新規のウサギ抗体ヒト化方法及びヒト化ウサギ抗体
本発明は、ウサギの重鎖及び軽鎖可変領域をヒト化するための新規で改善された方法を提供する。得られるヒト化ウサギ重鎖及び軽鎖と抗体、並びに含有する抗体断片は、それらが親抗体の抗原結合親和性を保持するので、免疫療法及び免疫診断における使用に十分適していて、ヒト抗体配列に対するそのきわめて高いレベルの配列同一性に基づけば、ヒトにおいて本質的には非免疫原性であるはずである。本発明は、治療用のヒト化抗ヒトＴＮＦ−α及び抗ヒトＩＬ−６抗体の製造のためのプロトコールを例示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含有するヒト化抗体又は抗体断片であって、ここで軽鎖ポリペプチドは、少なくとも以下：（ｉ）ＦＲ１からＦＲ３に至る中で選択されるアミノ酸残基の、所望の抗原への特異性を有するヒト化される親ウサギ抗体の軽鎖の対応するアミノ酸残基に対する（ヒト生殖細胞系配列のライブラリー中の他のヒト生殖細胞系配列に比べた）そのより大きな相同性（配列同一性パーセント）に基づいて該ライブラリーより選択されるヒト軽鎖生殖細胞系配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が含まれる、ＦＲ１の第一残基からＦＲ３の末端に至るアミノ酸残基；及び（ｉｉ）さらにここで、同じ親ウサギ抗体の軽鎖中の「選択性決定残基」に対応するＣＤＲ１及びＣＤＲ２中のＣＤＲ残基は、対応するウサギ選択性決定残基で置き換えられている；（ｉｉｉ）同じ親ウサギ抗体の全ＣＤＲ３領域が含まれるアミノ酸残基；（ｉｖ）同じ親ウサギ抗体の軽鎖に含まれる対応するＦＲ４領域に対するそのより大きな相同性（配列同一性）に基づいてヒト生殖細胞系配列のライブラリーから導かれる抗体軽鎖の全ＦＲ４領域が含まれるアミノ酸残基；及び（ｖ）ここで、選択される相同的なヒトＦＲ領域中のヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域のＦＲ残基の中で、対応するウサギＦＲ残基で置換されているものは、ほとんど又はまったくないこと；を含有するヒト化軽鎖ポリペプチドである、前記ヒト化抗体又は抗体断片。
【請求項２】
親ウサギ抗体が、ヒト、ウイルス、又は細菌の抗原に特異的である、請求項１のヒト化抗体。
【請求項３】
ヒト抗原が、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、又は癌抗原である、請求項２のヒト化抗体。
【請求項４】
ＩＬ−６、ヘプシジン、肝細胞増殖因子、又はＴＮＦポリペプチドに特異的である、請求項１のヒト化抗体。
【請求項５】
請求項１、２、３、又は４のいずれかに引用されるヒト化抗体に含まれるヒト化抗体軽鎖をコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸配列を含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項８】
酵母、細菌、及び哺乳動物の細胞より選択される、請求項７の細胞。
【請求項９】
二倍体の酵母細胞である、請求項８の細胞。
【請求項１０】
ピキア属（Pichia）又は他のメタノール資化性二倍体酵母である、請求項９の細胞。
【請求項１１】
少なくとも１つの重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含有するヒト化抗体又は抗体断片であって、ここで重鎖は、少なくとも以下：（ｉ）ＦＲ１からＦＲ３に至る中で選択されるアミノ酸残基の、所望の抗原への特異性を有するヒト化される親ウサギ抗体の重鎖の対応するアミノ酸残基に対する（ヒト生殖細胞系配列のライブラリー中の他のヒト生殖細胞系配列に比べた）そのより大きな相同性（配列同一性パーセント）に基づいて該ライブラリーより選択されるヒト生殖細胞系配列によりコードされるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が含まれる、ＦＲ１の第一残基からＦＲ３の末端に至るアミノ酸残基；及び（ｉｉ）さらにここで、同じ親ウサギ抗体の重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の「選択性決定残基」に対応するヒト重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２中のＣＤＲ残基は、ウサギ重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる対応する重鎖選択性決定残基で置き換えられている；（ｉｉｉ）同じ親ウサギ抗体の全ＣＤＲ３領域が含まれるアミノ酸残基；（ｉｖ）同じ親ウサギ抗体の重鎖に含まれる対応するＦＲ４領域に対するそのより大きな相同性（配列同一性）に基づいてヒト生殖細胞系配列のライブラリーから導かれるＦＲ４領域；及び（ｖ）ここでヒト重鎖ＦＲ１領域の最終の１〜３のアミノ酸は、対応するウサギ重鎖ＦＲ１残基の末端の１〜３のアミノ酸で置き換えられていてもよい；及び／又は、ヒト重鎖フレームワーク２領域の末端アミノ酸は、ウサギ重鎖フレームワーク２の対応する末端アミノ酸残基で置き換えられていてもよい；及び／又は、ウサギ重鎖ＣＤＲ２の末端から４番目のアミノ酸（典型的には、トリプトファン）は、対応するヒトＣＤＲ２残基（典型的には、セリン）で置き換えられていてもよい；及び（ｖｉ）ここで、選択される相同的なヒトＦＲ領域の残るＦＲ残基の中で、対応するウサギＦＲ残基で置換されているものは、ほとんど又はまったくないこと；を含有するヒト化重鎖ポリペプチドである、前記ヒト化抗体又は抗体断片。
【請求項１２】
親ウサギ抗体が、ヒト、ウイルス、又は細菌の抗原に特異的である、請求項１１のヒト化抗体。
【請求項１３】
ヒト抗原が、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、又は癌抗原である、請求項１２のヒト化抗体。
【請求項１４】
ＩＬ−６、ヘプシジン、肝細胞増殖因子、又はＴＮＦポリペプチドに特異的である、請求項１１のヒト化抗体。
【請求項１５】
請求項１１、１２、１３、又は１４のいずれかに引用されるヒト化抗体に含まれるヒト化抗体重鎖をコードする核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列を含有するベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項１８】
酵母、細菌、及び哺乳動物の細胞より選択される、請求項１７の細胞。
【請求項１９】
二倍体の酵母細胞である、請求項１８の細胞。
【請求項２０】
ピキア属（Pichia）又は他のメタノール資化性二倍体酵母である、請求項１９の細胞。
【請求項２１】
少なくとも１つのヒト化軽鎖ポリペプチドを含有し、そしてさらに少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含んでなる請求項１のヒト化抗体であって、ここで少なくとも１つの重鎖は、少なくとも以下：（ｉ）ＦＲ１からＦＲ３に至る中で選択されるアミノ酸残基の、所望の抗原への特異性を有するヒト化される親ウサギ抗体の重鎖の対応するアミノ酸残基に対する（ヒト生殖細胞系配列のライブラリー中の他のヒト生殖細胞系配列に比べた）そのより大きな相同性（配列同一性パーセント）に基づいて該ライブラリーより選択されるヒト生殖細胞系配列によりコードされるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が含まれる、ＦＲ１の第一残基からＦＲ３の末端に至るアミノ酸残基；及び（ｉｉ）さらにここで、同じ親ウサギ抗体の重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の「選択性決定残基」に対応するヒト重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２中のＣＤＲ残基は、ウサギ重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる対応する重鎖選択性決定残基で置き換えられている；（ｉｉｉ）同じ親ウサギ抗体の全ＣＤＲ３領域が含まれるアミノ酸残基；（ｉｖ）同じ親ウサギ抗体の重鎖に含まれる対応するＦＲ４領域に対するそのより大きな相同性（配列同一性）に基づいてヒト生殖細胞系配列のライブラリーから導かれるＦＲ４領域；及び（ｖ）ここでヒト重鎖ＦＲ１領域の最終の１〜３のアミノ酸は、対応するウサギ重鎖ＦＲ１残基の末端の１〜３のアミノ酸で置き換えられていてもよい；及び／又は、ヒト重鎖フレームワーク２領域の末端アミノ酸は、ウサギ重鎖フレームワーク２の対応する末端アミノ酸残基で置き換えられていてもよい；及び／又は、ウサギ重鎖ＣＤＲ２の末端から４番目のアミノ酸（典型的には、トリプトファン）は、対応するヒトＣＤＲ２残基（典型的には、セリン）で置き換えられていてもよい；及び（ｖｉ）ここで、選択される相同的なヒトＦＲ領域の残るＦＲ残基の中で、対応するウサギＦＲ残基で置換されているものは、ほとんど又はまったくないこと；を含有するヒト化重鎖ポリペプチドである、前記ヒト化抗体。
