新規の蛍光性ホウ素で置換されたジピロメテン及び診断へのその使用
本発明は、蛍光性でないジピロメテン−ホウ素に由来する新規の蛍光性化合物、同化合物を調製する方法、及び生体分子を蛍光標識するためのその使用に関する。本発明はまた、前記蛍光性化合物で標識された生体分子、及び医学診断法のような検出方法へのその使用に関する。より具体的には、本発明の検出法は、アルツハイマー病のような神経変性疾患を診断するのに特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の蛍光性化合物、フッ素化されていないジピロメテン−ホウ素誘導体、同化合物の調製法、及び生体分子を蛍光標識するためのその使用に関する。本発明はさらに、上記蛍光性化合物で標識された生体分子、及び医学診断法のような検出法へのその使用に関する；特に、本発明による検出法は、アルツハイマー病のような神経変性疾患の診断に特に有用であると見られる。
【背景技術】
【０００２】
蛍光マーカーは、免疫学、分子生物学、医学診断又はさらにはＤＮＡチップの分野で、生体分子を検出及び／又は推定するために、しばしば用いられる。
【０００３】
従来技術にある、蛍光マーカーとして用いることのできる多くの化合物の中では、ジピロメテン−ホウ素類の二フッ化物（ここから先ではＤＦＭＢと表す）を特に引用することができる。特許である、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３は、ＤＦＭＢに由来し蛍光性官能基を含有する化合物で、生体分子やポリマーを標識するのに用いることのできるものを記載する。
【０００４】
しかしながら、ＤＦＭＢ誘導体は化学的に不安定である；それゆえ、塩基性媒体中又はアミンやアルコラートのような求核剤の存在下で、これらの化合物のフッ素原子は容易に置換される。
【０００５】
国際特許出願である特許文献４、及び特許文献５は、フッ素化されていないジピロメテン−ホウ素類に由来する化合物を記載する。これらの化合物はＤＦＭＢ誘導体に比べてより良好な化学安定性を示す；特に、自動ペプチド合成中のカーバメートタイプ（例えばＦｍｏｃ）の基の脱保護で特に用いられる塩基性条件に強い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，７７４，３３９号
【特許文献２】米国特許第５，１８７，２８８号
【特許文献３】米国特許第５，４５１，６６３号
【特許文献４】国際公開第２００６／０８７４５９号
【特許文献５】国際公開第２００６／０８７４５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、下のような性質を示す、利用可能な蛍光性化合物への必要性は残っている：
−さらに向上した化学的安定性；
−高い蛍光量子収率及び高いモル吸光係数；
−調節可能な励起波長及び発光波長；並びに
−生体分子に容易にグラフトすることを可能にする官能基。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は生体分子にグラフトすることを可能にするカルボニル基を有する、フッ素化されていないジピロメテン−ホウ素誘導体である、一般式（Ｉ）の新規の蛍光性化合物を開発することによって達成された。一般式（Ｉ）の化合物は、フルオレセイン、ローダミン類及びジフルオロボラジアザ−インダセン類のような標準的な蛍光体に比べて化学的により安定である；加えて、これらの化合物は、ペプチド又はオリゴヌクレオチドの固相合成で用いられる様々な試薬に対して強く、それゆえに、アミノ酸又はヌクレオチドの標識に特に好適である。
【０００９】
本発明の文脈では、生体分子はアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、ビオチン若しくは誘導体、又はその構造類縁体、ヌクレオチド又は核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）を意味すると理解されたい。
【００１０】
蛍光体（蛍光性化合物又はマーカーとも呼ばれる）は、単一の波長（励起波長又は吸収波長として知られる）で光エネルギーを吸収することができ、発光により、吸収波長より大きいかそれに等しい波長（発光波長として知られる）で吸収したエネルギーを全て又は部分的に放出することができる官能基を含有する化合物である；蛍光体は、生体分子のような分子に共有結合で連結することができる。
【００１１】
一般的に、分子は、放射性の原子若しくは原子団のような検出可能な原子若しくは原子団、発色団又は蛍光体を少なくとも１つ含有するならば、標識されたと言われる。
【００１２】
本発明の文脈では、別段に定義しない限りは、分子は、蛍光体に共有結合で連結した場合、標識されたと言われる。
【００１３】
標識は、蛍光体を生体分子に共有結合で連結すること（該生体分子は、好ましくはアミノ酸又はヌクレオチドである）、次に蛍光体がアミノ酸の側鎖又はヌクレオチドに連結されることからなる方法を意味すると理解されたい。
【００１４】
カルボニル基とは以下の構造：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（例えばカルボン酸、エステル、アミド又はチオエステルに存在する）の官能基である。本発明の文脈では、一般式（Ｉ）の化合物のカルボニル基は、−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ基によって定義される。ここで、Ａｒ、ｍ及びＺは以下に定義される。
【００１７】
それゆえ、本発明はより具体的には、一般式（Ｉ）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
（式中、
−Ｒ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ａｒ、Ｚ、Ｌ及びＧは以下に定義され、
−Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、ｍは０又は１であり、
置換基Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のうち１つのみが−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ又は−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚであることが理解され；
好ましくはＲ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚであり、
−Ｒ２及びＲ５は、同じ又は異なっていて、それぞれ独立して水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ｌ及びＧは以下に定義され、
−Ｓ１及びＳ２は親水基であり、同じ又は異なっていて、式−Ｃ≡Ｃ−Ｌ’−Ａであり；
ここで、Ｌ’及びＡは以下に定義され、
−ＡｒはＣ５−Ｃ１４アリーレン又はヘテロアリーレンから選択され、その−ＣＯ−Ｚ基はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にあり；Ａｒは好ましくはベンゼン基、ナフタレン基、アントラセン基、ピレン基、ピリジン基、ピリミジン基、チオフェン基又はピロール基から選択され、
−Ｚは一般式（Ｉ）の化合物を生体分子に接合することを可能にする基であり；特に、Ｚは、−ＯＨ基、−Ｏ−スクシンイミド基、−Ｏ−マレイミド基、−Ｎ−グリシン基、−Ｎ−リシン基、−Ｙ−Ｌ’’−ＮＨ２基、−Ｙ−Ｌ’’−ＣＯＯＨ基又は−Ｙ−Ｌ’’−ＳＨ基から選択され、ここで、ＹはＮ原子及びＯ原子から選択され、Ｌ’’は以下に定義され；
−Ｌ及びＬ’’はそれぞれ独立して単結合、任意に分岐したＣ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ６、炭素鎖、Ｃ６−Ｃ１６アリーレン（Ｌについてはその−Ｈ基又は−Ｇ基、Ｌ’’についてはその−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基又は−ＳＨ基）はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にある）、Ｃ２−Ｃ４アルケニレン、Ｃ２−Ｃ４アルキニレン、１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、１個〜４個のアミド基−ＣＯ−ＮＨ−を間に挟む直鎖又は分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、ヌクレオチドセグメント及び／又は糖セグメントから選択され；
−Ｇはスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、ホスホルアミダイト、Ｃ２−Ｃ５アルキルイミデート、Ｃ６−Ｃ１０アリールイミデート、酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物及び酸臭化物、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドラジン類、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドロキシルアミン、カルボジイミド並びにパーフルオロ−フェノールからなる群から選択され；
−Ｌ’は単結合、Ｃ１−Ｃ１０アルケニレン又は１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖若しくは分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖から選択され；かつ
−ＡはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチル、ホスフェート基、又はスルホネート基から選択される基を表す）
の化合物に関する。
【００２０】
好ましくは、Ａはメチル、プロピルスルホネート、エチルスルホネート、又はメチル−ホスフェートである。
【００２１】
好ましいＣ６−Ｃ１６アリーレン基は、ベンゼン、ナフタレン、及びアントラセンから選択される。
【００２２】
本発明中では、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」という言葉は、１個〜４個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐炭化水素基又はシクロアルキルを表すのに用いられる；例えばメチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソプロピル等を挙げることができる。
【００２３】
本発明中では、「Ｃ２−Ｃ４アルケニレン」は２つの炭素原子間に二重結合を含有する、２個〜４個の炭素原子の直鎖炭素鎖を意味すると理解されたい。
【００２４】
本発明中では、「Ｃ２−Ｃ４アルキニレン」は、２つの炭素原子の間に三重結合を含有する、２個〜４個の炭素原子の直鎖炭素鎖を意味すると理解されたい。
【００２５】
本発明中では、「Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン」は、２つの炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する２個〜１０個の炭素原子の直鎖炭素鎖を意味すると理解されたい。
【００２６】
好ましくは、本発明の文脈では、１個〜１０個の酸素原子を間に挟む（interrupted by）直鎖又は分岐の飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖は、ポリ（エチレンオキシド）又はポリ（プロピレンオキシド）であり、その単位は１回〜６回繰り返す。
【００２７】
ヌクレオチドセグメントは、１つ又は複数のヌクレオチドを含有する直鎖を意味すると理解されたい。
【００２８】
糖セグメントは１つ又は複数の糖単位を含有する直鎖を意味すると理解されたい。
【００２９】
基Ｒ１〜Ｒ７の選択により化合物の性質（例えばその蛍光発光波長、その蛍光量子収率、その溶解度及びその双極子モーメント）を改変することが可能である。
【００３０】
本発明による化合物の特定の族は一般式（Ｉ）の対称な化合物を含む、すなわち、Ｒ２及びＲ５は同一であり、Ｒ３及びＲ６は同一であり、Ｒ４及びＲ７は同一であり、並びにＳ１及びＳ２は同一であり、その場合にはＲ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚを有する。
【００３１】
ここから先では、一般式（Ｉ）の化合物は、式Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚとも表される。ここで、Ｐは一般式（Ｉ）の化合物全体を表す（ただし−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ基、又は−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ基である置換基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７は除く、ここでＡｒ、ｍ及びＺは上と同じ定義を有する）。
【００３２】
一般式（Ｉ）の化合物は、生体分子へ容易にグラフトすることを可能にするのに加えて、以下の数多くの利点を示す：
−強い蛍光強度で発光し、タンパク質のような生体分子に付着しているときにはこの強度を失わない；
−ポリペプチド又はポリヌクレオチドを調製する際の固相合成の段階に化学的に強い；
−付着する生体分子の性質を乱さない。
【００３３】
本発明による化合物Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚの合成は合成中間体のジピロメテン−ホウ素誘導体から行われる。この合成中間体は、二フッ化化合物ＤＦＭＢを、式Ｓ１−ＭｇＸ、Ｓ１−ＬｉＸ、Ｓ２−ＭｇＸ、又はＳ２ＬｉＸのグリニャール有機金属試薬（有機マグネシウム又は有機リチウム、ここで、Ｘはハロゲン原子である）と国際特許出願である特許文献４に記載の条件下で反応することにより得られる；この反応により、Ｓ１基及びＳ２基を二フッ化化合物ＤＦＭＢに導入することが可能となる。
【００３４】
この合成中間体は式Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑを有し、ここでＰ、ｍ及びＡｒは式（Ｉ）に定義されるとおりであり、Ｑはハロゲン原子、特にＩ、Ｂｒ又はＣｌ；−Ｏ−トリフレート基（トリフレートは式−Ｏ−ＳＯ２−ＣＦ３を有し、Ｔｆとも表される）、−Ｏ−トシレート基（トシレートは式−Ｏ−ＳＯ２−Ｃ６Ｈ６−ＣＨ３を有し、Ｔｓとも表される）又は−Ｏ−メシレート基（メシレートは式−Ｏ−ＳＯ２−ＣＨ３を有し、Ｍｓとも表される）から選択される。
【００３５】
この合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑから出発し、基−Ｑは、一酸化炭素源との反応又は一酸化炭素との反応により、以下の存在下でカルボニル基へと変換される：
−所望のカルボニル基の種類（nature）により選択される求核剤：カルボン酸を得るには水、エステルを得るにはアルコール、アミドを得るにはアミン、チオエステルを得るにはチオール、及び
−パラジウム系（paradium−based）触媒、例えばＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２。
【００３６】
この合成のスキームは図１に示す。
【００３７】
この反応に用いられる一酸化炭素は、標識されていなくてもよく、１％〜９９％で調節可能な標識率の１３Ｃ原子で標識されていても（ＮＭＲモニタリング）、又は１４Ｃ原子で標識されていてもよい（放射線モニタリング）；このような標識により、本発明による蛍光性化合物（Ｉ）で標識された生体分子の補助的なモニタリングが可能になる。
【００３８】
既にＳ１基及びＳ２基をホウ素上に含有する合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑにカルボニル基−ＣＯ−Ｚを導入する必要がある；実際には、カルボニル基の存在は、Ｓ１及びＳ２の付加に必要な有機金属化合物の使用と両立可能ではない。
【００３９】
カルボニル基がＲ１である場合の、一般式（Ｉ）の化合物の調製の１つの具体例は実施例１に説明される。
【００４０】
同様に、カルボニル基はＲ３又はＲ４又はＲ７又はＲ６の位置に、もしこれらの位置に、上に定義されるような−Ｑ基を保持するならば、パラジウムで触媒されるカップリングの手段で、一酸化炭素、又は他の一酸化炭素源の存在下で直接導入され得る。
【００４１】
それゆえ、本発明の１つの主題は、水、アルコール、アミン又はチオールから選択される求核剤及びパラジウムを含有する触媒の存在下での一酸化炭素との反応により合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑを一般式（Ｉ）の化合物へと変換することを含むことを特徴とする、一般式（Ｉ）の化合物を調製する方法に関する；上記合成中間体は、Ｐが、基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７がＲ１の−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、若しくはＲ３若しくはＲ４若しくはＲ６若しくはＲ７の−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚに依存することを除いては、同様に調製される一般式（Ｉ）の化合物の構造と同一構造の基であり、Ａｒは式（Ｉ）に定義された通りであり、ｍは０又は１であり、もしＲ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚならばｍは１であることが理解され、Ｑはハロゲン原子、−Ｏ−トリフレート、−Ｏ−トシレート又は−Ｏ−メシレートから選択される。好ましい実施の形態では、Ｒ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚである。
【００４２】
また、本発明の主題は、一般式（Ｉ）の化合物の蛍光性マーカーとしての使用でもある。
【００４３】
そのカルボニル基のために、式（Ｉ）の化合物は、アミノ酸、タンパク質、ビオチン又はその誘導体若しくはその構造類縁体の一つ又はヌクレオチドのような生体分子に容易にグラフトされる。
【００４４】
また、もう１つのその主題によると、本発明は一般式（ＩＩ）の標識された生体分子に関する（ここから先では「標識された生体分子」と呼ぶ）：
Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ （ＩＩ）
（式中、
−Ｐ、Ａｒ及びｍは、上に定義されるとおりであり、ｍは０又は１であり、もし、
−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ基がＲ１で置換されていればｍは１であることが理解され；
−Ｘはカルボキシル基、アミン基又はチオール基を有するスペーサーである（例えば、１個〜３個のアミノ酸を含む鎖、又はさらには２個又は３個の酸素原子を間に挟んでもよく、蛍光体及び生体分子にアミド基、エーテル基、エステル基、若しくはチオエステル基、又はジスルフィド架橋で共有結合するＣ１−Ｃ６アルキレン）；
−ｎは０又は１に等しい整数であり、
−Ｔは生体分子である。
【００４５】
本発明の文脈では、スペーサーは蛍光体Ｐから生体分子Ｔを離す役割を果たす。好ましくは、スペーサーは化学的に不活性であり、言い換えれば離す基のいずれとも反応しない；特に、蛍光体の蛍光性及び生体分子の生物学的活性に影響しない。
【００４６】
生体分子として、Ｔは、天然又は合成のアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、ビオチン若しくは誘導体、又はその構造類縁体、ヌクレオチド又は核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）から選択される。Ｔがアミノ酸の場合、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート又はアスパラギン酸、システイン、グルタメート又はグルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択される。好ましくは、Ｔはリシン又はグリシンから選択される。
【００４７】
Ｔがヌクレオチドの場合、アデノシン、ウリジン、グアノシン、シチジン、若しくはリボチミジンのようなリボヌクレオチド、又はデオキシアデノシン、デオキシウリジン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、若しくはデオキシリボチミジンのようなデオキシリボヌクレオチドから選択される。
【００４８】
標識された生体分子は以下の方法により調製される。
【００４９】
Ｔがアミノ酸又はタンパク質である場合、一般式（ＩＩ）の標識された生体分子の調製は、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された一般式（Ｉ）の化合物から行われる；上記化合物（Ｉ）は（ｉ）ヒドロスクシンイミド又はテトラフルオロフェニルエステルに変換され、次に（ｉｉ）アミノ酸又はタンパク質と反応する（Guide to Labeling Proteins with Fluorescent Dyes - Note 7.1 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/）。
【００５０】
ペプチドカップリングは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ、実施例１を参照）によっても行われ得る。
【００５１】
工程（ｉｉ）では、ＢＯＣ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ｂｐｏｃ（２−（４−ビフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル）、Ｎｐｓ（２−ニトロフェニルスルフェニル）又はＤｔｓ（ジチア−スクシノイル）のような保護基、すなわちアミノ酸のアミン基（ポリペプチドの形成に関わる）に導入される保護基に既に連結したアミノ酸を用いるのが有利であり得る；実際、そのように保護されていることで、標識されたアミノ酸は、続いて、ペプチドの固相合成の標準技法に用いることができる（Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154）。この合成から、アミノ酸の少なくとも１つに蛍光体が存在することにより蛍光性ポリペプチドが得られる。
【００５２】
本発明の１つの変形形態によると、Ｔは、ビオチン、又はその誘導体若しくはその構造類縁体の１つである。その場合、一般式（ＩＩ）の標識された生体分子の調製は、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された一般式（Ｉ）の化合物から行われる；上記化合物（Ｉ）は（i）脂肪族ジアミン（これは１，６−ジアミノへキサン、１，３−ジアミノプロパン又は１，２−ジアミノエタンであり得る）との加水分解反応によりアミドへと変換され、次に（ｉｉ）当業者に既知の任意の標準方法で、ビオチン又は遊離カルボン酸基を保持するその誘導体若しくは構造類縁体の１つと反応する。
【００５３】
本発明のもう１つの変形形態では、Ｔはヌクレオチドである。一般式（ＩＩ）の標識された生体分子の調製は、次に、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された一般式（Ｉ）の化合物にから行われる；上記化合物（Ｉ）は、当業者に既知の任意の標準方法で、遊離アミン基を有する修飾されたヌクレオチドと反応する。
【００５４】
この標識されたヌクレオチドは、次に、有利には標識されたオリゴヌクレオチドの合成に用いられる。
【００５５】
オリゴヌクレオチド合成にはいくつかの手法がある；Merrifieldによってペプチド合成のために提唱された合成法にインスピレーションを得た固相オリゴヌクレオチド合成を特に参照することができ、又は、さらには、ホスホルアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成（Matteucci, M. D.; Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett. 1980, 21, 719-722； Matteucci, M. D.; Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3185-3191）も参照される。
【００５６】
標識された生体分子とリガンドとの相互作用は、該分子の蛍光発光スペクトルの変化につながる；検出法の発達はこの性質に由来する。
【００５７】
この性質に由来するもう１つの利点は、検出法は、本発明による蛍光体単独で実施することができ、例えば、タンパク質同士の相互作用の測定のためのＦＲＥＴ法（蛍光共鳴エネルギー移動については、Lopper et al., Protein-protein interactions: identification, 2007, Encyclopedia of Life Scienceを参照）又はリアルタイムＰＣＲ（Poitras et al., La PCR en temps reel : principeset applications, 2002, Reviews in Biology and Biotechnology, vol. 2, N°2, p.2-11）のような手法の場合のように、いくつかの蛍光体の組み合わせ、又は蛍光体−消光剤（fluorescence suppressor）の対を必要としないことである；しかしながら、これらの手法は、本発明による蛍光体の使用を排除するものではない。
【００５８】
本発明の文脈では、リガンドは、サンプル中のその存在又は非存在が検出される分子である；生体分子は、リガンドと相互作用する性質により選択される。
【００５９】
蛍光体の発光スペクトルは、当業者に既知の任意の標準方法で測定することができる。好ましくは、蛍光発光スペクトルは、蛍光スペクトロメーター又はスペクトル検出器を備えた顕微鏡装置の手法を用いて測定される；スペクトルはＸ軸に波長、Ｙ軸に光強度を有するグラフで表される。
【００６０】
それゆえ、異なる条件下で（テストサンプルの存在／非存在下で）標識された生体分子の蛍光スペクトルの異方性指数を測定することが可能である。
【００６１】
スペクトルの異方性指数（スペクトル指数又は変形指数（deformation index）とも呼ばれる）は、主蛍光発光ピーク位置との相関でスペクトルの非対称性を表す指数を意味すると理解されたい。
【００６２】
