新規の非タンパク分解起源の可溶性ＥＰＣＲタンパク質およびその使用
本発明は、選択的スプライシング機構に由来する新規の可溶形ＥＰＣＲに関し、より詳細には、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６または前記配列のフラグメントを含むポリペプチドに関する。本発明はまた、前記ポリペプチドを含む組み換え型または単離されたＥＰＣＲタンパク質、前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリペプチドを含むタンパク質をコードするｍＲＮＡ、および疾患の検出におけるこれらの使用に関する。本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたは宿主細胞、発現ベクターと前記細胞を含む発現系、前記ポリペプチドに対して特異的な単離された抗体、および生体試料における配列番号１の配列を含むＥＰＣＲタンパク質の選択的なインビトロ検出のための方法およびキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
最近記載されているプロテインＣシステム（ＰＣ）のタンパク質は、内皮プロテインＣ／活性化プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）である（１、２）。ＥＰＣＲは、内皮細胞の膜上に発現され、高親和性でＰＣおよび活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）と結合する（Ｋｄ〜３０ｎＭ）。その生理学的使命は、内皮表面上のＰＣを濃縮し、これをトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示し、それによって、ＰＣの効率的な活性化を助けることである（３）。ヒト以外の霊長類に関して実施された研究では、モノクローナル抗体を用いてＥＰＣＲをブロックすることは、ＡＰＣの生理学的産生を９０％減少させることが実証されており、また、最近の研究では、ＥＰＣＲの遺伝的欠陥が、静脈および動脈の血栓形成を患う素因になる可能性があることが示唆されている（４〜７）。これらの事実は、凝固調節において、また血栓形成において、ＥＰＣＲが果たす可能性がある重要な役割を実証する。さらに、ＥＰＣＲは、ＰＣの強力な抗炎症作用を担う分子の１つであるように思われる。
【０００２】
ＥＰＣＲとＰＣ／ＡＰＣの相互作用は、グラム陰性細菌による感染中に現れる凝血異常性および炎症性の反応の調節の際に、重要な役割を果たす可能性がある（８）。近年では、ＡＰＣは、内皮細胞上の抗炎症および抗アポトーシス作用を有すること、また、この作用が現れるためにはＥＰＣＲの存在が不可欠であることが実証されている（９、１０）。
【０００３】
ＥＰＣＲは、約４６ｋＤａの糖タンパク質である。成熟タンパク質は、１７残基からなるシグナルペプチドの排除後の、２２１アミノ酸からなる（１１）。これは、３つのイントロンによって分断された４つのエキソンによって形成される、染色体２０（２０ｑ１１．２）のロングアーム中に位置する遺伝子によってコードされる（１２）。エキソンＩは、５’非翻訳領域およびシグナルペプチドをコードし、エキソンＩＶは、膜貫通ドメイン、３残基の細胞質内テール、および３’非翻訳領域をコードする。エキソンＩＩおよびＩＩＩは、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体のＣＤ１スーパーファミリーに属するタンパク質のドメインα１およびα２との相同性を有する、ＥＰＣＲの細胞外領域の大部分をコードする。近年では、ＥＰＣＲが、ポケット（そこには、分子を安定させるリン脂質が収容される）を形成する、折り畳まれたβシート（その上にはαヘリックス構造を２つ有する）によって形成されるプラットフォームを、どのように有するかを示す三次元構造が、首尾よく結晶化され、分析されている（１３）。同様に、アラニンスキャニングによって、ＰＣ／ＡＰＣとの結合に関与する主要な残基（カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在下で、そのＧＬＡドメインを介して結合する）が特定されている（１４）。
【０００４】
しかし、内皮細胞膜上に固定されるＥＰＣＲに加えて、トロンビンなどの刺激によって誘導されるメタロプロテイナーゼによるＥＰＣＲの消化に少なくとも部分的に由来する、血漿可溶形（ｓＥＰＣＲ）が存在する（１５、１６）。
【０００５】
論文（１５）「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１００」、ｎｏ．２、１９９７年７月、４１１〜４１８は、血漿中に見られるＥＰＣＲの可溶形に関する。この論文には、血漿中のＥＰＣＲは、独特の種であるように思われ、精製されたタンパク質のアミノ末端フラグメントの配列決定では、血漿ＥＰＣＲの特有の配列が示され、これは、組換えｓＥＰＣＲのアミノ末端配列と一致したことが記載されている。この論文には、前記可溶性ＥＰＣＲの起源は、他の受容体の場合と同様に、タンパク分解性の破断または選択的切断−スプライシング機構である可能性があり、特に、ウシＥＰＣＲのゲノム構造は、タンパク質をコードする選択的切断部位を含有する（ここでは、膜貫通ドメインが、エキソンＩＩＩの後に位置しているイントロンによってコードされる配列によって置き換えられる）ことが記載されている（１７）。この文献は、選択的切断から得られるＥＰＣＲの形の可能性を証明するために、より多くの研究が必要であることを示している。
【０００６】
さらに、国際公開第−９９００６７３号には、ヒト血漿におけるｓＥＰＣＲの単離および特徴づけに関し、ｓＥＰＣＲが、タンパク質加水分解に由来する（ここでは、ＥＰＣＲの細胞外ドメインは遊離され、膜に結合した残りのタンパク質から離れる）、あるいは、ｍＲＮＡの選択的切断−スプライシング機構（これは、ａｌｔｓＥＰＣＲの配列を生じさせる）に由来する可能性があることが記載されている。本出願の図１は、タンパク分解起源の可溶性ＥＰＣＲ（ｐｓＥＰＣＲ）と、選択的切断−スプライシングによって得られる国際公開第−９９００６７３号に開示されたＥＰＣＲ（ａｌｔｓＥＰＣＲ）と、本発明の新規のＥＰＣＲ目的物（ｓＥＰＣＲｖａｒ）との間の違いを見ることができる図を示す。
【０００７】
したがって、本出願によって、少なくとも、ヒトＥＰＣＲは、選択的切断−スプライシング・プロセスを受け、前記選択的切断−スプライシング機構から得られる可溶性のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲｖａｒ）中にのみ存在する特有のインサートを含む、可溶性の切断型ＥＰＣＲを生じる可能性があることが示される。前記ｓＥＰＣＲｖａｒは、大血管における、またガンにおける疾患プロセスマーカーとして働く可能性がある。
【０００８】
ＡＰＣが、ｓＥＰＣＲに結合する場合、その抗凝血特性を失うが、その酵素的能力は維持されるため、ｓＥＰＣＲが、ＡＰＣ特異性を変化させ、おそらく、これを基質（現在は未知である）に方向付け、これが、ＡＰＣに起因する抗炎症特性につながる可能性があると考えられる（１８）。ｓＥＰＣＲは、膜上に存在するＥＰＣＲと、プロテインＣに対して競合し、このようにしてＡＰＣ産生を抑制する。ｓＥＰＣＲは、プロテイナーゼ−３（ＰＲ３）（１９）、好中球顆粒およびＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）中に存在するプロテイナーゼ、好中球および単球の表面に存在する誘導性の発現のインテグリンを介して、活性化された好中球と相互作用することが可能であることも記載されている。ＰＲ３は、おそらく、膜結合型ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１ベータ前駆体に作用する組織破壊メカニズムに関与する。Ｍａｃ−１は、細胞シグナル伝達および細胞間接着現象に介在し、内皮ＩＣＡＭ−１などの接着分子と相互作用し、その理由で、炎症性プロセス中の好中球の補充において役割を果たす。ＰＲ３およびＭａｃ−１へのｓＥＰＣＲの結合は、おそらく、その活性を低下させるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から開始して、新規のタンパク質をクローン化し、発現させることを可能にした。前記タンパク質は、その配列の、他の既知の配列との分析および比較、ならびにその機能の特徴づけによって、選択的スプライシング・プロセスによって産生される可溶性のＥＰＣＲタンパク質の未知の形であることが示された。一方、前記タンパク質は、示差的な特徴として、現在知られているＥＰＣＲ形には存在しない、当初ＥＰＣＲ遺伝子３’非翻訳領域と考えられていた領域によってコードされるポリペプチドの領域を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［発明の詳細な説明］
本発明は第一に、新規の可溶形のＥＰＣＲ（これを、本発明者らは、可溶性のＥＰＣＲ変異体（ｓＥＰＣＲｖａｒ）と呼ぶ）に、より詳細には、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含む、内皮プロテインＣ受容体または前記配列の残基のフラグメントから得られるポリペプチドに関する。ある特定の実施形態では、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する。本発明の特定の実施形態によれば、前記フラグメントは、配列番号１の残基２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、２４２〜２５６を含むフラグメントから選択される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、前記フラグメントは免疫原特性を有し、これは特に、特異的抗体を産生するための手順で有用である。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドを含む、単離されたあるいは組み換え型のタンパク質に関する。前記タンパク質は、ＥＰＣＲタンパク質である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記単離されたあるいは組み換え型のＥＰＣＲタンパク質は、配列番号１の配列を含む。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントを含む組み換え型タンパク質である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６によって形成されるポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列に由来する。このｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから逆転写されたＤＮＡに関する。
【００１６】
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ構築物中に含有される可能性がある。したがって、本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むタンパク質またはポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントをコードするＤＮＡ構築物である。好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する。前記構築物のある特定の実施形態では、これは、配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチドを含む。前記ＤＮＡ構築物は、前記タンパク質またはポリペプチドに作動可能に結合される制御配列を組み込む可能性がある。核酸またはポリヌクレオチドに関して、「作動可能に結合される」は、あるヌクレオチド領域が、別のヌクレオチド配列と、機能的関係に置かれることを意味する。「制御配列」は、機能（例えばある種のコード配列の転写および翻訳など）を調節する、ある種の宿主細胞によって特に認識される発現シグナルである。プロモーター、発現エンハンサー、転写ターミネーター、リボソーム結合部位などは制御配列である。ＤＮＡ構築物を形成するための所望の配列のスプライシングは、適切な制限部位における切断およびスプライシングによって行うことができる。これらの結合部位が存在しない場合、アダプターまたはスペーサーとして合成のオリゴヌクレオチドを使用して、従来の遺伝子工学的方法によってこれらを産生することが可能である。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物は、しばしば実験室マニュアルに書き留められている従来の遺伝子工学的方法によって得ることができる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドまたは構築物は、適切な発現ベクター中に挿入させることができる。したがって、本発明のさらなる目的は、前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む発現ベクターである。本発明の様々な実施形態における発現ベクターの選択は、前記発現ベクターが挿入されることとなる宿主細胞に依存する。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物が挿入されるベクターは、プラスミドまたはウイルス（これらは、一旦宿主細胞中に導入された場合に、細胞のゲノムに組み込まれる可能性もあるし、組み込まれない可能性もある）である可能性がある。この発現ベクターはまた、従来方法によって得ることができる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６含むポリペプチドまたは前記配列の残基の少なくとも９アミノ酸を有するフラグメントををコードするポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む、形質転換された宿主細胞である。本発明によれば、形質転換された宿主細胞は、原核生物細胞（例えば大腸菌）または真核生物（例えば酵母、特にピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫細胞または哺乳類細胞株であり得る。
【００２０】
本発明のある特定の実施形態では、配列番号２を有する本発明のポリヌクレオチドは、本発明において開示される選択的切断およびスプライシングによって産生される新規の形のｓＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲｖａｒ）に相当する、配列番号１の組み換え型のｓＥＰＣＲタンパク質を産生するために、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）中に導入される。組み換え型タンパク質の産生に必要なＤＮＡ構築物、発現ベクター、および形質転換された宿主細胞を産生するために使用される方法は、その精製のためのプロセスを含めて、後ほど詳述する。
【００２１】
本発明のある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む発現ベクターは、組成物中でのその使用、およびインビボでの遺伝子導入または治療のプロセスのために設計される。より具体的な実施形態では、この発現ベクターは、ウイルスベクターである。この目的に適したウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス類縁体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）ベクターなどが挙げられる。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドまたは前記構築物で形質転換される宿主細胞を含む発現系である。好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を含む。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の残基２０１〜２５６を含むタンパク質またはポリペプチド、または前記配列の残基の好ましくは少なくとも９アミノ酸を有するフラグメントを産生する方法であって、前記方法が、前記タンパク質、ポリペプチド、またはフラグメントの発現を可能にする条件で、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする方法である。培養を最適化する条件は、使用される宿主細胞に依存する。所望により、この方法はまた、発現されたタンパク質またはポリペプチドを単離および精製するためのいくつかのステップを含む可能性がある。
【００２４】
あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、他の従来方法によって、例えば固相技術に関する化学合成、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製によって得ることができ、所望により、これらを、従来の技術、例えば配列決定および質量分析、アミノ酸分析、核磁気共鳴などによって分析することもできる。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列を含むタンパク質または前記配列の残基のフラグメントをコードするｍＲＮＡである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基の免疫原特性を有するフラグメントに対する、特定の単離された抗体である。ある特定の実施形態では、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、前記抗体は、その配列が残基２０１〜２５６、２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、および２４２〜２５６（すべて配列番号１に関する）から選択されるポリペプチドまたはフラグメントに対して特異的である。
【００２８】
別の特定の実施形態では、前記抗体は、配列番号１に対して特異的であり、これが領域２０１〜２５６に結合しない場合には領域１〜２００を認識しない。
【００２９】