【請求項２２】
ＩＬ−６、ヘプシジン、肝細胞増殖因子、又はＴＮＦポリペプチドに特異的である、請求項２１のヒト化抗体。
【請求項２３】
以下の工程：
（ｉ）所望の抗原へ特異的に結合するウサギ抗体からのウサギ軽鎖抗体配列をコードするＤＮＡを入手して、フレームワーク１（ＦＲ１）の始まりからフレームワーク３（ＦＲ３）の終わりを含む範囲のアミノ酸残基を同定する工程；
（ｉｉ）ＦＲ１の始まりからＦＲ３配列の終わりに至る前記ウサギ軽鎖抗体アミノ酸配列を用いて、ヒト軽鎖抗体配列を含有するライブラリーに対する相同性検索を実行して、他のヒト生殖細胞系抗体軽鎖配列に比べてそれに対する実質的な配列相同性を示すヒト軽鎖抗体配列を同定する工程；
（ｉｉｉ）ウサギとヒトの両方の軽鎖配列において、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の領域に対応する配置とその特異的残基（specific residues）を同定して、ウサギのこれらの離散領域と選択されるヒト抗体軽鎖を並置する工程；
（ｉｖ）選択される相同的なヒト軽鎖配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が、ウサギ軽鎖配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる対応する選択性決定残基によって置換されているＤＮＡ又はアミノ酸配列を構築する工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）によって得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列へ、ウサギＣＤＲ３軽鎖抗体配列の対応するアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列又はそれを含有するポリペプチドをさらに付ける工程；
（ｖｉ）ウサギ軽鎖に含まれるＦＲ４に相同的であり、好ましくは、多くても２〜４のアミノ酸残基だけそれから異なるヒト軽鎖フレームワーク４領域（ＦＲ４）をさらに選択して、前記ヒトＦＲ４をコードするＤＮＡ配列又は前記ヒトＦＲ４の対応するアミノ酸残基を、工程（ｖ）の後で得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列の上へ付ける工程；並びに
（ｖｉｉ）工程（ｉ）〜（ｖｉ）より得られるヒト化ウサギ軽鎖配列をコードするか又は含有するＤＮＡ又はアミノ酸配列を合成する工程を含んでなる、ヒト化軽鎖抗体配列を産生するためのヒト化戦略。
【請求項２４】
ＦＲ１を始めるアミノ酸がウサギ軽鎖シグナル配列の後で最初のアミノ酸である、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２５】
シグナル配列が約２０〜２２のアミノ酸残基を含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２６】
ヒト軽鎖配列がヒト生殖細胞系可変軽鎖配列を含有するライブラリーより同定される、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２７】
ウサギ配列中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域が、ウサギＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域を対応するヒト軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域と並置することによって同定される、請求項２３のヒト化戦略
【請求項２８】
ウサギＣＤＲ３領域が９〜１５のアミノ酸残基を含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２９】
ウサギ軽鎖ＦＲ４領域が１１のアミノ酸残基を含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３０】
ＦＲ３がＹＹＣで終わる、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３１】
ウサギ軽鎖中のＦＲ４がＦＧＧＧＧで始まる、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３２】
前記ウサギＦＲ４領域がＶＶＫＲアミノ酸配列で始まる、請求項３１のヒト化戦略。
【請求項３３】
選択されるヒトＦＲ４軽鎖配列がＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲを含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３４】
得られるヒト化ウサギ軽鎖を所望の抗原へ結合するヒト化抗体又はヒト化抗体断片の製造に使用する、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３５】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生される、ヒト化ウサギ軽鎖可変アミノ酸配列又はそれをコードするＤＮＡ。
【請求項３６】
微生物抗原、ヒト抗原、ウイルス抗原、及びアレルゲンより選択される抗原に特異的である、請求項３５のヒト化ウサギ軽鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項３７】
ヒト抗原が、ヒトの自己抗原、サイトカイン、受容体タンパク質、酵素、ホルモン、受容体リガンド、ステロイド、増殖因子、及び癌遺伝子より選択される、請求項３６のヒト化ウサギ軽鎖可変アミノ酸又はＤＮＡ配列。
【請求項３８】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生されるヒト化ウサギ軽鎖可変配列を含有する抗体又は抗体断片。
【請求項３９】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生される、エフェクター部分へ付くヒト化ウサギ軽鎖又はそれを含有する抗体。
【請求項４０】
エフェクター部分が、薬物、毒素、酵素、放射性核種、フルオロフォア、サイトカイン、アフィニティー標識、及び転座型ポリペプチドより選択される、請求項３９のヒト化ウサギ軽鎖ポリペプチド。
【請求項４１】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生される、サイトカイン、増殖因子、又は腫瘍特異的ポリペプチドへ特異的に結合するウサギ抗体から導かれる、ヒト化ウサギ軽鎖ポリペプチド又はそれを含有する抗体又はそれらをコードするＤＮＡ。
【請求項４２】
ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１２、ヘプシジン、又は肝細胞増殖因子へ特異的に結合するウサギ抗体から導かれる、請求項４１のヒト化ウサギ軽鎖ポリペプチド又は含有する抗体。
【請求項４３】
以下の工程：
（ｉ）所望の抗原へ特異的に結合するウサギ抗体からウサギ重鎖抗体配列を入手して、フレームワーク１（ＦＲ１）の始まりからフレームワーク３（ＦＲ３）の終わりを含む範囲のアミノ酸残基を同定する工程；
（ｉｉ）ＦＲ１の始まりからＦＲ３配列の終わりに至る前記ウサギ重鎖抗体アミノ酸配列を使用する相同性検索を（例えば、ヒト生殖細胞系抗体配列含有ライブラリーのＢＬＡＳＴ検索によって）実行して、それに対して相同的である、即ち、好ましくは、それに対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％〜９０％の同一性を保有するヒト重鎖抗体配列を同定する工程；
（ｉｉｉ）ウサギとヒトの両方の重鎖配列において、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の領域に対応する配置とその特異的残基を同定して、ウサギのこれらの離散領域を選択される相同的なヒト抗体重鎖の対応領域に対して並置する工程；
