新規なＩＬ−１７結合化合物およびその医薬用途
本発明は、新規なＩＬ−１７阻害ポリペプチド、対応する融合タンパク質、組成物およびそれらの医薬用途に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＩＬ−１７阻害ポリペプチド、対応する融合タンパク質、組成物およびそれらの医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、適応免疫系または自然免疫系の他の細胞を支援することによって、免疫応答の調整において中心的な役割を果たす。初期の研究では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の２つのクラス（Ｔｈ１およびＴｈ２）が特定された。より最近では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の新規サブセットであるＴｈ１７系が特定された。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫が充分に及ばない、いくつかの菌類および微生物に加えて、細胞外の細菌に対する増強された宿主保護を担当する、適応免疫系の１部門として発生したと見られる。
【０００３】
Ｔｈ１７細胞は、新規なサイトカインファミリーであるＩＬ−１７ファミリーの発見との関連で特定されたが、現在は、このファミリーは６種（ＩＬ−１７Ａ〜Ｆ）を含むことが知られている。ＩＬ−１７（旧称ＣＴＬＡ−８）は主としてＴｈ１７細胞によって発現され、ＩＬ−１７Ａと規定されたが、これはこのサイトカインファミリーの創設種であることを示す。ＩＬ−１７の構成種は、他の現在知られている哺乳類タンパク質と配列相同性を持たず、従って、独特なサイトカインファミリーを構成する。構造類似性からヘテロダイマーが存在する可能性が暗示されるが、ＩＬ−１７Ｆの結晶構造から推定されるＩＬ−１７ファミリーの構成員の構造的特徴により、多数のサイトカインと同様に、それぞれのファミリーの構成員はおそらくホモダイマーとして産生されることが提示される。極最近、活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって発現されたＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆのヘテロダイマーが、ＩＬ−１７ＲＡ／ＩＬ−１７ＲＣ複合体を介してシグナルを送ることが特定された（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）Ｊ．Ｆ．ら（２００８年）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８１，２７９９−２８０５頁）。
【０００４】
以前はＴｈ１を介すると考えられていた、慢性炎症性疾患における中心的メディエーターおよびいくつかのタイプの自己免疫状態における主要な病原性エフェクターとして、Ｔｈ１７細胞が特定されたことにより、新たな治療アプローチが期待される（ウェーバー（Ｗｅａｖｅｒ）Ｔ．ら（２００８年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５，８２１−８５２頁）。実際に、炎症促進サイトカインであるＩＬ−１７は主にＴｈ１７細胞によって発現され、関節リウマチ（ＲＡ）患者では滑液中のレベルが上昇しており、初期ＲＡ発症に関与することが示されている。加えて、ＩＬ−１７は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の強力な誘導物質であるが、後者は骨侵食の主要原因であり、罹患患者にはひどい痛みをもたらす（ルバーツ（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ）Ｅ．（２００８年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，４１，８４−９１頁）。さらに、ＩＬ−１７の不適切または過剰な産生は、種々の他の疾病および障害の病理と関係するが、例えば、これらの疾病および障害としては、変形性関節症、骨インプラントの弛緩、急性移植拒絶反応（アントニサミー（Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ）ら、（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２，５７７−５８４頁；ヴァン・コーテン（ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ）ら（１９９８年）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，９，１５２６−１５３４頁）、敗血症、敗血性または内毒素性ショック、アレルギー、喘息（モレット（Ｍｏｌｅｔ）ら（２００１年）Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０８，４３０−４３８頁）、骨量の減少、乾癬（テウニッセン（Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１１，６４５−６４９頁）、虚血、全身性硬化症（クラサワ（Ｋｕｒａｓａｗａ）ら（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４３，２４５５−２４６３頁）、脳卒中、および他の炎症性疾患が挙げられる。
【０００５】
結果として、抗ＩＬ−１７化合物は、抗炎症薬としての可能性があり、多数のインビボ試験に沿った治療アプローチによって、ＩＬ−１７の中和が、関節炎等の炎症過程を減ずることが示される。例えば、関節炎の初期段階の間、免疫方法の後に開始する、ＩＬ−１７受容体ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質による内因性ＩＬ−１７の早期中和により、実験的関節炎の発症が抑制される（ルバーツ（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ）ら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７，１００４−１０１３頁）。さらに、動物モデルにおいて、コラーゲン誘導関節炎の発症後、中和抗ＩＬ−１７抗体による治療により、関節の炎症、軟骨破壊および骨侵食が減少した（ルバーツら（２００４年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５０；６５０−６５９頁）。組織学的分析により、関節の炎症の抑制が確認され、抗ＩＬ−１７抗体による治療後、全身性ＩＬ−６レベルが有意に減少した。対照的に、マウスＩＬ−１７を発現しているアデノウイルスベクターを用いた全身性および局所性ＩＬ−１７の過剰発現により、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の発症が加速され、その部位での滑膜炎が悪化した（ルバーツら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７，１００４−１０１３頁およびルバーツら（２００２年），Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．５１，１０２−１０４頁）。
【０００６】
抗体は、その製造し易さ、実質的にあらゆる所望の標的抗原に対して親和性および特異性が高いため、分析、精製、診断および治療目的に日常的に使用されるが、なおも多数の重大な欠点があり、例えば、複雑な哺乳類細胞の産生系が必要なこと、ジスルフィド結合の安定性への依存、ある抗体断片の凝集傾向、低溶解性、および最後に大切なことだが、抗体はヒト化した場合であっても望まない免疫反応を引き起こす可能性がある。結果として、最近、新規な分類の万能結合タンパク質を産生するための骨格として、小さな球状タンパク質の開発が注目されるようになった。多様性および標的特異性を与えるため、典型的には、好適な生物物理学的特性を有するタンパク質骨格の表面成分（例えば細胞外ループ）は組み合わせて変化させて、興味のある標的結合特異性をスクリーニングするタンパク質ライブラリーを製造する（ビンツ（Ｂｉｎｚ），Ｈ．Ｋ．，およびプルックスン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ），Ａ．（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，４５９−４６９頁）。
【０００７】
これらの非免疫グロブリン由来結合試薬は、集合的に規定された「骨格」である（スケッラ（Ｓｋｅｒｒａ）Ａ．（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，１６７−１８７頁）。５０を超える異なるタンパク質骨格が、過去１０〜１５年にわたって提案され、この分野の最先端のアプローチは（ゲバウアー（Ｇｅｂａｕｅｒ）ＭおよびスケッラＡ．（２００９年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５頁に要約）：アフィボディ（ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに基づく）、クニッツ型ドメイン、アドネクチン（ヒトフィブロネクチンの第１０ドメインに基づく）、アンチカリン（リポカリン由来）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリン反復タンパク質由来）、アビマー（多量体化ＬＤＬＲ−Ａに基づく）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）（超高熱古細菌由来のＳａｃ７ｄに基づく）、およびヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来するフィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）である。
【０００８】
一般に、ＳＨ３ドメインは、細胞間情報伝達に関与する、多種多様のタンパク質中に存在する（ムサッキオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）ら（１９９４年）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６１；２８３−２９７頁）。このドメインは、タンパク質中で一定の位置を占有せず、独立して発現および精製され得る。現在、約３００のヒトＳＨ３ドメインを有する１０００を超えるドメインの存在が知られている（ムサッキオＡ．（２００３年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６１；２１１−２６８頁）。ＳＨ３ドメインには広範な配列多様性があるが、全てのＳＨ３ドメインは保存された折りたたみ構造：２つの逆平行βシートで形成されるコンパクトなβバレルを共有する（ムサッキオＡ．（２００３年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６１；２１１−２６８頁）。代表的には、ＳＨ３ドメインは、ＰＸＸＰコア結合モチーフを含有する高プロリン含有ペプチドに結合する（レン（Ｒｅｎ）ら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９；１１５７−１１６１頁）が、非従来型のＳＨ３結合部位の例も記載されている（カークカイネン（Ｋａｒｋ−ｋａｉｎｅｎ）ら（２００６年）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．７；１８６−１９１頁）。これまでに配列決定したＳＨ３ドメインの多くは、およそ６０〜６５個のアミノ酸の全長を有するが、それらのいくつかは、二次構造の主要な保存エレメントに接続するループ中に挿入することにより、８５個のアミノ酸の特徴を有するかもしれない（コヤマ（Ｋｏｙａｍａ）ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２（６）；９４５−９５２頁）。種々のＳＨ３ドメインのアライメントにより、適切な構造形成および標準的な高プロリン含有モチーフの認識に関与する、保存アミノ酸残基が明らかになった（ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９；２１７０−２１８０頁）。
【０００９】
最近、本発明者らは、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインが、結合タンパク質産生に特に魅力的な骨格（「フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）」）であることを実証したが、これは、このドメインが、（ｉ）細菌中、溶解形態で多量発現され得ること、（ｉｉ）単量体であり、溶液中で保存した際に凝集しないこと、（ｉｉｉ）非常に安定であること（Ｔｍ ７０．５℃）、（ｉｉｉ）システイン残基がないこと、および（ｉｖ）マウスからヒトへ完全に保存されたアミノ酸配列を特徴とするヒト由来のものであり、従って非免疫原性であることによる（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、新規なＩＬ−１７Ａ結合分子を提供することであり、特に、ＩＬ−１７Ａに対して特異性および親和性が高い新規なＩＬ−１７Ａ結合分子を提供することである。さらなる目的は、好ましくはＩＬ−１７Ａが介在する疾患および医学的症状の治療および／または予防用の医薬品における使用のための、研究、診断および医学的処置に好適な、ＩＬ−１７Ａ結合分子、好ましくは、ＩＬ−１７阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、上記の目的は、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによって解決された：
（ｉ）（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）ａ−Ｄ−（Ｘ）ｂ−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）ｃ−Ｉ−（Ｘ）ｄ−Ｇ−（Ｘ）ｅ−ＷＷ−（Ｘ）ｆ−Ａ−（Ｘ）ｇ−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）ｈＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ （Ｉ）
式中、ａ〜ｈは０〜２０であり、
好ましくは、ａは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは６であり；
好ましくは、ｂは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｃは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｄは１〜１０であり、より好ましくは３〜９であり、最も好ましくは５または７であり；
好ましくは、ｅは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｆは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｇは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｈは０〜６であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１または２である；
（ｉｉ）（ｉ）に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）好ましくはストリンジェントな条件下で、（ｉ）をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸によってコードされる、アミノ酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片または機能性誘導体、
ここで、前記のポリペプチドはＩＬ−１７Ａに結合する。
【００１２】
上記一般式（Ｉ）は、ヒトＦｙｎ ＳＨ１３骨格の反復的および広範囲の突然変異解析およびＩＬ−１７Ａ結合に基づく選択の結果である。
【００１３】
Ｘで規定する位置は、アミノ酸のタイプおよびアミノ酸の数によっても広範に変化し得る。好ましくは、Ｘはいずれもシステインではない。Ｘによるアミノ酸の好ましい数は、下付き文字ａ〜ｈで示され、これらは全て、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０または１〜１０である。
【００１４】
天然のヒトＦｙｎ ＳＨ３において、（Ｘ）ａおよび（Ｘ）ｄは、それぞれ、ＲＴ−およびＳｒｃループと相関する可能性がある。必須ではないが、（Ｘ）ａおよび（Ｘ）ｄはループ構造を提供することが好ましい。典型的なループ構造は、２から２０を超えるアミノ酸を含むことが知られている（ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９；２１７０−２１８０頁）。従って、（Ｘ）ａおよび／または（Ｘ）ｄは、２〜２０のアミノ酸を有することが好ましい。好ましくは、ａは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは６である。好ましくはｄは１〜１０であり、より好ましくは３〜９であり、最も好ましくは５または７である。好ましくは（Ｘ）ａはＴＡＦＷＰＧであり、より好ましくはＶＡＦＷＰＧであり、最も好ましくはＫＡＦＷＰＧである。好ましくは（Ｘ）ｄはＬＮＳＳＥであり、より好ましくはＴＲＴＳＤまたはＬＨＴＳＤであり、最も好ましくはＬＲＴＳＤである。
【００１５】
（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｅ、（Ｘ）ｆおよび（Ｘ）ｇは、互いに独立して、好ましくは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。（Ｘ）ｈは好ましくは０〜６であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。
【００１６】
最も好ましい態様において、式（Ｉ）は以下である：
（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）６−Ｄ−（Ｘ）１−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）１−Ｉ−（Ｘ）５−７−Ｇ−（Ｘ）１−ＷＷ−（Ｘ）１−Ａ−（Ｘ）１−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）１−２ＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ （Ｉａ）
【００１７】
勿論、式（Ｉ）のアミノ酸配列には大多数のバリエーションがあり、それらは依然として本発明のポリペプチドのＩＬ−１７Ａ結合を可能にするであろう。従って、本発明は、（ｉ）に対して、少なくとも５０、６０または７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、ポリペプチドも包含する。
【００１８】
本書で使用する場合、アミノ酸配列間の「アミノ酸配列同一性」という用語は、生化学の当業者が通常広く使用するアラインメントおよび比較技術に関連することが意図される。２つのアミノ酸配列のアミノ酸配列同一性は、通常のアラインメント方法およびツールによって測定し得る。例えば、式（Ｉ）のアミノ酸配列に対する、任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を測定には、ＳＩＭ局所相似性プログラムを使用し得る（シャオキン・ファン（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ）およびウェッブ・ミラー（Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ）、「時間効率のよい線形空間局所相似性アルゴリズム（Ａ Ｔｉｍｅ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， Ｌｉｎｅａｒ−Ｓｐａｃｅ Ｌｏｃａｌ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」 Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， １２巻： ３３７−３５７頁， １９９１年）が、これは著者らおよびその機関から自由に入手可能であり（ワールドワイドウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照）、多重アラインメント分析には、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用し得る（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列加重、位置特異的ギャップペナルティおよび加重マトリックス選択による進行性多重配列アラインメント感度の改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０頁，１９９４年）。好ましくは、本発明のポリペプチド、断片または機能性誘導体の、式（Ｉ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性の程度は、式（Ｉ）の完全な配列に対して定量する。
【００１９】
さらに、本発明は、好ましくはストリンジェントな条件の下で、（ｉ）をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含する。換言すれば、本発明によるポリペプチドに包含されるアミノ酸配列は、好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする能力をなお有するべき核酸をコードすることによって、間接的に規定される。核酸が互いにハイブリダイズするかどうかは、特異的アラインメントおよび比較ツールにより、また実験的に、当該技術において規則的に測定される。１つの核酸がストリンジェントな条件下で特異的な参照核酸配列にハイブリダイズする能力を測定する、従来技術の一般的および／または標準的なプロトコル（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびルセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）（３巻），２００１年）の次に、興味のあるポリペプチドをコードする任意の核酸がストリンジェントな条件下で式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖にハイブリダイズする能力を、アラインメントツールを用いてこれら２つのヌクレオチド配列を比較することによって分析および測定することが好ましく、アラインメントツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０頁，１９９０年）およびＬＡＬＩＧＮアラインメントツール等が挙げられる。より好ましくは、本発明のポリペプチドであることが疑われる、興味のあるポリペプチドをコードする核酸が式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする能力は、以下の条件下でのサザンブロット分析で確認される：４５℃で、６ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後、６５℃で、０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄。
【００２０】
さらに、本発明は、上記の本発明のアミノ酸配列全ての断片、好ましくは機能性断片、または機能性誘導体を含む、ポリペプチドを包含する。
【００２１】
従って、「本発明によるポリペプチドまたはアミノ酸配列」という用語は、上記で特定された性質を有する、即ちＩＬ−１７Ａに結合する、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能性断片および誘導体も包含する。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能性誘導体は、ＩＬ−１７Ａへの結合を実証する、実質的に充分入手しやすいアミノ酸残基または非天然等価体を有する、あらゆるアミノ酸配列および／またはその化学誘導体（非天然アミノ酸等価体、グリコシル化、化学誘導）を包含することが意図される。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能性誘導体において、１以上のアミノ酸が、欠失、修飾、挿入および／または置換されてもよい。さらに、「機能性誘導体」との関連で、挿入とは、１以上のアミノ酸の上述の非誘導体化結合タンパク質中への挿入を言う。機能性誘導体は、５、４、３、２を超える、または１を超えるアミノ酸の変更（即ち、欠失、修飾、挿入および／または置換されたアミノ酸）を含まないことが、さらに好ましい。別の態様において、ポリペプチドまたはアミノ酸配列の全てのアミノ酸の、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下が変更される（即ち、欠失、修飾、挿入および／または置換されたアミノ酸である）ことが、さらに好ましい。誘導体における置換は、保存的または非保存的置換であってもよいが、好ましくは保存的置換である。いくつかの態様において、置換として、天然に存在するアミノ酸の、天然に存在しないアミノ酸での交換も挙げられる。保存的置換は、アミノ酸の、置換されるアミノ酸に類似した化学的性質を有する別のアミノ酸での置換を含む。好ましくは、保存的置換は、（ｉ）塩基性アミノ酸の、別の塩基性アミノ酸での置換；（ｉｉ）酸性アミノ酸の、別の酸性アミノ酸での置換；（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸の、別の芳香族アミノ酸での置換；（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸の、別の非極性脂肪族アミノ酸での置換；および（ｖ）極性非荷電アミノ酸の、別の極性非荷電アミノ酸での置換よりなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンよりなる群から選択される。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩より選択される。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンよりなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンよりなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンよりなる群から選択される。保存的アミノ酸置換と対照的に、非保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、上記で概説した保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に該当しない、あらゆるアミノ酸との交換である。機能性誘導体が欠失を含む場合には、誘導体中、参照ポリペプチド中に存在する１つまたはいくつかのアミノ酸が除去されている。しかし、欠失は、誘導体中に、全部でアミノ酸３つ未満、好ましくは４つ未満、より好ましくは５つ未満、および最も好ましくは６つ未満であるよう、多数であるべきではない。上記の通り、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列のアミノ酸は修飾されてもよく、例えば化学的に修飾されてもよい。例えば、ポリペプチドのアミノ酸の側鎖または遊離アミノまたはカルボキシ末端は、例えば、グリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等によって修飾されてもよい。化学的修飾はインビボでも、例えば宿主細胞中でも起こり得るが、これは当該技術においてよく知られている。例えば、好適な化学的修飾モチーフ、例えばポリペプチドのアミノ酸配列中に存在するグリコシル化配列モチーフは、ポリペプチドをグリコシル化させるであろう。本発明の機能性誘導体に言及する全ての態様において、本書の上記で規定した式（Ｉ）を有するアミノ酸配列は、機能性誘導体が導入される出発分子であることを理解しなければならない。挿入の場合、２つの出発分子において、第一の分子でＸａが４であり、第二の分子でＸａが５である以外は同一の配列を有する場合、例えばＸａのＣ末端への挿入が、第一の分子では２つのアミノ酸であり、第二の分子では１つのアミノ酸であるならば、同一の長さで、おそらく同一のアミノ酸配列の分子が得られるであろう。
【００２２】
本発明のポリペプチドはＩＬ−１７Ａに結合し、好ましくはヒトＩＬ−１７Ａに結合する。好ましくは、ＩＬ−１７Ａに特異的に結合し、即ち、他のサイトカインには結合しないか、それらにははるかにより少ない程度に結合し、好ましくは少なくとも２、５、１０、５０、１００、５００または１０００倍少なく結合する。本発明のポリペプチドの結合特異性を定量するための典型的で好ましいＥＬＩＳＡ分析を、実施例６および７に示す。
【００２３】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１７Ａに、特異的および高結合親和性で結合する。
【００２４】
さらに好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ−１７Ａに対して特異的な（インビボおよび／またはインビトロ）結合親和性を有し、好ましくはＫＤが１０−７〜１０−１２Ｍであり、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍであり、最も好ましくは１０−１２Ｍ未満である。例として、および好ましくは、本発明のポリペプチドの結合親和性は、以下の実施例２によって定量し得る。
【００２５】
最も好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、明細書に付記した通りの配列番号１〜１１９またはそれらの機能性誘導体よりなる群から選択される。
【００２６】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−１７Ａに結合するだけではなく、実際にＩＬ−１７Ａ（機能）を阻害する。この容量は、実施例３および１０に実証されており、ここで、ＩＬ−１７Ａの添加に対する応答において、ポリペプチドがヒト皮膚線維芽細胞中のＩＬ−６の誘導を阻害する能力が実証された。
【００２７】
さらに、本発明のポリペプチドは、溶液中で高い安定性を有し、例えば、単純なリン酸緩衝生理食塩水中、少なくとも６ヶ月間、４℃で安定である（実施例４参照）。
【００２８】
しかし、安定性はインビトロの組成物に限らず、本発明のポリペプチドを静注したマウスにおいて、既に明らかである（実施例５および１２参照）。
【００２９】
結論として、本発明のポリペプチドは、研究、診断および医学的応用に非常に適している。
【００３０】
ＩＬ−１７Ａ抗体を置換することの他に、本発明のポリペプチドはインビボおよびインビトロの薬学的および診断的応用のための、新規で免疫原性がより低い融合タンパク質の設計も可能にする。従って、第二の様相において、本発明は、薬学的および／または診断的有効成分に融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【００３１】
上記の通り、本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分を含んでいてもよく、例えば治療的または診断的関連放射性核種に対する、例えば非ペプチド性リンカー、非ペプチド性リガンドを含んでいてもよい。
【００３２】
好ましくは、前記の活性成分は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦβ、ＬＴ−β、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βよりなる群から選択されるサイトカインである。
【００３３】
別の好ましい態様において、前記の活性成分は毒性化合物であり、好ましくは有機小分子またはポリペプチドであり、より好ましくは、カリケアマイシン、マンタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラマイシン、ダイネミシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシン−Ａ鎖、モデシン、トランケートした緑膿菌エンドトキシンＡ、ジフテリア毒素および組み換えゲロニンよりなる群から選択される毒性化合物である。
【００３４】
別の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、前記の活性成分がケモカインであり、好ましくは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルカインよりなる群から選択されるケモカインである、融合タンパク質である。
【００３５】
さらに好ましい態様において、本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質は人工アミノ酸を含有する。
【００３６】
本発明の融合タンパク質のさらに好ましい態様において、前記の活性成分は蛍光色素であり、好ましくは、アレクサフルオルまたはＣｙ色素（ベルリエ（Ｂｅｒｌｉｅｒ）ら、「長波長アレクサフルオル色素のＣｙ色素との定量比較：色素およびそれらのバイオコンジュゲートの蛍光（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｌｏｎｇ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｄｙｅｓ ｔｏ Ｃｙ Ｄｙｅｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５１（１２）：１６９９−１７２２頁，２００３年）；光増感剤、好ましくは光毒性赤色蛍光タンパク質キラーレッド（ブリナ（Ｂｕｌｉｎａ）ら（２００６年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４，９５−９９頁）またはヘマトポルフィリン；凝血促進因子、好ましくは組織因子；プロドラッグ活性化酵素、好ましくは、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼよりなる群から選択される酵素；γ放射性アイソトープの群からの放射性核種、好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、または、ポジトロン放射体の群からの放射性核種、好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉ、または、β放射体の群からの放射性核種、好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、または、α放射体の群からの放射性核種、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔよりなる群から選択される成分である。
【００３７】
別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、本書において上記で規定した通りの１以上の非ポリペプチド成分に、直接または化学リンカーを介して結合してもよい。
【００３８】
本発明の融合タンパク質のより好ましい態様において、前記の活性成分は１以上の機能性Ｆｃドメインであり、好ましくは１以上のヒト機能性ドメインであり（例えば、配列番号１１７〜１１９および配列番号１３０を参照）、それ（ら）は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのインビボの半減期を延長することが可能であり、それらのいくつかは、例えば治療的、予防的および／または診断的適応において、哺乳類の免疫反応を、融合タンパク質の本発明のポリペプチド成分の特異的標的結合部位に向ける。本発明のポリペプチドは、１以上の機能性ＦｃドメインのＮ−またはＣ−末端のいずれか、または、１以上のＦｃドメインのＮ−およびＣ−末端の両者に融合し得る。本発明の融合タンパク質は、１つ以上、好ましくは１つのＦｃドメインの、少なくとも片側、好ましくはＮ−末端に融合した、本発明のポリペプチドの多量体、好ましくは四量体、三量体、または最も好ましくは二量体を含むことが好ましい。この点において、（２Ｃ１）２−Ｆｃと規定されるフィノマー−フィノマー−Ｆｃ融合タンパク質が多量体ポリペプチドＦｃ融合体の有利点を実証することが知られており、以下の実施例２の図３ｅおよび３ｆおよび表ＩＩに示す通り、この融合体は、対応する単量体２Ｃ１−Ｆｃ融合タンパク質よりも、ＩＬ−１７Ａに対する親和性が高い。従って、本発明の好ましい態様は、多量体ポリペプチドＦｃ融合タンパク質を対象にする。
【００３９】
