新規のＩｇＥエピトープの同定
本発明は、ＩｇＥに特異的に結合する高親和性抗体によって認識される、ＩｇＥのＣＨ３ドメインに由来する新規のペプチドエピトープに関する。これらの新規のペプチドは、被験体においてこれらのペプチドを投与して高親和性抗体を産生させることによる、被験体の能動免疫のため、ならびに被験体の受動免疫のために、非ヒト宿主においてＩｇＥのこれらの領域に特異的に結合する高親和性抗ＩｇＥ抗体を産生するための、両方に使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互関連出願）
本出願は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８９２およびＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８９４（２００４年２月２日出願）の優先権を主張する。上記出願の全ては、本明細書において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アレルギーは、外来の因子（例えば、アレルゲン）に対する過大な免疫応答によって誘導される過敏性状態である。即時（Ｉ型）過敏症は、アレルゲンとの接触直後のアレルギー性応答によって特徴付けられ、これは、Ｂ細胞を介して媒介され、そして抗原−抗体反応に基づく。遅延性過敏症は、Ｔ細胞を介して媒介され、そして細胞免疫の機構に基づく。近年、用語「アレルギー」は、よりＩ型過敏症と同義になってきている。
【０００３】
即時過敏症は、アレルゲンに暴露されて抗体分泌性プラスマ細胞に分化するＢ細胞による、免疫グロブリンクラスＥの抗体（ＩｇＥ抗体）の産生に基づく反応である。ＩｇＥに誘導される反応は、身体へのアレルゲン侵入部位で（すなわち、粘膜表面および／または局所リンパ節において）生じる局所的事象である。局所的に産生されたＩｇＥは、最初に局所性肥満細胞を感作する。すなわち、ＩｇＥ抗体は、定常領域を用いて、肥満細胞の表面上のＦｃεレセプターに結合し、次いで、「溢出」ＩｇＥが循環に侵入し、全身にわたって循環性好塩基球および組織固定（ｔｉｓｓｕｅ−ｆｉｘｅｄ）肥満細胞の両方のレセプターに結合する。その結合したＩｇＥが、その後アレルゲンに接触する場合、Ｆｃεレセプターは、アレルゲンと結合することによって交差結合され、細胞を脱顆粒させ、多くのアナフィラキシー性媒介物質（例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエンなど）を放出させる。即時過敏症に典型的な臨床症状（すなわち、気道または腸の平滑筋の収縮、小血管の拡張、ならびに水および血漿タンパク質に対する透過性の増大、粘液分泌（これらは、例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー性湿疹（ｅｘｃｅｍａ）、および喘息を引き起こす）、そして皮膚内に終わる神経の刺激（これは、かゆみおよび痛みを引き起こす））の原因となるのは、これらの物質の放出である。さらに、アレルゲンとの２回目の接触における反応は、ＩｇＥを細胞表面上に発現することによるアレルゲンとの最初の接触の後に、一部のＢ細胞が表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞（ｓＩｇＥ＋Ｂ細胞）の「記憶プール」を形成することに起因して、強化される。
【０００４】
ＩｇＥに対する２つの主要なレセプターが存在する。抗親和性レセプターＦｃεＲＩおよび低親和性レセプターＦｃεＲＩＩである。ＦｃεＲＩは、肥満細胞および好塩基球の表面上に優先的に発現されるが、ヒトランゲルハンス細胞、樹状細胞、および単球上にもまた、低レベルのＦｃεＲＩが見出され、ここで、ＦｃεＲＩは、ＩｇＥ媒介性アレルゲン提示において機能する。さらに、ＦｃεＲＩは、ヒト好酸球および血小板上でも報告されている（非特許文献１）。ＦｃεＲＩは、Ｂ細胞、Ｔ細胞または好中球の表面上には見いだされない。ランゲルハンス細胞および皮膚樹状細胞でのＦｃεＲＩの発現は、機能的におよび生物学的に、アレルギーの個体におけるＩｇＥ結合抗原提示に関して重要である（非特許文献２）。
【０００５】
低親和性レセプターＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）は、細胞質膜からの長いらせん形のコイル状の柄から伸びる頭部構造を有する３つの同一なサブユニットを備えるレクチン様分子である（非特許文献３）。ＩｇＥへの結合のとき、ＦｃεＲＩＩは、ＩｇＥの合成の調節に関与するＢ細胞上のＣＤ２１と会合する（非特許文献４、非特許文献５）。ＦｃｃＲＩＩは、アレルゲン提示に関して長く認識されてきた。（非特許文献６）。上皮細胞上のＦｃεＲＩＩに結合したＩｇＥは、特異的かつ迅速なアレルゲン提示を引き起こす（非特許文献７）。ＦｃεＲＩＩは、数種の細胞型（Ｂ細胞、好酸球、血小板、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、濾胞樹状細胞、およびランゲルハンス細胞が挙げられる）に存在する。
【０００６】
ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩと相互作用するＩｇＥ分子の構造の実体もまた同定されている。突然変異誘発研究は、ＣＨ３ドメインが、ＦｃεＲＩ（非特許文献８；非特許文献９）およびＦｃεＲＩＩ（非特許文献６；非特許文献１０）の両方とのＩｇＥの相互作用を媒介することを示した。高親和性レセプターおよび低親和レセプターの両方に対する結合部位は、２つのＣＨ３ドメインを通る中心回転軸に沿って対称的に位置する。ＦｃεＲＩ結合部位は、ＣＨ３ドメインの、ＣＨ２ドメインの接合部近くの外側に位置し、一方ＦｃεＲＩＩ結合部位は、ＣＨ３のカルボキシル末端にある。
【０００７】
アレルギー処置のための有望な考え方は、ＩｇＥアイソタイプ特異的であり、したがってＩｇＥに結合し得る、モノクローナル抗体の適用に関する。このアプローチは、ＩｇＥ免疫応答（アレルギーの誘導における最も初期の反応であり、そしてアレルギー状態を維持させる）をダウンレギュレートすることによる、アレルギー性反応の阻害に基づく。他の抗体クラスの応答が影響を与えない場合、アレルギー症状に対する即時効果および長期持続効果の両方が達成される。ヒト好塩基球密度の初期の研究は、患者の血漿中のＩｇＥレベルと好塩基球あたりのＦｃεＲＩレセプターの数との間の相関を示した（非特許文献１１）。彼らは、アレルギーの人物と非アレルギーの人物とにおけるＦｃεＲＩ密度が、好塩基球あたり１０４〜１０６レセプターの範囲に及ぶことを示した。後に、抗ＩｇＥによるアレルギー性疾患の処置が、循環性ＩｇＥの量を処置前のレベルの１％まで減少させることが示された（非特許文献１２）。ＭａｃＧｌａｓｈａｎは、患者の血清中を循環する遊離ＩｇＥに結合する、全抗ＩｇＥ抗体で処置された患者から得られた血清を分析した。彼らは、患者中の循環性ＩｇＥのレベルを低下させることは、好塩基球上に存在するレセプターの数を減少させる結果となることを報告した。したがって、彼らは、好塩基球および肥満細胞上のＦｃεＲＩ密度が循環性ＩｇＥ抗体のレベルによって直接的もしくは間接的に調節される、という仮説を立てた。
【０００８】
より最近では、特許文献１は、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩのＩｇＥ結合部位に結合してＩｇＥのレセプターへの結合をブロックする、ＩｇＥ分子およびフラグメントの使用を開示した。しかし、これらのアレルギー性疾患の管理に対する有害な副作用のない効果的な治療は、限られている。アレルギー性疾患の処置に対する１つの治療アプローチは、ヒト化抗ＩｇＥ抗体を使用して、アレルギー性鼻炎および喘息を処置することに関する（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。これらの臨床的データは、ＩｇＥのそのレセプターへの結合の阻害が、アレルギー性疾患を処置するための効果的なアプローチであることを実証する。
【０００９】
抗アレルギー剤として適切な抗体は、ＩｇＥ産生性プラスマ細胞へと分化する表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞と反応すべきであり、これによってこれらは、機能的にそれらのＢ細胞を消失させるために使用され得る。しかし、ＩｇＥに対する抗体は、基本的に、Ｆｃεレセプターと交差結合することによって、ＩｇＥ感作された肥満細胞から放出される媒介物質を誘導し得る。したがって、血清ＩｇＥレベルおよびｓＩｇＥ＋Ｂ細胞レベルに対して発揮される有利な効果を拮抗する。抗ＩｇＥ治療を発展させ得ることに伴う潜在的に危険な問題の１つは、既に抗親和性レセプターに結合しているＩｇＥに結合する治療用抗体によって引き起こされ、そしてヒスタミン放出を誘発し、潜在的にアナフィラキシー性の反応を引き起こす、ＩｇＥ交差結合の可能性である。
【００１０】
したがって、アレルギーの治療のために適用可能な抗体は、感作された肥満細胞および好塩基球に結合したＩｇＥと反応してはいけないが、ｓＩｇＥ＋Ｂ細胞を認識する能力を保持しているべきである。このようなＩｇＥアイソタイプ特異的抗体は、例えば、非特許文献１８）によって、特許文献２において、および数件の米国特許（例えば、特許文献３）において、記載されている。
【００１１】
抗ＩｇＥ抗体を産生するために使用されるペプチドはまた、アナフィラキシー性抗体を誘導する危険の可能性を被る。能動的ワクチン接種の間の抗ＩｇＥ抗体の産生は、免疫の間に産生された抗体が、高親和性ＩｇＥレセプターに結合したＩｇＥに結合する場合、または他の機構によって、受動的に投与された抗ＩｇＥ抗体と同様の方法で、ヒスタミン放出を誘発し得る。
【特許文献１】国際公開第９９／６２５５０号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第０４０７３９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４４９，７６０号明細書
【非特許文献１】Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｓ．ら，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ，１９９９年，９３：２５４３−２５５１
【非特許文献２】Ｋｌｕｂａｌ Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７年，１０８（３）：３３６−４２
【非特許文献３】Ｄｉｅｒｋｓ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年，１５０：２３７２−２３８２
【非特許文献４】Ｓａｎｏｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０年，８６：３３３−３４４
【非特許文献５】Ｂｏｎｎｅｆｏｙ，Ｊ．ら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐ．Ｊ．１９９６年，９：６３ｓ−６６ｓ
【非特許文献６】ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，３６６：４２１−４２８
【非特許文献７】Ｙａｎｇ，Ｐ．Ｐ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００年，１０６：８７９−８８６
【非特許文献８】Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４年，２６９：２６３６８−２６３７３
【非特許文献９】Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，３６：１５５６８−１５５７８
【非特許文献１０】Ｓｈｉ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，３６：２１１２−２１２２
【非特許文献１１】Ｍａｌｖｅａｕｘら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９７８年，６２：１７６
【非特許文献１２】ＭａｃＧｌａｓｈａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７年，１５８：１４３８−１４４５
【非特許文献１３】Ｃｏｒｎｅ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７年，９９：８７９−８８７
【非特許文献１４】Ｒａｃｉｎｅ−Ｐｏｏｎ，Ａ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９７年，６２：６７５−６９０
【非特許文献１５】Ｆａｈｙ，Ｊ．Ｖ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９７年，１５５：１８２４−１８３４
【非特許文献１６】Ｂｏｕｌｅｔ，Ｌ．Ｐ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１９９７年，１５５：１８３５−１８４０
【非特許文献１７】Ｍｉｌｇｒｏｍ，Ｅ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９９年，３４１：１９６６−１９７３
【非特許文献１８】Ｃｈａｎｇら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０年，８，１２２−１２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＩｇＥに特異的に結合するが、既にその高親和性レセプターに結合したＩｇＥには結合しない、高親和性の非アナフィラキシー性抗体に対する必要性、ならびに、アナフィラキシー性抗体を誘導しない、能動免疫のためのペプチドに対する必要性が存在する。本発明者らは、肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥに結合することなく、抗体の高親和性結合を提供する、ＩｇＥの特異的エピトープを同定した。これらの特異的エピトープは、次いで、レセプターに結合するＩｇＥの領域に結合するのみである、ＩｇＥに対する抗体を産生する能動免疫のための、特異的ペプチドを産生するために使用され得る。このことは、この抗体が、既にレセプターに結合したＩｇＥに交差結合しないこと、したがって非アナフィラキシー性であることを保証する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ＩｇＥのＣＨ３ドメインに由来する新規のペプチドエピトープに関する。これらのペプチドエピトープは、ＩｇＥに特異的に結合する高親和性抗体によって認識される。これらの新規のペプチドは、哺乳動物においてこれらのペプチドを投与して高親和性抗体を産生することによる、哺乳動物の能動免疫のために使用され得る。このペプチドエピトープはまた、非ヒト宿主において、ＩｇＥのこれらの領域に特異的に結合する高親和性抗ＩｇＥ抗体を産生すること、および得られた抗体を哺乳動物の受動免疫のために使用することに使用され得る。
【００１４】
本発明の一免疫原（エピトープＡ、図１１）は、以下のアミノ酸配列を含む：
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｘａａ Ａｒｇ Ｘａａ（配列番号７２）
エピトープＡの１つの例は、以下である：
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ（配列番号７３）
別の免疫原（エピトープＢ、図１１）は、以下のアミノ酸配列を含む：
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号７４）
エピトープＢの例としては、以下が挙げられる：
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７５）
Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７６）
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ（配列番号７７）
配列番号７２または配列番号７４のいずれにおいても、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり得る。
【００１５】
これらのペプチドは、上記ペプチドの少なくとも１つ、および生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、安定剤、もしくは賦形剤、ならびに免疫原性キャリアを含む組成物中に含まれ得る。上記免疫原性キャリアは、例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドであり得る。本発明はまた、配列番号７２〜７７をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、およびこのベクターを有する細胞に関する。
【００１６】
本発明はまた、エピトープＡおよび／またはエピトープＢに特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、エピトープＡおよび／またはエピトープＢに特異的に結合する抗体を作製する方法に関する。
【００１７】
本発明は、配列番号７２および／または配列番号７４を含むペプチドの、ＩｇＥ媒介性疾患もしくはＩｇＥ媒介性状態に罹患する被験体への投与に関する。
【００１８】
本発明は、配列番号７２および／または配列番号７４を含むペプチドを用いて産生された高親和性抗体の、ＩｇＥ媒介性疾患もしくはＩｇＥ媒介性状態に罹患する哺乳動物への投与に関する。この高親和性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。この抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。このようなＩｇＥ媒介性疾患もしくはＩｇＥ媒介性状態としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、および湿疹が挙げられる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常かつ典型的な意味で解釈されるべきである。しかし、本出願人らは、以下の用語が以下に定義されるような特定の定義を与えられることを所望する。
【００２０】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する用語「実質的に同一」は、参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を示す抗体鎖として解釈され得る。核酸配列に関するこの用語は、参照核酸配列に対して、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈され得る。
【００２１】
用語「同一性」または「相同性」は、配列全体に対する最大パーセント同一性を達成することを必要し、そして配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない場合、配列をアラインメントさせ、そしてギャップを導入した後に比較される、対応する配列の残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味すると解釈されるべきである。Ｎ末端またはＣ末端の伸張も、それらの挿入も、同一性または相同性の低減として解釈されるべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該分野で周知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを使用して測定され得る。
【００２２】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体が挙げられる）、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を網羅する。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する、糖タンパク質である。抗体が特定の標的に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは、抗体および標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。ネイティブな抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖と２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、そして他方の端に定常ドメインを有する。「高親和性」抗体とは、少なくとも１０−１０、好ましくは１０−１２の結合親和性を有するこれらの抗体をいう。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「抗ヒトＩｇＥ抗体」とは、このようなＩｇＥの高親和性レセプターＦｃεＲＩへの結合を、阻害または実質的に低下させるような様式で、ヒトＩｇＥを結合する抗体を意味する。
【００２４】
抗体の可変ドメインに関連する用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列がかなり異なり、そして各特定の抗体の、その特定の標的に対する結合および特異性において使用されるという事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均一に分布していない。これは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる（または超可変領域としても知られる）３つのセグメントに集中されている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ領域を含み、その多くはβ−シート構造を採用し、３つのＣＤＲによって結合され、これらはループを形成し、上記β−シート構造を結合し、いくつかの場合はその一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって、他の鎖からのＣＤＲと一緒に近接して保持され、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔらを参照のこと）。本明細書において使用される場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、他に示されない限り、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）の免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従って行われる。
【００２５】
用語「抗体フラグメント」とは、全長抗体の一部（一般的には、標的結合領域または可変領域）をいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。語句、抗体の「機能的フラグメントまたはアナログ」は、全長抗体に共通の定性的生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、ＩｇＥ免疫グロブリンに対して、このような分子の能力を、高親和性レセプターＦｃεＲＩに結合する能力を有することから防ぐかまたは実質的に低減させる様式で、結合し得るものをいう。本明細書において使用される場合、抗体に関して、「機能的フラグメント」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントをいう。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識部位および完全な標的結合部位を含む、最小抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域との強い、非共有結合性結合のダイマー（ＶＨ−ＶＬダイマー）からなる。これは、各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面における標的結合部位を規定するために相互作用する構造にある。集合的に、６つのＣＤＲが、抗体に対する標的結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、標的に関して特異的な３つのＣＤＲのみを含む、Ｆｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、標的に認識および結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、標的結合に関する所望の構造を形成するｓＦｖを形成し得るポリペプチドリンカーを含む。
【００２６】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基（抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む）の付加によってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断によって生成される。抗体フラグメントのさらなる化学結合は、当業者に公知である。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいう（すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、少数の量で存在し得る、可能性のある天然に存在する変異を除いて、同一である）。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の標的部位に対して指向する。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対して指向する種々の抗体を代表的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は、標的上の単一の決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され得、他の免疫グロブリンによって汚染されない可能性があるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一の抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用するためのモノクローナル抗体は、周知の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。本発明によって使用されるべき親モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換え法によって作製され得る。
【００２８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の標的結合配列）である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらの領域である。非ヒト抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的に、選択されたヒト免疫グロブリンテンプレートの免疫グロブリン定常領域）の少なくとも一部を含み得る。
【００２９】
用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、子孫を含む。全ての子孫は、意図的な変異または不慮の変異に起因して、ＤＮＡ内容物において正確には同一でない可能性があることが、また理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされる場合、同じ機能特性または生物学的特性を有する改変体子孫が含まれる。本発明において使用される「宿主細胞」は、一般的に、原核生物宿主または真核生物宿主である。
【００３０】
ＤＮＡによる細胞生物体の「形質転換」とは、生物体にＤＮＡを導入し、そのＤＮＡが、染色体外エレメントとして、または染色体組み込みによって複製されることを意味する。ＤＮＡによる細胞生物体の「トランスフェクション」とは、任意のコード配列が実際に発現されていてもいなくとも、細胞または生物体によるＤＮＡ（例えば、発現ベクター）の取り込みをいう。用語「トランスフェクトされた宿主細胞」および「形質転換された」とは、ＤＮＡが導入された細胞をいう。この細胞は、「宿主細胞」と称され、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。代表的な原核生物宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の系統が挙げられる。代表的な真核生物宿主細胞としては、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣またはヒト起原の細胞）が挙げられる。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と同種由来、または（ｏｆ）宿主細胞と異なる種であり得るか、あるいは、一部の外来ＤＮＡおよび一部の同種ＤＮＡを含む、ハイブリッドＤＮＡ配列であり得る。
【００３１】
用語「ベクター」とは、適切な宿主中におけるＤＮＡの発現を生じ得る適切な制御配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物を意味する。このような制御配列としては、転写を引き起こすプロモーター、このような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または、単に潜在的ゲノムインサートであり得る。一旦適切な宿主中へと形質転換された場合、ベクターは、複製して宿主ゲノムと独立して機能し得るか、またはいくつかの例では、ゲノムそのものへと一体化し得る。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、時として、交換可能に使用される。なぜなら、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態だからである。しかし、本発明は、当該分野で公知であるか、公知となる機能と等価な機能を果たすような他のベクターの形態を包含することを意図する。
【００３２】
発現「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。前配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関わる前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡと作動可能に連結されている可能性がある；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている；あるいは、リボゾーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「操作可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が、隣接しており、そして分泌リーダーの場合、隣接していてリーディングフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。
【００３３】
処置目的のための「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、非ヒト霊長類、および動物園の動物、競技用動物、またはペット用動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が挙げられる。
【００３４】