（ｉｖ）選択される相同的なヒト重鎖配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の残基が、ウサギ重鎖配列の対応するＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる選択性決定残基によって置換されているＤＮＡ又はアミノ酸配列を構築して、ヒト重鎖ＦＲ１領域の末端の１〜３のアミノ酸をウサギ重鎖ＦＲ１の対応する末端の１〜３のアミノ酸で置き換えてもよい；及び／又は、ヒト重鎖フレームワーク２領域の末端アミノ酸をウサギ重鎖フレームワーク２の対応する末端アミノ酸残基で置き換えてもよい；及び／又は、ウサギ重鎖ＣＤＲ２の末端から４番目のアミノ酸（典型的には、トリプトファン）を対応するヒトＣＤＲ２残基（典型的には、セリン）で置き換えてもよい工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）によって得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列へ、同じウサギ重鎖抗体配列に含まれるウサギ重鎖ＣＤＲ３の対応するアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列又はそれを有するポリペプチドをさらに付ける工程；
（ｖｉ）それに相同的である（好ましくは、ヒト化ウサギ抗体重鎖配列に含まれるＦＲ４より、多くても４つのアミノ酸残基だけ異なる）ヒト重鎖フレームワーク４領域（ＦＲ４）をさらに選択して、前記選択された相同的なヒトＦＲ４をコードするＤＮＡ配列又は前記ヒトＦＲ４の対応するアミノ酸残基を、工程（ｖ）の後で得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列の上へ付ける工程；並びに
（ｖｉｉ）工程（ｉ）〜（ｖｉ）より得られるヒト化ウサギ重鎖配列をコードするか又は含有するＤＮＡ又はアミノ酸配列を合成する工程を含んでなる、ヒト化重鎖抗体配列をウサギ重鎖抗体配列より産生するためのヒト化戦略。
【請求項４４】
ＦＲ１を始めるアミノ酸がウサギ重鎖シグナル配列の後で最初のアミノ酸である、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４５】
ＦＲ３の終わりがＦＲ１の第一残基の後の約９５〜１００番目のアミノ酸残基である、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４６】
シグナル配列が１９以下のアミノ酸残基を含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４７】
相同的なヒト重鎖配列が抗体成熟化に先立って得られるヒト生殖細胞系配列のＢＬＡＳＴ検索によって同定される、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４８】
選択される相同的なヒト重鎖がウサギ重鎖の対応領域に対して少なくとも９０〜９５％の配列同一性を保有する、請求項４３のヒト化戦略
【請求項４９】
ウサギ重鎖配列中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域がウサギＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域を対応するヒト重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域と並置することによって同定される、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５０】
ヒトＦＲ１の最終の３つのアミノ酸残基をウサギＦＲ１の対応する３つの残基で置き換える、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５１】
ウサギＦＲ１中の前記３つの残基にｓｅｒ−ｇｌｙが先行する、請求項５０のヒト化戦略。
【請求項５２】
ヒトＦＲ２の末端アミノ酸残基をウサギＦＲ２の対応する末端アミノ酸残基で置き換える工程をさらに含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５３】
末端のウサギＦＲ２残基がイソロイシン残基に先行される場合もあるグリシンを含む、請求項５２のヒト化戦略。
【請求項５４】
ウサギＣＤＲ２の終わりより約４残基に位置するトリプトファン残基をセリン残基に変える工程をさらに含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５５】
ウサギＣＤＲ３が５〜１９のアミノ酸残基を含む、請求項４３の方法。
【請求項５６】
ウサギＣＤＲ３に残基ＷＧ「Ｘ」Ｇが続き、ここで「Ｘ」は、好ましくはＱ又はＰである、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５７】
ウサギＦＲ４が１１のアミノ酸残基を含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５８】
ウサギＦＲ４がＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを含む、請求項５７のヒト化戦略。
【請求項５９】
請求項４３〜５８のいずれかにより産生される、微生物抗原、ヒト抗原、ウイルス抗原、及びアレルゲンより選択される抗原に特異的なウサギ抗体から導かれるヒト化ウサギ重鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項６０】
ヒト抗原に特異的である、請求項５９のヒト化ウサギ重鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項６１】
ヒト抗原が、ヒトの自己抗原、サイトカイン、受容体タンパク質、酵素、ホルモン、受容体リガンド、ステロイド、増殖因子、及び癌遺伝子より選択される、請求項５９のヒト化ウサギ重鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項６２】
請求項４３〜５８のいずれか１項に従って産生されるヒト化ウサギ重鎖可変配列を含有する抗体又は抗体断片。
【請求項６３】
請求項４３〜５８のいずれか１項に従って産生される、エフェクター部分へ付くヒト化ウサギ重鎖。
【請求項６４】
エフェクター部分が、薬物、毒素、酵素、放射性核種、フルオロフォア、サイトカイン、アフィニティー標識、及び転座型ポリペプチドより選択される、請求項６３のヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド。
【請求項６５】
請求項４３〜５８のいずれか１項に従って産生される、サイトカイン、増殖因子、又は腫瘍特異的ポリペプチドへ特異的に結合するウサギ抗体から導かれるヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド又はそれをコードするＤＮＡ。
【請求項６６】
ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−α、ＩＬ−１２、ヘプシジン、又は肝細胞増殖因子へ特異的に結合するウサギ抗体から導かれる、請求項６５のヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド。
【請求項６７】
非グリコシル化（aglycosylated）されている、請求項６４のヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド。
【請求項６８】
請求項２３〜３４の少なくとも１項に従って産生される少なくとも１つのヒト化ウサギ軽鎖と請求項４３〜５８の１項に従って産生される少なくとも１つのヒト化ウサギ重鎖を含んでなるヒト化ウサギ抗体。
【請求項６９】
ヒトの定常ドメインを含む、請求項６８のヒト化ウサギ抗体。
【請求項７０】
ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４より選択される、請求項６９のヒト化ウサギ抗体。
【請求項７１】
ヒト抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、病原体、寄生虫、酵母抗原、及び真菌抗原より選択される抗原へ結合する、請求項６８のヒト化ウサギ抗体。
【請求項７２】
ヒト化抗体の投与を含む免疫療法又は免疫診断の方法であって、ここで改善は、請求項１〜５、１１〜１４、２１、又は２２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又は抗体断片を投与することを含む、前記方法。