抗体の「機能性Ｆｃドメイン」は、当業者によく知られている用語であり、抗体のパパイン消化に基づいて規定される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類され、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類される。重鎖の定常領域によって、免疫グロブリンの種々のクラスはそれぞれ［α］、［δ］、［ε］、［γ］、および［μ］と呼ばれる。抗体の機能性Ｆｃドメインは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接的に関与する。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、新生児Ｆｃ受容体、活性化Ｆｃγ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａ、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂ、およびＣ１ｑ等の、親和性の異なる種々の受容体に結合し、非常に異なる活性を与える。ヒト抗体のＦｃドメインの活性化および抑制性受容体への親和性は、操作および修飾し得る（ストロール（Ｓｔｒｏｈｌ）Ｗ．（２００９年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，６８５−６９１頁参照）。従って、上記の通り、本発明は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのインビボでの半減期を延長することができ、ヒト由来の機能性Ｆｃドメイン、好ましくはＩｇＧ１抗体のヒト機能性Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１１７〜１１９および配列番号１３０参照）を含有する、Ｆｃ融合体を含む。
【００４０】
本発明の融合タンパク質のより好ましい態様において、活性成分は、活性化またはサイレンシングされたエフェクター機能を有するＩｇＧ１の１以上の改変ヒト機能性Ｆｃドメインであり、好ましくは、サイレンシングされたエフェクター機能を有するＩｇＧ１の１以上の改変ヒト機能性Ｆｃドメインであり、最も好ましくは、Ｌ２３４およびＬ２３５に突然変異を有する、サイレンシングされたエフェクター機能を有するＩｇＧ１の１以上の改変ヒト機能性Ｆｃドメインであり（例えば、配列番号１３１〜１３５参照）、カバト（Ｋａｂａｔ）のＥＵインデックスに従って番号を付ける（ジョンソン（Ｊｏｈｓｏｎ）Ｇ．およびウ（Ｗｕ）Ｔ．Ｔ．（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２１４−２１８頁参照）。
【００４１】
さらに好ましい態様は、上記の通りの本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質であって、さらに、血中半減期を調節する成分を含み、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、免疫グロブリンおよびアルブミン結合ペプチドよりなる群から選択される成分を含む、ポリペプチドまたは融合タンパク質に関する。
【００４２】
さらに、本発明の融合タンパク質があらゆる上記の本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを含み、好ましくは、配列番号１１７〜１１９および配列番号１３０〜１３５またはその機能性誘導体からなる群から選択されるものを含むことが好ましい。
【００４３】
本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質は、好ましくは単量体であるが、また本発明のポリペプチドの多量体も包含し、好ましくは四量体、より好ましくは三量体、または最も好ましくは二量体を包含することが注目される。
【００４４】
本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、多数の従来からの周知技術のいずれかにより、または、市販の自動合成装置により、調製してもよい。他方で、従来の組み換え技術単独で、または従来の合成技術との組み合わせにより調製してもよい。
【００４５】
この点において、本発明のさらなる様相は、（ｉ）本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）前記の核酸を含むベクター、および（ｉｉｉ）前記のポリヌクレオチドおよび／または前記のベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【００４６】
好ましくは、本発明は、
（ｉ）本発明のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸、より好ましくは
（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）６−Ｄ−（Ｘ）−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）１−Ｉ−（Ｘ）５−７−Ｇ−（Ｘ）１−ＷＷ−（Ｘ）−Ａ−（Ｘ）−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）１−２−ＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ
をコードする核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して、少なくとも６０％または７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を持つ配列を有する核酸；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸；
（ｉｖ）核酸であって、前記の核酸が、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸のうちの１つの置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、核酸；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸のいずれか１つの断片であって、本発明によるポリペプチドをコードする（ｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする、断片
を含む、単離または精製核酸を対象とする。
【００４７】
より好ましくは、本発明の核酸は、上述の通りのポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸を含む。この点において、上記の核酸（ｉ）〜（ｖ）のいずれも、好ましくはＩＬ−１７Ａに結合するポリペプチドをコード化し、より好ましくはＩＬ−１７Ａの機能を阻害することが理解される。
【００４８】
本発明の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびそれらのあらゆる他のアナログであり得る。ベクターおよび宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドおよび／または融合タンパク質の製造、例えば遺伝子治療用の治療に有用なベクターおよび宿主細胞の製造などの目的に適合するあらゆる従来のタイプであってもよい。当業者は、多くの従来技術からそのような核酸、ベクターおよび宿主細胞を選択し、通常の方法により過度の負担なく、それらが所望の目的に特に適合することを確認できるであろう。
【００４９】
好ましくは、核酸はプロモーターに動作可能に結合し、好ましくは、Ｔ５プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメント、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメントよりなる原核生物プロモータの群、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ ｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモーターよりなる真核生物プロモーターの群から選択されるプロモーターに結合する。
【００５０】
また、本発明の組み換えベクターは、本発明の核酸を含むものであって、好ましくは本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を産生する能力があるものが好ましい。好ましくは、このようなベクターは、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の遺伝子治療に使用されるベクターよりなる群から選択される。
【００５１】
加えて、本発明は、本発明の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質に特異的に結合する抗体を包含する。抗体が融合タンパク質に結合する場合、融合タンパク質の、本発明のポリペプチドまたは融合エピトープよりなる部分に特異的に結合し、即ち、一部は本発明のポリペプチドよりなり、一部は薬学的および／または診断的活性成分よりなる抗体の結合部位に結合するが、この活性成分は好ましくはポリペプチドまたはペプチドである。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。本書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗体分子全体だけではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ断片等の抗原結合断片にも言及する。また、キメラ抗体、好ましくはヒト化抗体も含まれる。このような抗体は、任意のタンパク質と本発明のポリペプチドとを判別する研究ツールとして有用である。さらなる様相は、本発明によるモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞株に関する。
【００５３】
本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＩＬ−１７Ａ結合および阻害特性、ならびに保存安定性およびインビボ安定性を実証することから、本発明のさらなる様相は、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質、核酸および／または組み換えベクター、および任意に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。医薬組成物という用語は、インビボで使用する診断用組成物も包含することが意図される。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、従来のあらゆる方法で製造してもよい。以下に示す疾患に罹患する患者の治療において、本発明の少なくとも１つの化合物は、経口または非経口経路を含む、治療的ポリペプチドまたはその治療的断片を有効量で生物学的に利用可能にするあらゆる形態または様式で投与し得る。例えば、本発明の組成物は、吸入等により、皮下、筋肉内、静脈内に投与し得る。製剤調製分野における当業者は、選択された製品の特別の性質、治療される疾患または病状、疾患または病状の病期、および他の関連する状況に応じて、適宜の形態および様式を容易に選択し得る（例えばレミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０年）参照）。好適な担体または賦形剤は、活性成分のビヒクルまたは媒体として働き得る、液体材料であってもよい。好適な担体または賦形剤は、当技術分野においてよく知られており、例えば、安定剤、抗酸化剤、ｐＨ調整物質、放出制御賦形剤等が挙げられる。本発明による組成物は、好ましくは凍結乾燥形態で提供される。速やかな投与のためには、好適な水性担体中、例えば注射用滅菌水または滅菌緩衝生理食塩水中に溶解する。ボーラス注入法としてよりは点滴による投与のため、より高容量を製造することが望まれる場合は、最終製剤の時点でヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン添加血液を溶媒中に取り込むことが有利である。あるいは、製剤は皮下投与し得る。ヒト血清アルブミン等の生理学的に不活性なタンパク質が過剰に存在することにより、輸液用の容器およびチューブ壁への吸着による薬学的に有効なポリペプチドの損失を防ぐ。アルブミンを使用する場合、好適な濃度は、食塩水の重量の０．５〜４．５％である。
【００５５】
本発明のＩＬ−１７Ａ結合および阻害ポリペプチドは、ＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態の治療および／または予防に特に有用である。したがって、本発明のさらなる様相は、医薬用途のため、即ち、医薬の製造のため、好ましくは、疾患または医学的状態の治療および／または予防のための医薬の製造のためであって、好ましくは疾患または医学的状態がＩＬ−１７Ａ−およびＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態よりなる群から選択されるものである、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質、核酸および／または組換えベクターの使用を対象とする。
【００５６】
好ましい態様において、本発明の医薬用途は、炎症性、自己免疫および／または骨量減少関連疾患または状態から選択される、疾患または医学的状態の治療および／または予防に関する。
【００５７】
最も好ましい態様において、前記の炎症性、自己免疫および／または骨量減少関連疾患または状態は、関節炎、好ましくは関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎および変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症および皮膚過敏症の両者を含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、内分泌性眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、虚血、全身性硬化症、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（１型糖尿病）、自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸宮体腎炎（ネフローゼ症候群を伴う、および、伴わず）、特発性ネフローゼ症候群または微小変化ネフロパシー、腫瘍、皮膚炎症の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨インプラントの弛緩、急性移植拒絶反応、代謝異常、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症、骨量の減少、変形性関節症、骨粗しょう症、閉塞性または炎症性気道疾患の歯周病、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫、急性および超急性炎症反応、ＩＬ−１７Ａ介在性ＴＮＦ−α関連疾患、急性感染症、敗血症、敗血性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の熱傷、悪液質、消耗症候群、脳卒中、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患から選択される。上記で特定された疾患および医学的状態の全ては、共通して、それらの起源および／または症状がＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ−１７に関連する。
【００５８】
好ましくはＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態よりなる群から選択され、より好ましくは上記に具体的に列挙したものからなる群から選択される、疾患または医学的状態の治療および／または予防のための本発明の化合物、即ちポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクターおよび宿主細胞の投与量および投与形態は、勿論、本発明の特定のポリペプチドまたは融合タンパク質阻害剤、個々の患者群または患者、さらなる医療的活性化合物の存在および治療している病状の重篤度によって変わるであろう。しかし、予防的および／または治療的使用のために投与すべき量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５ｍｇであることが、現在のところ好ましい。好ましくは、予防的および／または治療的使用のための投与頻度は、およそ１週間に２回からおよそ３ヶ月毎に１回の範囲内であり、好ましくはおよそ２週間毎に１回からおよそ１０週間毎に１回、より好ましくは４〜８週間毎に１回の範囲内である。本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、非経口的、静脈内に便利かつ好ましく投与されるが、好ましくは肘正中静脈または他の末梢静脈、筋肉内または皮下に投与される。ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、点眼剤としても局所的に送達され得る。患者の好ましい予防的および／または治療的処置としては、本発明のポリペプチドを月に１回から２〜３ヶ月毎に１回、またはより低頻度で投与することが挙げられる。
【００５９】
結論として、本発明は治療方法にも関し、ここで上記の医薬組成物の薬理学的有効量が、それを必要とする患者に投与され、好ましくはＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者に、より好ましくは、上記で特定した疾患または医学的状態のうちの１つを罹患する患者に投与される。本書で使用される場合、「処置」という用語は、疾患または医学的状態の予防的および／または治療的処置に関する。
【００６０】
本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、活性成分単独で投与してもよく、または、例えば補助剤として併用して、または他の薬剤と組み合わせて投与してもよく、他の薬剤としては、例えば上記の疾患の治療または予防のための、例えば免疫抑制剤または免疫調整剤、または他の抗炎症剤が挙げられる。例えば、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫抑制性モノクローナル抗体と組み合わせて使用してもよく、例えば、白血球受容体に親和性を有するモノクローナル抗体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６または他のリガンド；他の免疫調整化合物、例えばＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組み換え結合分子、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合する、ＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えばＡＴＣＣ ６８６２９）またはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−Ｉ拮抗剤、ＩＣＡＭ−Ｉまたは−３拮抗剤、ＶＣＡＭ−４拮抗剤またはＶＬＡ−４拮抗剤と組み合わせて使用してもよい。加えて、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＤＭＡＲＤ、例えば金塩、スルファサァラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６；リンパ球再循環のモジュレーター、例えばＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０アナログ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３；免疫抑制性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１等；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたは免疫抑制性ホモログ、そのアナログまたは誘導体；または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチナム、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えばＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体構築物、例えばエタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症性サイトカイン阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、例えばアナキンラまたはＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ ８８５、ＩＬ−６阻害剤；プロテアーゼの阻害剤または活性化剤、例えばメタロプロテアーゼ、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−２３抗体、抗ＩＬ−２２抗体、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＣＤ２０抗体、アスピリン等のＮＳＡＩＤまたは抗感染症薬と組み合わせて使用してもよい。当然のことながら、この併用薬のリストは限定的ではなく、完全でもない。
【００６１】
以下の実施例において、例示により、本発明をさらに記載するが、いずれも添付の特許請求の範囲に概説した通りの本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本発明のＩＬ−１７結合ポリペプチドの具体例のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す：（ａ）Ｂ１＿２（配列番号３９）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（レーン１）、Ｅ４（配列番号５７）（レーン２）、２Ｃ１（配列番号１０７）（レーン３）、Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）（レーン４：非還元的条件、レーン５：還元的条件）、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１１８）（レーン６：非還元的条件、レーン７：還元的条件）；（ｂ）［（２Ｃ１）２−Ｆｃ］（配列番号１１９）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（レーン１：非還元的条件、レーン２：還元的条件）。（２Ｃ１）２−Ｆｃの分子量は、リファレンス分子量全帯域マーカー（示さず）より推定される。
【図２】図２は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す：（ａ）クローンＢ１＿２（配列番号３９）、（ｂ）Ｅ４（配列番号５７）、（ｃ）２Ｃ１（配列番号１０７）、（ｄ）Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）、（ｅ）ＳＥＣピーク精製Ｅ４−Ｆｃ、精製およびＰＢＳ中４℃で４０日間保存した後分析、（ｆ）２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１１８）、（ｇ）（２Ｃ１）２−Ｆｃ（配列番号１１９）。
【図３】図３は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）センサーグラムを図示する：（ａ）クローンＢ１＿２（配列番号３９）、（ｂ）Ｅ４（配列番号５７）、（ｃ）２Ｃ１（配列番号１０７）、（ｄ）Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）、（ｅ）２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１１８）、（ｆ）（２Ｃ１）２−Ｆｃ（配列番号１１９）。
【図４】図４は、ＩＬ−１７Ａ阻害細胞分析の結果を図示する：（ａ）ＮＨＤＦ細胞をＩＬ−１７Ａと共にインキュベーションした後の、ＩＬ−６の容量依存性誘導。（ｂ）Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７バインダーおよびＩＬ−１７Ａ受容体−Ｆｃキメラによる、ＮＨＤＦ細胞におけるＩＬ−１７Ａ誘導ＩＬ−６産生の容量依存性阻害。（ｃ）ｂ）と同様であるが、ＩＬ−１７Ａ結合親和性を有しない対照タンパク質として、Ｆｙｎ ＳＨ３ ｗｔタンパク質を使用した。（ｄ）ＸＴＴ分析：生存細胞は、テトラゾリウム塩ＸＴＴを着色産物に代謝することができる。我々の実験において、全ての細胞は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＡおよびＦｙｎ ＳＨ３バインダー、またはＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラと共に２４時間インキュベーションした後、生存していた。
【図５】図５は、Ｇ３と規定した本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（配列番号３４）の、精製１日後（ＰＢＳ中、４℃で保存）のサイズ排除クロマトグラフィーを図示する。クロマトグラフィーはスーパーデックス７５（ＧＥ ヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））カラムを使用して実施した。
【図６】図６は、４℃（ａ）または−２０℃（ｂ）で６ヶ月を超えて保存した、Ｇ３と規定した本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（配列番号３４）の、サイズ排除クロマトグラフィーを図示する。
【図７】図７は、マウスにおける、Ｅ４−Ｆｃと規定した本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（配列番号１１７）の薬物動態データを示す：（ａ）血清中のＥ４−Ｆｃ濃度を、静注後の時間に対してプロットする、（ｂ）（ａ）と同様であるが、反対数表示でプロットする。最後の４点を用いて終末相半減期を計算したところ、５０．６時間であった。
【図８】図８は、２Ｃ１と規定した本発明のポリペプチド（配列番号１０７）の、結合特異性の表を示す。吸光度の結果は、種々の標的タンパク質：ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ｍｌＬ−１７Ａ（マウスＩＬ−１７Ａ）、ＴＮＦα（ヒト腫瘍壊死因子α）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、オボアルブミン（鶏卵白）、ＩＬ−６（ヒトインターロイキン６）を使用して実施されるＥＬＩＳＡに関係する。
【図９】図９は、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）の特異性を示す。ＥＬＩＳＡにおいて、結合剤としての本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）と共に、種々のＩＬ−１７ファミリーメンバー、異なる種のＩＬ−１７Ａおよび他の無関係な抗原を使用した。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のみがヒトおよびカニクイザルＩＬ−１７Ａに結合する。他の抗原のいずれに対しても、結合を検出できなかった。図の右側（破線の右側）には、ヒトＩＬ−１７ＣのＥＬＩＳＡシグナルが見られるが、これはヒトＩＬ−１７Ａ対照を用いて、別の日に定量した。説明：ｈＩＬ−１７Ａ：ヒトインターロイキン１７Ａ、ｈＩＬ−１７Ｂ：ヒトインターロイキン１７Ｂ、ｈＩＬ−１７Ｄ： ヒトインターロイキン１７Ｄ、ｈＩＬ−１７Ｅ：ヒトインターロイキン１７Ｅ、ｈＩＬ−１７Ｆ： ヒトインターロイキン１７Ｆ、マウスＩＬ−１７Ａ：マウスインターロイキン１７Ａ、ラットＩＬ−１７Ａ：ラットインターロイキン１７Ａ、イヌＩＬ−１７Ａ：イヌインターロイキン１７Ａ、ｃｙｎｏ Ｉｌ−１７Ａ：カニクイザルインターロイキン１７Ａ、ＥＤＢ：フィブロネクチンの追加ドメインＢ、ｈＩＬ−６：ヒトインターロイキン ６、ｈＴＮＦα：ヒト腫瘍壊死因子α、オボアルブミン：鶏卵黄由来のアルブミン、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ｎｅｇ ｃｔｒｌ：コーティングに抗原を使用せず、ｈＩＬ−１７Ｃ：ヒトインターロイキン１７Ｃ。
【図１０】図１０は、封入体からリフォールディングされたカニクイザルＩＬ−１７Ａでコートしたチップ上での、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサーグラムを図示する。
【図１１】図１１は、Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：全帯域レインボーマーカー（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、レーン２：２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）、レーン３：全帯域レインボーマーカー（ＧＥヘルスケア）、レーン４：２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３３）、レーン５：２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３４）、レーン６：２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３５）、レーン７：２Ｃ１−ｍ５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３２）、レーン８：２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）。
【図１２】図１２は、ＰＢＳ中４℃で保管した標準対照２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（×）と比較した、ヒト血清中３７℃で５日間保管した後の、ＩＬ−１７Ａに結合する２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（■）のＥＬＩＳＡを示す。
【図１３】図１３は、マウスに単回静注した後の、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の種々の時点での血清濃度を示す。哺乳類細胞において産生された２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）融合タンパク質（配列番号１３１）を、マウス（ｎ＝５）に静脈注射（ｉｖ）した（動物当り４０μｇ）。ＰＫプロファイルの最後の４点を用いて、２Ｃ１−Ｆｃ融合タンパク質の終末相半減期を計算したところ、５３時間であった。
【図１４】図１４は、急性炎症モデルにおける、本発明の抗ＩＬ−１７ Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）による、ヒトＩＬ−１７Ａ誘導ＫＣ産生の阻害を示す。３μｇのヒトＩＬ−１７Ａ（ＩＬ−１７）、ＰＢＳ（ＰＢＳ）、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａと１７μｇの本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）（ＩＬ−１７＋２Ｃ１）、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａと１６μｇの野生型Ｆｙｎ ＳＨ３モノマー（ＩＬ−１７＋ｗｔ）、１７μｇの本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）単独（２Ｃ１）、または１６μｇの野生型Ｆｙｎ ＳＨ３単量体単独（ｗｔ）の皮下注射の２時間後に、血液サンプルを採取し、マウス血清中のＫＣレベルを定量した。各群４匹のマウスの平均ＫＣレベルを示すが（±ＳＤ）、例外として野生型対照群（ＩＬ−１７Ａを含まない、または含む、Ｆｙｎ ＳＨ３）では、３匹のマウスの平均レベルを示す（±ＳＤ）。
【図１５】図１５は、急性炎症モデルにおける、２Ｃ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１３０）による、ヒトＩＬ−１７Ａ誘導ＫＣ産生の阻害を図示する。２Ｃ１−Ｆｃ／Ｉｌ−１７：４４μｇの２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）を静注した後、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａの皮下注射した。ＩＬ−１７Ａ投与から２時間後、マウスから血液サンプルを採取し、ＫＣ血清レベルをＥＬＩＳＡで測定した。対照実験を以下の通り実施した：ＰＢＳ／ＩＬ−１７：ＰＢＳの静注の後、ＩＬ−１７の皮下注射；２Ｃ１−Ｆｃ／ＰＢＳ：２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）の静注の後、ＰＢＳの皮下注射；ＰＢＳ／ＰＢＳ：ＰＢＳの静注の後、ＰＢＳの皮下注射；各群３〜５匹のマウスの平均ＫＣレベルを示す（±ＳＤ）。
【実施例】
【００６３】
実施例１：モノクローナルファージＥＬＩＳＡで定量された通り、本発明のＦｙｎ ＳＨ−３由来ポリペプチドはＩＬ−１７Ａに結合する。
方法
配列番号１〜１１６で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）らにおけるＦＹＮ ＳＨ３ライブラリについて記載された通り（グラブロフスキら、（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）ファージミドベクターｐＨＥＮ１にクローニングした。ファージ産生は、標準的プロトコル（ヴィティ（Ｖｉｔｉ），Ｆら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６，４８０−５０５頁）に従って実施した。ファージを含有するモノクローナル細菌上澄をＥＬＩＳＡに使用した：ビオチン化ＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）より購入、ビオチン化は、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用い、メーカーの使用説明書に従って実施した）を、ストレプトアビジンでコートしたウェル（ストレプタウェルズ（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌｓ）、ハイバインド（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））上に固定化し、ＰＢＳ、２％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ）、スイス）でブロッキングした後、２０μｌのＰＢＳ、１０％ミルクおよび８０μｌのファージ上澄を適用した。１時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したファージを抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で検出した。ペルオキシダーゼ活性の検出は、ＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ）を加えることによって行い、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。バインダーのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって検証した（ビッグダイ・ターミネーター（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ） ｖ３．１ サイクル・シークエンシング・キット、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０遺伝子分析器、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。
【００６４】
結果
Ｆｎｙ ＳＨ３−由来ＩＬ−１７Ａバインダーのアミノ酸配列は、配列表中に付記した通りの、配列番号１〜１１６で示される。
【００６５】
実施例２：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチドは、組み換えヒトＩＬ−１７Ａに高親和性で結合する。
この実施例は、種々の形態のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのクローニングおよび発現、および、これらのポリペプチドのサイズ排除クロマトグラフィーおよび表面プラスモン共鳴による特性評価を示す。
【００６６】
ａ）Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのクローニングおよび発現
選択したＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（クローンＢ１＿２：配列番号３９、クローンＥ４：配列番号５７およびクローン２Ｃ１：配列番号１０７）を、グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（グラブロフスキら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）に記載の通り、細胞質発現ベクターにクローニングし、発現および精製した。
【００６７】
ｂ）ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分に融合した、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのクローニングおよび発現
