を、式Ｖの化合物：
【化１０】
式中、Ｚ、ｎ、Ｒ３およびＲ４は請求項１と同様の定義である、
と反応させる段階；あるいは、
（ｃ）以下の化合物ＶＩまたはＶＩＩ：
【化１１】
式中、Ａ、Ｚ、ｎ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は請求項１と同様の定義であり、いずれの場合においても、Ｙは独立してハロゲン原子である、
の一方を、対応する有機金属試薬に変換させ、前記有機金属試薬を化合物ＶＩまたはＶＩＩの他方と反応させる段階、
を有する、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項２３】
式ＩＩ−Ａの化合物：
【化１２】
式中、Ｘは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
を、式ＩＩＩ−Ａの化合物：
【化１３】
と反応させる段階を有する、式Ｉ−Ａ：
【化１４】
式中、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、請求項１と同様の定義である、
を有する、請求項１に記載の化合物またはその製薬上許容されうる塩の製造方法。
【請求項２４】
請求項２２において定義され、Ｒ４が−ＣＨ２Ｒ５または−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ５である、式ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩの化合物。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１１４１９２（Ｐ２００９−１１４１９２Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９３３６２（Ｐ２００８−２９３３６２）
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【分割の表示】特願２００７−５３１７７３（Ｐ２００７−５３１７７３）の分割
【原出願日】平成１８年８月１６日（２００６．８．１６）
【出願人】（５０７０８７０４１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【分割の表示】特願２００７−５３１７７３（Ｐ２００７−５３１７７３）の分割
【原出願日】平成１８年８月１６日（２００６．８．１６）
【出願人】（５０７０８７０４１）
【Ｆターム（参考）】
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