【請求項７３】
ＩＬ−６又はＴＮＦに関連した疾患又は障害の症状を改善又は抑制することを含む、請求項７２の方法。
【請求項７４】
ＩＬ−６又はＴＮＦ−αに関連した前記疾患又は障害が癌又は炎症性状態である、請求項７３の方法。
【請求項７５】
抗体が抗ＩＬ−６抗体であり、ＩＬ−６関連の疲労、悪液質、又は関節炎を治療するか又はその予後を診断するために使用される、請求項７３の方法。
【請求項７６】
ＩＬ−６に関連した前記疾患又は障害が、全身疲労、運動誘発性疲労、癌関連疲労、炎症性疾患関連疲労、慢性疲労症候群、癌関連悪液質、心臓関連悪液質、呼吸関連悪液質、腎臓関連悪液質、加齢関連悪液質、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身型若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性多発性筋痛、巨細胞性動脈炎、自己免疫性脈管炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、シェーグレン症候群、成人発症型スティル病、慢性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、骨関節炎、骨粗鬆症、骨ページェット病、骨関節炎、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、白血病、腎細胞癌、多中心型キャッスルマン病、卵巣癌、癌化学療法時の薬剤耐性、癌化学療法の毒性、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、喘息、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び脳血管系疾患より選択される、請求項７３の方法。
【請求項７７】
前記疾患又は障害がＴＮＦに関連していて、全身疲労、運動誘発性疲労、癌関連疲労、炎症性疾患関連疲労、慢性疲労症候群、癌関連悪液質、心臓関連悪液質、呼吸関連悪液質、腎臓関連悪液質、加齢関連悪液質、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身型若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性多発性筋痛、巨細胞性動脈炎、自己免疫性脈管炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、シェーグレン症候群、成人発症型スティル病、慢性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、骨関節炎、骨粗鬆症、骨ページェット病、骨関節炎、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、白血病、腎細胞癌、多中心型キャッスルマン病、卵巣癌、癌化学療法時の薬剤耐性、癌化学療法の毒性、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、喘息、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び脳血管系疾患より選択される、請求項７３の方法。
【請求項７８】
ヒト化抗体又は抗体断片が、少なくとも１０〜２５ｍｇ／リットルの前記抗体を安定的に発現して培養基へ分泌する倍数体酵母培養物において発現される請求項７２の方法であって：
（ｉ）プロモーター及びシグナル配列へ機能可能的に連結した前記ヒト化抗体又は断片をコードする１以上の異種ポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つの発現ベクターを一倍体酵母細胞へ導入する工程；
（ｉｉ）前記第一及び／又は第二の一倍体酵母細胞より、接合又はスフェロプラスト融合によって、倍数体酵母を産生する工程；
（ｉｉｉ）前記ヒト化抗体又は断片を安定的に発現する倍数体酵母細胞を選択する工程；及び
（ｉｖ）少なくとも１０〜２５ｍｇ／リットルの前記ヒト化抗体又は断片を培養基へ安定的に発現する前記倍数体酵母細胞より、安定した倍数体酵母培養物を産生する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項７９】
前記酵母が以下の属：アルキシオザイマ（Arxiozyma）；アスコボトリオザイマ（Ascobotryozyma）；シテロマイセス（Citeromyces）；デバリオマイセス（Debaryomyces）；デッケラ（Dekkera）；エレモセシウム（Eremothecium）；イサットヘンキア（Issatchenkia）；カザクスタニア（Kazachstania）；クルイベロマイセス（Kluyveromyces）；コダマエア（Kodamaea）；ロデロマイセス（Lodderomyces）；パチソレン（Pachysolen）；ピキア（Pichia）；サッカロマイセス（Saccharomyces）；サツニスポラ（Saturnispora）；テトラピシスポラ（Tetrapisispora）；トルラスポラ（Torulaspora）；ウィリオプシス（Williopsis）；及びザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）より選択される、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記酵母属がピキアである、請求項７９の方法。
【請求項８１】
ピキアの種が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、及びハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（ピキア・アングスタ（Pichia angusta））より選択される、請求項８０の方法。
【請求項８２】
請求項２３〜３４又は４３〜５８のいずれか１項によって産生されるヒト化抗体ポリペプチドを含有するヒト化抗体又は抗体断片であって、５ｘ１０−７Ｍ−１、１０−７Ｍ−１、５ｘ１０−８Ｍ−１、１０−８Ｍ−１、５ｘ１０−９Ｍ−１、１０−９Ｍ−１、５ｘ１０−１０Ｍ−１、１０−１０Ｍ−１、５ｘ１０−１１Ｍ−１、１０−１１Ｍ−１、５ｘ１０−１２Ｍ−１、１０−１２Ｍ−１、５ｘ１０−１３Ｍ−１、１０−１３Ｍ−１、又は５ｘ１０−１４Ｍ−１以下の解離定数（ＫＤ）で抗原へ結合する、前記ヒト化抗体又は断片。
【請求項８３】
５ｘ１０−１０Ｍ−１以下の解離定数（ＫＤ）で抗原へ結合する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８４】
１０−４Ｓ−１、５ｘ１０−５Ｓ−１、１０−５Ｓ−１、５ｘ１０−６Ｓ−１、１０−６Ｓ−１、５ｘ１０−７Ｓ−１、又は１０−７Ｓ−１以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）で抗原へ結合する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８５】
親ウサギ抗体が１以上のウサギＢ細胞集団に由来する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８６】
ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒとの会合、又はＴＮＦとその受容体との会合を阻害する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８７】
ＩＬ−６Ｒが可溶性Ｌ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）である、請求項８６のヒト化抗体。
【請求項８８】
ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）が可溶性である、請求項８６のヒト化抗体。
【請求項８９】
請求項１〜２２又は８２〜８８のいずれか１項に記載のヒト化ウサギ抗体を発現するベクター。
【請求項９０】
請求項８９のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項９１】
ピキア属に属する酵母細胞である、請求項９０の宿主細胞。
【請求項１】
