新規な蛍光プローブ及びキナーゼ阻害剤の新規スクリーニング方法
【課題】キナーゼ阻害剤のスクリーニング方法およびその検出を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブの提供。
【解決手段】式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
【解決手段】式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤を開発するための技術分野に属し、特に、医薬品となり得るキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法およびその検出を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、自己または他のタンパク質上のチロシン、セリンあるいはスレオニンをリン酸化することにより細胞増殖、細胞間コミュニケーション、細胞生存等に関与するシグナルを伝えており、これらのリン酸化シグナルは正常細胞の増殖、生存等に重要な役割を果たしている。多くの疾患は、何らかの原因で正常に働かなくなったプロテインキナーゼを介したリン酸化シグナル、つまり異常な細胞応答に関連していることが知られている（非特許文献１参照）。このような疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝性疾患、神経学的疾患及び神経変性疾患、癌、心臓血管の疾患、アレルギー及び喘息、アルツハイマー病、ならびにホルモン関連の疾患が挙げられる。したがって、これらの疾患に関与するキナーゼを阻害する化合物はこれらの疾病などに対する予防／治療薬になると考えられ、新しいキナーゼ阻害剤の開発が日夜続けられている（非特許文献２、３参照）。
【０００３】
キナーゼ阻害剤の効率的な開発のためには、対象となるキナーゼに対して、阻害剤の候補となり得る化合物群をスクリーニングすることのできる評価系を確立することが必要である。しかしながら、キナーゼはヒトの生体内に５００種類以上存在しているとされており（非特許文献４参照）、対象となるキナーゼ以外を阻害しないような化合物を見出すことが、副作用の少ない薬剤を開発するうえで非常に重要である。これまでに報告されているキナーゼ阻害剤は、キナーゼに共通の基質であるＡＴＰの同じ部位に結合するものがほとんどであるが、この結合部位は同じＡＴＰを結合するようにできていることから容易に類推できるように非常に構造類似性が高く、選択的なキナーゼ阻害剤を得ることは容易ではない（非特許文献５参照）。
【０００４】
生体内ではキナーゼ活性は精密に調節されており、キナーゼ自身もキナーゼによるリン酸化によってｏｎ／ｏｆｆ（活性型と不活性型）の調節を受けており、その立体構造が大きく変化するとされている。つまり同じキナーゼでも、活性型か不活性型かのどちらを阻害するかで選択性に違いが出てくることが知られている（非特許文献６参照）。
【０００５】
現在、報告されているほとんどのキナーゼ阻害剤は活性型キナーゼを阻害するものであるが、前述のとおり活性型キナーゼのＡＴＰ結合部位の構造は、極めて高い類似性を持つため、そこに結合する阻害剤で高い選択性を出すのは難しいとされている。
【０００６】
一方、不活性型キナーゼに結合する阻害剤は、活性化ループの構造の変化によって出現する新たな領域との相互作用を利用できるため非常に高い選択性を示す場合が多い。つまり、活性型キナーゼの立体構造は類似しているが、不活性型キナーゼでは必ずしもそうではないということである。また不活性型キナーゼは競合基質であるＡＴＰとの親和性も低下しており、不活性型キナーゼに結合する物質には、生体内ではより強力な生理作用が期待できる。しかしながら、これまで報告されている不活性型キナーゼに結合する阻害剤は、ほとんどが偶然発見されたものであり、活性のないキナーゼを用いて化合物のスクリーニングを実施するのは非常に難しいとされている。
【０００７】
ところで、キナーゼを阻害する化合物をスクリーニングする方法としては、活性型キナーゼの酵素活性阻害を指標とした評価系が最も一般的である（非特許文献７参照）。競合結合測定法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）により、プローブとして用いられる標準阻害剤に対する拮抗阻害の評価系も用いられることもあるが（例えば、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標） Ｅｕ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ、インビトロジェン社）、拮抗阻害を検出するためにはキナーゼタンパク自体を化学的あるいは生物的に修飾する必要があり、さらに２次試薬も添加する必要があるため、バックグラウンドシグナルの上昇や操作が煩雑にならざるを得ない。
【０００８】
通常、蛍光プローブを合成する場合には、生化学分野でよく用いられているフルオレセインやその誘導体などの蛍光色素が用いられている。しかしながら、これらの蛍光色素は、それ自身が強い蛍光を発するため、測定時には標的タンパク質と結合していないプローブを取り除くか、あるいは、先に述べたように標的タンパクの修飾や２次試薬の添加などが必要となる。一方、蛍光検出−ＨＰＬＣなどによく用いられている蛍光ラベル化試薬、ベンゾオキサジアゾール誘導体は、有機溶媒中など疎水性環境で非常に強い蛍光を発するが、例えば水中ではほぼ無蛍光となることが知られており（例えば、東京化成工業のＷｅｂページ、ＨＰＬＣ用ラベル化剤、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｔｏｋｙｏｋａｓｅｉ.ｃｏ.ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ−ｃｈｅｍ／Ａ００７.ｓｈｔｍｌなどを参照）、この性質を利用した、タンパク質内部の疎水性環境を探るような蛍光プローブの例がいくつか報告されている（例えば非特許文献８、９などを参照）。
【０００９】
ちなみに、特許文献としては、国際公開第２００３／０９７６６７号、国際公開第２００３／０８９６６５号等にキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法が知られているが（特許文献１、特許文献２）、これらの方法は先に述べたように満足とは限らない。また、国際公開第２００４／０８５６１８号に不活性型キナーゼを標的としたスクリーニング方法について記載されているが（特許文献３）、どのようにして評価するのか、またスクリーニング方法の実証結果など全く示されていない。国際公開第２００５／０３３３３０号には、当業界で通常用いられているフルオレセイン誘導体を蛍光色素として利用した蛍光偏光法によるアッセイ方法について開示されているが（特許文献４）、不活性型キナーゼのスクリーニングに関する記載は全くなされていない。国際公開第２００８／０３３８３４号、国際公開第２００８／０３３８５４号には、ラジオアイソトープや蛍光色素でラベル化したＢＴＫ（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤がバイオアッセイにも使用できることが記載されているものの、ラベル化化合物およびバイオアッセイに関しては全く検討されていない（特許文献５、特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，（１９９５），８０，２２５−２３６
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，（２００２），１，３０９−３１５
【非特許文献３】Ｓｈｃｈｅｍｅｌｉｎｉｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｌｉａ Ｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ），（２００６），５２，８１−１００
【非特許文献４】Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００２），２９８，１９１２−１９３４
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，（２００９），９，２８−３９
【非特許文献６】Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（２００６），２，３５８−３６４
【非特許文献７】Ｃｏｍｌｅｙ，Ｊ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ，Ｆａｌｌ ２００４，４５−５６
【非特許文献８】Ｋｅｎｎｅｒ,Ｒ.Ａ., ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,（１９７１），１０，４４３３−４４４０
【非特許文献９】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．、ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００１）、２７６、４７１７−４７２３
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０９７６６７号
【特許文献２】ＷＯ２００３／０８９６６５号
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８５６１８号
【特許文献４】ＷＯ２００５／０３３３３０号
【特許文献５】ＷＯ２００８／０３３８３４号
【特許文献６】ＷＯ２００８／０３３８５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、活性型ないし不活性型キナーゼに結合する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいスクリーニング方法、およびその検出を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、前述のとおりベンゾオキサジアゾール誘導体が環境に依存して蛍光強度を変化させる性質に着目し、この性質を利用することにより上述の目的を達成し得る本発明を案出したものである。かくして、本発明に従えば、活性型ないし不活性型キナーゼに結合する薬剤のスクリーニングが簡便に可能となり、キナーゼ阻害剤にベンゾオキサジアゾール誘導体を結合させた蛍光プローブとキナーゼの混合物に被験物質を添加し、その蛍光強度の変化が観察されたときに、被験物質をキナーゼ阻害剤として選択することを特徴とする方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法および新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブを用いれば、活性型キナーゼのみならず、不活性型キナーゼに結合する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができ、従来の競合結合測定法において必要だった標的酵素の修飾および２次試薬が不要となる。かくして、本発明は、キナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングを通じて、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝性疾患、神経学的疾患及び神経変性疾患、癌、心臓血管の疾患、アレルギー及び喘息、アルツハイマー病、ならびにホルモン関連の疾患などに対する予防・治療薬の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の蛍光プローブが脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫに結合することで、水溶液中と比較して有意に高く酵素濃度依存的に蛍光を発することを示す。また、キナーゼ阻害剤の添加により蛍光強度が低下することを示す。
【図２】脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫと結合することで、本発明の蛍光プローブの蛍光が濃度依存的に増加することを示す。
【図３】本発明の蛍光プローブを使用して、試験化合物を種々の希釈で脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫ結合活性を指標にしてスクリーニングする場合に得られた蛍光変化結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、酵素活性がない、もしくは非常に弱い不活性型キナーゼを用いて、その基質結合部位に拮抗的に結合する化合物を見つけるために、競合結合測定法に注目して研究を行った。このとき、通常、生化学分野でよく用いられるフルオレセインなどの蛍光色素とは異なる性質を有するベンゾオキサジアゾール誘導体が、キナーゼの結合度に応じて蛍光強度が変化することにより、２次試薬等を必要としない非常に簡便な競合阻害試験に利用できるものと考え、本発明を導き出したものである。
本発明は、以下の（１）〜（７）によって達成される。
（１）下式（Ｉ）を有する新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブ。
【００１７】
【化１】
【００１８】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
（２）Ｚが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害活性を有する化合物である、（１）に記載の蛍光プローブ。
（３）Ｚが、下式（Ｉa）を有する化合物である、（１）または（２）に記載の蛍光プローブ。
【００１９】
【化２】
（式中、Ｒ２は置換されてもよいアルコキシ基を表す。）
（４）Ｚが、ＢＴＫ阻害活性を有する化合物である、（１）に記載の蛍光プローブ。
（５）Ｚが、下式（Ｉｂ）を有する化合物である、（１）または（４）に記載の蛍光プローブ。
【００２０】
【化３】
（６）（１）から（５）の何れか１つに記載の蛍光プローブを使用することを特徴とするキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。
（７）不活性型キナーゼを標的とした、（６）に記載のスクリーニング方法。
【００２１】
以下、本発明に従うキナーゼ阻害剤のスクリーニング法において用いられる蛍光プローブの作製法、ならびに当該蛍光プローブを用いるスクリーニング法に従って本発明の実施の形態を説明する。但し、以下に示す具体的な実施の形態は例示のためのものであり、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の新しいキナーゼ阻害剤のスクリーニング法の実施を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブは、下式（Ｉ）で示される化合物である。
【００２３】
【化４】
【００２４】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
【００２５】
尚、上記で「結合」とは、“ＺとＸ”、“Ｌとベンゾオキサジアゾール基”、あるいは“Ｚとベンゾオキサジアゾール基”が直接結合した場合を意味する。
【００２６】
前記式（Ｉ）において、キナーゼ阻害活性を有する化合物としては、標的とする活性型あるいは不活性型キナーゼの、触媒ドメインのＡＴＰ結合部位、基質結合部位もしくはアロステリック部位に可逆的に結合する化合物であれば、新規化合物や公知化合物の何れであってもよいが、このような性質を有する化合物としてはいくつかのものが既に知られており、これらを使用することができる。