用語「エピトープタグ化」とは、ポリペプチドに関して本明細書において使用される場合、「エピトープタグ」に融合されたポリペプチドをいう。エピトープタグポリペプチドは、そのエピトープに対して抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、ポリペプチドの活性を干渉しないように十分短い。エピトープタグはまた、好ましくは、かなり独特であり、したがって抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常、約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約９〜３０残基）の間である。例としては、以下が挙げられる：インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５））；そして単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５４７−５５３（１９９０））。特定の実施形態において、エピトープタグは、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のインビボ血清半減期の延長を担う、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープであり得る。
【００３５】
語「標識」とは、本明細書において使用される場合、分子またはタンパク質（例えば、抗体）と直接的または間接的に結合され得る検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自身検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であり得るか、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「固相」とは、本発明の抗体が接着し得る非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例としては、部分的もしくは全体的に、ガラス（例えば、制御された多孔質ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから形成されたものが挙げられる。特定の実施形態において、状況に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを包含し得；他方、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩｇＥ媒介性障害」とは、免疫グロブリンＩｇＥの過剰生成および／または免疫グロブリンＩｇＥに対する過剰な感受性によって特徴付けられる状態または疾患を意味する。具体的には、アナフィラキシー性過敏症ならびにアトピー性アレルギー（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性結膜炎（花粉症）、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギーが挙げられる）に関する状態を包含すると解釈される。例えば、蜂に刺されること、蛇にかまれること、食物、または医薬によって引き起こされるアナフィラキシーショックの重篤な生理学的状態もまた、本用語の範囲下に包含される。
【００３８】
（抗体の生成）
出発抗体または「親」抗体は、このような抗体を生成するために当該分野で利用可能な技術を用いて調製され得る。これらの技術は、当該分野で周知である。出発抗体を生成するための例示的方法は、以下の節においてより詳細に記載される。これらの記載は、親抗体を作製または選択するための考えられる代替案であり、このような分子が生成され得る方法を決して限定しない。
【００３９】
抗体の結合親和性は、本発明の高親和性抗体を生成する前に決定される。また、この抗体は、他の生物学的に活性なアッセイに（例えば、治療剤としての有効性を評価するために）供され得る。このようなアッセイは、当該分野で公知であり、そして抗体に対する標的および意図される用途に依存する。
【００４０】
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥの、その高親和性レセプターへの結合をブロックするもの）についてスクリーニングするために、慣習的な交差ブロックアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８））に記載されるようなアッセイ）が実施される。あるいは、エピトープマッピングは、抗体が目的のエピトープにどこで結合するかを決定するために実施され得る。必要に応じて、抗体を生成するために使用される標的のホモログに対する抗体の結合親和性（ここで、このホモログは、異なる種に由来する）は、当該分野で公知の技術を用いて評価され得る。一実施形態において、他の種は、前臨床研究において抗体が投与される非ヒト動物である。したがって、この種は、アカゲザル、カニクイザル、ヒヒ、チンパンジー、およびマカクのような非ヒト動物であり得る。他の実施形態において、この種は、例えば、げっ歯類、ネコ、またはイヌであり得る。
【００４１】
親抗体は、標的に対して親抗体よりもより高いかもしくはより強い結合親和性を有する抗体を生成するように、本発明に従って変化される。抗体特異性は、抗体とその標的との間に形成される独特の界面から生じる；この表面は、独特のはめ合いを生じるように互いに補完する（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３−２０）。その界面に沿った接触をさらに改善することによって、結合パートナーの会合を助けるために必要とされるエネルギーコストがより低いことの結果として、全体的な親和性が増加し得る。
【００４２】
抗体の結合表面は、一般的に、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成される。これらは、コアから外に伸びるループである。ＣＤＲは、特異的標的への結合のために独特の配列を有するアミノ酸から構成される。抗体の、その抗原に対する親和性を増加させるために、これらのアミノ酸の周辺の環境は、種々の非共有結合力を導入または改善し、最終的に、相互作用のエネルギー特性を低下させ、その結果としてより高い親和性をもたらすことによって、より都合よくならねばならない。
【００４３】
ファンデルワールス力は、２つの電気的に中性な分子の間で生じる非共有結合性相互作用である（Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）。会合は、永久双極子または誘起双極子から生じる静電気的相互作用に由来して、２つの表面の間で起こり得る。これらの双極子は、αヘリックスの端に沿って存在し得るか、または極性アミノ酸の近くに存在し得る。結合界面に沿ったファンデルワールス力の数の増加によって、より都合よい会合が生じる。
【００４４】
水素結合の導入もまた、抗体とその抗原との間の相互作用の特異性を増加させる。水素結合に関与する一般的なドナーおよびアクセプターは、主にアミノ酸を構成する窒素原子、酸素原子および硫黄原子である（上述のＶｏｅｔらを参照のこと）。水素結合は、短い距離のみにわたる傾向にあり（通常２．７〜３．１Å）、そのため、その結合パートナーは、これらの相互作用が生じるためには密接しなければならない。したがって、親和性を改善し得る１つの様式は、潜在的ドナー分子と潜在的アクセプター分子とを密接して接触させて、水素結合を確立させることである。
【００４５】
最後に、疎水性相互作用の改善もまた、２つの結合パートナーの間の有利なエネルギー特性を増加させる。結合表面に密接して位置する非極性残基は、他の非極性残基によって囲まれるべきであり、それによって有利な環境に存在する。非極性側鎖の囲み（ｔｈｅ ｂｕｒｉａｌ ｏｆ ｎｏｎｐｏｌａｒ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ）を満足することによって、相互作用のエネルギー特性は、強い結合界面のために有利となる。
【００４６】
タンパク質−タンパク質界面を安定化させる相互作用は、これらの接触を維持するエネルギーコストを低下させ、したがって、全体的親和性を増加させる。結合界面近くの個々のアミノ酸の周りの環境を改善することによって、より有利な環境が生成され、結果としてより高い親和性が得られる。したがって、有利な接触を導入し、そしてさらなる相補性を介して界面を改善することによって、抗体と抗原との間の全体的な結合相互作用は大きく改善される。
【００４７】
得られた抗親和性抗体は、好ましくは、親抗体の標的に対する結合親和性よりも少なくとも約１０倍高い、または少なくとも約２０倍高い、または少なくとも約５００倍高い、または１０００倍〜５０００倍高くあり得る、標的に対する結合親和性を有する。必要な、もしくは所望される、結合親和性における増強の程度は、親抗体の最初の結合親和性に依存する。
【００４８】
一般的に、親抗体由来の高親和性抗体を作製するための方法は、以下の工程を包含する。
【００４９】
１．目的の標的に結合する、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む親抗体を得るかまたか選択する工程。これは、伝統的なハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、または標的特異的抗体を生成する任意の他の方法によって行われ得る。
【００５０】
２．配列が親フレームワーク配列（好ましくはヒトテンプレート配列）に近いフレームワーク配列を選択する工程。このテンプレートは、例えば、その比較される全体の長さ、ＣＤＲのサイズ、フレームワークとＣＤＲとの間の接合部に位置するアミノ酸残基、全体的な相同性などに基づいて選択され得る。選択されるテンプレートは、１より多くの配列の混合物であり得るか、またはコンセンサステンプレートであり得る。
【００５１】
３．考えられるＣＤＲ位置の各々および全てにおいてランダムアミノ酸置換を作製することによってクローンのライブラリーを生成する工程。これは、例えば、ＣＤＲに隣接するか、または全ての考えられるアミノ酸と結合するか、それをフォールディングすることに影響を及ぼすヒトフレームワークテンプレート中のアミノ酸をランダムに置換し得、フレームワーク置換のライブラリーを生成する。これらのフレームワーク置換は、標的結合および抗体フォールディングに対するそれらの潜在的効果について評価され得る。フレームワーク中のアミノ酸の置換は、ＣＤＲ中のアミノ酸の置換と同時にか、または順次にかのいずれかで行われ得る。改変体のライブラリーを生成するための１つの方法は、オリゴヌクレオチド合成による。
【００５２】
４．工程（３）において生成された重鎖および／または軽鎖改変体を含む発現ベクターを構築する工程。上記改変体は、以下の式を含み得る：ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４（Ｉ）およびＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４（ＩＩ）、ここで、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、ＦＲＬ４、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３およびＦＲＨ４は、工程３において選択されたフレームワークテンプレートの軽鎖配列および重鎖配列の改変体を表し、そしてＣＤＲは、親抗体ＣＤＲの改変体ＣＤＲを表す。このような重鎖配列および軽鎖配列を含むベクターの例は、図１に示される。
【００５３】
５．特異的標的に対するクローンのライブラリーをスクリーニングする工程。標的に結合するこれらのクローンは、改善された結合親和性についてスクリーニングされる。親分子より大きな親和性で結合するこれらのクローンが選択され得る。最適な高親和性候補は、親抗体と比較して、（好ましくは、２０倍より大きい、１００倍より大きい、１０００倍より大きい、または５０００倍より大きい）最大の結合親和性の可能性を有する。選択された改変体が、望ましくない特定のアミノ酸（例えば、導入されたグリコシル化部位または潜在的に免疫原性の部位）を含む場合、それらのアミノ酸は、より有利なアミノ酸残基で置き換えられ得、そして結合親和性が再評価され得る。
【００５４】
また、この方法を使用して、完全ヒト親抗体から、ＣＤＲ領域のみをランダムに置換することによって、ヒトフレームワーク領域をインタクトなままにして、高親和性抗体を生成し得る。
【００５５】
改善されたハイスループットスクリーニング技術および図１に記載されたようなベクターによって、当業者は、所与のＣＤＲ中および／またはフレームワーク領域中の全ての部位における置換の包括的なライブラリーを、迅速かつ効果的にスクリーニングし得る。全てのアミノ酸を全ての位置において同時に、ランダムに置換することによって、個々の置換によっては予測または同定できない（例えば、相乗作用に起因する）親和性を有意に増加させる可能性のある組合せをスクリーニングすることができる。
【００５６】
（親抗体の調製）
（標的の調製）
可溶性の標的またはそれらのフラグメントは、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。この抗体は、目的の標的に対して指向する。好ましくは、この標的は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患する哺乳動物へのこの抗体の投与は、哺乳動物に治療的利益をもたらし得る。しかし、抗体は、非ポリペプチド標的に対して指向し得る。標的がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子（例えば、レセプター）またはリガンド（例えば、成長因子）であり得る。本発明の１つの標的は、ＩｇＥである。全細胞が抗体を作製するための免疫原として使用され得る。標的は、組み換え的に使用され得るか、または合成法を用いて使用され得る。標的はまた、天然の供給源から単離され得る。
【００５７】
本発明の抗体を生成するために使用される抗原は、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメント（エピトープＡおよび／またはエピトープＢが挙げられる）を包含し得る。動物を免疫するために使用されるポリペプチドは、標準的な組み換え法、化学合成法、または精製法によって得ることができる。当該分野で周知であるように、免疫原性を増加させるため、抗原は、キャリアタンパク質に結合され得る。一般的に使用されるキャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、結合されたペプチドは、動物（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）を免疫するために使用される。このようなキャリアに加えて、周知のアジュバントが抗原とともに投与されて、強力な免疫応答の誘導を促進し得る。
【００５８】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、通常、非ヒト哺乳動物において、アジュバントと組み合わせての関連する標的の複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって生成される。免疫応答を誘起し得る多くの因子は当該分野において周知である。
【００５９】
動物は、（各々、ウサギまたはマウスについての）タンパク質または結合体をフロイント完全アジュバントと組み合わせて、そしてその溶液を皮内に注射することによって、標的、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫される。一ヵ月後、その動物は、フロイント不完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは結合体を用いて、複数部位への皮下注射によって、追加免疫される。７日〜１４日後、この動物は、採血されて、その血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。
【００６０】
選択された哺乳動物抗体は、通常、標的に対して十分に強力な結合親和性を有する。例えば、この抗体は、ヒト抗ＩｇＥ標的と、約１×１０−８Ｍの結合親和性（Ｋｄ）の値で結合し得る。抗体親和性は、飽和結合；酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ）によって決定され得る。
【００６１】
目的の標的に結合する抗体をスクリーニングするため、慣習的な交差結合アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるようなアッセイ）が行われ得る。あるいは、エピトープマッピング（例えば、Ｃｈａｍｐｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載される）が行われて、結合を決定し得る。
【００６２】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を認識する抗体である。これらの均一な特異性は、モノクローナル抗体を、種々の異なる抗原部位を認識する抗体を通常含むポリクローナル抗体よりもずっと有用にしている。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、または組み換えＤＮＡ法によって作製され得る。
【００６３】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、げっ歯類）は、本明細書において上記されるように免疫されて、免疫のために使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘起される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて、骨髄腫細胞と融合される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９０−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００６４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、そして増殖する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨害する物質）を含む（ＨＡＴ培地）。好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対する感受性のある細胞である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００６５】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準的方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的のための適切な培養培地は含む。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地から従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって適切に分離される。
【００６６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、そのモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。一旦単離された場合、このＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得る。次いでこの発現ベクターは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）に移送されて、この組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンポリペプチドに共有結合性に結合することによって、改変され得る。
【００６７】
（ヒト化抗体）
ヒト化は、キメラ抗体を作製するための技術であり、キメラ抗体においては、インタクトなヒト可変ドメインよりもずっとわずかが、対応する非ヒト種由来の配列によって置換されている。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、これは代表的に、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、非ヒトＣＤＲまたはヒト抗体中の対応する配列についてのＣＤＲ配列で置換することによって行われる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。本発明において実施される場合、ヒト化抗体は、マウス抗体における類似部位由来の残基によって置換された、いくつかのＣＤＲ残基およびいくつかのＦＲ残基を有し得る。
【００６８】
ヒト化抗体を作製するのに使用されるべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ ｆｉｔ）」法に従って、非ヒト抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリーと比較される。非ヒト親抗体の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体についてのヒトフレームワークとして受容される（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、数種の異なるヒト化抗体に対して使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【００６９】
（抗体フラグメント）
種々の技術が、抗体フラグメントの生成のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５））。しかし、これらのフラグメントは、現在、組み換え宿主細胞によって直接的に生成され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨフラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから直接的に回収され得、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従うと、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組み換え宿主細胞培養物から直接的に単離され得る。抗体フラグメントを生成するための他の技術は、当業者に明らかである。別の実施形態において、最適な抗体は、単鎖Ｆｖフラグメントである（ｓｃＦｖ）（ＰＣＴ特許出願 国際公開番号９３／１６１８５）。
【００７０】
（高親和性抗体の調製）
一旦親抗体が同定され、単離された場合、親抗体の可変領域の１つ以上において、１つ以上のアミノ酸残基が変化され得る。あるいは、または加えて、フレームワーク残基の１つ以上の置換が、親抗体中に導入され得、これらは、抗体の（例えば、ヒトＩｇＥに対する）結合親和性に改善をもたらす。改変するフレームワーク領域の残基の例としては、以下が挙げられる：直接的に標的に非共有結合性に結合するもの（Ａｍｉｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲの高次構造と相互作用するもの／ＣＤＲの高次構造に影響するもの（Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に（ＥＰ ２３９ ４００ Ｂ１）関与するもの。特定の実施形態において、このようなフレームワーク領域の残基の１つ以上の改変は、目的の標的に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。
【００７１】
抗体の生物学的特性の改変は、例えば、以下を維持することに対するそれらの影響において有意に異なる置換を選択することによって達成され得る：（ａ）置換の範囲におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート構造もしくはヘリックス構造）；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ（ｂｕｌｋ）。非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーと別の分類との交換を伴う。
【００７２】
アミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、より早期に調製された、種依存性抗体の改変体または非改変バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。改変体を生成するための好ましい方法は、オリゴヌクレオチド媒介性合成である。特定の実施形態において、抗体改変体は、例えば、約２〜約１５の超可変領域置換を置換した、単一の超可変領域残基を有するのみである。
【００７３】
改変体のライブラリーを生成するための１つの方法は、図２に示されるスキームに従うオリゴヌクレオチド媒介性合成による方法である。各々約１００ヌクレオチドの３つのオリゴヌクレオチドが、全軽鎖可変領域または全重鎖可変領域にわたって合成され得る。各オリゴヌクレオチドは、以下を含む：（１）トリプレット（ＮＮＫ）２０によって生成された６０アミノ酸伸長（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＫはＧまたはＴである）、および（２）隣のオリゴか、または各端のベクター配列とのおよそ１５〜３０ヌクレオチドの重複。ＰＣＲ反応におけるこれら３つのオリゴヌクレオチドのアニーリングのとき、ポリメラーゼは、反対側の鎖を充填し、完全二重鎖化された重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列を生成する。トリプレットの数は、任意の反復長に調整され得、そして、オリゴヌクレオチド中のそれらの位置は、所与のＣＤＲまたはフレームワーク領域におけるアミノ酸のみを置換するように選択され得る。（ＮＮＫ）を用いることによって、コードされた改変体中の各々の位置において、全２０アミノ酸が考えられる。５〜１０アミノ酸（１５〜３０ヌクレオチド）の重複配列は、置換されないが、これはフレームワークの積み重なり（ｓｔａｃｋｉｎｇ）領域内に含まれるように選択され得るか、または合成の別のラウンドまたはその後のラウンドで置換され得る。オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。これらのオリゴヌクレオチドから抗体改変体を生成するための方法もまた、当該分野で周知である（例えば、ＰＣＲ）。
【００７４】
重鎖改変体および軽鎖改変体のライブラリーは、それらの配列のランダムな位置において異なり、任意の発現ベクター（例えば、バクテリオファージ、具体的には、図１のベクター）中で構築され得る。これらのベクターの各々は、特定の重鎖改変体および軽鎖改変体をコードするＤＮＡを含む。
【００７５】
抗体改変体の生成に続いて、親抗体に比較した改変体の生物学的活性が決定される。上記のように、これは、改変体の標的に対する結合親和性を決定する工程を包含する。多くのハイスループット法が、抗体改変体を、目的の標的と結合するそれらの能力に関して迅速にスクリーニングするために存在する。
【００７６】
次いで、この最初のスクリーニングから選択された１つ以上の抗体改変体が、親抗体に対して増強された結合親和性についてスクリーニングされ得る。結合親和性を決定するための１つの一般的な方法は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて会合速度定数および解離速度定数を評価することによる方法である。バイオセンサーチップは、製造元（ＢＩＡｃｏｒｅ）の指示に従って、標的の共有結合のために活性化される。次いで、標的は、希釈され、そしてチップ上に注入されて、固定材料の反応ユニット（ＲＵ）におけるシグナルを得る。ＲＵのシグナルは、固定材料の質量に比例するので、このシグナルは、マトリックス上の固定された標的密度の範囲を示す。解離データは、一部位モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｍｏｄｅｌ）に適合されて、ｋｏｆｆ ＋／− ｓ．ｄ．（測定の標準偏差）を得る。偽第一次速度定数（ｋｓ）は、各会合曲線について計算されて、タンパク質濃度の関数としてプロットされてｋｏｎ ＋／− ｓ．ｅ．（適合の標準誤差）を得る。結合の平衡解離定数ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＳＰＲ測定から計算される。平衡解離定数ＫＤは、ｋｏｆｆに反比例するので、親和性改善の推定は、会合速度（ｋｏｎ）が全改変体について一定であると仮定して行われ得る。
【００７７】
得られた高親和性を有する候補は、必要に応じて、１つ以上のさらなる生物学的活性アッセイに供されて、増強された結合親和性を有する抗体改変体が、さらに所望される治療特性を保有することを確認し得る。例えば、抗ＩｇＥ抗体の場合、ＩｇＥのレセプターへの結合をブロックし、ヒスタミンの放出を阻害するものについてスクリーニングし得る。最適な抗体改変体は、親抗体よりも有意に高い結合親和性で標的に結合する能力を保有する。
【００７８】
そのようにして選択された抗体改変体は、多くの場合抗体の意図された用途に依存して、さらなる改変に供され得る。このような改変は、アミノ酸配列のさらなる変化、異種ポリペプチドとの融合、および／または以下に詳述されるような共有結合性の改変を含む。例えば、抗体の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基が、一般的にセリンによって置換されて、分子の酸化的安定性を改善し得、そして異常な交差結合を防止し得る。逆に、システイン結合が抗体に付加されて、（特に、この抗体が、Ｆｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）その安定性を改善し得る。
【００７９】
（ベクター）
本発明はまた、本明細書において開示されるような抗体改変体をコードする単離された核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに上記抗体改変体の生成のための組み換え技術を提供する。抗体改変体の組み換え生成のため、それをコードする核酸が単離され、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のため、複製可能なベクターに挿入される。抗体改変体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、この抗体改変体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列決定される。
【００８０】
多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素としては、一般的に以下の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列。
【００８１】
図１に示されるファージ発現ベクターは、一般的に使用されるＭ１３ベクターと、迅速な分泌のためおよび適切な結合特異性および最低の親和性基準に関して改変体Ｆａｂをスクリーニングするため、Ｍ１３の自身の遺伝子ＩＩＩウイルス分泌シグナルとから構成される。このベクターは、全遺伝子ＩＩＩ配列を使用せず、したがって細菌細胞の表面上に表示が存在しないが、Ｆａｂはペリプラズム空間に分泌される。あるいは、Ｆａｂは、細胞質中で発現され得、そして単離され得る。重鎖および軽鎖の各々は、それら自身の分泌シグナルを有するが、単一の強力な誘導プロモーターに依存して発現される。
【００８２】
図１におけるベクターはまた、容易な精製および検出のために、Ｈｉｓタグおよびｍｙｃタグを提供する。当業者は、Ｆａｂが、別個のプロモーターから独立して発現され得るか、または分泌シグナルが選択されたウイルス配列である必要はないが、選択された宿主細胞からの抗体フラグメントの分泌に適切な原核生物もしくは真核生物のシグナル配列であり得ることを認識する、重鎖および軽鎖が異なるベクター上に位置していてもよいことが、また認識されるべきである。
【００８３】
（Ａ．シグナル配列構成要素）