少なくとも１つの重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含有するヒト化抗体又は抗体断片であって、ここで軽鎖ポリペプチドは、少なくとも以下：（ｉ）ＦＲ１からＦＲ３に至る中で選択されるアミノ酸残基の、所望の抗原への特異性を有するヒト化される親ウサギ抗体の軽鎖の対応するアミノ酸残基に対する（ヒト生殖細胞系配列のライブラリー中の他のヒト生殖細胞系配列に比べた）そのより大きな相同性（配列同一性パーセント）に基づいて該ライブラリーより選択されるヒト軽鎖生殖細胞系配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が含まれる、ＦＲ１の第一残基からＦＲ３の末端に至るアミノ酸残基；及び（ｉｉ）さらにここで、同じ親ウサギ抗体の軽鎖中の「選択性決定残基」に対応するＣＤＲ１及びＣＤＲ２中のＣＤＲ残基は、対応するウサギ選択性決定残基で置き換えられている；（ｉｉｉ）同じ親ウサギ抗体の全ＣＤＲ３領域が含まれるアミノ酸残基；（ｉｖ）同じ親ウサギ抗体の軽鎖に含まれる対応するＦＲ４領域に対するそのより大きな相同性（配列同一性）に基づいてヒト生殖細胞系配列のライブラリーから導かれる抗体軽鎖の全ＦＲ４領域が含まれるアミノ酸残基；及び（ｖ）ここで、選択される相同的なヒトＦＲ領域中のヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域のＦＲ残基の中で、対応するウサギＦＲ残基で置換されているものは、ほとんど又はまったくないこと；を含有するヒト化軽鎖ポリペプチドである、前記ヒト化抗体又は抗体断片。
【請求項２】
親ウサギ抗体が、ヒト、ウイルス、又は細菌の抗原に特異的である、請求項１のヒト化抗体。
【請求項３】
ヒト抗原が、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、又は癌抗原である、請求項２のヒト化抗体。
【請求項４】
ＩＬ−６、ヘプシジン、肝細胞増殖因子、又はＴＮＦポリペプチドに特異的である、請求項１のヒト化抗体。
【請求項５】
請求項１、２、３、又は４のいずれかに引用されるヒト化抗体に含まれるヒト化抗体軽鎖をコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸配列を含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項８】
酵母、細菌、及び哺乳動物の細胞より選択される、請求項７の細胞。
【請求項９】
二倍体の酵母細胞である、請求項８の細胞。
【請求項１０】
ピキア属（Pichia）又は他のメタノール資化性二倍体酵母である、請求項９の細胞。
【請求項１１】
少なくとも１つの重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含有するヒト化抗体又は抗体断片であって、ここで重鎖は、少なくとも以下：（ｉ）ＦＲ１からＦＲ３に至る中で選択されるアミノ酸残基の、所望の抗原への特異性を有するヒト化される親ウサギ抗体の重鎖の対応するアミノ酸残基に対する（ヒト生殖細胞系配列のライブラリー中の他のヒト生殖細胞系配列に比べた）そのより大きな相同性（配列同一性パーセント）に基づいて該ライブラリーより選択されるヒト生殖細胞系配列によりコードされるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が含まれる、ＦＲ１の第一残基からＦＲ３の末端に至るアミノ酸残基；及び（ｉｉ）さらにここで、同じ親ウサギ抗体の重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の「選択性決定残基」に対応するヒト重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２中のＣＤＲ残基は、ウサギ重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる対応する重鎖選択性決定残基で置き換えられている；（ｉｉｉ）同じ親ウサギ抗体の全ＣＤＲ３領域が含まれるアミノ酸残基；（ｉｖ）同じ親ウサギ抗体の重鎖に含まれる対応するＦＲ４領域に対するそのより大きな相同性（配列同一性）に基づいてヒト生殖細胞系配列のライブラリーから導かれるＦＲ４領域；及び（ｖ）ここでヒト重鎖ＦＲ１領域の最終の１〜３のアミノ酸は、対応するウサギ重鎖ＦＲ１残基の末端の１〜３のアミノ酸で置き換えられていてもよい；及び／又は、ヒト重鎖フレームワーク２領域の末端アミノ酸は、ウサギ重鎖フレームワーク２の対応する末端アミノ酸残基で置き換えられていてもよい；及び／又は、ウサギ重鎖ＣＤＲ２の末端から４番目のアミノ酸（典型的には、トリプトファン）は、対応するヒトＣＤＲ２残基（典型的には、セリン）で置き換えられていてもよい；及び（ｖｉ）ここで、選択される相同的なヒトＦＲ領域の残るＦＲ残基の中で、対応するウサギＦＲ残基で置換されているものは、ほとんど又はまったくないこと；を含有するヒト化重鎖ポリペプチドである、前記ヒト化抗体又は抗体断片。
【請求項１２】
親ウサギ抗体が、ヒト、ウイルス、又は細菌の抗原に特異的である、請求項１１のヒト化抗体。
【請求項１３】
ヒト抗原が、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、又は癌抗原である、請求項１２のヒト化抗体。
【請求項１４】
ＩＬ−６、ヘプシジン、肝細胞増殖因子、又はＴＮＦポリペプチドに特異的である、請求項１１のヒト化抗体。
【請求項１５】
請求項１１、１２、１３、又は１４のいずれかに引用されるヒト化抗体に含まれるヒト化抗体重鎖をコードする核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列を含有するベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項１８】
酵母、細菌、及び哺乳動物の細胞より選択される、請求項１７の細胞。
【請求項１９】
二倍体の酵母細胞である、請求項１８の細胞。
【請求項２０】
ピキア属（Pichia）又は他のメタノール資化性二倍体酵母である、請求項１９の細胞。
【請求項２１】
少なくとも１つのヒト化軽鎖ポリペプチドを含有し、そしてさらに少なくとも１つの重鎖ポリペプチドを含んでなる請求項１のヒト化抗体であって、ここで少なくとも１つの重鎖は、少なくとも以下：（ｉ）ＦＲ１からＦＲ３に至る中で選択されるアミノ酸残基の、所望の抗原への特異性を有するヒト化される親ウサギ抗体の重鎖の対応するアミノ酸残基に対する（ヒト生殖細胞系配列のライブラリー中の他のヒト生殖細胞系配列に比べた）そのより大きな相同性（配列同一性パーセント）に基づいて該ライブラリーより選択されるヒト生殖細胞系配列によりコードされるＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が含まれる、ＦＲ１の第一残基からＦＲ３の末端に至るアミノ酸残基；及び（ｉｉ）さらにここで、同じ親ウサギ抗体の重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の「選択性決定残基」に対応するヒト重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２中のＣＤＲ残基は、ウサギ重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる対応する重鎖選択性決定残基で置き換えられている；（ｉｉｉ）同じ親ウサギ抗体の全ＣＤＲ３領域が含まれるアミノ酸残基；（ｉｖ）同じ親ウサギ抗体の重鎖に含まれる対応するＦＲ４領域に対するそのより大きな相同性（配列同一性）に基づいてヒト生殖細胞系配列のライブラリーから導かれるＦＲ４領域；及び（ｖ）ここでヒト重鎖ＦＲ１領域の最終の１〜３のアミノ酸は、対応するウサギ重鎖ＦＲ１残基の末端の１〜３のアミノ酸で置き換えられていてもよい；及び／又は、ヒト重鎖フレームワーク２領域の末端アミノ酸は、ウサギ重鎖フレームワーク２の対応する末端アミノ酸残基で置き換えられていてもよい；及び／又は、ウサギ重鎖ＣＤＲ２の末端から４番目のアミノ酸（典型的には、トリプトファン）は、対応するヒトＣＤＲ２残基（典型的には、セリン）で置き換えられていてもよい；及び（ｖｉ）ここで、選択される相同的なヒトＦＲ領域の残るＦＲ残基の中で、対応するウサギＦＲ残基で置換されているものは、ほとんど又はまったくないこと；を含有するヒト化重鎖ポリペプチドである、前記ヒト化抗体。
【請求項２２】
ＩＬ−６、ヘプシジン、肝細胞増殖因子、又はＴＮＦポリペプチドに特異的である、請求項２１のヒト化抗体。
【請求項２３】
以下の工程：
（ｉ）所望の抗原へ特異的に結合するウサギ抗体からのウサギ軽鎖抗体配列をコードするＤＮＡを入手して、フレームワーク１（ＦＲ１）の始まりからフレームワーク３（ＦＲ３）の終わりを含む範囲のアミノ酸残基を同定する工程；