好ましい実施形態によれば、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、生体試料における、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質（例えば配列番号１の新規のＥＰＣＲタンパク質）、または前記配列の残基のフラグメントの選択的インビトロ検出のための方法であって、
−生体試料を得ること、
−配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントの量を分析すること、
を含む方法である。
【００３１】
前記生体試料は、生体材料を含む任意の試料である可能性がある。好ましい実施形態では、前記生体試料は、尿、血漿、血清、組織、または間質液試料である。
【００３２】
前記方法は、例えば、質量分析、イムノアッセイ、化学アッセイ、液体クロマトグラフィー、および様々な間接的および直接的光度測定方法を含めた、任意の既知の方法であり得る。例えば、いくつかの分析法は、質量分析を使用するマーカーを定量化するために適用される可能性がある。一般的に言うと、マーカーは、例えば液体クロマトグラフィーまたは二次元ゲル電気泳動によって、生体試料から単離される。マーカーは、質量分析、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）を伴うタンデム質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（「マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析・飛行時間型ＭＳ」）などによって定量化される。標的マーカーは、既知量の精製されたマーカー標準と比較することによって、あるいは、健康な対照から得られる同じタイプの生体試料中に存在する前記マーカーの量と比較することによって定量化することができる。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、この方法は、イムノアッセイであり得る。一般に、イムノアッセイには、１種または複数のマーカーリガンドが使用される。本発明で使用される「リガンド」は、標的マーカーに特異的に結合することが可能な任意の化合物または分子である。これらのリガンドは、別々に、あるいは組み合わせて使用することができる（例えば、抗体は、アプタマーと組み合わせて使用することができる）。
【００３４】
本発明の一つの実施形態では、イムノアッセイは、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）アッセイ、不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、イムノメトリックアッセイ（サンドイッチ）、濁度アッセイ、比濁アッセイ、または他の同様のアッセイである可能性がある。同様に、イムノアッセイは、手動で、あるいは自動分析器を用いて行われる可能性がある。
【００３５】
本発明の方法では、前記タンパク質の量は、血管損傷に関連する炎症性疾患、炎症、凝固異常に関連する疾患、およびガンから選択される疾患に関連する。前記疾患はまた、狼瘡などの自己免疫性疾患、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、移植のモニタリングの際の不安定狭心症、再狭窄、血管形成、および肝臓または腎臓病である可能性もある。
【００３６】
本発明の方法によれば、検出されるＥＰＣＲタンパク質の量はまた、較正標準と比較することができる。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質、例えば、配列番号１の新規のＥＰＣＲタンパク質、または前記配列の残基の好ましくは少なくとも９アミノ酸のフラグメントの検出および定量化のための試験キットであって、
ａ）配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントに特異的な抗体、即ち、領域２０１〜２５６に結合しない場合には領域１〜２００を認識しない配列番号１のタンパク質に特異的な抗体、
ｂ）抗体ａ）と、生体試料中に存在する配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントとの間の反応を検出する試薬、
を含むキットである。
【００３８】
好ましくは、このキットはまた、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質の正常および異常なレベルと、産生される反応物の量を相関させるための標準を含む。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質、例えば配列番号１の新規のＥＰＣＲタンパク質、または前記配列の残基のフラグメントに相当するｍＲＮＡの検出および定量化のための、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメント（好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する）をコードするポリヌクレオチドの使用である。前記ＥＰＣＲタンパク質は、血管損傷に関連する炎症性疾患、炎症、ガン、および凝固異常に関連する疾患から選択される疾患に関連する量で存在する。
【００４０】
さらに、非タンパク分解起源の新規の可溶形のＥＰＣＲは、この形の可溶性のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲｖａｒ）の存在を、単独的かつ独占的に検出するのに選択的である分析方法であって、他の形の可溶性のＥＰＣＲまたは膜ＥＰＣＲが検出される方法と重複する前記方法を用いずに、特定の疾患を検出できるという利点を有する分析方法の開発のために役割を果たす可能性がある。
【００４１】
［図面の簡単な説明］
図１は、ＲＮＡがプロセッシングされ、成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が産生される方式に依存する、異なるタイプのＥＰＣＲを示す図である。３つの別の形のｍＲＮＡが産生される可能性があり、これらは、続いて、３つの異なる形のタンパク質を産生することとなる：１：膜ＥＰＣＲ（ｍＥＰＣＲ）として翻訳されるタンパク質とは異なる４つのエキソンを伴うｍＲＮＡ。２．エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩのみを含み、その後にイントロン３およびこのイントロンの後の全配列が続く、国際公開第９９００６７３号パンフレット中にエスモン（Ｅｓｍｏｎ）によって開示された可溶形のＥＰＣＲ（ａｌｔｓＥＳＰＣ）として翻訳されることとなるｍＲＮＡ。３．本発明に開示された新規の形の選択的切断およびスプライシングによって、エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩを含むｍＲＮＡが産生されることとなるが、プロセッシング中に、エキソンＥｘ ＩＶは失われ、この理由から、膜貫通ドメインも細胞質のテールも転写されず、その場所では、エキソンＩＩＩの後、３’非翻訳領域に位置する潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）エキソンであるであろう配列が出現し、この場合、ｍＲＮＡは、本発明の新規の可溶性ＥＰＣＲ形（ｓＥＰＣＲｖａｒ）として翻訳される。可溶性ＥＰＣＲはまた、おそらくメタロプロテアーゼ（まだ特徴づけられていない）から、タンパク分解活性によって産生することもできる。メタロプロテアーゼは、膜高さでＥＰＣＲを切断し、その結果、細胞外受容体の画分からなり、膜貫通ドメインおよび細胞質内テールを欠く、新規の可溶形のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）が産生される。
【００４２】
図２は、特異的なＥＰＣＲ遺伝子プライマーを用いるＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡの増幅の後に得られるバンドパターンである：野生型ＥＰＣＲ ｃＤＮＡ（１２２１ｂｐ、矢印１）に相当するバンドに加えて、選択的切断−スプライシングによって産生された新規の変異体アイソフォームのｃＤＮＡに相当する新規の増幅断片が認められる（矢印２）。
【００４３】
図３は、どちらも緑色蛍光タンパク質と融合させた、野生型ＥＰＣＲ（パネルＡ）を用いて、あるいはアイソフォーム（パネルＢ）を用いて形質移入されたＣＯＳ−７細胞である。パネルＡは、野生型タンパク質が、細胞膜（矢印）上に蓄積する傾向があることを示すのに対して、アイソフォーム３を用いた場合、この局在化パターンは認められない（パネルＢ）。
【００４４】
図４は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるｓＥＰＣＲｖａｒ発現を説明する図である。本明細書に示すように、ｓＥＰＣＲｖａｒは、安定に形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞の上清から精製された。パネルＡ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＧＥＬＣＯＤＥ Ｂｌｕｅ染料を使用して検出された様々なタンパク質を示す。ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：組み換え型のｓＥＰＣＲ。約４２ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。ストリート ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。４７ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。パネルＢ：モノクローナル抗−ＥＰＣＲ抗体を用いるウェスタンブロットによって検出されるタンパク質、ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：ブランク、ストリート ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。約４７ｋＤａのブロードなバンド（様々なタンパク質のグリコシル化に起因し、３５から６０ｋＤａまでの間に広がる）が観察される。
【００４５】
図５は、異なる組織および腫瘍由来のｃＤＮＡからのＥＰＣＲ遺伝子の増幅である。パネルＡ）１：分子量マーカー、２：心臓、３：肝臓、４：腎臓、５：膵臓、６：肺、７：胎盤。パネルＢ）１：分子量マーカー、２：骨格筋、３：脳、４：胸腺、５：小腸、６：脾臓。パネルＣ）１：マーカー、２：前立腺、３：睾丸、４：卵巣、５：大腸。パネルＤ）は、肺腫瘍の腫瘍株：２：Ｈ ４４６、３：Ｈ ５１０、４：Ｈ １２６４、５：Ｈ ５４９、６：Ｈ ４４１、７：ＨＴＢ ５１、８：Ｈ ６７６、９：Ｈ ７２７、１０：Ｈ ７２０、１１：Ｈ ３８５、１２：Ｈ １２９９からのサンプルである。分子量マーカーを含有するストリートは、図中に略語Ｓｔ（「ｓｔａｎｄａｒｄ（標準）」より）で示す。マーカーの下方のバンドは、１００ｂｐサイズに相当し、各新しいバンドは、その前のバンドに対して１００ｂｐの増分（１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ・・・）に相当する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
内皮細胞ｃＤＮＡからのＥＰＣＲ ｃＤＮＡの増幅
ＨＵＶＥＣ細胞を、ヒトの臍帯静脈から得て、標準の手順に従って培養し（ジャッフェ ＥＡ（Ｊａｆｆｅ ＥＡ）、ナフマン ＲＬ（Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ）、ベッカー ＣＧ（Ｂｅｃｋｅｒ ＣＧ）、ミニック ＣＲ（Ｍｉｎｉｃｋ ＣＲ）「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ．」、「Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓ．」、１９７３年１１月、５２（１１）：２７４５〜５６）、全ＲＮＡを、（ペレス−ルイス Ａ（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｕｉｚ Ａ）、モンテス Ｒ（Ｍｏｎｔｅｓ Ｒ）、ベラスコ Ｆ（Ｖｅｌａｓｃｏ Ｆ）、ロペス−ペドレラ Ｃ（Ｌｏｐｅｚ−Ｐｅｄｒｅｒａ Ｃ）、アントニオパラモ Ｊ（Ａｎｔｏｎｉｏ Ｐａｒａｍｏ Ｊ）、オルベ Ｊ（Ｏｒｂｅ Ｊ）、ハーミダ Ｊ（Ｈｅｒｍｉｄａ Ｊ）、ローシャ Ｅ（Ｒｏｃｈａ Ｅ）、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．」、「Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．」、２００２年１２月、８８（６）：１０６０〜５）に記載される通り、標準の技術に従って抽出した。得られたＲＮＡは、転写酵素を用いて３７℃で６０分間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写させ、それに続いて酵素失活のために６５℃で５分間インキュベートした。これを行うために、１２０単位（Ｕ）のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））を、ＲＮＡ１μｇに加え、１０μＬの最終体積にした。これは、４μＬの逆転写酵素緩衝液、２ｍｍｏｌ／Ｌのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、０．３μｇ／ｍＬのランダムヘキサマー（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのジオチオトレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）、および３５ＵのＲｎａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤由来のＲＮＡｓｉｎ ４８，０００Ｕ／ｍＬ、ＲＮＡガード、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））を含有していた。
【００４７】
ＥＰＣＲ遺伝子の発現を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。使用されるプライマー（ジェンセット（Ｇｅｎｓｅｔ）、フランス）は、配列番号３の配列に相当する５’プライマー、および配列番号４の配列に相当する３’プライマーであった。
【００４８】
ＰＣＲは、２５μＬの体積で行われた。１μｇのＲＮＡの逆転写によってあらかじめ得られた一定分量のｃＤＮＡが使用され、それに、１Ｕのｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、２．５μＬの反応緩衝液（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＬの各プライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ溶液から）、０．２５μＬのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））、および０．２５μｌの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡが加えられた。この反応混合物を、水で２５μＬに調節した。増幅サイクルは、９４℃で３０秒の変性相と、別のアニーリングと、７２℃で３．５分の伸張相からなる。このサイクルを５回繰り返し、その後、同じ変性相と、別のアニーリングと、６８℃で３分の伸張相の３２サイクルを実施する。最終の伸張期間として、混合物を５分間６８℃に維持して、増幅を終結させた。ＰＣＲ増幅されたセグメントは、１２２１塩基対（ｂｐ）の長さを有する。ＥＰＣＲ遺伝子がこれらの条件で増幅された場合、さらなるバンドが、約８５０塩基対の高さで出現する（図２）。
【００４９】
増幅されたＥＰＣＲのさらなるバンドの配列決定
バンド２は、鋳型として図２の８５０ｂｐバンドから開始すること以外は、同じ増幅条件を使用して増幅した。アガロースゲル電気泳動の後、製造業者の指示書に従って市販のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、増幅産物を精製した。このようにして精製された産物を、配列決定反応（ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）、ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）のための鋳型として使用した。配列番号５および配列番号６の配列に相当するプライマーを使用して、２つの配列決定反応（１つは５’−３’方向、もう１つは逆方向）を実施した。
【００５０】
反応の結果は、自動シーケンサー、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで分析した。結論としては、新規のバンドは、配列番号７の配列によって定義されるフラグメントに相当する。
【００５１】
その配列が配列番号２であるこのフラグメントの中央部分は、エキソン４および３’非翻訳領域の部分を欠く新規のＥＰＣＲのｃＤＮＡに相当する。このｃＤＮＡの起源は、おそらく、ＥＰＣＲ ＲＮＡの選択的切断−スプライシング現象である。
【００５２】
この新種のｃＤＮＡは、アミノ酸の配列が配列番号１であるポリペプチドをコードする。前記配列の残基１〜１７は、シグナルペプチドに相当し、残基１８〜２００は、ＥＰＣＲの共通の細胞外ドメインに相当し、残基２０１〜２５６は、この新規の形のＥＰＣＲの新規の示差的なドメインに相当し、ＥＰＣＲの膜貫通ドメインに代わるものである。この新規のドメインは、膜貫通ドメインであるための基準を満たさない。
【００５３】
緑色蛍光タンパク質と融合させたＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの哺乳類細胞における発現
ＥＰＣＲアイソフォームの細胞内の局在化を研究するために、そのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、それを緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させた。このようにして調製されるベクターを使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用する培養で、哺乳類ＣＯＳ−７細胞を一過的に形質転換させた。対照として、同じベクターを使用し、そこでは野生型ＥＰＣＲのｃＤＮＡをクローニングし、緑色蛍光タンパク質と融合させた。野生型ＥＰＣＲおよびアイソフォームの細胞内局在化を、蛍光顕微鏡検査によって検出した。図３に示さているように、野生型ＥＰＣＲは、主に細胞膜上に局在化する（ここでは緑色蛍光が認められる）が、ｓＥＰＣＲｖａｒアイソフォームは、本発明者らの仮定と一致して、細胞膜上には局在化しない。