本発明の抗体改変体は、組み換え的に生成され得る。この改変体はまた、異種ポリペプチド（好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチド）と融合された融合ポリペプチドとして発現され得る。好んで選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。ネイティブ抗体シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列によって置換され得る。あるいは、図１のベクターの場合、選択されたシグナル配列は、遺伝子ＩＩＩ由来のウイルスシグナル配列であった。酵母分泌については、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ α因子リーダーが挙げられる）もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、または、例えば国際公開番号９０／１３６４６において記載されるシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が利用可能である。このような前駆領域のためのＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、抗体改変体をコードするＤＮＡに連結される。
【００８４】
（Ｂ．複製起点の構成要素）
ベクターは、通常、ベクターが１種以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡと独立に複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自立的に複製する配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に対して適切であり、２μプラスミド起点は、酵母に対して適切であり、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶもしくはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のベクターに対して有用である。一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むので、代表的に唯一使用され得る）。
【００８５】
（Ｃ．選択遺伝子構成要素）
ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも称される）を含み得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養素要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属にとってのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【００８６】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を利用する。異種遺伝子によって首尾よく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、したがって選択レジメンを生き延びる。このような優性選択の例は、薬物（ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシン）を使用する。
【００８７】
哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの別の例は、抗体核酸（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものである。
【００８８】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、全ての形質転換体をメトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養培地中で培養することによって、最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが利用される場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【００８９】
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列によって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、上記選択マーカーに対する選択因子（例えば、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８（米国特許第４，９６５，１９９号）））を含む培地中での細胞増殖によって選択され得る。
【００９０】
酵母中での使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹｒｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の改変体系統（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６もしくはＰＥＰ４−１）に対する選択マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損性酵母系統（ＡＴＣＣ ２０，６２２もしくは３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補完される。
【００９１】
（Ｄ．プロモーター構成要素）
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、かつ抗体核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主とともに使用するために適切なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結された、シャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【００９２】
プロモーター配列は、真核生物に関して知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始部から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域である（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
【００９３】
酵母宿主とともに使用するための適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ）に対するプロモーターが挙げられる。
【００９４】
他の酵母プロモーター（増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導プロモーター）は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース利用およびガラクトース利用を担う酵素に対するプロモーター領域である。酵母発現において使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【００９５】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、トリポックスウイルス、アデノウイルス２のようなアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）、熱ショックプロモーターによって制御される（ただし、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする）。
【００９６】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして、都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの極初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変形態は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。あるいは、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡは、マウス細胞において、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下で発現された。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）が、プロモーターとして使用され得る。
【００９７】
（Ｅ．エンハンサーエレメント構成要素）
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から知られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）。しかし代表的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関する、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して５’位置または３’位置において、ベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターの５’部位に位置する。
【００９８】
（Ｆ．転写終止構成要素）
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、もしくは他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終止のためおよびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含み得る。このような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの、５’非翻訳領域から、そしてときには３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写される、ヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終止構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。例えば、国際公開番号９４／１１０２６を参照のこと。
【００９９】
（宿主細胞の選択および形質転換）
本明細書中に記載のベクターにＤＮＡをクローニングまたは発現させるのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物としては、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、エルウィニア属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、サルモネラ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属およびＳｈｉｇｅｌｌａ属などの腸内細菌、ならびにバチルス属、シュードモナス属およびストレプトミセス属）の両方が挙げられる。一つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）のような他の菌株も適している。これらの例は、限定的ではなく、むしろ例示的である。
【０１００】
原核生物に加えて真核生物微生物（例えば、糸状菌または酵母）は、抗体をコードするベクターのための適したクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、下等真核宿主微生物の内で最も一般的に使用される。しかし、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａおよび糸状菌（例えば、アカパンカビ属、ペニシリウム属、イトクズグサ属およびコウジカビ属（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ）の宿主などの他の多数の属、種および菌株が、本明細書中で一般的に利用可能であり、そして有用である。
【０１０１】
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。第一に、脊椎動物培養または無脊椎動物培養に由来しようと、任意の高等真核細胞培養が機能し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６、４７〜５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｅｔｌｏｗら編、第８巻、ｐ．２７７−２７９（Ｐｌｅｎａｍ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９８６）；Ｍｓｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ 第３１５巻、５９２〜５９４（１９８５））。多数のバキュロウイルス株および改変体ならびに宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、ヤブカ属（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１改変体、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）が、公けに利用可能であり、このようなウイルスが、本発明による本明細書中のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに使用され得る。さらに、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用される。
【０１０２】
脊椎動物細胞および培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、慣例的になっている。Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）を参照のこと。有用な哺乳動物宿主細胞系統の例は、サル腎臓系統、ヒト胚腎臓系統、生まれたばかりのハムスターの腎臓細胞；チャイニーズハムスターの卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０）；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝細胞；マウス乳腺癌；およびＮＳ０細胞である。
【０１０３】
宿主細胞は、抗体産生のために上記ベクターで形質転換され、プロモーターを含むため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切なものとして改変された通常の栄養培地で培養される。
【０１０４】
本発明の抗体改変体を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号；同第４，５６０，６５５号；同第５，１２２，４６９号；同第５，７１２，１６３号または同第６，０４８，７２８号に記載される任意の培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれもが、必要な場合、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または表皮増殖因子）、塩（例えば、Ｘ塩化物、ここで、Ｘは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウムである；およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ．ＴＭ．薬物）、痕跡元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な補充物はまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞にこれまで用いられてきたものであり、当業者に明らかである。
【０１０５】
（抗体精製）
組換え技術を使用する場合、抗体改変体は、細胞内で産生され得るか、ペリプラズム空間で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体改変体が、細胞内で産生される場合、第一の工程として、粒状の破片である、宿主細胞の断片または溶解した断片のいずれかは、例えば、遠心分離または限外濾過により取り除かれ得る。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記述する。手短かには、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって溶解する。細胞の破片は、遠心分離によって取り除かれ得る。抗体改変体が、培地中に分泌される場合、そのような発現系由来の上清は、一般的には最初に市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、前の工程のいずれかに例えば、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターが含まれてもよく、外来性の夾雑物の増殖を防止するために抗生物質が含まれてもよい。
【０１０６】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体改変体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖またはヒトＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７〜１５７５（１９８６））。親和性リガンドが取り付けられるマトリクスは、多くの場合アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス（例えば、調節された多孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は、アガロースを用いて達成され得るより早い流速および短いプロセス時間を可能にする。抗体改変体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂もしくはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上のヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィーによるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための技術がまた回収されるべき抗体改変体によって利用可能である。
【０１０７】
任意の予備精製工程の後、目的の抗体改変体および夾雑物を含む混合物は、約２．５〜４．５の間のｐＨで、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で、溶出緩衝液を使用して、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【０１０８】
（薬学的処方物）
ポリペプチドまたは抗体の治療処方物は、凍結乾燥処方物または水溶液として保存するために、所望の程度の精製度を有するポリペプチドを、当該分野で代表的に利用される任意の「薬学的に受容可能な」キャリア、賦形剤または安定化剤（これらは全て「賦形剤」と称される）と混合することにより調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および他の種々の添加剤である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．Ｏｓｏｌ編（１９８０）を参照のこと）。このような添加剤は、用いられる投薬量および濃度では、レシピエントに対して無毒性でなければならない。
【０１０９】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲にｐＨを維持するのを補助する。それらは、好ましくは約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明に使用するための適した緩衝剤としては、有機酸とその塩および無機酸とその塩の両方が挙げられ、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウムの混合物、クエン酸三ナトリウムの混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウムの混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウムの混合物、コハク酸−水酸化ナトリウムの混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウムの混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウムの混合物、酒石酸−酒石酸カリウムの混合物、酒石酸−水酸化ナトリウムの混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウムの混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウムの混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウムの混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウムの混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩（例えば、Ｔｒｉｓ）が言及され得る。
【０１１０】
保存剤は、微生物の増殖を妨げるために添加され得、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加され得る。本発明に使用するための適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
【０１１１】
「安定化剤」として公知であることもある等張化剤は、本発明の液体組成物の等張性を確実にするために添加され得、多価糖アルコール、好ましくは三価アルコールまたはそれより多価の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール）が挙げられる。
【０１１２】
安定化剤は、治療剤を溶解させるか、または変性もしくは容器の壁への付着を防止するのを補助する充填剤から添加剤の機能の範囲であり得る広い範疇の賦形剤をいう。代表的な安定化剤は、多価糖アルコール（上記で列挙した）；アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖または糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクティトール、グリセロールなど、イノシトールなどのシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）および三糖（例えば、ラフィノース）；多糖（例えば、デキストラン）であり得る。安定化剤は、活性タンパク質の重量部あたり０．１〜１０，０００の重量の範囲で存在し得る。
【０１１３】
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても公知である）は、治療剤の可溶化を補助するため、および治療タンパク質を攪拌に誘導される凝集に対して保護するために添加され得、また処方物が、タンパク質の変性を引き起こすことなく、圧力を加えた剪断表面に露出されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０１１４】
さらなる種々の賦形剤としては、充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が挙げられる。本明細書中の処方物はまた、必要な場合、処置される特定の適応症に必要な一種より多い活性化合物、好ましくは互いに不利に影響しない相補的活性を有する化合物を含有し得る。例えば、さらに免疫抑制剤を提供することが望ましくあり得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量で、組合せて適切に存在する。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、または例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルそれぞれのコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン）中での界面のポリマー化により調製されたマイクロカプセルに閉じ込められ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．Ｏｓａｌ編（１９８０）に開示される。
【０１１５】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌性でなければならない。このことは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例としては、抗体改変体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形した物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解酢酸ビニルエチレン、分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸のコポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能マイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。例えば、酢酸ビニルエチレンと乳酸−グリコール酸ポリマーは、１００日間に亘って分子の放出を可能にし、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。封じ込められた抗体が、体内に長い期間保持される場合、それらは、３７℃にて湿気に曝露された結果として変性し得るか、または凝集し得、生物学的活性の喪失および免疫原性における可能な変化を生じる。合理的な方法は、関係する機構に依存して安定化のために、工夫され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介した細胞間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変することによって、酸性溶液から凍結乾燥することによって、含水量を制御することによって、適切な添加剤を使用することによって、そして、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１１６】
特定の障害または状態の処置に有効である治療ポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの量は、障害もしくは状態の性質に依存し、そして、標準的な臨床技術により決定され得る。可能な場合、用量−応答曲線を決定し、ヒトで試験する前に、最初にインビトロで、次いで有用な動物モデル系で本発明の薬学的組成物を決定することが望ましい。
【０１１７】
好ましい実施形態において、治療ポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの水溶液は、皮下注射によって投与される。各用量は、体重１ｋｇあたり約０．５μｇ〜約５０μｇの範囲であり得るか、またはより好ましくは、体重１ｋｇあたり約３μｇ〜約３０μｇの範囲であり得る。
【０１１８】
皮下投与のための投薬計画は、多数の臨床的因子（疾患の型、疾患の重篤度、および治療剤に対する患者の感受性）に依存して一ヶ月に一回から一日一回に変動し得る。
【０１１９】
（抗体改変体の使用）
本発明の抗体改変体は、親和性精製因子として使用され得る。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野で周知の方法を使用して、固相（例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ樹脂、またはろ紙）上に固定される。固定された抗体改変体は、精製されるべき標的を含むサンプルと接触され、その後、その支持体は、精製されるべき標的を除いてサンプル中の実質的に全ての物質を取り除く適した溶媒で洗浄される。その支持体は、固定された抗体改変体結合される。最後に、その支持体は、標的を抗体改変体から放出する別の適切な溶媒（例えば、グリシン緩衝液）で洗浄される。
【０１２０】
改変抗体はまた、診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織または血清における目的の標的の発現の検出）に有用であり得る。診断適用について、抗体改変体は、代表的に検出可能部分で標識される。多数の標識が、蛍光の変化を定量するために利用可能な技術であり、上に記した。化学発光基質は、化学反応により電気的に励起され、次いで、放射光は、（例えば、化学発光計を使用して）測定され得るか、または蛍光受容体にエネルギーを供与し得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合するための技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７３：１４７〜１６６（１９８１）中のＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙに記載されている。
【０１２１】
標識は、抗体改変体と間接的に結合されることもある。当業者は、このことを達成するための種々の技術を知っている。例えば、抗体改変体は、ビオチンと結合され得、上記の３種の広範な範疇の標識のいずれかが、アビジンと結合され得、逆もまた同様である。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、従って標識は、この間接的な様式で抗体改変体と結合され得る。あるいは、標識の抗体改変体との間接的な結合を達成するために、抗体改変体は、小型のハプテン（例えば、ジグロキシン（ｄｉｇｌｏｘｉｎ））と結合され、上記の異なる型の標識の一つが、抗ハプテン抗体改変体（例えば、抗ジグロキシン抗体）と結合される。従って、標識の抗体改変体との間接的な結合は、達成され得る。
【０１２２】
本発明の別の実施形態において、抗体改変体は、標識される必要はなく、その存在は、抗体改変体に結合する標識された抗体を使用して検出され得る。
【０１２３】
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイ）で使用され得る。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．１４７〜１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９８７）。
【０１２４】
競合結合アッセイは、標識された標準が、限られた量の抗体改変体との結合について試験サンプルと競合する能力に依存する。試験サンプル中の標的の量は、抗体に結する標準の量に反比例する。結合する標準の量の決定を容易にするために、抗体は、一般的に、競合の前か後に、不溶化される。結果として、抗体に結合する標準サンプルおよび試験サンプルは、結合しないままである標準サンプルおよび試験サンプルから好都合に分離され得る。
【０１２５】