（ｉｉ）ＦＲ１の始まりからＦＲ３配列の終わりに至る前記ウサギ軽鎖抗体アミノ酸配列を用いて、ヒト軽鎖抗体配列を含有するライブラリーに対する相同性検索を実行して、他のヒト生殖細胞系抗体軽鎖配列に比べてそれに対する実質的な配列相同性を示すヒト軽鎖抗体配列を同定する工程；
（ｉｉｉ）ウサギとヒトの両方の軽鎖配列において、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の領域に対応する配置とその特異的残基（specific residues）を同定して、ウサギのこれらの離散領域と選択されるヒト抗体軽鎖を並置する工程；
（ｉｖ）選択される相同的なヒト軽鎖配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域が、ウサギ軽鎖配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる対応する選択性決定残基によって置換されているＤＮＡ又はアミノ酸配列を構築する工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）によって得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列へ、ウサギＣＤＲ３軽鎖抗体配列の対応するアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列又はそれを含有するポリペプチドをさらに付ける工程；
（ｖｉ）ウサギ軽鎖に含まれるＦＲ４に相同的であり、好ましくは、多くても２〜４のアミノ酸残基だけそれから異なるヒト軽鎖フレームワーク４領域（ＦＲ４）をさらに選択して、前記ヒトＦＲ４をコードするＤＮＡ配列又は前記ヒトＦＲ４の対応するアミノ酸残基を、工程（ｖ）の後で得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列の上へ付ける工程；並びに
（ｖｉｉ）工程（ｉ）〜（ｖｉ）より得られるヒト化ウサギ軽鎖配列をコードするか又は含有するＤＮＡ又はアミノ酸配列を合成する工程を含んでなる、ヒト化軽鎖抗体配列を産生するためのヒト化戦略。
【請求項２４】
ＦＲ１を始めるアミノ酸がウサギ軽鎖シグナル配列の後で最初のアミノ酸である、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２５】
シグナル配列が約２０〜２２のアミノ酸残基を含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２６】
ヒト軽鎖配列がヒト生殖細胞系可変軽鎖配列を含有するライブラリーより同定される、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２７】
ウサギ配列中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域が、ウサギＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域を対応するヒト軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域と並置することによって同定される、請求項２３のヒト化戦略
【請求項２８】
ウサギＣＤＲ３領域が９〜１５のアミノ酸残基を含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項２９】
ウサギ軽鎖ＦＲ４領域が１１のアミノ酸残基を含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３０】
ＦＲ３がＹＹＣで終わる、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３１】
ウサギ軽鎖中のＦＲ４がＦＧＧＧＧで始まる、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３２】
前記ウサギＦＲ４領域がＶＶＫＲアミノ酸配列で始まる、請求項３１のヒト化戦略。
【請求項３３】
選択されるヒトＦＲ４軽鎖配列がＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲを含む、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３４】
得られるヒト化ウサギ軽鎖を所望の抗原へ結合するヒト化抗体又はヒト化抗体断片の製造に使用する、請求項２３のヒト化戦略。
【請求項３５】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生される、ヒト化ウサギ軽鎖可変アミノ酸配列又はそれをコードするＤＮＡ。
【請求項３６】
微生物抗原、ヒト抗原、ウイルス抗原、及びアレルゲンより選択される抗原に特異的である、請求項３５のヒト化ウサギ軽鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項３７】
ヒト抗原が、ヒトの自己抗原、サイトカイン、受容体タンパク質、酵素、ホルモン、受容体リガンド、ステロイド、増殖因子、及び癌遺伝子より選択される、請求項３６のヒト化ウサギ軽鎖可変アミノ酸又はＤＮＡ配列。
【請求項３８】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生されるヒト化ウサギ軽鎖可変配列を含有する抗体又は抗体断片。
【請求項３９】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生される、エフェクター部分へ付くヒト化ウサギ軽鎖又はそれを含有する抗体。
【請求項４０】
エフェクター部分が、薬物、毒素、酵素、放射性核種、フルオロフォア、サイトカイン、アフィニティー標識、及び転座型ポリペプチドより選択される、請求項３９のヒト化ウサギ軽鎖ポリペプチド。
【請求項４１】
請求項２３〜３４のいずれか１項に従って産生される、サイトカイン、増殖因子、又は腫瘍特異的ポリペプチドへ特異的に結合するウサギ抗体から導かれる、ヒト化ウサギ軽鎖ポリペプチド又はそれを含有する抗体又はそれらをコードするＤＮＡ。
【請求項４２】
ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１２、ヘプシジン、又は肝細胞増殖因子へ特異的に結合するウサギ抗体から導かれる、請求項４１のヒト化ウサギ軽鎖ポリペプチド又は含有する抗体。
【請求項４３】
以下の工程：
（ｉ）所望の抗原へ特異的に結合するウサギ抗体からウサギ重鎖抗体配列を入手して、フレームワーク１（ＦＲ１）の始まりからフレームワーク３（ＦＲ３）の終わりを含む範囲のアミノ酸残基を同定する工程；
（ｉｉ）ＦＲ１の始まりからＦＲ３配列の終わりに至る前記ウサギ重鎖抗体アミノ酸配列を使用する相同性検索を（例えば、ヒト生殖細胞系抗体配列含有ライブラリーのＢＬＡＳＴ検索によって）実行して、それに対して相同的である、即ち、好ましくは、それに対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％〜９０％の同一性を保有するヒト重鎖抗体配列を同定する工程；
（ｉｉｉ）ウサギとヒトの両方の重鎖配列において、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の領域に対応する配置とその特異的残基を同定して、ウサギのこれらの離散領域を選択される相同的なヒト抗体重鎖の対応領域に対して並置する工程；
（ｉｖ）選択される相同的なヒト重鎖配列のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の残基が、ウサギ重鎖配列の対応するＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域に含まれる選択性決定残基によって置換されているＤＮＡ又はアミノ酸配列を構築して、ヒト重鎖ＦＲ１領域の末端の１〜３のアミノ酸をウサギ重鎖ＦＲ１の対応する末端の１〜３のアミノ酸で置き換えてもよい；及び／又は、ヒト重鎖フレームワーク２領域の末端アミノ酸をウサギ重鎖フレームワーク２の対応する末端アミノ酸残基で置き換えてもよい；及び／又は、ウサギ重鎖ＣＤＲ２の末端から４番目のアミノ酸（典型的には、トリプトファン）を対応するヒトＣＤＲ２残基（典型的には、セリン）で置き換えてもよい工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）によって得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列へ、同じウサギ重鎖抗体配列に含まれるウサギ重鎖ＣＤＲ３の対応するアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列又はそれを有するポリペプチドをさらに付ける工程；