測定されたスペクトルの異方性指数を決定するために、スペクトルは非線形減衰法を用いた逆重畳積分（deconvolution）により成分ガウス曲線に分解することからなる分析に付す。これらのガウス曲線（ピークの位置、振幅、面積及び分散）の特徴を計算する：
−ピークの位置は最大光強度を観測することのできる波長に対応する；
−振幅はピークの光強度である；
−面積は曲線下の光強度の積分である；
−分散は波長で表現される曲線の半値幅（half-height width）である。
【００６３】
同一のスペクトルでは、２つの主要ガウス曲線の振幅の割合又は面積の割合により、蛍光スペクトルの変形指数をスペクトルが記録される条件の関数として定義することが可能である。サンプルの存在／非存在下で測定したスペクトルの、変形指数の値の変化によりリガンドの存在を検出し、その比を算出することが可能である。
【００６４】
１つの変形形態では、スペクトルの異方性は、バンドパス光学フィルター（band pass optical filters）によっても測定可能である。スペクトルの変形指数は、続いて、異なるバンドパスフィルターにより測定した蛍光強度の割合を用いて算出される。
【００６５】
それゆえ、もう１つのその主題によると、本発明はサンプル中で、一般式（ＩＩ）の標識された生体分子のリガンドを検出する方法であって、
ａ）テストサンプル単独での蛍光発光スペクトルを測定する工程（得られたスペクトルは「ベースライン」と称する）
ｂ）溶液中での標識された生体分子の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、変形指数を計算する工程、
ｃ）上記標識された生体分子を、試験されるサンプルと溶液中でインキュベートし、そして、混合物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた混合物の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、変形指数を計算する工程、並びに
ｅ）工程ｂ）及び工程ｄ）で計算した変形指数を比較し、そして、該指数が異なる場合には、リガンドと標識された生体分子との間の相互作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出する方法に関する。
【００６６】
好ましくは、工程ｂ）で、生体分子は標識された分子の蛍光スペクトルが生体サンプルの存在下で測定されるのと同じ組成の溶液中に存在する。
【００６７】
本発明の１つの変形形態では、検出法によりサンプル中のリガンドを定量することも可能である。これを行うためには、スペクトルの変形指数の値の検量線（a calibration curve）を、リガンドの量の関数として先に作成する。
【００６８】
加えて、リガンドが異なる立体配座をとるならば、（その三次元の配座が、おかれる環境に依存して変化し得る、これはペプチドの場合にも同様であり得る）、リガンドと複合体を形成した標識された生体分子の蛍光スペクトルは、リガンドの配座に依存して異なる；この性質により、リガンドの定性的検出のための方法を行うことが可能になる。
【００６９】
サンプルは生物由来でもよい、すなわち、臓器、組織、細胞、微生物等の全て又は部分を表す。
【００７０】
サンプルはまた、どのような種類のものでもよく、例えば、限定されるものではないが、食品であり得る。食品では、望ましくない又は病原性でさえある微生物のような汚染物質、農薬のような毒素又は汚染因子等が存在しないことを試験することが望ましい。
【００７１】
本発明による検出法の実施は、疾患の診断にも有用であり得る。
【００７２】
それゆえ、アルツハイマー病のような神経変性疾患の診断のための方法が発達してきた。
【００７３】
寿命が一般的に延びたことは、神経変性疾患の、及び、特に、アルツハイマー病の有病率の増大に有利に働いた。このような状態は現代社会に大きな社会問題及び経済問題を打ち立てた。医療イメージング及び神経心理学試験と組み合わされた臨床試験では、疾患の終末期における遅い診断が可能になるだけであり、決定的な診断は、死後に行われる脳組織の試験によってのみ得られるが、それは満足のいくものではない。それゆえ、非侵襲的な疾患の診断を可能にするであろう周辺の生物学的マーカーを同定する多様なルートが探索された。
【００７４】
アルツハイマー病では赤血球が変化していることが示されている；この変化は、細胞内カルシウム濃度の脱調節によって引き起こされ得るタンパク質キナーゼＣの異常配座と考えられている（Janoshazi et al. Neurobiol. Aging 2006, 27: 245-251）。
【００７５】
加えて、アルツハイマー病の過程で神経組織及び血液中で生産されるヒトβ−アミロイドペプチドは、赤血球の表面と相互作用し、カルシウム恒常性を変化させる可能性があることが示されている（Mattson MP et al. Brain Res 1997, 771: 147-153）。
【００７６】
本発明の文脈で実施された試験では、先に低濃度の標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下に置かれた赤血球のような生細胞は、続いて本発明に記載の蛍光体を有するβ−アミロイドペプチドに結合しことができることが示される；この結合は蛍光体の蛍光スペクトルの特異的な変形を伴い、先に細胞が曝露された標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の濃度を算出することを可能にする。それゆえ、個体の体内を循環するヒトβ−アミロイドペプチド１−４２を定量することが可能である。
【００７７】
より詳細には、アルツハイマー病の診断法では、本発明による検出法を実施する；それにより下記のようなサンプル中のβ−アミロイドペプチド１−４２の量を算出するのが可能になる：
−赤血球を含む生物学的サンプル、例えば血液；及び
−標識された生体分子はＴがβ−アミロイドペプチド１−４２に由来するペプチドであるようなものである。
【００７８】
β−アミロイドペプチド１−４２は、配列番号１の配列のペプチドである。
β−アミロイドペプチド１−４２の誘導体は、その１つ又は複数のアミノ酸が、本発明による一般式（Ｉ）の蛍光性化合物で標識された同じアミノ酸で置換された、ペプチドを意味すると理解されたい；この誘導体はまた、鎖の任意の部分に、１つ又は複数の標識されたアミノ酸の挿入を含み得る。
【００７９】
例として、β−アミロイドペプチド１−４２誘導体の調製が実施例１に記載されており、結果として以下のペプチドが得られる：
Ｈ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ＊−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１）、ただし、１６位のリシンに蛍光体を含む。
【００８０】
リシンではないアミノ酸は標識され、β−アミロイドペプチド１−４２の誘導体を調製するのに用いられ得る；これらは、好ましくは、アミン基又はカルボン酸基をその側鎖に有するアミノ酸である。
【００８１】
サンプル中で測定した蛍光スペクトルの変形指数の値を、次に検量線と比較することにより、テストサンプル中に存在するβ−アミロイドペプチド１−４２の割合を算出することが可能である。
【００８２】
この診断法の実施のため、健康な被検体に由来し、増加濃度のβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下で１８時間プレインキュベーションしたヒト赤血球を用いて検量線を作成した。次に、本発明による方法の工程ｅ）は、工程ｄ）で得られたスペクトルの変形指数をその検量線と比較することからなる。
【００８３】
それゆえ、この方法により、このペプチドと、血清アルブミンのような他の可溶性タンパク質との相互作用が引き起こす予想の難しさを克服し、循環するβ−アミロイドペプチド１−４２の量を算出することが可能になる。これは、簡便で速く、安価なアルツハイマー病の独自の診断手段を打ち立てる。また、予後診断のための手段、疾患に対する治療の有効性のモニタリングの手段、細胞株又は疾患の動物モデルの補助を伴うと治療薬の発達の手段も意味する。
【００８４】
本発明による方法のもう１つの実施の形態によって、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子のリガンドと相互作用することが可能な化合物の同定が可能となる。このような実施の形態は、
ａ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、溶液中での標識された生体分子の変形指数を計算する工程、
ｂ）上記標識された生体分子を溶液中でリガンドとインキュベートし、そして、混合物１を得る工程、
ｃ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、混合物１の変形指数を計算する工程、
ｄ）上記リガンドを上記試験される化合物とインキュベートし、続いて上記標識された生体分子を溶液中に添加し、そして、混合物２を得る工程、
ｅ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、混合物２の変形指数を計算する工程、
ｆ）工程ａ）、工程ｃ）及び工程ｅ）で計算された変形指数の比較により、リガンドと試験化合物との間の相互作用を検出する工程、
を含む。
【００８５】
そのように実施することで、この検出法により可能性のある治療薬を同定することが可能になり、又はさらには、そのような治療薬の有効性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで測定することが可能になる。
【００８６】
本発明はまた、本発明による検出法を実施するための診断キット又は試薬セットにも関する。これらのキットは、適切な内容物及び試薬、並びに取扱い説明書と共に、少なくとも１つの標識された本発明による一般式（ＩＩ）の生体分子を含むことを特徴とする。
【００８７】
ここで、本発明を、図面及び以下の実施例を参照してより詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は単に本発明の主題を説明する目的で与えるものであり、限定するものではないことを明確に理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明による一般式（Ｉ）の化合物を合成するためのスキームを示す図である。
【図２】実施例１に記載の化合物１ａ−ｄ〜６ａを導く合成スキームを示す図である（ＴＥＡ＝トリエチルアミン）。
【図３】実施例１に記載の化合物６ａ１３−ｂ及び７ａ、７ａ１３及びｂを導く合成スキーム（ＥＤＣＩ＝Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド及びＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を示す図である。
【図４】実施例３の条件下での蛍光発光スペクトルの測定を説明する図である。グラフＡは、化合物７ａに連結したβ−アミロイドペプチドの蛍光スペクトルを示し、グラフＢは、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２を有する細胞のプレインキュベーション前（実線）及びプレインキュベーション後（点線）にＰＣ１２細胞の存在下で記録した、化合物７ａに連結したβ−アミロイドペプチドの蛍光スペクトルの逆重畳積分を示す。
【図５】実施例４に説明されるような異なる濃度の標識されていないβ−アミロイドペプチド（Ａｂ）のプレインキュベーション後の、β−アミロイドペプチド１−４２に連結した化合物７ａのスペクトル指数の値を表すグラフである。
【図６】実施例５に説明されるような標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２とプレインキュベートされたラット赤血球の存在下の化合物７ａに連結したβ−アミロイドペプチド１−４２のスペクトル指数の変化を示すヒストグラムである。
【実施例】
【００８９】
実施例１−Ｒ１が−Ａｒ−ＣＯ−Ｚである本発明による一般式（Ｉ）の化合物の調製
この実施例の化合物１ａ−ｄ〜７ａ−ｂは、現在最も使用されている蛍光体とのスペクトルの対応で選択された。（記号ａ：フルオレセイン、記号ｂ：ローダミン６Ｇ；記号ｃ：ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）及び記号ｄ：ＴＯＴＯ−３）
化合物１ａ−ｄ〜６ａを導く合成スキームが図２に示される。
【００９０】
化合物１ａ−ｄは、国際特許出願である特許文献４に示される操作手順に従い、ＴＨＦ中６０°Ｃでのメトキシエトキシエチニル有機金属（グリニャール試薬）の対応する二フッ化物（米国特許第４，７４４，３３９号に記載されるように調製可能）との反応によって得られる。
【００９１】
化合物１ａ−ｄが有するヨウ素を、次に、一酸化炭素雰囲気下、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２触媒の存在下で、トリエチルアミン及びベンゼンの混合溶媒中、７０℃でカルボニル基へと変換する。用いる求核剤の選択により、次に生体分子へのカップリングに用いることができる数多くの官能基を直接得ることが可能になる：
−エタノールを用いると、エチルエステル２ａ−ｄが非常に良い収率で得られる；
−過剰量の脂肪族ジアミンを用いることにより、タイプ４の化合物を得ることができる；
−遊離アミンを有し、カルボン酸基が保護されたアミノ酸（例えば、グリシンのエチルエステル）が直接用いられた場合、アミノ酸は直接導入され、タイプ５の化合物を与えることができる。
【００９２】
化合物３ａ−ｄから出発し、図３に示された合成スキームによる化合物７ａ、ａ１３、ｂが得られる。指数「１３」を有する化合物は、１３Ｃで標識されている。
【００９３】
化合物２ａ−ｄのエステル基は、エタノール中、苛性ソーダの存在下で鹸化され、対応するカルボン酸３ａ−ｄを得ることができる（図２を参照されたい）。これらのカルボン酸は、生体分子の標識に直接用いるか、又は、アミノ酸タイプのスペーサーに連結することができる（図３の合成スキームに示したように、下の化合物６ａ−ｂに用いられるペプチドカップリング手法でグラフト化）。
【００９４】
それらをペプチド合成装置で使用可能にするため、化合物３ａ−ｂを、標準ペプチド合成（ＥＤＣ、ＤＭＡＰ）でグリシンエステルと結合する。この工程により、必要であれば、ＮＭＲ追跡が可能になるように例えば１３Ｃ原子で標識されたフラグメント（化合物５ａ１３）を導入することが可能になる。
【００９５】
得られた化合物５ａ−ｂは、次に、カルボン酸６ａ−ｂに鹸化される。
【００９６】
酸６ａ−ｂは、ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換され、これは直接リシン−Ｆｍｏｃと反応する。
【００９７】
化合物７ａ−ｂは、標識されたアミノ酸Ｌｙｓをペプチド合成装置に導入するのに直接用いることができる。
化合物２ａの調製
化合物２ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【００９８】
【化３】
【００９９】
化合物１ａ（２３５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１５ｍＬ）に、１ｍＬのエタノール（１７．２ｍｍｏｌ）、４４ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０７ｍｍｏｌ）及び５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９９：１又はＡｃＯＥｔ／石油エーテル ４０：６０）、化合物２ａ（２１０ｍｇ、９７％）をオレンジ色の粉末の形態で得た。
化合物２ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝１．３３（ｓ，６Ｈ），１．４２（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．３５（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），４．４０（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．００（ｓ，２Ｈ），７．７８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．５Ｈｚ，ν０δ＝３００．４Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ，）：δ＝１４．４，１４．８，１６．１，５９．０，５９．７，６１．４，６８．４，６８．６，７１．８，９０．９，１２１．８，１２８．６，１２９．１，１３０．３，１３１．０，１４０．３，１４０．３，１４０．９，１５５．６，１６６．１；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．２（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５００（９０ ０００），３６６（４９００），３０８（７７００）；
ＦＡＢ＋ ｍ／ｚ：５８５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００）；
Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４１ＢＮ２Ｏ６：Ｃ，６９．８６；Ｈ，７．０７；Ｎ，４．７９。実測値：Ｃ，６９．７７；Ｈ，７．０４；Ｎ，４．５９。
化合物２ｂの調製
化合物２ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１００】
【化４】
【０１０１】
化合物１ｂ（９８０ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（５０ｍＬ）に、３ｍＬのエタノール（１７．２ｍｍｏｌ）、２４０ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０７ｍｍｏｌ）及び１５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０°Ｃで一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ２０：８０；４０：６０）、化合物２ｂ（８９５ｍｇ、定量的）をオレンジ色の粉末の形態で得た。
化合物２ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：０．９７（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．４０Ｈｚ），１．２３（ｓ，６Ｈ），１．４３（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．１０Ｈｚ），２．３１（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．４０Ｈｚ），２．６９（ｓ，６Ｈ），３．３５（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），４．４３（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１０Ｈｚ），７．７８（ＡＢｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．１９Ｈｚ，ν０δ＝２２３．０７Ｈｚ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１２．０３，１４．０７，１４．４１，１４．７６，１７．４０，２９．７８，５９．０２，５９．７９，６１．３７，６８．５７，７１．８５，９０．６７，１２８．６０，１２８．９５，１３０．１９，１３０．８１，１３３．１１，１３６．０２，１３８．７７，１４１．２７，１５４．０５，１６６．２８。
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．２（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５２２（８０ ０００），４８８（２０ ０００），３８１（６４００），２７７（６４００）。
化合物２ｃの調製
化合物２ｃを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０２】
【化５】
【０１０３】
化合物１ｃ（１００ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（２５ｍＬ）に、１ｍＬのエタノール、２４ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド及び５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×１０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ８０：２０；１００％）、化合物２ｃ（８８ｍｇ、９２％）を青色の粉末の形態で得た。
化合物２ｃの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ２００ＭＨｚ）：１．４０（ｓ，６Ｈ），１．４４（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝１０．５Ｈｚ），３．１５（ｍ，４Ｈ），３．１９（ｓ，６Ｈ），３．４１（ｓ，６Ｈ），３．５０（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．８８（ｍ，４Ｈ），４．１５（ｓ，４Ｈ），４．１８（ｍ，４Ｈ），４．４１（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝１０．５Ｈｚ），６．６２（ｓ，２Ｈ），７．２７（ＡＢ ｓｙｓ，８Ｈ，ＪＡＢ＝８．７３Ｈｚ、ν０δ＝１２０．７３Ｈｚ），７．６０（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝１６．２６Ｈｚ、ν０δ＝１９２．６３Ｈｚ），７．８３（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．３４Ｈｚ、ν０δ＝１４１．８９Ｈｚ）．
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝６４７（１２１ ０００），３７３（７２ ８００）。
化合物２ｄの調製
化合物２ｄを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０４】
【化６】
【０１０５】
化合物１ｄ（１００ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（２５ｍＬ）に、２ｍＬのエタノール、２４ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０７ｍｍｏｌ）及び５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×１０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ２０：８０；４０：６０）、化合物２ｄ（８２ｍｇ、８８％）を紫色の粉末の形態で得た。
化合物２ｄの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．３５（ｓ，３Ｈ），１．３８（ｓ，３Ｈ），１．４３（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．１５Ｈｚ），２．７４（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．３１（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．５４（ｍ，６Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｍ，４Ｈ），４．４３（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．６７Ｈｚ、ν０δ＝１８０．１８Ｈｚ）；７．５８（ＡＢ ｓｙｓ，２Ｈ，ＪＡＢ＝１６．２９Ｈｚ、ν０δ＝２９７．７２Ｈｚ），７．８５（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝７．９９Ｈｚ、ν０δ＝２２６．２８Ｈｚ）。
化合物の調製３ａ
化合物３ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０６】
【化７】
【０１０７】
化合物２ａ（２１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に２１５ｍｇの苛性ソーダ（５．３９ｍｍｏｌ）を加えた。３時間、周囲温度で溶液を攪拌した。３０ｍＬ〜４０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出した。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。
【０１０８】
水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（１９０ｍｇ、９５％）。
化合物３ａの特性分析
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５０１（７２ ８００），３６６（４０００），３０７（６４００）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝４９４（７１ ５００），３６４（３９００），３０７（４９００）。
化合物３ｂの調製
化合物３ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０９】
【化８】
【０１１０】
化合物２ｂ（８４０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍＬ）に２．１０ｇの苛性ソーダ（０．５２５ｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩、溶液を攪拌した。３０ｍＬ〜４０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ｂをオレンジ色の粉末の形態で得た（７７８ｍｇ、９７％）。
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５１７（６５ ０００），３７８（３６００），３２０（５０００）。
化合物３ｃの調製