クローンＥ４および２Ｃ１（配列番号５７および１０７）をクローニングし、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分との融合タンパク質として発現させた（手順は、以下参照；配列番号１１７および１１８）。さらに、１０個のアミノ酸リンカーを有する２Ｃ１二量体［（２Ｃ１）２−Ｆｃ］をクローニングし、Ｆｃ融合タンパク質として発現させた（配列番号１１９）。
【００６８】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を、プライマーｆｍ５（５’ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣ ３’、配列番号１２１）およびｆｍ６（５’ＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ ３’、配列番号１２２）を用い、および、テンプレートとして市販のｐＦＵＳＥ−ｈｌｇＧ１−Ｆｃ２（インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））真核性ベクターを用いて
ＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、以前に同じ酵素で消化したｐＡＳＫ−ＩＢＡ２ベクター（ＩＢＡ−バイオタグノロジー（Ｂｉｏｔａｇｎｏｌｏｇｙ））と連結し、新たなベクターｐＡＦを得た。
【００６９】
クローンＥ４および２Ｃ１（配列番号５７および１０７）の遺伝子情報を、ｆｍ７（５’ＡＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＴＧ ３’、配列番号１２３）およびｆｍ８（５’ＣＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣ ３’、配列番号１２４）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｆｃに融合した２Ｃ１二量体の調製には、２Ｃ１ ＤＮＡテンプレートを２つの独立したＰＣＲに使用した。第一の反応では、プライマー４７ｂ．ｆｏ（５’ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１２５）および５２．ｂａ（５’ＧＡＣ ＴＡＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＡＴ ３’、配列番号１２６）を使用し、第二のＰＣＲでは、プライマー４８ｂ．ｂａ（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＡＴ ３’、配列番号１２７）および５１．ｆｏ（５’ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＴ ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１２８）を使用した。
【００７０】
２つのＤＮＡ断片をＰＣＲによって組み立て、２つのドメインの間に１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１２０）を有する２Ｃ１ホモ二量体を得た。得られたＤＮＡ断片を、プライマーｆｍ７およびｆｍ８を用いた２Ｃ１単量体について記載した通りに、さらに増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏｌ／ＢａｍＨＩで消化し、二重消化したペリプラズム発現ベクターｐＡＦにクローニングした。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１中に電気穿孔し、０．２μｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンでタンパク質発現を誘導した。細菌培養物を、ロータリーシェーカー中、２５℃で一晩成長させ、フィノマー−Ｆｃ融合タンパク質を、単一プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程のペリプラズム分画から精製した。２０μｌのタンパク質溶液を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））分析を実施した。
【００７１】
ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣシステムで、スーパーデックス７５カラム（１０／３００）またはスーパーデックス７５ショートカラム（５／１５０）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて実施した。
【００７２】
ｄ）親和性測定
親和性測定は、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）３０００装置（バイアコア）を用いて実施した。ビオチン化ＩＬ−１７Ａと単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドとの間の相互作用分析、およびビオチン化ＩＬ−１７ＡおよびＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）との間の相互作用分析には、ストレプトアビジンＳＡチップ（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））を、それぞれ固定化した１３００および５１０ ＲＵビオチン化ＩＬ−１７Ａと共に使用した。ランニングバッファーは、ＰＢＳ、０．１％ＮａＮ３および界面活性剤Ｐ２０（バイアコア）であった。相互作用は、流速２０ｍｌ／分で、種々の濃度のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを注入して測定した。ＩＬ−１７Ａと２Ｃ１−Ｆｃ融合体との間、およびＩＬ−１７Ａと（２Ｃ１）２−Ｆｃ融合体との間の相互作用分析のため、ＣＭ５チップ（バイアコア）を、２９００ ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））でコートした。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（バイアコア）であった。相互作用は、約２５０〜２７５ ＲＵのＦｃ融合タンパク質を流速１０μｌ／分で注入し、その後、種々の濃度のＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を流速３０μｌ／分で注入することによって測定した。相互作用の速度論的データ（個別のｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は全て、ＢＩＡエバリュエーション３．２ＲＣ１ソフトウェアを用いて評価した。
【００７３】
ｅ）結果
本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの発現収率は、振とうフラスコ中、非最適化条件下で、細菌培養物１リットル中６０〜８５ｍｇであった。Ｆｃ融合タンパク質は、収率０．２〜０．４ｍｇ／ｌ（表Ｉ）で発現した。Ｆｃ融合タンパク質の配列は、付記の通りの配列番号１１７〜１１９に列記する。
【００７４】
【表１】
【００７５】
図１は、表示された精製タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。
【００７６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルにより、全ての構築物が主として単一の単量体ピークとして溶出したことが実証された（図２参照）。Ｆｙｎ ＳＨ３由来結合タンパク質についてのこれまでの研究で既に観察された通り（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）、主要なピークは、約８ｋＤａのタンパク質について予想されるものより遅く溶出した。本発明のＦｃ融合タンパク質については、サイズ排除クロマトグラフィーによる第二の精製工程を、単回工程のタンパク質Ａ−セファロース精製の後に実施して、図２ｅ中、融合タンパク質Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）に示される通りの単量体タンパク質を得た。Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）はＰＢＳ中４℃で保存した場合、少なくとも４０日間は安定であった。
【００７７】
結合特性は、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）チップ上でのリアルタイム相互作用分析によって分析し（図３）、選択されたＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質について、以下の解離定数（ＫＤ）が明らかになった：
【００７８】
【表２】
【００７９】
実施例３：ＩＬ−１７Ａ阻害細胞分析
ＩＬ−１７Ａは、線維芽細胞においてＩＬ−６の産生を投与量依存的に誘導する（ヤオ（Ｙａｏ）ら（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３，８１１−８２１頁）。表示したＦｙｎ ＳＨ３−誘導ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の阻害活性は、ヒト皮膚線維芽細胞を、種々の濃度のＦｙｎ ＳＨ３変異体またはヒトＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラの非存在または存在下、組み換えＩＬ−１７Ａで刺激することによって試験した。刺激の２４時間後に、細胞培養上澄を採取し、ＥＬＩＳＡでＩＬ−６について分析した。加えて、細胞が、ＩＬ−１７Ａ単独、またはＩＬ−１７Ａおよび本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来阻害ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド、またはＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラと共に２４時間インキュベーションした後に、生存していたことを実証するために、ＸＴＴ試薬を用いて比色試験を実施した。生存し、代謝的に活性な細胞のみが、テトラゾリウム塩ＸＴＴを、橙色化合物であるホルマザンに還元する能力がある（スクディエロ（Ｓｃｕｄｉｅｒｏ）ら（１９８８年），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，４８２７−４８３３頁）。
【００８０】
方法
エンドトキシンを除去するため、表示したタンパク質溶液を、アクロディスク・ムスタング（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｍｕｓｔａｎｇ）Ｅメンブレン（ＶＷＲ）で３回濾過した。濾過の後、本発明の阻害性Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを含有するタンパク質溶液のエンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）試験（パイロジェント（ＰＹＲＯＧＥＮＴ）単一検査ゲル凝集ＬＡＬ分析（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）））によって定量したところ、０．１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００８１】
約１ｘ１０４個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ），ＮＨＤＦ−ｃ， Ｃ１２３００）を含有する４００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに分配し（２４穴プレート、ＮｕｎｃまたはＴＰＰ）、３７℃で２４時間培養した（培地：線維芽細胞成長培地Ｃ−２３０１０、プロモセル）。上澄を吸引し、種々の濃度の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドまたはＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラ（ＲｎＤシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ＩＬ−１７Ａ（ＲｎＤシステムズ）含有培地（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）と混合した後、３５０μｌの対応する溶液を各ウェルに添加した（阻害剤溶液とＩＬ−１７Ａ含有培地の混合比は１：３であった）。陽性対照として、ＰＢＳをＩＬ−１７Ａ含有培地（「阻害剤なし」）と１：３の割合で混合し、陰性対照として、ＰＢＳを培地のみ（「ＩＬ−１７Ａなし」）と１：３の割合で混合した。ＩＬ−１７Ａ依存性ＩＬ−６産生を定量するため、ＩＬ−１７Ａ含有培地を使用し（ＩＬ−１７Ａの最終濃度：１０、２５および５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＢＳと３：１の比で混合した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、上澄を吸引し、ＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡによりメーカーの使用説明書に従って定量した（ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））。上澄の吸引の直後に、ＸＴＴ含有培地を添加し（細胞増殖（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）キットＩＩ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、メーカーの使用説明書に従って、細胞生存性を定量した。
【００８２】
ＩＬ−１７Ａ阻害率は、以下の式を用いて定量した：
【００８３】
【化１】
【００８４】
結果
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＩＬ−１７Ａと種々の濃度でインキュベーションした。図４（ａ）は、ＩＬ−６のＩＬ−１７Ａ用量依存性誘導を示す。次の工程において、ＮＨＤＦ細胞を、ＩＬ−１７Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）および種々の濃度の表示した本発明のＦｙｎ ＳＨ３誘導ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドまたはＩＬ−１７Ａ受容体−Ｆｃキメラと共にインキュベーションした（図４（ｂ））。クローン２Ｃ１（配列番号１０７）およびＥ４（配列番号５７）の両者がＩＬ−１７Ａ誘導ＩＬ−６産生を阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ約１ｎＭおよび６ｎＭであったことが観察された。ＩＬ−１７Ａ受容体−Ｆｃキメラは、ＩＣ５０値が５００ｐＭであることが報告されている（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））。この実験では、約１ｎＭの値が得られた。この分析は、３つの独立した実験の代表的な結果を表す。ＩＬ−６産生の阻害が特異的なＩＬ−１７Ａ中和の結果であることをさらに実証するために、細胞を、ＩＬ−１７Ａの存在下で結合特異性に無関係のタンパク質としてＦｙｎ ＳＨ３ｗｔドメイン（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）と共にインキュベーションした（図４（ｃ））。予想した通り、ＩＬ−６産生の阻害は観察されず、一方、クローン２Ｃ１（配列番号１０７）はＩＬ−１７Ａ−誘導ＩＬ−６産生を阻害する能力があった。図４（ｄ）にＸＴＴ分析を示すが、これは、全ての細胞が、本発明のＦｙｎ ＳＨ３−由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（濃度７５０ｎＭ）およびＩＬ−１７受容体（１０ｎＭ）と共に２４時間インキュベーションした後、生存能力があったことを確認する。
【００８５】
実施例４：安定性
治療的適応を目的とする全ての生体化合物の極めて重要な様相は、溶液中に保管した場合の、その安定性および凝集耐性である。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、単純なリン酸緩衝生理食塩水中、４℃または−２０℃で少なくとも６ヶ月間保管した際に安定であることが判っていることから、特に有用な薬剤および診断薬候補である。
【００８６】
方法
本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのタンパク質溶液を、精製後、４℃または−２０℃で６ヶ月間保管した。タンパク質の安定性および凝集状態を分析するため、タンパク質溶液を濾過し（ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＰ、０．２２μｍ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣシステムでスーパーデックス７５ショートカラム（５／１５０）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて実施した。
【００８７】
結果
Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドＧ３（配列番号３４）が発現収率１２３ｍｇ／Ｌで産生され、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから主に単一のピークとして溶出された（図５参照）。
【００８８】
Ｇ３（配列番号３４）の安定性および凝集抵抗を、タンパク質をＰＢＳ中、４℃または−２０℃で保管して評価した。６ヵ月後、タンパク質の状態を、サイズ排除クロマトグラフィーによって調べた。測定により、凝集または分解の兆候は全く見られなかった。６ヶ月間の貯蔵後の溶出プロファイルを図６に示す。
【００８９】
実施例５：インビボ半減期
本発明の融合タンパク質Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）のインビボ半減期を、ＥＬＩＳＡにより、単回静注後の種々の時点でマウス血清中のＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）濃度を測定することによって定量した。
【００９０】
方法
Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）のクローニングおよび発現を実施例２に記載する。Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の３．３μＭ（０．２２ｍｇ／ｍｌ）溶液２００μｌを５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））に静注射した。７分後、２０分後、１、２、４、８、２４および４８時間後に、約２０μｌの血液を伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡを実施するまで、血清を−２０℃で保管した。濃度が分っているＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の希釈系列を用いて、血清中のＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）濃度をＥＬＩＳＡによって定量した：５０μｌのビオチン化ＩＬ−１７Ａ（３０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、メーカーの使用説明書に従って、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化）を、ストレプトアビミンでコートしたウェル（リアクチバインド（Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄ）、ピアス）に添加し、ＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ）、スイス）でブロッキングした後、４５μｌのＰＢＳ、４％ミルクおよび５μｌの血清サンプルを添加した。１時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したＦｃ融合タンパク質をプロテインＡ−ＨＲＰ複合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で検出した。ペルオキシダーゼ活性は、クアンタレッドを強化した化学蛍光ＨＲＰ基質（ピアス）を添加することによって検出した。蛍光強度は、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で５〜１０分後に測定した。種々の時点で血清中（各時点ｎ≧３、最終時点：ｎ＝１を除く）定量したＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）濃度および得られた排出相の傾きｋ（片対数目盛りにプロット）から、Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の半減期を、式ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを用いて計算した。
【００９１】
結果
排出相（β相、最後の４回の測定時点）から計算した、本発明の融合タンパク質Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の半減期は、５０．６時間であった（図７参照）。
【００９２】
実施例６：ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の結合特異性を定量するためのＥＬＩＳＡ
方法
標的タンパク質である、ヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））、マウスＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ヒトＴＮＦα（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、ヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ウシ血清アルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびオボアルブミン（シグマ）を、マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））に一晩コートした（濃度５μｇ／ｍｌの各標的を１００μｌ）。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ））でブロッキングし、ＰＢＳでの洗浄工程（上記の通り）の後、５０μｌの２Ｃ１（配列番号１０７）を最終濃度５０ｎＭで、５０μｌの抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、自家製造、ＯＤ＝２の貯蔵溶液をＰＢＳ、２％ミルクで１：２５０に希釈）と共にウェルに添加した。インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ミルクで１：１０００に希釈した、１００μｌの抗マウスＨＲＰ免疫抱合体（シグマ）をウェルに添加した。９６穴プレートを室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。１００μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ）を加えて比色検出を行い、６０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【００９３】
結果
クローン２Ｃ１（配列番号１０７）は高特異性でヒトＩＬ−１７Ａに結合し、ＥＬＩＳＡで示した通り、他の被験タンパク質のいずれとも交差反応しなかった（図８）。ＩＬ−１７Ｆについてバックグラウンド上に小さなシグナルが観察されたが、２Ｃ１がＩＬ−１７Ｆをコートしたバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）チップにプローブ結合した場合、検出可能な結合は測定されなかった（データは示さず）。
【００９４】
実施例７：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、ヒトおよびカニクリザルＩＬ−１７Ａに特異的および高親和性で結合する
方法
ａ）特異性
本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの結合特異性を定量するため、以下の標的タンパク質を使用した（実施例６より多い標的タンパク質）。
- ヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））
- ヒトＩＬ−１７Ｂ（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））
- ヒトＩＬ−１７Ｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- ヒトＩＬ−１７Ｄ（ペプロテック）
- ヒトＩＬ−１７Ｅ（ペプロテック）
- ヒトＩＬ−１７Ｆ（アブド・セロテック（Ａｂｄ Ｓｅｒｏｔｅｃ））
- マウスＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- ラットＩＬ−１７Ａ（アクロン・バイオテック（Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ））
- イヌＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＩＬ−１７Ａ（Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて自家製造、単一ペプチドなし、Ｃ−末端グリシン残基の後、ヘキサヒスチジンタグを用いる、抱合体からリフォールディング、配列番号１２９）
- フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（自家製造、Ｅ．ｃｏｌｉ；カルネモッラ（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ）ら（１９９６年）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６８（３），３９７−４０５頁参照）
- ヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- ヒトＴＮＦα（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））
- オボアルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
- ＢＳＡ（シグマ）
【００９５】
標的タンパク質を、マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上に一晩コートした（濃度１０μｇ／ｍｌの各標的１００μｌ）。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ））で室温で１時間ブロッキングし、その後ＰＢＳでの洗浄工程（上記の通り）の後、５０μｌの本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を最終濃度８０ｎＭで、５０μｌの抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（自家製造、ＯＤ＝２の貯蔵溶液をＰＢＳ、２％ミルクで１：２５０に希釈）と共にセルに添加した。インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ミルクで１：１０００に希釈した、１００μｌの抗マウスＨＲＰ免疫抱合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をウェルに添加した。９６穴プレートを室温で１時間インキュベーションした後、０．１％ＴｗｅｅｎのＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。１００μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を加えることによって比色検出を行い、６０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【００９６】
ｂ）カニクイザルＩＬ−１７Ａに対する親和性の測定
親和性測定は、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）３０００装置（バイアコア）を用いて実施した。カニクイザルＩＬ−１７Ａと本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）との間の相互作用分析のため、ＣＭ５チップ（バイアコア）を６９００ ＲＵのカニクイザルＩＬ−１７Ａでコートした。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ（バイアコア）であった。相互作用は、流速２０μｌ／分で種々の濃度の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を注入することによって測定した。相互作用の速度論的データ（個別のｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は全て、ＢＩＡエバリュエーション３．２ＲＣ１ソフトウェアを用いて評価した。
【００９７】
結果
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１７Ａに高特異性で結合し、ＥＬＩＳＡで示した通り、他の被験タンパク質のいずれとも交差反応しなかった（図９）。
【００９８】
本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のカニクイザルＩＬ−１７Ａに対する親和性をＥ．ｃｏｌｉ（抱合体からリフォールディング）で産生されたカニクイザルＩＬ−１７Ａを用いて、バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）で測定した。２Ｃ１は、ＫＤ １１ ｎＭでカニクイザルＩＬ−１７Ａに結合したことが分った（図１０）。
【００９９】
実施例８：哺乳類細胞における、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分および修飾Ｆｃ部分に融合した本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドの発現
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を、ＩｇＧ１のＦｃ部分（２Ｃ１−Ｆｃ、配列番号１３０）に遺伝子的に融合させ、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞で発現させた。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）は、変異体Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位のロイシンに代わりアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１の修飾Ｆｃ部分への遺伝的融合としてもクローニングし、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞で発現した（２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）、配列番号１３１）。さらに、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドとＦｃ部分との間のリンカーの長さが異なる、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）融合タンパク質の以下の４つの変異体を産生した：
【０１００】
・（配列番号１３２）“２Ｃ１−ｍ５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；５個のアミノ酸によるヒンジ領域の伸長：ＥＰＫＳＳリンカー
・（配列番号１３３）“２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；５個のアミノ酸の伸長：ＧＧＧＧＳリンカー
・（配列番号１３４）“２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；１０個のアミノ酸の伸長：（ＧＧＧＧＳ）２リンカー
・（配列番号１３５）“２Ｃ１−ｍ１５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；１５個のアミノ酸の伸長：（ＧＧＧＧＳ）３リンカー
【０１０１】
方法
“２Ｃ１−Ｆｃ”のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分に融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）、（配列番号１３０）：クローン２Ｃ１（配列番号１０７）をコードする遺伝子をテンプレートとして用い、プライマーＳＢ３（５’ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＣＣ ３’、配列番号１３６）およびＳＢ４（５’ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ３’、配列番号１３７）を用いて増幅して、制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩを導入した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩで消化し、先に二重消化したｐＦＵＳＥ−ｈｌｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））中にクローニングした。このＦｃ融合体をｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローニングするため、２Ｃ１−Ｆｃ融合体をコードする遺伝子を含有する、得られたｐＦＵＳＥベクターをテンプレートとして用い、プライマーＳＢ５（５’ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＣ ３’、配列番号１３８）およびＳＢ６（５’ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡＧ ３’、配列番号１３９）を用いて増幅して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化した後、挿入物を、先に二重消化したｐＣＥＰ４ベクターに連結して、配列番号１３０の遺伝情報を含有するプラスミドを得た。
【０１０２】
“２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）、（配列番号１３１を得る）：
２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを２つのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５およびＳＢ７（５’ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＣＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ３’、配列番号１４０）を使用した。第二のＰＣＲでは、プライマーＳＢ８（５’ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＣ ３’、配列番号１４１）およびＳＢ６を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０３】
“２Ｃ１−ｍ５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３２）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に５個のアミノ酸のリンカーＥＰＫＳＳで融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および“Ｂａ＿２Ｃ１＿Ｒ＿ＥＰＫＳＳ”（５’ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＧＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４２）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿ＥＰＫＳＳ”（５’ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４３）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０４】