例えば、ＡＴＰ結合部位に結合して活性型キナーゼを阻害するものとしては、スタウロスポリン、スニチニブ（Ｎ−（２−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−５−［（Ｚ）−（５−ｆｌｕｏｒｏ−２−ｏｘｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ダサチニブ（Ｎ−（２−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−［［６−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−５−ｔｈｉａｚｏｌｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）などのキナーゼ阻害薬もしくはそれらの誘導体などが挙げられる。
【００２７】
不活性型キナーゼを標的とする場合は、不活性型キナーゼにより強く結合することが知られている化合物、具体的には、不活性型ＢＴＫを阻害するＮ−［３−［４，５−Ｄｉｈｙｄｒｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−６−［［４−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−５−ｏｘｏ−２−ｐｙｒａｚｉｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ（ＣＧＩ１７４６）に代表される上記［化３］の部分構造をもつ誘導体、不活性型ｐ３８ＭＡＰＫを阻害するｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄに代表される上記［化２］の部分構造をもつ誘導体、不活性型ＡＢＬを阻害するイマチニブ、ニロチニブもしくはそれらの誘導体などが挙げられる。
【００２８】
また、アロステリック部位に結合してキナーゼ活性を阻害することが知られているものとしては、ＭＡＰＫキナーゼのＭＥＫを阻害する２−（２−Ｃｈｌｏｒｏ−４−ｉｏｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙ−３，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ（ＰＤ−１８４３５２，ＣＩ−１０４０）もしくはそれらの誘導体などが挙げられる。
前記式（Ｉ）において、「置換されてもよい炭化水素基」の「炭化水素」部分としては、例えば、
ａ）炭素数１から６の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルキル基（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、ヘキシル等）、
ｂ）炭素数１から６の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルケニル基(例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、２−ブテニル等)、
ｃ）炭素数２から６のアルキニル基(例えば、エチニル、プロパルギル、２−ブチニル等)、
ｄ）炭素数３から８のシクロアルキル基(例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等)、
ｅ）炭素数３から８のシクロアルケニル基(例えば、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等)、
【００２９】
ｆ）アラルキル基、アラルキル基のアリール部分としては、炭素数６から１４のアリールが挙げられ(例えば、フェニル、ナフチル、インデニル等)、アラルキル基のアルキレン部分としては、前記アルキル基から水素原子を１つ除いたものと同義である、
などが挙げられる。
【００３０】
「置換されてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてよいカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、置換されてもよいスルフィド基等を挙げることができる。
【００３１】
「置換されてもよいアミノ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアミノ基または直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアミノ基を表し、具体的にはメチルアミノ基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、ピペラジノ基、モルホリノ基、アニリノ基などが挙げられる。
【００３２】
「置換されてもよいアルキルカルバモイル基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルキルカルバモイル基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルキルカルバモイル基を表す。
【００３３】
「置換されてもよいアシルアミノ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルキルカルボニルアミノ基を表す。
【００３４】
「置換されてもよいアルコキシ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルコキシ基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルコキシ基を表す。
【００３５】
「置換されてもよいヒドラジノ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するヒドラジノ基または直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいヒドラジノ基を表す。
【００３６】
ベンゾオキサジアゾール基を、キナーゼ阻害活性を有する化合物に結合するためのリンカーである式（Ｉ）のＬおよびＸとしては、市販で入手可能なベンゾオキサジアゾール誘導体を蛍光標識色素として結合するのに使用し得る当業界で知られているあらゆる基であってもよい。典型的には、この実施態様において、ＬおよびＸは、ベンゾオキサジアゾール誘導体の反応性官能基であるフッ素、塩素などのハロゲンまたはイソチオシアネート基と、キナーゼ阻害活性を有する化合物の適当な位置に導入したアミン性官能基との反応により生成されてもよい。
【００３７】
ベンゾオキサジアゾール基は、Ｚのキナーゼ阻害活性を保持しつつ、キナーゼに結合すると蛍光が変化するように適宜、選ばれたＬおよびＸを介してＺと結合を形成する。
【００３８】
本発明の蛍光プローブ（Ｉ）は、例えば、置換基の種類によって、異性体が存在する場合がある。本明細書において、それらの異性体の一形態のみの化学構造で記載することがあるが、本発明には、構造上生じ得るすべての異性体（幾何異性体、光学異性体、互変異性体など）も含有し、異性体単体、またはそれらの混合物も含有する。
【００３９】
また、本発明の蛍光プローブ(Ｉ)は、その水溶性などの物性を調節するために、塩にして用いる場合があり、本発明には、化学性質上、生じ得るすべての塩も含有する。
本発明の蛍光プローブ（Ｉ）の具体的な化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
【００４０】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４１】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（３−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４２】
Ｎ−（４−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）フェニル）−３−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）プロパンアミド
【００４３】
３−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）−Ｎ−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）ベンズアミド
【００４４】
４−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）−Ｎ−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）ベンズアミド
【００４５】
４−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（４−（２−モルホリノエトキシ）ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）−Ｎ−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）ベンズアミド
【００４６】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）１‐ブチン−１−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４７】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）ブチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４８】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（４−（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００４９】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５０】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（２−（（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）メチル）モルホリン−４−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５１】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（（２−（２−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５２】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（４−（２−（メチル（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）アセチル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５３】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（３−（６−（（４−（４−（７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル）ベンゾ［Ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−４−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）−２−メチルフェニル）ベンズアミド
【００５４】
本発明の蛍光プローブ（Ｉ）は、例えば以下の方法によって製造することができる。なお、以下に示した製造法において、定義した基が実施方法の条件下で変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護［Ｔ.Ｗ.Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉs ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］等の手段を付すことにより容易に製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
スキーム１
【００５５】
【化５】
【００５６】
スキーム１において、Ｒ１、Ｌ、ＸおよびＺは先に定義されたとおりであり、
ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）は、蛍光ラベル化試薬として種々のＡを官能基として有する誘導体が市販されており（例えば、東京化成工業株式会社などから入手可能）、官能基Ａは化合物（ＩＩ）と反応後、Ｘに変換される。もし、ＺがリンカーＬもしくはベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）と反応しうる適当な官能基を適当な位置に有しないときには、その前駆体化合物や、有機合成化学で通常用いられる方法を実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する誘導体を合成し、その誘導体を用いてスキーム１の反応を実施してもよい。また、リンカーＬを介して、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）でＺをラベル化するときは、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基など、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）との反応に適当な官能基を適当な位置に有しているＬ’を、必要であれば官能基の保護、脱保護を繰り返して、当業界で知られている通常の有機合成の条件などを用いてＺに導入し、得られた化合物（ＩＩ）を適当なベンゾキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）と反応させることにより、式（Ｉ）の所望の化合物を得ることができる。
ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）は、例えば、
【００５７】
アミノ基やメルカプト基のラベル化試薬として、ＡがＦやＣｌなどのハロゲン原子であるＮＢＤ−Ｃｌ、ＮＢＤ−Ｆ、イソチオシアネート基であるＮＢＤ−ＮＣＳ、
【００５８】
カルボキシル基のラベル化試薬として、ＡがピペラジンであるＮＢＤ−ＰＺ、ＤＢＤ−ＰＺ、２−アミノエチルアミノ基であるＤＢＤ−ＥＤ、Ｎ−ヒドラジノカルボニルメチル−Ｎ−メチルアミノ基であるＮＢＤ−ＣＯ−Ｈｚ
などが市販で入手可能である。
【００５９】
また、カルボニル基のラベル化には、Ａがヒドラジノ基であるＮＢＤ−ＨやＤＢＤ−Ｈ、水酸基のラベル化としては、ＡがＮ−クロロホルミルメチル−Ｎ−メチルアミノ基であるＤＢＤ−ＣＯＣｌなどが市販されている。
また、本発明のスクリーニング方法は、上記方法により得られた本発明の蛍光プローブとキナーゼの混合物に被験物質を添加し、その蛍光強度の変化（低下）が観察されたときに、被験物質をキナーゼ阻害剤として選択することを特徴とする。
【実施例】
【００６０】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【００６１】
化合物の同定は水素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）及びマススペクトル（ＭＳ）により行った。１Ｈ−ＮＭＲは、特に指示のないかぎりは４００MHzで測定されたものであり、また化合物及び測定条件によっては交換性水素が明瞭に観測されない場合がある。質量分析は液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣＭＳ）システムを用い、以下に示したＡ法もしくはＢ法にて測定した。