化合物３ｃを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１１】
【化９】
【０１１２】
化合物２ｃ（８０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に１３０ｍｇの苛性ソーダ（３．２２ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩、溶液を攪拌した。１０ｍＬ〜２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×１０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ｃを青色の粉末の形態で得た（７０ｍｇ、９０％）。
化合物３ｃの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．４１（ｓ，６Ｈ），３．１５（ｍ，４Ｈ），３．２０（ｓ，６Ｈ），３．４１（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６０（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｍ，４Ｈ），４．１７（ｓ，４Ｈ），４．２２（ｍ，４Ｈ），６．６３（ｓ，２Ｈ），７．２８（ＡＢ ｓｙｓ，８Ｈ，ＪＡＢ＝８．６Ｈｚ，ν０δ＝１２０．５９Ｈｚ），７．６１（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝１６．１２Ｈｚ，ν０δ＝１９１．４４Ｈｚ），７．８８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．１９Ｈｚ，ν０δ＝１４４．７３Ｈｚ）。
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝６４７（１１８ ０００），３７３（６７ ８００）。
化合物３ｄの調製
化合物３ｄを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１３】
【化１０】
【０１１４】
化合物２ｄ（８０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に１６２ｍｇの苛性ソーダ（４．０５ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩、溶液を攪拌した。１０ｍＬ〜２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×１０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ｄをオレンジ色の粉末の形態で得た（７０ｍｇ、９０％）。
化合物３ｄの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．３６（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｓ，６Ｈ），３．３２（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｍ，６Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｍ，６Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．６７Ｈｚ，ν０δ＝１８０．１８Ｈｚ）；７．５８（ＡＢ ｓｙｓ，２Ｈ，ＪＡＢ＝１６．２９Ｈｚ，ν０δ＝２９７．７２Ｈｚ），７．８５（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝７．９９Ｈｚ，ν０δ＝２２６．２８Ｈｚ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１４．８６，１５．０８，１６．３７，２９．７９，５８．９１，５９．１８，５９．５８，６７．６３，６８．４１，６９．７９，７０．８８，７１．６９，７２．０５，９１．４３，１２８．７６，１２９．０６，１２９．６９，１３０．１５，１３０．４４，１３０．８６，１３４．１０，１３８．６５，１４０．３９，１４０．５９，１４１．２５，１５２．６１，１５５．５４，１５９．６１，１７０．４０。
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５６４（７０ ０００），３３８（２５ ０００）。
化合物４ａの調製
化合物４ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１５】
【化１１】
【０１１６】
化合物１ａ（２００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１５ｍＬ）に１ｍＬのエチレンジアミン（１５ｍｍｏｌ）、６６ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０９ｍｍｏｌ）及び１ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＣＨ２Ｃｌ２ １００％→ＣＨ２Ｃｌ２ ７５：２５のグラディエント）、化合物４ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（１６０ｍｇ、８０％）。
化合物４ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ＝１．３４（ｓ，６Ｈ），２．７２（ｓ，６Ｈ），３．０１（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．３６（ｓ，６Ｈ），３．５５（ｍ，６Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｓ，４Ｈ），６．０１（ｓ，２Ｈ），６．９８（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．６９（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．３Ｈｚ，ν０δ＝１６２．７Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．４ＭＨｚ，）：δ＝１５．０，１６．２，４１．３，４２．２，５９．１，５９．８，６８．７，７１．９，９０．６，１２１．９，１２７．９，１２８．８，１２９．４，１３４．９，１３９．１，１４０．４，１４１．０，１５５．７，１６７．０；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．３（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５００（６４ ５００），３７１（５６００）
ＦＡＢ＋ ｍ／ｚ：５９９．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００）；
Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４３ＢＮ４Ｏ５：Ｃ，６８．２３；Ｈ，７．２４；Ｎ，９．３６。実測値：Ｃ，６７．８４；Ｈ，７．０７；Ｎ，９．２２。
化合物５ａの調製
化合物５ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１７】
【化１２】
【０１１８】
化合物１ａ（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（６ｍＬ）に８０ｍｇのグリシンエチルエステル（０．４７ｍｍｏｌ）、２２ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０３ｍｍｏｌ）及び２ｍＬのトリエチルアミンを加えた。８０℃で、一酸化炭素を「吹き込む」ことで６時間溶液を攪拌した。反応混合物をセライト濾過し、部分的に蒸留した。残渣をジクロロメタンで抽出し、水（２×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ５０：５０）、化合物５ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（４３ｍｇ、４３％）。
化合物５ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ＝１．３３（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３４（ｓ，６Ｈ），２．７２（ｓ，６Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｓ，４Ｈ），４．２７（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝４．５Ｈｚ），４．２９（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ），６．０１（ｓ，２Ｈ），６．７７（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝４．９Ｈｚ），７．６９（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．３Ｈｚ，ν０δ＝１５６．４Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．４ＭＨｚ，）：δ＝１４．３，１４．９，１６．２，４２．１，５９．１，５９．８，６１．９，６８．７，７１．９，９１．０，１２１．９，１２７．９，１２９．０，１２９．３，１３４．２，１３９．５，１４０．２，１４１．０，１５５．８，１６６．７，１７０．２；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．３（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５０１（８４ ２００），３６６（４２００），３０９（６５００）。
化合物６ａの調製
化合物６ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１９】
【化１３】
【０１２０】
化合物５ａ（４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１０ｍＬ）に、苛性ソーダ（６０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。２時間周囲温度で溶液を攪拌した。１０ｍＬ〜２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（２×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。生成物をジクロロメタンで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物６ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（３５ｍｇ、９０％）。
化合物６ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝１．３２（ｓ，６Ｈ），２．７２（ｓ，６Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），４．２７（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝３．４Ｈｚ），４．８７（ｂ，１Ｈ），６．０１（ｓ，２Ｈ），７．０４（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．６９（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝６．０Ｈｚ，ν０δ＝１６０．２Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ，）：δ＝１４．９，１６．２，４２．０，５９．０，５９．７，６８．６，７１．８，９０．９，１２１．９，１２８．０，１２９．０，１２９．３，１３３．８，１３９．６，１４０．２，１４０．９，１５５．８，１６７．３，１７２．３；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．２（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５０１（６５ ０００），３６６（３８００），３０９（５９００）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝４９６（５９ ６００），３６７（４１００），３０８（６１００）。
化合物７ａの調製
化合物７ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２１】
【化１４】
【０１２２】
化合物６ａ（２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）に０℃で、１２ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（０．０６ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を一晩、氷浴を周囲温度まで戻しながら攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、１Ｍ塩酸溶液（２×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解した。この溶液にアセトニトリル／水混合物（５ｍＬ／１ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１６ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。溶液を周囲温度で１時間攪拌し、次に酢酸エチルで抽出した。有機相を水（２×２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。残渣を溶出シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ＡｃＯＥｔ １００％→ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ ９０：１０のグラディエント）。水相を集め、１Ｍ塩酸溶液でｐＨ１まで酸性にし、ジクロロメタンで抽出した。生じた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。異なるフラクションをそれぞれ集め、オレンジ色の粉末の形態で化合物７ａを得た（２５ｍｇ、６４％）。
化合物７ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ＝１．２７（ｓ，６Ｈ），１．３５−１．８２（ｍ，６Ｈ），２．６７（ｓ，６Ｈ），３．２１−３．３１（ｍ，８Ｈ），３．４９（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｍ，４Ｈ），３．９９−４．３６（ｍ，１０Ｈ），５．９５（ｓ，２Ｈ），７．２２−７．３９（ｍ，６Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．９３（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝７．７Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．４ＭＨｚ，）：δ＝１４．７，１６．０，２３．４，２８．６，３１．５，３１．９，３９．１，４３．３，５３．６，５８．９，５９．６，６７．０，６８．５，７１．７，９０．７，１１８．８，１２０．０，１２１．８，１２３．３，１２５．１，１２７．１，１２７．８，１２８．０，１２９．２，１２９．８，１３３．９，１３９．４，１４０．２，１４０．９，１４１．３，１４３．８，１４３．９，１５５．６，１５６．４，１６７．５，１６９．２；
ＥＳＩ ｍ／ｚ：９８６．４（［Ｍ＋Ｎａ］＋，１００）。
化合物５ａ１３の調製
化合物５ａ１３を以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２３】
【化１５】
【０１２４】
化合物３ａ（５７０ｍｇ、１．０２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に、０°Ｃで、２９４ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（１．５３７ｍｍｏｌ）及び１８７ｍｇのジメチルアミノピリジン（１．５３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。次に、この溶液に、１４２ｍｇの、炭素１３で標識されたグリシンエステル（１．１２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、水（２×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテルのグラディエント２０／８０、３０／７０、４０／６０で溶出する）で精製し、化合物５ａ１３をオレンジ色の粉末の形態で得た（５２７ｍｇ、８２％）。
【０１２５】
化合物の特性分析５ａ１３
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．３２（ｓ，６Ｈ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．０２（ｄ，１Ｈ，１Ｊ＝１４１．３Ｈｚ，３Ｊ＝４．４Ｈｚ），４．１８（ｓ，４Ｈ），４．５０（ｄ，１Ｈ，１Ｊ＝１４１．３Ｈｚ，３Ｊ＝４．４Ｈｚ），６．００（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），７．６８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８Ｈｚ，ν０δ＝１５９．５６Ｈｚ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１４．７２，１６，４１．７２，５２．４８，５８．８６，５９．５４，６８．４４，７１．６６，７６．５７，７７，７７．４２，１２１．６６，１２７．７８，１２８．７１，１２９．０６，１３３．８８，１３９．２４，１４０，１４０．７２，１５５．５１，１６６．５８，１６９．９７６，１７０．７９。
化合物６ａ１３の調製
化合物６ａ１３を以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２６】
【化１６】
【０１２７】
化合物５ａ１３（５００ｍｇ、０．７９５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３０ｍＬ）に苛性ソーダ（１．２７ｇ、３２ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。２時間周囲温度で溶液を攪拌した。２０ｍＬ〜３０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物６ａ１３をオレンジ色の粉末の形態で得た（４６４ｍｇ、９５％）。
化合物６ａ１３の特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：δ＝１．２９（ｓ，６Ｈ），２．７０（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｍ，４Ｈ），３．９３（ｓ，１Ｈ，１Ｊ＝１４０．６Ｈｚ），４．１７（ｓ，４Ｈ），４．３９（ｓ，１Ｈ，１Ｊ＝１４０．６Ｈｚ），７．６７（ＡＢ ｓｙｓ，Ｈ，ＪＡＢ＝７．７２Ｈｚ，ν０δ＝１７７．９５Ｈｚ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１４．７２，１５．４３，１６．０３，４２．２０，４３．０２，５４．９４，５８．３６，５８．８５，５９．５５，６８．４６，７１．６３，７６．５７，９０．７６，１２１．７４，１２７．９４，１２８．７４，１２９．０５，１３３．７０，１３９．３５，１３９．９４，１４０．６８，１４０．７８，１５５．２６，１５５．４８，１５５．５７，１６７．３５。
化合物７ａ１３の調製
化合物７ａ１３を以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２８】
【化１７】
【０１２９】
化合物６ａ１３（４３０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１２０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に０°Ｃで、２０７ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を一晩、氷浴を周囲温度まで戻しながら攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、１Ｍ塩酸溶液（３×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液にアセトニトリル／水混合物（１５ｍＬ／５ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（５６６ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１９３ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。溶液を周囲温度で２時間攪拌し、次に酢酸エチルで抽出した。有機相を水（３×２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ＡｃＯＥｔ １００％→ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ ９０：１０のグラディエントで溶出）。異なるフラクションをそれぞれ集め、オレンジ色の粉末の形態で化合物７ａ１３を得た（５３９ｍｇ、８０％）。
化合物７ａ１３の特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ ４００ＭＨｚ ６０°Ｃ）：δ＝１．１８（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｓ，６Ｈ），１．４０（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．２３（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝６．７２Ｈｚ）３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５１（ｍ，４Ｈ），３．６３（ｍ，４Ｈ），４．１４（ｓ，４Ｈ），４．１８（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝５．１０Ｈｚ），４．２１（ｄ，２Ｈ，１ＪＨＣ１３＝１４０Ｈｚ），６．０４（ｓ，２Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｍ，４Ｈ），７．６１（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），８．０１（ｄ，２Ｈ）。
化合物５ｂの調製
化合物５ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１３０】
【化１８】
【０１３１】
化合物３ｂ（６００ｍｇ、０．９７９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に、０°Ｃで、２８０ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（１．４７ｍｍｏｌ）及び１８０ｍｇのジメチルアミノピリジン（１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。次に、この溶液に、２０５ｍｇのグリシンエステル（１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、水（２×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテルのグラディエント２０／８０、３０／７０、４０／６０で溶出する）で精製し、化合物５ｂをオレンジ色の粉末の形態で得た（５６０ｍｇ、８２％）。
化合物５ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：０．９７（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．３５Ｈｚ），１．２２（ｓ，６Ｈ），１．３１（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１０Ｈｚ），２．２８（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．６８（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．１８（ｓ，４Ｈ），４．２５（ｍ，４Ｈ），６．８４（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝４．７Ｈｚ），７．７８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．５Ｈｚ，ν０δ＝３００．４Ｈｚ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１２．０８，１４．０５，１４．２５，１４．７５，１５．３４，１７．３８，２９．７２，４２．０５，５９，５９．７６，６１．８５，６８．５５，７１．８３，９０．６２，１２７．８１，１２８．６６，１２９．１６，１３３．１１，１３３．９１，１３６．０２，１３８．６０，１４０．２７，１５４．０４，１６６．８０，１７０．１４。
化合物６ｂの調製
化合物６ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１３２】
【化１９】
【０１３３】
化合物５ｂ（５１０ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍＬ）に、苛性ソーダ（１．２０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。２時間周囲温度で溶液を攪拌した。２０ｍＬ〜３０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物６ｂをオレンジ色の粉末の形態で得た（４９０ｍｇ、定量的）。