【００５４】
ＥＰＣＲアイソフォームのクローニング、発現、精製、および特徴付け
クローニングおよび発現
同定されたＥＰＣＲ変異体（ＥＰＣＲｖａｒ）を発現させるために、ｓＥＰＣＲ ｖａｒ配列を、ｃＤＮＡ鋳型として内皮細胞を使用して、イニシエーター
５’−ａｇｃｔｔｇｇｃａｔａｔｃｇａｔｔａｇｃｃａａｇａｃｇｃｃｔｃａｇａｔｇ−３’および
５’−ａｇｃｔａｔｃｇｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｃｃｔａｔｔａｔａｔｃａｇｃ−３’
を用いる（これらは、それぞれ５’および３’末端にＣｌａＩおよび別のＮｏｔＩ制限部位を付加されている）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、そのシグナルペプチドを伴わずに増幅させた（残基１７〜２５６）。こうした修飾により、サッカロミセスセレビシエのα因子分泌シグナルの後の、ｐＰＩＣＺαＣ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））プラスミドのＣｌａＩおよびＮｏｔＩ部位に、ＥＰＣＲ変異体配列を結合することが可能になり、酵母から細胞外培地への多くのタンパク質の効率的な分泌が可能になった。クローニングプロセスにより、セリン残基および別のイソロイシン残基が、ｓＥＰＣＲｖａｒのアミノ末端に加えられた。直接的配列決定を使用して、挿入配列およびベクターが適切であることが確認されることが確認された。あらかじめ調製された発現ベクターを用いて、ＰｍｅＩ制限酵素を用いるそれらの直鎖化の後、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を、化学的方法を使用して形質転換させ（Ｅａｓｙ Ｃｏｍｐ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、その結果、メタノール反応内因性プロモーターにおける、ｓＥＰＣＲｖａｒコード配列の相同的組換えによる組込みが示された。ゼオシンの存在下で形質転換産物を培養し、ｓＥＰＣＲｖａｒコード配列を含有する、言い換えるとゼオシン抵抗性遺伝子を含有するベクターで形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）コロニーを選択した。簡単に言うと、形質転換された酵母を、１％（ｖ／ｖ）のグリセロール（ＢＭＧＹ）が補充された４ｍｌのＢＭＹ培地［１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物、２％（ｗ／ｖ）のペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６，０）、硫酸アンモニウムを含む酵母窒素源１．３４％（ｗ／ｖ）、４×１０−５％（ｗ／ｖ）のビオチン］中で培養し、撹拌しながら約１８時間２８〜３０℃でインキュベートした。細胞は、室温で５分間、２，０００ｇで遠心分離することによって収集した。上清を捨て、１８時間、１％メタノールを用いて、ｓＥＰＣＲｖａｒ発現を誘導した。これを行うために、細胞を、０．５％（ｗ／ｖ）メタノールが補充された３ｍｌのＭＢＹに再懸濁し、勢いよく攪拌しながら、約２８〜３０℃で１８時間インキュベートした。誘導後、条件培地からのサンプルを、１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にローディングし、ＲＣＲ−２モノクローナル抗体（フクドメケンジ（Ｋｅｎｊｉ Ｆｕｋｏｄｏｍｅ）博士、佐賀大学（Ｓａｇａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、日本（Ｊａｐａｎ）によって快く提供された）を使用するウェスタンブロットによってｓＥＰＣＲｖａｒを検出した（図４）。大規模産生については、最も高濃度のｓＥＰＣＲｖａｒを分泌したコロニーを選択した。その高いｓＥＰＣＲｖａｒ産生能力に起因して選択されたコロニーにおいて、そのメタノール代謝（新陳代謝が早いものまたは遅いもの）を研究し、これによって、最も適切なコロニーのための最適発現条件が確立された。一旦培養条件およびメタノール誘導が最適化されたら、大量のｓＥＰＣＲｖａｒを産生するために規模を増大した。
【００５５】
精製
Ｐ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養上清を濃縮し、ＮａＣｌを含まない２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対して透析した後、２つの連続する精製ステップ：イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過を実施した。イオン交換精製では、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））を使用し、溶出は、２０カラム分に匹敵する体積の、０．０〜３００ｍＭのＮａＣｌグラジエントを用いて実施した。ｓＥＰＣＲｖａｒを含有する溶出分画を合わせ、遠心限外濾過によって濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５−ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））にかけてゲル濾過を実施した。精製されたタンパク質の濃度を、ＢＣＡ総タンパク質アッセイ（ピエール（Ｐｉｅｒｒｅ）、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））およびＢＳＡ標準を使用して決定した。精製されたｓＥＰＣＲｖａｒを検出するために、サンプルを、１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にローディングし、還元条件下で電気泳動を実施し、続いて、クマシーブルーで染色した。電気泳動ゲルをエレクトロブロッティングにかけ、ＲＣＲ−２モノクローナル抗体を用いてｓＥＰＣＲｖａｒを検出した。ｓＥＰＣＲｖａｒの分子量を評価するために、各ゲル電気泳動には分子量標準を含ませた。
【００５６】
新規の可溶性ＥＰＣＲ変異体の活性を特徴づけるための生化学的分析
ＰＣに対するｓＥＰＣＲｖａｒの親和性
培養された内皮細胞におけるＡＰＣの産生。使用される細胞株は、ＥＡ．ｈｙ９２６（トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲを発現する能力を保持している、形質転換されたヒトの内皮細胞株）であった（スターンズ−クロサワＤＪ（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａ ＤＪ）、クロサワ Ｓ（Ｋｕｒｏｓａｗａ Ｓ）、モリカ ＪＳ（Ｍｏｌｌｉｃａ ＪＳ）、フェレル ＧＬ（Ｆｅｒｒｅｌｌ ＧＬ）、エスモン ＣＴ（Ｅｓｍｏｎ ＣＴ）、「Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．」「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．」１９９６年、９３：１０２１２〜６）。９６ウエルプレート上の５×１０４細胞／ウェルを、０．０２Ｕ／ｍｌのトロンビン（０．１７ｎＭ）（ＥＲＬ、イギリス、スウォンジー（Ｓｗａｎｓｅａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））と共にインキュベートし、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ ＢＳＡ、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０２％ ＮａＮ３を補充された、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ＰＣ（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、米国イリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ．ＵＳＡ））の濃度を５０ｎＭと１，０００ｎＭとの間で変化させ、室温にて４５分後、トロンビンを阻害するために、レピルジン（シェーリングＡＧ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）、ドイツ、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を、０．２μｌの最終濃度で加え、３〜４分後に、ＡＰＣによるそのタンパク質加水分解をモニタリングする目的で、発色基質Ｓ−２３６６（クロモジェニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、イタリア、ミラノ（Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を０．４ｍＭの最終濃度で加えた。４０５ｎｍでの吸光度の上昇を、マイクロプレートリーダー（ｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ、ラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、フィンランド（Ｆｉｎｌａｎｄ）で動力学的に記録した。ミハエリス・メンテンの式に対する曲線データの調整を、これらの条件でのＰＣ活性化Ｋｍ値を算出するＥｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（バイオソフト（Ｂｉｏｓｏｆｔ）、イギリス、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））を使用して実施した。
【００５７】
ｓＥＰＣＲｖａｒの阻害効果を研究するために、２μｍｏｌ／Ｌを、トロンビンおよびＰＣと同時に加えた。このようにして、ＰＣ活性化に対するｓＥＰＣＲｖａｒの効果を分析し、ＰＣに対するその親和性を反映する、ｓＥＰＣＲが活性化に対して有する効果と比較することができた。
【００５８】
表１は、ｓＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの存在下または非存在下での、培養された内皮細胞の表面上の、トロンビンによるプロテインＣ活性化の生化学的特性を示す。
【００５９】
表１
【表１】
【００６０】
ＰＣに対するｓＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの親和性
活性化部分卜ロンボプラスチン時間の決定。健康な対象からの５血漿の混合物を使用し、ダイアグノスティカ・スタゴ・ベーリンガーマンハイム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ＳＴＡ Ｃｏｍｐａｃｔ装置（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、およびパトロンチン（Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ）試薬（デイドベーリング（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、米国（ＵＳＡ））を使用して、活性化部分卜ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を決定した。周知のように、正常な血漿の混合物中のＡＰＣの存在は、ＡＰＴＴを延長させる。使用される実験条件では、ＡＰＣが存在しない場合のＡＰＴＴは、３３．１±０．４ｓ（平均±ＳＤ）であったのに対して、ＡＰＣが１ｎｍｏｌ／Ｌの最終濃度で加えられた場合、ＡＰＴＴは、４３．９±０．４ｓに延長された。ｓＥＰＣＲが加えられた場合、ＡＰＣの効果は低下し、１ｍｍｏｌ／ＬのｓＥＰＣＲが存在する場合には、ＡＰＴＴは、３７．２±０．２ｓであった。ＡＰＣの抗凝血効果に対するｓＥＰＣＲのこの阻害効果は、用量依存的である。正常な血漿の混合物に加えられたｓＥＰＣＲは、ＡＰＴＴに対する直接的な効果を有しなかった（ｓＥＰＣＲが存在する場合の３３．９±０．４ｓと比較して、ｓＥＰＣＲが存在しない場合には３３．１±０．４ｓ）。すべての実験を４回繰り返した。ｓＥＰＣＲではなく、同じ濃度のｓＥＰＣＲｖａｒが加えられた場合、結果は、ｓＥＰＣＲを用いて得られるものと重ねることができ、ｓＥＰＣＲと同様に、ｓＥＰＣＲｖａｒもＡＰＣと結合することが実証された。
【００６１】
表２は、ＡＰＣ抗凝血作用に対するｓＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの効果を示す。それに１ｎｍｏｌ／ＬのＡＰＣおよび様々な濃度のｓＥＰＣＲが加えられた、正常な血漿の混合物の血液凝固時間（ＡＰＴＴ）。４つの実験の平均±ＳＤを示す。ＡＰＣが存在しない場合のＡＰＴＴは、３３．１±０．４秒であった。
【００６２】
表２
【表２】
【００６３】
様々な組織および腫瘍株におけるｓＥＰＣＲｖａｒの発現分析
ｓＥＰＣＲｖａｒが発現される組織を同定するために、ＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒに相当するｃＤＮＡの同時増幅を可能にするプライマーを使用するＰＣＲによって、様々なヒト組織のｃＤＮＡライブラリ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣ）パネルＩおよびＩＩ、バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、米国（ＵＳＡ））を研究した。使用されるプライマー（ジェンセット（Ｇｅｎｓｅｔ、フランス）は、以下の通りであった：
プライマー５’：５’−ＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＣＣＧＣ−３’および
プライマー３’：５’−ＣＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴ−３’
【００６４】
ＰＣＲは、２５μＬの体積で実施した。ｃＤＮＡのアリコットを使用し、これに、１ Ｕのｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、２．５μＬの反応緩衝液（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＬの各プライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ溶液から）、０．２５μＬのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））、および０．２５μｌの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを加えた。反応混合物を、水で２５μＬに調節した。増幅サイクルは、９４℃で３０秒の変性段階、５６℃で１分の別のアニーリング段階、７２℃で１．５分の伸張からなる。このサイクルを３５回繰り返す。最終の伸張期間として７２℃で５分間混合物を維持して、増幅を終結させた。増幅されたＥＰＣＲのｃＤＮＡセグメントは、５７８ｂｐ長であったのに対し、ｓＥＰＣＲｖａｒのｃＤＮＡセグメントは、１８９ｂｐであった（図５）。ｓＥＰＣＲｖａｒ形は、膵臓、心臓、肝臓、腎臓、肺、胎盤、胸腺、小腸、脾臓、および大腸に多量に発現された。ｓＥＰＣＲｖａｒ形は、いくつかの腫瘍株に、特にＨ ５４９、Ｈ ４４１、およびＨ ７２０に多量に発現された。いくつかの腫瘍株、特にＨ ４４６およびＨ ６７６は、まだ同定されていない別の形（これは、その電気泳動移動度によれば、１０００ｂｐを有する）をさらに発現した。
【００６５】
抗体産生
免疫化
生後少なくとも１ヵ月のＢＡＬＢ／Ｃ雄を、以下のパターンに従って、ｓＥＰＣＲｖａｒで免疫化させた：フロイント・アジュバントまたは別のアジュバント中の１０μｇと２００μｇの間の量の免疫原を用いる、少なくとも２週間間隔での３回の皮下、皮内、または腹腔内の免疫化、あるいはこれらの組み合わせ、３回目の免疫化の２週間後、２日間隔で、同じ量の免疫原（ただし、生理食塩水血清（ｓａｌｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）中）を使用して、２回の新規の追加免疫を投与した。他の動物も、配列番号１のペプチド２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、および２４２〜２５６の混合物を用いて免疫化させた。これらのペプチドは、カイト Ｊ．（Ｋｙｔｅ Ｊ．）、ドリトル Ｒ．Ｆ．（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．）のアルゴリズム（「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、１９８２年、１５７：１０５〜１３２）に従うＰｒｏｔｓｃａｌｅプログラムによると非常に親水性であることから選択された。
【００６６】
融合
最後の追加免疫投与の２日後に、ハイブリドーマを産生した。ポリエチレングリコール１５００または４０００の存在下で、動物の脾細胞を骨髄腫細胞（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６．５．３、Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１、その他）と融合させることからなる技術を用いた。この薬剤は、膜融合を可能にし、その結果、様々な細胞型との間のハイブリッドが産生されることとなる。動物Ｂリンパ球と骨髄腫細胞との間のハイブリッドは、新規の細胞型、ハイブリドーマを形成し、これは、抗体を産生し、また、培養中に無限に増殖する。これらのハイブリドーマを選択し、残りのハイブリッドを排除するために、細胞培養物にＨＡＴ培地を加えた。ＨＡＴは、アミノプテリン、すなわちグアノシンの新規の合成経路（新生経路）の阻害剤を含有する。骨髄腫細胞は、核酸合成サルベージ経路に必要な機能性のＨＰＲＴ酵素を欠いているので、唯一の利用可能な経路（新生経路）が、アミノプテリンでブロックされる場合、これらは、核酸を合成することができない。したがって、培養の２週後、培養中で生き残る唯一の細胞は、脾細胞−骨髄腫ハイブリッドである。脾細胞は、ハイブリッドに代替の経路によるグアノシン合成能力を付与し、骨髄腫細胞に、インビトロの培養において際限なく培養される能力を付与する。