【００６２】
Ａ法：ＬＣＭＳ−２０１０Ａシステム（島津製作所）を使用し、質量分析はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）法により測定した。分離カラムはＣａｄｅｎｚａ ＣＤ‐Ｃ１８（５０×２ｍｍ）（インタクト社製）を用いた。溶出には１０ｍＭギ酸水溶液（Ａ液）および１０ｍＭギ酸メタノール溶液（Ｂ液）によるグラジェント法を用い、溶出条件は、流速０．５ｍＬ／分、０分〜０．５分（Ｂ液：５％（ｖ／ｖ））、０．５分〜２．５分（Ｂ液：５〜９５％（ｖ／ｖ）直線グラジェント）、２．５分〜４分（Ｂ液：９５％（ｖ／ｖ））とした。
【００６３】
Ｂ法：液体クロマトグラフ質量分析計システム（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱマス検出器、日本ウォーターズ社製）を使用し、質量分析はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）法により測定した。分離カラムはＵｎｉｓｏｎ ＵＳ‐Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ）（インタクト社製）を用いた。溶出には１０ｍＭギ酸水溶液（Ａ液）および１０ｍＭギ酸メタノール溶液（Ｂ液）によるグラジェント法を用い、溶出条件は、溶出条件は、流速２ｍＬ／分、０分〜０．５分（Ｂ液：５％（ｖ／ｖ））、０．５分〜３分（Ｂ液：１０〜９０％（ｖ／ｖ）直線グラジェント）、３分〜４分（Ｂ液：９０％（ｖ／ｖ））とした。
実施例１から８は、本発明の蛍光プローブ（Ｉ）のうち、Ｚがｐ３８ＭＡＰＫ阻害活性を有する化合物である場合を例として、具体的に説明する。
実施例１
【００６４】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００６５】
【化６】
（第１工程）
【００６６】
４−ニトロフェニルヒドラジン（７６６ｍｇ）、ピバロイルアセトニトリル（６２６ｍｇ）をエタノール（１２ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（２．５ｍＬ）を加え９０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗生成物をエタノールで懸濁洗浄し、３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−アミン塩酸塩１．３１ｇを得た。
（第２工程）
【００６７】
３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−アミン塩酸塩（２９７ｍｇ）にジクロロメタン（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（１６７μＬ）、１−ナフチルイソシアネート（１５８μＬ）を加え８０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣に水（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア１４５ｍｇを得た。
（第３工程）
【００６８】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア（１４５ｍｇ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、ギ酸アンモニウム（１３２ｍｇ）、触媒量の１０％パラジウム−炭素を加え９０℃で３時間還流した。不溶物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、１−（１−（４−アミノフェニル）−３−（ｔ‐ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア８１ｍｇを得た。
（第４工程）
【００６９】
１−（１−（４−アミノフェニル）−３−（ｔ‐ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア（２１ｍｇ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、４‐フルオロ‐７‐ニトロ-２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール（１０ｍｇ）を加え室温で１８時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて表題化合物２２ｍｇを得た。ＬＣＭＳ：ＨＰＬＣ保持時間３．５３分（Ａ法）、ｍ／ｚ５６３（ＭＨ＋）。
【００７０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 6.44 (s, 1H), 6.85 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.47 (t, J=7.91 Hz, 1H), 7.51 - 7.61 (m, 2H), 7.62 - 7.77 (m, 5H), 7.87 - 7.98 (m, 2H), 8.04 (d, J=8.28 Hz, 1H), 8.57 (d, J=8.78 Hz, 1H), 8.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 11.18 (s, 1H).
【００７１】
下記実施例２から７の化合物は、実施例１に記載の方法もしくは類似の方法に従い、適当な試薬および有機合成化学で通常用いられる方法により製造した。表中のＭｅｔｈｏｄはＬＣＭＳの分析方法、ＲＴはＬＣＭＳにおけるＨＰＬＣ保持時間、ＭＳはＬＣＭＳにおけるマススペクトル分析データ（特に指示のない限りポジティブイオンモードで測定されたＭＨ+）を示す。
【００７２】
【表１】
また、実施例９から１４は、本発明の蛍光プローブ（Ｉ）のうち、ＺがＢＴＫ阻害活性を有する化合物である場合を例として、具体的に説明する。
参考例１
【００７３】
４−（（６−（３−（４−（ｔ‐ブチル）ベンズアミド）−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）安息香酸
【００７４】
【化７】
（第1工程）
【００７５】
文献Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．４８、ｐ．１９０１（２００５年）に記載の方法で調製した３，５−ジブロモ−１−メチルピラジン−２（１Ｈ）−オン（５９３ｍｇ）のジメチルアセトアミド溶液（３．７ｍＬ）に４‐アミノ安息香酸エチル（４７５ｍｇ）を加え、マイクロウェーブ合成装置を用いて１０５℃で２０時間反応させた。析出した固体をろ取し、酢酸エチルで洗浄後、乾燥させてエチル ４−（（６−ブロモ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート６２０ｍｇを得た。
【００７６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δppm 1.39 (t, J=7.15 Hz, 3H), 3.55 (s, 3H), 4.37 (q, J=7.28 Hz, 2H), 6.83 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.78 Hz, 2H), 8.06 (d,J=8.78 Hz, 2H), 8.45 (s, 1H).
（第２工程）
【００７７】
エチル ４−（（６−ブロモ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート（８７０ｍｇ）の１，４−ジオキサン溶液（７．６ｍＬ）に３‐アミノ‐２‐メチルフェニルボロン酸ピナコールエステル（７４９ｍｇ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（４００ｍｇ）、２．４Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）を加え、１０５℃で６０時間撹拌した。不溶物をセライトろ過した後、ろ液にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、２Ｍ塩酸（５０ｍＬ）で抽出した。水層に２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）を加えてアルカリ性にした。析出した固体をろ取し、水で洗浄後、乾燥させてエチル ４−（６−（３−アミノ−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート５８８ｍｇを得た。
（第３工程）
【００７８】
エチル ４−（６−（３−アミノ−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート（５８８ｍｇ）のジクロロメタン溶液溶液（７．８ｍＬ）にピリジン（０．１４ｍＬ）、４‐ｔ‐ブチルベンゾイルクロリド（０．４５５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、エチル ４−（（６−（３−（４−（ｔ‐ブチル）ベンズアミド）−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート５３４ｍｇを得た。
（第４工程）
【００７９】
エチル ４−（（６−（３−（４−（ｔ‐ブチル）ベンズアミド）−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート（４００ｍｇ）のテトラヒドロフラン溶液（７ｍＬ）に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（７ｍＬ）、エタノール（７ｍＬ）を加え、８０℃で３時間撹拌した。反応混合物に１Ｍ塩酸（７ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して表題化合物３７７ｍｇを得た。
【００８０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.33 (s, 9H), 2.30 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 7.25 - 7.36 (m, 3H), 7.40 (dd, J=6.53, 2.51 Hz, 1H), 7.56 (d, J=8.28 Hz, 2H), 7.85 (d, J=8.78 Hz, 2H), 7.96 (d, J=8.53 Hz, 2H), 8.14 (d, J=8.78 Hz, 2H), 9.59 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 12.58 (s, 1H).
実施例９
【００８１】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（４−（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００８２】
【化８】
【００８３】
参考例１で得られた化合物（５０ｍｇ）のテトラヒドロフラン溶液（１．６ｍＬ）に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５６ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４５ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌したのち、４‐ニトロ‐７‐ピペラジノ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール（３６．６ｍｇ）のジメチルホルムアミド（０．３ｍＬ）溶液を加え、室温でさらに１８時間撹拌した。反応混合物にクロロホルム（５０ｍＬ）を加え、１Ｍ塩酸、水、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し表題化合物６３ｍｇを得た。ＬＣＭＳ：ＨＰＬＣ保持時間３．７２分（Ｂ法）、ｍ／ｚ７４２（ＭＨ＋）。
【００８４】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 2.30 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 3.80 (br. s., 4H), 4.22 (br. s., 4H), 6.60 (d, J=9.29 Hz, 1H), 7.24 - 7.41 (m, 4H), 7.44 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.94 (d, J=8.53 Hz, 2H), 8.12 (d, J=8.78 Hz, 2H), 8.52 (d, J=9.03 Hz, 1H), 9.50 (s, 1H), 9.89 (s, 1H).
【００８５】
下記実施例１０から１３に示す化合物は、実施例９に記載の方法もしくは類似の方法に従い、適当な試薬および有機合成化学で通常用いられる方法により製造した。表中のＭｅｔｈｏｄはＬＣＭＳの分析方法、ＲＴはＬＣＭＳにおけるＨＰＬＣ保持時間、ＭＳはＬＣＭＳにおけるマススペクトル分析データ（特に指示のない限りポジティブイオンモードで測定されたＭＨ+）を示す。
【００８６】
【表２】
実施例１４
【００８７】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（３−（６−（（４−（４−（７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル）ベンゾ［Ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−４−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）−２−メチルフェニル）ベンズアミド
【００８８】
【化９】
【００８９】
実施例９に記載の手順に従って、４‐ニトロ‐７‐ピペラジノ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾールの替わりに４‐（Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノスルホニル）‐７‐ピペラジノ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール（２７ｍｇ）を用い、反応・処理することにより表題化合物４７ｍｇを得た。
ＬＣＭＳ：ＨＰＬＣ保持時間３．７２分（Ｂ法）、ｍ／ｚ８０４（ＭＨ＋）。
【００９０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 2.30 (s, 3H), 2.65 - 2.80 (m, 6H), 3.58 (s, 3H), 3.75 (br. s., 4H), 3.96 (br. s., 4H), 6.60 (d, J=8.28 Hz, 1H), 7.25 - 7.34 (m, 3H), 7.38 (dd, J=6.90, 2.38 Hz, 1H), 7.43 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.86 (d, J=8.03 Hz, 1H), 7.94 (d, J=8.28 Hz, 2H), 8.12(d, J=8.78 Hz, 2H), 9.50 (s, 1H), 9.90 (s, 1H).