化合物６ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：δ＝０．９６（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．２２（ｓ，６Ｈ），２．３０（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．６８（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），３．５４（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ），４．１８（ｓ，４Ｈ），４．２６（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．１３（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．４０（ＡＢ ｓｙｓ，Ｈ，ＪＡＢ＝６．０Ｈｚ，ν０δ＝１６０．２Ｈｚ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１２．０８，１４．０３，１４．７３，１７．３５，４１．９３，５８．９１，５９．７１，６８．４８，７１．７４，９０．５１，１２７．９０，１２８．６０，１２９．１８，１３３．１４，１３３．５７，１３６．０１，１３８．５４，１４０．３９，１５４．０４，１６７．３５，１７２．２９。
化合物７ｂの調製
化合物７ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１３４】
【化２０】
【０１３５】
化合物６ｂ（４３０ｍｇ、０．６４３ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１２ｍｇ、０．９６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に０℃で、１９０ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（０．９６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を一晩、氷浴を周囲温度まで戻しながら攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、１Ｍ塩酸溶液（３×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液にアセトニトリル／水混合物（１５ｍＬ／５ｍＬ）中Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（５２２ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１８０ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。溶液を周囲温度で２時間攪拌し、次に酢酸エチルで抽出した。有機相を水（３×２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ＡｃＯＥｔ １００％→ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ ９０：１０のグラディエントで溶出）。異なるフラクションをそれぞれ集め、オレンジ色の粉末の形態で化合物７ｂを得た（４９１ｍｇ、７５％）。
化合物７ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ ４００ＭＨｚ ６０°Ｃ）：δ＝０．９８（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．５０Ｈｚ），１．２６（ｓ，６Ｈ），１．４１（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．５０Ｈｚ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．２４（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝５．１０Ｈｚ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５１（ｍ，４Ｈ），３．６３（ｍ，４Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｓ，４Ｈ），４．１９（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝５．１０Ｈｚ），４．３７（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｍ，６Ｈ），７．６２（ｍ，２Ｈ），７．８７（ＡＢ ｓｙｓ，Ｈ，ＪＡＢ＝７．６６Ｈｚ，ν０δ＝１１２．８４Ｈｚ）。
実施例２−本発明による一般式（Ｉ）の化合物で標識されたリシンを含有するペプチドの合成
実施例１に従って調製した化合物７ａ（リシンは標識されている）は自動ペプチド合成装置中で用いられ、以下のヒトβ−アミロイドペプチド１−４２に対応するアミノ酸配列の１６位でリシンと置換される：
Ｈ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ＊−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１）
このペプチドは実施例３、４及び５で用いられ、ここから先では標識されたアミロイドペプチドと呼ばれる。
実施例３及び４に共通のプロトコル
ＰＣ１２細胞（オスラット副腎髄質血管腫瘍に由来する）を先にコラーゲン及びポリオルチニンで処理したガラス底のペトリ皿に接種する。５％のＣＯ２を含有する雰囲気下、３７℃で、グルタミンを含有し、１０％のウマ血漿、５％のウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ １６４０培地中、７日間培養する。細胞の分化を誘導するため、培地に、接種の２４時間後に５０ｎｇ／ｍＬのマウス神経栄養性成長因子（ＮＧＦ）２．５Ｓを追加する。
【０１３６】
測定の前日、標識されていない配列番号１のβ−アミロイドペプチド１−４２又は対応する標識されていない配列番号２の逆ペプチド（４２−１）を１０ｎｍｏｌ．Ｌ−１及び１０００ｎｍｏｌ．Ｌ−１の間の異なる濃度で加える。
【０１３７】
次の日、この調製物を、周囲温度で、クレブス培地で３回洗い、蛍光スペクトロメーターを備えた倒立顕微鏡に設置する。ベースラインの蛍光スペクトル（励起４８０ｎｍ；発光４９５ｎｍ〜６００ｎｍ）を、標識されたアミロイドペプチド（２５０ｎｍｏｌ．Ｌ−１）の追加前に記録する。２回目の蛍光スペクトルは１０分間のインキュベーション後に記録する。
実施例３ − β−アミロイドペプチド１−４２と結合した化合物７ａの標識されていないβ−アミロイドペプチドとのプレインキュベーション後のスペクトル指数の値の測定
ベースラインスペクトルを標識されたアミロイドペプチドの蛍光スペクトルから差し引く。得られたスペクトルを、図４に説明されるように逆重畳積分及び非線形回帰によって４成分ガウス曲線に分解する。この蛍光スペクトル（黒線）は、スペクトル逆重畳積分ソフトウェアの手法により（Ｐｅａｋｆｉｔ、Seasolve Software Inc.、 www.seasolve.com）成分ガウス曲線（異なる明度のグレーの線）に分解することができる（グラフＡ）。それぞれ５２５ｎｍ及び５４０ｎｍを中心とするガウス曲線の振幅の比（グラフ又は他から逆重畳積分ソフトウェアで測定する）は、スペクトルの分布を説明するスペクトル指数を定義する。
【０１３８】
グラフＢは、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下の細胞のプレインキュベーション前の（実線）及びプレインキュベーション後の（点線）、ＰＣ１２細胞の存在下で記録した、標識されたアミロイドペプチドの蛍光スペクトルの逆重畳積分を示す。５２５ｎｍを中心にするガウス曲線の振幅の有意な増加（結果としてスペクトル指数の増加につながる）が、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下、先に細胞が設置されたときに観測される。
【０１３９】
それゆえ、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２と共に細胞をプレインキュベーションすることはスペクトルの変化につながるのが観測され、β−アミロイドペプチド１−４２の存在をサンプル中で検出することができる。
実施例４ − β−アミロイドペプチド１−４２と結合した化合物７ａの、異なる濃度の標識されていないβ−アミロイドペプチドとのプレインキュベーション後のスペクトル指数の値の測定
同じ実験原則に従い、β−アミロイドペプチド１−４２と結合した化合物７ａの異なる濃度の標識されていない配列番号１のβ−アミロイドペプチドとのプレインキュベーション後のスペクトル指数値を測定する。
【０１４０】
ＰＣ１２細胞を、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２又は４２−１の存在下で、１２時間プレインキュベートし、続いて、洗浄を行ったのち、蛍光スペクトロメーターを備えた顕微鏡下に設置する。一回目のスペクトル（ベースライン）を記録する。
【０１４１】
次に、標識されたβ−アミロイドペプチドを加える。蛍光性化合物の添加の１０分後、スペクトルを記録する。
【０１４２】
スペクトル指数は、逆重畳積分により計算される１つ目のガウスの振幅と２つ目のガウスの振幅との比である（図４を参照されたい）。
【０１４３】
結果は図５に示す：
−標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の非存在下（１つ目のヒストグラム）、
−１００ｎＭの標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下（２つ目のヒストグラム）、
−２５０ｎＭの標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下（三つめのヒストグラム）、
−２５０ｎＭの標識されていないβ−アミロイドペプチド４２−１の存在下（四つ目のヒストグラム）。
【０１４４】
プローブの蛍光のスペクトル指数の値は、細胞プレインキュベーション期間に存在する標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の濃度の関数として変化する。スペクトル指数の値の変化の欠如はまた、細胞を不活性β−アミロイドペプチド４２−１の存在下でインキュベートする場合にも観測される（ステューデントのｔ検定：＊＊＊Ａｂ ０ｎＭではｐ＜０．５％；°°Ａｂ １−４２ ２５０ｎＭではｐ＜１％）。このグラフは、それぞれ三度ずつ（in triplicate）測定された４つの独立した実験を表す。
図５は、比の値の変化はβ−アミロイドペプチド１−４２によって特に誘導されたことを示し、この値はプレインキュベートされたペプチドの濃度の増加に伴って増加することを示す；さらに、β−アミロイドペプチド４２−１は比の値に有意な影響を与えないように見える。
ゆえに、プローブの蛍光スペクトルを分析することにより、細胞がプレインキュベートされたβ−アミロイドペプチドの濃度を評価することが可能になる。
実施例５ − 標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２とプレインキュベートされたラット赤血球の存在下でのβ−アミロイドペプチド１−４２と繋がった化合物７ａのスペクトル指数の値の変化
ラット血液のサンプル（１ｍｌ〜３ｍｌ）をヘパリン添加したチューブに回収する。サンプルをクレブス培地で希釈する。次に、バッファー層を捨てながら３回遠心分離する（「バフィーコート」）。得られた赤血球を、次に３７℃で２時間、様々な濃度（１０ｎｍｏｌ．Ｌ−１〜１０００ｎｍｏｌ．Ｌ−１）の、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２、又は、対応する標識されていない逆ペプチド（４２−１）の存在下でインキュベートする。追加の洗浄ののち、細胞を蛍光スペクトロメーターに設置し、ベースラインの蛍光スペクトル（励起４８０ｎｍ；発光４９５ｎｍ〜６００ｎｍ）を記録し、標識されたアミロイドペプチド（２５０ｎｍｏｌ．Ｌ−１）を添加する。２つ目の蛍光スペクトルは、標識されたアミロイドペプチドの存在下での１０分間のインキュベーションののち記録する。
【０１４５】
標識されたβ−アミロイドペプチドの蛍光スペクトルからベースラインスペクトルを差し引く。得られたスペクトルを、逆重畳積分及び非線形回帰によって４成分ガウス曲線に分解する。５１０ｎｍ付近を中心とするガウスの振幅と、５３０ｎｍ付近を中心とするガウスの振幅との比を計算する。その値は、図６に説明するように、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の濃度（その存在下で細胞がインキュベートされる）の関数として変化する。
【０１４６】
図６のヒストグラムは、スペクトル指数の値が、細胞のプレインキュベーション時に用いられる、標識されていないβ−アミロイドペプチド濃度の関数として増加することを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の蛍光性化合物、フッ素化されていないジピロメテン−ホウ素誘導体、同化合物の調製法、及び生体分子を蛍光標識するためのその使用に関する。本発明はさらに、上記蛍光性化合物で標識された生体分子、及び医学診断法のような検出法へのその使用に関する；特に、本発明による検出法は、アルツハイマー病のような神経変性疾患の診断に特に有用であると見られる。
【背景技術】
【０００２】
蛍光マーカーは、免疫学、分子生物学、医学診断又はさらにはＤＮＡチップの分野で、生体分子を検出及び／又は推定するために、しばしば用いられる。
【０００３】
従来技術にある、蛍光マーカーとして用いることのできる多くの化合物の中では、ジピロメテン−ホウ素類の二フッ化物（ここから先ではＤＦＭＢと表す）を特に引用することができる。特許である、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３は、ＤＦＭＢに由来し蛍光性官能基を含有する化合物で、生体分子やポリマーを標識するのに用いることのできるものを記載する。
【０００４】
しかしながら、ＤＦＭＢ誘導体は化学的に不安定である；それゆえ、塩基性媒体中又はアミンやアルコラートのような求核剤の存在下で、これらの化合物のフッ素原子は容易に置換される。
【０００５】
国際特許出願である特許文献４、及び特許文献５は、フッ素化されていないジピロメテン−ホウ素類に由来する化合物を記載する。これらの化合物はＤＦＭＢ誘導体に比べてより良好な化学安定性を示す；特に、自動ペプチド合成中のカーバメートタイプ（例えばＦｍｏｃ）の基の脱保護で特に用いられる塩基性条件に強い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，７７４，３３９号
【特許文献２】米国特許第５，１８７，２８８号
【特許文献３】米国特許第５，４５１，６６３号
【特許文献４】国際公開第２００６／０８７４５９号
【特許文献５】国際公開第２００６／０８７４５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、下のような性質を示す、利用可能な蛍光性化合物への必要性は残っている：
−さらに向上した化学的安定性；
−高い蛍光量子収率及び高いモル吸光係数；
−調節可能な励起波長及び発光波長；並びに
−生体分子に容易にグラフトすることを可能にする官能基。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は生体分子にグラフトすることを可能にするカルボニル基を有する、フッ素化されていないジピロメテン−ホウ素誘導体である、一般式（Ｉ）の新規の蛍光性化合物を開発することによって達成された。一般式（Ｉ）の化合物は、フルオレセイン、ローダミン類及びジフルオロボラジアザ−インダセン類のような標準的な蛍光体に比べて化学的により安定である；加えて、これらの化合物は、ペプチド又はオリゴヌクレオチドの固相合成で用いられる様々な試薬に対して強く、それゆえに、アミノ酸又はヌクレオチドの標識に特に好適である。
【０００９】
本発明の文脈では、生体分子はアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、ビオチン若しくは誘導体、又はその構造類縁体、ヌクレオチド又は核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）を意味すると理解されたい。
【００１０】
蛍光体（蛍光性化合物又はマーカーとも呼ばれる）は、単一の波長（励起波長又は吸収波長として知られる）で光エネルギーを吸収することができ、発光により、吸収波長より大きいかそれに等しい波長（発光波長として知られる）で吸収したエネルギーを全て又は部分的に放出することができる官能基を含有する化合物である；蛍光体は、生体分子のような分子に共有結合で連結することができる。
【００１１】
一般的に、分子は、放射性の原子若しくは原子団のような検出可能な原子若しくは原子団、発色団又は蛍光体を少なくとも１つ含有するならば、標識されたと言われる。
【００１２】
本発明の文脈では、別段に定義しない限りは、分子は、蛍光体に共有結合で連結した場合、標識されたと言われる。
【００１３】
標識は、蛍光体を生体分子に共有結合で連結すること（該生体分子は、好ましくはアミノ酸又はヌクレオチドである）、次に蛍光体がアミノ酸の側鎖又はヌクレオチドに連結されることからなる方法を意味すると理解されたい。
【００１４】
カルボニル基とは以下の構造：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（例えばカルボン酸、エステル、アミド又はチオエステルに存在する）の官能基である。本発明の文脈では、一般式（Ｉ）の化合物のカルボニル基は、−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ基によって定義される。ここで、Ａｒ、ｍ及びＺは以下に定義される。
【００１７】
それゆえ、本発明はより具体的には、一般式（Ｉ）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
（式中、
−Ｒ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ａｒ、Ｚ、Ｌ及びＧは以下に定義され、
−Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、ｍは０又は１であり、
置換基Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のうち１つのみが−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ又は−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚであることが理解され；
好ましくはＲ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚであり、
−Ｒ２及びＲ５は、同じ又は異なっていて、それぞれ独立して水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ｌ及びＧは以下に定義され、
−Ｓ１及びＳ２は親水基であり、同じ又は異なっていて、式−Ｃ≡Ｃ−Ｌ’−Ａであり；
ここで、Ｌ’及びＡは以下に定義され、
−ＡｒはＣ５−Ｃ１４アリーレン又はヘテロアリーレンから選択され、その−ＣＯ−Ｚ基はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にあり；Ａｒは好ましくはベンゼン基、ナフタレン基、アントラセン基、ピレン基、ピリジン基、ピリミジン基、チオフェン基又はピロール基から選択され、
−Ｚは一般式（Ｉ）の化合物を生体分子に接合することを可能にする基であり；特に、Ｚは、−ＯＨ基、−Ｏ−スクシンイミド基、−Ｏ−マレイミド基、−Ｎ−グリシン基、−Ｎ−リシン基、−Ｙ−Ｌ’’−ＮＨ２基、−Ｙ−Ｌ’’−ＣＯＯＨ基又は−Ｙ−Ｌ’’−ＳＨ基から選択され、ここで、ＹはＮ原子及びＯ原子から選択され、Ｌ’’は以下に定義され；
−Ｌ及びＬ’’はそれぞれ独立して単結合、任意に分岐したＣ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ６、炭素鎖、Ｃ６−Ｃ１６アリーレン（Ｌについてはその−Ｈ基又は−Ｇ基、Ｌ’’についてはその−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基又は−ＳＨ基）はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にある）、Ｃ２−Ｃ４アルケニレン、Ｃ２−Ｃ４アルキニレン、１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、１個〜４個のアミド基−ＣＯ−ＮＨ−を間に挟む直鎖又は分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、ヌクレオチドセグメント及び／又は糖セグメントから選択され；
−Ｇはスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、ホスホルアミダイト、Ｃ２−Ｃ５アルキルイミデート、Ｃ６−Ｃ１０アリールイミデート、酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物及び酸臭化物、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドラジン類、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドロキシルアミン、カルボジイミド並びにパーフルオロ−フェノールからなる群から選択され；
−Ｌ’は単結合、Ｃ１−Ｃ１０アルケニレン又は１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖若しくは分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖から選択され；かつ
−ＡはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチル、ホスフェート基、又はスルホネート基から選択される基を表す）
の化合物に関する。
【００２０】
好ましくは、Ａはメチル、プロピルスルホネート、エチルスルホネート、又はメチル−ホスフェートである。
【００２１】
好ましいＣ６−Ｃ１６アリーレン基は、ベンゼン、ナフタレン、及びアントラセンから選択される。
【００２２】
本発明中では、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」という言葉は、１個〜４個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐炭化水素基又はシクロアルキルを表すのに用いられる；例えばメチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソプロピル等を挙げることができる。
【００２３】
本発明中では、「Ｃ２−Ｃ４アルケニレン」は２つの炭素原子間に二重結合を含有する、２個〜４個の炭素原子の直鎖炭素鎖を意味すると理解されたい。
【００２４】
本発明中では、「Ｃ２−Ｃ４アルキニレン」は、２つの炭素原子の間に三重結合を含有する、２個〜４個の炭素原子の直鎖炭素鎖を意味すると理解されたい。
【００２５】
本発明中では、「Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン」は、２つの炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する２個〜１０個の炭素原子の直鎖炭素鎖を意味すると理解されたい。
【００２６】
好ましくは、本発明の文脈では、１個〜１０個の酸素原子を間に挟む（interrupted by）直鎖又は分岐の飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖は、ポリ（エチレンオキシド）又はポリ（プロピレンオキシド）であり、その単位は１回〜６回繰り返す。
【００２７】
ヌクレオチドセグメントは、１つ又は複数のヌクレオチドを含有する直鎖を意味すると理解されたい。
【００２８】
糖セグメントは１つ又は複数の糖単位を含有する直鎖を意味すると理解されたい。
【００２９】
基Ｒ１〜Ｒ７の選択により化合物の性質（例えばその蛍光発光波長、その蛍光量子収率、その溶解度及びその双極子モーメント）を改変することが可能である。
【００３０】
本発明による化合物の特定の族は一般式（Ｉ）の対称な化合物を含む、すなわち、Ｒ２及びＲ５は同一であり、Ｒ３及びＲ６は同一であり、Ｒ４及びＲ７は同一であり、並びにＳ１及びＳ２は同一であり、その場合にはＲ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚを有する。
【００３１】
ここから先では、一般式（Ｉ）の化合物は、式Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚとも表される。ここで、Ｐは一般式（Ｉ）の化合物全体を表す（ただし−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ基、又は−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ基である置換基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７は除く、ここでＡｒ、ｍ及びＺは上と同じ定義を有する）。
【００３２】
一般式（Ｉ）の化合物は、生体分子へ容易にグラフトすることを可能にするのに加えて、以下の数多くの利点を示す：
−強い蛍光強度で発光し、タンパク質のような生体分子に付着しているときにはこの強度を失わない；
−ポリペプチド又はポリヌクレオチドを調製する際の固相合成の段階に化学的に強い；
−付着する生体分子の性質を乱さない。
【００３３】
本発明による化合物Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚの合成は合成中間体のジピロメテン−ホウ素誘導体から行われる。この合成中間体は、二フッ化化合物ＤＦＭＢを、式Ｓ１−ＭｇＸ、Ｓ１−ＬｉＸ、Ｓ２−ＭｇＸ、又はＳ２ＬｉＸのグリニャール有機金属試薬（有機マグネシウム又は有機リチウム、ここで、Ｘはハロゲン原子である）と国際特許出願である特許文献４に記載の条件下で反応することにより得られる；この反応により、Ｓ１基及びＳ２基を二フッ化化合物ＤＦＭＢに導入することが可能となる。