“２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３３）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に５個のアミノ酸のリンカーＧＧＧＧＳで融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および４７ｃ．ｆｏ（５’ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４４）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿５ａａＧＳ−リンカー”（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４５）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０５】
“２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３４）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）２で融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および４７ｂ．ｆｏ（５’ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４６）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿１０ａａＧＳ−リンカー”（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４７）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０６】
“２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３５）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に１５個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）３で融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および４７．ｆｏ．ｃｏｒｒ（５’ＴＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４８）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿１５ａａＧＳ−リンカー”（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４９）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０７】
この融合タンパク質の発現には、対応するプラスミドを、エンドトキシンを含まないメガプレップ（Ｍｅｇａｐｒｅｐ）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製し、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−１０８５２）の一過性のトランスフェクションに使用した。ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞は、トランスフェクションの２４時間前に３０％のコンフルエンスで播種した。培地は、トランスフェクションの直前に、ＤＭＥＭ／５％ ＦＣＳ／ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で置換した。６０μｇのＤＮＡを使用して、１５０ｃｍ２の接着細胞をトランスフェクションした。ＤＮＡおよびＰＥＩ（２５ｋＤａ、ポリサイエンシーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を１：３の割合で混合し、１０秒間ボルテックスした。その後、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を室温で１０分間インキュベーションした後、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞に加えた。２４時間後、培地をＣＤ−ＣＨＯ／ＨＴ／Ｌ−グルタミン／ペンストレップ（インビトロジェン）で置換し、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベーションした。９６時間後に細胞培養物上澄を採取した。
【０１０８】
タンパク質精製のため、細胞培養物上澄を、プロテインＡ−セファロースアフィニティーカラムに適用した。その後、カラムをＰＢＳで洗浄し、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシンを用いてタンパク質を溶出した。その後溶出されたタンパク質をＰＢＳ中に透析した。要すれば、エンドトキシンの除去のため、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１１４を用いた第二の精製工程を実施した（マガリャイス（Ｍａｇａｌｈaｅｓ）ら（２００７年）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ，１０（３），３８８−４０４頁）。
【０１０９】
結果
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来Ｆｃ融合体を発現および精製することができた。図１１は、Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。
【０１１０】
実施例９：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、ヒト血清中で安定である
タンパク質薬は、患者に薬力学的効果を与え得るため、一定期間、血清中で安定であるべきである。この実施例では、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）の血清安定性を試験する。
【０１１１】
方法
１０μｇ／ｍｌの２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）を含有するヒト血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の３ｍｌの溶液を調製し、３７℃のインキュベーター中に置いた。指示した時点で２００μｌのサンプルを除き、実験の終了まで−２０℃に凍結させた。５日後、回収したサンプルでＥＬＩＳＡを実施したが、対照標準としてＰＢＳ中４℃で保管した２Ｃ１−Ｆｃサンプル（配列番号１３０）を使用した。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡを実施するため、ＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））をマキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上に一晩コートした（５μｇ／ｍｌを１００μｌ）。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ））でブロッキングし、ＰＢＳでの洗浄工程（上記の通り）の後、ＰＢＳ、２％ミルクで希釈した２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（指示した濃度で）を含む、１００μｌの試験サンプルを加えた。インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ミルクで１：１０００に希釈した、１００μｌのプロテインＡ−ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加した。９６穴プレートを室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。１００μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を加えて比色検出を行い、６０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【０１１３】
結果
ヒト血清中、３７℃で５日間の保管期間の後、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）は、ＰＢＳ中４℃で保管した２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）と同様に、実質的にその標的であるＩＬ−１７Ａに結合することができたが、このことは、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）がヒト血清中３７℃で安定であることを示唆する（図１２）。
【０１１４】
実施例１０：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドはインビトロでＩＬ−１７Ａを阻害する
この分析では、本発明の指示したＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドについて、インビトロでＩＬ−１７Ａを阻害する能力を試験した。細胞分析は、本発明の実施例３に記載した細胞分析と同様であり、主な違いは、ＩＬ−１７Ａを１ｎｇ／ｍｌの低濃度（実施例３の５０ｎｇ／ｍｌと比較して）でＴＮＦαと共に用いることである。
【０１１５】
方法
試験した本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのエンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）試験（パイロジェント（ＰＹＲＯＧＥＮＴ）単一検査ゲル凝集ＬＡＬ（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）））によって測定したところ、０．１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【０１１６】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ，プロモセル社（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｉｎｃ．），ＮＨＤＦ−ｃ，Ｃ１２３００）をＩＬ−１７Ａ阻害細胞分析に使用する。ヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））と組み合わせて細胞培養培地に添加すると、用量依存性のＮＨＤＦ細胞によるＩＬ−６産生を引き起こす。細胞培養培地（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ），Ｃ−２３０１０）中に放出されるＩＬ−６を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、デュオセット（ＤｕｏＳｅｔ）ＥＬＩＳＡシステムキット（ＤＹ２０６））を用いたＥＬＩＳＡによって、細胞培養物上澄中で定量する。
【０１１７】
１０４個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ），ＮＨＤＦ−ｃ，Ｃ１２３００）を各ウェルに分配し（２４穴プレート、ヌンク（Ｎｕｎｃ）またはＴＰＰ）、３７℃で２４時間培養した（培地：線維芽細胞成長培地Ｃ−２３０１０、プロモセル）。上澄を吸引し、種々の濃度の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドまたはＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラ（ＲｎＤシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ＩＬ−１７Ａ（ＲｎＤシステムズ）およびＴＮＦα（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））含有培地（最終ＩＬ−１７Ａ濃度１ｎｇ／ｍｌおよび最終ＴＮＦα濃度５０ｐｇ／ｍｌ）と混合した後、三重に、３５０μｌの対応する溶液を各ウェルに添加した（阻害剤溶液とサイトカイン含有培地の混合比は１：２３であった）。対照のウェルとしては、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを用いない（ＰＢＳのみ）インキュベーション、ＩＬ−１７Ａのみ、ＴＮＦαのみ、および培地のみのインキュベーションを用いた。３７℃で２４時間インキュベーションした後、上澄を吸引し、ＥＬＩＳＡ吸光度（ＩＬ−６濃度に相関）を、メーカーの使用説明書に従って定量した（ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））。
【０１１８】
結果
ＮＨＤＦ細胞を、一定の濃度のＩＬ−１７Ａ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦα（５０ｐｇ／ｍｌ）、並びに種々の濃度の市販のＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラまたは種々の濃度の以下の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドと共にインキュベーションした：
- ２Ｃ１（配列番号１０７）
- ２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）
- ２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）
- ２Ｃ１−ｍ５Ｅ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３２）
- ２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３３）
- ２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３４）
- ２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３５）
【０１１９】
表ＩＩＩは、本発明の指示したＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドを用いて実施した、いくつかの細胞分析より得られたＩＣ５０値の平均を示す。最良のＩＣ５０値（０．１１ｎＭ）は、２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３５）を用いて得られた。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
実施例１１：２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）のインビボ半減期
本発明の融合タンパク質２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）のインビボの半減期を、単回静注後の種々の時点でマウス血清中の２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の濃度を測定することにより定量した。
【０１２２】
方法
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））に、各マウス２００μｌを静注した。指示した時点で、約２０μｌの血液を伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで、血清を−２０℃で保管した。濃度が分っている２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）希釈系列を用いて、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の血清中の濃度をＥＬＩＳＡによって定量した：５０μｌのビオチン化ＩＬ−１７Ａ（３０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、メーカーの使用説明書に従って、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化）を、ストレプトアビミンでコートしたウェル（リアクチバインド（Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄ）、ピアス）に添加し、ＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ）、スイス）でブロッキングした後、４５μｌのＰＢＳ、４％ミルクおよび５μｌの血清サンプルを添加した。１時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したＦｃ融合タンパク質をプロテインＡ−ＨＲＰ複合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で検出した。ペルオキシダーゼ活性は、クアンタレッド（ＱｕａｎｔａＲｅｄ）を強化した化学蛍光ＨＲＰ基質（ピアス）を添加することによって検出した。蛍光強度は、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で５〜１０分後に測定した。種々の時点で血清中（各時点でマウス数ｎ＝５）定量した２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の濃度および得られた排出相の傾きｋ（片対数目盛りにプロット）から、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の半減期を、式ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを用いて計算した。
【０１２３】
結果
排出相（β相、最後から４回目の時点）から計算された、本発明の融合タンパク質２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の半減期は、５３時間であった（図１３参照）。
【０１２４】
実施例１２ 本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、インビボでヒトＩＬ−１７Ａを中和する
ヒトＩＬ−１７Ａは、マウスＩＬ−１７受容体に結合および刺激することができ、マウスＫＣ（ＣＸＣＬ１）ケモカインの上昇およびその後の分泌を導く（アラン（Ａｌｌａｎ）Ｂ．ら（２００７年）ＷＯ２００７／０７０７５０，米国イーライ・リリー（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ））。ＫＣ基礎レベルがおよそ１００ｐｇ／ｍｌであることと比較して、皮下ＩＬ−１７Ａ注射（３μｇ）の２時間後に観察されたＫＣレベルは、血清中、５００および１０００ｐｇ／ｍｌの間であった。
【０１２５】
方法
ａ）本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を用いる、インビボでのＩＬ−１７Ａの中和
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）（１７μｇ）を、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））とＣ５７ＢＬ／６マウスに混注（皮下）し、注射の２時間後に、血液サンプルを、伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで、血清を−２０℃で保管した。血清中のＫＣレベルは、市販のクアンティカイン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）マウスＣＬＣＬ１／ＫＣキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて定量した。対照群は、結合特異性に関与しないタンパク質としてＩＬ−１７ＡおよびＦｙｎ ＳＨ３ｗｔドメインを注射したマウス（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁参照）、ＰＢＳのみ、ＩＬ−１７Ａのみ、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のみを注射したマウス、またはＦｙｎ ＳＨ３ｗｔタンパク質のみを投与したマウスであった。
【０１２６】
ｂ）２Ｃ１−Ｆｃ融合体（配列番号１３０）を用いたインビボの中和：
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（４４μｇ／マウス）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静注した。２０〜６０分後、ヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を３μｇ／マウス皮下注射し、ＩＬ−１７Ａ注射の２時間後に、血液サンプルを、伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで、血清を−２０℃で保管した。血清中のＫＣレベルは、市販のクアンティカイン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）マウスＣＬＣＬ１／ＫＣキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて定量した。対照群は、ＰＢＳ（静注）およびＩＬ−１７Ａ（皮下注）、ＰＢＳのみ（静注および皮下注）、および、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）静注の後ＰＢＳ（皮下注）したマウスであった。
【０１２７】
結果
ヒトＩＬ−１７Ａをマウスに皮下注射した後、動物はＫＣと呼ばれるケモカインを過剰発現する。マウスの血清中、ＫＣレベルの上昇はＥＬＩＳＡによって測定し得る。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドの注射により、ＫＣのアップレギュレーションが阻止された。
【０１２８】
ａ）
ＩＬ−１７Ａおよび本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に混注した。本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）の阻害特性のため、ＫＣレベルはこの群において上昇せず、低いままであって、ほぼ基礎レベルと同等であった。ＫＣ産生の阻害が特異的ＩＬ−１７Ａ中和によることを実証するため、マウスにＩＬ−１７Ａと野生型Ｆｙｎ ＳＨ３ドメイン（ＩＬ−１７Ａに対する結合活性を有しない）を混注したが；これらのマウスでは、ＫＣレベルはＩＬ−１７Ａのみを投与した群と同程度の高さであった。図１４は、この実験で得られた結果を示す。
【０１２９】
ｂ）
この第二の急性炎症実験において、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）を静注し、その後、ＩＬ−１７Ａを皮下注射した。上記ａ）の通り、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、血清中のＫＣレベルのアップレギュレーションを阻止した。図１５は、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）によるインビボでのＩＬ−１７Ａの阻害を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＩＬ−１７阻害ポリペプチド、対応する融合タンパク質、組成物およびそれらの医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、適応免疫系または自然免疫系の他の細胞を支援することによって、免疫応答の調整において中心的な役割を果たす。初期の研究では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の２つのクラス（Ｔｈ１およびＴｈ２）が特定された。より最近では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の新規サブセットであるＴｈ１７系が特定された。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫が充分に及ばない、いくつかの菌類および微生物に加えて、細胞外の細菌に対する増強された宿主保護を担当する、適応免疫系の１部門として発生したと見られる。
【０００３】
Ｔｈ１７細胞は、新規なサイトカインファミリーであるＩＬ−１７ファミリーの発見との関連で特定されたが、現在は、このファミリーは６種（ＩＬ−１７Ａ〜Ｆ）を含むことが知られている。ＩＬ−１７（旧称ＣＴＬＡ−８）は主としてＴｈ１７細胞によって発現され、ＩＬ−１７Ａと規定されたが、これはこのサイトカインファミリーの創設種であることを示す。ＩＬ−１７の構成種は、他の現在知られている哺乳類タンパク質と配列相同性を持たず、従って、独特なサイトカインファミリーを構成する。構造類似性からヘテロダイマーが存在する可能性が暗示されるが、ＩＬ−１７Ｆの結晶構造から推定されるＩＬ−１７ファミリーの構成員の構造的特徴により、多数のサイトカインと同様に、それぞれのファミリーの構成員はおそらくホモダイマーとして産生されることが提示される。極最近、活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって発現されたＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆのヘテロダイマーが、ＩＬ−１７ＲＡ／ＩＬ−１７ＲＣ複合体を介してシグナルを送ることが特定された（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）Ｊ．Ｆ．ら（２００８年）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８１，２７９９−２８０５頁）。
【０００４】
以前はＴｈ１を介すると考えられていた、慢性炎症性疾患における中心的メディエーターおよびいくつかのタイプの自己免疫状態における主要な病原性エフェクターとして、Ｔｈ１７細胞が特定されたことにより、新たな治療アプローチが期待される（ウェーバー（Ｗｅａｖｅｒ）Ｔ．ら（２００８年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５，８２１−８５２頁）。実際に、炎症促進サイトカインであるＩＬ−１７は主にＴｈ１７細胞によって発現され、関節リウマチ（ＲＡ）患者では滑液中のレベルが上昇しており、初期ＲＡ発症に関与することが示されている。加えて、ＩＬ−１７は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の強力な誘導物質であるが、後者は骨侵食の主要原因であり、罹患患者にはひどい痛みをもたらす（ルバーツ（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ）Ｅ．（２００８年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，４１，８４−９１頁）。さらに、ＩＬ−１７の不適切または過剰な産生は、種々の他の疾病および障害の病理と関係するが、例えば、これらの疾病および障害としては、変形性関節症、骨インプラントの弛緩、急性移植拒絶反応（アントニサミー（Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ）ら、（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２，５７７−５８４頁；ヴァン・コーテン（ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ）ら（１９９８年）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，９，１５２６−１５３４頁）、敗血症、敗血性または内毒素性ショック、アレルギー、喘息（モレット（Ｍｏｌｅｔ）ら（２００１年）Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０８，４３０−４３８頁）、骨量の減少、乾癬（テウニッセン（Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１１，６４５−６４９頁）、虚血、全身性硬化症（クラサワ（Ｋｕｒａｓａｗａ）ら（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４３，２４５５−２４６３頁）、脳卒中、および他の炎症性疾患が挙げられる。
【０００５】
結果として、抗ＩＬ−１７化合物は、抗炎症薬としての可能性があり、多数のインビボ試験に沿った治療アプローチによって、ＩＬ−１７の中和が、関節炎等の炎症過程を減ずることが示される。例えば、関節炎の初期段階の間、免疫方法の後に開始する、ＩＬ−１７受容体ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質による内因性ＩＬ−１７の早期中和により、実験的関節炎の発症が抑制される（ルバーツ（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ）ら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７，１００４−１０１３頁）。さらに、動物モデルにおいて、コラーゲン誘導関節炎の発症後、中和抗ＩＬ−１７抗体による治療により、関節の炎症、軟骨破壊および骨侵食が減少した（ルバーツら（２００４年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５０；６５０−６５９頁）。組織学的分析により、関節の炎症の抑制が確認され、抗ＩＬ−１７抗体による治療後、全身性ＩＬ−６レベルが有意に減少した。対照的に、マウスＩＬ−１７を発現しているアデノウイルスベクターを用いた全身性および局所性ＩＬ−１７の過剰発現により、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の発症が加速され、その部位での滑膜炎が悪化した（ルバーツら（２００１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７，１００４−１０１３頁およびルバーツら（２００２年），Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．５１，１０２−１０４頁）。
【０００６】
抗体は、その製造し易さ、実質的にあらゆる所望の標的抗原に対して親和性および特異性が高いため、分析、精製、診断および治療目的に日常的に使用されるが、なおも多数の重大な欠点があり、例えば、複雑な哺乳類細胞の産生系が必要なこと、ジスルフィド結合の安定性への依存、ある抗体断片の凝集傾向、低溶解性、および最後に大切なことだが、抗体はヒト化した場合であっても望まない免疫反応を引き起こす可能性がある。結果として、最近、新規な分類の万能結合タンパク質を産生するための骨格として、小さな球状タンパク質の開発が注目されるようになった。多様性および標的特異性を与えるため、典型的には、好適な生物物理学的特性を有するタンパク質骨格の表面成分（例えば細胞外ループ）は組み合わせて変化させて、興味のある標的結合特異性をスクリーニングするタンパク質ライブラリーを製造する（ビンツ（Ｂｉｎｚ），Ｈ．Ｋ．，およびプルックスン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ），Ａ．（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，４５９−４６９頁）。
【０００７】
これらの非免疫グロブリン由来結合試薬は、集合的に規定された「骨格」である（スケッラ（Ｓｋｅｒｒａ）Ａ．（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，１６７−１８７頁）。５０を超える異なるタンパク質骨格が、過去１０〜１５年にわたって提案され、この分野の最先端のアプローチは（ゲバウアー（Ｇｅｂａｕｅｒ）ＭおよびスケッラＡ．（２００９年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５頁に要約）：アフィボディ（ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに基づく）、クニッツ型ドメイン、アドネクチン（ヒトフィブロネクチンの第１０ドメインに基づく）、アンチカリン（リポカリン由来）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリン反復タンパク質由来）、アビマー（多量体化ＬＤＬＲ−Ａに基づく）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）（超高熱古細菌由来のＳａｃ７ｄに基づく）、およびヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来するフィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）である。
【０００８】
一般に、ＳＨ３ドメインは、細胞間情報伝達に関与する、多種多様のタンパク質中に存在する（ムサッキオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）ら（１９９４年）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６１；２８３−２９７頁）。このドメインは、タンパク質中で一定の位置を占有せず、独立して発現および精製され得る。現在、約３００のヒトＳＨ３ドメインを有する１０００を超えるドメインの存在が知られている（ムサッキオＡ．（２００３年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６１；２１１−２６８頁）。ＳＨ３ドメインには広範な配列多様性があるが、全てのＳＨ３ドメインは保存された折りたたみ構造：２つの逆平行βシートで形成されるコンパクトなβバレルを共有する（ムサッキオＡ．（２００３年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６１；２１１−２６８頁）。代表的には、ＳＨ３ドメインは、ＰＸＸＰコア結合モチーフを含有する高プロリン含有ペプチドに結合する（レン（Ｒｅｎ）ら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９；１１５７−１１６１頁）が、非従来型のＳＨ３結合部位の例も記載されている（カークカイネン（Ｋａｒｋ−ｋａｉｎｅｎ）ら（２００６年）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．７；１８６−１９１頁）。これまでに配列決定したＳＨ３ドメインの多くは、およそ６０〜６５個のアミノ酸の全長を有するが、それらのいくつかは、二次構造の主要な保存エレメントに接続するループ中に挿入することにより、８５個のアミノ酸の特徴を有するかもしれない（コヤマ（Ｋｏｙａｍａ）ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２（６）；９４５−９５２頁）。種々のＳＨ３ドメインのアライメントにより、適切な構造形成および標準的な高プロリン含有モチーフの認識に関与する、保存アミノ酸残基が明らかになった（ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９；２１７０−２１８０頁）。
【０００９】
最近、本発明者らは、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインが、結合タンパク質産生に特に魅力的な骨格（「フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）」）であることを実証したが、これは、このドメインが、（ｉ）細菌中、溶解形態で多量発現され得ること、（ｉｉ）単量体であり、溶液中で保存した際に凝集しないこと、（ｉｉｉ）非常に安定であること（Ｔｍ ７０．５℃）、（ｉｉｉ）システイン残基がないこと、および（ｉｖ）マウスからヒトへ完全に保存されたアミノ酸配列を特徴とするヒト由来のものであり、従って非免疫原性であることによる（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、新規なＩＬ−１７Ａ結合分子を提供することであり、特に、ＩＬ−１７Ａに対して特異性および親和性が高い新規なＩＬ−１７Ａ結合分子を提供することである。さらなる目的は、好ましくはＩＬ−１７Ａが介在する疾患および医学的症状の治療および／または予防用の医薬品における使用のための、研究、診断および医学的処置に好適な、ＩＬ−１７Ａ結合分子、好ましくは、ＩＬ−１７阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、上記の目的は、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドによって解決された：
（ｉ）（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）ａ−Ｄ−（Ｘ）ｂ−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）ｃ−Ｉ−（Ｘ）ｄ−Ｇ−（Ｘ）ｅ−ＷＷ−（Ｘ）ｆ−Ａ−（Ｘ）ｇ−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）ｈＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ （Ｉ）
式中、ａ〜ｈは０〜２０であり、