実施例１５
リン酸化（活性型）および脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫに対するキナーゼ活性阻害試験
【００９１】
リン酸化（活性型）ＢＴＫは、ビオチン化ＢＴＫ蛋白質ＢＴＮ−ＢＴＫ(カルナバイオサイエンス社製）酵素溶液にＡＴＰ、ＭｇＣｌ２をそれぞれ３ｍＭ、１０ｍＭとなるように添加し、４℃で一晩反応させた後、１０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎを用いてバッファー交換を行い、未反応のＡＴＰを除去することにより得た。
【００９２】
脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫは、ＢＴＮ−ＢＴＫ酵素溶液にλ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｐ０７５３Ｓ）とＭｎＣｌ２をそれぞれ１０Ｕ／μｇ、２ｍＭとなるように添加し、４℃で一晩反応させた後、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ｔａｇ抗体アガロースゲルクロマトグラフィーによりλ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを除去したのち、１０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎを用いてバッファー交換を行い得た。
【００９３】
キナーゼ活性の測定は、ＭＳＡアッセイキット（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓｉｓｔ(商標)ｋｉｔ、カルナバイオサイエンス社製）を用いて行った。キナーゼ反応の基質は、キット付属のＦＩＴＣ標識ＳＲＣｔｉｄｅペプチドを用いた。アッセイバッファー［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標）、２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｐＨ７．５]を用い、基質（４μＭ）、ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ）、ＡＴＰ（１００μＭ、リン酸化ＢＴＫ用もしくは２００μM、脱リン酸化ＢＴＫ用）となるように調整し、基質混合液を作成した。またキナーゼを０．６ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から、１０濃度（０．００００３ｍＭ、０．０００１ｍＭ、０．０００３ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ）にＤＭＳＯでさらに希釈し、それぞれをアッセイバッファーで２５倍希釈して、薬物溶液を調整した（４％ＤＭＳＯ溶液）。
【００９４】
薬物溶液もしくは溶媒溶液（コントロール）（４％ＤＭＳＯ−アッセイバッファー）５μＬ、基質混合液５μＬ、および酵素溶液１０μＬをポリプロピレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１時間室温で反応させた後、６０μＬのキット付属のターミネーションバッファーを添加し反応を停止させた。反応阻害率は、ＬａｂＣｈｉｐ ＥＺ ＲｅａｄｅｒIIシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、アッセイキットのプロトコールに従って測定した。
【００９５】
ＦＩＴＣ標識ＳＲＣｔｉｄｅペプチド（キナーゼ反応基質：Substrate），及び、そのリン酸化物（Product）の、蛍光強度のピークの高さをそれぞれＳおよびＰとし、被験化合物の阻害率（％）を次の式に従って算出した。
またブランクとして酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。
被験化合物のキナーゼ阻害率（％）は、次の式に従って算出した。
キナーゼ阻害率（％）＝（１−（Ｃ−Ａ）／（Ｂ−Ａ））×１００
ただし、ＡはブランクのＰ／（Ｐ＋Ｓ）、ＢはコントロールのＰ／（Ｐ＋Ｓ）、Ｃは被験化合物ウェルのＰ／（Ｐ＋Ｓ）を示す。
また、ＩＣ５０値は、阻害率と被験化合物濃度（対数）の回帰分析により算出した。
【００９６】
表３に示すとおり、実施例９から１１の本発明の蛍光プローブは、蛍光標識していないＣＧＩ１７４６（公知の不活性型キナーゼに結合する化合物）と同様に脱リン酸化ＢＴＫのキナーゼ活性を強く阻害することが判明した。
【００９７】
【表３】
実施例１６
標的キナーゼへの結合による蛍光プローブの蛍光強度変化の測定
【００９８】
本発明の蛍光プローブ（実施例９）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液をアッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５（商標）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５］で希釈し、１μＭの蛍光プローブ溶液を調整した。同様にして競合化合物（ＣＧＩ１７４６）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から１００μＭの競合化合物溶液を調整した。また標的キナーゼとして、脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを０．２、１、３μＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。ポリスチレン製３８４穴プレートの各ウェルに、酵素溶液と蛍光プローブ溶液を等量ずつ加え、室温で1時間インキュベートした。ブランクとして、酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。また、競合試験として、最終濃度５μＭとなるように上記競合化合物溶液を加えて調整した反応溶液も測定した。各ウェルの蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙＨ１マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ社製）で測定した（測定波長：励起４８５ｎｍ／蛍光５５０ｎｍ）。
【００９９】
結果を図１に示す。図１に示されるように標的キナーゼである脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫの存在により濃度依存的に蛍光プローブの蛍光強度の増加が認められる。また、競合化合物であるキナーゼ阻害剤ＣＧＩ１７４６の添加により蛍光強度が低下することから、この系は結合部位特異的に起こり、また可逆的なことが理解される。
実施例１７
脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを用いた蛍光プローブの結合活性測定
【０１００】
蛍光プローブ（実施例９）の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から、２ｍＭを最高濃度として公比２でＤＭＳＯ希釈した１３濃度のＤＭＳＯ溶液を、さらに実施例１６記載のアッセイバッファーで１０００倍希釈して、蛍光プローブ溶液を調整した（０．１％ＤＭＳＯ溶液)。同様にして競合化合物（ＣＧＩ１７４６）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から実施例１６記載のアッセイバッファーを用いて４０μＭの競合化合物溶液を調整した。また脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを１２０ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。蛍光プローブ溶液４０μＬ、コントロール溶液（４％ＤＭＳＯ−アッセイバッファー）２０μＬ、および酵素溶液２０μＬをポリプロピレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１時間室温でインキュベートした後、各ウェルの蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙＨ１マイクロプレートリーダーで測定した（測定波長：励起４８５ｎｍ／蛍光５５０ｎｍ）。またコントロール溶液の代わりに競合化合物溶液を加えたウェルの蛍光強度も測定し、これをバックグラウンドとして測定値から差し引き、蛍光強度変化量（ΔＲＦＵ）とした。各蛍光プローブ濃度における蛍光強度変化量（ΔＲＦＵ）を蛍光プローブ化合物濃度に対してプロットし、飽和曲線を作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア(ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて、蛍光プローブの乖離定数（Ｋｄ）を算出した。
図２に測定結果を示す。脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫに対する蛍光プローブ（実施例９）のＫｄ値は６３ｎＭと測定された。
【０１０１】
この結果は、本発明の蛍光プローブが、不活性型ＢＴＫから非常に解離し易く、競合する不活性型キナーゼを標的とする候補化合物のスクリーニングに有用であることを示している。
実施例１８
脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを用いた競合結合測定試験
【０１０２】
本発明の蛍光プローブ（実施例９）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を実施例１６記載のアッセイバッファーで希釈し、１００ｎＭの蛍光プローブ溶液を調整した。また脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを１００ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物（ＣＧＩ１７４６）の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から、２０μＭを最高濃度として公比２でＤＭＳＯ希釈した８濃度のＤＭＳＯ溶液を、さらに実施例１６記載のアッセイバッファーで２５倍希釈して、薬物溶液を調整した（４％ＤＭＳＯ溶液）。薬物溶液２０μＬと酵素溶液２０μＬをポリスチレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１５分後、蛍光プローブ溶液（４０μＬ）を添加した。室温で２時間インキュベートした後、各ウェルの蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙＨ１マイクロプレートリーダーで測定した（測定波長：励起４８５ｎｍ／蛍光５５０ｎｍ）。蛍光強度とキナーゼ阻害剤濃度をプロットしＩＣ５０値を算出した。
【０１０３】
結果を図３に示す。脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫと蛍光プローブ（実施例９）に対するＣＧＩ１７４６の競合阻害活性（ＩＣ５０値）は２２ｎＭと測定された。
【０１０４】
つまり、本発明の蛍光プローブを用いて、既知の不活性型ＢＴＫを阻害する化合物（ＣＧＩ１７４６）の阻害活性を決定できたことは、本発明の蛍光プローブが、不活性型キナーゼのスクリーニングに有効であることを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤を開発するための技術分野に属し、特に、医薬品となり得るキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法およびその検出を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、自己または他のタンパク質上のチロシン、セリンあるいはスレオニンをリン酸化することにより細胞増殖、細胞間コミュニケーション、細胞生存等に関与するシグナルを伝えており、これらのリン酸化シグナルは正常細胞の増殖、生存等に重要な役割を果たしている。多くの疾患は、何らかの原因で正常に働かなくなったプロテインキナーゼを介したリン酸化シグナル、つまり異常な細胞応答に関連していることが知られている（非特許文献１参照）。このような疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝性疾患、神経学的疾患及び神経変性疾患、癌、心臓血管の疾患、アレルギー及び喘息、アルツハイマー病、ならびにホルモン関連の疾患が挙げられる。したがって、これらの疾患に関与するキナーゼを阻害する化合物はこれらの疾病などに対する予防／治療薬になると考えられ、新しいキナーゼ阻害剤の開発が日夜続けられている（非特許文献２、３参照）。
【０００３】
キナーゼ阻害剤の効率的な開発のためには、対象となるキナーゼに対して、阻害剤の候補となり得る化合物群をスクリーニングすることのできる評価系を確立することが必要である。しかしながら、キナーゼはヒトの生体内に５００種類以上存在しているとされており（非特許文献４参照）、対象となるキナーゼ以外を阻害しないような化合物を見出すことが、副作用の少ない薬剤を開発するうえで非常に重要である。これまでに報告されているキナーゼ阻害剤は、キナーゼに共通の基質であるＡＴＰの同じ部位に結合するものがほとんどであるが、この結合部位は同じＡＴＰを結合するようにできていることから容易に類推できるように非常に構造類似性が高く、選択的なキナーゼ阻害剤を得ることは容易ではない（非特許文献５参照）。
【０００４】
生体内ではキナーゼ活性は精密に調節されており、キナーゼ自身もキナーゼによるリン酸化によってｏｎ／ｏｆｆ（活性型と不活性型）の調節を受けており、その立体構造が大きく変化するとされている。つまり同じキナーゼでも、活性型か不活性型かのどちらを阻害するかで選択性に違いが出てくることが知られている（非特許文献６参照）。
【０００５】
現在、報告されているほとんどのキナーゼ阻害剤は活性型キナーゼを阻害するものであるが、前述のとおり活性型キナーゼのＡＴＰ結合部位の構造は、極めて高い類似性を持つため、そこに結合する阻害剤で高い選択性を出すのは難しいとされている。
【０００６】
一方、不活性型キナーゼに結合する阻害剤は、活性化ループの構造の変化によって出現する新たな領域との相互作用を利用できるため非常に高い選択性を示す場合が多い。つまり、活性型キナーゼの立体構造は類似しているが、不活性型キナーゼでは必ずしもそうではないということである。また不活性型キナーゼは競合基質であるＡＴＰとの親和性も低下しており、不活性型キナーゼに結合する物質には、生体内ではより強力な生理作用が期待できる。しかしながら、これまで報告されている不活性型キナーゼに結合する阻害剤は、ほとんどが偶然発見されたものであり、活性のないキナーゼを用いて化合物のスクリーニングを実施するのは非常に難しいとされている。
【０００７】
ところで、キナーゼを阻害する化合物をスクリーニングする方法としては、活性型キナーゼの酵素活性阻害を指標とした評価系が最も一般的である（非特許文献７参照）。競合結合測定法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）により、プローブとして用いられる標準阻害剤に対する拮抗阻害の評価系も用いられることもあるが（例えば、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標） Ｅｕ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ、インビトロジェン社）、拮抗阻害を検出するためにはキナーゼタンパク自体を化学的あるいは生物的に修飾する必要があり、さらに２次試薬も添加する必要があるため、バックグラウンドシグナルの上昇や操作が煩雑にならざるを得ない。
【０００８】