サンドイッチアッセイは、二つの抗体の使用を伴い、それぞれは、検出されるべき、異なる免疫原性部分またはエピトープまたはタンパク質に結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、分析されるべき試験サンプルは、固体支持体上に固定された一次抗体によって結合され、その後、二次抗体は、試験サンプルに結合し、それによって不溶性の３つの部分の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。二次抗体はそれ自体、検出可能な部分で標識され得る（直接サンドイッチアッセイ）か、または検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、一つの型のサンドイッチアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１２６】
免疫組織化学に関して、腫瘍サンプルは、新鮮であっても凍結されていてもよく、パラフィンに包埋されていても保存剤（例えばホルマリン）で固定されていてもよい。
【０１２７】
その抗体はまたインビボ診断アッセイに使用され得る。一般的に、抗体改変体は、放射性ヌクレオチド（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識されて、その結果腫瘍は、免疫シンチグラフィを使用して局在化され得る。例えば、本発明の高親和性抗ＩｇＥ抗体は、例えば、喘息患者の肺に存在するＩｇＥの量を検出するために使用され得る。
【０１２８】
本発明の抗体は、キット、すなわち、診断アッセイを行なうための指示書を備える、所定量の試薬のパッケージングした組合せで提供され得る。抗体改変体が、酵素で標識される場合、そのキットは、酵素に必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を備え得る。さらに、他の添加剤（例えば、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）など）が含まれ得る。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために、大きく変動し得る。特に、試薬は、溶解の際に、適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、乾燥粉末、通常は、凍結乾燥した粉末として提供され得る。
【０１２９】
（抗体のインビボ使用）
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために使用され得ることが企図される。一実施形態において、この抗体は、例えば、前臨床データを得る目的で、非ヒト哺乳動物に投与される。処置されるべき例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および前臨床研究が行われる他の哺乳動物が挙げられる。このような哺乳動物は、この抗体を用いて処置されるべき疾患に対する確立された動物モデルであり得るか、または、目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、用量増大研究が、哺乳動物に対して行なわれ得る。この抗体またはポリペプチドは、任意の適切な手段で投与され、その手段としては、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、鼻腔内投与が挙げられ、局所的な免疫抑制処置について所望の場合、病巣内投与が挙げられる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。さらに、抗体改変体は、パルス注入、特に低下用量の抗体改変体を用いたパルス注入により適切に投与される。好ましくは、この用量は、注射によって与えられ、最も好ましくは、投与が、短期であるか、長期であるかに一部依存して、静脈内注射または皮下注射によって与えられる。
【０１３０】
疾患の予防または処置のために、適切な投薬量の抗体またはポリペプチドは、処置されるべき疾患の型、疾患の重篤度および過程、抗体改変体が、予防目的または治療目的で投与されたか否か、これまでの治療、患者の臨床履歴および抗体改変体に対する応答、および主治医の裁量に依存する。本発明の非常に高い親和性の抗ヒトＩｇＥ抗体は、患者に、一時に、または一連の処置にわたって適切に投与され得る。疾患の型および重篤度に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための初期候補投薬量であり、この量は例えば、一回以上の別個の投与であっても、連続注入であってもよい。代表的な毎日の投薬量は、上記の因子に依存して、約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日以上に亘る繰り返しの投与については、その条件に依存して、その処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持される。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。抗ＬＦＡ−１抗体または抗ＩＣＡＭ−１抗体についての例示的な用量レジメンは、国際公開番号９４／０４１８８に開示される。抗体改変体組成物は、良好な医療行為と一致した様式で処方され、投薬され、投与される。この文脈において、考慮のための因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医師に公知の他の因子が挙げられる。投与されるべき抗体改変体の「治療有効量」は、このような考慮すべき事項によって決定され、疾患または障害を予防するか、改善するか、または処置するために必要である最少量である。この抗体改変体は、必ずしもではないが、必要に応じて、問題の障害を予防または処置するために現在使用されている一種以上の薬剤と一緒に処方される。このような他の薬剤の有効量は、処方物中に存在する抗体の量、障害または処置の型、および上で考察した他の因子に依存する。これらは、一般的に同じ投薬量で、上で使用した投与経路で、またはこれまでに用いた投薬量の約１〜９９％で使用される。
【０１３１】
ＩｇＥをその標的として認識する本発明の抗体は、「ＩｇＥ媒介性障害」を処置するために、使用され得る。これらとしては、例えば、ぜん息、アレルギー性鼻炎およびアレルギー性結膜炎（枯草熱）、湿疹、じんま疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーのような疾患が挙げられる。例えば、蜂に刺されること、蛇にかまれること、食物または薬物によって引き起こされるアナフィラキシーショックの深刻な生理学的状態もまた本発明の範囲に包含される。
【０１３２】
（抗体エピトープマッピング）
用語「エピトープ」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が抗原に対して応答する部位をいう。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次元のフォールディングによって並列する連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、代表的に、変性溶媒に曝露されて保持されるのに対して、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、代表的に変性溶媒を用いた処理に対して失われる。エピトープは、代表的に、少なくとも３個、より通常は、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を、固有の空間コンフォメーションに含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫学的検定において同定され得る。
【０１３３】
本発明の高親和性抗体ＩｇＥに対する結合部位のエピトープマッピングは、結合についてのウエスタンブロット分析、ＩｇＥのＣＨ３ドメインのペプチドスキャン、結合を示した領域のアラニン走査、ＩｇＧ１の対応する領域からのアミノ酸置換および特定部位の変異誘発を含む。
【０１３４】
ＩｇＥの全ＣＨ３ドメインのペプチドスキャンは、７３個の重複するペプチドを必要とした。各ペプチドを、本発明の標識した抗ＩｇＥ抗体による結合に供し、ＩｇＥの、その高親和性レセプターへの結合をブロックするＩｇＥの特異的なエピトープを決定した。ペプチドスキャンは、二つのペプチドを、ＩｇＥ上の潜在的な抗ＩｇＥ ＭＡｂ接触部位と同定し、エピトープ「Ａ」およびエピトープ「Ｂ」と名付けた（図１１を参照のこと）。エピトープ「Ａ」配列およびエピトープ「Ｂ」配列は、直鎖状配列で約８０アミノ酸離れているが、ＩｇＥの三次元構造では互いに近くに位置している。両方とも表面に露出されていて、それらは、ＩｇＥのＦｃεＲＩ結合部位に重複し、両方ともペプチドであり、Ａｒｇの正に荷電した残基およびＰｒｏの疎水性残基が存在する。図１２は、ペプチドスキャンを使用してＥＬＩＳＡにより決定したエピトープＢの結合領域を図示する。
【０１３５】
どのアミノ酸残基が、これらのエピトープ内での高親和性抗体の結合に重要であるかの決定を、アラニンスキャニング変異誘発によって行なった（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、「Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈＧＨ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ａｌａｎｉｎｅ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、ｐ．１０８１〜１０８５）。エピトープＡおよびエピトープＢの各残基の代わりに、アラニンを用い、高親和性モノクローナル抗体の結合を決定した（実施例１２の下ならびに図１３および図１４を参照のこと）。
【０１３６】
（能動免疫および受動免疫）
本発明はまた、薬学的組成物（例えば、配列番号７２および／または配列番号７４を含む本発明のペプチド免疫源分子、ならびに希釈剤、賦形剤、アジュバントまたはキャリアを含有するワクチン）に関する。本発明は、さらに、本発明の少なくとも一つのペプチドを、そのペプチドに対する免疫応答を誘発し得る部分と共有結合させる工程を包含する、本発明の免疫源の調製のためのプロセスに関する。
【０１３７】
本発明はまた、例えば、ＩｇＥ媒介性疾患またはＩｇＥ媒介性状態（例えば、アレルギーおよびアトピー性皮膚炎）の処置における医薬として使用するための上に定義された免疫原性ペプチドに関する。
【０１３８】
本発明はさらに、上に定義する免疫原性ペプチドの治療有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、ＩｇＥ媒介性疾患またはＩｇＥ媒介性状態（例えば、アレルギーおよびアトピー性皮膚炎）に対して哺乳動物を免疫状態にする方法に関する。
【０１３９】
本発明の免疫原性ペプチドは、非細胞溶解性のヒスタミン放出を実質的に媒介し得ないが、エピトープＡおよび／またはエピトープＢの標的アミノ酸配列との血清学的な強い交差反応性を抗体に誘発し得る。
【０１４０】
ペプチドの初期用量（例えば、約０．２ｍｇ〜約５ｍｇ）が、例えば、筋肉内に投与され得、その後１４日後〜２８日後に、同じ用量で繰り返し投与される（追加抗原）。用量は、当然のことながらある程度は、患者の年齢、体重、全体的な健康に依存する。免疫処置は、「能動的」または「受動的」であり得る。「能動」免疫において、被験体は、本発明の免疫原性ペプチドを受容し、抗ＩｇＥ応答が、被験体の免疫系によって能動的に誘導される。
【０１４１】
「能動」免疫、これは、ヒト使用について好ましいが、他の哺乳動物種（例えば、イヌ）も同様に処置され得る。用語「免疫原性キャリア」は、本明細書中では、宿主動物内で免疫原性応答を独立に誘発する特性を有し、ポリペプチドおよび免疫原性キャリア物質の対応する基の中の遊離のカルボキシル基、アミノ基またはヒドロキシル基の間のペプチド結合またはエステル結合の形成を介して、または、従来の二官能性連結基を介した結合、または融合タンパク質として直接ポリペプチドに共有結合し得る物質を包含する。
【０１４２】
このような免疫原性キャリアの例としては、以下：アルブミン（例えば、ＢＳＡ）；グロブリン；サイログロブリン；ヘモグロブリン；ヘモシアニン（特に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））；回虫属から抽出したタンパク質（例えば、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１巻、（１９７３）２６０〜２６８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２２巻、（１９７９）３０２〜３０８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、９８巻、（１９６７）８９３〜９００、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９巻、（１９６０）５７５〜５７８に記載される回虫属抽出物またはその精製産物）；ポリリシン；ポリグルタミン酸；リシン−グルタミン酸コポリマー；リシンまたはオルニチンなどを含むコポリマーなどが挙げられる。ワクチンは、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドを免疫原性キャリア物質として使用して産生され（Ｌｅｐｏｗ Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第１５０巻、（１９８４）４０２〜４０６；Ｃｏｅｎ Ｂｅｕｖｅｒｙ，Ｅ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第４０巻、（１９８３）３９〜４５）、これらのトキソイド物質はまた、本発明に使用され得る。ツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）は、（１）それ自体ではＴ細胞応答を誘導せず（すなわち、それは、事実上「Ｔ細胞ハプテン」である）、なお十分にプロセスされた抗原として挙動し、従ってＴ細胞により認識される；（２）連結した認識様式では、最も強力なハプテン「キャリア」の一つであることが公知である；そして（３）さらなる試験を行なわずに、ヒトにおいて使用され得るので、「能動」免疫スキームにおける利用に特に好ましい。
【０１４３】
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクターおよびこのベクターを有する細胞に関する。さらに、能動免疫は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することにより達成され得る。このような治療に適したベクターは、当該分野で公知であり、例えば、アデノウイルスベクターが挙げられる。
【０１４４】
「受動」免疫は、本発明の抗ＩｇＥ抗体を、ＩｇＥ媒介性疾患またはＩｇＥ媒介性状態を罹患する患者に投与することによって達成される。これらの抗体は、本発明の免疫原性ペプチドを非ヒト哺乳動物に投与し、生じた抗血清を収集することにより調製され得る。改善された力価は、長期間にわたる繰り返しの注射によって獲得され得る。抗体を誘発するために使用され得る哺乳動物の種に特に制限はなく、一般的には、ウサギまたはモルモットを使用することが好ましいが、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツジなども使用され得る。抗体は、最後の投与の後、１〜２週間の経過後、免疫状態にした動物から血液を収集し、血液を遠心分離し、血清を血液から単離することにより回収される。モノクローナル抗体は、例えば、ヒトまたはマウスのものであり得る。
【０１４５】
被験体を免疫状態にする場合、本発明の抗体は、哺乳動物に、例えば、筋肉内注射により導入され得る。しかし、抗体投与の任意の形態が使用され得る。被験体に許容され、有害な副作用を有さない任意の従来の液体または固体のビヒクルが、使用され得る。生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ約６．８〜７．２、好ましくはｐＨ約７．０）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、それのみでビヒクルとして、または例えば、水酸化アルミニウムベースのアジュバントなどの適切なアジュバントと一緒にビヒクルとして使用され得る。
【０１４６】
以下の実施例は、限定の目的で提供されるのではなく、例示の目的で提供される。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１）
（抗ＩｇＥマウスＭＡｂ ＴＥＳ−Ｃ２１のヒト化）
マウスｍＡｂ ＴＥＳ−Ｃ２１の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を、公開されたデータベースで利用可能なヒト抗体生殖細胞系配列と比較した。上記工程１に記載されるテンプレートを決定する場合、いくつかの基準を用い、これらの基準としては、全長、フレームワーク内の類似したＣＤＲ位置、全体の相同性、ＣＤＲの大きさなどが挙げられる。これらの基準は全てひとまとめにして、ＴＥＳ−Ｃ２１ＭＡｂ重鎖配列とＴＥＳ−Ｃ２１ＭＡｂ軽鎖配列との間の配列アラインメント、ならびに図３Ａおよび図３Ｂに示されるそれぞれのヒトテンプレート配列に示される最適なヒトテンプレートを選択するための結果を提供する。
【０１４８】
この場合、この抗体を設計するために、一種より多いヒトフレームワークテンプレートを使用した。ＶＨ鎖に対して選択されたヒトテンプレートは、ＤＰ８８（アミノ酸残基１〜９５）とＪＨ４ｂ（アミノ酸残基１０３〜１１３）との組合せであった（図３Ｂを参照のこと）。ＶＬ鎖に対して選択されたヒトテンプレートは、ＪＫ４（アミノ酸残基９８〜１０７）と合わせたＬ１６（ＶＫサブグループＩＩＩ、アミノ酸残基１〜８７）の組合せであった（図３Ａを参照のこと）。マウス配列とヒトテンプレートとの間のフレームワーク相同性は、ＶＨに関して約７０％、ＶＬに関して約７４％であった。
【０１４９】
一旦テンプレートを選択すると、ＤＮＡ合成、および上に記載され、そして図２に示されるオーバーラッピングＰＣＲによりＦａｂライブラリーを構築した。このライブラリーは、それぞれ選択されたヒトテンプレートであるＤＰ８８／ＪＨ４ｂおよびＬ１６／ＪＫ４を用いて合成した合成ＴＥＳ−Ｃ２１ ＣＤＲからなった。このライブラリーの複雑さは、４０９６（＝２１２）であった。部分的なＶＨ配列およびＶＬ配列をコードする重複するヌクレオチドを、１８〜２１のヌクレオチドの重複を有する約６３〜約７６のヌクレオチドの範囲で合成した。
【０１５０】
ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅を、フレームワーク領域ＦＲ１に対する特異的配列を含むビオチン化フォワードプライマーおよびリーダー配列（遺伝子ＩＩＩ）の末端にアニーリングした突出配列および保存された定常領域（ＣＫまたはＣＨ１）由来のリバースプライマーを使用して、標準ＰＣＲ条件下で行なった。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動、または市販のＰＣＲ精製キットにより精製し、取り込まれなかったビオチン化プライマーおよび非特異的ＰＣＲ産物を取り除いた。
【０１５１】
ＰＣＲ産物の５’リン酸化を、２μｇのＰＣＲ産物、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μＬ）、２μＬの１０×ＰＮＫ緩衝液、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰを用いて、ｄｄＨ２Ｏで、総体積２０μＬに調節して行なった。３７℃にて４５分間インキュベートした後、６５℃にて１０分間加熱変性し、次の工程のために、ｄｄＨ２Ｏを添加して反応体積を２００μＬに調節した。
【０１５２】
１００μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズを、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２度洗浄し、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液に再懸濁した。リン酸化ＰＣＲ産物を、ビーズと混合し、室温（ＲＴ）で穏やかに振盪しながら１６分間インキュベートした。
【０１５３】
このビーズを、沈降させ、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２度洗浄した。非ビオチン化ｓｓＤＮＡ（マイナス鎖）を、３００μＬの新鮮に調製した０．１５ＭのＮａＯＨで、室温で穏やかに振盪しながら１０分間溶出した。第二のＮａＯＨ溶出は、収率をわずかに増加させ得る（任意）。溶離液を遠心分離して、微量のビーズを完全に取り除いた。
【０１５４】
ｓｓＤＮＡを、１μＬグリコゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）、１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）および２．５体積のＥｔＯＨを添加することにより、上清から沈殿させた。次いで、沈殿したｓｓＤＮＡを、７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、その後、３分間凍結乾燥し、２０μＬのｄｄＨ２Ｏに溶解した。ｓｓＤＮＡを、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）アガロースプレート上に、ＤＮＡ標準と一緒にスポッティングすることにより定量するか、またはＯＤ２６０を測定することにより定量した。
【０１５５】
（実施例２）
（ＶＨおよびＶＬのファージ発現ベクターへのクローニング）
ＶＨおよびＶＬをハイブリダイゼーション変異誘発により、ファージ発現ベクターにクローニングした。ウリジン化テンプレートを、ＣＪ２３６ Ｅ．ｃｏｌｉ株（ｄｕｔ「ｕｎｇ」）を、Ｍ１３ベースのファージで感染させることにより調製した（ファージ発現ベクターＴＮ００３）。
【０１５６】
以下の成分（２００ｎｇのウリジン化ファージベクター（８．４９ｋｂ）；９２ｎｇのリン酸化一本鎖Ｈ鎖（４８９塩基）；１００ｎｇのリン酸化一本鎖Ｌ鎖（５２５塩基）；１μＬの１０×アニーリング緩衝液；ｄｄＨ２Ｏで体積を１０μｌに調整）を、８５℃の温度で５分間ＰＣＲ保持（変性）し、次いで、１時間かけて５５℃に低下させることによって（ベクターに対して約８倍のモル比の挿入物において）アニーリングさせた。そのサンプルを氷上で冷却した。
【０１５７】
アニーリングさせた産物に、以下の成分：１．４μＬの１０×合成緩衝液；０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１ユニット／μＬ）；１μＬ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット／μＬ）を添加し、その後、氷上で５分間インキュベートし、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いで、その産物をエタノール沈殿し、１０μＬのｄｄＨ２ＯまたはＴＥに溶解させた。ＤＮＡを、１μＬ のＸｂａＩ（１０ユニット／μＬ）で２時間消化し、６５℃で２０分間加熱不活性化した。消化したＤＮＡを、エレクトロポレーションにより５０μＬのエレクトロコンピーテントＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクトした。生じたファージを、３７℃で一晩、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細菌ローン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌａｗｎ）上で増殖させることにより、力価を測った。クローンを、組成を確認するために、配列決定した。
【０１５８】
（実施例３）
（ライブラリースクリーニングのためのディープウェルでの培養）
（Ａ．ファージライブラリーのプレーティング）
ファージライブラリーを、ＬＢ培地に希釈し、プレートあたりの所望のプラーク数を達成した。高力価のファージを、２００μＬのＸＬ−１Ｂ細胞培養物と混合した。３ｍＬのＬＢの表面の寒天を混合し、ＬＢプレートに注ぎ、室温で１０分間そのままにしておいた。そのプレートを、３７℃にて、一晩インキュベートした。
【０１５９】
（Ｂ．ファージ溶出）
１００μＬのファージ溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を滅菌Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一晩後のライブラリープレート由来の単一のファージプラークを、フィルター処理したピペットチップを用いてウェルに移した。ファージ溶出プレートを、３７℃にて１時間インキュベートした。このプレートをインキュベーションに続いて４℃にて保存し得る。
【０１６０】
（Ｃ．ディープウェルプレートでの培養）
５０ｍＬの培養物由来のＸＬ１Ｂ細胞を、２×ＹＴ培地に、１：１００希釈で添加した。その細胞を、Ａ６００が０．９〜１．２の間になるまで、シェーカー内で３７℃にて増殖させた。
【０１６１】
（Ｃ．ディープウェルプレート内でのファージによる感染）
細胞が適切なＯＤに到達したときに、１Ｍ ＩＰＴＧ（１：２０００）をＸＬ １Ｂ培養物に添加した。ＩＰＴＧの最終濃度は、０．５ｍＭであった。７５０μＬの細胞培養物を９６ウェルのディープウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに移した。各ウェルに、２５μＬの溶出ファージを接種した。このディープウェルプレートをシェーカー（２５０ｒｐｍ）内に配置し、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１６２】
（Ｄ．ＥＬＩＳＡスクリーニングのための上清の調製）
インキュベーション後、このディープウェルプレートを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ−５．３プレートローターを使用して、３，２５０ｒｐｍにて２０分間遠心した。ＥＬＩＳＡのために、各ウェルから５０μＬの上清を抜き取った。
【０１６３】
（Ｅ．ＸＬ−１細胞の１５ｍＬの液体培養物の接種）
ＸＬ−１を、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２×ＹＴ中で、シェーカー内で（２５０ｒｐｍ）、３７℃にて、Ａ６００が０．９〜１．２になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの最終濃度で添加し、１５ｍＬの培養物を５０ｍＬの円錐管に、各クローンが特徴付けられるように移した。細胞に、高力価ストック（力価＝約１０１１ｐｆｕ／ｍＬ）由来の１０μＬのファージを接種し、３７℃にて１時間インキュベートした。この細胞を、室温で振盪しながら一晩増殖させた。
【０１６４】
（Ｆ．ペリプラズム由来の可溶性Ｆａｂの単離）
この細胞を、４，５００ｒｐｍでの２０分間のＩＥＣ遠心分離にて、ペレット化した。培養培地を取り除き、ペレットを、６５０μＬの再懸濁緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡおよび５００ｍＭのスクロースを含有する、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ボルテックスし、その後穏やかに振盪しながら１時間氷上に配置した。細胞の破片を、４℃で、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより取り除いた。可溶性Ｆａｂを含む上清を、収集し、そして４℃にて保存した。
【０１６５】
（実施例４）
（フレームワーク改変）
フレームワーク内の上記の潜在的に重要な位置に、１２個のマウス／ヒトのゆらぎ残基が存在する。ＶＨの７３位は、ヒト化ライブラリーでは、マウス残基スレオニンとして維持されていた。なぜならこの位置は、結合に影響を及ぼすと確定されたからである。しかし、ＶＨ７３のスレオニンが、ヒト生殖細胞系ＶＨサブグループ１および２の共通のヒト残基であることが示された。
【０１６６】
ＴＥＳ−Ｃ２１配列とヒトテンプレートとの間で異なるフレームワーク残基を、上記のように無作為に置換し、次いで、標的結合および抗体フォールディングに対するその潜在的な影響について評価した。結合に影響し得る潜在的なフレームワーク残基を同定した。この場合、それらは、ＶＨの残基１２、２７、４３、４８、６７、６９であり、ＶＬの残基１、３、４、４９、６０、８５であった（Ｋａｂａｔ記数法）（図４を参照のこと）。２７位および６９位のみが、ＶＨ領域（クローン番号１１３６−２Ｃ）の結合に顕著に影響することが、後に実証された。
【０１６７】
使用した一次スクリーニングは、培養培地を用いる一点ＥＬＩＳＡ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｏｉｎｔ ＥＬＩＳＡ）（ＳＰＥ）であった（以下の記載を参照のこと）。一次スクリーニングは、抗体の標的分子に結合するクローンを選択した。親分子と等しいか、またはそれより良好なシグナルを与えるクローンを、次のラウンドのスクリーニングのために選択した。
【０１６８】
第２のラウンドのスクリーニングにおいて、個々のファージを、１５ｍｌの細菌培養で増殖させ、ペリプラズム調製物を、ＳＰＥ滴定アッセイおよびＥＬＩＳＡ滴定アッセイのために使用した。このアッセイにおいて、より高い結合を保持しているクローンをさらに特徴付けした。一旦全ての選択された一次クローンを、加工すると、上から１０〜１５％のクローンを配列決定し、そのクローンを配列に従って、配置した。各配列群由来の代表を、互いに比較し、最も良いクローンを選択した。これらの選択されたクローンの配列を合わせ、種々の組合せの効果を評価した。
【０１６９】
構築したライブラリーを、組換えヒトＩｇＥ、ＳＥ４４に対する結合の改善についてＥＬＩＳＡスクリーニングに供した。マウスＴＥＳ−Ｃ２１Ｆａｂより大きい結合親和性を有するクローンを単離し、配列決定した。クローンＩＤ番号４、４９、７２、７６および１３６を、さらに特徴付けした。クローン４、４９、７２、７８および１３６に対するＥＬＩＺＡ滴定曲線を図５Ａおよび図５Ｂに示すが、これは、その親和性が、その親であるＴＥＳ−Ｃ２１に類似していることを示唆する。これらのクローンは、ヒトＩｇＥに対する結合について、マウスＴＥＳ−Ｃ２１と競合し、このことは、結合するエピトープが、ヒト化プロセスの間に変化しなかったことを示唆する。ヒト化Ｆａｂは、ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥに結合せず、このことは、ヒト化抗体が、二価ＩｇＧに構築される場合にヒスタミン放出を引き起こすようにレセプターと架橋するのではなさそうであることを示唆する。ヒト化クローン１３６は、５個のマウス重鎖フレームワーク残基（＝９４．３％のヒトＶＨフレームワークホモロジー）を保持し、親和性成熟により選択された１００％のヒト軽鎖フレームワークを有する。ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合のヒト化Ｆａｂによる阻害を実証した（図６）。
【０１７０】
（実施例５）
（抗ＩｇＥをスクリーニングするための一点ＥＬＩＳＡプロトコル）
プレートを、炭酸塩被覆緩衝液中の２μｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＦｄで、４℃で一晩被覆した。被覆溶液を取り除き、そして、そのプレートを、ウェルあたり２００μＬの３％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、３７℃にて１時間ブロックした。プレートを、ＰＢＳ／０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＦａｂサンプル（すなわち、高力価ファージおよびＤＭＢブロックから分泌されたＦａｂもしくはペリプラズム調製物、または１５ｍＬの調製物を含む上清）を添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中に０．０１５μｇ／ｍＬで希釈した５０μＬ／ウェルのビオチン化ＳＥ４４および０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）を添加した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、４×ＰＢＳＴで洗浄した。０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）中に１：２０００で希釈した５０μＬ／ウェルのストレプトアビジンＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、６×ＰＢＳＴで洗浄した。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ 基質（Ｓｉｇｍａ）を添加して展開し、次いで、５０μＬ／ウェルの０．２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。