好ましくは、ａは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは６であり；
好ましくは、ｂは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｃは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｄは１〜１０であり、より好ましくは３〜９であり、最も好ましくは５または７であり；
好ましくは、ｅは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｆは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｇは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｈは０〜６であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１または２である；
（ｉｉ）（ｉ）に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）好ましくはストリンジェントな条件下で、（ｉ）をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸によってコードされる、アミノ酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片または機能性誘導体、
ここで、前記のポリペプチドはＩＬ−１７Ａに結合する。
【００１２】
上記一般式（Ｉ）は、ヒトＦｙｎ ＳＨ１３骨格の反復的および広範囲の突然変異解析およびＩＬ−１７Ａ結合に基づく選択の結果である。
【００１３】
Ｘで規定する位置は、アミノ酸のタイプおよびアミノ酸の数によっても広範に変化し得る。好ましくは、Ｘはいずれもシステインではない。Ｘによるアミノ酸の好ましい数は、下付き文字ａ〜ｈで示され、これらは全て、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０または１〜１０である。
【００１４】
天然のヒトＦｙｎ ＳＨ３において、（Ｘ）ａおよび（Ｘ）ｄは、それぞれ、ＲＴ−およびＳｒｃループと相関する可能性がある。必須ではないが、（Ｘ）ａおよび（Ｘ）ｄはループ構造を提供することが好ましい。典型的なループ構造は、２から２０を超えるアミノ酸を含むことが知られている（ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９；２１７０−２１８０頁）。従って、（Ｘ）ａおよび／または（Ｘ）ｄは、２〜２０のアミノ酸を有することが好ましい。好ましくは、ａは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは６である。好ましくはｄは１〜１０であり、より好ましくは３〜９であり、最も好ましくは５または７である。好ましくは（Ｘ）ａはＴＡＦＷＰＧであり、より好ましくはＶＡＦＷＰＧであり、最も好ましくはＫＡＦＷＰＧである。好ましくは（Ｘ）ｄはＬＮＳＳＥであり、より好ましくはＴＲＴＳＤまたはＬＨＴＳＤであり、最も好ましくはＬＲＴＳＤである。
【００１５】
（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｅ、（Ｘ）ｆおよび（Ｘ）ｇは、互いに独立して、好ましくは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。（Ｘ）ｈは好ましくは０〜６であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。
【００１６】
最も好ましい態様において、式（Ｉ）は以下である：
（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）６−Ｄ−（Ｘ）１−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）１−Ｉ−（Ｘ）５−７−Ｇ−（Ｘ）１−ＷＷ−（Ｘ）１−Ａ−（Ｘ）１−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）１−２ＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ （Ｉａ）
【００１７】
勿論、式（Ｉ）のアミノ酸配列には大多数のバリエーションがあり、それらは依然として本発明のポリペプチドのＩＬ−１７Ａ結合を可能にするであろう。従って、本発明は、（ｉ）に対して、少なくとも５０、６０または７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、ポリペプチドも包含する。
【００１８】
本書で使用する場合、アミノ酸配列間の「アミノ酸配列同一性」という用語は、生化学の当業者が通常広く使用するアラインメントおよび比較技術に関連することが意図される。２つのアミノ酸配列のアミノ酸配列同一性は、通常のアラインメント方法およびツールによって測定し得る。例えば、式（Ｉ）のアミノ酸配列に対する、任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を測定には、ＳＩＭ局所相似性プログラムを使用し得る（シャオキン・ファン（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ）およびウェッブ・ミラー（Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ）、「時間効率のよい線形空間局所相似性アルゴリズム（Ａ Ｔｉｍｅ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， Ｌｉｎｅａｒ−Ｓｐａｃｅ Ｌｏｃａｌ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」 Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， １２巻： ３３７−３５７頁， １９９１年）が、これは著者らおよびその機関から自由に入手可能であり（ワールドワイドウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照）、多重アラインメント分析には、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用し得る（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列加重、位置特異的ギャップペナルティおよび加重マトリックス選択による進行性多重配列アラインメント感度の改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０頁，１９９４年）。好ましくは、本発明のポリペプチド、断片または機能性誘導体の、式（Ｉ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性の程度は、式（Ｉ）の完全な配列に対して定量する。
【００１９】
さらに、本発明は、好ましくはストリンジェントな条件の下で、（ｉ）をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含する。換言すれば、本発明によるポリペプチドに包含されるアミノ酸配列は、好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする能力をなお有するべき核酸をコードすることによって、間接的に規定される。核酸が互いにハイブリダイズするかどうかは、特異的アラインメントおよび比較ツールにより、また実験的に、当該技術において規則的に測定される。１つの核酸がストリンジェントな条件下で特異的な参照核酸配列にハイブリダイズする能力を測定する、従来技術の一般的および／または標準的なプロトコル（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびルセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）（３巻），２００１年）の次に、興味のあるポリペプチドをコードする任意の核酸がストリンジェントな条件下で式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖にハイブリダイズする能力を、アラインメントツールを用いてこれら２つのヌクレオチド配列を比較することによって分析および測定することが好ましく、アラインメントツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０頁，１９９０年）およびＬＡＬＩＧＮアラインメントツール等が挙げられる。より好ましくは、本発明のポリペプチドであることが疑われる、興味のあるポリペプチドをコードする核酸が式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする能力は、以下の条件下でのサザンブロット分析で確認される：４５℃で、６ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後、６５℃で、０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄。
【００２０】
さらに、本発明は、上記の本発明のアミノ酸配列全ての断片、好ましくは機能性断片、または機能性誘導体を含む、ポリペプチドを包含する。
【００２１】
従って、「本発明によるポリペプチドまたはアミノ酸配列」という用語は、上記で特定された性質を有する、即ちＩＬ−１７Ａに結合する、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能性断片および誘導体も包含する。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能性誘導体は、ＩＬ−１７Ａへの結合を実証する、実質的に充分入手しやすいアミノ酸残基または非天然等価体を有する、あらゆるアミノ酸配列および／またはその化学誘導体（非天然アミノ酸等価体、グリコシル化、化学誘導）を包含することが意図される。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能性誘導体において、１以上のアミノ酸が、欠失、修飾、挿入および／または置換されてもよい。さらに、「機能性誘導体」との関連で、挿入とは、１以上のアミノ酸の上述の非誘導体化結合タンパク質中への挿入を言う。機能性誘導体は、５、４、３、２を超える、または１を超えるアミノ酸の変更（即ち、欠失、修飾、挿入および／または置換されたアミノ酸）を含まないことが、さらに好ましい。別の態様において、ポリペプチドまたはアミノ酸配列の全てのアミノ酸の、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下が変更される（即ち、欠失、修飾、挿入および／または置換されたアミノ酸である）ことが、さらに好ましい。誘導体における置換は、保存的または非保存的置換であってもよいが、好ましくは保存的置換である。いくつかの態様において、置換として、天然に存在するアミノ酸の、天然に存在しないアミノ酸での交換も挙げられる。保存的置換は、アミノ酸の、置換されるアミノ酸に類似した化学的性質を有する別のアミノ酸での置換を含む。好ましくは、保存的置換は、（ｉ）塩基性アミノ酸の、別の塩基性アミノ酸での置換；（ｉｉ）酸性アミノ酸の、別の酸性アミノ酸での置換；（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸の、別の芳香族アミノ酸での置換；（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸の、別の非極性脂肪族アミノ酸での置換；および（ｖ）極性非荷電アミノ酸の、別の極性非荷電アミノ酸での置換よりなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンよりなる群から選択される。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩より選択される。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンよりなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンよりなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンよりなる群から選択される。保存的アミノ酸置換と対照的に、非保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、上記で概説した保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に該当しない、あらゆるアミノ酸との交換である。機能性誘導体が欠失を含む場合には、誘導体中、参照ポリペプチド中に存在する１つまたはいくつかのアミノ酸が除去されている。しかし、欠失は、誘導体中に、全部でアミノ酸３つ未満、好ましくは４つ未満、より好ましくは５つ未満、および最も好ましくは６つ未満であるよう、多数であるべきではない。上記の通り、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列のアミノ酸は修飾されてもよく、例えば化学的に修飾されてもよい。例えば、ポリペプチドのアミノ酸の側鎖または遊離アミノまたはカルボキシ末端は、例えば、グリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等によって修飾されてもよい。化学的修飾はインビボでも、例えば宿主細胞中でも起こり得るが、これは当該技術においてよく知られている。例えば、好適な化学的修飾モチーフ、例えばポリペプチドのアミノ酸配列中に存在するグリコシル化配列モチーフは、ポリペプチドをグリコシル化させるであろう。本発明の機能性誘導体に言及する全ての態様において、本書の上記で規定した式（Ｉ）を有するアミノ酸配列は、機能性誘導体が導入される出発分子であることを理解しなければならない。挿入の場合、２つの出発分子において、第一の分子でＸａが４であり、第二の分子でＸａが５である以外は同一の配列を有する場合、例えばＸａのＣ末端への挿入が、第一の分子では２つのアミノ酸であり、第二の分子では１つのアミノ酸であるならば、同一の長さで、おそらく同一のアミノ酸配列の分子が得られるであろう。
【００２２】
本発明のポリペプチドはＩＬ−１７Ａに結合し、好ましくはヒトＩＬ−１７Ａに結合する。好ましくは、ＩＬ−１７Ａに特異的に結合し、即ち、他のサイトカインには結合しないか、それらにははるかにより少ない程度に結合し、好ましくは少なくとも２、５、１０、５０、１００、５００または１０００倍少なく結合する。本発明のポリペプチドの結合特異性を定量するための典型的で好ましいＥＬＩＳＡ分析を、実施例６および７に示す。
【００２３】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１７Ａに、特異的および高結合親和性で結合する。
【００２４】
さらに好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ−１７Ａに対して特異的な（インビボおよび／またはインビトロ）結合親和性を有し、好ましくはＫＤが１０−７〜１０−１２Ｍであり、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍであり、最も好ましくは１０−１２Ｍ未満である。例として、および好ましくは、本発明のポリペプチドの結合親和性は、以下の実施例２によって定量し得る。
【００２５】
最も好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、明細書に付記した通りの配列番号１〜１１９またはそれらの機能性誘導体よりなる群から選択される。
【００２６】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−１７Ａに結合するだけではなく、実際にＩＬ−１７Ａ（機能）を阻害する。この容量は、実施例３および１０に実証されており、ここで、ＩＬ−１７Ａの添加に対する応答において、ポリペプチドがヒト皮膚線維芽細胞中のＩＬ−６の誘導を阻害する能力が実証された。
【００２７】
さらに、本発明のポリペプチドは、溶液中で高い安定性を有し、例えば、単純なリン酸緩衝生理食塩水中、少なくとも６ヶ月間、４℃で安定である（実施例４参照）。
【００２８】
しかし、安定性はインビトロの組成物に限らず、本発明のポリペプチドを静注したマウスにおいて、既に明らかである（実施例５および１２参照）。
【００２９】
結論として、本発明のポリペプチドは、研究、診断および医学的応用に非常に適している。
【００３０】
ＩＬ−１７Ａ抗体を置換することの他に、本発明のポリペプチドはインビボおよびインビトロの薬学的および診断的応用のための、新規で免疫原性がより低い融合タンパク質の設計も可能にする。従って、第二の様相において、本発明は、薬学的および／または診断的有効成分に融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【００３１】
上記の通り、本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分を含んでいてもよく、例えば治療的または診断的関連放射性核種に対する、例えば非ペプチド性リンカー、非ペプチド性リガンドを含んでいてもよい。
【００３２】
好ましくは、前記の活性成分は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦβ、ＬＴ−β、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βよりなる群から選択されるサイトカインである。
【００３３】
別の好ましい態様において、前記の活性成分は毒性化合物であり、好ましくは有機小分子またはポリペプチドであり、より好ましくは、カリケアマイシン、マンタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラマイシン、ダイネミシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシン−Ａ鎖、モデシン、トランケートした緑膿菌エンドトキシンＡ、ジフテリア毒素および組み換えゲロニンよりなる群から選択される毒性化合物である。
【００３４】
別の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、前記の活性成分がケモカインであり、好ましくは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルカインよりなる群から選択されるケモカインである、融合タンパク質である。
【００３５】
さらに好ましい態様において、本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質は人工アミノ酸を含有する。
【００３６】
本発明の融合タンパク質のさらに好ましい態様において、前記の活性成分は蛍光色素であり、好ましくは、アレクサフルオルまたはＣｙ色素（ベルリエ（Ｂｅｒｌｉｅｒ）ら、「長波長アレクサフルオル色素のＣｙ色素との定量比較：色素およびそれらのバイオコンジュゲートの蛍光（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｌｏｎｇ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｄｙｅｓ ｔｏ Ｃｙ Ｄｙｅｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５１（１２）：１６９９−１７２２頁，２００３年）；光増感剤、好ましくは光毒性赤色蛍光タンパク質キラーレッド（ブリナ（Ｂｕｌｉｎａ）ら（２００６年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４，９５−９９頁）またはヘマトポルフィリン；凝血促進因子、好ましくは組織因子；プロドラッグ活性化酵素、好ましくは、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼよりなる群から選択される酵素；γ放射性アイソトープの群からの放射性核種、好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、または、ポジトロン放射体の群からの放射性核種、好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉ、または、β放射体の群からの放射性核種、好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、または、α放射体の群からの放射性核種、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔよりなる群から選択される成分である。
【００３７】
別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、本書において上記で規定した通りの１以上の非ポリペプチド成分に、直接または化学リンカーを介して結合してもよい。
【００３８】
本発明の融合タンパク質のより好ましい態様において、前記の活性成分は１以上の機能性Ｆｃドメインであり、好ましくは１以上のヒト機能性ドメインであり（例えば、配列番号１１７〜１１９および配列番号１３０を参照）、それ（ら）は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのインビボの半減期を延長することが可能であり、それらのいくつかは、例えば治療的、予防的および／または診断的適応において、哺乳類の免疫反応を、融合タンパク質の本発明のポリペプチド成分の特異的標的結合部位に向ける。本発明のポリペプチドは、１以上の機能性ＦｃドメインのＮ−またはＣ−末端のいずれか、または、１以上のＦｃドメインのＮ−およびＣ−末端の両者に融合し得る。本発明の融合タンパク質は、１つ以上、好ましくは１つのＦｃドメインの、少なくとも片側、好ましくはＮ−末端に融合した、本発明のポリペプチドの多量体、好ましくは四量体、三量体、または最も好ましくは二量体を含むことが好ましい。この点において、（２Ｃ１）２−Ｆｃと規定されるフィノマー−フィノマー−Ｆｃ融合タンパク質が多量体ポリペプチドＦｃ融合体の有利点を実証することが知られており、以下の実施例２の図３ｅおよび３ｆおよび表ＩＩに示す通り、この融合体は、対応する単量体２Ｃ１−Ｆｃ融合タンパク質よりも、ＩＬ−１７Ａに対する親和性が高い。従って、本発明の好ましい態様は、多量体ポリペプチドＦｃ融合タンパク質を対象にする。
【００３９】
抗体の「機能性Ｆｃドメイン」は、当業者によく知られている用語であり、抗体のパパイン消化に基づいて規定される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類され、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類される。重鎖の定常領域によって、免疫グロブリンの種々のクラスはそれぞれ［α］、［δ］、［ε］、［γ］、および［μ］と呼ばれる。抗体の機能性Ｆｃドメインは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接的に関与する。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、新生児Ｆｃ受容体、活性化Ｆｃγ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａ、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂ、およびＣ１ｑ等の、親和性の異なる種々の受容体に結合し、非常に異なる活性を与える。ヒト抗体のＦｃドメインの活性化および抑制性受容体への親和性は、操作および修飾し得る（ストロール（Ｓｔｒｏｈｌ）Ｗ．（２００９年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，６８５−６９１頁参照）。従って、上記の通り、本発明は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのインビボでの半減期を延長することができ、ヒト由来の機能性Ｆｃドメイン、好ましくはＩｇＧ１抗体のヒト機能性Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１１７〜１１９および配列番号１３０参照）を含有する、Ｆｃ融合体を含む。
【００４０】
本発明の融合タンパク質のより好ましい態様において、活性成分は、活性化またはサイレンシングされたエフェクター機能を有するＩｇＧ１の１以上の改変ヒト機能性Ｆｃドメインであり、好ましくは、サイレンシングされたエフェクター機能を有するＩｇＧ１の１以上の改変ヒト機能性Ｆｃドメインであり、最も好ましくは、Ｌ２３４およびＬ２３５に突然変異を有する、サイレンシングされたエフェクター機能を有するＩｇＧ１の１以上の改変ヒト機能性Ｆｃドメインであり（例えば、配列番号１３１〜１３５参照）、カバト（Ｋａｂａｔ）のＥＵインデックスに従って番号を付ける（ジョンソン（Ｊｏｈｓｏｎ）Ｇ．およびウ（Ｗｕ）Ｔ．Ｔ．（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２１４−２１８頁参照）。
【００４１】
さらに好ましい態様は、上記の通りの本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質であって、さらに、血中半減期を調節する成分を含み、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、免疫グロブリンおよびアルブミン結合ペプチドよりなる群から選択される成分を含む、ポリペプチドまたは融合タンパク質に関する。
【００４２】
さらに、本発明の融合タンパク質があらゆる上記の本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを含み、好ましくは、配列番号１１７〜１１９および配列番号１３０〜１３５またはその機能性誘導体からなる群から選択されるものを含むことが好ましい。
【００４３】
本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質は、好ましくは単量体であるが、また本発明のポリペプチドの多量体も包含し、好ましくは四量体、より好ましくは三量体、または最も好ましくは二量体を包含することが注目される。
【００４４】
本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、多数の従来からの周知技術のいずれかにより、または、市販の自動合成装置により、調製してもよい。他方で、従来の組み換え技術単独で、または従来の合成技術との組み合わせにより調製してもよい。
【００４５】
この点において、本発明のさらなる様相は、（ｉ）本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）前記の核酸を含むベクター、および（ｉｉｉ）前記のポリヌクレオチドおよび／または前記のベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【００４６】
好ましくは、本発明は、
（ｉ）本発明のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードする核酸、より好ましくは
（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）６−Ｄ−（Ｘ）−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）１−Ｉ−（Ｘ）５−７−Ｇ−（Ｘ）１−ＷＷ−（Ｘ）−Ａ−（Ｘ）−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）１−２−ＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ
をコードする核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して、少なくとも６０％または７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を持つ配列を有する核酸；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸；
（ｉｖ）核酸であって、前記の核酸が、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸のうちの１つの置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、核酸；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸のいずれか１つの断片であって、本発明によるポリペプチドをコードする（ｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする、断片
を含む、単離または精製核酸を対象とする。
【００４７】
より好ましくは、本発明の核酸は、上述の通りのポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸を含む。この点において、上記の核酸（ｉ）〜（ｖ）のいずれも、好ましくはＩＬ−１７Ａに結合するポリペプチドをコード化し、より好ましくはＩＬ−１７Ａの機能を阻害することが理解される。
【００４８】
本発明の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびそれらのあらゆる他のアナログであり得る。ベクターおよび宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドおよび／または融合タンパク質の製造、例えば遺伝子治療用の治療に有用なベクターおよび宿主細胞の製造などの目的に適合するあらゆる従来のタイプであってもよい。当業者は、多くの従来技術からそのような核酸、ベクターおよび宿主細胞を選択し、通常の方法により過度の負担なく、それらが所望の目的に特に適合することを確認できるであろう。
【００４９】
好ましくは、核酸はプロモーターに動作可能に結合し、好ましくは、Ｔ５プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメント、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメントよりなる原核生物プロモータの群、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ ｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモーターよりなる真核生物プロモーターの群から選択されるプロモーターに結合する。
【００５０】
また、本発明の組み換えベクターは、本発明の核酸を含むものであって、好ましくは本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を産生する能力があるものが好ましい。好ましくは、このようなベクターは、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の遺伝子治療に使用されるベクターよりなる群から選択される。
【００５１】
加えて、本発明は、本発明の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質に特異的に結合する抗体を包含する。抗体が融合タンパク質に結合する場合、融合タンパク質の、本発明のポリペプチドまたは融合エピトープよりなる部分に特異的に結合し、即ち、一部は本発明のポリペプチドよりなり、一部は薬学的および／または診断的活性成分よりなる抗体の結合部位に結合するが、この活性成分は好ましくはポリペプチドまたはペプチドである。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。本書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗体分子全体だけではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ断片等の抗原結合断片にも言及する。また、キメラ抗体、好ましくはヒト化抗体も含まれる。このような抗体は、任意のタンパク質と本発明のポリペプチドとを判別する研究ツールとして有用である。さらなる様相は、本発明によるモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞株に関する。
【００５３】
本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＩＬ−１７Ａ結合および阻害特性、ならびに保存安定性およびインビボ安定性を実証することから、本発明のさらなる様相は、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質、核酸および／または組み換えベクター、および任意に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。医薬組成物という用語は、インビボで使用する診断用組成物も包含することが意図される。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、従来のあらゆる方法で製造してもよい。以下に示す疾患に罹患する患者の治療において、本発明の少なくとも１つの化合物は、経口または非経口経路を含む、治療的ポリペプチドまたはその治療的断片を有効量で生物学的に利用可能にするあらゆる形態または様式で投与し得る。例えば、本発明の組成物は、吸入等により、皮下、筋肉内、静脈内に投与し得る。製剤調製分野における当業者は、選択された製品の特別の性質、治療される疾患または病状、疾患または病状の病期、および他の関連する状況に応じて、適宜の形態および様式を容易に選択し得る（例えばレミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０年）参照）。好適な担体または賦形剤は、活性成分のビヒクルまたは媒体として働き得る、液体材料であってもよい。好適な担体または賦形剤は、当技術分野においてよく知られており、例えば、安定剤、抗酸化剤、ｐＨ調整物質、放出制御賦形剤等が挙げられる。本発明による組成物は、好ましくは凍結乾燥形態で提供される。速やかな投与のためには、好適な水性担体中、例えば注射用滅菌水または滅菌緩衝生理食塩水中に溶解する。ボーラス注入法としてよりは点滴による投与のため、より高容量を製造することが望まれる場合は、最終製剤の時点でヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン添加血液を溶媒中に取り込むことが有利である。あるいは、製剤は皮下投与し得る。ヒト血清アルブミン等の生理学的に不活性なタンパク質が過剰に存在することにより、輸液用の容器およびチューブ壁への吸着による薬学的に有効なポリペプチドの損失を防ぐ。アルブミンを使用する場合、好適な濃度は、食塩水の重量の０．５〜４．５％である。
【００５５】
本発明のＩＬ−１７Ａ結合および阻害ポリペプチドは、ＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態の治療および／または予防に特に有用である。したがって、本発明のさらなる様相は、医薬用途のため、即ち、医薬の製造のため、好ましくは、疾患または医学的状態の治療および／または予防のための医薬の製造のためであって、好ましくは疾患または医学的状態がＩＬ−１７Ａ−およびＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態よりなる群から選択されるものである、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質、核酸および／または組換えベクターの使用を対象とする。
【００５６】
好ましい態様において、本発明の医薬用途は、炎症性、自己免疫および／または骨量減少関連疾患または状態から選択される、疾患または医学的状態の治療および／または予防に関する。
【００５７】
最も好ましい態様において、前記の炎症性、自己免疫および／または骨量減少関連疾患または状態は、関節炎、好ましくは関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎および変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症および皮膚過敏症の両者を含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、内分泌性眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、虚血、全身性硬化症、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（１型糖尿病）、自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸宮体腎炎（ネフローゼ症候群を伴う、および、伴わず）、特発性ネフローゼ症候群または微小変化ネフロパシー、腫瘍、皮膚炎症の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨インプラントの弛緩、急性移植拒絶反応、代謝異常、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症、骨量の減少、変形性関節症、骨粗しょう症、閉塞性または炎症性気道疾患の歯周病、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫、急性および超急性炎症反応、ＩＬ−１７Ａ介在性ＴＮＦ−α関連疾患、急性感染症、敗血症、敗血性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の熱傷、悪液質、消耗症候群、脳卒中、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患から選択される。上記で特定された疾患および医学的状態の全ては、共通して、それらの起源および／または症状がＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ−１７に関連する。