【００６７】
抗ｓＥＰＣＲｖａｒおよび抗ｓＥＰＣＲ抗体を産生するハイブリドーマの検出
ＨＡＴ培地中の細胞を、少なくとも１０の９６ウェル培養マイクロプレートに分配する。融合の９日後と１４日後との間に、コロニーのサイズは、上清中の抗体の存在を分析するのに十分となる。目的の抗体、すなわちｓＥＰＣＲｖａｒに対する抗体を分泌するハイブリドーマを選択するために、クローンを含有する５枚のマイクロプレートのすべてのウェルから上清のサンプルを取り出し、これをイムノアッセイにかけた。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡについては、プレートを、ｓＥＰＣＲｖａｒ（０．３μｇ／ウェル）で被覆し、４℃での１５時間のインキュベーション、および適切なタンパク質による対応するブロッキングの後、培養上清を加え、相応な洗浄を実施し、次いで、二次マウス抗免疫グロブリン抗体を加える。このようにして、ウェルの洗浄およびペルオキシダーゼおよびｏ−フェニレンジアミンを用いる発色の後、着色または吸光度（４９２ｎｍ）の上昇が検出されたウェルは、ｓＥＰＣＲｖａｒ抗体を分泌するハイブリドーマのクローンを含有する可能性がある。ウェスタンブロットについては、組み換え型タンパク質および／またはｓＥＰＣＲｖａｒタンパク質を発現する組織または細胞抽出物を、ポリアクリルアミドゲルで泳動した。これを、上清中の特異的抗体の存在を証明するために、格子型（ｇｒｉｌｌｅ−ｔｙｐｅ）装置によって独立した領域に分けられたニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ブロッキングおよび特異的抗体とのインキュベーションを行った後、これを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ酵素に結合した二次抗体と共にインキュベートした。発色は、酵素によって形質転換される際、特異的な抗体に結合された場所で光を産生する基質を使用して実施した。発光バンドが、予測分子量を有するタンパク質に相当する場合、その上清が由来するウェルからの抗体産生細胞を増殖させ、液体窒素中に凍結させることとなる。
【００６８】
ｓＥＰＣＲｖａｒは、全ｓＥＰＣＲ部分を含有するので、ｓＥＰＣＲｖａｒに対して陽性であるハイブリドーマの、組み換え型ＥＰＣＲの細胞外領域との反応性が分析されることとなる。このようにして、ｓＥＰＣＲｖａｒの特定の領域に対する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００６９】
ハイブリドーマの単クローン性
抗ｓＥＰＣＲｖａｒ抗体を分泌する各細胞培養物がモノクローナルであることを確認するために、クローニングまたは限界希釈技術が適用される。第１のウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ試験で陽性であった最初の培養物からの、あるいは幹細胞からの、単離された細胞を、新しい培養マイクロプレート上で増殖させる。１種または複数の細胞から生じている新規のコロニーが、一旦十分なサイズを獲得したら、これから再び上清を取り出し、これを新規のＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにかけることになる。再び陽性であったコロニーを限界希釈にかけ、このプロセスを、第３の限界希釈の後に分析された上清の１００％が、ｓＥＰＣＲｖａｒに対する抗体を含有するようになるまで繰り返した。
【００７０】
抗体精製
より大きな抗体濃度を達成するために、ハイブリドーマを特別な条件で培養した後（インテグラバイオサイエンス（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのＣＥＬｌｉｎｅシステムを備えた培養ビン、またはベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からのＣＥＬｌｉｎｅシステム）、ＩｇＧを含有する上清を、以下の方法のうちの１つまたは複数を用いる液体クロマトグラフィーによる精製にかけることとなる：ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ装置、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用する、免疫親和性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ／プロテインＧ／プロテインＬ、固定化金属、バイオアフィニティ）、陽イオン交換、ヒドロキシアパタイト、疎水的相互作用、ゲル濾過、など。
【００７１】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ＲＮＡがプロセッシングされ、成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が産生される方式に依存する、異なるタイプのＥＰＣＲを示す図である。３つの別の形のｍＲＮＡが産生される可能性があり、これらは、続いて、３つの異なる形のタンパク質を産生することとなる：１：膜ＥＰＣＲ（ｍＥＰＣＲ）として翻訳されるタンパク質とは異なる４つのエキソンを伴うｍＲＮＡ。２．エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩのみを含み、その後にイントロン３およびこのイントロンの後の全配列が続く、国際公開第９９００６７３号パンフレット中にエスモン（Ｅｓｍｏｎ）によって開示された可溶形のＥＰＣＲ（ａｌｔｓＥＳＰＣ）として翻訳されることとなるｍＲＮＡ。３．本発明に開示された新規の形の選択的切断およびスプライシングによって、エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩを含むｍＲＮＡが産生されることとなるが、プロセッシング中に、エキソンＥｘ ＩＶは失われ、この理由から、膜貫通ドメインも細胞質のテールも転写されず、その場所では、エキソンＩＩＩの後、３’非翻訳領域に位置する潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）エキソンであるであろう配列が出現し、この場合、ｍＲＮＡは、本発明の新規の可溶性ＥＰＣＲ形（ｓＥＰＣＲｖａｒ）として翻訳される。可溶性ＥＰＣＲはまた、おそらくメタロプロテアーゼ（まだ特徴づけられていない）から、タンパク分解活性によって産生することもできる。メタロプロテアーゼは、膜高さでＥＰＣＲを切断し、その結果、細胞外受容体の画分からなり、膜貫通ドメインおよび細胞質内テールを欠く、新規の可溶形のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）が産生される。
【図２】図２は、特異的なＥＰＣＲ遺伝子プライマーを用いるＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡの増幅の後に得られるバンドパターンである：野生型ＥＰＣＲ ｃＤＮＡ（１２２１ｂｐ、矢印１）に相当するバンドに加えて、選択的切断−スプライシングによって産生された新規の変異体アイソフォームのｃＤＮＡに相当する新規の増幅断片が認められる（矢印２）。
【図３】図３は、どちらも緑色蛍光タンパク質と融合させた、野生型ＥＰＣＲ（パネルＡ）を用いて、あるいはアイソフォーム（パネルＢ）を用いて形質移入されたＣＯＳ−７細胞である。パネルＡは、野生型タンパク質が、細胞膜（矢印）上に蓄積する傾向があることを示すのに対して、アイソフォーム３を用いた場合、この局在化パターンは認められない（パネルＢ）。
【図４】図４は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるｓＥＰＣＲｖａｒ発現を説明する図である。本明細書に示すように、ｓＥＰＣＲｖａｒは、安定に形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞の上清から精製された。パネルＡ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＧＥＬＣＯＤＥ Ｂｌｕｅ染料を使用して検出された様々なタンパク質を示す。ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：組み換え型のｓＥＰＣＲ。約４２ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。Ｓｔｒｅｅｔ ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。４７ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。パネルＢ：モノクローナル抗−ＥＰＣＲ抗体を用いるウェスタンブロットによって検出されるタンパク質、ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：ブランク、ストリート ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。約４７ｋＤａのブロードなバンド（様々なタンパク質のグリコシル化に起因し、３５から６０ｋＤａまでの間に広がる）が観察される。
【図５】図５は、異なる組織および腫瘍由来のｃＤＮＡからのＥＰＣＲ遺伝子の増幅である。パネルＡ）１：分子量マーカー、２：心臓、３：肝臓、４：腎臓、５：膵臓、６：肺、７：胎盤。パネルＢ）１：分子量マーカー、２：骨格筋、３：脳、４：胸腺、５：小腸、６：脾臓。パネルＣ）１：マーカー、２：前立腺、３：睾丸、４：卵巣、５：大腸。パネルＤ）は、肺腫瘍の腫瘍株：２：Ｈ ４４６、３：Ｈ ５１０、４：Ｈ １２６４、５：Ｈ ５４９、６：Ｈ ４４１、７：ＨＴＢ ５１、８：Ｈ ６７６、９：Ｈ ７２７、１０：Ｈ ７２０、１１：Ｈ ３８５、１２：Ｈ １２９９からのサンプルである。分子量マーカーを含有するストリートは、図中に略語Ｓｔ（「ｓｔａｎｄａｒｄ（標準）」より）で示す。マーカーの下方のバンドは、１００ｂｐサイズに相当し、各新しいバンドは、その前のバンドに対して１００ｂｐの増分（１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ・・・）に相当する。
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
最近記載されているプロテインＣシステム（ＰＣ）のタンパク質は、内皮プロテインＣ／活性化プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）である（１、２）。ＥＰＣＲは、内皮細胞の膜上に発現され、高親和性でＰＣおよび活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）と結合する（Ｋｄ〜３０ｎＭ）。その生理学的使命は、内皮表面上のＰＣを濃縮し、これをトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示し、それによって、ＰＣの効率的な活性化を助けることである（３）。ヒト以外の霊長類に関して実施された研究では、モノクローナル抗体を用いてＥＰＣＲをブロックすることは、ＡＰＣの生理学的産生を９０％減少させることが実証されており、また、最近の研究では、ＥＰＣＲの遺伝的欠陥が、静脈および動脈の血栓形成を患う素因になる可能性があることが示唆されている（４〜７）。これらの事実は、凝固調節において、また血栓形成において、ＥＰＣＲが果たす可能性がある重要な役割を実証する。さらに、ＥＰＣＲは、ＰＣの強力な抗炎症作用を担う分子の１つであるように思われる。
【０００２】
ＥＰＣＲとＰＣ／ＡＰＣの相互作用は、グラム陰性細菌による感染中に現れる凝血異常性および炎症性の反応の調節の際に、重要な役割を果たす可能性がある（８）。近年では、ＡＰＣは、内皮細胞上の抗炎症および抗アポトーシス作用を有すること、また、この作用が現れるためにはＥＰＣＲの存在が不可欠であることが実証されている（９、１０）。
【０００３】
ＥＰＣＲは、約４６ｋＤａの糖タンパク質である。成熟タンパク質は、１７残基からなるシグナルペプチドの排除後の、２２１アミノ酸からなる（１１）。これは、３つのイントロンによって分断された４つのエキソンによって形成される、染色体２０（２０ｑ１１．２）のロングアーム中に位置する遺伝子によってコードされる（１２）。エキソンＩは、５’非翻訳領域およびシグナルペプチドをコードし、エキソンＩＶは、膜貫通ドメイン、３残基の細胞質内テール、および３’非翻訳領域をコードする。エキソンＩＩおよびＩＩＩは、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体のＣＤ１スーパーファミリーに属するタンパク質のドメインα１およびα２との相同性を有する、ＥＰＣＲの細胞外領域の大部分をコードする。近年では、ＥＰＣＲが、ポケット（そこには、分子を安定させるリン脂質が収容される）を形成する、折り畳まれたβシート（その上にはαヘリックス構造を２つ有する）によって形成されるプラットフォームを、どのように有するかを示す三次元構造が、首尾よく結晶化され、分析されている（１３）。同様に、アラニンスキャニングによって、ＰＣ／ＡＰＣとの結合に関与する主要な残基（カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在下で、そのＧＬＡドメインを介して結合する）が特定されている（１４）。
【０００４】
しかし、内皮細胞膜上に固定されるＥＰＣＲに加えて、トロンビンなどの刺激によって誘導されるメタロプロテイナーゼによるＥＰＣＲの消化に少なくとも部分的に由来する、血漿可溶形（ｓＥＰＣＲ）が存在する（１５、１６）。
【０００５】
論文（１５）「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１００」、ｎｏ．２、１９９７年７月、４１１〜４１８は、血漿中に見られるＥＰＣＲの可溶形に関する。この論文には、血漿中のＥＰＣＲは、独特の種であるように思われ、精製されたタンパク質のアミノ末端フラグメントの配列決定では、血漿ＥＰＣＲの特有の配列が示され、これは、組換えｓＥＰＣＲのアミノ末端配列と一致したことが記載されている。この論文には、前記可溶性ＥＰＣＲの起源は、他の受容体の場合と同様に、タンパク分解性の破断または選択的切断−スプライシング機構である可能性があり、特に、ウシＥＰＣＲのゲノム構造は、タンパク質をコードする選択的切断部位を含有する（ここでは、膜貫通ドメインが、エキソンＩＩＩの後に位置しているイントロンによってコードされる配列によって置き換えられる）ことが記載されている（１７）。この文献は、選択的切断から得られるＥＰＣＲの形の可能性を証明するために、より多くの研究が必要であることを示している。
【０００６】
さらに、国際公開第−９９００６７３号には、ヒト血漿におけるｓＥＰＣＲの単離および特徴づけに関し、ｓＥＰＣＲが、タンパク質加水分解に由来する（ここでは、ＥＰＣＲの細胞外ドメインは遊離され、膜に結合した残りのタンパク質から離れる）、あるいは、ｍＲＮＡの選択的切断−スプライシング機構（これは、ａｌｔｓＥＰＣＲの配列を生じさせる）に由来する可能性があることが記載されている。本出願の図１は、タンパク分解起源の可溶性ＥＰＣＲ（ｐｓＥＰＣＲ）と、選択的切断−スプライシングによって得られる国際公開第−９９００６７３号に開示されたＥＰＣＲ（ａｌｔｓＥＰＣＲ）と、本発明の新規のＥＰＣＲ目的物（ｓＥＰＣＲｖａｒ）との間の違いを見ることができる図を示す。
【０００７】
したがって、本出願によって、少なくとも、ヒトＥＰＣＲは、選択的切断−スプライシング・プロセスを受け、前記選択的切断−スプライシング機構から得られる可溶性のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲｖａｒ）中にのみ存在する特有のインサートを含む、可溶性の切断型ＥＰＣＲを生じる可能性があることが示される。前記ｓＥＰＣＲｖａｒは、大血管における、またガンにおける疾患プロセスマーカーとして働く可能性がある。
【０００８】
ＡＰＣが、ｓＥＰＣＲに結合する場合、その抗凝血特性を失うが、その酵素的能力は維持されるため、ｓＥＰＣＲが、ＡＰＣ特異性を変化させ、おそらく、これを基質（現在は未知である）に方向付け、これが、ＡＰＣに起因する抗炎症特性につながる可能性があると考えられる（１８）。ｓＥＰＣＲは、膜上に存在するＥＰＣＲと、プロテインＣに対して競合し、このようにしてＡＰＣ産生を抑制する。ｓＥＰＣＲは、プロテイナーゼ−３（ＰＲ３）（１９）、好中球顆粒およびＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）中に存在するプロテイナーゼ、好中球および単球の表面に存在する誘導性の発現のインテグリンを介して、活性化された好中球と相互作用することが可能であることも記載されている。ＰＲ３は、おそらく、膜結合型ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１ベータ前駆体に作用する組織破壊メカニズムに関与する。Ｍａｃ−１は、細胞シグナル伝達および細胞間接着現象に介在し、内皮ＩＣＡＭ−１などの接着分子と相互作用し、その理由で、炎症性プロセス中の好中球の補充において役割を果たす。ＰＲ３およびＭａｃ−１へのｓＥＰＣＲの結合は、おそらく、その活性を低下させるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から開始して、新規のタンパク質をクローン化し、発現させることを可能にした。前記タンパク質は、その配列の、他の既知の配列との分析および比較、ならびにその機能の特徴づけによって、選択的スプライシング・プロセスによって産生される可溶性のＥＰＣＲタンパク質の未知の形であることが示された。一方、前記タンパク質は、示差的な特徴として、現在知られているＥＰＣＲ形には存在しない、当初ＥＰＣＲ遺伝子３’非翻訳領域と考えられていた領域によってコードされるポリペプチドの領域を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［発明の詳細な説明］