【０１７１】
（実施例６）
（ＥＬＩＳＡ滴定：抗ＩｇＥ）
プレートを、炭酸塩被覆緩衝液中の０．２５μｇ／ｍＬ（精製したＦａｂ ０．１μｇ／ｍｌ）のＳＥ４４で４℃で一晩被覆した。被覆溶液を取り除き、このプレートを、２００μＬ／ウェルの３％のＢＳＡ／ＰＢＳで、３７℃にて１時間ブロックした。
【０１７２】
このプレートを、ＰＢＳ／０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。５０μＬ／ウェルのＦａｂ（１５ｍＬのペリプラズム調製物由来）を添加して、１：２の希釈で開始して、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に連続的に３倍希釈した。プレートを、室温で２時間インキュベートした。
【０１７３】
このプレートを、ＰＢＳＴで４回洗浄し、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のビオチンヒツジ抗ヒトＦｄの１：１０００希釈（０．８μｇ／ｍｌ）を５０μＬ／ウェルで添加した。このプレートを、再度室温で２時間インキュベートした。
【０１７４】
ＰＢＳＴでの４回の洗浄後、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のＮｅｕｔｒａ−アビジン−ＡＰの１：２０００（０．９μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルで添加し、このプレートを、室温で１時間インキュベートした。
【０１７５】
このプレートを、ＰＢＳＴで４回洗浄した。そして、ｐＮＰＰ基質を５０μＬ／ウェルで添加することにより展開した。展開を、５０μＬ／ウェルの３ＭのＮａＯＨを添加することにより停止させた。各ウェルの吸光度を、４０５ｎｍまたは４１０ｎｍで読み取った。
【０１７６】
（実施例７）
（可溶性Ｆａｂを発現するＭ１３ファージの親和性精製のためのプロトコル）
（Ａ．１日目）
１０ｍｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２つの５００ｍＬ培養物（２×ＹＴ）に、５ｍＬの一晩のストックＸＬ１Ｂを接種し、３７℃にてＡ６００が０．９〜１．２になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの濃度まで添加した。次いで、細胞培養物を、培養あたり２００μＬのファージで感染させ、振盪しながら３７℃にて１時間インキュベートした。感染後、その細胞を２５℃にて一晩振盪しながら増殖させた。
【０１７７】
（Ｂ．２日目）
細胞を、２５０ｍＬの遠心管中で、４℃で、３５００×ｇにて３０分間で、ペレット化した。培養培地を吸引し、ペレットを、合計１２〜１５ｍＬの溶解緩衝液（緩衝液Ａ＋プロテアーゼインヒビターの混液）に再懸濁した。
【０１７８】
【化１】
再懸濁した細胞を、５０ｍＬの円錐管に移し、混合物が、小さな塊として一緒に移動する（溶解に起因して）まで、その管を数回逆さにすることによって、１００μＬの１００ｍｇ／ｍＬのリゾチームに溶解した。細胞を氷上で超音波処理し、その後、１０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（約１０００ユニット）を添加し、４℃にて３０分間穏やかに振動させた。破片を、５０ｍＬの遠心管を用いて、４℃にて、１２０００×ｇにて３０分間遠心することによりペレット化した。上清を新しい円錐管に移し、４℃にて保存した。
【０１７９】
Ｎｉ−ＮＴアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉｓ、ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、可溶性Ｆａｂを精製した。この溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡと混合し、カラムにロードした。流れ出たものを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収集した。このカラムを、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのイミダゾール、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）で洗浄し、その後５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾールを２０ｍＬ用いて洗浄した。Ｆａｂを、５００μＬの溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、４５０ｍＭのイミダゾール、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）を用いて６回洗浄し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。カラム画分を、４℃にて保存した。カラム画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、Ｆａｂの量が最も多い画分を選択し、ＰＢＳ中に４℃にて透析した。
【０１８０】
（実施例８）
（可溶性レセプターアッセイ）
ＥＬＩＳＡに適した９６ウェルアッセイプレートを、０．０５ｍＬの０．５μｇ／ｍＬ ＦｃεＲＩα鎖レセプター被覆緩衝液（５０ｍＭ 炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６）で、４〜８℃にて１２時間被覆した。このウェルを吸引し、２５０μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。別個のアッセイプレートにおいて、サンプルおよび参照のＴＥＳ−Ｃ２１ ＭＡｂを、２００μｇ／ｍＬ〜０．００１μｇ／ｍＬまで、アッセイ緩衝液（０．５％ ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１：４希釈して滴定し、等量の１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＩｇＥを添加して、そのプレートを２５℃にて、２〜３時間インキュベートした。ＦｃεＲＩ被覆ウェルを、０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳを用いて三回洗浄し、サンプルウェルから５０μＬを移し、２５℃にて、３０分間攪拌しながらインキュベートした。アッセイ緩衝液に１：２０００で希釈した１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを５０μＬ／ウェルで、３０分間攪拌しながらインキュベートし、次いで、そのプレートを既に述べたように洗浄した。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、発色させた。等量の０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させ、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１８１】
（実施例９）
（抗体のＩｇＥ負荷ＦｃεＲＩに対する結合）
ＦｃεＲＩのαサブユニットと結合したヒトＩｇＥに対する抗体の結合を、１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＥと４℃にて３０分間プレインキュベートすることによって、決定した。プレートを三回洗浄し、その後、種々の濃度のマウス抗ヒトＩｇＥ ＭＡｂ Ｅ−１０−１０またはヒト化Ｆａｂ改変体のどちらかと１時間インキュベートした。Ｆａｂの結合を、ビオチン標識した抗ヒトＦｄ抗体を用いて、その後ＳＡ−ＨＲＰにより検出した。マウスＭＡｂ Ｅ−１０−１０を、ヤギ抗マウスＩｇ Ｆｃ ＨＲＰ結合Ａｂにより検出した。
【０１８２】
（実施例１０）
（クローン特徴付け）
各候補を、結合親和性についてアッセイし、ポジティブクローンを配列決定した。結合親和性を増加させる、ＣＤＲ領域における有益な変異を有する抗体改変体をさらに特徴付けした。アッセイには、Ｂｉａｃｏｒｅ分析；ＩｇＥのレセプターに対するＩｇＥ結合の阻害；およびレセプターが結合したＩｇＥの架橋が含まれる。
【０１８３】
改変体のライブラリーを作製した。親和性を改善することが実証された種々のＣＤＲに対するアミノ酸配列を表１に示す。図７は、置換の組合せを有する高親和性の候補を示す。
【０１８４】
【表１】
１９個の重鎖改変体を図９に示し、３５個の軽鎖改変体を、図８に示す。さらに３個の候補を、結合親和性について特徴付けし、これらを表２に示す。
【０１８５】
【表２】
（実施例１１）
（抗ＩｇＥ抗体の発現および精製ならびにＨＲＰ結合）
高親和性ＭＡｂ候補を生成した。インタクトな抗ＩｇＥ ＭＡｂの生成のために、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をファージベクターテンプレートからＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモーターの発現下で、Ｈ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターに別個にサブクローニングした。６個の全長抗体クローンを構築した。これらを図１０Ａ〜図１０Ｆに示す。適切な重鎖プラスミドおよび適切な軽鎖プラスミドを、当該分野で周知の技術によるエレクトロポレーションを使用して、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０に同時トランスフェクトした。例えば、Ｌｉｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４３巻、第１２号：３９６７〜７５（１９８９）を参照のこと。抗体を、プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して単一の安定な細胞株上清から精製した。抗体の濃度を、２８０ｎｍでのスペクトロフォトメーターおよびＦＣＡアッセイ（ＩＤＥＸＸ）を使用して決定した。
【０１８６】
ペルオキシダーゼ結合キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、精製した抗体に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させた。結合した各抗ＩｇＥ ＭＡｂの力価を、モノクローナルヒトＩｇＥ（ＳＥ４４）で被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【０１８７】
以下の培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【０１８８】
【表３】
この寄託を、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約および特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく規則（ブダペスト条約）の下で行なった。このことは、寄託の日から３０年間生存培養の維持を保証する。この生物は、ブダペスト条約の条件の下でＡＴＣＣにより入手可能にされ、このことは、関連する米国特許の発行の際に、培養の子孫の永久的かつ非制限的な利用可能性を公共に保証する。
【０１８９】
本出願の譲受人は、寄託されたこの培養が、適切な条件下で培養された場合に死滅するか、失われるか、破壊される場合に、通知に対して、同一の培養の生存可能な試料により、ただちに取り替えられることに同意した。寄託した株の利用可能性は、特許法に従って任意の政府の当局に認可された権利に違反して、本発明の実施に対する実施権として解釈されるべきではない。
【０１９０】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施可能にするのに十分であると考えられる。本発明は、寄託した培養物によってその範囲が限定されるべきではない。なぜならば、寄託された実施形態は、本発明の一局面の例示として意図され、機能的に等価である任意の培養物が、本発明の範囲内であるからである。本明細書中の材料の寄託は、本明細書中に含まれる記載が、その最良の形態を含めて、本発明の任意の局面の実施を可能にするのに不適切であるという承認を構成せず、特許請求の範囲の、本明細書が示す特定の例示への制限として解釈されるべきではない。実際、本明細書中に示され、記載される改変に加えて、本発明の種々の改変が、前述の記載から当業者に明らかになり、それらは、添付された特許請求の範囲の範囲内である。
【０１９１】
（実施例１２）
（ヒトＩｇＥの高親和性結合エピトープのマッピング）
（Ａ．ペプチド合成および抗ＩｇＥ結合アッセイ）
研究は、ＩｇＥが、そのＣＨ３ドメインを介してそのレセプターに結合することを示した。本発明のＨＡ 抗ＩｇＥ抗体は、非常に効率的にＩｇＥのそのレセプターへの結合をブロックするので、本発明者らは、全長ＣＨ３ドメインを含むペプチドを使用してエピトープをマッピングした。第一に、本発明者らは、二つのＶ５タグ化したペプチドを調製し、その一つは、ヒトＩｇＥの全長定常領域を含み、もう一つは、ヒトＩｇＥのＣＨ２−ＣＨ３領域のみを含んでいた。これらの二つのペプチドは、インビトロ転写翻訳によって発現し、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂ結合を検出するために、ウエスタンブロットアッセイに使用された。ＣＬ−２ ＣＭＡｂおよびＣＬ−５Ｉ ＭＡｂは両方ともインタクトなヒトＩｇＥに結合し得、両方ともそのペプチドに結合し得る。
【０１９２】
エピトープをより詳細にマッピングするために、ヒトＩｇＥの残基１４１〜３６８のアミノ酸を含み、全長ＣＨ３ドメインを含む７３個の重複するペプチドを合成した。各ペプチドは、上記ペプチドの３’末端と重複する３アミノ酸を有する１２アミノ酸残基からなる。ＳＰＯＴ膜を、セルロース膜上に、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸を用いて合成した。その膜をメタノール中でリンスし、次いで、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）中で、１０分間、３回洗浄した。ブロック溶液（ＴＢＳ中５％乳汁または３％ＢＳＡ）中で一晩インキュベートした後、ブロック溶液に希釈したＨＲＰ標識抗ＩｇＥ ＭＡｂを、膜と一緒に３時間インキュベートした。ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ（登録商標）中で１５分間、３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＩｇＥ反応性を、所望の時間ＢｉｏＭａｘ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ）の化学発光露光することにより測定した。
【０１９３】
この実験の結果は、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂが、ＩｇＥのＣＨ３部分の二つの領域に結合することを示唆し、この二つの領域は、以下の二つのペプチド配列ＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰ（エピトープ「Ａ」）およびＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴ（エピトープ「Ｂ」）により表される（図１２を参照のこと）。エピトープＡに対する結合は、エピトープＢに対する結合より数倍弱かった。
【０１９４】
（Ｂ．アラニンスキャニング変異誘発）
ＩｇＧ１に見出されるアミノ酸とペプチド内のアミノ酸との置換に伴うアラニンスキャニングを、どのアミノ酸が、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂのこれらのペプチドへの結合に決定的に関与しているかを決定するために行なった。ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂ結合に重要であることが決定されたアミノ酸を、ＩｇＥのε鎖におけるインビトロ変異誘発方法を使用して置換した。上に記載されるＣε２領域およびＣε３領域をカバーする別のペプチドをまた、この研究に使用した（図１３および図１４を参照のこと）。
【０１９５】
ヒトＩｇＥアミノ酸残基に対してＥＵ番号付けスキームを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＩｇＥの全長Ｆｃ領域および、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのみを含むＩｇＥ Ｆｃの短縮形態を増幅した。このＤＮＡ産物を、ＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に直接クローニングした。
【０１９６】
ＩｇＥ−Ｆｃにおける変異誘発を、オーバーラッピングＰＣＲ（Ｈｏら、１９８９）を使用して行った。このＤＮＡ産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、適切な制限酵素を用いて消化し、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターにサブクローニングした。各改変体構築物について、ＰＣＲ増幅領域を、ＤＮＡの両方の鎖から、ジデオキシヌクレオチド方法を使用して完全に配列決定した。組換えヒトＩｇＥ Ｆｃおよびその変異体を、網赤血球溶解物ベースのインビトロ転写とインビトロ翻訳との結合システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して発現させた。
【０１９７】
このインビトロ転写とインビトロ翻訳との結合システム（１０μｌの反応混合物）由来の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）に供し、次いで、ニトロセルロース膜に移した。この膜を、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の５％脱脂粉乳を用いてブロックし、その後一次抗体、抗ＩｇＥ ＭＡｂで染色した。特異的な反応バンドを、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）を使用して検出し、その免疫応答性バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ウェスタンブロッティング検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化した。抗Ｖ５抗体を、これらのペプチドのＣ末端に導入されたＶ５タグを検出するポジティブコントロールとして使用した。抗Ｖ５抗体を用いたウエスタンブロットは、全てのペプチドが、ほぼ等しいレベルで発現したことを実証した。興味深いことに、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂは、エピトープ「Ａ」に変異を保有するペプチドに結合し得たが、それらは、エピトープ「Ｂ」に変異を保有するペプチドには結合しなかった。このことは、この第２の部位が、結合に関してより重要であったことを示唆する（図１５を参照のこと）。
【０１９８】
（実施例１３）
（エピトープＢの免疫原性ペプチドを使用するトランスジェニックマウスの能動免疫）
ヒトＩｇＥを構成的に発現するトランスジェニックマウスを使用して、エピトープＢのヒト免疫原性ペプチドに対する抗体の能動的な産生を実証した。二つの融合ペプチド（それぞれが、本発明の免疫原性ペプチドであるシステイン残基およびＫＬＨを含む）を化学的に合成した。ペプチド１の配列は、以下：
（ＫＬＨ−Ｃｙｓ）−Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
であり、ペプチド２の配列は、以下：
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ−（Ｃｙｓ−ＫＬＨ）
であった。
【０１９９】
そのトランスジェニックマウスに、２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）中の２０μｇの免疫原性ペプチドを皮下に注射した。２週間の間隔で２度、不完全フロイントアジュバント中の２０μｇのペプチド免疫源を、そのマウスに、皮下に注射した。次いで、二週間後、屠殺の３日前に、そのマウスに再度、腹腔内に、ＰＢＳ中の２０μｇの同じ免疫源を注射した。血清を収集し、エピトープＢに特異的な抗ＩｇＥ抗体の存在について試験した。図１６に見られるように、このペプチドは、これらのトランスジェニックマウスにおいて、抗ＩｇＥ抗体を誘発した。
【０２００】
当業者は、慣例的にすぎない実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、抗体クローニングおよび抗体スクリーニングに使用されるファージベクターの模式的表現である。
【図２】図２は、抗体改変体を生成するために有用なオリゴヌクレオチドの模式的表現である。
【図３】図３Ａは、マウス抗ＩｇＥ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の軽鎖とＬ１６およびＪＫ４の混合ヒトテンプレートとの比較を示す。図３Ｂは、ＴＥＳ−Ｃ２１の重鎖とＤＰ８８およびＪＨ４ｂの混合ヒトテンプレートとの比較を示す。
【図４】図４は、親ＴＥＳ−Ｃ２１と比較して高親和性を有する、フレームワーク残基改変体の表を提示する。
【図５】図５ＡおよびＢは、ＴＥＳ−Ｃ２１の親Ｆａｂとネガティブコントロール（５Ｄ１２）と比較した、クローン４、４９、７２、７８および１３６についてのＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図６】図６は、親ＴＥＳ−Ｃ２１およびネガティブコントロール抗体と比較した、クローン２Ｃ、５Ａおよび５Ｉの阻害アッセイを示す。
【図７】図７Ａは、ＩｇＥに対するさらに高い親和性をもたらす有益な変異の組み合わせを有するクローンの配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、クローン１３６、１、２、４、８、１３、１５、２１、３０、３１、３５、４３、４４、５３、８１、９０および１１３についての全軽鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、クローン１３６、１、２、４、８、１３、１５、２１、３０、３１、３５、４３、４４、５３、８１、９０および１１３についての全軽鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、３５個のクローンについての全重鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、３５個のクローンについての全重鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒトＩｇＥのＣＨ３領域アミノ酸配列を示し、そしてエピトープ「Ａ」およびエピトープ「Ｂ」を強調表示する。
【図１２】図１２は、エピトープＢを同定するために使用される重複ペプチドを示す。
【図１３】図１３は、エピトープＡの結合領域中の重要な残基の識別を示す。
【図１４】図１４は、エピトープＢの結合領域中の重要な残基の識別を示す。
【図１５】図１５は、変異体ペプチドの結合するＭＡｂのウエスタンブロット分析を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＩｇＥを発現するトランスジェニック動物における抗ＩｇＥ抗体の産生を示す。
【技術分野】
【０００１】
（相互関連出願）
本出願は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８９２およびＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８９４（２００４年２月２日出願）の優先権を主張する。上記出願の全ては、本明細書において参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アレルギーは、外来の因子（例えば、アレルゲン）に対する過大な免疫応答によって誘導される過敏性状態である。即時（Ｉ型）過敏症は、アレルゲンとの接触直後のアレルギー性応答によって特徴付けられ、これは、Ｂ細胞を介して媒介され、そして抗原−抗体反応に基づく。遅延性過敏症は、Ｔ細胞を介して媒介され、そして細胞免疫の機構に基づく。近年、用語「アレルギー」は、よりＩ型過敏症と同義になってきている。
【０００３】
即時過敏症は、アレルゲンに暴露されて抗体分泌性プラスマ細胞に分化するＢ細胞による、免疫グロブリンクラスＥの抗体（ＩｇＥ抗体）の産生に基づく反応である。ＩｇＥに誘導される反応は、身体へのアレルゲン侵入部位で（すなわち、粘膜表面および／または局所リンパ節において）生じる局所的事象である。局所的に産生されたＩｇＥは、最初に局所性肥満細胞を感作する。すなわち、ＩｇＥ抗体は、定常領域を用いて、肥満細胞の表面上のＦｃεレセプターに結合し、次いで、「溢出」ＩｇＥが循環に侵入し、全身にわたって循環性好塩基球および組織固定（ｔｉｓｓｕｅ−ｆｉｘｅｄ）肥満細胞の両方のレセプターに結合する。その結合したＩｇＥが、その後アレルゲンに接触する場合、Ｆｃεレセプターは、アレルゲンと結合することによって交差結合され、細胞を脱顆粒させ、多くのアナフィラキシー性媒介物質（例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエンなど）を放出させる。即時過敏症に典型的な臨床症状（すなわち、気道または腸の平滑筋の収縮、小血管の拡張、ならびに水および血漿タンパク質に対する透過性の増大、粘液分泌（これらは、例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー性湿疹（ｅｘｃｅｍａ）、および喘息を引き起こす）、そして皮膚内に終わる神経の刺激（これは、かゆみおよび痛みを引き起こす））の原因となるのは、これらの物質の放出である。さらに、アレルゲンとの２回目の接触における反応は、ＩｇＥを細胞表面上に発現することによるアレルゲンとの最初の接触の後に、一部のＢ細胞が表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞（ｓＩｇＥ＋Ｂ細胞）の「記憶プール」を形成することに起因して、強化される。
【０００４】
ＩｇＥに対する２つの主要なレセプターが存在する。抗親和性レセプターＦｃεＲＩおよび低親和性レセプターＦｃεＲＩＩである。ＦｃεＲＩは、肥満細胞および好塩基球の表面上に優先的に発現されるが、ヒトランゲルハンス細胞、樹状細胞、および単球上にもまた、低レベルのＦｃεＲＩが見出され、ここで、ＦｃεＲＩは、ＩｇＥ媒介性アレルゲン提示において機能する。さらに、ＦｃεＲＩは、ヒト好酸球および血小板上でも報告されている（非特許文献１）。ＦｃεＲＩは、Ｂ細胞、Ｔ細胞または好中球の表面上には見いだされない。ランゲルハンス細胞および皮膚樹状細胞でのＦｃεＲＩの発現は、機能的におよび生物学的に、アレルギーの個体におけるＩｇＥ結合抗原提示に関して重要である（非特許文献２）。
【０００５】
低親和性レセプターＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）は、細胞質膜からの長いらせん形のコイル状の柄から伸びる頭部構造を有する３つの同一なサブユニットを備えるレクチン様分子である（非特許文献３）。ＩｇＥへの結合のとき、ＦｃεＲＩＩは、ＩｇＥの合成の調節に関与するＢ細胞上のＣＤ２１と会合する（非特許文献４、非特許文献５）。ＦｃｃＲＩＩは、アレルゲン提示に関して長く認識されてきた。（非特許文献６）。上皮細胞上のＦｃεＲＩＩに結合したＩｇＥは、特異的かつ迅速なアレルゲン提示を引き起こす（非特許文献７）。ＦｃεＲＩＩは、数種の細胞型（Ｂ細胞、好酸球、血小板、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、濾胞樹状細胞、およびランゲルハンス細胞が挙げられる）に存在する。
【０００６】
ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩと相互作用するＩｇＥ分子の構造の実体もまた同定されている。突然変異誘発研究は、ＣＨ３ドメインが、ＦｃεＲＩ（非特許文献８；非特許文献９）およびＦｃεＲＩＩ（非特許文献６；非特許文献１０）の両方とのＩｇＥの相互作用を媒介することを示した。高親和性レセプターおよび低親和レセプターの両方に対する結合部位は、２つのＣＨ３ドメインを通る中心回転軸に沿って対称的に位置する。ＦｃεＲＩ結合部位は、ＣＨ３ドメインの、ＣＨ２ドメインの接合部近くの外側に位置し、一方ＦｃεＲＩＩ結合部位は、ＣＨ３のカルボキシル末端にある。
【０００７】
アレルギー処置のための有望な考え方は、ＩｇＥアイソタイプ特異的であり、したがってＩｇＥに結合し得る、モノクローナル抗体の適用に関する。このアプローチは、ＩｇＥ免疫応答（アレルギーの誘導における最も初期の反応であり、そしてアレルギー状態を維持させる）をダウンレギュレートすることによる、アレルギー性反応の阻害に基づく。他の抗体クラスの応答が影響を与えない場合、アレルギー症状に対する即時効果および長期持続効果の両方が達成される。ヒト好塩基球密度の初期の研究は、患者の血漿中のＩｇＥレベルと好塩基球あたりのＦｃεＲＩレセプターの数との間の相関を示した（非特許文献１１）。彼らは、アレルギーの人物と非アレルギーの人物とにおけるＦｃεＲＩ密度が、好塩基球あたり１０４〜１０６レセプターの範囲に及ぶことを示した。後に、抗ＩｇＥによるアレルギー性疾患の処置が、循環性ＩｇＥの量を処置前のレベルの１％まで減少させることが示された（非特許文献１２）。ＭａｃＧｌａｓｈａｎは、患者の血清中を循環する遊離ＩｇＥに結合する、全抗ＩｇＥ抗体で処置された患者から得られた血清を分析した。彼らは、患者中の循環性ＩｇＥのレベルを低下させることは、好塩基球上に存在するレセプターの数を減少させる結果となることを報告した。したがって、彼らは、好塩基球および肥満細胞上のＦｃεＲＩ密度が循環性ＩｇＥ抗体のレベルによって直接的もしくは間接的に調節される、という仮説を立てた。
【０００８】
より最近では、特許文献１は、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩのＩｇＥ結合部位に結合してＩｇＥのレセプターへの結合をブロックする、ＩｇＥ分子およびフラグメントの使用を開示した。しかし、これらのアレルギー性疾患の管理に対する有害な副作用のない効果的な治療は、限られている。アレルギー性疾患の処置に対する１つの治療アプローチは、ヒト化抗ＩｇＥ抗体を使用して、アレルギー性鼻炎および喘息を処置することに関する（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。これらの臨床的データは、ＩｇＥのそのレセプターへの結合の阻害が、アレルギー性疾患を処置するための効果的なアプローチであることを実証する。
【０００９】