【００３４】
この合成中間体は式Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑを有し、ここでＰ、ｍ及びＡｒは式（Ｉ）に定義されるとおりであり、Ｑはハロゲン原子、特にＩ、Ｂｒ又はＣｌ；−Ｏ−トリフレート基（トリフレートは式−Ｏ−ＳＯ２−ＣＦ３を有し、Ｔｆとも表される）、−Ｏ−トシレート基（トシレートは式−Ｏ−ＳＯ２−Ｃ６Ｈ６−ＣＨ３を有し、Ｔｓとも表される）又は−Ｏ−メシレート基（メシレートは式−Ｏ−ＳＯ２−ＣＨ３を有し、Ｍｓとも表される）から選択される。
【００３５】
この合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑから出発し、基−Ｑは、一酸化炭素源との反応又は一酸化炭素との反応により、以下の存在下でカルボニル基へと変換される：
−所望のカルボニル基の種類（nature）により選択される求核剤：カルボン酸を得るには水、エステルを得るにはアルコール、アミドを得るにはアミン、チオエステルを得るにはチオール、及び
−パラジウム系（paradium−based）触媒、例えばＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２。
【００３６】
この合成のスキームは図１に示す。
【００３７】
この反応に用いられる一酸化炭素は、標識されていなくてもよく、１％〜９９％で調節可能な標識率の１３Ｃ原子で標識されていても（ＮＭＲモニタリング）、又は１４Ｃ原子で標識されていてもよい（放射線モニタリング）；このような標識により、本発明による蛍光性化合物（Ｉ）で標識された生体分子の補助的なモニタリングが可能になる。
【００３８】
既にＳ１基及びＳ２基をホウ素上に含有する合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑにカルボニル基−ＣＯ−Ｚを導入する必要がある；実際には、カルボニル基の存在は、Ｓ１及びＳ２の付加に必要な有機金属化合物の使用と両立可能ではない。
【００３９】
カルボニル基がＲ１である場合の、一般式（Ｉ）の化合物の調製の１つの具体例は実施例１に説明される。
【００４０】
同様に、カルボニル基はＲ３又はＲ４又はＲ７又はＲ６の位置に、もしこれらの位置に、上に定義されるような−Ｑ基を保持するならば、パラジウムで触媒されるカップリングの手段で、一酸化炭素、又は他の一酸化炭素源の存在下で直接導入され得る。
【００４１】
それゆえ、本発明の１つの主題は、水、アルコール、アミン又はチオールから選択される求核剤及びパラジウムを含有する触媒の存在下での一酸化炭素との反応により合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑを一般式（Ｉ）の化合物へと変換することを含むことを特徴とする、一般式（Ｉ）の化合物を調製する方法に関する；上記合成中間体は、Ｐが、基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７がＲ１の−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、若しくはＲ３若しくはＲ４若しくはＲ６若しくはＲ７の−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚに依存することを除いては、同様に調製される一般式（Ｉ）の化合物の構造と同一構造の基であり、Ａｒは式（Ｉ）に定義された通りであり、ｍは０又は１であり、もしＲ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚならばｍは１であることが理解され、Ｑはハロゲン原子、−Ｏ−トリフレート、−Ｏ−トシレート又は−Ｏ−メシレートから選択される。好ましい実施の形態では、Ｒ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚである。
【００４２】
また、本発明の主題は、一般式（Ｉ）の化合物の蛍光性マーカーとしての使用でもある。
【００４３】
そのカルボニル基のために、式（Ｉ）の化合物は、アミノ酸、タンパク質、ビオチン又はその誘導体若しくはその構造類縁体の一つ又はヌクレオチドのような生体分子に容易にグラフトされる。
【００４４】
また、もう１つのその主題によると、本発明は一般式（ＩＩ）の標識された生体分子に関する（ここから先では「標識された生体分子」と呼ぶ）：
Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ （ＩＩ）
（式中、
−Ｐ、Ａｒ及びｍは、上に定義されるとおりであり、ｍは０又は１であり、もし、
−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ基がＲ１で置換されていればｍは１であることが理解され；
−Ｘはカルボキシル基、アミン基又はチオール基を有するスペーサーである（例えば、１個〜３個のアミノ酸を含む鎖、又はさらには２個又は３個の酸素原子を間に挟んでもよく、蛍光体及び生体分子にアミド基、エーテル基、エステル基、若しくはチオエステル基、又はジスルフィド架橋で共有結合するＣ１−Ｃ６アルキレン）；
−ｎは０又は１に等しい整数であり、
−Ｔは生体分子である。
【００４５】
本発明の文脈では、スペーサーは蛍光体Ｐから生体分子Ｔを離す役割を果たす。好ましくは、スペーサーは化学的に不活性であり、言い換えれば離す基のいずれとも反応しない；特に、蛍光体の蛍光性及び生体分子の生物学的活性に影響しない。
【００４６】
生体分子として、Ｔは、天然又は合成のアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、ビオチン若しくは誘導体、又はその構造類縁体、ヌクレオチド又は核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）から選択される。Ｔがアミノ酸の場合、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート又はアスパラギン酸、システイン、グルタメート又はグルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択される。好ましくは、Ｔはリシン又はグリシンから選択される。
【００４７】
Ｔがヌクレオチドの場合、アデノシン、ウリジン、グアノシン、シチジン、若しくはリボチミジンのようなリボヌクレオチド、又はデオキシアデノシン、デオキシウリジン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、若しくはデオキシリボチミジンのようなデオキシリボヌクレオチドから選択される。
【００４８】
標識された生体分子は以下の方法により調製される。
【００４９】
Ｔがアミノ酸又はタンパク質である場合、一般式（ＩＩ）の標識された生体分子の調製は、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された一般式（Ｉ）の化合物から行われる；上記化合物（Ｉ）は（ｉ）ヒドロスクシンイミド又はテトラフルオロフェニルエステルに変換され、次に（ｉｉ）アミノ酸又はタンパク質と反応する（Guide to Labeling Proteins with Fluorescent Dyes - Note 7.1 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/）。
【００５０】
ペプチドカップリングは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ、実施例１を参照）によっても行われ得る。
【００５１】
工程（ｉｉ）では、ＢＯＣ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ｂｐｏｃ（２−（４−ビフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル）、Ｎｐｓ（２−ニトロフェニルスルフェニル）又はＤｔｓ（ジチア−スクシノイル）のような保護基、すなわちアミノ酸のアミン基（ポリペプチドの形成に関わる）に導入される保護基に既に連結したアミノ酸を用いるのが有利であり得る；実際、そのように保護されていることで、標識されたアミノ酸は、続いて、ペプチドの固相合成の標準技法に用いることができる（Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154）。この合成から、アミノ酸の少なくとも１つに蛍光体が存在することにより蛍光性ポリペプチドが得られる。
【００５２】
本発明の１つの変形形態によると、Ｔは、ビオチン、又はその誘導体若しくはその構造類縁体の１つである。その場合、一般式（ＩＩ）の標識された生体分子の調製は、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された一般式（Ｉ）の化合物から行われる；上記化合物（Ｉ）は（i）脂肪族ジアミン（これは１，６−ジアミノへキサン、１，３−ジアミノプロパン又は１，２−ジアミノエタンであり得る）との加水分解反応によりアミドへと変換され、次に（ｉｉ）当業者に既知の任意の標準方法で、ビオチン又は遊離カルボン酸基を保持するその誘導体若しくは構造類縁体の１つと反応する。
【００５３】
本発明のもう１つの変形形態では、Ｔはヌクレオチドである。一般式（ＩＩ）の標識された生体分子の調製は、次に、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された一般式（Ｉ）の化合物にから行われる；上記化合物（Ｉ）は、当業者に既知の任意の標準方法で、遊離アミン基を有する修飾されたヌクレオチドと反応する。
【００５４】
この標識されたヌクレオチドは、次に、有利には標識されたオリゴヌクレオチドの合成に用いられる。
【００５５】
オリゴヌクレオチド合成にはいくつかの手法がある；Merrifieldによってペプチド合成のために提唱された合成法にインスピレーションを得た固相オリゴヌクレオチド合成を特に参照することができ、又は、さらには、ホスホルアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成（Matteucci, M. D.; Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett. 1980, 21, 719-722； Matteucci, M. D.; Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3185-3191）も参照される。
【００５６】
標識された生体分子とリガンドとの相互作用は、該分子の蛍光発光スペクトルの変化につながる；検出法の発達はこの性質に由来する。
【００５７】
この性質に由来するもう１つの利点は、検出法は、本発明による蛍光体単独で実施することができ、例えば、タンパク質同士の相互作用の測定のためのＦＲＥＴ法（蛍光共鳴エネルギー移動については、Lopper et al., Protein-protein interactions: identification, 2007, Encyclopedia of Life Scienceを参照）又はリアルタイムＰＣＲ（Poitras et al., La PCR en temps reel : principeset applications, 2002, Reviews in Biology and Biotechnology, vol. 2, N°2, p.2-11）のような手法の場合のように、いくつかの蛍光体の組み合わせ、又は蛍光体−消光剤（fluorescence suppressor）の対を必要としないことである；しかしながら、これらの手法は、本発明による蛍光体の使用を排除するものではない。
【００５８】
本発明の文脈では、リガンドは、サンプル中のその存在又は非存在が検出される分子である；生体分子は、リガンドと相互作用する性質により選択される。
【００５９】
蛍光体の発光スペクトルは、当業者に既知の任意の標準方法で測定することができる。好ましくは、蛍光発光スペクトルは、蛍光スペクトロメーター又はスペクトル検出器を備えた顕微鏡装置の手法を用いて測定される；スペクトルはＸ軸に波長、Ｙ軸に光強度を有するグラフで表される。
【００６０】
それゆえ、異なる条件下で（テストサンプルの存在／非存在下で）標識された生体分子の蛍光スペクトルの異方性指数を測定することが可能である。
【００６１】
スペクトルの異方性指数（スペクトル指数又は変形指数（deformation index）とも呼ばれる）は、主蛍光発光ピーク位置との相関でスペクトルの非対称性を表す指数を意味すると理解されたい。
【００６２】
測定されたスペクトルの異方性指数を決定するために、スペクトルは非線形減衰法を用いた逆重畳積分（deconvolution）により成分ガウス曲線に分解することからなる分析に付す。これらのガウス曲線（ピークの位置、振幅、面積及び分散）の特徴を計算する：
−ピークの位置は最大光強度を観測することのできる波長に対応する；
−振幅はピークの光強度である；
−面積は曲線下の光強度の積分である；
−分散は波長で表現される曲線の半値幅（half-height width）である。
【００６３】
同一のスペクトルでは、２つの主要ガウス曲線の振幅の割合又は面積の割合により、蛍光スペクトルの変形指数をスペクトルが記録される条件の関数として定義することが可能である。サンプルの存在／非存在下で測定したスペクトルの、変形指数の値の変化によりリガンドの存在を検出し、その比を算出することが可能である。
【００６４】
１つの変形形態では、スペクトルの異方性は、バンドパス光学フィルター（band pass optical filters）によっても測定可能である。スペクトルの変形指数は、続いて、異なるバンドパスフィルターにより測定した蛍光強度の割合を用いて算出される。
【００６５】
それゆえ、もう１つのその主題によると、本発明はサンプル中で、一般式（ＩＩ）の標識された生体分子のリガンドを検出する方法であって、
ａ）テストサンプル単独での蛍光発光スペクトルを測定する工程（得られたスペクトルは「ベースライン」と称する）
ｂ）溶液中での標識された生体分子の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、変形指数を計算する工程、
ｃ）上記標識された生体分子を、試験されるサンプルと溶液中でインキュベートし、そして、混合物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた混合物の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、変形指数を計算する工程、並びに
ｅ）工程ｂ）及び工程ｄ）で計算した変形指数を比較し、そして、該指数が異なる場合には、リガンドと標識された生体分子との間の相互作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出する方法に関する。
【００６６】
好ましくは、工程ｂ）で、生体分子は標識された分子の蛍光スペクトルが生体サンプルの存在下で測定されるのと同じ組成の溶液中に存在する。
【００６７】
本発明の１つの変形形態では、検出法によりサンプル中のリガンドを定量することも可能である。これを行うためには、スペクトルの変形指数の値の検量線（a calibration curve）を、リガンドの量の関数として先に作成する。
【００６８】
加えて、リガンドが異なる立体配座をとるならば、（その三次元の配座が、おかれる環境に依存して変化し得る、これはペプチドの場合にも同様であり得る）、リガンドと複合体を形成した標識された生体分子の蛍光スペクトルは、リガンドの配座に依存して異なる；この性質により、リガンドの定性的検出のための方法を行うことが可能になる。
【００６９】
サンプルは生物由来でもよい、すなわち、臓器、組織、細胞、微生物等の全て又は部分を表す。
【００７０】
サンプルはまた、どのような種類のものでもよく、例えば、限定されるものではないが、食品であり得る。食品では、望ましくない又は病原性でさえある微生物のような汚染物質、農薬のような毒素又は汚染因子等が存在しないことを試験することが望ましい。
【００７１】
本発明による検出法の実施は、疾患の診断にも有用であり得る。
【００７２】
それゆえ、アルツハイマー病のような神経変性疾患の診断のための方法が発達してきた。
【００７３】
寿命が一般的に延びたことは、神経変性疾患の、及び、特に、アルツハイマー病の有病率の増大に有利に働いた。このような状態は現代社会に大きな社会問題及び経済問題を打ち立てた。医療イメージング及び神経心理学試験と組み合わされた臨床試験では、疾患の終末期における遅い診断が可能になるだけであり、決定的な診断は、死後に行われる脳組織の試験によってのみ得られるが、それは満足のいくものではない。それゆえ、非侵襲的な疾患の診断を可能にするであろう周辺の生物学的マーカーを同定する多様なルートが探索された。
【００７４】
アルツハイマー病では赤血球が変化していることが示されている；この変化は、細胞内カルシウム濃度の脱調節によって引き起こされ得るタンパク質キナーゼＣの異常配座と考えられている（Janoshazi et al. Neurobiol. Aging 2006, 27: 245-251）。
【００７５】
加えて、アルツハイマー病の過程で神経組織及び血液中で生産されるヒトβ−アミロイドペプチドは、赤血球の表面と相互作用し、カルシウム恒常性を変化させる可能性があることが示されている（Mattson MP et al. Brain Res 1997, 771: 147-153）。
【００７６】
本発明の文脈で実施された試験では、先に低濃度の標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下に置かれた赤血球のような生細胞は、続いて本発明に記載の蛍光体を有するβ−アミロイドペプチドに結合しことができることが示される；この結合は蛍光体の蛍光スペクトルの特異的な変形を伴い、先に細胞が曝露された標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の濃度を算出することを可能にする。それゆえ、個体の体内を循環するヒトβ−アミロイドペプチド１−４２を定量することが可能である。
【００７７】
より詳細には、アルツハイマー病の診断法では、本発明による検出法を実施する；それにより下記のようなサンプル中のβ−アミロイドペプチド１−４２の量を算出するのが可能になる：
−赤血球を含む生物学的サンプル、例えば血液；及び
−標識された生体分子はＴがβ−アミロイドペプチド１−４２に由来するペプチドであるようなものである。
【００７８】
β−アミロイドペプチド１−４２は、配列番号１の配列のペプチドである。
β−アミロイドペプチド１−４２の誘導体は、その１つ又は複数のアミノ酸が、本発明による一般式（Ｉ）の蛍光性化合物で標識された同じアミノ酸で置換された、ペプチドを意味すると理解されたい；この誘導体はまた、鎖の任意の部分に、１つ又は複数の標識されたアミノ酸の挿入を含み得る。
【００７９】
例として、β−アミロイドペプチド１−４２誘導体の調製が実施例１に記載されており、結果として以下のペプチドが得られる：
Ｈ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ＊−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１）、ただし、１６位のリシンに蛍光体を含む。
【００８０】
リシンではないアミノ酸は標識され、β−アミロイドペプチド１−４２の誘導体を調製するのに用いられ得る；これらは、好ましくは、アミン基又はカルボン酸基をその側鎖に有するアミノ酸である。
【００８１】
サンプル中で測定した蛍光スペクトルの変形指数の値を、次に検量線と比較することにより、テストサンプル中に存在するβ−アミロイドペプチド１−４２の割合を算出することが可能である。
【００８２】
この診断法の実施のため、健康な被検体に由来し、増加濃度のβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下で１８時間プレインキュベーションしたヒト赤血球を用いて検量線を作成した。次に、本発明による方法の工程ｅ）は、工程ｄ）で得られたスペクトルの変形指数をその検量線と比較することからなる。
【００８３】
それゆえ、この方法により、このペプチドと、血清アルブミンのような他の可溶性タンパク質との相互作用が引き起こす予想の難しさを克服し、循環するβ−アミロイドペプチド１−４２の量を算出することが可能になる。これは、簡便で速く、安価なアルツハイマー病の独自の診断手段を打ち立てる。また、予後診断のための手段、疾患に対する治療の有効性のモニタリングの手段、細胞株又は疾患の動物モデルの補助を伴うと治療薬の発達の手段も意味する。
【００８４】
本発明による方法のもう１つの実施の形態によって、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子のリガンドと相互作用することが可能な化合物の同定が可能となる。このような実施の形態は、
ａ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、溶液中での標識された生体分子の変形指数を計算する工程、
ｂ）上記標識された生体分子を溶液中でリガンドとインキュベートし、そして、混合物１を得る工程、
ｃ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、混合物１の変形指数を計算する工程、
ｄ）上記リガンドを上記試験される化合物とインキュベートし、続いて上記標識された生体分子を溶液中に添加し、そして、混合物２を得る工程、
ｅ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、混合物２の変形指数を計算する工程、
ｆ）工程ａ）、工程ｃ）及び工程ｅ）で計算された変形指数の比較により、リガンドと試験化合物との間の相互作用を検出する工程、
を含む。
【００８５】
そのように実施することで、この検出法により可能性のある治療薬を同定することが可能になり、又はさらには、そのような治療薬の有効性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで測定することが可能になる。
【００８６】
本発明はまた、本発明による検出法を実施するための診断キット又は試薬セットにも関する。これらのキットは、適切な内容物及び試薬、並びに取扱い説明書と共に、少なくとも１つの標識された本発明による一般式（ＩＩ）の生体分子を含むことを特徴とする。
【００８７】
ここで、本発明を、図面及び以下の実施例を参照してより詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は単に本発明の主題を説明する目的で与えるものであり、限定するものではないことを明確に理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明による一般式（Ｉ）の化合物を合成するためのスキームを示す図である。
【図２】実施例１に記載の化合物１ａ−ｄ〜６ａを導く合成スキームを示す図である（ＴＥＡ＝トリエチルアミン）。
【図３】実施例１に記載の化合物６ａ１３−ｂ及び７ａ、７ａ１３及びｂを導く合成スキーム（ＥＤＣＩ＝Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド及びＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を示す図である。
【図４】実施例３の条件下での蛍光発光スペクトルの測定を説明する図である。グラフＡは、化合物７ａに連結したβ−アミロイドペプチドの蛍光スペクトルを示し、グラフＢは、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２を有する細胞のプレインキュベーション前（実線）及びプレインキュベーション後（点線）にＰＣ１２細胞の存在下で記録した、化合物７ａに連結したβ−アミロイドペプチドの蛍光スペクトルの逆重畳積分を示す。
【図５】実施例４に説明されるような異なる濃度の標識されていないβ−アミロイドペプチド（Ａｂ）のプレインキュベーション後の、β−アミロイドペプチド１−４２に連結した化合物７ａのスペクトル指数の値を表すグラフである。
【図６】実施例５に説明されるような標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２とプレインキュベートされたラット赤血球の存在下の化合物７ａに連結したβ−アミロイドペプチド１−４２のスペクトル指数の変化を示すヒストグラムである。
【実施例】
【００８９】
実施例１−Ｒ１が−Ａｒ−ＣＯ−Ｚである本発明による一般式（Ｉ）の化合物の調製
この実施例の化合物１ａ−ｄ〜７ａ−ｂは、現在最も使用されている蛍光体とのスペクトルの対応で選択された。（記号ａ：フルオレセイン、記号ｂ：ローダミン６Ｇ；記号ｃ：ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）及び記号ｄ：ＴＯＴＯ−３）
化合物１ａ−ｄ〜６ａを導く合成スキームが図２に示される。
【００９０】
化合物１ａ−ｄは、国際特許出願である特許文献４に示される操作手順に従い、ＴＨＦ中６０°Ｃでのメトキシエトキシエチニル有機金属（グリニャール試薬）の対応する二フッ化物（米国特許第４，７４４，３３９号に記載されるように調製可能）との反応によって得られる。
【００９１】
化合物１ａ−ｄが有するヨウ素を、次に、一酸化炭素雰囲気下、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２触媒の存在下で、トリエチルアミン及びベンゼンの混合溶媒中、７０℃でカルボニル基へと変換する。用いる求核剤の選択により、次に生体分子へのカップリングに用いることができる数多くの官能基を直接得ることが可能になる：
−エタノールを用いると、エチルエステル２ａ−ｄが非常に良い収率で得られる；
−過剰量の脂肪族ジアミンを用いることにより、タイプ４の化合物を得ることができる；
−遊離アミンを有し、カルボン酸基が保護されたアミノ酸（例えば、グリシンのエチルエステル）が直接用いられた場合、アミノ酸は直接導入され、タイプ５の化合物を与えることができる。
【００９２】
化合物３ａ−ｄから出発し、図３に示された合成スキームによる化合物７ａ、ａ１３、ｂが得られる。指数「１３」を有する化合物は、１３Ｃで標識されている。
【００９３】