【００５８】
好ましくはＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態よりなる群から選択され、より好ましくは上記に具体的に列挙したものからなる群から選択される、疾患または医学的状態の治療および／または予防のための本発明の化合物、即ちポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクターおよび宿主細胞の投与量および投与形態は、勿論、本発明の特定のポリペプチドまたは融合タンパク質阻害剤、個々の患者群または患者、さらなる医療的活性化合物の存在および治療している病状の重篤度によって変わるであろう。しかし、予防的および／または治療的使用のために投与すべき量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５ｍｇであることが、現在のところ好ましい。好ましくは、予防的および／または治療的使用のための投与頻度は、およそ１週間に２回からおよそ３ヶ月毎に１回の範囲内であり、好ましくはおよそ２週間毎に１回からおよそ１０週間毎に１回、より好ましくは４〜８週間毎に１回の範囲内である。本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、非経口的、静脈内に便利かつ好ましく投与されるが、好ましくは肘正中静脈または他の末梢静脈、筋肉内または皮下に投与される。ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、点眼剤としても局所的に送達され得る。患者の好ましい予防的および／または治療的処置としては、本発明のポリペプチドを月に１回から２〜３ヶ月毎に１回、またはより低頻度で投与することが挙げられる。
【００５９】
結論として、本発明は治療方法にも関し、ここで上記の医薬組成物の薬理学的有効量が、それを必要とする患者に投与され、好ましくはＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ１７に関連する疾患または医学的状態を罹患する患者に、より好ましくは、上記で特定した疾患または医学的状態のうちの１つを罹患する患者に投与される。本書で使用される場合、「処置」という用語は、疾患または医学的状態の予防的および／または治療的処置に関する。
【００６０】
本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、活性成分単独で投与してもよく、または、例えば補助剤として併用して、または他の薬剤と組み合わせて投与してもよく、他の薬剤としては、例えば上記の疾患の治療または予防のための、例えば免疫抑制剤または免疫調整剤、または他の抗炎症剤が挙げられる。例えば、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫抑制性モノクローナル抗体と組み合わせて使用してもよく、例えば、白血球受容体に親和性を有するモノクローナル抗体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６または他のリガンド；他の免疫調整化合物、例えばＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組み換え結合分子、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合する、ＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えばＡＴＣＣ ６８６２９）またはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−Ｉ拮抗剤、ＩＣＡＭ−Ｉまたは−３拮抗剤、ＶＣＡＭ−４拮抗剤またはＶＬＡ−４拮抗剤と組み合わせて使用してもよい。加えて、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＤＭＡＲＤ、例えば金塩、スルファサァラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６；リンパ球再循環のモジュレーター、例えばＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０アナログ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３；免疫抑制性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１等；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたは免疫抑制性ホモログ、そのアナログまたは誘導体；または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチナム、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えばＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体構築物、例えばエタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症性サイトカイン阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、例えばアナキンラまたはＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ ８８５、ＩＬ−６阻害剤；プロテアーゼの阻害剤または活性化剤、例えばメタロプロテアーゼ、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−２３抗体、抗ＩＬ−２２抗体、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＣＤ２０抗体、アスピリン等のＮＳＡＩＤまたは抗感染症薬と組み合わせて使用してもよい。当然のことながら、この併用薬のリストは限定的ではなく、完全でもない。
【００６１】
以下の実施例において、例示により、本発明をさらに記載するが、いずれも添付の特許請求の範囲に概説した通りの本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本発明のＩＬ−１７結合ポリペプチドの具体例のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す：（ａ）Ｂ１＿２（配列番号３９）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（レーン１）、Ｅ４（配列番号５７）（レーン２）、２Ｃ１（配列番号１０７）（レーン３）、Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）（レーン４：非還元的条件、レーン５：還元的条件）、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１１８）（レーン６：非還元的条件、レーン７：還元的条件）；（ｂ）［（２Ｃ１）２−Ｆｃ］（配列番号１１９）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（レーン１：非還元的条件、レーン２：還元的条件）。（２Ｃ１）２−Ｆｃの分子量は、リファレンス分子量全帯域マーカー（示さず）より推定される。
【図２】図２は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す：（ａ）クローンＢ１＿２（配列番号３９）、（ｂ）Ｅ４（配列番号５７）、（ｃ）２Ｃ１（配列番号１０７）、（ｄ）Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）、（ｅ）ＳＥＣピーク精製Ｅ４−Ｆｃ、精製およびＰＢＳ中４℃で４０日間保存した後分析、（ｆ）２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１１８）、（ｇ）（２Ｃ１）２−Ｆｃ（配列番号１１９）。
【図３】図３は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）センサーグラムを図示する：（ａ）クローンＢ１＿２（配列番号３９）、（ｂ）Ｅ４（配列番号５７）、（ｃ）２Ｃ１（配列番号１０７）、（ｄ）Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）、（ｅ）２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１１８）、（ｆ）（２Ｃ１）２−Ｆｃ（配列番号１１９）。
【図４】図４は、ＩＬ−１７Ａ阻害細胞分析の結果を図示する：（ａ）ＮＨＤＦ細胞をＩＬ−１７Ａと共にインキュベーションした後の、ＩＬ−６の容量依存性誘導。（ｂ）Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７バインダーおよびＩＬ−１７Ａ受容体−Ｆｃキメラによる、ＮＨＤＦ細胞におけるＩＬ−１７Ａ誘導ＩＬ−６産生の容量依存性阻害。（ｃ）ｂ）と同様であるが、ＩＬ−１７Ａ結合親和性を有しない対照タンパク質として、Ｆｙｎ ＳＨ３ ｗｔタンパク質を使用した。（ｄ）ＸＴＴ分析：生存細胞は、テトラゾリウム塩ＸＴＴを着色産物に代謝することができる。我々の実験において、全ての細胞は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＡおよびＦｙｎ ＳＨ３バインダー、またはＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラと共に２４時間インキュベーションした後、生存していた。
【図５】図５は、Ｇ３と規定した本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（配列番号３４）の、精製１日後（ＰＢＳ中、４℃で保存）のサイズ排除クロマトグラフィーを図示する。クロマトグラフィーはスーパーデックス７５（ＧＥ ヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））カラムを使用して実施した。
【図６】図６は、４℃（ａ）または−２０℃（ｂ）で６ヶ月を超えて保存した、Ｇ３と規定した本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（配列番号３４）の、サイズ排除クロマトグラフィーを図示する。
【図７】図７は、マウスにおける、Ｅ４−Ｆｃと規定した本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（配列番号１１７）の薬物動態データを示す：（ａ）血清中のＥ４−Ｆｃ濃度を、静注後の時間に対してプロットする、（ｂ）（ａ）と同様であるが、反対数表示でプロットする。最後の４点を用いて終末相半減期を計算したところ、５０．６時間であった。
【図８】図８は、２Ｃ１と規定した本発明のポリペプチド（配列番号１０７）の、結合特異性の表を示す。吸光度の結果は、種々の標的タンパク質：ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ｍｌＬ−１７Ａ（マウスＩＬ−１７Ａ）、ＴＮＦα（ヒト腫瘍壊死因子α）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、オボアルブミン（鶏卵白）、ＩＬ−６（ヒトインターロイキン６）を使用して実施されるＥＬＩＳＡに関係する。
【図９】図９は、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）の特異性を示す。ＥＬＩＳＡにおいて、結合剤としての本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）と共に、種々のＩＬ−１７ファミリーメンバー、異なる種のＩＬ−１７Ａおよび他の無関係な抗原を使用した。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のみがヒトおよびカニクイザルＩＬ−１７Ａに結合する。他の抗原のいずれに対しても、結合を検出できなかった。図の右側（破線の右側）には、ヒトＩＬ−１７ＣのＥＬＩＳＡシグナルが見られるが、これはヒトＩＬ−１７Ａ対照を用いて、別の日に定量した。説明：ｈＩＬ−１７Ａ：ヒトインターロイキン１７Ａ、ｈＩＬ−１７Ｂ：ヒトインターロイキン１７Ｂ、ｈＩＬ−１７Ｄ： ヒトインターロイキン１７Ｄ、ｈＩＬ−１７Ｅ：ヒトインターロイキン１７Ｅ、ｈＩＬ−１７Ｆ： ヒトインターロイキン１７Ｆ、マウスＩＬ−１７Ａ：マウスインターロイキン１７Ａ、ラットＩＬ−１７Ａ：ラットインターロイキン１７Ａ、イヌＩＬ−１７Ａ：イヌインターロイキン１７Ａ、ｃｙｎｏ Ｉｌ−１７Ａ：カニクイザルインターロイキン１７Ａ、ＥＤＢ：フィブロネクチンの追加ドメインＢ、ｈＩＬ−６：ヒトインターロイキン ６、ｈＴＮＦα：ヒト腫瘍壊死因子α、オボアルブミン：鶏卵黄由来のアルブミン、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ｎｅｇ ｃｔｒｌ：コーティングに抗原を使用せず、ｈＩＬ−１７Ｃ：ヒトインターロイキン１７Ｃ。
【図１０】図１０は、封入体からリフォールディングされたカニクイザルＩＬ−１７Ａでコートしたチップ上での、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサーグラムを図示する。
【図１１】図１１は、Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：全帯域レインボーマーカー（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、レーン２：２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）、レーン３：全帯域レインボーマーカー（ＧＥヘルスケア）、レーン４：２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３３）、レーン５：２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３４）、レーン６：２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３５）、レーン７：２Ｃ１−ｍ５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３２）、レーン８：２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）。
【図１２】図１２は、ＰＢＳ中４℃で保管した標準対照２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（×）と比較した、ヒト血清中３７℃で５日間保管した後の、ＩＬ−１７Ａに結合する２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（■）のＥＬＩＳＡを示す。
【図１３】図１３は、マウスに単回静注した後の、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の種々の時点での血清濃度を示す。哺乳類細胞において産生された２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）融合タンパク質（配列番号１３１）を、マウス（ｎ＝５）に静脈注射（ｉｖ）した（動物当り４０μｇ）。ＰＫプロファイルの最後の４点を用いて、２Ｃ１−Ｆｃ融合タンパク質の終末相半減期を計算したところ、５３時間であった。
【図１４】図１４は、急性炎症モデルにおける、本発明の抗ＩＬ−１７ Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）による、ヒトＩＬ−１７Ａ誘導ＫＣ産生の阻害を示す。３μｇのヒトＩＬ−１７Ａ（ＩＬ−１７）、ＰＢＳ（ＰＢＳ）、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａと１７μｇの本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）（ＩＬ−１７＋２Ｃ１）、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａと１６μｇの野生型Ｆｙｎ ＳＨ３モノマー（ＩＬ−１７＋ｗｔ）、１７μｇの本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）単独（２Ｃ１）、または１６μｇの野生型Ｆｙｎ ＳＨ３単量体単独（ｗｔ）の皮下注射の２時間後に、血液サンプルを採取し、マウス血清中のＫＣレベルを定量した。各群４匹のマウスの平均ＫＣレベルを示すが（±ＳＤ）、例外として野生型対照群（ＩＬ−１７Ａを含まない、または含む、Ｆｙｎ ＳＨ３）では、３匹のマウスの平均レベルを示す（±ＳＤ）。
【図１５】図１５は、急性炎症モデルにおける、２Ｃ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１３０）による、ヒトＩＬ−１７Ａ誘導ＫＣ産生の阻害を図示する。２Ｃ１−Ｆｃ／Ｉｌ−１７：４４μｇの２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）を静注した後、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａの皮下注射した。ＩＬ−１７Ａ投与から２時間後、マウスから血液サンプルを採取し、ＫＣ血清レベルをＥＬＩＳＡで測定した。対照実験を以下の通り実施した：ＰＢＳ／ＩＬ−１７：ＰＢＳの静注の後、ＩＬ−１７の皮下注射；２Ｃ１−Ｆｃ／ＰＢＳ：２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）の静注の後、ＰＢＳの皮下注射；ＰＢＳ／ＰＢＳ：ＰＢＳの静注の後、ＰＢＳの皮下注射；各群３〜５匹のマウスの平均ＫＣレベルを示す（±ＳＤ）。
【実施例】
【００６３】
実施例１：モノクローナルファージＥＬＩＳＡで定量された通り、本発明のＦｙｎ ＳＨ−３由来ポリペプチドはＩＬ−１７Ａに結合する。
方法
配列番号１〜１１６で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）らにおけるＦＹＮ ＳＨ３ライブラリについて記載された通り（グラブロフスキら、（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）ファージミドベクターｐＨＥＮ１にクローニングした。ファージ産生は、標準的プロトコル（ヴィティ（Ｖｉｔｉ），Ｆら（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６，４８０−５０５頁）に従って実施した。ファージを含有するモノクローナル細菌上澄をＥＬＩＳＡに使用した：ビオチン化ＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）より購入、ビオチン化は、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用い、メーカーの使用説明書に従って実施した）を、ストレプトアビジンでコートしたウェル（ストレプタウェルズ（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌｓ）、ハイバインド（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））上に固定化し、ＰＢＳ、２％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ）、スイス）でブロッキングした後、２０μｌのＰＢＳ、１０％ミルクおよび８０μｌのファージ上澄を適用した。１時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したファージを抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で検出した。ペルオキシダーゼ活性の検出は、ＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ）を加えることによって行い、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。バインダーのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって検証した（ビッグダイ・ターミネーター（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ） ｖ３．１ サイクル・シークエンシング・キット、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０遺伝子分析器、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。
【００６４】
結果
Ｆｎｙ ＳＨ３−由来ＩＬ−１７Ａバインダーのアミノ酸配列は、配列表中に付記した通りの、配列番号１〜１１６で示される。
【００６５】
実施例２：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来のポリペプチドは、組み換えヒトＩＬ−１７Ａに高親和性で結合する。
この実施例は、種々の形態のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのクローニングおよび発現、および、これらのポリペプチドのサイズ排除クロマトグラフィーおよび表面プラスモン共鳴による特性評価を示す。
【００６６】
ａ）Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのクローニングおよび発現
選択したＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（クローンＢ１＿２：配列番号３９、クローンＥ４：配列番号５７およびクローン２Ｃ１：配列番号１０７）を、グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（グラブロフスキら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）に記載の通り、細胞質発現ベクターにクローニングし、発現および精製した。
【００６７】
ｂ）ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分に融合した、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのクローニングおよび発現
クローンＥ４および２Ｃ１（配列番号５７および１０７）をクローニングし、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分との融合タンパク質として発現させた（手順は、以下参照；配列番号１１７および１１８）。さらに、１０個のアミノ酸リンカーを有する２Ｃ１二量体［（２Ｃ１）２−Ｆｃ］をクローニングし、Ｆｃ融合タンパク質として発現させた（配列番号１１９）。
【００６８】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を、プライマーｆｍ５（５’ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣ ３’、配列番号１２１）およびｆｍ６（５’ＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ ３’、配列番号１２２）を用い、および、テンプレートとして市販のｐＦＵＳＥ−ｈｌｇＧ１−Ｆｃ２（インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））真核性ベクターを用いて
ＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、以前に同じ酵素で消化したｐＡＳＫ−ＩＢＡ２ベクター（ＩＢＡ−バイオタグノロジー（Ｂｉｏｔａｇｎｏｌｏｇｙ））と連結し、新たなベクターｐＡＦを得た。
【００６９】
クローンＥ４および２Ｃ１（配列番号５７および１０７）の遺伝子情報を、ｆｍ７（５’ＡＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＴＧ ３’、配列番号１２３）およびｆｍ８（５’ＣＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣ ３’、配列番号１２４）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｆｃに融合した２Ｃ１二量体の調製には、２Ｃ１ ＤＮＡテンプレートを２つの独立したＰＣＲに使用した。第一の反応では、プライマー４７ｂ．ｆｏ（５’ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１２５）および５２．ｂａ（５’ＧＡＣ ＴＡＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＡＴ ３’、配列番号１２６）を使用し、第二のＰＣＲでは、プライマー４８ｂ．ｂａ（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＴＡＴ ３’、配列番号１２７）および５１．ｆｏ（５’ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＴ ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１２８）を使用した。
【００７０】
２つのＤＮＡ断片をＰＣＲによって組み立て、２つのドメインの間に１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１２０）を有する２Ｃ１ホモ二量体を得た。得られたＤＮＡ断片を、プライマーｆｍ７およびｆｍ８を用いた２Ｃ１単量体について記載した通りに、さらに増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏｌ／ＢａｍＨＩで消化し、二重消化したペリプラズム発現ベクターｐＡＦにクローニングした。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１中に電気穿孔し、０．２μｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンでタンパク質発現を誘導した。細菌培養物を、ロータリーシェーカー中、２５℃で一晩成長させ、フィノマー−Ｆｃ融合タンパク質を、単一プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程のペリプラズム分画から精製した。２０μｌのタンパク質溶液を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））分析を実施した。
【００７１】
ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣシステムで、スーパーデックス７５カラム（１０／３００）またはスーパーデックス７５ショートカラム（５／１５０）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて実施した。
【００７２】
ｄ）親和性測定
親和性測定は、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）３０００装置（バイアコア）を用いて実施した。ビオチン化ＩＬ−１７Ａと単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドとの間の相互作用分析、およびビオチン化ＩＬ−１７ＡおよびＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）との間の相互作用分析には、ストレプトアビジンＳＡチップ（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））を、それぞれ固定化した１３００および５１０ ＲＵビオチン化ＩＬ−１７Ａと共に使用した。ランニングバッファーは、ＰＢＳ、０．１％ＮａＮ３および界面活性剤Ｐ２０（バイアコア）であった。相互作用は、流速２０ｍｌ／分で、種々の濃度のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを注入して測定した。ＩＬ−１７Ａと２Ｃ１−Ｆｃ融合体との間、およびＩＬ−１７Ａと（２Ｃ１）２−Ｆｃ融合体との間の相互作用分析のため、ＣＭ５チップ（バイアコア）を、２９００ ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））でコートした。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（バイアコア）であった。相互作用は、約２５０〜２７５ ＲＵのＦｃ融合タンパク質を流速１０μｌ／分で注入し、その後、種々の濃度のＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を流速３０μｌ／分で注入することによって測定した。相互作用の速度論的データ（個別のｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は全て、ＢＩＡエバリュエーション３．２ＲＣ１ソフトウェアを用いて評価した。
【００７３】
ｅ）結果
本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの発現収率は、振とうフラスコ中、非最適化条件下で、細菌培養物１リットル中６０〜８５ｍｇであった。Ｆｃ融合タンパク質は、収率０．２〜０．４ｍｇ／ｌ（表Ｉ）で発現した。Ｆｃ融合タンパク質の配列は、付記の通りの配列番号１１７〜１１９に列記する。
【００７４】
【表１】
【００７５】
図１は、表示された精製タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。
【００７６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルにより、全ての構築物が主として単一の単量体ピークとして溶出したことが実証された（図２参照）。Ｆｙｎ ＳＨ３由来結合タンパク質についてのこれまでの研究で既に観察された通り（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）、主要なピークは、約８ｋＤａのタンパク質について予想されるものより遅く溶出した。本発明のＦｃ融合タンパク質については、サイズ排除クロマトグラフィーによる第二の精製工程を、単回工程のタンパク質Ａ−セファロース精製の後に実施して、図２ｅ中、融合タンパク質Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）に示される通りの単量体タンパク質を得た。Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）はＰＢＳ中４℃で保存した場合、少なくとも４０日間は安定であった。
【００７７】
結合特性は、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）チップ上でのリアルタイム相互作用分析によって分析し（図３）、選択されたＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質について、以下の解離定数（ＫＤ）が明らかになった：
【００７８】
【表２】
【００７９】
実施例３：ＩＬ−１７Ａ阻害細胞分析
ＩＬ−１７Ａは、線維芽細胞においてＩＬ−６の産生を投与量依存的に誘導する（ヤオ（Ｙａｏ）ら（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３，８１１−８２１頁）。表示したＦｙｎ ＳＨ３−誘導ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の阻害活性は、ヒト皮膚線維芽細胞を、種々の濃度のＦｙｎ ＳＨ３変異体またはヒトＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラの非存在または存在下、組み換えＩＬ−１７Ａで刺激することによって試験した。刺激の２４時間後に、細胞培養上澄を採取し、ＥＬＩＳＡでＩＬ−６について分析した。加えて、細胞が、ＩＬ−１７Ａ単独、またはＩＬ−１７Ａおよび本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来阻害ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド、またはＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラと共に２４時間インキュベーションした後に、生存していたことを実証するために、ＸＴＴ試薬を用いて比色試験を実施した。生存し、代謝的に活性な細胞のみが、テトラゾリウム塩ＸＴＴを、橙色化合物であるホルマザンに還元する能力がある（スクディエロ（Ｓｃｕｄｉｅｒｏ）ら（１９８８年），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，４８２７−４８３３頁）。
【００８０】
方法
エンドトキシンを除去するため、表示したタンパク質溶液を、アクロディスク・ムスタング（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｍｕｓｔａｎｇ）Ｅメンブレン（ＶＷＲ）で３回濾過した。濾過の後、本発明の阻害性Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを含有するタンパク質溶液のエンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）試験（パイロジェント（ＰＹＲＯＧＥＮＴ）単一検査ゲル凝集ＬＡＬ分析（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）））によって定量したところ、０．１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００８１】
約１ｘ１０４個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ），ＮＨＤＦ−ｃ， Ｃ１２３００）を含有する４００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに分配し（２４穴プレート、ＮｕｎｃまたはＴＰＰ）、３７℃で２４時間培養した（培地：線維芽細胞成長培地Ｃ−２３０１０、プロモセル）。上澄を吸引し、種々の濃度の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドまたはＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラ（ＲｎＤシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ＩＬ−１７Ａ（ＲｎＤシステムズ）含有培地（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）と混合した後、３５０μｌの対応する溶液を各ウェルに添加した（阻害剤溶液とＩＬ−１７Ａ含有培地の混合比は１：３であった）。陽性対照として、ＰＢＳをＩＬ−１７Ａ含有培地（「阻害剤なし」）と１：３の割合で混合し、陰性対照として、ＰＢＳを培地のみ（「ＩＬ−１７Ａなし」）と１：３の割合で混合した。ＩＬ−１７Ａ依存性ＩＬ−６産生を定量するため、ＩＬ−１７Ａ含有培地を使用し（ＩＬ−１７Ａの最終濃度：１０、２５および５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＢＳと３：１の比で混合した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、上澄を吸引し、ＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡによりメーカーの使用説明書に従って定量した（ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））。上澄の吸引の直後に、ＸＴＴ含有培地を添加し（細胞増殖（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）キットＩＩ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、メーカーの使用説明書に従って、細胞生存性を定量した。
【００８２】
ＩＬ−１７Ａ阻害率は、以下の式を用いて定量した：
【００８３】
【化１】
【００８４】
結果