抗アレルギー剤として適切な抗体は、ＩｇＥ産生性プラスマ細胞へと分化する表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞と反応すべきであり、これによってこれらは、機能的にそれらのＢ細胞を消失させるために使用され得る。しかし、ＩｇＥに対する抗体は、基本的に、Ｆｃεレセプターと交差結合することによって、ＩｇＥ感作された肥満細胞から放出される媒介物質を誘導し得る。したがって、血清ＩｇＥレベルおよびｓＩｇＥ＋Ｂ細胞レベルに対して発揮される有利な効果を拮抗する。抗ＩｇＥ治療を発展させ得ることに伴う潜在的に危険な問題の１つは、既に抗親和性レセプターに結合しているＩｇＥに結合する治療用抗体によって引き起こされ、そしてヒスタミン放出を誘発し、潜在的にアナフィラキシー性の反応を引き起こす、ＩｇＥ交差結合の可能性である。
【００１０】
したがって、アレルギーの治療のために適用可能な抗体は、感作された肥満細胞および好塩基球に結合したＩｇＥと反応してはいけないが、ｓＩｇＥ＋Ｂ細胞を認識する能力を保持しているべきである。このようなＩｇＥアイソタイプ特異的抗体は、例えば、非特許文献１８）によって、特許文献２において、および数件の米国特許（例えば、特許文献３）において、記載されている。
【００１１】
抗ＩｇＥ抗体を産生するために使用されるペプチドはまた、アナフィラキシー性抗体を誘導する危険の可能性を被る。能動的ワクチン接種の間の抗ＩｇＥ抗体の産生は、免疫の間に産生された抗体が、高親和性ＩｇＥレセプターに結合したＩｇＥに結合する場合、または他の機構によって、受動的に投与された抗ＩｇＥ抗体と同様の方法で、ヒスタミン放出を誘発し得る。
【特許文献１】国際公開第９９／６２５５０号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第０４０７３９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４４９，７６０号明細書
【非特許文献１】Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｓ．ら，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ，１９９９年，９３：２５４３−２５５１
【非特許文献２】Ｋｌｕｂａｌ Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７年，１０８（３）：３３６−４２
【非特許文献３】Ｄｉｅｒｋｓ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年，１５０：２３７２−２３８２
【非特許文献４】Ｓａｎｏｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０年，８６：３３３−３４４
【非特許文献５】Ｂｏｎｎｅｆｏｙ，Ｊ．ら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐ．Ｊ．１９９６年，９：６３ｓ−６６ｓ
【非特許文献６】ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，３６６：４２１−４２８
【非特許文献７】Ｙａｎｇ，Ｐ．Ｐ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００年，１０６：８７９−８８６
【非特許文献８】Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４年，２６９：２６３６８−２６３７３
【非特許文献９】Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，３６：１５５６８−１５５７８
【非特許文献１０】Ｓｈｉ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，３６：２１１２−２１２２
【非特許文献１１】Ｍａｌｖｅａｕｘら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９７８年，６２：１７６
【非特許文献１２】ＭａｃＧｌａｓｈａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７年，１５８：１４３８−１４４５
【非特許文献１３】Ｃｏｒｎｅ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７年，９９：８７９−８８７
【非特許文献１４】Ｒａｃｉｎｅ−Ｐｏｏｎ，Ａ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９７年，６２：６７５−６９０
【非特許文献１５】Ｆａｈｙ，Ｊ．Ｖ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９７年，１５５：１８２４−１８３４
【非特許文献１６】Ｂｏｕｌｅｔ，Ｌ．Ｐ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１９９７年，１５５：１８３５−１８４０
【非特許文献１７】Ｍｉｌｇｒｏｍ，Ｅ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９９年，３４１：１９６６−１９７３
【非特許文献１８】Ｃｈａｎｇら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０年，８，１２２−１２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＩｇＥに特異的に結合するが、既にその高親和性レセプターに結合したＩｇＥには結合しない、高親和性の非アナフィラキシー性抗体に対する必要性、ならびに、アナフィラキシー性抗体を誘導しない、能動免疫のためのペプチドに対する必要性が存在する。本発明者らは、肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥに結合することなく、抗体の高親和性結合を提供する、ＩｇＥの特異的エピトープを同定した。これらの特異的エピトープは、次いで、レセプターに結合するＩｇＥの領域に結合するのみである、ＩｇＥに対する抗体を産生する能動免疫のための、特異的ペプチドを産生するために使用され得る。このことは、この抗体が、既にレセプターに結合したＩｇＥに交差結合しないこと、したがって非アナフィラキシー性であることを保証する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ＩｇＥのＣＨ３ドメインに由来する新規のペプチドエピトープに関する。これらのペプチドエピトープは、ＩｇＥに特異的に結合する高親和性抗体によって認識される。これらの新規のペプチドは、哺乳動物においてこれらのペプチドを投与して高親和性抗体を産生することによる、哺乳動物の能動免疫のために使用され得る。このペプチドエピトープはまた、非ヒト宿主において、ＩｇＥのこれらの領域に特異的に結合する高親和性抗ＩｇＥ抗体を産生すること、および得られた抗体を哺乳動物の受動免疫のために使用することに使用され得る。
【００１４】
本発明の一免疫原（エピトープＡ、図１１）は、以下のアミノ酸配列を含む：
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｘａａ Ａｒｇ Ｘａａ（配列番号７２）
エピトープＡの１つの例は、以下である：
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ（配列番号７３）
別の免疫原（エピトープＢ、図１１）は、以下のアミノ酸配列を含む：
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号７４）
エピトープＢの例としては、以下が挙げられる：
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７５）
Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７６）
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ（配列番号７７）
配列番号７２または配列番号７４のいずれにおいても、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり得る。
【００１５】
これらのペプチドは、上記ペプチドの少なくとも１つ、および生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、安定剤、もしくは賦形剤、ならびに免疫原性キャリアを含む組成物中に含まれ得る。上記免疫原性キャリアは、例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドであり得る。本発明はまた、配列番号７２〜７７をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、およびこのベクターを有する細胞に関する。
【００１６】
本発明はまた、エピトープＡおよび／またはエピトープＢに特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、エピトープＡおよび／またはエピトープＢに特異的に結合する抗体を作製する方法に関する。
【００１７】
本発明は、配列番号７２および／または配列番号７４を含むペプチドの、ＩｇＥ媒介性疾患もしくはＩｇＥ媒介性状態に罹患する被験体への投与に関する。
【００１８】
本発明は、配列番号７２および／または配列番号７４を含むペプチドを用いて産生された高親和性抗体の、ＩｇＥ媒介性疾患もしくはＩｇＥ媒介性状態に罹患する哺乳動物への投与に関する。この高親和性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。この抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。このようなＩｇＥ媒介性疾患もしくはＩｇＥ媒介性状態としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、および湿疹が挙げられる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常かつ典型的な意味で解釈されるべきである。しかし、本出願人らは、以下の用語が以下に定義されるような特定の定義を与えられることを所望する。
【００２０】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する用語「実質的に同一」は、参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を示す抗体鎖として解釈され得る。核酸配列に関するこの用語は、参照核酸配列に対して、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈され得る。
【００２１】
用語「同一性」または「相同性」は、配列全体に対する最大パーセント同一性を達成することを必要し、そして配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない場合、配列をアラインメントさせ、そしてギャップを導入した後に比較される、対応する配列の残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味すると解釈されるべきである。Ｎ末端またはＣ末端の伸張も、それらの挿入も、同一性または相同性の低減として解釈されるべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該分野で周知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを使用して測定され得る。
【００２２】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体が挙げられる）、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を網羅する。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する、糖タンパク質である。抗体が特定の標的に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは、抗体および標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。ネイティブな抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖と２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、そして他方の端に定常ドメインを有する。「高親和性」抗体とは、少なくとも１０−１０、好ましくは１０−１２の結合親和性を有するこれらの抗体をいう。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「抗ヒトＩｇＥ抗体」とは、このようなＩｇＥの高親和性レセプターＦｃεＲＩへの結合を、阻害または実質的に低下させるような様式で、ヒトＩｇＥを結合する抗体を意味する。
【００２４】
抗体の可変ドメインに関連する用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列がかなり異なり、そして各特定の抗体の、その特定の標的に対する結合および特異性において使用されるという事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均一に分布していない。これは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる（または超可変領域としても知られる）３つのセグメントに集中されている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ領域を含み、その多くはβ−シート構造を採用し、３つのＣＤＲによって結合され、これらはループを形成し、上記β−シート構造を結合し、いくつかの場合はその一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって、他の鎖からのＣＤＲと一緒に近接して保持され、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔらを参照のこと）。本明細書において使用される場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、他に示されない限り、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）の免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従って行われる。
【００２５】
用語「抗体フラグメント」とは、全長抗体の一部（一般的には、標的結合領域または可変領域）をいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。語句、抗体の「機能的フラグメントまたはアナログ」は、全長抗体に共通の定性的生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、ＩｇＥ免疫グロブリンに対して、このような分子の能力を、高親和性レセプターＦｃεＲＩに結合する能力を有することから防ぐかまたは実質的に低減させる様式で、結合し得るものをいう。本明細書において使用される場合、抗体に関して、「機能的フラグメント」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントをいう。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識部位および完全な標的結合部位を含む、最小抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域との強い、非共有結合性結合のダイマー（ＶＨ−ＶＬダイマー）からなる。これは、各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面における標的結合部位を規定するために相互作用する構造にある。集合的に、６つのＣＤＲが、抗体に対する標的結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、標的に関して特異的な３つのＣＤＲのみを含む、Ｆｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、標的に認識および結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、標的結合に関する所望の構造を形成するｓＦｖを形成し得るポリペプチドリンカーを含む。
【００２６】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基（抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む）の付加によってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断によって生成される。抗体フラグメントのさらなる化学結合は、当業者に公知である。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいう（すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、少数の量で存在し得る、可能性のある天然に存在する変異を除いて、同一である）。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の標的部位に対して指向する。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対して指向する種々の抗体を代表的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は、標的上の単一の決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され得、他の免疫グロブリンによって汚染されない可能性があるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一の抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用するためのモノクローナル抗体は、周知の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。本発明によって使用されるべき親モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換え法によって作製され得る。
【００２８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の標的結合配列）である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらの領域である。非ヒト抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的に、選択されたヒト免疫グロブリンテンプレートの免疫グロブリン定常領域）の少なくとも一部を含み得る。
【００２９】
用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、子孫を含む。全ての子孫は、意図的な変異または不慮の変異に起因して、ＤＮＡ内容物において正確には同一でない可能性があることが、また理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされる場合、同じ機能特性または生物学的特性を有する改変体子孫が含まれる。本発明において使用される「宿主細胞」は、一般的に、原核生物宿主または真核生物宿主である。
【００３０】
ＤＮＡによる細胞生物体の「形質転換」とは、生物体にＤＮＡを導入し、そのＤＮＡが、染色体外エレメントとして、または染色体組み込みによって複製されることを意味する。ＤＮＡによる細胞生物体の「トランスフェクション」とは、任意のコード配列が実際に発現されていてもいなくとも、細胞または生物体によるＤＮＡ（例えば、発現ベクター）の取り込みをいう。用語「トランスフェクトされた宿主細胞」および「形質転換された」とは、ＤＮＡが導入された細胞をいう。この細胞は、「宿主細胞」と称され、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。代表的な原核生物宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の系統が挙げられる。代表的な真核生物宿主細胞としては、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣またはヒト起原の細胞）が挙げられる。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と同種由来、または（ｏｆ）宿主細胞と異なる種であり得るか、あるいは、一部の外来ＤＮＡおよび一部の同種ＤＮＡを含む、ハイブリッドＤＮＡ配列であり得る。
【００３１】
用語「ベクター」とは、適切な宿主中におけるＤＮＡの発現を生じ得る適切な制御配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物を意味する。このような制御配列としては、転写を引き起こすプロモーター、このような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または、単に潜在的ゲノムインサートであり得る。一旦適切な宿主中へと形質転換された場合、ベクターは、複製して宿主ゲノムと独立して機能し得るか、またはいくつかの例では、ゲノムそのものへと一体化し得る。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、時として、交換可能に使用される。なぜなら、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態だからである。しかし、本発明は、当該分野で公知であるか、公知となる機能と等価な機能を果たすような他のベクターの形態を包含することを意図する。
【００３２】
発現「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。前配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関わる前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡと作動可能に連結されている可能性がある；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている；あるいは、リボゾーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「操作可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が、隣接しており、そして分泌リーダーの場合、隣接していてリーディングフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。
【００３３】
処置目的のための「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、非ヒト霊長類、および動物園の動物、競技用動物、またはペット用動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が挙げられる。
【００３４】
用語「エピトープタグ化」とは、ポリペプチドに関して本明細書において使用される場合、「エピトープタグ」に融合されたポリペプチドをいう。エピトープタグポリペプチドは、そのエピトープに対して抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、ポリペプチドの活性を干渉しないように十分短い。エピトープタグはまた、好ましくは、かなり独特であり、したがって抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常、約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約９〜３０残基）の間である。例としては、以下が挙げられる：インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５））；そして単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５４７−５５３（１９９０））。特定の実施形態において、エピトープタグは、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のインビボ血清半減期の延長を担う、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープであり得る。
【００３５】
語「標識」とは、本明細書において使用される場合、分子またはタンパク質（例えば、抗体）と直接的または間接的に結合され得る検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自身検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であり得るか、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「固相」とは、本発明の抗体が接着し得る非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例としては、部分的もしくは全体的に、ガラス（例えば、制御された多孔質ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから形成されたものが挙げられる。特定の実施形態において、状況に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを包含し得；他方、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩｇＥ媒介性障害」とは、免疫グロブリンＩｇＥの過剰生成および／または免疫グロブリンＩｇＥに対する過剰な感受性によって特徴付けられる状態または疾患を意味する。具体的には、アナフィラキシー性過敏症ならびにアトピー性アレルギー（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性結膜炎（花粉症）、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギーが挙げられる）に関する状態を包含すると解釈される。例えば、蜂に刺されること、蛇にかまれること、食物、または医薬によって引き起こされるアナフィラキシーショックの重篤な生理学的状態もまた、本用語の範囲下に包含される。
【００３８】
（抗体の生成）
出発抗体または「親」抗体は、このような抗体を生成するために当該分野で利用可能な技術を用いて調製され得る。これらの技術は、当該分野で周知である。出発抗体を生成するための例示的方法は、以下の節においてより詳細に記載される。これらの記載は、親抗体を作製または選択するための考えられる代替案であり、このような分子が生成され得る方法を決して限定しない。
【００３９】
抗体の結合親和性は、本発明の高親和性抗体を生成する前に決定される。また、この抗体は、他の生物学的に活性なアッセイに（例えば、治療剤としての有効性を評価するために）供され得る。このようなアッセイは、当該分野で公知であり、そして抗体に対する標的および意図される用途に依存する。
【００４０】
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥの、その高親和性レセプターへの結合をブロックするもの）についてスクリーニングするために、慣習的な交差ブロックアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８））に記載されるようなアッセイ）が実施される。あるいは、エピトープマッピングは、抗体が目的のエピトープにどこで結合するかを決定するために実施され得る。必要に応じて、抗体を生成するために使用される標的のホモログに対する抗体の結合親和性（ここで、このホモログは、異なる種に由来する）は、当該分野で公知の技術を用いて評価され得る。一実施形態において、他の種は、前臨床研究において抗体が投与される非ヒト動物である。したがって、この種は、アカゲザル、カニクイザル、ヒヒ、チンパンジー、およびマカクのような非ヒト動物であり得る。他の実施形態において、この種は、例えば、げっ歯類、ネコ、またはイヌであり得る。
【００４１】
親抗体は、標的に対して親抗体よりもより高いかもしくはより強い結合親和性を有する抗体を生成するように、本発明に従って変化される。抗体特異性は、抗体とその標的との間に形成される独特の界面から生じる；この表面は、独特のはめ合いを生じるように互いに補完する（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３−２０）。その界面に沿った接触をさらに改善することによって、結合パートナーの会合を助けるために必要とされるエネルギーコストがより低いことの結果として、全体的な親和性が増加し得る。
【００４２】
抗体の結合表面は、一般的に、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成される。これらは、コアから外に伸びるループである。ＣＤＲは、特異的標的への結合のために独特の配列を有するアミノ酸から構成される。抗体の、その抗原に対する親和性を増加させるために、これらのアミノ酸の周辺の環境は、種々の非共有結合力を導入または改善し、最終的に、相互作用のエネルギー特性を低下させ、その結果としてより高い親和性をもたらすことによって、より都合よくならねばならない。
【００４３】
ファンデルワールス力は、２つの電気的に中性な分子の間で生じる非共有結合性相互作用である（Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）。会合は、永久双極子または誘起双極子から生じる静電気的相互作用に由来して、２つの表面の間で起こり得る。これらの双極子は、αヘリックスの端に沿って存在し得るか、または極性アミノ酸の近くに存在し得る。結合界面に沿ったファンデルワールス力の数の増加によって、より都合よい会合が生じる。
【００４４】
水素結合の導入もまた、抗体とその抗原との間の相互作用の特異性を増加させる。水素結合に関与する一般的なドナーおよびアクセプターは、主にアミノ酸を構成する窒素原子、酸素原子および硫黄原子である（上述のＶｏｅｔらを参照のこと）。水素結合は、短い距離のみにわたる傾向にあり（通常２．７〜３．１Å）、そのため、その結合パートナーは、これらの相互作用が生じるためには密接しなければならない。したがって、親和性を改善し得る１つの様式は、潜在的ドナー分子と潜在的アクセプター分子とを密接して接触させて、水素結合を確立させることである。
【００４５】
最後に、疎水性相互作用の改善もまた、２つの結合パートナーの間の有利なエネルギー特性を増加させる。結合表面に密接して位置する非極性残基は、他の非極性残基によって囲まれるべきであり、それによって有利な環境に存在する。非極性側鎖の囲み（ｔｈｅ ｂｕｒｉａｌ ｏｆ ｎｏｎｐｏｌａｒ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ）を満足することによって、相互作用のエネルギー特性は、強い結合界面のために有利となる。
【００４６】
タンパク質−タンパク質界面を安定化させる相互作用は、これらの接触を維持するエネルギーコストを低下させ、したがって、全体的親和性を増加させる。結合界面近くの個々のアミノ酸の周りの環境を改善することによって、より有利な環境が生成され、結果としてより高い親和性が得られる。したがって、有利な接触を導入し、そしてさらなる相補性を介して界面を改善することによって、抗体と抗原との間の全体的な結合相互作用は大きく改善される。