（ｖｉ）それに相同的である（好ましくは、ヒト化ウサギ抗体重鎖配列に含まれるＦＲ４より、多くても４つのアミノ酸残基だけ異なる）ヒト重鎖フレームワーク４領域（ＦＲ４）をさらに選択して、前記選択された相同的なヒトＦＲ４をコードするＤＮＡ配列又は前記ヒトＦＲ４の対応するアミノ酸残基を、工程（ｖ）の後で得られるＤＮＡ又はアミノ酸配列の上へ付ける工程；並びに
（ｖｉｉ）工程（ｉ）〜（ｖｉ）より得られるヒト化ウサギ重鎖配列をコードするか又は含有するＤＮＡ又はアミノ酸配列を合成する工程を含んでなる、ヒト化重鎖抗体配列をウサギ重鎖抗体配列より産生するためのヒト化戦略。
【請求項４４】
ＦＲ１を始めるアミノ酸がウサギ重鎖シグナル配列の後で最初のアミノ酸である、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４５】
ＦＲ３の終わりがＦＲ１の第一残基の後の約９５〜１００番目のアミノ酸残基である、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４６】
シグナル配列が１９以下のアミノ酸残基を含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４７】
相同的なヒト重鎖配列が抗体成熟化に先立って得られるヒト生殖細胞系配列のＢＬＡＳＴ検索によって同定される、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項４８】
選択される相同的なヒト重鎖がウサギ重鎖の対応領域に対して少なくとも９０〜９５％の配列同一性を保有する、請求項４３のヒト化戦略
【請求項４９】
ウサギ重鎖配列中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域がウサギＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域を対応するヒト重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、及びＣＤＲ２領域と並置することによって同定される、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５０】
ヒトＦＲ１の最終の３つのアミノ酸残基をウサギＦＲ１の対応する３つの残基で置き換える、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５１】
ウサギＦＲ１中の前記３つの残基にｓｅｒ−ｇｌｙが先行する、請求項５０のヒト化戦略。
【請求項５２】
ヒトＦＲ２の末端アミノ酸残基をウサギＦＲ２の対応する末端アミノ酸残基で置き換える工程をさらに含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５３】
末端のウサギＦＲ２残基がイソロイシン残基に先行される場合もあるグリシンを含む、請求項５２のヒト化戦略。
【請求項５４】
ウサギＣＤＲ２の終わりより約４残基に位置するトリプトファン残基をセリン残基に変える工程をさらに含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５５】
ウサギＣＤＲ３が５〜１９のアミノ酸残基を含む、請求項４３の方法。
【請求項５６】
ウサギＣＤＲ３に残基ＷＧ「Ｘ」Ｇが続き、ここで「Ｘ」は、好ましくはＱ又はＰである、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５７】
ウサギＦＲ４が１１のアミノ酸残基を含む、請求項４３のヒト化戦略。
【請求項５８】
ウサギＦＲ４がＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを含む、請求項５７のヒト化戦略。
【請求項５９】
請求項４３〜５８のいずれかにより産生される、微生物抗原、ヒト抗原、ウイルス抗原、及びアレルゲンより選択される抗原に特異的なウサギ抗体から導かれるヒト化ウサギ重鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項６０】
ヒト抗原に特異的である、請求項５９のヒト化ウサギ重鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項６１】
ヒト抗原が、ヒトの自己抗原、サイトカイン、受容体タンパク質、酵素、ホルモン、受容体リガンド、ステロイド、増殖因子、及び癌遺伝子より選択される、請求項５９のヒト化ウサギ重鎖可変アミノ酸配列又はＤＮＡ配列。
【請求項６２】
請求項４３〜５８のいずれか１項に従って産生されるヒト化ウサギ重鎖可変配列を含有する抗体又は抗体断片。
【請求項６３】
請求項４３〜５８のいずれか１項に従って産生される、エフェクター部分へ付くヒト化ウサギ重鎖。
【請求項６４】
エフェクター部分が、薬物、毒素、酵素、放射性核種、フルオロフォア、サイトカイン、アフィニティー標識、及び転座型ポリペプチドより選択される、請求項６３のヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド。
【請求項６５】
請求項４３〜５８のいずれか１項に従って産生される、サイトカイン、増殖因子、又は腫瘍特異的ポリペプチドへ特異的に結合するウサギ抗体から導かれるヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド又はそれをコードするＤＮＡ。
【請求項６６】
ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−α、ＩＬ−１２、ヘプシジン、又は肝細胞増殖因子へ特異的に結合するウサギ抗体から導かれる、請求項６５のヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド。
【請求項６７】
非グリコシル化（aglycosylated）されている、請求項６４のヒト化ウサギ重鎖ポリペプチド。
【請求項６８】
請求項２３〜３４の少なくとも１項に従って産生される少なくとも１つのヒト化ウサギ軽鎖と請求項４３〜５８の１項に従って産生される少なくとも１つのヒト化ウサギ重鎖を含んでなるヒト化ウサギ抗体。
【請求項６９】
ヒトの定常ドメインを含む、請求項６８のヒト化ウサギ抗体。
【請求項７０】
ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４より選択される、請求項６９のヒト化ウサギ抗体。
【請求項７１】
ヒト抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、病原体、寄生虫、酵母抗原、及び真菌抗原より選択される抗原へ結合する、請求項６８のヒト化ウサギ抗体。
【請求項７２】
ヒト化抗体の投与を含む免疫療法又は免疫診断の方法であって、ここで改善は、請求項１〜５、１１〜１４、２１、又は２２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又は抗体断片を投与することを含む、前記方法。
【請求項７３】
ＩＬ−６又はＴＮＦに関連した疾患又は障害の症状を改善又は抑制することを含む、請求項７２の方法。
【請求項７４】
ＩＬ−６又はＴＮＦ−αに関連した前記疾患又は障害が癌又は炎症性状態である、請求項７３の方法。
【請求項７５】
抗体が抗ＩＬ−６抗体であり、ＩＬ−６関連の疲労、悪液質、又は関節炎を治療するか又はその予後を診断するために使用される、請求項７３の方法。
【請求項７６】
ＩＬ−６に関連した前記疾患又は障害が、全身疲労、運動誘発性疲労、癌関連疲労、炎症性疾患関連疲労、慢性疲労症候群、癌関連悪液質、心臓関連悪液質、呼吸関連悪液質、腎臓関連悪液質、加齢関連悪液質、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身型若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性多発性筋痛、巨細胞性動脈炎、自己免疫性脈管炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、シェーグレン症候群、成人発症型スティル病、慢性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、骨関節炎、骨粗鬆症、骨ページェット病、骨関節炎、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、白血病、腎細胞癌、多中心型キャッスルマン病、卵巣癌、癌化学療法時の薬剤耐性、癌化学療法の毒性、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、喘息、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び脳血管系疾患より選択される、請求項７３の方法。