通常、蛍光プローブを合成する場合には、生化学分野でよく用いられているフルオレセインやその誘導体などの蛍光色素が用いられている。しかしながら、これらの蛍光色素は、それ自身が強い蛍光を発するため、測定時には標的タンパク質と結合していないプローブを取り除くか、あるいは、先に述べたように標的タンパクの修飾や２次試薬の添加などが必要となる。一方、蛍光検出−ＨＰＬＣなどによく用いられている蛍光ラベル化試薬、ベンゾオキサジアゾール誘導体は、有機溶媒中など疎水性環境で非常に強い蛍光を発するが、例えば水中ではほぼ無蛍光となることが知られており（例えば、東京化成工業のＷｅｂページ、ＨＰＬＣ用ラベル化剤、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｔｏｋｙｏｋａｓｅｉ.ｃｏ.ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ−ｃｈｅｍ／Ａ００７.ｓｈｔｍｌなどを参照）、この性質を利用した、タンパク質内部の疎水性環境を探るような蛍光プローブの例がいくつか報告されている（例えば非特許文献８、９などを参照）。
【０００９】
ちなみに、特許文献としては、国際公開第２００３／０９７６６７号、国際公開第２００３／０８９６６５号等にキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法が知られているが（特許文献１、特許文献２）、これらの方法は先に述べたように満足とは限らない。また、国際公開第２００４／０８５６１８号に不活性型キナーゼを標的としたスクリーニング方法について記載されているが（特許文献３）、どのようにして評価するのか、またスクリーニング方法の実証結果など全く示されていない。国際公開第２００５／０３３３３０号には、当業界で通常用いられているフルオレセイン誘導体を蛍光色素として利用した蛍光偏光法によるアッセイ方法について開示されているが（特許文献４）、不活性型キナーゼのスクリーニングに関する記載は全くなされていない。国際公開第２００８／０３３８３４号、国際公開第２００８／０３３８５４号には、ラジオアイソトープや蛍光色素でラベル化したＢＴＫ（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤がバイオアッセイにも使用できることが記載されているものの、ラベル化化合物およびバイオアッセイに関しては全く検討されていない（特許文献５、特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，（１９９５），８０，２２５−２３６
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，（２００２），１，３０９−３１５
【非特許文献３】Ｓｈｃｈｅｍｅｌｉｎｉｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｌｉａ Ｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ），（２００６），５２，８１−１００
【非特許文献４】Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００２），２９８，１９１２−１９３４
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，（２００９），９，２８−３９
【非特許文献６】Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（２００６），２，３５８−３６４
【非特許文献７】Ｃｏｍｌｅｙ，Ｊ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ，Ｆａｌｌ ２００４，４５−５６
【非特許文献８】Ｋｅｎｎｅｒ,Ｒ.Ａ., ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,（１９７１），１０，４４３３−４４４０
【非特許文献９】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．、ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００１）、２７６、４７１７−４７２３
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０９７６６７号
【特許文献２】ＷＯ２００３／０８９６６５号
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８５６１８号
【特許文献４】ＷＯ２００５／０３３３３０号
【特許文献５】ＷＯ２００８／０３３８３４号
【特許文献６】ＷＯ２００８／０３３８５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、活性型ないし不活性型キナーゼに結合する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいスクリーニング方法、およびその検出を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、前述のとおりベンゾオキサジアゾール誘導体が環境に依存して蛍光強度を変化させる性質に着目し、この性質を利用することにより上述の目的を達成し得る本発明を案出したものである。かくして、本発明に従えば、活性型ないし不活性型キナーゼに結合する薬剤のスクリーニングが簡便に可能となり、キナーゼ阻害剤にベンゾオキサジアゾール誘導体を結合させた蛍光プローブとキナーゼの混合物に被験物質を添加し、その蛍光強度の変化が観察されたときに、被験物質をキナーゼ阻害剤として選択することを特徴とする方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法および新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブを用いれば、活性型キナーゼのみならず、不活性型キナーゼに結合する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができ、従来の競合結合測定法において必要だった標的酵素の修飾および２次試薬が不要となる。かくして、本発明は、キナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングを通じて、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝性疾患、神経学的疾患及び神経変性疾患、癌、心臓血管の疾患、アレルギー及び喘息、アルツハイマー病、ならびにホルモン関連の疾患などに対する予防・治療薬の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の蛍光プローブが脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫに結合することで、水溶液中と比較して有意に高く酵素濃度依存的に蛍光を発することを示す。また、キナーゼ阻害剤の添加により蛍光強度が低下することを示す。
【図２】脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫと結合することで、本発明の蛍光プローブの蛍光が濃度依存的に増加することを示す。
【図３】本発明の蛍光プローブを使用して、試験化合物を種々の希釈で脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫ結合活性を指標にしてスクリーニングする場合に得られた蛍光変化結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、酵素活性がない、もしくは非常に弱い不活性型キナーゼを用いて、その基質結合部位に拮抗的に結合する化合物を見つけるために、競合結合測定法に注目して研究を行った。このとき、通常、生化学分野でよく用いられるフルオレセインなどの蛍光色素とは異なる性質を有するベンゾオキサジアゾール誘導体が、キナーゼの結合度に応じて蛍光強度が変化することにより、２次試薬等を必要としない非常に簡便な競合阻害試験に利用できるものと考え、本発明を導き出したものである。
本発明は、以下の（１）〜（７）によって達成される。
（１）下式（Ｉ）を有する新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブ。
【００１７】
【化１】
【００１８】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
（２）Ｚが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害活性を有する化合物である、（１）に記載の蛍光プローブ。
（３）Ｚが、下式（Ｉa）を有する化合物である、（１）または（２）に記載の蛍光プローブ。
【００１９】
【化２】
（式中、Ｒ２は置換されてもよいアルコキシ基を表す。）
（４）Ｚが、ＢＴＫ阻害活性を有する化合物である、（１）に記載の蛍光プローブ。
（５）Ｚが、下式（Ｉｂ）を有する化合物である、（１）または（４）に記載の蛍光プローブ。
【００２０】
【化３】
（６）（１）から（５）の何れか１つに記載の蛍光プローブを使用することを特徴とするキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。
（７）不活性型キナーゼを標的とした、（６）に記載のスクリーニング方法。
【００２１】
以下、本発明に従うキナーゼ阻害剤のスクリーニング法において用いられる蛍光プローブの作製法、ならびに当該蛍光プローブを用いるスクリーニング法に従って本発明の実施の形態を説明する。但し、以下に示す具体的な実施の形態は例示のためのものであり、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の新しいキナーゼ阻害剤のスクリーニング法の実施を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブは、下式（Ｉ）で示される化合物である。
【００２３】
【化４】
【００２４】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
【００２５】
尚、上記で「結合」とは、“ＺとＸ”、“Ｌとベンゾオキサジアゾール基”、あるいは“Ｚとベンゾオキサジアゾール基”が直接結合した場合を意味する。
【００２６】
前記式（Ｉ）において、キナーゼ阻害活性を有する化合物としては、標的とする活性型あるいは不活性型キナーゼの、触媒ドメインのＡＴＰ結合部位、基質結合部位もしくはアロステリック部位に可逆的に結合する化合物であれば、新規化合物や公知化合物の何れであってもよいが、このような性質を有する化合物としてはいくつかのものが既に知られており、これらを使用することができる。
例えば、ＡＴＰ結合部位に結合して活性型キナーゼを阻害するものとしては、スタウロスポリン、スニチニブ（Ｎ−（２−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−５−［（Ｚ）−（５−ｆｌｕｏｒｏ−２−ｏｘｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ダサチニブ（Ｎ−（２−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−［［６−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−５−ｔｈｉａｚｏｌｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）などのキナーゼ阻害薬もしくはそれらの誘導体などが挙げられる。
【００２７】
不活性型キナーゼを標的とする場合は、不活性型キナーゼにより強く結合することが知られている化合物、具体的には、不活性型ＢＴＫを阻害するＮ−［３−［４，５−Ｄｉｈｙｄｒｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−６−［［４−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−５−ｏｘｏ−２−ｐｙｒａｚｉｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ（ＣＧＩ１７４６）に代表される上記［化３］の部分構造をもつ誘導体、不活性型ｐ３８ＭＡＰＫを阻害するｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄに代表される上記［化２］の部分構造をもつ誘導体、不活性型ＡＢＬを阻害するイマチニブ、ニロチニブもしくはそれらの誘導体などが挙げられる。
【００２８】
また、アロステリック部位に結合してキナーゼ活性を阻害することが知られているものとしては、ＭＡＰＫキナーゼのＭＥＫを阻害する２−（２−Ｃｈｌｏｒｏ−４−ｉｏｄｏ−ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙ−３，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ（ＰＤ−１８４３５２，ＣＩ−１０４０）もしくはそれらの誘導体などが挙げられる。
前記式（Ｉ）において、「置換されてもよい炭化水素基」の「炭化水素」部分としては、例えば、
ａ）炭素数１から６の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルキル基（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、ヘキシル等）、
ｂ）炭素数１から６の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルケニル基(例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、２−ブテニル等)、
ｃ）炭素数２から６のアルキニル基(例えば、エチニル、プロパルギル、２−ブチニル等)、
ｄ）炭素数３から８のシクロアルキル基(例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等)、
ｅ）炭素数３から８のシクロアルケニル基(例えば、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等)、
【００２９】
ｆ）アラルキル基、アラルキル基のアリール部分としては、炭素数６から１４のアリールが挙げられ(例えば、フェニル、ナフチル、インデニル等)、アラルキル基のアルキレン部分としては、前記アルキル基から水素原子を１つ除いたものと同義である、
などが挙げられる。
【００３０】
「置換されてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてよいカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、置換されてもよいスルフィド基等を挙げることができる。
【００３１】
「置換されてもよいアミノ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアミノ基または直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアミノ基を表し、具体的にはメチルアミノ基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、ピペラジノ基、モルホリノ基、アニリノ基などが挙げられる。
【００３２】
「置換されてもよいアルキルカルバモイル基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルキルカルバモイル基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルキルカルバモイル基を表す。
【００３３】
「置換されてもよいアシルアミノ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルキルカルボニルアミノ基を表す。
【００３４】