【００４７】
得られた抗親和性抗体は、好ましくは、親抗体の標的に対する結合親和性よりも少なくとも約１０倍高い、または少なくとも約２０倍高い、または少なくとも約５００倍高い、または１０００倍〜５０００倍高くあり得る、標的に対する結合親和性を有する。必要な、もしくは所望される、結合親和性における増強の程度は、親抗体の最初の結合親和性に依存する。
【００４８】
一般的に、親抗体由来の高親和性抗体を作製するための方法は、以下の工程を包含する。
【００４９】
１．目的の標的に結合する、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む親抗体を得るかまたか選択する工程。これは、伝統的なハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、または標的特異的抗体を生成する任意の他の方法によって行われ得る。
【００５０】
２．配列が親フレームワーク配列（好ましくはヒトテンプレート配列）に近いフレームワーク配列を選択する工程。このテンプレートは、例えば、その比較される全体の長さ、ＣＤＲのサイズ、フレームワークとＣＤＲとの間の接合部に位置するアミノ酸残基、全体的な相同性などに基づいて選択され得る。選択されるテンプレートは、１より多くの配列の混合物であり得るか、またはコンセンサステンプレートであり得る。
【００５１】
３．考えられるＣＤＲ位置の各々および全てにおいてランダムアミノ酸置換を作製することによってクローンのライブラリーを生成する工程。これは、例えば、ＣＤＲに隣接するか、または全ての考えられるアミノ酸と結合するか、それをフォールディングすることに影響を及ぼすヒトフレームワークテンプレート中のアミノ酸をランダムに置換し得、フレームワーク置換のライブラリーを生成する。これらのフレームワーク置換は、標的結合および抗体フォールディングに対するそれらの潜在的効果について評価され得る。フレームワーク中のアミノ酸の置換は、ＣＤＲ中のアミノ酸の置換と同時にか、または順次にかのいずれかで行われ得る。改変体のライブラリーを生成するための１つの方法は、オリゴヌクレオチド合成による。
【００５２】
４．工程（３）において生成された重鎖および／または軽鎖改変体を含む発現ベクターを構築する工程。上記改変体は、以下の式を含み得る：ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４（Ｉ）およびＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４（ＩＩ）、ここで、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、ＦＲＬ４、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３およびＦＲＨ４は、工程３において選択されたフレームワークテンプレートの軽鎖配列および重鎖配列の改変体を表し、そしてＣＤＲは、親抗体ＣＤＲの改変体ＣＤＲを表す。このような重鎖配列および軽鎖配列を含むベクターの例は、図１に示される。
【００５３】
５．特異的標的に対するクローンのライブラリーをスクリーニングする工程。標的に結合するこれらのクローンは、改善された結合親和性についてスクリーニングされる。親分子より大きな親和性で結合するこれらのクローンが選択され得る。最適な高親和性候補は、親抗体と比較して、（好ましくは、２０倍より大きい、１００倍より大きい、１０００倍より大きい、または５０００倍より大きい）最大の結合親和性の可能性を有する。選択された改変体が、望ましくない特定のアミノ酸（例えば、導入されたグリコシル化部位または潜在的に免疫原性の部位）を含む場合、それらのアミノ酸は、より有利なアミノ酸残基で置き換えられ得、そして結合親和性が再評価され得る。
【００５４】
また、この方法を使用して、完全ヒト親抗体から、ＣＤＲ領域のみをランダムに置換することによって、ヒトフレームワーク領域をインタクトなままにして、高親和性抗体を生成し得る。
【００５５】
改善されたハイスループットスクリーニング技術および図１に記載されたようなベクターによって、当業者は、所与のＣＤＲ中および／またはフレームワーク領域中の全ての部位における置換の包括的なライブラリーを、迅速かつ効果的にスクリーニングし得る。全てのアミノ酸を全ての位置において同時に、ランダムに置換することによって、個々の置換によっては予測または同定できない（例えば、相乗作用に起因する）親和性を有意に増加させる可能性のある組合せをスクリーニングすることができる。
【００５６】
（親抗体の調製）
（標的の調製）
可溶性の標的またはそれらのフラグメントは、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。この抗体は、目的の標的に対して指向する。好ましくは、この標的は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患する哺乳動物へのこの抗体の投与は、哺乳動物に治療的利益をもたらし得る。しかし、抗体は、非ポリペプチド標的に対して指向し得る。標的がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子（例えば、レセプター）またはリガンド（例えば、成長因子）であり得る。本発明の１つの標的は、ＩｇＥである。全細胞が抗体を作製するための免疫原として使用され得る。標的は、組み換え的に使用され得るか、または合成法を用いて使用され得る。標的はまた、天然の供給源から単離され得る。
【００５７】
本発明の抗体を生成するために使用される抗原は、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメント（エピトープＡおよび／またはエピトープＢが挙げられる）を包含し得る。動物を免疫するために使用されるポリペプチドは、標準的な組み換え法、化学合成法、または精製法によって得ることができる。当該分野で周知であるように、免疫原性を増加させるため、抗原は、キャリアタンパク質に結合され得る。一般的に使用されるキャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、結合されたペプチドは、動物（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）を免疫するために使用される。このようなキャリアに加えて、周知のアジュバントが抗原とともに投与されて、強力な免疫応答の誘導を促進し得る。
【００５８】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体は、通常、非ヒト哺乳動物において、アジュバントと組み合わせての関連する標的の複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって生成される。免疫応答を誘起し得る多くの因子は当該分野において周知である。
【００５９】
動物は、（各々、ウサギまたはマウスについての）タンパク質または結合体をフロイント完全アジュバントと組み合わせて、そしてその溶液を皮内に注射することによって、標的、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫される。一ヵ月後、その動物は、フロイント不完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは結合体を用いて、複数部位への皮下注射によって、追加免疫される。７日〜１４日後、この動物は、採血されて、その血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。
【００６０】
選択された哺乳動物抗体は、通常、標的に対して十分に強力な結合親和性を有する。例えば、この抗体は、ヒト抗ＩｇＥ標的と、約１×１０−８Ｍの結合親和性（Ｋｄ）の値で結合し得る。抗体親和性は、飽和結合；酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ）によって決定され得る。
【００６１】
目的の標的に結合する抗体をスクリーニングするため、慣習的な交差結合アッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるようなアッセイ）が行われ得る。あるいは、エピトープマッピング（例えば、Ｃｈａｍｐｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載される）が行われて、結合を決定し得る。
【００６２】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を認識する抗体である。これらの均一な特異性は、モノクローナル抗体を、種々の異なる抗原部位を認識する抗体を通常含むポリクローナル抗体よりもずっと有用にしている。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、または組み換えＤＮＡ法によって作製され得る。
【００６３】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、げっ歯類）は、本明細書において上記されるように免疫されて、免疫のために使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘起される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて、骨髄腫細胞と融合される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９０−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００６４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、そして増殖する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨害する物質）を含む（ＨＡＴ培地）。好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対する感受性のある細胞である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００６５】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準的方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的のための適切な培養培地は含む。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地から従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって適切に分離される。
【００６６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、そのモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。一旦単離された場合、このＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得る。次いでこの発現ベクターは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）に移送されて、この組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンポリペプチドに共有結合性に結合することによって、改変され得る。
【００６７】
（ヒト化抗体）
ヒト化は、キメラ抗体を作製するための技術であり、キメラ抗体においては、インタクトなヒト可変ドメインよりもずっとわずかが、対応する非ヒト種由来の配列によって置換されている。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、これは代表的に、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、非ヒトＣＤＲまたはヒト抗体中の対応する配列についてのＣＤＲ配列で置換することによって行われる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。本発明において実施される場合、ヒト化抗体は、マウス抗体における類似部位由来の残基によって置換された、いくつかのＣＤＲ残基およびいくつかのＦＲ残基を有し得る。
【００６８】
ヒト化抗体を作製するのに使用されるべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ ｆｉｔ）」法に従って、非ヒト抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリーと比較される。非ヒト親抗体の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体についてのヒトフレームワークとして受容される（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、数種の異なるヒト化抗体に対して使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【００６９】
（抗体フラグメント）
種々の技術が、抗体フラグメントの生成のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５））。しかし、これらのフラグメントは、現在、組み換え宿主細胞によって直接的に生成され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨフラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから直接的に回収され得、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従うと、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組み換え宿主細胞培養物から直接的に単離され得る。抗体フラグメントを生成するための他の技術は、当業者に明らかである。別の実施形態において、最適な抗体は、単鎖Ｆｖフラグメントである（ｓｃＦｖ）（ＰＣＴ特許出願 国際公開番号９３／１６１８５）。
【００７０】
（高親和性抗体の調製）
一旦親抗体が同定され、単離された場合、親抗体の可変領域の１つ以上において、１つ以上のアミノ酸残基が変化され得る。あるいは、または加えて、フレームワーク残基の１つ以上の置換が、親抗体中に導入され得、これらは、抗体の（例えば、ヒトＩｇＥに対する）結合親和性に改善をもたらす。改変するフレームワーク領域の残基の例としては、以下が挙げられる：直接的に標的に非共有結合性に結合するもの（Ａｍｉｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲの高次構造と相互作用するもの／ＣＤＲの高次構造に影響するもの（Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に（ＥＰ ２３９ ４００ Ｂ１）関与するもの。特定の実施形態において、このようなフレームワーク領域の残基の１つ以上の改変は、目的の標的に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。
【００７１】
抗体の生物学的特性の改変は、例えば、以下を維持することに対するそれらの影響において有意に異なる置換を選択することによって達成され得る：（ａ）置換の範囲におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート構造もしくはヘリックス構造）；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ（ｂｕｌｋ）。非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーと別の分類との交換を伴う。
【００７２】
アミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、より早期に調製された、種依存性抗体の改変体または非改変バージョンの、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。改変体を生成するための好ましい方法は、オリゴヌクレオチド媒介性合成である。特定の実施形態において、抗体改変体は、例えば、約２〜約１５の超可変領域置換を置換した、単一の超可変領域残基を有するのみである。
【００７３】
改変体のライブラリーを生成するための１つの方法は、図２に示されるスキームに従うオリゴヌクレオチド媒介性合成による方法である。各々約１００ヌクレオチドの３つのオリゴヌクレオチドが、全軽鎖可変領域または全重鎖可変領域にわたって合成され得る。各オリゴヌクレオチドは、以下を含む：（１）トリプレット（ＮＮＫ）２０によって生成された６０アミノ酸伸長（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＫはＧまたはＴである）、および（２）隣のオリゴか、または各端のベクター配列とのおよそ１５〜３０ヌクレオチドの重複。ＰＣＲ反応におけるこれら３つのオリゴヌクレオチドのアニーリングのとき、ポリメラーゼは、反対側の鎖を充填し、完全二重鎖化された重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列を生成する。トリプレットの数は、任意の反復長に調整され得、そして、オリゴヌクレオチド中のそれらの位置は、所与のＣＤＲまたはフレームワーク領域におけるアミノ酸のみを置換するように選択され得る。（ＮＮＫ）を用いることによって、コードされた改変体中の各々の位置において、全２０アミノ酸が考えられる。５〜１０アミノ酸（１５〜３０ヌクレオチド）の重複配列は、置換されないが、これはフレームワークの積み重なり（ｓｔａｃｋｉｎｇ）領域内に含まれるように選択され得るか、または合成の別のラウンドまたはその後のラウンドで置換され得る。オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。これらのオリゴヌクレオチドから抗体改変体を生成するための方法もまた、当該分野で周知である（例えば、ＰＣＲ）。
【００７４】
重鎖改変体および軽鎖改変体のライブラリーは、それらの配列のランダムな位置において異なり、任意の発現ベクター（例えば、バクテリオファージ、具体的には、図１のベクター）中で構築され得る。これらのベクターの各々は、特定の重鎖改変体および軽鎖改変体をコードするＤＮＡを含む。
【００７５】
抗体改変体の生成に続いて、親抗体に比較した改変体の生物学的活性が決定される。上記のように、これは、改変体の標的に対する結合親和性を決定する工程を包含する。多くのハイスループット法が、抗体改変体を、目的の標的と結合するそれらの能力に関して迅速にスクリーニングするために存在する。
【００７６】
次いで、この最初のスクリーニングから選択された１つ以上の抗体改変体が、親抗体に対して増強された結合親和性についてスクリーニングされ得る。結合親和性を決定するための１つの一般的な方法は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて会合速度定数および解離速度定数を評価することによる方法である。バイオセンサーチップは、製造元（ＢＩＡｃｏｒｅ）の指示に従って、標的の共有結合のために活性化される。次いで、標的は、希釈され、そしてチップ上に注入されて、固定材料の反応ユニット（ＲＵ）におけるシグナルを得る。ＲＵのシグナルは、固定材料の質量に比例するので、このシグナルは、マトリックス上の固定された標的密度の範囲を示す。解離データは、一部位モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｍｏｄｅｌ）に適合されて、ｋｏｆｆ ＋／− ｓ．ｄ．（測定の標準偏差）を得る。偽第一次速度定数（ｋｓ）は、各会合曲線について計算されて、タンパク質濃度の関数としてプロットされてｋｏｎ ＋／− ｓ．ｅ．（適合の標準誤差）を得る。結合の平衡解離定数ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＳＰＲ測定から計算される。平衡解離定数ＫＤは、ｋｏｆｆに反比例するので、親和性改善の推定は、会合速度（ｋｏｎ）が全改変体について一定であると仮定して行われ得る。
【００７７】
得られた高親和性を有する候補は、必要に応じて、１つ以上のさらなる生物学的活性アッセイに供されて、増強された結合親和性を有する抗体改変体が、さらに所望される治療特性を保有することを確認し得る。例えば、抗ＩｇＥ抗体の場合、ＩｇＥのレセプターへの結合をブロックし、ヒスタミンの放出を阻害するものについてスクリーニングし得る。最適な抗体改変体は、親抗体よりも有意に高い結合親和性で標的に結合する能力を保有する。
【００７８】
そのようにして選択された抗体改変体は、多くの場合抗体の意図された用途に依存して、さらなる改変に供され得る。このような改変は、アミノ酸配列のさらなる変化、異種ポリペプチドとの融合、および／または以下に詳述されるような共有結合性の改変を含む。例えば、抗体の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基が、一般的にセリンによって置換されて、分子の酸化的安定性を改善し得、そして異常な交差結合を防止し得る。逆に、システイン結合が抗体に付加されて、（特に、この抗体が、Ｆｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）その安定性を改善し得る。
【００７９】
（ベクター）
本発明はまた、本明細書において開示されるような抗体改変体をコードする単離された核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに上記抗体改変体の生成のための組み換え技術を提供する。抗体改変体の組み換え生成のため、それをコードする核酸が単離され、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のため、複製可能なベクターに挿入される。抗体改変体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、この抗体改変体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列決定される。
【００８０】
多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素としては、一般的に以下の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列。
【００８１】
図１に示されるファージ発現ベクターは、一般的に使用されるＭ１３ベクターと、迅速な分泌のためおよび適切な結合特異性および最低の親和性基準に関して改変体Ｆａｂをスクリーニングするため、Ｍ１３の自身の遺伝子ＩＩＩウイルス分泌シグナルとから構成される。このベクターは、全遺伝子ＩＩＩ配列を使用せず、したがって細菌細胞の表面上に表示が存在しないが、Ｆａｂはペリプラズム空間に分泌される。あるいは、Ｆａｂは、細胞質中で発現され得、そして単離され得る。重鎖および軽鎖の各々は、それら自身の分泌シグナルを有するが、単一の強力な誘導プロモーターに依存して発現される。
【００８２】
図１におけるベクターはまた、容易な精製および検出のために、Ｈｉｓタグおよびｍｙｃタグを提供する。当業者は、Ｆａｂが、別個のプロモーターから独立して発現され得るか、または分泌シグナルが選択されたウイルス配列である必要はないが、選択された宿主細胞からの抗体フラグメントの分泌に適切な原核生物もしくは真核生物のシグナル配列であり得ることを認識する、重鎖および軽鎖が異なるベクター上に位置していてもよいことが、また認識されるべきである。
【００８３】
（Ａ．シグナル配列構成要素）
本発明の抗体改変体は、組み換え的に生成され得る。この改変体はまた、異種ポリペプチド（好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチド）と融合された融合ポリペプチドとして発現され得る。好んで選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。ネイティブ抗体シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列によって置換され得る。あるいは、図１のベクターの場合、選択されたシグナル配列は、遺伝子ＩＩＩ由来のウイルスシグナル配列であった。酵母分泌については、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ α因子リーダーが挙げられる）もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、または、例えば国際公開番号９０／１３６４６において記載されるシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が利用可能である。このような前駆領域のためのＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、抗体改変体をコードするＤＮＡに連結される。
【００８４】
（Ｂ．複製起点の構成要素）
ベクターは、通常、ベクターが１種以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡと独立に複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自立的に複製する配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に対して適切であり、２μプラスミド起点は、酵母に対して適切であり、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶもしくはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のベクターに対して有用である。一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むので、代表的に唯一使用され得る）。
【００８５】
（Ｃ．選択遺伝子構成要素）
ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも称される）を含み得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養素要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属にとってのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【００８６】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を利用する。異種遺伝子によって首尾よく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、したがって選択レジメンを生き延びる。このような優性選択の例は、薬物（ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシン）を使用する。
【００８７】
哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの別の例は、抗体核酸（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものである。
【００８８】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、全ての形質転換体をメトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養培地中で培養することによって、最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが利用される場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【００８９】
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列によって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、上記選択マーカーに対する選択因子（例えば、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８（米国特許第４，９６５，１９９号）））を含む培地中での細胞増殖によって選択され得る。
【００９０】
酵母中での使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹｒｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の改変体系統（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６もしくはＰＥＰ４−１）に対する選択マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損性酵母系統（ＡＴＣＣ ２０，６２２もしくは３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補完される。
【００９１】
（Ｄ．プロモーター構成要素）
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、かつ抗体核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主とともに使用するために適切なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結された、シャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【００９２】
プロモーター配列は、真核生物に関して知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始部から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域である（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
【００９３】
酵母宿主とともに使用するための適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ）に対するプロモーターが挙げられる。
【００９４】
他の酵母プロモーター（増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導プロモーター）は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース利用およびガラクトース利用を担う酵素に対するプロモーター領域である。酵母発現において使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【００９５】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、トリポックスウイルス、アデノウイルス２のようなアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）、熱ショックプロモーターによって制御される（ただし、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする）。