【請求項７７】
前記疾患又は障害がＴＮＦに関連していて、全身疲労、運動誘発性疲労、癌関連疲労、炎症性疾患関連疲労、慢性疲労症候群、癌関連悪液質、心臓関連悪液質、呼吸関連悪液質、腎臓関連悪液質、加齢関連悪液質、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身型若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性多発性筋痛、巨細胞性動脈炎、自己免疫性脈管炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、シェーグレン症候群、成人発症型スティル病、慢性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、骨関節炎、骨粗鬆症、骨ページェット病、骨関節炎、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、白血病、腎細胞癌、多中心型キャッスルマン病、卵巣癌、癌化学療法時の薬剤耐性、癌化学療法の毒性、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、喘息、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び脳血管系疾患より選択される、請求項７３の方法。
【請求項７８】
ヒト化抗体又は抗体断片が、少なくとも１０〜２５ｍｇ／リットルの前記抗体を安定的に発現して培養基へ分泌する倍数体酵母培養物において発現される請求項７２の方法であって：
（ｉ）プロモーター及びシグナル配列へ機能可能的に連結した前記ヒト化抗体又は断片をコードする１以上の異種ポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つの発現ベクターを一倍体酵母細胞へ導入する工程；
（ｉｉ）前記第一及び／又は第二の一倍体酵母細胞より、接合又はスフェロプラスト融合によって、倍数体酵母を産生する工程；
（ｉｉｉ）前記ヒト化抗体又は断片を安定的に発現する倍数体酵母細胞を選択する工程；及び
（ｉｖ）少なくとも１０〜２５ｍｇ／リットルの前記ヒト化抗体又は断片を培養基へ安定的に発現する前記倍数体酵母細胞より、安定した倍数体酵母培養物を産生する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項７９】
前記酵母が以下の属：アルキシオザイマ（Arxiozyma）；アスコボトリオザイマ（Ascobotryozyma）；シテロマイセス（Citeromyces）；デバリオマイセス（Debaryomyces）；デッケラ（Dekkera）；エレモセシウム（Eremothecium）；イサットヘンキア（Issatchenkia）；カザクスタニア（Kazachstania）；クルイベロマイセス（Kluyveromyces）；コダマエア（Kodamaea）；ロデロマイセス（Lodderomyces）；パチソレン（Pachysolen）；ピキア（Pichia）；サッカロマイセス（Saccharomyces）；サツニスポラ（Saturnispora）；テトラピシスポラ（Tetrapisispora）；トルラスポラ（Torulaspora）；ウィリオプシス（Williopsis）；及びザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）より選択される、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記酵母属がピキアである、請求項７９の方法。
【請求項８１】
ピキアの種が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、及びハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（ピキア・アングスタ（Pichia angusta））より選択される、請求項８０の方法。
【請求項８２】
請求項２３〜３４又は４３〜５８のいずれか１項によって産生されるヒト化抗体ポリペプチドを含有するヒト化抗体又は抗体断片であって、５ｘ１０−７Ｍ−１、１０−７Ｍ−１、５ｘ１０−８Ｍ−１、１０−８Ｍ−１、５ｘ１０−９Ｍ−１、１０−９Ｍ−１、５ｘ１０−１０Ｍ−１、１０−１０Ｍ−１、５ｘ１０−１１Ｍ−１、１０−１１Ｍ−１、５ｘ１０−１２Ｍ−１、１０−１２Ｍ−１、５ｘ１０−１３Ｍ−１、１０−１３Ｍ−１、又は５ｘ１０−１４Ｍ−１以下の解離定数（ＫＤ）で抗原へ結合する、前記ヒト化抗体又は断片。
【請求項８３】
５ｘ１０−１０Ｍ−１以下の解離定数（ＫＤ）で抗原へ結合する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８４】
１０−４Ｓ−１、５ｘ１０−５Ｓ−１、１０−５Ｓ−１、５ｘ１０−６Ｓ−１、１０−６Ｓ−１、５ｘ１０−７Ｓ−１、又は１０−７Ｓ−１以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）で抗原へ結合する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８５】
親ウサギ抗体が１以上のウサギＢ細胞集団に由来する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８６】
ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒとの会合、又はＴＮＦとその受容体との会合を阻害する、請求項８２のヒト化抗体。
【請求項８７】
ＩＬ−６Ｒが可溶性Ｌ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）である、請求項８６のヒト化抗体。
【請求項８８】
ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）が可溶性である、請求項８６のヒト化抗体。
【請求項８９】
請求項１〜２２又は８２〜８８のいずれか１項に記載のヒト化ウサギ抗体を発現するベクター。
【請求項９０】
請求項８９のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項９１】
ピキア属に属する酵母細胞である、請求項９０の宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２８５８９（Ｐ２０１０−５２８５８９Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９５３５（Ｐ２０１０−５０９５３５）
【出願日】平成２０年５月２１日（２００８．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４４２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４７５７
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０８３４３３７５）アルダー・バイオファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２１日（２００８．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４４２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４７５７
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０８３４３３７５）アルダー・バイオファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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