「置換されてもよいアルコキシ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルコキシ基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルコキシ基を表す。
【００３５】
「置換されてもよいヒドラジノ基」としては、置換もしくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するヒドラジノ基または直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいヒドラジノ基を表す。
【００３６】
ベンゾオキサジアゾール基を、キナーゼ阻害活性を有する化合物に結合するためのリンカーである式（Ｉ）のＬおよびＸとしては、市販で入手可能なベンゾオキサジアゾール誘導体を蛍光標識色素として結合するのに使用し得る当業界で知られているあらゆる基であってもよい。典型的には、この実施態様において、ＬおよびＸは、ベンゾオキサジアゾール誘導体の反応性官能基であるフッ素、塩素などのハロゲンまたはイソチオシアネート基と、キナーゼ阻害活性を有する化合物の適当な位置に導入したアミン性官能基との反応により生成されてもよい。
【００３７】
ベンゾオキサジアゾール基は、Ｚのキナーゼ阻害活性を保持しつつ、キナーゼに結合すると蛍光が変化するように適宜、選ばれたＬおよびＸを介してＺと結合を形成する。
【００３８】
本発明の蛍光プローブ（Ｉ）は、例えば、置換基の種類によって、異性体が存在する場合がある。本明細書において、それらの異性体の一形態のみの化学構造で記載することがあるが、本発明には、構造上生じ得るすべての異性体（幾何異性体、光学異性体、互変異性体など）も含有し、異性体単体、またはそれらの混合物も含有する。
【００３９】
また、本発明の蛍光プローブ(Ｉ)は、その水溶性などの物性を調節するために、塩にして用いる場合があり、本発明には、化学性質上、生じ得るすべての塩も含有する。
本発明の蛍光プローブ（Ｉ）の具体的な化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
【００４０】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４１】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（３−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４２】
Ｎ−（４−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）フェニル）−３−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）プロパンアミド
【００４３】
３−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）−Ｎ−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）ベンズアミド
【００４４】
４−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）−Ｎ−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）ベンズアミド
【００４５】
４−（３−（ｔ‐ブチル）−５−（３−（４−（２−モルホリノエトキシ）ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）−Ｎ−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）ベンズアミド
【００４６】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）１‐ブチン−１−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４７】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）ブチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００４８】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（４−（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００４９】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５０】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（２−（（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）メチル）モルホリン−４−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５１】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（（２−（２−（２−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５２】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（４−（２−（メチル（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）アセチル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００５３】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（３−（６−（（４−（４−（７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル）ベンゾ［Ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−４−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）−２−メチルフェニル）ベンズアミド
【００５４】
本発明の蛍光プローブ（Ｉ）は、例えば以下の方法によって製造することができる。なお、以下に示した製造法において、定義した基が実施方法の条件下で変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護［Ｔ.Ｗ.Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉs ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］等の手段を付すことにより容易に製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
スキーム１
【００５５】
【化５】
【００５６】
スキーム１において、Ｒ１、Ｌ、ＸおよびＺは先に定義されたとおりであり、
ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）は、蛍光ラベル化試薬として種々のＡを官能基として有する誘導体が市販されており（例えば、東京化成工業株式会社などから入手可能）、官能基Ａは化合物（ＩＩ）と反応後、Ｘに変換される。もし、ＺがリンカーＬもしくはベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）と反応しうる適当な官能基を適当な位置に有しないときには、その前駆体化合物や、有機合成化学で通常用いられる方法を実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する誘導体を合成し、その誘導体を用いてスキーム１の反応を実施してもよい。また、リンカーＬを介して、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）でＺをラベル化するときは、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基など、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）との反応に適当な官能基を適当な位置に有しているＬ’を、必要であれば官能基の保護、脱保護を繰り返して、当業界で知られている通常の有機合成の条件などを用いてＺに導入し、得られた化合物（ＩＩ）を適当なベンゾキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）と反応させることにより、式（Ｉ）の所望の化合物を得ることができる。
ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬（ＩＩＩ）は、例えば、
【００５７】
アミノ基やメルカプト基のラベル化試薬として、ＡがＦやＣｌなどのハロゲン原子であるＮＢＤ−Ｃｌ、ＮＢＤ−Ｆ、イソチオシアネート基であるＮＢＤ−ＮＣＳ、
【００５８】
カルボキシル基のラベル化試薬として、ＡがピペラジンであるＮＢＤ−ＰＺ、ＤＢＤ−ＰＺ、２−アミノエチルアミノ基であるＤＢＤ−ＥＤ、Ｎ−ヒドラジノカルボニルメチル−Ｎ−メチルアミノ基であるＮＢＤ−ＣＯ−Ｈｚ
などが市販で入手可能である。
【００５９】
また、カルボニル基のラベル化には、Ａがヒドラジノ基であるＮＢＤ−ＨやＤＢＤ−Ｈ、水酸基のラベル化としては、ＡがＮ−クロロホルミルメチル−Ｎ−メチルアミノ基であるＤＢＤ−ＣＯＣｌなどが市販されている。
また、本発明のスクリーニング方法は、上記方法により得られた本発明の蛍光プローブとキナーゼの混合物に被験物質を添加し、その蛍光強度の変化（低下）が観察されたときに、被験物質をキナーゼ阻害剤として選択することを特徴とする。
【実施例】
【００６０】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【００６１】
化合物の同定は水素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）及びマススペクトル（ＭＳ）により行った。１Ｈ−ＮＭＲは、特に指示のないかぎりは４００MHzで測定されたものであり、また化合物及び測定条件によっては交換性水素が明瞭に観測されない場合がある。質量分析は液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣＭＳ）システムを用い、以下に示したＡ法もしくはＢ法にて測定した。
【００６２】
Ａ法：ＬＣＭＳ−２０１０Ａシステム（島津製作所）を使用し、質量分析はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）法により測定した。分離カラムはＣａｄｅｎｚａ ＣＤ‐Ｃ１８（５０×２ｍｍ）（インタクト社製）を用いた。溶出には１０ｍＭギ酸水溶液（Ａ液）および１０ｍＭギ酸メタノール溶液（Ｂ液）によるグラジェント法を用い、溶出条件は、流速０．５ｍＬ／分、０分〜０．５分（Ｂ液：５％（ｖ／ｖ））、０．５分〜２．５分（Ｂ液：５〜９５％（ｖ／ｖ）直線グラジェント）、２．５分〜４分（Ｂ液：９５％（ｖ／ｖ））とした。
【００６３】
Ｂ法：液体クロマトグラフ質量分析計システム（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱマス検出器、日本ウォーターズ社製）を使用し、質量分析はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）法により測定した。分離カラムはＵｎｉｓｏｎ ＵＳ‐Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ）（インタクト社製）を用いた。溶出には１０ｍＭギ酸水溶液（Ａ液）および１０ｍＭギ酸メタノール溶液（Ｂ液）によるグラジェント法を用い、溶出条件は、溶出条件は、流速２ｍＬ／分、０分〜０．５分（Ｂ液：５％（ｖ／ｖ））、０．５分〜３分（Ｂ液：１０〜９０％（ｖ／ｖ）直線グラジェント）、３分〜４分（Ｂ液：９０％（ｖ／ｖ））とした。
実施例１から８は、本発明の蛍光プローブ（Ｉ）のうち、Ｚがｐ３８ＭＡＰＫ阻害活性を有する化合物である場合を例として、具体的に説明する。
実施例１
【００６４】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）アミノ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア
【００６５】
【化６】
（第１工程）
【００６６】
４−ニトロフェニルヒドラジン（７６６ｍｇ）、ピバロイルアセトニトリル（６２６ｍｇ）をエタノール（１２ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（２．５ｍＬ）を加え９０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗生成物をエタノールで懸濁洗浄し、３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−アミン塩酸塩１．３１ｇを得た。
（第２工程）
【００６７】
３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−アミン塩酸塩（２９７ｍｇ）にジクロロメタン（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（１６７μＬ）、１−ナフチルイソシアネート（１５８μＬ）を加え８０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣に水（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア１４５ｍｇを得た。
（第３工程）
【００６８】
１−（３−（ｔ‐ブチル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア（１４５ｍｇ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、ギ酸アンモニウム（１３２ｍｇ）、触媒量の１０％パラジウム−炭素を加え９０℃で３時間還流した。不溶物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、１−（１−（４−アミノフェニル）−３−（ｔ‐ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア８１ｍｇを得た。
（第４工程）
【００６９】
１−（１−（４−アミノフェニル）−３−（ｔ‐ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）ウレア（２１ｍｇ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、４‐フルオロ‐７‐ニトロ-２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール（１０ｍｇ）を加え室温で１８時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて表題化合物２２ｍｇを得た。ＬＣＭＳ：ＨＰＬＣ保持時間３．５３分（Ａ法）、ｍ／ｚ５６３（ＭＨ＋）。
【００７０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 6.44 (s, 1H), 6.85 (d, J=8.78 Hz, 1H), 7.47 (t, J=7.91 Hz, 1H), 7.51 - 7.61 (m, 2H), 7.62 - 7.77 (m, 5H), 7.87 - 7.98 (m, 2H), 8.04 (d, J=8.28 Hz, 1H), 8.57 (d, J=8.78 Hz, 1H), 8.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 11.18 (s, 1H).