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をＩＬ−１７Ａと種々の濃度でインキュベーションした。図４（ａ）は、ＩＬ−６のＩＬ−１７Ａ用量依存性誘導を示す。次の工程において、ＮＨＤＦ細胞を、ＩＬ−１７Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）および種々の濃度の表示した本発明のＦｙｎ ＳＨ３誘導ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドまたはＩＬ−１７Ａ受容体−Ｆｃキメラと共にインキュベーションした（図４（ｂ））。クローン２Ｃ１（配列番号１０７）およびＥ４（配列番号５７）の両者がＩＬ−１７Ａ誘導ＩＬ−６産生を阻害し、ＩＣ５０値はそれぞれ約１ｎＭおよび６ｎＭであったことが観察された。ＩＬ−１７Ａ受容体−Ｆｃキメラは、ＩＣ５０値が５００ｐＭであることが報告されている（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））。この実験では、約１ｎＭの値が得られた。この分析は、３つの独立した実験の代表的な結果を表す。ＩＬ−６産生の阻害が特異的なＩＬ−１７Ａ中和の結果であることをさらに実証するために、細胞を、ＩＬ−１７Ａの存在下で結合特異性に無関係のタンパク質としてＦｙｎ ＳＨ３ｗｔドメイン（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁）と共にインキュベーションした（図４（ｃ））。予想した通り、ＩＬ−６産生の阻害は観察されず、一方、クローン２Ｃ１（配列番号１０７）はＩＬ−１７Ａ−誘導ＩＬ−６産生を阻害する能力があった。図４（ｄ）にＸＴＴ分析を示すが、これは、全ての細胞が、本発明のＦｙｎ ＳＨ３−由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（濃度７５０ｎＭ）およびＩＬ−１７受容体（１０ｎＭ）と共に２４時間インキュベーションした後、生存能力があったことを確認する。
【００８５】
実施例４：安定性
治療的適応を目的とする全ての生体化合物の極めて重要な様相は、溶液中に保管した場合の、その安定性および凝集耐性である。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、単純なリン酸緩衝生理食塩水中、４℃または−２０℃で少なくとも６ヶ月間保管した際に安定であることが判っていることから、特に有用な薬剤および診断薬候補である。
【００８６】
方法
本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのタンパク質溶液を、精製後、４℃または−２０℃で６ヶ月間保管した。タンパク質の安定性および凝集状態を分析するため、タンパク質溶液を濾過し（ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＰ、０．２２μｍ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣシステムでスーパーデックス７５ショートカラム（５／１５０）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて実施した。
【００８７】
結果
Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドＧ３（配列番号３４）が発現収率１２３ｍｇ／Ｌで産生され、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから主に単一のピークとして溶出された（図５参照）。
【００８８】
Ｇ３（配列番号３４）の安定性および凝集抵抗を、タンパク質をＰＢＳ中、４℃または−２０℃で保管して評価した。６ヵ月後、タンパク質の状態を、サイズ排除クロマトグラフィーによって調べた。測定により、凝集または分解の兆候は全く見られなかった。６ヶ月間の貯蔵後の溶出プロファイルを図６に示す。
【００８９】
実施例５：インビボ半減期
本発明の融合タンパク質Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）のインビボ半減期を、ＥＬＩＳＡにより、単回静注後の種々の時点でマウス血清中のＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）濃度を測定することによって定量した。
【００９０】
方法
Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）のクローニングおよび発現を実施例２に記載する。Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の３．３μＭ（０．２２ｍｇ／ｍｌ）溶液２００μｌを５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））に静注射した。７分後、２０分後、１、２、４、８、２４および４８時間後に、約２０μｌの血液を伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡを実施するまで、血清を−２０℃で保管した。濃度が分っているＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の希釈系列を用いて、血清中のＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）濃度をＥＬＩＳＡによって定量した：５０μｌのビオチン化ＩＬ−１７Ａ（３０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、メーカーの使用説明書に従って、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化）を、ストレプトアビミンでコートしたウェル（リアクチバインド（Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄ）、ピアス）に添加し、ＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ）、スイス）でブロッキングした後、４５μｌのＰＢＳ、４％ミルクおよび５μｌの血清サンプルを添加した。１時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したＦｃ融合タンパク質をプロテインＡ−ＨＲＰ複合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で検出した。ペルオキシダーゼ活性は、クアンタレッドを強化した化学蛍光ＨＲＰ基質（ピアス）を添加することによって検出した。蛍光強度は、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で５〜１０分後に測定した。種々の時点で血清中（各時点ｎ≧３、最終時点：ｎ＝１を除く）定量したＥ４−Ｆｃ（配列番号１１７）濃度および得られた排出相の傾きｋ（片対数目盛りにプロット）から、Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の半減期を、式ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを用いて計算した。
【００９１】
結果
排出相（β相、最後の４回の測定時点）から計算した、本発明の融合タンパク質Ｅ４−Ｆｃ（配列番号１１７）の半減期は、５０．６時間であった（図７参照）。
【００９２】
実施例６：ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の結合特異性を定量するためのＥＬＩＳＡ
方法
標的タンパク質である、ヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））、マウスＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ヒトＴＮＦα（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、ヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ウシ血清アルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびオボアルブミン（シグマ）を、マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））に一晩コートした（濃度５μｇ／ｍｌの各標的を１００μｌ）。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ））でブロッキングし、ＰＢＳでの洗浄工程（上記の通り）の後、５０μｌの２Ｃ１（配列番号１０７）を最終濃度５０ｎＭで、５０μｌの抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、自家製造、ＯＤ＝２の貯蔵溶液をＰＢＳ、２％ミルクで１：２５０に希釈）と共にウェルに添加した。インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ミルクで１：１０００に希釈した、１００μｌの抗マウスＨＲＰ免疫抱合体（シグマ）をウェルに添加した。９６穴プレートを室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。１００μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ）を加えて比色検出を行い、６０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【００９３】
結果
クローン２Ｃ１（配列番号１０７）は高特異性でヒトＩＬ−１７Ａに結合し、ＥＬＩＳＡで示した通り、他の被験タンパク質のいずれとも交差反応しなかった（図８）。ＩＬ−１７Ｆについてバックグラウンド上に小さなシグナルが観察されたが、２Ｃ１がＩＬ−１７Ｆをコートしたバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）チップにプローブ結合した場合、検出可能な結合は測定されなかった（データは示さず）。
【００９４】
実施例７：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、ヒトおよびカニクリザルＩＬ−１７Ａに特異的および高親和性で結合する
方法
ａ）特異性
本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの結合特異性を定量するため、以下の標的タンパク質を使用した（実施例６より多い標的タンパク質）。
- ヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））
- ヒトＩＬ−１７Ｂ（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））
- ヒトＩＬ−１７Ｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- ヒトＩＬ−１７Ｄ（ペプロテック）
- ヒトＩＬ−１７Ｅ（ペプロテック）
- ヒトＩＬ−１７Ｆ（アブド・セロテック（Ａｂｄ Ｓｅｒｏｔｅｃ））
- マウスＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- ラットＩＬ−１７Ａ（アクロン・バイオテック（Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ））
- イヌＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＩＬ−１７Ａ（Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて自家製造、単一ペプチドなし、Ｃ−末端グリシン残基の後、ヘキサヒスチジンタグを用いる、抱合体からリフォールディング、配列番号１２９）
- フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（自家製造、Ｅ．ｃｏｌｉ；カルネモッラ（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ）ら（１９９６年）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６８（３），３９７−４０５頁参照）
- ヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ）
- ヒトＴＮＦα（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））
- オボアルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
- ＢＳＡ（シグマ）
【００９５】
標的タンパク質を、マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上に一晩コートした（濃度１０μｇ／ｍｌの各標的１００μｌ）。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ））で室温で１時間ブロッキングし、その後ＰＢＳでの洗浄工程（上記の通り）の後、５０μｌの本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を最終濃度８０ｎＭで、５０μｌの抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（自家製造、ＯＤ＝２の貯蔵溶液をＰＢＳ、２％ミルクで１：２５０に希釈）と共にセルに添加した。インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ミルクで１：１０００に希釈した、１００μｌの抗マウスＨＲＰ免疫抱合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をウェルに添加した。９６穴プレートを室温で１時間インキュベーションした後、０．１％ＴｗｅｅｎのＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。１００μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を加えることによって比色検出を行い、６０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【００９６】
ｂ）カニクイザルＩＬ−１７Ａに対する親和性の測定
親和性測定は、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）３０００装置（バイアコア）を用いて実施した。カニクイザルＩＬ−１７Ａと本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）との間の相互作用分析のため、ＣＭ５チップ（バイアコア）を６９００ ＲＵのカニクイザルＩＬ−１７Ａでコートした。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ（バイアコア）であった。相互作用は、流速２０μｌ／分で種々の濃度の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を注入することによって測定した。相互作用の速度論的データ（個別のｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は全て、ＢＩＡエバリュエーション３．２ＲＣ１ソフトウェアを用いて評価した。
【００９７】
結果
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１７Ａに高特異性で結合し、ＥＬＩＳＡで示した通り、他の被験タンパク質のいずれとも交差反応しなかった（図９）。
【００９８】
本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のカニクイザルＩＬ−１７Ａに対する親和性をＥ．ｃｏｌｉ（抱合体からリフォールディング）で産生されたカニクイザルＩＬ−１７Ａを用いて、バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）で測定した。２Ｃ１は、ＫＤ １１ ｎＭでカニクイザルＩＬ−１７Ａに結合したことが分った（図１０）。
【００９９】
実施例８：哺乳類細胞における、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分および修飾Ｆｃ部分に融合した本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドの発現
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を、ＩｇＧ１のＦｃ部分（２Ｃ１−Ｆｃ、配列番号１３０）に遺伝子的に融合させ、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞で発現させた。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）は、変異体Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位のロイシンに代わりアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１の修飾Ｆｃ部分への遺伝的融合としてもクローニングし、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞で発現した（２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）、配列番号１３１）。さらに、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドとＦｃ部分との間のリンカーの長さが異なる、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）融合タンパク質の以下の４つの変異体を産生した：
【０１００】
・（配列番号１３２）“２Ｃ１−ｍ５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；５個のアミノ酸によるヒンジ領域の伸長：ＥＰＫＳＳリンカー
・（配列番号１３３）“２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；５個のアミノ酸の伸長：ＧＧＧＧＳリンカー
・（配列番号１３４）“２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；１０個のアミノ酸の伸長：（ＧＧＧＧＳ）２リンカー
・（配列番号１３５）“２Ｃ１−ｍ１５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”；１５個のアミノ酸の伸長：（ＧＧＧＧＳ）３リンカー
【０１０１】
方法
“２Ｃ１−Ｆｃ”のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分に融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）、（配列番号１３０）：クローン２Ｃ１（配列番号１０７）をコードする遺伝子をテンプレートとして用い、プライマーＳＢ３（５’ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＣＣ ３’、配列番号１３６）およびＳＢ４（５’ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ３’、配列番号１３７）を用いて増幅して、制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩを導入した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩで消化し、先に二重消化したｐＦＵＳＥ−ｈｌｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））中にクローニングした。このＦｃ融合体をｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローニングするため、２Ｃ１−Ｆｃ融合体をコードする遺伝子を含有する、得られたｐＦＵＳＥベクターをテンプレートとして用い、プライマーＳＢ５（５’ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＣ ３’、配列番号１３８）およびＳＢ６（５’ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡＧ ３’、配列番号１３９）を用いて増幅して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化した後、挿入物を、先に二重消化したｐＣＥＰ４ベクターに連結して、配列番号１３０の遺伝情報を含有するプラスミドを得た。
【０１０２】
“２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）、（配列番号１３１を得る）：
２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを２つのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５およびＳＢ７（５’ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＣＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ３’、配列番号１４０）を使用した。第二のＰＣＲでは、プライマーＳＢ８（５’ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＣ ３’、配列番号１４１）およびＳＢ６を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０３】
“２Ｃ１−ｍ５Ｅ−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３２）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に５個のアミノ酸のリンカーＥＰＫＳＳで融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および“Ｂａ＿２Ｃ１＿Ｒ＿ＥＰＫＳＳ”（５’ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＧＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４２）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿ＥＰＫＳＳ”（５’ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４３）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０４】
“２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３３）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に５個のアミノ酸のリンカーＧＧＧＧＳで融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および４７ｃ．ｆｏ（５’ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４４）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿５ａａＧＳ−リンカー”（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４５）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０５】
“２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３４）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）２で融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および４７ｂ．ｆｏ（５’ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４６）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿１０ａａＧＳ−リンカー”（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４７）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０６】
“２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）”（配列番号１３５）のクローニング：ヒトＩｇＧ１抗体の修飾Ｆｃ部分（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）に１５個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）３で融合した、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、２回のＰＣＲにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーＳＢ５および４７．ｆｏ．ｃｏｒｒ（５’ＴＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＡＣ ３’、配列番号１４８）を使用した。第二の反応では、プライマーＳＢ６および“Ｂａ＿Ｈｉｎｇｅ＿Ｆ＿１５ａａＧＳ−リンカー”（５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ３’、配列番号１４９）を使用した。テンプレートとして両断片を有するＰＣＲアセンブリを実施し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上述の通り、消化したｐＣＥＰ４ベクターと連結した。
【０１０７】
この融合タンパク質の発現には、対応するプラスミドを、エンドトキシンを含まないメガプレップ（Ｍｅｇａｐｒｅｐ）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製し、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−１０８５２）の一過性のトランスフェクションに使用した。ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞は、トランスフェクションの２４時間前に３０％のコンフルエンスで播種した。培地は、トランスフェクションの直前に、ＤＭＥＭ／５％ ＦＣＳ／ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で置換した。６０μｇのＤＮＡを使用して、１５０ｃｍ２の接着細胞をトランスフェクションした。ＤＮＡおよびＰＥＩ（２５ｋＤａ、ポリサイエンシーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を１：３の割合で混合し、１０秒間ボルテックスした。その後、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を室温で１０分間インキュベーションした後、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞に加えた。２４時間後、培地をＣＤ−ＣＨＯ／ＨＴ／Ｌ−グルタミン／ペンストレップ（インビトロジェン）で置換し、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベーションした。９６時間後に細胞培養物上澄を採取した。
【０１０８】
タンパク質精製のため、細胞培養物上澄を、プロテインＡ−セファロースアフィニティーカラムに適用した。その後、カラムをＰＢＳで洗浄し、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシンを用いてタンパク質を溶出した。その後溶出されたタンパク質をＰＢＳ中に透析した。要すれば、エンドトキシンの除去のため、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１１４を用いた第二の精製工程を実施した（マガリャイス（Ｍａｇａｌｈaｅｓ）ら（２００７年）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ，１０（３），３８８−４０４頁）。
【０１０９】
結果
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来Ｆｃ融合体を発現および精製することができた。図１１は、Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。
【０１１０】
実施例９：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、ヒト血清中で安定である
タンパク質薬は、患者に薬力学的効果を与え得るため、一定期間、血清中で安定であるべきである。この実施例では、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）の血清安定性を試験する。
【０１１１】
方法
１０μｇ／ｍｌの２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）を含有するヒト血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の３ｍｌの溶液を調製し、３７℃のインキュベーター中に置いた。指示した時点で２００μｌのサンプルを除き、実験の終了まで−２０℃に凍結させた。５日後、回収したサンプルでＥＬＩＳＡを実施したが、対照標準としてＰＢＳ中４℃で保管した２Ｃ１−Ｆｃサンプル（配列番号１３０）を使用した。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡを実施するため、ＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））をマキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上に一晩コートした（５μｇ／ｍｌを１００μｌ）。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ））でブロッキングし、ＰＢＳでの洗浄工程（上記の通り）の後、ＰＢＳ、２％ミルクで希釈した２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（指示した濃度で）を含む、１００μｌの試験サンプルを加えた。インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ミルクで１：１０００に希釈した、１００μｌのプロテインＡ−ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加した。９６穴プレートを室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。１００μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を加えて比色検出を行い、６０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【０１１３】
結果
ヒト血清中、３７℃で５日間の保管期間の後、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）は、ＰＢＳ中４℃で保管した２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）と同様に、実質的にその標的であるＩＬ−１７Ａに結合することができたが、このことは、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）がヒト血清中３７℃で安定であることを示唆する（図１２）。
【０１１４】
実施例１０：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドはインビトロでＩＬ−１７Ａを阻害する
この分析では、本発明の指示したＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドについて、インビトロでＩＬ−１７Ａを阻害する能力を試験した。細胞分析は、本発明の実施例３に記載した細胞分析と同様であり、主な違いは、ＩＬ−１７Ａを１ｎｇ／ｍｌの低濃度（実施例３の５０ｎｇ／ｍｌと比較して）でＴＮＦαと共に用いることである。
【０１１５】
方法
試験した本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドのエンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）試験（パイロジェント（ＰＹＲＯＧＥＮＴ）単一検査ゲル凝集ＬＡＬ（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）））によって測定したところ、０．１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【０１１６】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ，プロモセル社（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｉｎｃ．），ＮＨＤＦ−ｃ，Ｃ１２３００）をＩＬ−１７Ａ阻害細胞分析に使用する。ヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））と組み合わせて細胞培養培地に添加すると、用量依存性のＮＨＤＦ細胞によるＩＬ−６産生を引き起こす。細胞培養培地（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ），Ｃ−２３０１０）中に放出されるＩＬ−６を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、デュオセット（ＤｕｏＳｅｔ）ＥＬＩＳＡシステムキット（ＤＹ２０６））を用いたＥＬＩＳＡによって、細胞培養物上澄中で定量する。
【０１１７】
１０４個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ），ＮＨＤＦ−ｃ，Ｃ１２３００）を各ウェルに分配し（２４穴プレート、ヌンク（Ｎｕｎｃ）またはＴＰＰ）、３７℃で２４時間培養した（培地：線維芽細胞成長培地Ｃ−２３０１０、プロモセル）。上澄を吸引し、種々の濃度の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドまたはＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラ（ＲｎＤシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、ＩＬ−１７Ａ（ＲｎＤシステムズ）およびＴＮＦα（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））含有培地（最終ＩＬ−１７Ａ濃度１ｎｇ／ｍｌおよび最終ＴＮＦα濃度５０ｐｇ／ｍｌ）と混合した後、三重に、３５０μｌの対応する溶液を各ウェルに添加した（阻害剤溶液とサイトカイン含有培地の混合比は１：２３であった）。対照のウェルとしては、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを用いない（ＰＢＳのみ）インキュベーション、ＩＬ−１７Ａのみ、ＴＮＦαのみ、および培地のみのインキュベーションを用いた。３７℃で２４時間インキュベーションした後、上澄を吸引し、ＥＬＩＳＡ吸光度（ＩＬ−６濃度に相関）を、メーカーの使用説明書に従って定量した（ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））。
【０１１８】
結果
ＮＨＤＦ細胞を、一定の濃度のＩＬ−１７Ａ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦα（５０ｐｇ／ｍｌ）、並びに種々の濃度の市販のＩＬ−１７Ａ受容体Ｆｃキメラまたは種々の濃度の以下の本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドと共にインキュベーションした：
- ２Ｃ１（配列番号１０７）
- ２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）
- ２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）
- ２Ｃ１−ｍ５Ｅ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３２）
- ２Ｃ１−ｍ５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３３）
- ２Ｃ１−ｍ１０−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３４）
- ２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３５）
【０１１９】
表ＩＩＩは、本発明の指示したＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドを用いて実施した、いくつかの細胞分析より得られたＩＣ５０値の平均を示す。最良のＩＣ５０値（０．１１ｎＭ）は、２Ｃ１−ｍ１５−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３５）を用いて得られた。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