化合物２ａ−ｄのエステル基は、エタノール中、苛性ソーダの存在下で鹸化され、対応するカルボン酸３ａ−ｄを得ることができる（図２を参照されたい）。これらのカルボン酸は、生体分子の標識に直接用いるか、又は、アミノ酸タイプのスペーサーに連結することができる（図３の合成スキームに示したように、下の化合物６ａ−ｂに用いられるペプチドカップリング手法でグラフト化）。
【００９４】
それらをペプチド合成装置で使用可能にするため、化合物３ａ−ｂを、標準ペプチド合成（ＥＤＣ、ＤＭＡＰ）でグリシンエステルと結合する。この工程により、必要であれば、ＮＭＲ追跡が可能になるように例えば１３Ｃ原子で標識されたフラグメント（化合物５ａ１３）を導入することが可能になる。
【００９５】
得られた化合物５ａ−ｂは、次に、カルボン酸６ａ−ｂに鹸化される。
【００９６】
酸６ａ−ｂは、ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換され、これは直接リシン−Ｆｍｏｃと反応する。
【００９７】
化合物７ａ−ｂは、標識されたアミノ酸Ｌｙｓをペプチド合成装置に導入するのに直接用いることができる。
化合物２ａの調製
化合物２ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【００９８】
【化３】
【００９９】
化合物１ａ（２３５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１５ｍＬ）に、１ｍＬのエタノール（１７．２ｍｍｏｌ）、４４ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０７ｍｍｏｌ）及び５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９９：１又はＡｃＯＥｔ／石油エーテル ４０：６０）、化合物２ａ（２１０ｍｇ、９７％）をオレンジ色の粉末の形態で得た。
化合物２ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝１．３３（ｓ，６Ｈ），１．４２（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．３５（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），４．４０（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．００（ｓ，２Ｈ），７．７８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．５Ｈｚ，ν０δ＝３００．４Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ，）：δ＝１４．４，１４．８，１６．１，５９．０，５９．７，６１．４，６８．４，６８．６，７１．８，９０．９，１２１．８，１２８．６，１２９．１，１３０．３，１３１．０，１４０．３，１４０．３，１４０．９，１５５．６，１６６．１；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．２（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５００（９０ ０００），３６６（４９００），３０８（７７００）；
ＦＡＢ＋ ｍ／ｚ：５８５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００）；
Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４１ＢＮ２Ｏ６：Ｃ，６９．８６；Ｈ，７．０７；Ｎ，４．７９。実測値：Ｃ，６９．７７；Ｈ，７．０４；Ｎ，４．５９。
化合物２ｂの調製
化合物２ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１００】
【化４】
【０１０１】
化合物１ｂ（９８０ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（５０ｍＬ）に、３ｍＬのエタノール（１７．２ｍｍｏｌ）、２４０ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０７ｍｍｏｌ）及び１５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０°Ｃで一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ２０：８０；４０：６０）、化合物２ｂ（８９５ｍｇ、定量的）をオレンジ色の粉末の形態で得た。
化合物２ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：０．９７（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．４０Ｈｚ），１．２３（ｓ，６Ｈ），１．４３（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．１０Ｈｚ），２．３１（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．４０Ｈｚ），２．６９（ｓ，６Ｈ），３．３５（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），４．４３（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１０Ｈｚ），７．７８（ＡＢｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．１９Ｈｚ，ν０δ＝２２３．０７Ｈｚ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１２．０３，１４．０７，１４．４１，１４．７６，１７．４０，２９．７８，５９．０２，５９．７９，６１．３７，６８．５７，７１．８５，９０．６７，１２８．６０，１２８．９５，１３０．１９，１３０．８１，１３３．１１，１３６．０２，１３８．７７，１４１．２７，１５４．０５，１６６．２８。
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．２（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５２２（８０ ０００），４８８（２０ ０００），３８１（６４００），２７７（６４００）。
化合物２ｃの調製
化合物２ｃを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０２】
【化５】
【０１０３】
化合物１ｃ（１００ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（２５ｍＬ）に、１ｍＬのエタノール、２４ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド及び５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×１０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ８０：２０；１００％）、化合物２ｃ（８８ｍｇ、９２％）を青色の粉末の形態で得た。
化合物２ｃの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ２００ＭＨｚ）：１．４０（ｓ，６Ｈ），１．４４（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝１０．５Ｈｚ），３．１５（ｍ，４Ｈ），３．１９（ｓ，６Ｈ），３．４１（ｓ，６Ｈ），３．５０（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．８８（ｍ，４Ｈ），４．１５（ｓ，４Ｈ），４．１８（ｍ，４Ｈ），４．４１（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝１０．５Ｈｚ），６．６２（ｓ，２Ｈ），７．２７（ＡＢ ｓｙｓ，８Ｈ，ＪＡＢ＝８．７３Ｈｚ、ν０δ＝１２０．７３Ｈｚ），７．６０（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝１６．２６Ｈｚ、ν０δ＝１９２．６３Ｈｚ），７．８３（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．３４Ｈｚ、ν０δ＝１４１．８９Ｈｚ）．
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝６４７（１２１ ０００），３７３（７２ ８００）。
化合物２ｄの調製
化合物２ｄを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０４】
【化６】
【０１０５】
化合物１ｄ（１００ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（２５ｍＬ）に、２ｍＬのエタノール、２４ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０７ｍｍｏｌ）及び５ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×１０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ２０：８０；４０：６０）、化合物２ｄ（８２ｍｇ、８８％）を紫色の粉末の形態で得た。
化合物２ｄの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．３５（ｓ，３Ｈ），１．３８（ｓ，３Ｈ），１．４３（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．１５Ｈｚ），２．７４（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．３１（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．５４（ｍ，６Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｍ，４Ｈ），４．４３（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．６７Ｈｚ、ν０δ＝１８０．１８Ｈｚ）；７．５８（ＡＢ ｓｙｓ，２Ｈ，ＪＡＢ＝１６．２９Ｈｚ、ν０δ＝２９７．７２Ｈｚ），７．８５（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝７．９９Ｈｚ、ν０δ＝２２６．２８Ｈｚ）。
化合物の調製３ａ
化合物３ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０６】
【化７】
【０１０７】
化合物２ａ（２１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に２１５ｍｇの苛性ソーダ（５．３９ｍｍｏｌ）を加えた。３時間、周囲温度で溶液を攪拌した。３０ｍＬ〜４０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出した。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。
【０１０８】
水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（１９０ｍｇ、９５％）。
化合物３ａの特性分析
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５０１（７２ ８００），３６６（４０００），３０７（６４００）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝４９４（７１ ５００），３６４（３９００），３０７（４９００）。
化合物３ｂの調製
化合物３ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１０９】
【化８】
【０１１０】
化合物２ｂ（８４０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍＬ）に２．１０ｇの苛性ソーダ（０．５２５ｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩、溶液を攪拌した。３０ｍＬ〜４０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ｂをオレンジ色の粉末の形態で得た（７７８ｍｇ、９７％）。
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５１７（６５ ０００），３７８（３６００），３２０（５０００）。
化合物３ｃの調製
化合物３ｃを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１１】
【化９】
【０１１２】
化合物２ｃ（８０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に１３０ｍｇの苛性ソーダ（３．２２ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩、溶液を攪拌した。１０ｍＬ〜２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×１０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ｃを青色の粉末の形態で得た（７０ｍｇ、９０％）。
化合物３ｃの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．４１（ｓ，６Ｈ），３．１５（ｍ，４Ｈ），３．２０（ｓ，６Ｈ），３．４１（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６０（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｍ，４Ｈ），４．１７（ｓ，４Ｈ），４．２２（ｍ，４Ｈ），６．６３（ｓ，２Ｈ），７．２８（ＡＢ ｓｙｓ，８Ｈ，ＪＡＢ＝８．６Ｈｚ，ν０δ＝１２０．５９Ｈｚ），７．６１（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝１６．１２Ｈｚ，ν０δ＝１９１．４４Ｈｚ），７．８８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．１９Ｈｚ，ν０δ＝１４４．７３Ｈｚ）。
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝６４７（１１８ ０００），３７３（６７ ８００）。
化合物３ｄの調製
化合物３ｄを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１３】
【化１０】
【０１１４】
化合物２ｄ（８０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に１６２ｍｇの苛性ソーダ（４．０５ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩、溶液を攪拌した。１０ｍＬ〜２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×１０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物３ｄをオレンジ色の粉末の形態で得た（７０ｍｇ、９０％）。
化合物３ｄの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．３６（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｓ，６Ｈ），３．３２（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｍ，６Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｍ，６Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），７．２２（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．６７Ｈｚ，ν０δ＝１８０．１８Ｈｚ）；７．５８（ＡＢ ｓｙｓ，２Ｈ，ＪＡＢ＝１６．２９Ｈｚ，ν０δ＝２９７．７２Ｈｚ），７．８５（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝７．９９Ｈｚ，ν０δ＝２２６．２８Ｈｚ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１４．８６，１５．０８，１６．３７，２９．７９，５８．９１，５９．１８，５９．５８，６７．６３，６８．４１，６９．７９，７０．８８，７１．６９，７２．０５，９１．４３，１２８．７６，１２９．０６，１２９．６９，１３０．１５，１３０．４４，１３０．８６，１３４．１０，１３８．６５，１４０．３９，１４０．５９，１４１．２５，１５２．６１，１５５．５４，１５９．６１，１７０．４０。
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５６４（７０ ０００），３３８（２５ ０００）。
化合物４ａの調製
化合物４ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１５】
【化１１】
【０１１６】
化合物１ａ（２００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１５ｍＬ）に１ｍＬのエチレンジアミン（１５ｍｍｏｌ）、６６ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０９ｍｍｏｌ）及び１ｍＬのトリエチルアミンを加えた。７０℃で一晩、一酸化炭素を「吹き込む」ことで溶液を攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水（３×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＣＨ２Ｃｌ２ １００％→ＣＨ２Ｃｌ２ ７５：２５のグラディエント）、化合物４ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（１６０ｍｇ、８０％）。
化合物４ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ＝１．３４（ｓ，６Ｈ），２．７２（ｓ，６Ｈ），３．０１（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．３６（ｓ，６Ｈ），３．５５（ｍ，６Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｓ，４Ｈ），６．０１（ｓ，２Ｈ），６．９８（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．６９（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．３Ｈｚ，ν０δ＝１６２．７Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．４ＭＨｚ，）：δ＝１５．０，１６．２，４１．３，４２．２，５９．１，５９．８，６８．７，７１．９，９０．６，１２１．９，１２７．９，１２８．８，１２９．４，１３４．９，１３９．１，１４０．４，１４１．０，１５５．７，１６７．０；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．３（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５００（６４ ５００），３７１（５６００）
ＦＡＢ＋ ｍ／ｚ：５９９．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００）；
Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４３ＢＮ４Ｏ５：Ｃ，６８．２３；Ｈ，７．２４；Ｎ，９．３６。実測値：Ｃ，６７．８４；Ｈ，７．０７；Ｎ，９．２２。
化合物５ａの調製
化合物５ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１７】
【化１２】
【０１１８】
化合物１ａ（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（６ｍＬ）に８０ｍｇのグリシンエチルエステル（０．４７ｍｍｏｌ）、２２ｍｇのパラジウムビス−トリフェニルホスフィンジクロリド（０．０３ｍｍｏｌ）及び２ｍＬのトリエチルアミンを加えた。８０℃で、一酸化炭素を「吹き込む」ことで６時間溶液を攪拌した。反応混合物をセライト濾過し、部分的に蒸留した。残渣をジクロロメタンで抽出し、水（２×２０ｍＬ）で洗った。有機相を親水性の綿で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＡｃＯＥｔ／石油エーテル ５０：５０）、化合物５ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（４３ｍｇ、４３％）。
化合物５ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ＝１．３３（ｔ，３Ｈ，３Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３４（ｓ，６Ｈ），２．７２（ｓ，６Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｓ，４Ｈ），４．２７（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝４．５Ｈｚ），４．２９（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ），６．０１（ｓ，２Ｈ），６．７７（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝４．９Ｈｚ），７．６９（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．３Ｈｚ，ν０δ＝１５６．４Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．４ＭＨｚ，）：δ＝１４．３，１４．９，１６．２，４２．１，５９．１，５９．８，６１．９，６８．７，７１．９，９１．０，１２１．９，１２７．９，１２９．０，１２９．３，１３４．２，１３９．５，１４０．２，１４１．０，１５５．８，１６６．７，１７０．２；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．３（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５０１（８４ ２００），３６６（４２００），３０９（６５００）。
化合物６ａの調製
化合物６ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１１９】
【化１３】
【０１２０】
化合物５ａ（４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１０ｍＬ）に、苛性ソーダ（６０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。２時間周囲温度で溶液を攪拌した。１０ｍＬ〜２０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（２×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。生成物をジクロロメタンで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物６ａをオレンジ色の粉末の形態で得た（３５ｍｇ、９０％）。
化合物６ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝１．３２（ｓ，６Ｈ），２．７２（ｓ，６Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），４．２７（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝３．４Ｈｚ），４．８７（ｂ，１Ｈ），６．０１（ｓ，２Ｈ），７．０４（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝３．８Ｈｚ），７．６９（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝６．０Ｈｚ，ν０δ＝１６０．２Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ，）：δ＝１４．９，１６．２，４２．０，５９．０，５９．７，６８．６，７１．８，９０．９，１２１．９，１２８．０，１２９．０，１２９．３，１３３．８，１３９．６，１４０．２，１４０．９，１５５．８，１６７．３，１７２．３；
１１Ｂ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２８．４ＭＨｚ）：δ＝−１０．２（ｓ）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝５０１（６５ ０００），３６６（３８００），３０９（５９００）；
ＵＶ−Ｖｉｓ（ＰＢＳ バッファー）λ ｎｍ（ε，Ｍ−１ｃｍ−１）＝４９６（５９ ６００），３６７（４１００），３０８（６１００）。
化合物７ａの調製
化合物７ａを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２１】
【化１４】
【０１２２】