【００７１】
下記実施例２から７の化合物は、実施例１に記載の方法もしくは類似の方法に従い、適当な試薬および有機合成化学で通常用いられる方法により製造した。表中のＭｅｔｈｏｄはＬＣＭＳの分析方法、ＲＴはＬＣＭＳにおけるＨＰＬＣ保持時間、ＭＳはＬＣＭＳにおけるマススペクトル分析データ（特に指示のない限りポジティブイオンモードで測定されたＭＨ+）を示す。
【００７２】
【表１】
また、実施例９から１４は、本発明の蛍光プローブ（Ｉ）のうち、ＺがＢＴＫ阻害活性を有する化合物である場合を例として、具体的に説明する。
参考例１
【００７３】
４−（（６−（３−（４−（ｔ‐ブチル）ベンズアミド）−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）安息香酸
【００７４】
【化７】
（第1工程）
【００７５】
文献Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．４８、ｐ．１９０１（２００５年）に記載の方法で調製した３，５−ジブロモ−１−メチルピラジン−２（１Ｈ）−オン（５９３ｍｇ）のジメチルアセトアミド溶液（３．７ｍＬ）に４‐アミノ安息香酸エチル（４７５ｍｇ）を加え、マイクロウェーブ合成装置を用いて１０５℃で２０時間反応させた。析出した固体をろ取し、酢酸エチルで洗浄後、乾燥させてエチル ４−（（６−ブロモ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート６２０ｍｇを得た。
【００７６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δppm 1.39 (t, J=7.15 Hz, 3H), 3.55 (s, 3H), 4.37 (q, J=7.28 Hz, 2H), 6.83 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.78 Hz, 2H), 8.06 (d,J=8.78 Hz, 2H), 8.45 (s, 1H).
（第２工程）
【００７７】
エチル ４−（（６−ブロモ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート（８７０ｍｇ）の１，４−ジオキサン溶液（７．６ｍＬ）に３‐アミノ‐２‐メチルフェニルボロン酸ピナコールエステル（７４９ｍｇ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（４００ｍｇ）、２．４Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）を加え、１０５℃で６０時間撹拌した。不溶物をセライトろ過した後、ろ液にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、２Ｍ塩酸（５０ｍＬ）で抽出した。水層に２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）を加えてアルカリ性にした。析出した固体をろ取し、水で洗浄後、乾燥させてエチル ４−（６−（３−アミノ−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート５８８ｍｇを得た。
（第３工程）
【００７８】
エチル ４−（６−（３−アミノ−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート（５８８ｍｇ）のジクロロメタン溶液溶液（７．８ｍＬ）にピリジン（０．１４ｍＬ）、４‐ｔ‐ブチルベンゾイルクロリド（０．４５５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、エチル ４−（（６−（３−（４−（ｔ‐ブチル）ベンズアミド）−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート５３４ｍｇを得た。
（第４工程）
【００７９】
エチル ４−（（６−（３−（４−（ｔ‐ブチル）ベンズアミド）−２−メチルフェニル）−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−イル）アミノ）ベンゾエート（４００ｍｇ）のテトラヒドロフラン溶液（７ｍＬ）に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（７ｍＬ）、エタノール（７ｍＬ）を加え、８０℃で３時間撹拌した。反応混合物に１Ｍ塩酸（７ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して表題化合物３７７ｍｇを得た。
【００８０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.33 (s, 9H), 2.30 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 7.25 - 7.36 (m, 3H), 7.40 (dd, J=6.53, 2.51 Hz, 1H), 7.56 (d, J=8.28 Hz, 2H), 7.85 (d, J=8.78 Hz, 2H), 7.96 (d, J=8.53 Hz, 2H), 8.14 (d, J=8.78 Hz, 2H), 9.59 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 12.58 (s, 1H).
実施例９
【００８１】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（２−メチル−３−（４−メチル−６−（（４−（４−（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）フェニル）ベンズアミド
【００８２】
【化８】
【００８３】
参考例１で得られた化合物（５０ｍｇ）のテトラヒドロフラン溶液（１．６ｍＬ）に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５６ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４５ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌したのち、４‐ニトロ‐７‐ピペラジノ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール（３６．６ｍｇ）のジメチルホルムアミド（０．３ｍＬ）溶液を加え、室温でさらに１８時間撹拌した。反応混合物にクロロホルム（５０ｍＬ）を加え、１Ｍ塩酸、水、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し表題化合物６３ｍｇを得た。ＬＣＭＳ：ＨＰＬＣ保持時間３．７２分（Ｂ法）、ｍ／ｚ７４２（ＭＨ＋）。
【００８４】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 2.30 (s, 3H), 3.58 (s, 3H), 3.80 (br. s., 4H), 4.22 (br. s., 4H), 6.60 (d, J=9.29 Hz, 1H), 7.24 - 7.41 (m, 4H), 7.44 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.94 (d, J=8.53 Hz, 2H), 8.12 (d, J=8.78 Hz, 2H), 8.52 (d, J=9.03 Hz, 1H), 9.50 (s, 1H), 9.89 (s, 1H).
【００８５】
下記実施例１０から１３に示す化合物は、実施例９に記載の方法もしくは類似の方法に従い、適当な試薬および有機合成化学で通常用いられる方法により製造した。表中のＭｅｔｈｏｄはＬＣＭＳの分析方法、ＲＴはＬＣＭＳにおけるＨＰＬＣ保持時間、ＭＳはＬＣＭＳにおけるマススペクトル分析データ（特に指示のない限りポジティブイオンモードで測定されたＭＨ+）を示す。
【００８６】
【表２】
実施例１４
【００８７】
４−（ｔ‐ブチル）−Ｎ−（３−（６−（（４−（４−（７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル）ベンゾ［Ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）アミノ）−４−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロピラジン−２−イル）−２−メチルフェニル）ベンズアミド
【００８８】
【化９】
【００８９】
実施例９に記載の手順に従って、４‐ニトロ‐７‐ピペラジノ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾールの替わりに４‐（Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノスルホニル）‐７‐ピペラジノ‐２，１，３‐ベンゾオキサジアゾール（２７ｍｇ）を用い、反応・処理することにより表題化合物４７ｍｇを得た。
ＬＣＭＳ：ＨＰＬＣ保持時間３．７２分（Ｂ法）、ｍ／ｚ８０４（ＭＨ＋）。
【００９０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 2.30 (s, 3H), 2.65 - 2.80 (m, 6H), 3.58 (s, 3H), 3.75 (br. s., 4H), 3.96 (br. s., 4H), 6.60 (d, J=8.28 Hz, 1H), 7.25 - 7.34 (m, 3H), 7.38 (dd, J=6.90, 2.38 Hz, 1H), 7.43 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.54 (d, J=8.53 Hz, 2H), 7.86 (d, J=8.03 Hz, 1H), 7.94 (d, J=8.28 Hz, 2H), 8.12(d, J=8.78 Hz, 2H), 9.50 (s, 1H), 9.90 (s, 1H).