本発明は第一に、新規の可溶形のＥＰＣＲ（これを、本発明者らは、可溶性のＥＰＣＲ変異体（ｓＥＰＣＲｖａｒ）と呼ぶ）に、より詳細には、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含む、内皮プロテインＣ受容体または前記配列の残基のフラグメントから得られるポリペプチドに関する。ある特定の実施形態では、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する。本発明の特定の実施形態によれば、前記フラグメントは、配列番号１の残基２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、２４２〜２５６を含むフラグメントから選択される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、前記フラグメントは免疫原特性を有し、これは特に、特異的抗体を産生するための手順で有用である。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドを含む、単離されたあるいは組み換え型のタンパク質に関する。前記タンパク質は、ＥＰＣＲタンパク質である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記単離されたあるいは組み換え型のＥＰＣＲタンパク質は、配列番号１の配列を含む。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントを含む組み換え型タンパク質である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６によって形成されるポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列に由来する。このｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから逆転写されたＤＮＡに関する。
【００１６】
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ構築物中に含有される可能性がある。したがって、本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むタンパク質またはポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントをコードするＤＮＡ構築物である。好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する。前記構築物のある特定の実施形態では、これは、配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチドを含む。前記ＤＮＡ構築物は、前記タンパク質またはポリペプチドに作動可能に結合される制御配列を組み込む可能性がある。核酸またはポリヌクレオチドに関して、「作動可能に結合される」は、あるヌクレオチド領域が、別のヌクレオチド配列と、機能的関係に置かれることを意味する。「制御配列」は、機能（例えばある種のコード配列の転写および翻訳など）を調節する、ある種の宿主細胞によって特に認識される発現シグナルである。プロモーター、発現エンハンサー、転写ターミネーター、リボソーム結合部位などは制御配列である。ＤＮＡ構築物を形成するための所望の配列のスプライシングは、適切な制限部位における切断およびスプライシングによって行うことができる。これらの結合部位が存在しない場合、アダプターまたはスペーサーとして合成のオリゴヌクレオチドを使用して、従来の遺伝子工学的方法によってこれらを産生することが可能である。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物は、しばしば実験室マニュアルに書き留められている従来の遺伝子工学的方法によって得ることができる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドまたは構築物は、適切な発現ベクター中に挿入させることができる。したがって、本発明のさらなる目的は、前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む発現ベクターである。本発明の様々な実施形態における発現ベクターの選択は、前記発現ベクターが挿入されることとなる宿主細胞に依存する。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物が挿入されるベクターは、プラスミドまたはウイルス（これらは、一旦宿主細胞中に導入された場合に、細胞のゲノムに組み込まれる可能性もあるし、組み込まれない可能性もある）である可能性がある。この発現ベクターはまた、従来方法によって得ることができる。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６含むポリペプチドまたは前記配列の残基の少なくとも９アミノ酸を有するフラグメントををコードするポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む、形質転換された宿主細胞である。本発明によれば、形質転換された宿主細胞は、原核生物細胞（例えば大腸菌）または真核生物（例えば酵母、特にピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫細胞または哺乳類細胞株であり得る。
【００２０】
本発明のある特定の実施形態では、配列番号２を有する本発明のポリヌクレオチドは、本発明において開示される選択的切断およびスプライシングによって産生される新規の形のｓＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲｖａｒ）に相当する、配列番号１の組み換え型のｓＥＰＣＲタンパク質を産生するために、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）中に導入される。組み換え型タンパク質の産生に必要なＤＮＡ構築物、発現ベクター、および形質転換された宿主細胞を産生するために使用される方法は、その精製のためのプロセスを含めて、後ほど詳述する。
【００２１】
本発明のある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む発現ベクターは、組成物中でのその使用、およびインビボでの遺伝子導入または治療のプロセスのために設計される。より具体的な実施形態では、この発現ベクターは、ウイルスベクターである。この目的に適したウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス類縁体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）ベクターなどが挙げられる。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドまたは前記構築物で形質転換される宿主細胞を含む発現系である。好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を含む。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の残基２０１〜２５６を含むタンパク質またはポリペプチド、または前記配列の残基の好ましくは少なくとも９アミノ酸を有するフラグメントを産生する方法であって、前記方法が、前記タンパク質、ポリペプチド、またはフラグメントの発現を可能にする条件で、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする方法である。培養を最適化する条件は、使用される宿主細胞に依存する。所望により、この方法はまた、発現されたタンパク質またはポリペプチドを単離および精製するためのいくつかのステップを含む可能性がある。
【００２４】
あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、他の従来方法によって、例えば固相技術に関する化学合成、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製によって得ることができ、所望により、これらを、従来の技術、例えば配列決定および質量分析、アミノ酸分析、核磁気共鳴などによって分析することもできる。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列を含むタンパク質または前記配列の残基のフラグメントをコードするｍＲＮＡである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基の免疫原特性を有するフラグメントに対する、特定の単離された抗体である。ある特定の実施形態では、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、前記抗体は、その配列が残基２０１〜２５６、２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、および２４２〜２５６（すべて配列番号１に関する）から選択されるポリペプチドまたはフラグメントに対して特異的である。
【００２８】
別の特定の実施形態では、前記抗体は、配列番号１に対して特異的であり、これが領域２０１〜２５６に結合しない場合には領域１〜２００を認識しない。
【００２９】
好ましい実施形態によれば、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、生体試料における、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質（例えば配列番号１の新規のＥＰＣＲタンパク質）、または前記配列の残基のフラグメントの選択的インビトロ検出のための方法であって、
−生体試料を得ること、
−配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントの量を分析すること、
を含む方法である。
【００３１】
前記生体試料は、生体材料を含む任意の試料である可能性がある。好ましい実施形態では、前記生体試料は、尿、血漿、血清、組織、または間質液試料である。
【００３２】
前記方法は、例えば、質量分析、イムノアッセイ、化学アッセイ、液体クロマトグラフィー、および様々な間接的および直接的光度測定方法を含めた、任意の既知の方法であり得る。例えば、いくつかの分析法は、質量分析を使用するマーカーを定量化するために適用される可能性がある。一般的に言うと、マーカーは、例えば液体クロマトグラフィーまたは二次元ゲル電気泳動によって、生体試料から単離される。マーカーは、質量分析、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）を伴うタンデム質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（「マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析・飛行時間型ＭＳ」）などによって定量化される。標的マーカーは、既知量の精製されたマーカー標準と比較することによって、あるいは、健康な対照から得られる同じタイプの生体試料中に存在する前記マーカーの量と比較することによって定量化することができる。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、この方法は、イムノアッセイであり得る。一般に、イムノアッセイには、１種または複数のマーカーリガンドが使用される。本発明で使用される「リガンド」は、標的マーカーに特異的に結合することが可能な任意の化合物または分子である。これらのリガンドは、別々に、あるいは組み合わせて使用することができる（例えば、抗体は、アプタマーと組み合わせて使用することができる）。
【００３４】
本発明の一つの実施形態では、イムノアッセイは、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）アッセイ、不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、イムノメトリックアッセイ（サンドイッチ）、濁度アッセイ、比濁アッセイ、または他の同様のアッセイである可能性がある。同様に、イムノアッセイは、手動で、あるいは自動分析器を用いて行われる可能性がある。
【００３５】
本発明の方法では、前記タンパク質の量は、血管損傷に関連する炎症性疾患、炎症、凝固異常に関連する疾患、およびガンから選択される疾患に関連する。前記疾患はまた、狼瘡などの自己免疫性疾患、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、移植のモニタリングの際の不安定狭心症、再狭窄、血管形成、および肝臓または腎臓病である可能性もある。
【００３６】
本発明の方法によれば、検出されるＥＰＣＲタンパク質の量はまた、較正標準と比較することができる。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質、例えば、配列番号１の新規のＥＰＣＲタンパク質、または前記配列の残基の好ましくは少なくとも９アミノ酸のフラグメントの検出および定量化のための試験キットであって、
ａ）配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメントに特異的な抗体、即ち、領域２０１〜２５６に結合しない場合には領域１〜２００を認識しない配列番号１のタンパク質に特異的な抗体、
ｂ）抗体ａ）と、生体試料中に存在する配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントとの間の反応を検出する試薬、
を含むキットである。
【００３８】
好ましくは、このキットはまた、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質の正常および異常なレベルと、産生される反応物の量を相関させるための標準を含む。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質、例えば配列番号１の新規のＥＰＣＲタンパク質、または前記配列の残基のフラグメントに相当するｍＲＮＡの検出および定量化のための、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列の残基のフラグメント（好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも９アミノ酸を有する）をコードするポリヌクレオチドの使用である。前記ＥＰＣＲタンパク質は、血管損傷に関連する炎症性疾患、炎症、ガン、および凝固異常に関連する疾患から選択される疾患に関連する量で存在する。
【００４０】
さらに、非タンパク分解起源の新規の可溶形のＥＰＣＲは、この形の可溶性のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲｖａｒ）の存在を、単独的かつ独占的に検出するのに選択的である分析方法であって、他の形の可溶性のＥＰＣＲまたは膜ＥＰＣＲが検出される方法と重複する前記方法を用いずに、特定の疾患を検出できるという利点を有する分析方法の開発のために役割を果たす可能性がある。
【００４１】
［図面の簡単な説明］
図１は、ＲＮＡがプロセッシングされ、成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が産生される方式に依存する、異なるタイプのＥＰＣＲを示す図である。３つの別の形のｍＲＮＡが産生される可能性があり、これらは、続いて、３つの異なる形のタンパク質を産生することとなる：１：膜ＥＰＣＲ（ｍＥＰＣＲ）として翻訳されるタンパク質とは異なる４つのエキソンを伴うｍＲＮＡ。２．エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩのみを含み、その後にイントロン３およびこのイントロンの後の全配列が続く、国際公開第９９００６７３号パンフレット中にエスモン（Ｅｓｍｏｎ）によって開示された可溶形のＥＰＣＲ（ａｌｔｓＥＳＰＣ）として翻訳されることとなるｍＲＮＡ。３．本発明に開示された新規の形の選択的切断およびスプライシングによって、エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩを含むｍＲＮＡが産生されることとなるが、プロセッシング中に、エキソンＥｘ ＩＶは失われ、この理由から、膜貫通ドメインも細胞質のテールも転写されず、その場所では、エキソンＩＩＩの後、３’非翻訳領域に位置する潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）エキソンであるであろう配列が出現し、この場合、ｍＲＮＡは、本発明の新規の可溶性ＥＰＣＲ形（ｓＥＰＣＲｖａｒ）として翻訳される。可溶性ＥＰＣＲはまた、おそらくメタロプロテアーゼ（まだ特徴づけられていない）から、タンパク分解活性によって産生することもできる。メタロプロテアーゼは、膜高さでＥＰＣＲを切断し、その結果、細胞外受容体の画分からなり、膜貫通ドメインおよび細胞質内テールを欠く、新規の可溶形のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）が産生される。
【００４２】
図２は、特異的なＥＰＣＲ遺伝子プライマーを用いるＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡの増幅の後に得られるバンドパターンである：野生型ＥＰＣＲ ｃＤＮＡ（１２２１ｂｐ、矢印１）に相当するバンドに加えて、選択的切断−スプライシングによって産生された新規の変異体アイソフォームのｃＤＮＡに相当する新規の増幅断片が認められる（矢印２）。
【００４３】
図３は、どちらも緑色蛍光タンパク質と融合させた、野生型ＥＰＣＲ（パネルＡ）を用いて、あるいはアイソフォーム（パネルＢ）を用いて形質移入されたＣＯＳ−７細胞である。パネルＡは、野生型タンパク質が、細胞膜（矢印）上に蓄積する傾向があることを示すのに対して、アイソフォーム３を用いた場合、この局在化パターンは認められない（パネルＢ）。
【００４４】