化合物６ａ（２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）に０℃で、１２ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（０．０６ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を一晩、氷浴を周囲温度まで戻しながら攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、１Ｍ塩酸溶液（２×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解した。この溶液にアセトニトリル／水混合物（５ｍＬ／１ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１６ｍｇ、０.０４ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。溶液を周囲温度で１時間攪拌し、次に酢酸エチルで抽出した。有機相を水（２×２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。残渣を溶出シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ＡｃＯＥｔ １００％→ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ ９０：１０のグラディエント）。水相を集め、１Ｍ塩酸溶液でｐＨ１まで酸性にし、ジクロロメタンで抽出した。生じた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。異なるフラクションをそれぞれ集め、オレンジ色の粉末の形態で化合物７ａを得た（２５ｍｇ、６４％）。
化合物７ａの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：δ＝１．２７（ｓ，６Ｈ），１．３５−１．８２（ｍ，６Ｈ），２．６７（ｓ，６Ｈ），３．２１−３．３１（ｍ，８Ｈ），３．４９（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｍ，４Ｈ），３．９９−４．３６（ｍ，１０Ｈ），５．９５（ｓ，２Ｈ），７．２２−７．３９（ｍ，６Ｈ），７．５４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．９３（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝７．７Ｈｚ）；
１３Ｃ｛１Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５．４ＭＨｚ，）：δ＝１４．７，１６．０，２３．４，２８．６，３１．５，３１．９，３９．１，４３．３，５３．６，５８．９，５９．６，６７．０，６８．５，７１．７，９０．７，１１８．８，１２０．０，１２１．８，１２３．３，１２５．１，１２７．１，１２７．８，１２８．０，１２９．２，１２９．８，１３３．９，１３９．４，１４０．２，１４０．９，１４１．３，１４３．８，１４３．９，１５５．６，１５６．４，１６７．５，１６９．２；
ＥＳＩ ｍ／ｚ：９８６．４（［Ｍ＋Ｎａ］＋，１００）。
化合物５ａ１３の調製
化合物５ａ１３を以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２３】
【化１５】
【０１２４】
化合物３ａ（５７０ｍｇ、１．０２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に、０°Ｃで、２９４ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（１．５３７ｍｍｏｌ）及び１８７ｍｇのジメチルアミノピリジン（１．５３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。次に、この溶液に、１４２ｍｇの、炭素１３で標識されたグリシンエステル（１．１２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、水（２×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテルのグラディエント２０／８０、３０／７０、４０／６０で溶出する）で精製し、化合物５ａ１３をオレンジ色の粉末の形態で得た（５２７ｍｇ、８２％）。
【０１２５】
化合物の特性分析５ａ１３
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：１．３２（ｓ，６Ｈ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．０２（ｄ，１Ｈ，１Ｊ＝１４１．３Ｈｚ，３Ｊ＝４．４Ｈｚ），４．１８（ｓ，４Ｈ），４．５０（ｄ，１Ｈ，１Ｊ＝１４１．３Ｈｚ，３Ｊ＝４．４Ｈｚ），６．００（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），７．６８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８Ｈｚ，ν０δ＝１５９．５６Ｈｚ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１４．７２，１６，４１．７２，５２．４８，５８．８６，５９．５４，６８．４４，７１．６６，７６．５７，７７，７７．４２，１２１．６６，１２７．７８，１２８．７１，１２９．０６，１３３．８８，１３９．２４，１４０，１４０．７２，１５５．５１，１６６．５８，１６９．９７６，１７０．７９。
化合物６ａ１３の調製
化合物６ａ１３を以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２６】
【化１６】
【０１２７】
化合物５ａ１３（５００ｍｇ、０．７９５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３０ｍＬ）に苛性ソーダ（１．２７ｇ、３２ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。２時間周囲温度で溶液を攪拌した。２０ｍＬ〜３０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物６ａ１３をオレンジ色の粉末の形態で得た（４６４ｍｇ、９５％）。
化合物６ａ１３の特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：δ＝１．２９（ｓ，６Ｈ），２．７０（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｍ，４Ｈ），３．９３（ｓ，１Ｈ，１Ｊ＝１４０．６Ｈｚ），４．１７（ｓ，４Ｈ），４．３９（ｓ，１Ｈ，１Ｊ＝１４０．６Ｈｚ），７．６７（ＡＢ ｓｙｓ，Ｈ，ＪＡＢ＝７．７２Ｈｚ，ν０δ＝１７７．９５Ｈｚ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１４．７２，１５．４３，１６．０３，４２．２０，４３．０２，５４．９４，５８．３６，５８．８５，５９．５５，６８．４６，７１．６３，７６．５７，９０．７６，１２１．７４，１２７．９４，１２８．７４，１２９．０５，１３３．７０，１３９．３５，１３９．９４，１４０．６８，１４０．７８，１５５．２６，１５５．４８，１５５．５７，１６７．３５。
化合物７ａ１３の調製
化合物７ａ１３を以下の反応スキームに従って調製する：
【０１２８】
【化１７】
【０１２９】
化合物６ａ１３（４３０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１２０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に０°Ｃで、２０７ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を一晩、氷浴を周囲温度まで戻しながら攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、１Ｍ塩酸溶液（３×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液にアセトニトリル／水混合物（１５ｍＬ／５ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（５６６ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１９３ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。溶液を周囲温度で２時間攪拌し、次に酢酸エチルで抽出した。有機相を水（３×２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ＡｃＯＥｔ １００％→ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ ９０：１０のグラディエントで溶出）。異なるフラクションをそれぞれ集め、オレンジ色の粉末の形態で化合物７ａ１３を得た（５３９ｍｇ、８０％）。
化合物７ａ１３の特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ ４００ＭＨｚ ６０°Ｃ）：δ＝１．１８（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｓ，６Ｈ），１．４０（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．２３（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝６．７２Ｈｚ）３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５１（ｍ，４Ｈ），３．６３（ｍ，４Ｈ），４．１４（ｓ，４Ｈ），４．１８（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝５．１０Ｈｚ），４．２１（ｄ，２Ｈ，１ＪＨＣ１３＝１４０Ｈｚ），６．０４（ｓ，２Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｍ，４Ｈ），７．６１（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），８．０１（ｄ，２Ｈ）。
化合物５ｂの調製
化合物５ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１３０】
【化１８】
【０１３１】
化合物３ｂ（６００ｍｇ、０．９７９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に、０°Ｃで、２８０ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（１．４７ｍｍｏｌ）及び１８０ｍｇのジメチルアミノピリジン（１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。次に、この溶液に、２０５ｍｇのグリシンエステル（１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を１時間周囲温度で攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、水（２×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテルのグラディエント２０／８０、３０／７０、４０／６０で溶出する）で精製し、化合物５ｂをオレンジ色の粉末の形態で得た（５６０ｍｇ、８２％）。
化合物５ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：０．９７（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．３５Ｈｚ），１．２２（ｓ，６Ｈ），１．３１（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１０Ｈｚ），２．２８（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．６８（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），４．１８（ｓ，４Ｈ），４．２５（ｍ，４Ｈ），６．８４（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝４．７Ｈｚ），７．７８（ＡＢ ｓｙｓ，４Ｈ，ＪＡＢ＝８．５Ｈｚ，ν０δ＝３００．４Ｈｚ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１２．０８，１４．０５，１４．２５，１４．７５，１５．３４，１７．３８，２９．７２，４２．０５，５９，５９．７６，６１．８５，６８．５５，７１．８３，９０．６２，１２７．８１，１２８．６６，１２９．１６，１３３．１１，１３３．９１，１３６．０２，１３８．６０，１４０．２７，１５４．０４，１６６．８０，１７０．１４。
化合物６ｂの調製
化合物６ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１３２】
【化１９】
【０１３３】
化合物５ｂ（５１０ｍｇ、０．７３２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍＬ）に、苛性ソーダ（１．２０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。２時間周囲温度で溶液を攪拌した。２０ｍＬ〜３０ｍＬの酢酸エチルを加えた。有機相を水（３×２０ｍＬ）で抽出する。水相を集め、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ１〜ｐＨ２まで酸性にした。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を親水性の綿で乾燥し、次に乾ききるまで蒸留し、化合物６ｂをオレンジ色の粉末の形態で得た（４９０ｍｇ、定量的）。
化合物６ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ３００ＭＨｚ）：δ＝０．９６（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．２２（ｓ，６Ｈ），２．３０（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．６８（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，６Ｈ），４．１９（ｓ，４Ｈ），３．５４（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ），４．１８（ｓ，４Ｈ），４．２６（ｄ，２Ｈ，３Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．１３（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．４０（ＡＢ ｓｙｓ，Ｈ，ＪＡＢ＝６．０Ｈｚ，ν０δ＝１６０．２Ｈｚ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，）：δ＝１２．０８，１４．０３，１４．７３，１７．３５，４１．９３，５８．９１，５９．７１，６８．４８，７１．７４，９０．５１，１２７．９０，１２８．６０，１２９．１８，１３３．１４，１３３．５７，１３６．０１，１３８．５４，１４０．３９，１５４．０４，１６７．３５，１７２．２９。
化合物７ｂの調製
化合物７ｂを以下の反応スキームに従って調製する：
【０１３４】
【化２０】
【０１３５】
化合物６ｂ（４３０ｍｇ、０．６４３ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１２ｍｇ、０．９６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に０℃で、１９０ｍｇのＮ−ジメチル−３−アミノプロピルカルボジイミド（０．９６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応媒体を一晩、氷浴を周囲温度まで戻しながら攪拌した。溶液をジクロロメタン中で希釈し、１Ｍ塩酸溶液（３×２０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３溶液、次に飽和ＮａＣｌ溶液で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次に乾ききるまで減圧下で蒸留した。残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液にアセトニトリル／水混合物（１５ｍＬ／５ｍＬ）中Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（５２２ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１８０ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。溶液を周囲温度で２時間攪拌し、次に酢酸エチルで抽出した。有機相を水（３×２０ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ＡｃＯＥｔ １００％→ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ ９０：１０のグラディエントで溶出）。異なるフラクションをそれぞれ集め、オレンジ色の粉末の形態で化合物７ｂを得た（４９１ｍｇ、７５％）。
化合物７ｂの特性分析
１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ ４００ＭＨｚ ６０°Ｃ）：δ＝０．９８（ｔ，６Ｈ，３Ｊ＝７．５０Ｈｚ），１．２６（ｓ，６Ｈ），１．４１（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｑ，４Ｈ，３Ｊ＝７．５０Ｈｚ），２．７１（ｓ，６Ｈ），３．２４（ｔ，２Ｈ，３Ｊ＝５．１０Ｈｚ），３．３４（ｓ，６Ｈ），３．５１（ｍ，４Ｈ），３．６３（ｍ，４Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｓ，４Ｈ），４．１９（ｔ，１Ｈ，３Ｊ＝５．１０Ｈｚ），４．３７（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｍ，６Ｈ），７．６２（ｍ，２Ｈ），７．８７（ＡＢ ｓｙｓ，Ｈ，ＪＡＢ＝７．６６Ｈｚ，ν０δ＝１１２．８４Ｈｚ）。
実施例２−本発明による一般式（Ｉ）の化合物で標識されたリシンを含有するペプチドの合成
実施例１に従って調製した化合物７ａ（リシンは標識されている）は自動ペプチド合成装置中で用いられ、以下のヒトβ−アミロイドペプチド１−４２に対応するアミノ酸配列の１６位でリシンと置換される：
Ｈ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ＊−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１）
このペプチドは実施例３、４及び５で用いられ、ここから先では標識されたアミロイドペプチドと呼ばれる。
実施例３及び４に共通のプロトコル
ＰＣ１２細胞（オスラット副腎髄質血管腫瘍に由来する）を先にコラーゲン及びポリオルチニンで処理したガラス底のペトリ皿に接種する。５％のＣＯ２を含有する雰囲気下、３７℃で、グルタミンを含有し、１０％のウマ血漿、５％のウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ １６４０培地中、７日間培養する。細胞の分化を誘導するため、培地に、接種の２４時間後に５０ｎｇ／ｍＬのマウス神経栄養性成長因子（ＮＧＦ）２．５Ｓを追加する。
【０１３６】
測定の前日、標識されていない配列番号１のβ−アミロイドペプチド１−４２又は対応する標識されていない配列番号２の逆ペプチド（４２−１）を１０ｎｍｏｌ．Ｌ−１及び１０００ｎｍｏｌ．Ｌ−１の間の異なる濃度で加える。
【０１３７】
次の日、この調製物を、周囲温度で、クレブス培地で３回洗い、蛍光スペクトロメーターを備えた倒立顕微鏡に設置する。ベースラインの蛍光スペクトル（励起４８０ｎｍ；発光４９５ｎｍ〜６００ｎｍ）を、標識されたアミロイドペプチド（２５０ｎｍｏｌ．Ｌ−１）の追加前に記録する。２回目の蛍光スペクトルは１０分間のインキュベーション後に記録する。
実施例３ − β−アミロイドペプチド１−４２と結合した化合物７ａの標識されていないβ−アミロイドペプチドとのプレインキュベーション後のスペクトル指数の値の測定
ベースラインスペクトルを標識されたアミロイドペプチドの蛍光スペクトルから差し引く。得られたスペクトルを、図４に説明されるように逆重畳積分及び非線形回帰によって４成分ガウス曲線に分解する。この蛍光スペクトル（黒線）は、スペクトル逆重畳積分ソフトウェアの手法により（Ｐｅａｋｆｉｔ、Seasolve Software Inc.、 www.seasolve.com）成分ガウス曲線（異なる明度のグレーの線）に分解することができる（グラフＡ）。それぞれ５２５ｎｍ及び５４０ｎｍを中心とするガウス曲線の振幅の比（グラフ又は他から逆重畳積分ソフトウェアで測定する）は、スペクトルの分布を説明するスペクトル指数を定義する。
【０１３８】
グラフＢは、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下の細胞のプレインキュベーション前の（実線）及びプレインキュベーション後の（点線）、ＰＣ１２細胞の存在下で記録した、標識されたアミロイドペプチドの蛍光スペクトルの逆重畳積分を示す。５２５ｎｍを中心にするガウス曲線の振幅の有意な増加（結果としてスペクトル指数の増加につながる）が、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下、先に細胞が設置されたときに観測される。
【０１３９】
それゆえ、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２と共に細胞をプレインキュベーションすることはスペクトルの変化につながるのが観測され、β−アミロイドペプチド１−４２の存在をサンプル中で検出することができる。
実施例４ − β−アミロイドペプチド１−４２と結合した化合物７ａの、異なる濃度の標識されていないβ−アミロイドペプチドとのプレインキュベーション後のスペクトル指数の値の測定
同じ実験原則に従い、β−アミロイドペプチド１−４２と結合した化合物７ａの異なる濃度の標識されていない配列番号１のβ−アミロイドペプチドとのプレインキュベーション後のスペクトル指数値を測定する。
【０１４０】
ＰＣ１２細胞を、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２又は４２−１の存在下で、１２時間プレインキュベートし、続いて、洗浄を行ったのち、蛍光スペクトロメーターを備えた顕微鏡下に設置する。一回目のスペクトル（ベースライン）を記録する。
【０１４１】
次に、標識されたβ−アミロイドペプチドを加える。蛍光性化合物の添加の１０分後、スペクトルを記録する。
【０１４２】
スペクトル指数は、逆重畳積分により計算される１つ目のガウスの振幅と２つ目のガウスの振幅との比である（図４を参照されたい）。
【０１４３】
結果は図５に示す：
−標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の非存在下（１つ目のヒストグラム）、
−１００ｎＭの標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下（２つ目のヒストグラム）、
−２５０ｎＭの標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の存在下（三つめのヒストグラム）、
−２５０ｎＭの標識されていないβ−アミロイドペプチド４２−１の存在下（四つ目のヒストグラム）。
【０１４４】
プローブの蛍光のスペクトル指数の値は、細胞プレインキュベーション期間に存在する標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の濃度の関数として変化する。スペクトル指数の値の変化の欠如はまた、細胞を不活性β−アミロイドペプチド４２−１の存在下でインキュベートする場合にも観測される（ステューデントのｔ検定：＊＊＊Ａｂ ０ｎＭではｐ＜０．５％；°°Ａｂ １−４２ ２５０ｎＭではｐ＜１％）。このグラフは、それぞれ三度ずつ（in triplicate）測定された４つの独立した実験を表す。
図５は、比の値の変化はβ−アミロイドペプチド１−４２によって特に誘導されたことを示し、この値はプレインキュベートされたペプチドの濃度の増加に伴って増加することを示す；さらに、β−アミロイドペプチド４２−１は比の値に有意な影響を与えないように見える。
ゆえに、プローブの蛍光スペクトルを分析することにより、細胞がプレインキュベートされたβ−アミロイドペプチドの濃度を評価することが可能になる。
実施例５ − 標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２とプレインキュベートされたラット赤血球の存在下でのβ−アミロイドペプチド１−４２と繋がった化合物７ａのスペクトル指数の値の変化
ラット血液のサンプル（１ｍｌ〜３ｍｌ）をヘパリン添加したチューブに回収する。サンプルをクレブス培地で希釈する。次に、バッファー層を捨てながら３回遠心分離する（「バフィーコート」）。得られた赤血球を、次に３７℃で２時間、様々な濃度（１０ｎｍｏｌ．Ｌ−１〜１０００ｎｍｏｌ．Ｌ−１）の、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２、又は、対応する標識されていない逆ペプチド（４２−１）の存在下でインキュベートする。追加の洗浄ののち、細胞を蛍光スペクトロメーターに設置し、ベースラインの蛍光スペクトル（励起４８０ｎｍ；発光４９５ｎｍ〜６００ｎｍ）を記録し、標識されたアミロイドペプチド（２５０ｎｍｏｌ．Ｌ−１）を添加する。２つ目の蛍光スペクトルは、標識されたアミロイドペプチドの存在下での１０分間のインキュベーションののち記録する。
【０１４５】
標識されたβ−アミロイドペプチドの蛍光スペクトルからベースラインスペクトルを差し引く。得られたスペクトルを、逆重畳積分及び非線形回帰によって４成分ガウス曲線に分解する。５１０ｎｍ付近を中心とするガウスの振幅と、５３０ｎｍ付近を中心とするガウスの振幅との比を計算する。その値は、図６に説明するように、標識されていないβ−アミロイドペプチド１−４２の濃度（その存在下で細胞がインキュベートされる）の関数として変化する。
【０１４６】
図６のヒストグラムは、スペクトル指数の値が、細胞のプレインキュベーション時に用いられる、標識されていないβ−アミロイドペプチド濃度の関数として増加することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
−Ｒ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ａｒ、Ｚ、Ｌ及びＧは以下に定義され；
−Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、ｍは０又は１であり；
置換基Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のうち１つのみが−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ又は−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚであることが理解され；
−Ｒ２及びＲ５は、同じ又は異なっていて、それぞれ独立して水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ｌ及びＧは以下に定義される；
−Ｓ１及びＳ２は親水基であり、同じ又は異なっていて、式−Ｃ≡Ｃ−Ｌ’−Ａであり、
ここで、Ｌ’及びＡは以下に定義され；
−ＡｒはＣ５−Ｃ１４アリーレン又はヘテロアリーレンから選択され、その−ＣＯ−Ｚ基はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にあり；
−Ｚは−ＯＨ基、−Ｏ−スクシンイミド基、−Ｏ−マレイミド基、−Ｎ−グリシン基、−Ｎ−リシン基、−Ｙ−Ｌ’’−ＮＨ２基、−Ｙ−Ｌ’’−ＣＯＯＨ基又は−Ｙ−Ｌ’’−ＳＨ基から選択され、ここで、ＹはＮ原子及びＯ原子から選択され、Ｌ’’は以下に定義され；
−Ｌ及びＬ’’はそれぞれ独立して単結合、任意に分岐したＣ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ６、飽和炭素鎖、Ｃ６−Ｃ１６アリーレン（Ｌについてはその−Ｈ基又は−Ｇ基、Ｌ’’についてはその−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基又は−ＳＨ基はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にある）、Ｃ２−Ｃ４アルケニレン、Ｃ２−Ｃ４アルキニレン、１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、１個〜４個のアミド基−ＣＯ−ＮＨ―を間に挟む直鎖又は分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、ヌクレオチドセグメント及び／又は糖セグメントから選択され；
−Ｇはスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、ホスホルアミデート、Ｃ２−Ｃ５アルキルイミデート、Ｃ６−Ｃ１０アリールイミデート、酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物及び酸臭化物、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドラジン類、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドロキシルアミン、カルボジイミド並びにパーフルオロ−フェノールからなる群から選択され；
−Ｌ’は単結合、Ｃ１−Ｃ１０アルケニレン又は１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖若しくは分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖から選択され；かつ
−ＡはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチル、ホスフェート基、又はスルホネート基から選択される基を表す）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１が−Ａｒ−ＣＯ−Ｚであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
対称であり、Ｒ２及びＲ５が同一であり、Ｒ３及びＲ６が同一であり、Ｒ４及びＲ７が同一であり、Ｓ１及びＳ２が同一であり、並びにＲ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚを有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒがベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ピリジン、ピリミジン、チオフェン又はピロールから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ａがメチル、プロピルスルホネート、エチルスルホネート、又はメチルホスフェートから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
１個〜１０個の酸素原子を間に挟む前記直鎖又は分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖がポリ（エチレンオキシド）又はポリ（プロピレンオキシド）であり、その単位は１回〜６回の間で繰り返すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
水、アルコール、アミン又はチオールから選択される求核剤、及びパラジウムを含有する触媒の存在下での炭素源との反応により合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑを一般式（Ｉ）の化合物へと変換することを含み；
前記合成中間体は、Ｐが、基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７がＲ１の−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、又はＲ３若しくはＲ４若しくはＲ６若しくはＲ７の−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚを除いては、同様に調製される一般式（Ｉ）の化合物の構造と同一構造の基であり、Ａｒは式（Ｉ）に定義されるとおりであり、ｍは０又は１であり、Ｒ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚである場合ｍは１であることが理解され、Ｑはハロゲン原子、−Ｏ−トリフレート、−Ｏ−トシレート又は−Ｏ−メシレートから選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物を調製する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物の蛍光性マーカーとしての使用。
【請求項９】
一般式（ＩＩ）の標識された生体分子：
Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ （ＩＩ）
（式中、
−Ｐは請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物（ただし−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ基である基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７を除く）であり
−ＡｒはＣ５−Ｃ１０アリーレン又はヘテロアリーレンから選択され、その−ＣＯ−Ｚ基がオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にあり、
−ｍは０又は１であり、−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ基がＲ１で置換されていればｍは１であることが理解され、
−Ｘはカルボキシル基、アミン基又はチオール基を有するスペーサーであり、
−ｎは０又は１に等しい整数であり、かつ
−Ｔは生体分子である）。
【請求項１０】
Ｔが天然アミノ酸又は合成アミノ酸、ポリペプチド、ビオチン又はその誘導体若しくはその構造類縁体の１つ、ヌクレオチド又は核酸から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の標識された生体分子。
【請求項１１】
Ｔが配列番号１のβ−アミロイドペプチド１−４２に由来するペプチドであることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の標識された生体分子。
【請求項１２】
Ｘが、少なくとも１つのアミノ酸又は２個若しくは３個の酸素原子を間に挟んでもよいＣ１−Ｃ６アルキレンを含有する鎖から選択されることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の標識された生体分子。
【請求項１３】
Ｚが末端カルボン酸を含有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物をヒドロキシスクシンイミドエステルへと変換する工程、及びＴと反応させる工程を含むことを特徴とする、Ｔがアミノ酸である請求項９〜１２のいずれか一項に記載の生体分子を調製する方法。
【請求項１４】
Ｔがビオチン又はその誘導体若しくはその構造類縁体の１つである請求項９又は請求項１０に記載の生体分子を調製する方法であって、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物から実施され、前記化合物（Ｉ）は（ｉ）脂肪族ジアミンの加水分解反応によってアミドへと変換され、次に（ｉｉ）ビオチン、又は遊離カルボン酸基を保持するその誘導体若しくは構造類縁体の１つと反応することを特徴とする、生体分子を調製する方法。
【請求項１５】
Ｔがヌクレオチドである請求項９又は請求項１０に記載の生体分子を調製する方法であって、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物から実施され、該化合物（Ｉ）を遊離アミン基を有する修飾されたヌクレオチドと反応させることを特徴とする、生体分子を調製する方法。
【請求項１６】
サンプル中で、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子のリガンドを検出する方法であって、
ａ）前記試験されるサンプル単独での蛍光発光スペクトルを測定する工程（得られたスペクトルは「ベースライン」と称する）、
ｂ）溶液中での前記標識された生体分子の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、変形指数を計算する工程、
ｃ）前記標識された生体分子を、前記試験されるサンプルと溶液中でインキュベートし、そして、混合物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた前記混合物の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、前記変形指数を計算する工程、並びに
ｅ）工程ｂ）及び工程ｄ）で計算した前記変形指数を比較し、そして、該指数が異なる場合には、前記リガンドと前記標識された生体分子との間の相互作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出する方法。
【請求項１７】
前記リガンドがβ−アミロイドペプチド１−４２であり、前記サンプルが赤血球を含有し、前記標識された生体分子が請求項１１に記載のものである請求項１６に記載の方法を実施することを特徴とする、アルツハイマー病を診断する方法。
【請求項１８】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子のリガンドと相互作用することが可能な化合物を同定する方法であって、
ａ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、溶液中で前記標識された生体分子の変形指数を計算する工程、
ｂ）前記標識された生体分子を、溶液中でのリガンドとインキュベートし、混合物１を得る工程、
ｃ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、前記混合物１の変形指数を計算する工程、
ｄ）前記リガンドを前記試験される化合物とインキュベートし、続いて前記標識された生体分子を溶液中に添加し、そして、混合物２を得る工程、
ｅ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、混合物２を変形指数の計算する工程、
ｆ）工程ａ）、工程ｃ）及び工程ｅ）で計算された変形指数の比較により、前記リガンドと前記試験される化合物の間の相互作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする、同定する方法。
【請求項１９】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法を実施する診断キット。
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
−Ｒ１は−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ａｒ、Ｚ、Ｌ及びＧは以下に定義され；
−Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ、水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、ｍは０又は１であり；
置換基Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７のうち１つのみが−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ又は−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚであることが理解され；
−Ｒ２及びＲ５は、同じ又は異なっていて、それぞれ独立して水素原子（−Ｈ）、−Ｌ−Ｈ、−Ｇ及び−Ｌ−Ｇからなる群から選択され、
ここで、Ｌ及びＧは以下に定義される；
−Ｓ１及びＳ２は親水基であり、同じ又は異なっていて、式−Ｃ≡Ｃ−Ｌ’−Ａであり、
ここで、Ｌ’及びＡは以下に定義され；
−ＡｒはＣ５−Ｃ１４アリーレン又はヘテロアリーレンから選択され、その−ＣＯ−Ｚ基はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にあり；
−Ｚは−ＯＨ基、−Ｏ−スクシンイミド基、−Ｏ−マレイミド基、−Ｎ−グリシン基、−Ｎ−リシン基、−Ｙ−Ｌ’’−ＮＨ２基、−Ｙ−Ｌ’’−ＣＯＯＨ基又は−Ｙ−Ｌ’’−ＳＨ基から選択され、ここで、ＹはＮ原子及びＯ原子から選択され、Ｌ’’は以下に定義され；
−Ｌ及びＬ’’はそれぞれ独立して単結合、任意に分岐したＣ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ６、飽和炭素鎖、Ｃ６−Ｃ１６アリーレン（Ｌについてはその−Ｈ基又は−Ｇ基、Ｌ’’についてはその−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基又は−ＳＨ基はオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にある）、Ｃ２−Ｃ４アルケニレン、Ｃ２−Ｃ４アルキニレン、１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、１個〜４個のアミド基−ＣＯ−ＮＨ―を間に挟む直鎖又は分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖、ヌクレオチドセグメント及び／又は糖セグメントから選択され；
−Ｇはスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、ホスホルアミデート、Ｃ２−Ｃ５アルキルイミデート、Ｃ６−Ｃ１０アリールイミデート、酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物及び酸臭化物、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドラジン類、Ｃ１−Ｃ４アルキルで置換されたヒドロキシルアミン、カルボジイミド並びにパーフルオロ−フェノールからなる群から選択され；
−Ｌ’は単結合、Ｃ１−Ｃ１０アルケニレン又は１個〜１０個の酸素原子を間に挟む直鎖若しくは分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖から選択され；かつ
−ＡはＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチル、ホスフェート基、又はスルホネート基から選択される基を表す）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１が−Ａｒ−ＣＯ−Ｚであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
対称であり、Ｒ２及びＲ５が同一であり、Ｒ３及びＲ６が同一であり、Ｒ４及びＲ７が同一であり、Ｓ１及びＳ２が同一であり、並びにＲ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚを有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒがベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ピリジン、ピリミジン、チオフェン又はピロールから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ａがメチル、プロピルスルホネート、エチルスルホネート、又はメチルホスフェートから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
１個〜１０個の酸素原子を間に挟む前記直鎖又は分岐飽和Ｃ１−Ｃ２０炭素鎖がポリ（エチレンオキシド）又はポリ（プロピレンオキシド）であり、その単位は１回〜６回の間で繰り返すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
水、アルコール、アミン又はチオールから選択される求核剤、及びパラジウムを含有する触媒の存在下での炭素源との反応により合成中間体Ｐ−（Ａｒ）ｍ−Ｑを一般式（Ｉ）の化合物へと変換することを含み；
前記合成中間体は、Ｐが、基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７がＲ１の−Ａｒ−ＣＯ−Ｚ、又はＲ３若しくはＲ４若しくはＲ６若しくはＲ７の−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚを除いては、同様に調製される一般式（Ｉ）の化合物の構造と同一構造の基であり、Ａｒは式（Ｉ）に定義されるとおりであり、ｍは０又は１であり、Ｒ１がカルボニル基−Ａｒ−ＣＯ−Ｚである場合ｍは１であることが理解され、Ｑはハロゲン原子、−Ｏ−トリフレート、−Ｏ−トシレート又は−Ｏ−メシレートから選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物を調製する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物の蛍光性マーカーとしての使用。
【請求項９】
一般式（ＩＩ）の標識された生体分子：
Ｐ−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ （ＩＩ）
（式中、
−Ｐは請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物（ただし−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−Ｚ基である基Ｒ１又はＲ３又はＲ４又はＲ６又はＲ７を除く）であり
−ＡｒはＣ５−Ｃ１０アリーレン又はヘテロアリーレンから選択され、その−ＣＯ−Ｚ基がオルト位、メタ位又はパラ位、好ましくはパラ位にあり、
−ｍは０又は１であり、−（Ａｒ）ｍ−ＣＯ−（Ｘ）ｎ−Ｔ基がＲ１で置換されていればｍは１であることが理解され、
−Ｘはカルボキシル基、アミン基又はチオール基を有するスペーサーであり、
−ｎは０又は１に等しい整数であり、かつ
−Ｔは生体分子である）。
【請求項１０】
Ｔが天然アミノ酸又は合成アミノ酸、ポリペプチド、ビオチン又はその誘導体若しくはその構造類縁体の１つ、ヌクレオチド又は核酸から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の標識された生体分子。
【請求項１１】
Ｔが配列番号１のβ−アミロイドペプチド１−４２に由来するペプチドであることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の標識された生体分子。
【請求項１２】
Ｘが、少なくとも１つのアミノ酸又は２個若しくは３個の酸素原子を間に挟んでもよいＣ１−Ｃ６アルキレンを含有する鎖から選択されることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の標識された生体分子。
【請求項１３】
Ｚが末端カルボン酸を含有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物をヒドロキシスクシンイミドエステルへと変換する工程、及びＴと反応させる工程を含むことを特徴とする、Ｔがアミノ酸である請求項９〜１２のいずれか一項に記載の生体分子を調製する方法。
【請求項１４】
Ｔがビオチン又はその誘導体若しくはその構造類縁体の１つである請求項９又は請求項１０に記載の生体分子を調製する方法であって、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物から実施され、前記化合物（Ｉ）は（ｉ）脂肪族ジアミンの加水分解反応によってアミドへと変換され、次に（ｉｉ）ビオチン、又は遊離カルボン酸基を保持するその誘導体若しくは構造類縁体の１つと反応することを特徴とする、生体分子を調製する方法。
【請求項１５】
Ｔがヌクレオチドである請求項９又は請求項１０に記載の生体分子を調製する方法であって、カルボン酸を有するＺ基で官能基化された請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物から実施され、該化合物（Ｉ）を遊離アミン基を有する修飾されたヌクレオチドと反応させることを特徴とする、生体分子を調製する方法。
【請求項１６】
サンプル中で、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子のリガンドを検出する方法であって、
ａ）前記試験されるサンプル単独での蛍光発光スペクトルを測定する工程（得られたスペクトルは「ベースライン」と称する）、
ｂ）溶液中での前記標識された生体分子の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、変形指数を計算する工程、
ｃ）前記標識された生体分子を、前記試験されるサンプルと溶液中でインキュベートし、そして、混合物を得る工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた前記混合物の蛍光発光スペクトルを測定し、得られたスペクトルからベースラインを差し引き、そして、前記変形指数を計算する工程、並びに
ｅ）工程ｂ）及び工程ｄ）で計算した前記変形指数を比較し、そして、該指数が異なる場合には、前記リガンドと前記標識された生体分子との間の相互作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出する方法。
【請求項１７】
前記リガンドがβ−アミロイドペプチド１−４２であり、前記サンプルが赤血球を含有し、前記標識された生体分子が請求項１１に記載のものである請求項１６に記載の方法を実施することを特徴とする、アルツハイマー病を診断する方法。
【請求項１８】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子のリガンドと相互作用することが可能な化合物を同定する方法であって、
ａ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、溶液中で前記標識された生体分子の変形指数を計算する工程、
ｂ）前記標識された生体分子を、溶液中でのリガンドとインキュベートし、混合物１を得る工程、
ｃ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、前記混合物１の変形指数を計算する工程、
ｄ）前記リガンドを前記試験される化合物とインキュベートし、続いて前記標識された生体分子を溶液中に添加し、そして、混合物２を得る工程、
ｅ）蛍光発光スペクトルを測定し、そして、混合物２を変形指数の計算する工程、
ｆ）工程ａ）、工程ｃ）及び工程ｅ）で計算された変形指数の比較により、前記リガンドと前記試験される化合物の間の相互作用を検出する工程、
を含むことを特徴とする、同定する方法。
【請求項１９】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の標識された生体分子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法を実施する診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５１３９７３（Ｐ２０１２−５１３９７３Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２８６４（Ｐ２０１１−５４２８６４）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００１４８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６４３３
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【出願人】（５０９２２８２６０）ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００１４８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６４３３
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【出願人】（５０９２２８２６０）ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール (8)
【Ｆターム（参考）】
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