実施例１５
リン酸化（活性型）および脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫに対するキナーゼ活性阻害試験
【００９１】
リン酸化（活性型）ＢＴＫは、ビオチン化ＢＴＫ蛋白質ＢＴＮ−ＢＴＫ(カルナバイオサイエンス社製）酵素溶液にＡＴＰ、ＭｇＣｌ２をそれぞれ３ｍＭ、１０ｍＭとなるように添加し、４℃で一晩反応させた後、１０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎを用いてバッファー交換を行い、未反応のＡＴＰを除去することにより得た。
【００９２】
脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫは、ＢＴＮ−ＢＴＫ酵素溶液にλ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｐ０７５３Ｓ）とＭｎＣｌ２をそれぞれ１０Ｕ／μｇ、２ｍＭとなるように添加し、４℃で一晩反応させた後、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ｔａｇ抗体アガロースゲルクロマトグラフィーによりλ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを除去したのち、１０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎを用いてバッファー交換を行い得た。
【００９３】
キナーゼ活性の測定は、ＭＳＡアッセイキット（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓｉｓｔ(商標)ｋｉｔ、カルナバイオサイエンス社製）を用いて行った。キナーゼ反応の基質は、キット付属のＦＩＴＣ標識ＳＲＣｔｉｄｅペプチドを用いた。アッセイバッファー［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標）、２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｐＨ７．５]を用い、基質（４μＭ）、ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ）、ＡＴＰ（１００μＭ、リン酸化ＢＴＫ用もしくは２００μM、脱リン酸化ＢＴＫ用）となるように調整し、基質混合液を作成した。またキナーゼを０．６ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から、１０濃度（０．００００３ｍＭ、０．０００１ｍＭ、０．０００３ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ）にＤＭＳＯでさらに希釈し、それぞれをアッセイバッファーで２５倍希釈して、薬物溶液を調整した（４％ＤＭＳＯ溶液）。
【００９４】
薬物溶液もしくは溶媒溶液（コントロール）（４％ＤＭＳＯ−アッセイバッファー）５μＬ、基質混合液５μＬ、および酵素溶液１０μＬをポリプロピレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１時間室温で反応させた後、６０μＬのキット付属のターミネーションバッファーを添加し反応を停止させた。反応阻害率は、ＬａｂＣｈｉｐ ＥＺ ＲｅａｄｅｒIIシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、アッセイキットのプロトコールに従って測定した。
【００９５】
ＦＩＴＣ標識ＳＲＣｔｉｄｅペプチド（キナーゼ反応基質：Substrate），及び、そのリン酸化物（Product）の、蛍光強度のピークの高さをそれぞれＳおよびＰとし、被験化合物の阻害率（％）を次の式に従って算出した。
またブランクとして酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。
被験化合物のキナーゼ阻害率（％）は、次の式に従って算出した。
キナーゼ阻害率（％）＝（１−（Ｃ−Ａ）／（Ｂ−Ａ））×１００
ただし、ＡはブランクのＰ／（Ｐ＋Ｓ）、ＢはコントロールのＰ／（Ｐ＋Ｓ）、Ｃは被験化合物ウェルのＰ／（Ｐ＋Ｓ）を示す。
また、ＩＣ５０値は、阻害率と被験化合物濃度（対数）の回帰分析により算出した。
【００９６】
表３に示すとおり、実施例９から１１の本発明の蛍光プローブは、蛍光標識していないＣＧＩ１７４６（公知の不活性型キナーゼに結合する化合物）と同様に脱リン酸化ＢＴＫのキナーゼ活性を強く阻害することが判明した。
【００９７】
【表３】
実施例１６
標的キナーゼへの結合による蛍光プローブの蛍光強度変化の測定
【００９８】
本発明の蛍光プローブ（実施例９）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液をアッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５（商標）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５］で希釈し、１μＭの蛍光プローブ溶液を調整した。同様にして競合化合物（ＣＧＩ１７４６）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から１００μＭの競合化合物溶液を調整した。また標的キナーゼとして、脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを０．２、１、３μＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。ポリスチレン製３８４穴プレートの各ウェルに、酵素溶液と蛍光プローブ溶液を等量ずつ加え、室温で1時間インキュベートした。ブランクとして、酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。また、競合試験として、最終濃度５μＭとなるように上記競合化合物溶液を加えて調整した反応溶液も測定した。各ウェルの蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙＨ１マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ社製）で測定した（測定波長：励起４８５ｎｍ／蛍光５５０ｎｍ）。
【００９９】
結果を図１に示す。図１に示されるように標的キナーゼである脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫの存在により濃度依存的に蛍光プローブの蛍光強度の増加が認められる。また、競合化合物であるキナーゼ阻害剤ＣＧＩ１７４６の添加により蛍光強度が低下することから、この系は結合部位特異的に起こり、また可逆的なことが理解される。
実施例１７
脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを用いた蛍光プローブの結合活性測定
【０１００】
蛍光プローブ（実施例９）の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から、２ｍＭを最高濃度として公比２でＤＭＳＯ希釈した１３濃度のＤＭＳＯ溶液を、さらに実施例１６記載のアッセイバッファーで１０００倍希釈して、蛍光プローブ溶液を調整した（０．１％ＤＭＳＯ溶液)。同様にして競合化合物（ＣＧＩ１７４６）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から実施例１６記載のアッセイバッファーを用いて４０μＭの競合化合物溶液を調整した。また脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを１２０ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。蛍光プローブ溶液４０μＬ、コントロール溶液（４％ＤＭＳＯ−アッセイバッファー）２０μＬ、および酵素溶液２０μＬをポリプロピレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１時間室温でインキュベートした後、各ウェルの蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙＨ１マイクロプレートリーダーで測定した（測定波長：励起４８５ｎｍ／蛍光５５０ｎｍ）。またコントロール溶液の代わりに競合化合物溶液を加えたウェルの蛍光強度も測定し、これをバックグラウンドとして測定値から差し引き、蛍光強度変化量（ΔＲＦＵ）とした。各蛍光プローブ濃度における蛍光強度変化量（ΔＲＦＵ）を蛍光プローブ化合物濃度に対してプロットし、飽和曲線を作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア(ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて、蛍光プローブの乖離定数（Ｋｄ）を算出した。
図２に測定結果を示す。脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫに対する蛍光プローブ（実施例９）のＫｄ値は６３ｎＭと測定された。
【０１０１】
この結果は、本発明の蛍光プローブが、不活性型ＢＴＫから非常に解離し易く、競合する不活性型キナーゼを標的とする候補化合物のスクリーニングに有用であることを示している。
実施例１８
脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを用いた競合結合測定試験
【０１０２】
本発明の蛍光プローブ（実施例９）の１ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を実施例１６記載のアッセイバッファーで希釈し、１００ｎＭの蛍光プローブ溶液を調整した。また脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫを１００ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物（ＣＧＩ１７４６）の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液から、２０μＭを最高濃度として公比２でＤＭＳＯ希釈した８濃度のＤＭＳＯ溶液を、さらに実施例１６記載のアッセイバッファーで２５倍希釈して、薬物溶液を調整した（４％ＤＭＳＯ溶液）。薬物溶液２０μＬと酵素溶液２０μＬをポリスチレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１５分後、蛍光プローブ溶液（４０μＬ）を添加した。室温で２時間インキュベートした後、各ウェルの蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙＨ１マイクロプレートリーダーで測定した（測定波長：励起４８５ｎｍ／蛍光５５０ｎｍ）。蛍光強度とキナーゼ阻害剤濃度をプロットしＩＣ５０値を算出した。
【０１０３】
結果を図３に示す。脱リン酸化（不活性型）ＢＴＫと蛍光プローブ（実施例９）に対するＣＧＩ１７４６の競合阻害活性（ＩＣ５０値）は２２ｎＭと測定された。
【０１０４】
つまり、本発明の蛍光プローブを用いて、既知の不活性型ＢＴＫを阻害する化合物（ＣＧＩ１７４６）の阻害活性を決定できたことは、本発明の蛍光プローブが、不活性型キナーゼのスクリーニングに有効であることを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）を有する新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブ。
【化１】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
【請求項２】
Ｚが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害活性を有する化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
Ｚが、下式（Ｉa）を有する化合物である、請求項１または２に記載の蛍光プローブ。
【化２】
（式中、Ｒ２は置換されてもよいアルコキシ基を表す。）
【請求項４】
Ｚが、ＢＴＫ阻害活性を有する化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｚが、下式（Ｉｂ）を有する化合物である、請求項１または４に記載の蛍光プローブ。
【化３】
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の蛍光プローブを使用することを特徴とするキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項７】
不活性型キナーゼを標的とした、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
下式（Ｉ）を有する新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブ。
【化１】
（式中、Ｚは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Ｌは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Ｘは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、Ｒ１はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。）
【請求項２】
Ｚが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害活性を有する化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
Ｚが、下式（Ｉa）を有する化合物である、請求項１または２に記載の蛍光プローブ。
【化２】
（式中、Ｒ２は置換されてもよいアルコキシ基を表す。）
【請求項４】
Ｚが、ＢＴＫ阻害活性を有する化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｚが、下式（Ｉｂ）を有する化合物である、請求項１または４に記載の蛍光プローブ。
【化３】
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の蛍光プローブを使用することを特徴とするキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項７】
不活性型キナーゼを標的とした、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−１０４６８７（Ｐ２０１３−１０４６８７Ａ）
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４６６９５（Ｐ２０１１−２４６６９５）
【出願日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【出願人】（５０３２８６４２４）カルナバイオサイエンス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【出願人】（５０３２８６４２４）カルナバイオサイエンス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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