図４は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるｓＥＰＣＲｖａｒ発現を説明する図である。本明細書に示すように、ｓＥＰＣＲｖａｒは、安定に形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞の上清から精製された。パネルＡ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＧＥＬＣＯＤＥ Ｂｌｕｅ染料を使用して検出された様々なタンパク質を示す。ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：組み換え型のｓＥＰＣＲ。約４２ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。ストリート ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。４７ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。パネルＢ：モノクローナル抗−ＥＰＣＲ抗体を用いるウェスタンブロットによって検出されるタンパク質、ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：ブランク、ストリート ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。約４７ｋＤａのブロードなバンド（様々なタンパク質のグリコシル化に起因し、３５から６０ｋＤａまでの間に広がる）が観察される。
【００４５】
図５は、異なる組織および腫瘍由来のｃＤＮＡからのＥＰＣＲ遺伝子の増幅である。パネルＡ）１：分子量マーカー、２：心臓、３：肝臓、４：腎臓、５：膵臓、６：肺、７：胎盤。パネルＢ）１：分子量マーカー、２：骨格筋、３：脳、４：胸腺、５：小腸、６：脾臓。パネルＣ）１：マーカー、２：前立腺、３：睾丸、４：卵巣、５：大腸。パネルＤ）は、肺腫瘍の腫瘍株：２：Ｈ ４４６、３：Ｈ ５１０、４：Ｈ １２６４、５：Ｈ ５４９、６：Ｈ ４４１、７：ＨＴＢ ５１、８：Ｈ ６７６、９：Ｈ ７２７、１０：Ｈ ７２０、１１：Ｈ ３８５、１２：Ｈ １２９９からのサンプルである。分子量マーカーを含有するストリートは、図中に略語Ｓｔ（「ｓｔａｎｄａｒｄ（標準）」より）で示す。マーカーの下方のバンドは、１００ｂｐサイズに相当し、各新しいバンドは、その前のバンドに対して１００ｂｐの増分（１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ・・・）に相当する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
内皮細胞ｃＤＮＡからのＥＰＣＲ ｃＤＮＡの増幅
ＨＵＶＥＣ細胞を、ヒトの臍帯静脈から得て、標準の手順に従って培養し（ジャッフェ ＥＡ（Ｊａｆｆｅ ＥＡ）、ナフマン ＲＬ（Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ）、ベッカー ＣＧ（Ｂｅｃｋｅｒ ＣＧ）、ミニック ＣＲ（Ｍｉｎｉｃｋ ＣＲ）「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ．」、「Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓ．」、１９７３年１１月、５２（１１）：２７４５〜５６）、全ＲＮＡを、（ペレス−ルイス Ａ（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｕｉｚ Ａ）、モンテス Ｒ（Ｍｏｎｔｅｓ Ｒ）、ベラスコ Ｆ（Ｖｅｌａｓｃｏ Ｆ）、ロペス−ペドレラ Ｃ（Ｌｏｐｅｚ−Ｐｅｄｒｅｒａ Ｃ）、アントニオパラモ Ｊ（Ａｎｔｏｎｉｏ Ｐａｒａｍｏ Ｊ）、オルベ Ｊ（Ｏｒｂｅ Ｊ）、ハーミダ Ｊ（Ｈｅｒｍｉｄａ Ｊ）、ローシャ Ｅ（Ｒｏｃｈａ Ｅ）、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．」、「Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．」、２００２年１２月、８８（６）：１０６０〜５）に記載される通り、標準の技術に従って抽出した。得られたＲＮＡは、転写酵素を用いて３７℃で６０分間インキュベートし、ｃＤＮＡに逆転写させ、それに続いて酵素失活のために６５℃で５分間インキュベートした。これを行うために、１２０単位（Ｕ）のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））を、ＲＮＡ１μｇに加え、１０μＬの最終体積にした。これは、４μＬの逆転写酵素緩衝液、２ｍｍｏｌ／Ｌのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、０．３μｇ／ｍＬのランダムヘキサマー（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのジオチオトレイトール（ｄｉｏｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）、および３５ＵのＲｎａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤由来のＲＮＡｓｉｎ ４８，０００Ｕ／ｍＬ、ＲＮＡガード、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））を含有していた。
【００４７】
ＥＰＣＲ遺伝子の発現を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。使用されるプライマー（ジェンセット（Ｇｅｎｓｅｔ）、フランス）は、配列番号３の配列に相当する５’プライマー、および配列番号４の配列に相当する３’プライマーであった。
【００４８】
ＰＣＲは、２５μＬの体積で行われた。１μｇのＲＮＡの逆転写によってあらかじめ得られた一定分量のｃＤＮＡが使用され、それに、１Ｕのｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、２．５μＬの反応緩衝液（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＬの各プライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ溶液から）、０．２５μＬのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））、および０．２５μｌの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡが加えられた。この反応混合物を、水で２５μＬに調節した。増幅サイクルは、９４℃で３０秒の変性相と、別のアニーリングと、７２℃で３．５分の伸張相からなる。このサイクルを５回繰り返し、その後、同じ変性相と、別のアニーリングと、６８℃で３分の伸張相の３２サイクルを実施する。最終の伸張期間として、混合物を５分間６８℃に維持して、増幅を終結させた。ＰＣＲ増幅されたセグメントは、１２２１塩基対（ｂｐ）の長さを有する。ＥＰＣＲ遺伝子がこれらの条件で増幅された場合、さらなるバンドが、約８５０塩基対の高さで出現する（図２）。
【００４９】
増幅されたＥＰＣＲのさらなるバンドの配列決定
バンド２は、鋳型として図２の８５０ｂｐバンドから開始すること以外は、同じ増幅条件を使用して増幅した。アガロースゲル電気泳動の後、製造業者の指示書に従って市販のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、増幅産物を精製した。このようにして精製された産物を、配列決定反応（ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）、ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）のための鋳型として使用した。配列番号５および配列番号６の配列に相当するプライマーを使用して、２つの配列決定反応（１つは５’−３’方向、もう１つは逆方向）を実施した。
【００５０】
反応の結果は、自動シーケンサー、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで分析した。結論としては、新規のバンドは、配列番号７の配列によって定義されるフラグメントに相当する。
【００５１】
その配列が配列番号２であるこのフラグメントの中央部分は、エキソン４および３’非翻訳領域の部分を欠く新規のＥＰＣＲのｃＤＮＡに相当する。このｃＤＮＡの起源は、おそらく、ＥＰＣＲ ＲＮＡの選択的切断−スプライシング現象である。
【００５２】
この新種のｃＤＮＡは、アミノ酸の配列が配列番号１であるポリペプチドをコードする。前記配列の残基１〜１７は、シグナルペプチドに相当し、残基１８〜２００は、ＥＰＣＲの共通の細胞外ドメインに相当し、残基２０１〜２５６は、この新規の形のＥＰＣＲの新規の示差的なドメインに相当し、ＥＰＣＲの膜貫通ドメインに代わるものである。この新規のドメインは、膜貫通ドメインであるための基準を満たさない。
【００５３】
緑色蛍光タンパク質と融合させたＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの哺乳類細胞における発現
ＥＰＣＲアイソフォームの細胞内の局在化を研究するために、そのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、それを緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させた。このようにして調製されるベクターを使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用する培養で、哺乳類ＣＯＳ−７細胞を一過的に形質転換させた。対照として、同じベクターを使用し、そこでは野生型ＥＰＣＲのｃＤＮＡをクローニングし、緑色蛍光タンパク質と融合させた。野生型ＥＰＣＲおよびアイソフォームの細胞内局在化を、蛍光顕微鏡検査によって検出した。図３に示さているように、野生型ＥＰＣＲは、主に細胞膜上に局在化する（ここでは緑色蛍光が認められる）が、ｓＥＰＣＲｖａｒアイソフォームは、本発明者らの仮定と一致して、細胞膜上には局在化しない。
【００５４】
ＥＰＣＲアイソフォームのクローニング、発現、精製、および特徴付け
クローニングおよび発現
同定されたＥＰＣＲ変異体（ＥＰＣＲｖａｒ）を発現させるために、ｓＥＰＣＲ ｖａｒ配列を、ｃＤＮＡ鋳型として内皮細胞を使用して、イニシエーター
５’−ａｇｃｔｔｇｇｃａｔａｔｃｇａｔｔａｇｃｃａａｇａｃｇｃｃｔｃａｇａｔｇ−３’および
５’−ａｇｃｔａｔｃｇｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｃｃｔａｔｔａｔａｔｃａｇｃ−３’
を用いる（これらは、それぞれ５’および３’末端にＣｌａＩおよび別のＮｏｔＩ制限部位を付加されている）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、そのシグナルペプチドを伴わずに増幅させた（残基１７〜２５６）。こうした修飾により、サッカロミセスセレビシエのα因子分泌シグナルの後の、ｐＰＩＣＺαＣ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））プラスミドのＣｌａＩおよびＮｏｔＩ部位に、ＥＰＣＲ変異体配列を結合することが可能になり、酵母から細胞外培地への多くのタンパク質の効率的な分泌が可能になった。クローニングプロセスにより、セリン残基および別のイソロイシン残基が、ｓＥＰＣＲｖａｒのアミノ末端に加えられた。直接的配列決定を使用して、挿入配列およびベクターが適切であることが確認されることが確認された。あらかじめ調製された発現ベクターを用いて、ＰｍｅＩ制限酵素を用いるそれらの直鎖化の後、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を、化学的方法を使用して形質転換させ（Ｅａｓｙ Ｃｏｍｐ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、その結果、メタノール反応内因性プロモーターにおける、ｓＥＰＣＲｖａｒコード配列の相同的組換えによる組込みが示された。ゼオシンの存在下で形質転換産物を培養し、ｓＥＰＣＲｖａｒコード配列を含有する、言い換えるとゼオシン抵抗性遺伝子を含有するベクターで形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）コロニーを選択した。簡単に言うと、形質転換された酵母を、１％（ｖ／ｖ）のグリセロール（ＢＭＧＹ）が補充された４ｍｌのＢＭＹ培地［１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物、２％（ｗ／ｖ）のペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６，０）、硫酸アンモニウムを含む酵母窒素源１．３４％（ｗ／ｖ）、４×１０−５％（ｗ／ｖ）のビオチン］中で培養し、撹拌しながら約１８時間２８〜３０℃でインキュベートした。細胞は、室温で５分間、２，０００ｇで遠心分離することによって収集した。上清を捨て、１８時間、１％メタノールを用いて、ｓＥＰＣＲｖａｒ発現を誘導した。これを行うために、細胞を、０．５％（ｗ／ｖ）メタノールが補充された３ｍｌのＭＢＹに再懸濁し、勢いよく攪拌しながら、約２８〜３０℃で１８時間インキュベートした。誘導後、条件培地からのサンプルを、１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にローディングし、ＲＣＲ−２モノクローナル抗体（フクドメケンジ（Ｋｅｎｊｉ Ｆｕｋｏｄｏｍｅ）博士、佐賀大学（Ｓａｇａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、日本（Ｊａｐａｎ）によって快く提供された）を使用するウェスタンブロットによってｓＥＰＣＲｖａｒを検出した（図４）。大規模産生については、最も高濃度のｓＥＰＣＲｖａｒを分泌したコロニーを選択した。その高いｓＥＰＣＲｖａｒ産生能力に起因して選択されたコロニーにおいて、そのメタノール代謝（新陳代謝が早いものまたは遅いもの）を研究し、これによって、最も適切なコロニーのための最適発現条件が確立された。一旦培養条件およびメタノール誘導が最適化されたら、大量のｓＥＰＣＲｖａｒを産生するために規模を増大した。
【００５５】
精製
Ｐ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養上清を濃縮し、ＮａＣｌを含まない２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対して透析した後、２つの連続する精製ステップ：イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過を実施した。イオン交換精製では、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））を使用し、溶出は、２０カラム分に匹敵する体積の、０．０〜３００ｍＭのＮａＣｌグラジエントを用いて実施した。ｓＥＰＣＲｖａｒを含有する溶出分画を合わせ、遠心限外濾過によって濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５−ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））にかけてゲル濾過を実施した。精製されたタンパク質の濃度を、ＢＣＡ総タンパク質アッセイ（ピエール（Ｐｉｅｒｒｅ）、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））およびＢＳＡ標準を使用して決定した。精製されたｓＥＰＣＲｖａｒを検出するために、サンプルを、１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にローディングし、還元条件下で電気泳動を実施し、続いて、クマシーブルーで染色した。電気泳動ゲルをエレクトロブロッティングにかけ、ＲＣＲ−２モノクローナル抗体を用いてｓＥＰＣＲｖａｒを検出した。ｓＥＰＣＲｖａｒの分子量を評価するために、各ゲル電気泳動には分子量標準を含ませた。
【００５６】
新規の可溶性ＥＰＣＲ変異体の活性を特徴づけるための生化学的分析
ＰＣに対するｓＥＰＣＲｖａｒの親和性
培養された内皮細胞におけるＡＰＣの産生。使用される細胞株は、ＥＡ．ｈｙ９２６（トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲを発現する能力を保持している、形質転換されたヒトの内皮細胞株）であった（スターンズ−クロサワＤＪ（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａ ＤＪ）、クロサワ Ｓ（Ｋｕｒｏｓａｗａ Ｓ）、モリカ ＪＳ（Ｍｏｌｌｉｃａ ＪＳ）、フェレル ＧＬ（Ｆｅｒｒｅｌｌ ＧＬ）、エスモン ＣＴ（Ｅｓｍｏｎ ＣＴ）、「Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．」「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．」１９９６年、９３：１０２１２〜６）。９６ウエルプレート上の５×１０４細胞／ウェルを、０．０２Ｕ／ｍｌのトロンビン（０．１７ｎＭ）（ＥＲＬ、イギリス、スウォンジー（Ｓｗａｎｓｅａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））と共にインキュベートし、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ ＢＳＡ、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０２％ ＮａＮ３を補充された、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ＰＣ（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、米国イリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ．ＵＳＡ））の濃度を５０ｎＭと１，０００ｎＭとの間で変化させ、室温にて４５分後、トロンビンを阻害するために、レピルジン（シェーリングＡＧ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）、ドイツ、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を、０．２μｌの最終濃度で加え、３〜４分後に、ＡＰＣによるそのタンパク質加水分解をモニタリングする目的で、発色基質Ｓ−２３６６（クロモジェニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、イタリア、ミラノ（Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を０．４ｍＭの最終濃度で加えた。４０５ｎｍでの吸光度の上昇を、マイクロプレートリーダー（ｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ、ラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、フィンランド（Ｆｉｎｌａｎｄ）で動力学的に記録した。ミハエリス・メンテンの式に対する曲線データの調整を、これらの条件でのＰＣ活性化Ｋｍ値を算出するＥｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（バイオソフト（Ｂｉｏｓｏｆｔ）、イギリス、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））を使用して実施した。