実施例１１：２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）のインビボ半減期
本発明の融合タンパク質２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）のインビボの半減期を、単回静注後の種々の時点でマウス血清中の２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の濃度を測定することにより定量した。
【０１２２】
方法
２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））に、各マウス２００μｌを静注した。指示した時点で、約２０μｌの血液を伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで、血清を−２０℃で保管した。濃度が分っている２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）希釈系列を用いて、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の血清中の濃度をＥＬＩＳＡによって定量した：５０μｌのビオチン化ＩＬ−１７Ａ（３０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、メーカーの使用説明書に従って、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化）を、ストレプトアビミンでコートしたウェル（リアクチバインド（Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄ）、ピアス）に添加し、ＰＢＳ、４％ミルク（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス（Ｍｉｇｒｏｓ）、スイス）でブロッキングした後、４５μｌのＰＢＳ、４％ミルクおよび５μｌの血清サンプルを添加した。１時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したＦｃ融合タンパク質をプロテインＡ−ＨＲＰ複合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で検出した。ペルオキシダーゼ活性は、クアンタレッド（ＱｕａｎｔａＲｅｄ）を強化した化学蛍光ＨＲＰ基質（ピアス）を添加することによって検出した。蛍光強度は、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で５〜１０分後に測定した。種々の時点で血清中（各時点でマウス数ｎ＝５）定量した２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の濃度および得られた排出相の傾きｋ（片対数目盛りにプロット）から、２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の半減期を、式ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを用いて計算した。
【０１２３】
結果
排出相（β相、最後から４回目の時点）から計算された、本発明の融合タンパク質２Ｃ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）（配列番号１３１）の半減期は、５３時間であった（図１３参照）。
【０１２４】
実施例１２ 本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、インビボでヒトＩＬ−１７Ａを中和する
ヒトＩＬ−１７Ａは、マウスＩＬ−１７受容体に結合および刺激することができ、マウスＫＣ（ＣＸＣＬ１）ケモカインの上昇およびその後の分泌を導く（アラン（Ａｌｌａｎ）Ｂ．ら（２００７年）ＷＯ２００７／０７０７５０，米国イーライ・リリー（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ））。ＫＣ基礎レベルがおよそ１００ｐｇ／ｍｌであることと比較して、皮下ＩＬ−１７Ａ注射（３μｇ）の２時間後に観察されたＫＣレベルは、血清中、５００および１０００ｐｇ／ｍｌの間であった。
【０１２５】
方法
ａ）本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）を用いる、インビボでのＩＬ−１７Ａの中和
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）（１７μｇ）を、３μｇのヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））とＣ５７ＢＬ／６マウスに混注（皮下）し、注射の２時間後に、血液サンプルを、伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで、血清を−２０℃で保管した。血清中のＫＣレベルは、市販のクアンティカイン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）マウスＣＬＣＬ１／ＫＣキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて定量した。対照群は、結合特異性に関与しないタンパク質としてＩＬ−１７ＡおよびＦｙｎ ＳＨ３ｗｔドメインを注射したマウス（グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７年）ＪＢＣ，２８２，３１９６−３２０４頁参照）、ＰＢＳのみ、ＩＬ−１７Ａのみ、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）のみを注射したマウス、またはＦｙｎ ＳＨ３ｗｔタンパク質のみを投与したマウスであった。
【０１２６】
ｂ）２Ｃ１−Ｆｃ融合体（配列番号１３０）を用いたインビボの中和：
本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）（４４μｇ／マウス）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静注した。２０〜６０分後、ヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））を３μｇ／マウス皮下注射し、ＩＬ−１７Ａ注射の２時間後に、血液サンプルを、伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）ＣＢ３００（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））で採取した。血液サンプルを９５００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで、血清を−２０℃で保管した。血清中のＫＣレベルは、市販のクアンティカイン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）マウスＣＬＣＬ１／ＫＣキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて定量した。対照群は、ＰＢＳ（静注）およびＩＬ−１７Ａ（皮下注）、ＰＢＳのみ（静注および皮下注）、および、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）静注の後ＰＢＳ（皮下注）したマウスであった。
【０１２７】
結果
ヒトＩＬ−１７Ａをマウスに皮下注射した後、動物はＫＣと呼ばれるケモカインを過剰発現する。マウスの血清中、ＫＣレベルの上昇はＥＬＩＳＡによって測定し得る。本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドの注射により、ＫＣのアップレギュレーションが阻止された。
【０１２８】
ａ）
ＩＬ−１７Ａおよび本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に混注した。本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１（配列番号１０７）の阻害特性のため、ＫＣレベルはこの群において上昇せず、低いままであって、ほぼ基礎レベルと同等であった。ＫＣ産生の阻害が特異的ＩＬ−１７Ａ中和によることを実証するため、マウスにＩＬ−１７Ａと野生型Ｆｙｎ ＳＨ３ドメイン（ＩＬ−１７Ａに対する結合活性を有しない）を混注したが；これらのマウスでは、ＫＣレベルはＩＬ−１７Ａのみを投与した群と同程度の高さであった。図１４は、この実験で得られた結果を示す。
【０１２９】
ｂ）
この第二の急性炎症実験において、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）を静注し、その後、ＩＬ−１７Ａを皮下注射した。上記ａ）の通り、本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、血清中のＫＣレベルのアップレギュレーションを阻止した。図１５は、２Ｃ１−Ｆｃ（配列番号１３０）によるインビボでのＩＬ−１７Ａの阻害を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記のポリペプチドがＩＬ−１７Ａに結合する、ポリペプチド：
（ｉ）（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）ａ−Ｄ−（Ｘ）ｂ−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）ｃ−Ｉ−（Ｘ）ｄ−Ｇ−（Ｘ）ｅ−ＷＷ−（Ｘ）ｆ−Ａ−（Ｘ）ｇ−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）ｈＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ （Ｉ）
式中、ａ〜ｈは０〜２０であり、
好ましくは、ａは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは６であり；
好ましくは、ｂは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｃは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｄは１〜１０であり、より好ましくは３〜９であり、最も好ましくは５または７であり；
好ましくは、ｅは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｆは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｇは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｈは０〜６であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１または２である；
（ｉｉ）（ｉ）に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）をコードする核酸の相補鎖に、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸によってコードされる、アミノ酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片または機能性誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ヒトＩＬ−１７Ａに対する特異的な結合親和性を有し、好ましくはＫＤが１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−１２Ｍ未満のヒトＩＬ−１７Ａに対する特異的な結合親和性を有する、ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜１１９よりなる群またはその機能性誘導体から選択される、請求項１または２のポリペプチド。
【請求項４】
薬学的および／または診断学的有効成分に融合した請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項５】
前記の成分がサイトカインであり、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦβ、ＬＴ−β、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βよりなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記の成分が毒性化合物であり、好ましくは低分子有機化合物またはポリペプチドであり、より好ましくは、カリケアマイシン、マイタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラマイシン、ジネマイシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシンＡ鎖、モデクシン、切断性緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素および組換えゲロニンよりなる群から選択される毒性化合物である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記の成分がケモカインであり、好ましくは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＮ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルカインよりなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記の成分が蛍光色素であり、好ましくはアレクサフルオルまたはＣｙ色素から選択される成分である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記の成分が光増感剤であり、好ましくは光毒性赤色蛍光タンパク質キラーレッドまたはヘマトポルフィリンである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記の成分が凝血促進因子であり、好ましくは組織因子である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記の成分がプロドラッグ活性化酵素であり、好ましくは、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼよりなる群から選択される酵素である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記の成分が、γ放射性アイソトープの群からの放射性核種、好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎであるか、または、ポジトロン放射体の群からの放射性核種、好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉであるか、または、β放射体の群からの放射性核種、好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕであるか、または、α放射体の群からの放射性核種、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記の成分が機能性Ｆｃドメインであり、好ましくはヒト機能性Ｆｃドメインであり、より好ましくは、請求項１〜３のいずれかの多量体ポリペプチド、好ましくは二量体ポリペプチドを含むヒト機能性Ｆｃドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
さらに、血中半減期を調節する成分、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、免疫グロブリンおよびアルブミン結合ペプチドよりなる群から選択される成分を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号１〜１１９からよりなる群から選択されるポリペプチドまたはその機能性誘導体を含む、融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドの多量体、好ましくは二量体または三量体を含む、請求項１〜３のいずれかのポリペプチドまたは請求項４〜１６のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１８】
下記を含む、単離され、精製された核酸：
（ｉ）請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは
（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）６−Ｄ−（Ｘ）−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）１−Ｉ−（Ｘ）５−７−Ｇ−（Ｘ）１−ＷＷ−（Ｘ）−Ａ−（Ｘ）−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）１−２−ＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ
をコードする核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性をもつ配列を有する核酸；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸；
（ｉｖ）核酸であって、前記の核酸が、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸のうちの１つの置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、核酸；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸のいずれか１つの断片であって、請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする（ｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする、断片。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、請求項１８の核酸。
【請求項２０】
前記の核酸がＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡである、請求項１８または１９の核酸。
【請求項２１】
前記の核酸がプロモータに、好ましくは、Ｔ５プロモータ／ｌａｃオペレータエレメント、Ｔ７プロモータ／ｌａｃオペレータエレメントよりなる原核生物プロモータの群、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ ｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモータよりなる真核生物プロモータの群から選択されるプロモータに、動作可能に連結されている、請求項１８〜２０のいずれか一項の核酸。
【請求項２２】
組換えベクターであって、請求項１８〜２１のいずれか一項の核酸を含み、ベクターは好ましくは請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質を生産ことができる、組換えベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換えベクターであって、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の遺伝子治療に使用されるベクターよりなる群から選択される、組換えベクター。
【請求項２４】
前記請求項のいずれかに記載の核酸および／またはベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項２６】
請求項２６に記載のモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項２７】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド若しくは融合タンパク質、核酸および／または組換えベクター、および薬学的に許容される担体を含んでいてもよい、医薬組成物。
【請求項２８】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド若しくは融合タンパク質、核酸および／または組換えベクターの、医薬の、好ましくは、ＩＬ−１７Ａ−およびＴｈ１７−関連疾患または医学的状態よりなる群から選択される疾患または医学的状態の治療および／または予防のための医薬の製造のための、使用。
【請求項２９】
疾患または医学的状態が、炎症性、自己免疫および／または骨量減少関連疾患および医学的状態から選択される、請求項２８の使用。
【請求項３０】
疾患または医学的状態が、関節炎、好ましくは関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎および変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症および皮膚過敏症の両者を含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、内分泌性眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（１型糖尿病）、自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸宮体腎炎（ネフローゼ症候群を伴う、および、伴わず）、特発性ネフローゼ症候群または微小変化ネフロパシー、腫瘍、皮膚の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨インプラントの弛緩、代謝異常、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症、骨量の減少、変形性関節症、骨粗しょう症、閉塞性または炎症性気道疾患の歯周病、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫、急性および超急性炎症反応、ＩＬ−１７Ａ介在性ＴＮＦ−α関連疾患、急性感染症、敗血性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の熱傷、悪液質消耗症候群、脳卒中、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患よりなる群から選択される、請求項２８および３０に記載の使用。
【請求項１】
下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記のポリペプチドがＩＬ−１７Ａに結合する、ポリペプチド：
（ｉ）（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）ａ−Ｄ−（Ｘ）ｂ−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）ｃ−Ｉ−（Ｘ）ｄ−Ｇ−（Ｘ）ｅ−ＷＷ−（Ｘ）ｆ−Ａ−（Ｘ）ｇ−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）ｈＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ （Ｉ）
式中、ａ〜ｈは０〜２０であり、
好ましくは、ａは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは６であり；
好ましくは、ｂは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｃは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｄは１〜１０であり、より好ましくは３〜９であり、最も好ましくは５または７であり；
好ましくは、ｅは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｆは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｇは０〜５であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１であり；
好ましくは、ｈは０〜６であり、より好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１または２である；
（ｉｉ）（ｉ）に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）をコードする核酸の相補鎖に、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸によってコードされる、アミノ酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片または機能性誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ヒトＩＬ−１７Ａに対する特異的な結合親和性を有し、好ましくはＫＤが１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−１２Ｍ未満のヒトＩＬ−１７Ａに対する特異的な結合親和性を有する、ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜１１９よりなる群またはその機能性誘導体から選択される、請求項１または２のポリペプチド。
【請求項４】
薬学的および／または診断学的有効成分に融合した請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項５】
前記の成分がサイトカインであり、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦβ、ＬＴ−β、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βよりなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記の成分が毒性化合物であり、好ましくは低分子有機化合物またはポリペプチドであり、より好ましくは、カリケアマイシン、マイタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラマイシン、ジネマイシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシンＡ鎖、モデクシン、切断性緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素および組換えゲロニンよりなる群から選択される毒性化合物である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記の成分がケモカインであり、好ましくは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＮ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルカインよりなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記の成分が蛍光色素であり、好ましくはアレクサフルオルまたはＣｙ色素から選択される成分である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記の成分が光増感剤であり、好ましくは光毒性赤色蛍光タンパク質キラーレッドまたはヘマトポルフィリンである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記の成分が凝血促進因子であり、好ましくは組織因子である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記の成分がプロドラッグ活性化酵素であり、好ましくは、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼよりなる群から選択される酵素である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記の成分が、γ放射性アイソトープの群からの放射性核種、好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎであるか、または、ポジトロン放射体の群からの放射性核種、好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉであるか、または、β放射体の群からの放射性核種、好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕであるか、または、α放射体の群からの放射性核種、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記の成分が機能性Ｆｃドメインであり、好ましくはヒト機能性Ｆｃドメインであり、より好ましくは、請求項１〜３のいずれかの多量体ポリペプチド、好ましくは二量体ポリペプチドを含むヒト機能性Ｆｃドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
さらに、血中半減期を調節する成分、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、免疫グロブリンおよびアルブミン結合ペプチドよりなる群から選択される成分を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号１〜１１９からよりなる群から選択されるポリペプチドまたはその機能性誘導体を含む、融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかのポリペプチドの多量体、好ましくは二量体または三量体を含む、請求項１〜３のいずれかのポリペプチドまたは請求項４〜１６のいずれかの融合タンパク質。
【請求項１８】
下記を含む、単離され、精製された核酸：
（ｉ）請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは
（Ｇ／Ｅ）ＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ−（Ｘ）６−Ｄ−（Ｘ）−ＳＦＨＫＧＥＫＦ−（Ｘ）１−Ｉ−（Ｘ）５−７−Ｇ−（Ｘ）１−ＷＷ−（Ｘ）−Ａ−（Ｘ）−ＳＬＴＴＧ−（Ｘ）１−２−ＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ
をコードする核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性をもつ配列を有する核酸；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸；
（ｉｖ）核酸であって、前記の核酸が、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸のうちの１つの置換、付加および／または欠失によって誘導し得る、核酸；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸のいずれか１つの断片であって、請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする（ｉ）の核酸の相補鎖にハイブリダイズする、断片。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、請求項１８の核酸。
【請求項２０】
前記の核酸がＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡである、請求項１８または１９の核酸。
【請求項２１】
前記の核酸がプロモータに、好ましくは、Ｔ５プロモータ／ｌａｃオペレータエレメント、Ｔ７プロモータ／ｌａｃオペレータエレメントよりなる原核生物プロモータの群、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ ｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモータよりなる真核生物プロモータの群から選択されるプロモータに、動作可能に連結されている、請求項１８〜２０のいずれか一項の核酸。
【請求項２２】
組換えベクターであって、請求項１８〜２１のいずれか一項の核酸を含み、ベクターは好ましくは請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質を生産ことができる、組換えベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換えベクターであって、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の遺伝子治療に使用されるベクターよりなる群から選択される、組換えベクター。
【請求項２４】
前記請求項のいずれかに記載の核酸および／またはベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項２６】
請求項２６に記載のモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項２７】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド若しくは融合タンパク質、核酸および／または組換えベクター、および薬学的に許容される担体を含んでいてもよい、医薬組成物。
【請求項２８】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド若しくは融合タンパク質、核酸および／または組換えベクターの、医薬の、好ましくは、ＩＬ−１７Ａ−およびＴｈ１７−関連疾患または医学的状態よりなる群から選択される疾患または医学的状態の治療および／または予防のための医薬の製造のための、使用。
【請求項２９】
疾患または医学的状態が、炎症性、自己免疫および／または骨量減少関連疾患および医学的状態から選択される、請求項２８の使用。
【請求項３０】
疾患または医学的状態が、関節炎、好ましくは関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎および変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症および皮膚過敏症の両者を含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、内分泌性眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（１型糖尿病）、自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸宮体腎炎（ネフローゼ症候群を伴う、および、伴わず）、特発性ネフローゼ症候群または微小変化ネフロパシー、腫瘍、皮膚の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨インプラントの弛緩、代謝異常、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症、骨量の減少、変形性関節症、骨粗しょう症、閉塞性または炎症性気道疾患の歯周病、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫、急性および超急性炎症反応、ＩＬ−１７Ａ介在性ＴＮＦ−α関連疾患、急性感染症、敗血性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の熱傷、悪液質消耗症候群、脳卒中、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患よりなる群から選択される、請求項２８および３０に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１３−５０２９１０（Ｐ２０１３−５０２９１０Ａ）
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２６０３５（Ｐ２０１２−５２６０３５）
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２３１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２３６８５
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（５１２０４６９３６）コヴァジェン アクチェン ゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２３１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２３６８５
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（５１２０４６９３６）コヴァジェン アクチェン ゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】
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