【００５７】
ｓＥＰＣＲｖａｒの阻害効果を研究するために、２μｍｏｌ／Ｌを、トロンビンおよびＰＣと同時に加えた。このようにして、ＰＣ活性化に対するｓＥＰＣＲｖａｒの効果を分析し、ＰＣに対するその親和性を反映する、ｓＥＰＣＲが活性化に対して有する効果と比較することができた。
【００５８】
表１は、ｓＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの存在下または非存在下での、培養された内皮細胞の表面上の、トロンビンによるプロテインＣ活性化の生化学的特性を示す。
【００５９】
表１
【表１】
【００６０】
ＰＣに対するｓＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの親和性
活性化部分卜ロンボプラスチン時間の決定。健康な対象からの５血漿の混合物を使用し、ダイアグノスティカ・スタゴ・ベーリンガーマンハイム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ＳＴＡ Ｃｏｍｐａｃｔ装置（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、およびパトロンチン（Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ）試薬（デイドベーリング（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、米国（ＵＳＡ））を使用して、活性化部分卜ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を決定した。周知のように、正常な血漿の混合物中のＡＰＣの存在は、ＡＰＴＴを延長させる。使用される実験条件では、ＡＰＣが存在しない場合のＡＰＴＴは、３３．１±０．４ｓ（平均±ＳＤ）であったのに対して、ＡＰＣが１ｎｍｏｌ／Ｌの最終濃度で加えられた場合、ＡＰＴＴは、４３．９±０．４ｓに延長された。ｓＥＰＣＲが加えられた場合、ＡＰＣの効果は低下し、１ｍｍｏｌ／ＬのｓＥＰＣＲが存在する場合には、ＡＰＴＴは、３７．２±０．２ｓであった。ＡＰＣの抗凝血効果に対するｓＥＰＣＲのこの阻害効果は、用量依存的である。正常な血漿の混合物に加えられたｓＥＰＣＲは、ＡＰＴＴに対する直接的な効果を有しなかった（ｓＥＰＣＲが存在する場合の３３．９±０．４ｓと比較して、ｓＥＰＣＲが存在しない場合には３３．１±０．４ｓ）。すべての実験を４回繰り返した。ｓＥＰＣＲではなく、同じ濃度のｓＥＰＣＲｖａｒが加えられた場合、結果は、ｓＥＰＣＲを用いて得られるものと重ねることができ、ｓＥＰＣＲと同様に、ｓＥＰＣＲｖａｒもＡＰＣと結合することが実証された。
【００６１】
表２は、ＡＰＣ抗凝血作用に対するｓＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒの効果を示す。それに１ｎｍｏｌ／ＬのＡＰＣおよび様々な濃度のｓＥＰＣＲが加えられた、正常な血漿の混合物の血液凝固時間（ＡＰＴＴ）。４つの実験の平均±ＳＤを示す。ＡＰＣが存在しない場合のＡＰＴＴは、３３．１±０．４秒であった。
【００６２】
表２
【表２】
【００６３】
様々な組織および腫瘍株におけるｓＥＰＣＲｖａｒの発現分析
ｓＥＰＣＲｖａｒが発現される組織を同定するために、ＥＰＣＲおよびｓＥＰＣＲｖａｒに相当するｃＤＮＡの同時増幅を可能にするプライマーを使用するＰＣＲによって、様々なヒト組織のｃＤＮＡライブラリ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣ）パネルＩおよびＩＩ、バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、米国（ＵＳＡ））を研究した。使用されるプライマー（ジェンセット（Ｇｅｎｓｅｔ、フランス）は、以下の通りであった：
プライマー５’：５’−ＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＣＣＧＣ−３’および
プライマー３’：５’−ＣＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴ−３’
【００６４】
ＰＣＲは、２５μＬの体積で実施した。ｃＤＮＡのアリコットを使用し、これに、１ Ｕのｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、２．５μＬの反応緩衝液（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＬの各プライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ溶液から）、０．２５μＬのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））、および０．２５μｌの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを加えた。反応混合物を、水で２５μＬに調節した。増幅サイクルは、９４℃で３０秒の変性段階、５６℃で１分の別のアニーリング段階、７２℃で１．５分の伸張からなる。このサイクルを３５回繰り返す。最終の伸張期間として７２℃で５分間混合物を維持して、増幅を終結させた。増幅されたＥＰＣＲのｃＤＮＡセグメントは、５７８ｂｐ長であったのに対し、ｓＥＰＣＲｖａｒのｃＤＮＡセグメントは、１８９ｂｐであった（図５）。ｓＥＰＣＲｖａｒ形は、膵臓、心臓、肝臓、腎臓、肺、胎盤、胸腺、小腸、脾臓、および大腸に多量に発現された。ｓＥＰＣＲｖａｒ形は、いくつかの腫瘍株に、特にＨ ５４９、Ｈ ４４１、およびＨ ７２０に多量に発現された。いくつかの腫瘍株、特にＨ ４４６およびＨ ６７６は、まだ同定されていない別の形（これは、その電気泳動移動度によれば、１０００ｂｐを有する）をさらに発現した。
【００６５】
抗体産生
免疫化
生後少なくとも１ヵ月のＢＡＬＢ／Ｃ雄を、以下のパターンに従って、ｓＥＰＣＲｖａｒで免疫化させた：フロイント・アジュバントまたは別のアジュバント中の１０μｇと２００μｇの間の量の免疫原を用いる、少なくとも２週間間隔での３回の皮下、皮内、または腹腔内の免疫化、あるいはこれらの組み合わせ、３回目の免疫化の２週間後、２日間隔で、同じ量の免疫原（ただし、生理食塩水血清（ｓａｌｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）中）を使用して、２回の新規の追加免疫を投与した。他の動物も、配列番号１のペプチド２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、および２４２〜２５６の混合物を用いて免疫化させた。これらのペプチドは、カイト Ｊ．（Ｋｙｔｅ Ｊ．）、ドリトル Ｒ．Ｆ．（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．）のアルゴリズム（「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、１９８２年、１５７：１０５〜１３２）に従うＰｒｏｔｓｃａｌｅプログラムによると非常に親水性であることから選択された。
【００６６】
融合
最後の追加免疫投与の２日後に、ハイブリドーマを産生した。ポリエチレングリコール１５００または４０００の存在下で、動物の脾細胞を骨髄腫細胞（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６．５．３、Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１、その他）と融合させることからなる技術を用いた。この薬剤は、膜融合を可能にし、その結果、様々な細胞型との間のハイブリッドが産生されることとなる。動物Ｂリンパ球と骨髄腫細胞との間のハイブリッドは、新規の細胞型、ハイブリドーマを形成し、これは、抗体を産生し、また、培養中に無限に増殖する。これらのハイブリドーマを選択し、残りのハイブリッドを排除するために、細胞培養物にＨＡＴ培地を加えた。ＨＡＴは、アミノプテリン、すなわちグアノシンの新規の合成経路（新生経路）の阻害剤を含有する。骨髄腫細胞は、核酸合成サルベージ経路に必要な機能性のＨＰＲＴ酵素を欠いているので、唯一の利用可能な経路（新生経路）が、アミノプテリンでブロックされる場合、これらは、核酸を合成することができない。したがって、培養の２週後、培養中で生き残る唯一の細胞は、脾細胞−骨髄腫ハイブリッドである。脾細胞は、ハイブリッドに代替の経路によるグアノシン合成能力を付与し、骨髄腫細胞に、インビトロの培養において際限なく培養される能力を付与する。
【００６７】
抗ｓＥＰＣＲｖａｒおよび抗ｓＥＰＣＲ抗体を産生するハイブリドーマの検出
ＨＡＴ培地中の細胞を、少なくとも１０の９６ウェル培養マイクロプレートに分配する。融合の９日後と１４日後との間に、コロニーのサイズは、上清中の抗体の存在を分析するのに十分となる。目的の抗体、すなわちｓＥＰＣＲｖａｒに対する抗体を分泌するハイブリドーマを選択するために、クローンを含有する５枚のマイクロプレートのすべてのウェルから上清のサンプルを取り出し、これをイムノアッセイにかけた。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡについては、プレートを、ｓＥＰＣＲｖａｒ（０．３μｇ／ウェル）で被覆し、４℃での１５時間のインキュベーション、および適切なタンパク質による対応するブロッキングの後、培養上清を加え、相応な洗浄を実施し、次いで、二次マウス抗免疫グロブリン抗体を加える。このようにして、ウェルの洗浄およびペルオキシダーゼおよびｏ−フェニレンジアミンを用いる発色の後、着色または吸光度（４９２ｎｍ）の上昇が検出されたウェルは、ｓＥＰＣＲｖａｒ抗体を分泌するハイブリドーマのクローンを含有する可能性がある。ウェスタンブロットについては、組み換え型タンパク質および／またはｓＥＰＣＲｖａｒタンパク質を発現する組織または細胞抽出物を、ポリアクリルアミドゲルで泳動した。これを、上清中の特異的抗体の存在を証明するために、格子型（ｇｒｉｌｌｅ−ｔｙｐｅ）装置によって独立した領域に分けられたニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ブロッキングおよび特異的抗体とのインキュベーションを行った後、これを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ酵素に結合した二次抗体と共にインキュベートした。発色は、酵素によって形質転換される際、特異的な抗体に結合された場所で光を産生する基質を使用して実施した。発光バンドが、予測分子量を有するタンパク質に相当する場合、その上清が由来するウェルからの抗体産生細胞を増殖させ、液体窒素中に凍結させることとなる。
【００６８】
ｓＥＰＣＲｖａｒは、全ｓＥＰＣＲ部分を含有するので、ｓＥＰＣＲｖａｒに対して陽性であるハイブリドーマの、組み換え型ＥＰＣＲの細胞外領域との反応性が分析されることとなる。このようにして、ｓＥＰＣＲｖａｒの特定の領域に対する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００６９】
ハイブリドーマの単クローン性
抗ｓＥＰＣＲｖａｒ抗体を分泌する各細胞培養物がモノクローナルであることを確認するために、クローニングまたは限界希釈技術が適用される。第１のウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ試験で陽性であった最初の培養物からの、あるいは幹細胞からの、単離された細胞を、新しい培養マイクロプレート上で増殖させる。１種または複数の細胞から生じている新規のコロニーが、一旦十分なサイズを獲得したら、これから再び上清を取り出し、これを新規のＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにかけることになる。再び陽性であったコロニーを限界希釈にかけ、このプロセスを、第３の限界希釈の後に分析された上清の１００％が、ｓＥＰＣＲｖａｒに対する抗体を含有するようになるまで繰り返した。
【００７０】
抗体精製
より大きな抗体濃度を達成するために、ハイブリドーマを特別な条件で培養した後（インテグラバイオサイエンス（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのＣＥＬｌｉｎｅシステムを備えた培養ビン、またはベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からのＣＥＬｌｉｎｅシステム）、ＩｇＧを含有する上清を、以下の方法のうちの１つまたは複数を用いる液体クロマトグラフィーによる精製にかけることとなる：ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ装置、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用する、免疫親和性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ／プロテインＧ／プロテインＬ、固定化金属、バイオアフィニティ）、陽イオン交換、ヒドロキシアパタイト、疎水的相互作用、ゲル濾過、など。
【００７１】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ＲＮＡがプロセッシングされ、成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が産生される方式に依存する、異なるタイプのＥＰＣＲを示す図である。３つの別の形のｍＲＮＡが産生される可能性があり、これらは、続いて、３つの異なる形のタンパク質を産生することとなる：１：膜ＥＰＣＲ（ｍＥＰＣＲ）として翻訳されるタンパク質とは異なる４つのエキソンを伴うｍＲＮＡ。２．エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩのみを含み、その後にイントロン３およびこのイントロンの後の全配列が続く、国際公開第９９００６７３号パンフレット中にエスモン（Ｅｓｍｏｎ）によって開示された可溶形のＥＰＣＲ（ａｌｔｓＥＳＰＣ）として翻訳されることとなるｍＲＮＡ。３．本発明に開示された新規の形の選択的切断およびスプライシングによって、エキソンＥｘ Ｉ、Ｅｘ ＩＩ、およびＥｘ ＩＩＩを含むｍＲＮＡが産生されることとなるが、プロセッシング中に、エキソンＥｘ ＩＶは失われ、この理由から、膜貫通ドメインも細胞質のテールも転写されず、その場所では、エキソンＩＩＩの後、３’非翻訳領域に位置する潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）エキソンであるであろう配列が出現し、この場合、ｍＲＮＡは、本発明の新規の可溶性ＥＰＣＲ形（ｓＥＰＣＲｖａｒ）として翻訳される。可溶性ＥＰＣＲはまた、おそらくメタロプロテアーゼ（まだ特徴づけられていない）から、タンパク分解活性によって産生することもできる。メタロプロテアーゼは、膜高さでＥＰＣＲを切断し、その結果、細胞外受容体の画分からなり、膜貫通ドメインおよび細胞質内テールを欠く、新規の可溶形のＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）が産生される。
【図２】図２は、特異的なＥＰＣＲ遺伝子プライマーを用いるＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡの増幅の後に得られるバンドパターンである：野生型ＥＰＣＲ ｃＤＮＡ（１２２１ｂｐ、矢印１）に相当するバンドに加えて、選択的切断−スプライシングによって産生された新規の変異体アイソフォームのｃＤＮＡに相当する新規の増幅断片が認められる（矢印２）。
【図３】図３は、どちらも緑色蛍光タンパク質と融合させた、野生型ＥＰＣＲ（パネルＡ）を用いて、あるいはアイソフォーム（パネルＢ）を用いて形質移入されたＣＯＳ−７細胞である。パネルＡは、野生型タンパク質が、細胞膜（矢印）上に蓄積する傾向があることを示すのに対して、アイソフォーム３を用いた場合、この局在化パターンは認められない（パネルＢ）。
【図４】図４は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるｓＥＰＣＲｖａｒ発現を説明する図である。本明細書に示すように、ｓＥＰＣＲｖａｒは、安定に形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞の上清から精製された。パネルＡ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＧＥＬＣＯＤＥ Ｂｌｕｅ染料を使用して検出された様々なタンパク質を示す。ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：組み換え型のｓＥＰＣＲ。約４２ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。Ｓｔｒｅｅｔ ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。４７ｋＤａのブロードなバンド（タンパク質の強いグリコシル化に起因する）が観察される。パネルＢ：モノクローナル抗−ＥＰＣＲ抗体を用いるウェスタンブロットによって検出されるタンパク質、ストリート Ｓｔ：発現される各バンドの分子量をｋＤａで示す、分子量マーカー、ストリート １：ブランク、ストリート ２：ｓＥＰＣＲｖａｒ。約４７ｋＤａのブロードなバンド（様々なタンパク質のグリコシル化に起因し、３５から６０ｋＤａまでの間に広がる）が観察される。
【図５】図５は、異なる組織および腫瘍由来のｃＤＮＡからのＥＰＣＲ遺伝子の増幅である。パネルＡ）１：分子量マーカー、２：心臓、３：肝臓、４：腎臓、５：膵臓、６：肺、７：胎盤。パネルＢ）１：分子量マーカー、２：骨格筋、３：脳、４：胸腺、５：小腸、６：脾臓。パネルＣ）１：マーカー、２：前立腺、３：睾丸、４：卵巣、５：大腸。パネルＤ）は、肺腫瘍の腫瘍株：２：Ｈ ４４６、３：Ｈ ５１０、４：Ｈ １２６４、５：Ｈ ５４９、６：Ｈ ４４１、７：ＨＴＢ ５１、８：Ｈ ６７６、９：Ｈ ７２７、１０：Ｈ ７２０、１１：Ｈ ３８５、１２：Ｈ １２９９からのサンプルである。分子量マーカーを含有するストリートは、図中に略語Ｓｔ（「ｓｔａｎｄａｒｄ（標準）」より）で示す。マーカーの下方のバンドは、１００ｂｐサイズに相当し、各新しいバンドは、その前のバンドに対して１００ｂｐの増分（１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ・・・）に相当する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６、または２０１と２５６との間の前記配列の残基のフラグメントを含むことを特徴とする、大血管およびガンにおける疾患プロセスのためのマーカーとして有用な、内皮プロテインＣ受容体に由来するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の残基２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、２４２〜２５６を含むフラグメントであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドを含むことを特徴とする、単離されたＥＰＣＲタンパク質。
【請求項４】
配列番号１の配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の単離されたＥＰＣＲタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする組み換え型のタンパク質。
【請求項６】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドのフラグメントをコードする配列を含むことを特徴とする、単離されたあるいは組み換え型のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列に由来することを特徴とする、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチド発現を調節する作動可能に結合された制御配列をさらに含むことを特徴とする、請求項６または７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６によって形成されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドのフラグメントをコードする配列を含むことを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列から得られるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドの発現を調節する作動可能に結合された制御配列をさらに含むことを特徴とする、請求項９または１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項１に記載の配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列のフラグメントをコードする、請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、または請求項１２に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物が、適切な制御配列に作動可能に結合されていることを特徴とする請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、原核細胞または真核生物細胞であることを特徴とする請求項１３または１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、細菌大腸菌または酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）であることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１２に記載の発現ベクターと、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むことを特徴とする発現系。
【請求項１８】
前記タンパク質、ポリペプチド、またはフラグメントの発現を可能にする条件下で、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質、ポリペプチド、または前記ポリペプチドのフラグメントを産生する方法。
【請求項１９】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むタンパク質、または前記配列の残基の少なくとも９アミノ酸のフラグメントをコードすることを特徴とするｍＲＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは免疫原特性を有する前記配列の残基のフラグメントに対して特異的な抗体。
【請求項２１】
配列番号１の残基２０１〜２５６の配列のフラグメントが、少なくとも９アミノ酸を有することを特徴とする、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
配列が、残基２０１〜２５６、残基２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、２４２〜２５６（すべて配列番号１に関する）から選択される前記ポリペプチドのポリペプチドまたはフラグメントに対して特異的であることを特徴とする、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号１に対して特異的であり、領域２０１〜２５６に結合しない場合には領域１〜２００を認識しないことを特徴とする請求項２０に記載の抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１に記載の配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質、または前記配列の残基のフラグメントの、生体試料のインビトロでの選択的検出のための方法であって、
−生体試料を得ること、
−配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントの量を分析すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記生体試料が、尿、血漿、血清、組織、および間質液から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、免疫学的方法、クロマトグラフィー法、および分光光度法から選択されることを特徴とする請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質の量が、血管損傷に関連する炎症性のプロセス、炎症、ガン、および凝固異常に関連する疾患から選択される疾患に関連することを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
検出されるＥＰＣＲタンパク質の量を、較正標準と比較することによって比較することを含むことを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントの検出および定量化のための試験キットであって、ａ）請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の特異的な抗体、
ｂ）生体試料中に存在する配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質と、抗体ａ）との間の反応を検出する試薬、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
産生される反応物の量を、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質の正常および異常なレベルと相関させるための標準も含むことを特徴とする請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントに相当するｍＲＮＡを検出および定量化するための、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
前記ＥＰＣＲタンパク質が、血管損傷に関連する炎症性の疾患、炎症、ガンおよび凝固異常に関連する疾患から選択される疾患に関連する量で存在することを特徴とする請求項３２に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６、または２０１と２５６との間の前記配列の残基のフラグメントを含むことを特徴とする、大血管およびガンにおける疾患プロセスのためのマーカーとして有用な、内皮プロテインＣ受容体に由来するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の残基２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、２４２〜２５６を含むフラグメントであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドを含むことを特徴とする、単離されたＥＰＣＲタンパク質。
【請求項４】
配列番号１の配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の単離されたＥＰＣＲタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする組み換え型のタンパク質。
【請求項６】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６から形成されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドのフラグメントをコードする配列を含むことを特徴とする、単離されたあるいは組み換え型のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列に由来することを特徴とする、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチド発現を調節する作動可能に結合された制御配列をさらに含むことを特徴とする、請求項６または７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６によって形成されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドのフラグメントをコードする配列を含むことを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
配列番号２に相当するｃＤＮＡ配列から得られるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドの発現を調節する作動可能に結合された制御配列をさらに含むことを特徴とする、請求項９または１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項１に記載の配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは前記配列のフラグメントをコードする、請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、または請求項１２に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物が、適切な制御配列に作動可能に結合されていることを特徴とする請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、原核細胞または真核生物細胞であることを特徴とする請求項１３または１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、細菌大腸菌または酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）であることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１２に記載の発現ベクターと、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むことを特徴とする発現系。
【請求項１８】
前記タンパク質、ポリペプチド、またはフラグメントの発現を可能にする条件下で、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質、ポリペプチド、または前記ポリペプチドのフラグメントを産生する方法。
【請求項１９】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むタンパク質、または前記配列の残基の少なくとも９アミノ酸のフラグメントをコードすることを特徴とするｍＲＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドまたは免疫原特性を有する前記配列の残基のフラグメントに対して特異的な抗体。
【請求項２１】
配列番号１の残基２０１〜２５６の配列のフラグメントが、少なくとも９アミノ酸を有することを特徴とする、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
配列が、残基２０１〜２５６、残基２１３〜２２７、２２９〜２４２、２１２〜２２６、２２７〜２４１、２４２〜２５６（すべて配列番号１に関する）から選択される前記ポリペプチドのポリペプチドまたはフラグメントに対して特異的であることを特徴とする、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号１に対して特異的であり、領域２０１〜２５６に結合しない場合には領域１〜２００を認識しないことを特徴とする請求項２０に記載の抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１に記載の配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質、または前記配列の残基のフラグメントの、生体試料のインビトロでの選択的検出のための方法であって、
−生体試料を得ること、
−配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントの量を分析すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記生体試料が、尿、血漿、血清、組織、および間質液から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、免疫学的方法、クロマトグラフィー法、および分光光度法から選択されることを特徴とする請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質の量が、血管損傷に関連する炎症性のプロセス、炎症、ガン、および凝固異常に関連する疾患から選択される疾患に関連することを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
検出されるＥＰＣＲタンパク質の量を、較正標準と比較することによって比較することを含むことを特徴とする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントの検出および定量化のための試験キットであって、ａ）請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の特異的な抗体、
ｂ）生体試料中に存在する配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質と、抗体ａ）との間の反応を検出する試薬、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
産生される反応物の量を、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質の正常および異常なレベルと相関させるための標準も含むことを特徴とする請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むＥＰＣＲタンパク質または前記配列の残基のフラグメントに相当するｍＲＮＡを検出および定量化するための、配列番号１の配列の残基２０１〜２５６を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
前記ＥＰＣＲタンパク質が、血管損傷に関連する炎症性の疾患、炎症、ガンおよび凝固異常に関連する疾患から選択される疾患に関連する量で存在することを特徴とする請求項３２に記載のポリヌクレオチドの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５３２５３６（Ｐ２００８−５３２５３６Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０１３４０（Ｐ２００８−５０１３４０）
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９７５６４
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９７５６４
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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