【００９６】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして、都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの極初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変形態は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。あるいは、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡは、マウス細胞において、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下で発現された。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）が、プロモーターとして使用され得る。
【００９７】
（Ｅ．エンハンサーエレメント構成要素）
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から知られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）。しかし代表的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関する、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して５’位置または３’位置において、ベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターの５’部位に位置する。
【００９８】
（Ｆ．転写終止構成要素）
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、もしくは他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終止のためおよびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含み得る。このような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの、５’非翻訳領域から、そしてときには３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写される、ヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終止構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。例えば、国際公開番号９４／１１０２６を参照のこと。
【００９９】
（宿主細胞の選択および形質転換）
本明細書中に記載のベクターにＤＮＡをクローニングまたは発現させるのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物としては、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、エルウィニア属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、サルモネラ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属およびＳｈｉｇｅｌｌａ属などの腸内細菌、ならびにバチルス属、シュードモナス属およびストレプトミセス属）の両方が挙げられる。一つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）のような他の菌株も適している。これらの例は、限定的ではなく、むしろ例示的である。
【０１００】
原核生物に加えて真核生物微生物（例えば、糸状菌または酵母）は、抗体をコードするベクターのための適したクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、下等真核宿主微生物の内で最も一般的に使用される。しかし、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａおよび糸状菌（例えば、アカパンカビ属、ペニシリウム属、イトクズグサ属およびコウジカビ属（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ）の宿主などの他の多数の属、種および菌株が、本明細書中で一般的に利用可能であり、そして有用である。
【０１０１】
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。第一に、脊椎動物培養または無脊椎動物培養に由来しようと、任意の高等真核細胞培養が機能し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６、４７〜５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｅｔｌｏｗら編、第８巻、ｐ．２７７−２７９（Ｐｌｅｎａｍ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９８６）；Ｍｓｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ 第３１５巻、５９２〜５９４（１９８５））。多数のバキュロウイルス株および改変体ならびに宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、ヤブカ属（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１改変体、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）が、公けに利用可能であり、このようなウイルスが、本発明による本明細書中のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに使用され得る。さらに、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用される。
【０１０２】
脊椎動物細胞および培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、慣例的になっている。Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）を参照のこと。有用な哺乳動物宿主細胞系統の例は、サル腎臓系統、ヒト胚腎臓系統、生まれたばかりのハムスターの腎臓細胞；チャイニーズハムスターの卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０）；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝細胞；マウス乳腺癌；およびＮＳ０細胞である。
【０１０３】
宿主細胞は、抗体産生のために上記ベクターで形質転換され、プロモーターを含むため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切なものとして改変された通常の栄養培地で培養される。
【０１０４】
本発明の抗体改変体を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号；同第４，５６０，６５５号；同第５，１２２，４６９号；同第５，７１２，１６３号または同第６，０４８，７２８号に記載される任意の培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれもが、必要な場合、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または表皮増殖因子）、塩（例えば、Ｘ塩化物、ここで、Ｘは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウムである；およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ．ＴＭ．薬物）、痕跡元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な補充物はまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞にこれまで用いられてきたものであり、当業者に明らかである。
【０１０５】
（抗体精製）
組換え技術を使用する場合、抗体改変体は、細胞内で産生され得るか、ペリプラズム空間で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体改変体が、細胞内で産生される場合、第一の工程として、粒状の破片である、宿主細胞の断片または溶解した断片のいずれかは、例えば、遠心分離または限外濾過により取り除かれ得る。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記述する。手短かには、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって溶解する。細胞の破片は、遠心分離によって取り除かれ得る。抗体改変体が、培地中に分泌される場合、そのような発現系由来の上清は、一般的には最初に市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、前の工程のいずれかに例えば、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターが含まれてもよく、外来性の夾雑物の増殖を防止するために抗生物質が含まれてもよい。
【０１０６】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体改変体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖またはヒトＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７〜１５７５（１９８６））。親和性リガンドが取り付けられるマトリクスは、多くの場合アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス（例えば、調節された多孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は、アガロースを用いて達成され得るより早い流速および短いプロセス時間を可能にする。抗体改変体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂もしくはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上のヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィーによるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための技術がまた回収されるべき抗体改変体によって利用可能である。
【０１０７】
任意の予備精製工程の後、目的の抗体改変体および夾雑物を含む混合物は、約２．５〜４．５の間のｐＨで、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で、溶出緩衝液を使用して、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【０１０８】
（薬学的処方物）
ポリペプチドまたは抗体の治療処方物は、凍結乾燥処方物または水溶液として保存するために、所望の程度の精製度を有するポリペプチドを、当該分野で代表的に利用される任意の「薬学的に受容可能な」キャリア、賦形剤または安定化剤（これらは全て「賦形剤」と称される）と混合することにより調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および他の種々の添加剤である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．Ｏｓｏｌ編（１９８０）を参照のこと）。このような添加剤は、用いられる投薬量および濃度では、レシピエントに対して無毒性でなければならない。
【０１０９】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲にｐＨを維持するのを補助する。それらは、好ましくは約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明に使用するための適した緩衝剤としては、有機酸とその塩および無機酸とその塩の両方が挙げられ、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウムの混合物、クエン酸三ナトリウムの混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウムの混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウムの混合物、コハク酸−水酸化ナトリウムの混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウムの混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウムの混合物、酒石酸−酒石酸カリウムの混合物、酒石酸−水酸化ナトリウムの混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウムの混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウムの混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウムの混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウムの混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩（例えば、Ｔｒｉｓ）が言及され得る。
【０１１０】
保存剤は、微生物の増殖を妨げるために添加され得、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加され得る。本発明に使用するための適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
【０１１１】
「安定化剤」として公知であることもある等張化剤は、本発明の液体組成物の等張性を確実にするために添加され得、多価糖アルコール、好ましくは三価アルコールまたはそれより多価の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール）が挙げられる。
【０１１２】
安定化剤は、治療剤を溶解させるか、または変性もしくは容器の壁への付着を防止するのを補助する充填剤から添加剤の機能の範囲であり得る広い範疇の賦形剤をいう。代表的な安定化剤は、多価糖アルコール（上記で列挙した）；アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖または糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクティトール、グリセロールなど、イノシトールなどのシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）および三糖（例えば、ラフィノース）；多糖（例えば、デキストラン）であり得る。安定化剤は、活性タンパク質の重量部あたり０．１〜１０，０００の重量の範囲で存在し得る。
【０１１３】
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても公知である）は、治療剤の可溶化を補助するため、および治療タンパク質を攪拌に誘導される凝集に対して保護するために添加され得、また処方物が、タンパク質の変性を引き起こすことなく、圧力を加えた剪断表面に露出されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０１１４】
さらなる種々の賦形剤としては、充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が挙げられる。本明細書中の処方物はまた、必要な場合、処置される特定の適応症に必要な一種より多い活性化合物、好ましくは互いに不利に影響しない相補的活性を有する化合物を含有し得る。例えば、さらに免疫抑制剤を提供することが望ましくあり得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量で、組合せて適切に存在する。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、または例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルそれぞれのコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン）中での界面のポリマー化により調製されたマイクロカプセルに閉じ込められ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．Ｏｓａｌ編（１９８０）に開示される。
【０１１５】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌性でなければならない。このことは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例としては、抗体改変体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形した物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解酢酸ビニルエチレン、分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸のコポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能マイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。例えば、酢酸ビニルエチレンと乳酸−グリコール酸ポリマーは、１００日間に亘って分子の放出を可能にし、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。封じ込められた抗体が、体内に長い期間保持される場合、それらは、３７℃にて湿気に曝露された結果として変性し得るか、または凝集し得、生物学的活性の喪失および免疫原性における可能な変化を生じる。合理的な方法は、関係する機構に依存して安定化のために、工夫され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介した細胞間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変することによって、酸性溶液から凍結乾燥することによって、含水量を制御することによって、適切な添加剤を使用することによって、そして、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１１６】
特定の障害または状態の処置に有効である治療ポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの量は、障害もしくは状態の性質に依存し、そして、標準的な臨床技術により決定され得る。可能な場合、用量−応答曲線を決定し、ヒトで試験する前に、最初にインビトロで、次いで有用な動物モデル系で本発明の薬学的組成物を決定することが望ましい。
【０１１７】
好ましい実施形態において、治療ポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの水溶液は、皮下注射によって投与される。各用量は、体重１ｋｇあたり約０．５μｇ〜約５０μｇの範囲であり得るか、またはより好ましくは、体重１ｋｇあたり約３μｇ〜約３０μｇの範囲であり得る。
【０１１８】
皮下投与のための投薬計画は、多数の臨床的因子（疾患の型、疾患の重篤度、および治療剤に対する患者の感受性）に依存して一ヶ月に一回から一日一回に変動し得る。
【０１１９】
（抗体改変体の使用）
本発明の抗体改変体は、親和性精製因子として使用され得る。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野で周知の方法を使用して、固相（例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ樹脂、またはろ紙）上に固定される。固定された抗体改変体は、精製されるべき標的を含むサンプルと接触され、その後、その支持体は、精製されるべき標的を除いてサンプル中の実質的に全ての物質を取り除く適した溶媒で洗浄される。その支持体は、固定された抗体改変体結合される。最後に、その支持体は、標的を抗体改変体から放出する別の適切な溶媒（例えば、グリシン緩衝液）で洗浄される。
【０１２０】
改変抗体はまた、診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織または血清における目的の標的の発現の検出）に有用であり得る。診断適用について、抗体改変体は、代表的に検出可能部分で標識される。多数の標識が、蛍光の変化を定量するために利用可能な技術であり、上に記した。化学発光基質は、化学反応により電気的に励起され、次いで、放射光は、（例えば、化学発光計を使用して）測定され得るか、または蛍光受容体にエネルギーを供与し得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合するための技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７３：１４７〜１６６（１９８１）中のＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙに記載されている。
【０１２１】
標識は、抗体改変体と間接的に結合されることもある。当業者は、このことを達成するための種々の技術を知っている。例えば、抗体改変体は、ビオチンと結合され得、上記の３種の広範な範疇の標識のいずれかが、アビジンと結合され得、逆もまた同様である。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、従って標識は、この間接的な様式で抗体改変体と結合され得る。あるいは、標識の抗体改変体との間接的な結合を達成するために、抗体改変体は、小型のハプテン（例えば、ジグロキシン（ｄｉｇｌｏｘｉｎ））と結合され、上記の異なる型の標識の一つが、抗ハプテン抗体改変体（例えば、抗ジグロキシン抗体）と結合される。従って、標識の抗体改変体との間接的な結合は、達成され得る。
【０１２２】
本発明の別の実施形態において、抗体改変体は、標識される必要はなく、その存在は、抗体改変体に結合する標識された抗体を使用して検出され得る。
【０１２３】
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイ）で使用され得る。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．１４７〜１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９８７）。
【０１２４】
競合結合アッセイは、標識された標準が、限られた量の抗体改変体との結合について試験サンプルと競合する能力に依存する。試験サンプル中の標的の量は、抗体に結する標準の量に反比例する。結合する標準の量の決定を容易にするために、抗体は、一般的に、競合の前か後に、不溶化される。結果として、抗体に結合する標準サンプルおよび試験サンプルは、結合しないままである標準サンプルおよび試験サンプルから好都合に分離され得る。
【０１２５】
サンドイッチアッセイは、二つの抗体の使用を伴い、それぞれは、検出されるべき、異なる免疫原性部分またはエピトープまたはタンパク質に結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、分析されるべき試験サンプルは、固体支持体上に固定された一次抗体によって結合され、その後、二次抗体は、試験サンプルに結合し、それによって不溶性の３つの部分の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。二次抗体はそれ自体、検出可能な部分で標識され得る（直接サンドイッチアッセイ）か、または検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、一つの型のサンドイッチアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１２６】
免疫組織化学に関して、腫瘍サンプルは、新鮮であっても凍結されていてもよく、パラフィンに包埋されていても保存剤（例えばホルマリン）で固定されていてもよい。
【０１２７】
その抗体はまたインビボ診断アッセイに使用され得る。一般的に、抗体改変体は、放射性ヌクレオチド（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識されて、その結果腫瘍は、免疫シンチグラフィを使用して局在化され得る。例えば、本発明の高親和性抗ＩｇＥ抗体は、例えば、喘息患者の肺に存在するＩｇＥの量を検出するために使用され得る。
【０１２８】
本発明の抗体は、キット、すなわち、診断アッセイを行なうための指示書を備える、所定量の試薬のパッケージングした組合せで提供され得る。抗体改変体が、酵素で標識される場合、そのキットは、酵素に必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を備え得る。さらに、他の添加剤（例えば、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）など）が含まれ得る。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために、大きく変動し得る。特に、試薬は、溶解の際に、適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、乾燥粉末、通常は、凍結乾燥した粉末として提供され得る。
【０１２９】
（抗体のインビボ使用）
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために使用され得ることが企図される。一実施形態において、この抗体は、例えば、前臨床データを得る目的で、非ヒト哺乳動物に投与される。処置されるべき例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および前臨床研究が行われる他の哺乳動物が挙げられる。このような哺乳動物は、この抗体を用いて処置されるべき疾患に対する確立された動物モデルであり得るか、または、目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、用量増大研究が、哺乳動物に対して行なわれ得る。この抗体またはポリペプチドは、任意の適切な手段で投与され、その手段としては、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、鼻腔内投与が挙げられ、局所的な免疫抑制処置について所望の場合、病巣内投与が挙げられる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。さらに、抗体改変体は、パルス注入、特に低下用量の抗体改変体を用いたパルス注入により適切に投与される。好ましくは、この用量は、注射によって与えられ、最も好ましくは、投与が、短期であるか、長期であるかに一部依存して、静脈内注射または皮下注射によって与えられる。
【０１３０】
疾患の予防または処置のために、適切な投薬量の抗体またはポリペプチドは、処置されるべき疾患の型、疾患の重篤度および過程、抗体改変体が、予防目的または治療目的で投与されたか否か、これまでの治療、患者の臨床履歴および抗体改変体に対する応答、および主治医の裁量に依存する。本発明の非常に高い親和性の抗ヒトＩｇＥ抗体は、患者に、一時に、または一連の処置にわたって適切に投与され得る。疾患の型および重篤度に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための初期候補投薬量であり、この量は例えば、一回以上の別個の投与であっても、連続注入であってもよい。代表的な毎日の投薬量は、上記の因子に依存して、約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日以上に亘る繰り返しの投与については、その条件に依存して、その処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持される。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。抗ＬＦＡ−１抗体または抗ＩＣＡＭ−１抗体についての例示的な用量レジメンは、国際公開番号９４／０４１８８に開示される。抗体改変体組成物は、良好な医療行為と一致した様式で処方され、投薬され、投与される。この文脈において、考慮のための因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医師に公知の他の因子が挙げられる。投与されるべき抗体改変体の「治療有効量」は、このような考慮すべき事項によって決定され、疾患または障害を予防するか、改善するか、または処置するために必要である最少量である。この抗体改変体は、必ずしもではないが、必要に応じて、問題の障害を予防または処置するために現在使用されている一種以上の薬剤と一緒に処方される。このような他の薬剤の有効量は、処方物中に存在する抗体の量、障害または処置の型、および上で考察した他の因子に依存する。これらは、一般的に同じ投薬量で、上で使用した投与経路で、またはこれまでに用いた投薬量の約１〜９９％で使用される。
【０１３１】
ＩｇＥをその標的として認識する本発明の抗体は、「ＩｇＥ媒介性障害」を処置するために、使用され得る。これらとしては、例えば、ぜん息、アレルギー性鼻炎およびアレルギー性結膜炎（枯草熱）、湿疹、じんま疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーのような疾患が挙げられる。例えば、蜂に刺されること、蛇にかまれること、食物または薬物によって引き起こされるアナフィラキシーショックの深刻な生理学的状態もまた本発明の範囲に包含される。
【０１３２】
（抗体エピトープマッピング）
用語「エピトープ」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が抗原に対して応答する部位をいう。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次元のフォールディングによって並列する連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、代表的に、変性溶媒に曝露されて保持されるのに対して、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、代表的に変性溶媒を用いた処理に対して失われる。エピトープは、代表的に、少なくとも３個、より通常は、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を、固有の空間コンフォメーションに含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫学的検定において同定され得る。
【０１３３】
本発明の高親和性抗体ＩｇＥに対する結合部位のエピトープマッピングは、結合についてのウエスタンブロット分析、ＩｇＥのＣＨ３ドメインのペプチドスキャン、結合を示した領域のアラニン走査、ＩｇＧ１の対応する領域からのアミノ酸置換および特定部位の変異誘発を含む。
【０１３４】
ＩｇＥの全ＣＨ３ドメインのペプチドスキャンは、７３個の重複するペプチドを必要とした。各ペプチドを、本発明の標識した抗ＩｇＥ抗体による結合に供し、ＩｇＥの、その高親和性レセプターへの結合をブロックするＩｇＥの特異的なエピトープを決定した。ペプチドスキャンは、二つのペプチドを、ＩｇＥ上の潜在的な抗ＩｇＥ ＭＡｂ接触部位と同定し、エピトープ「Ａ」およびエピトープ「Ｂ」と名付けた（図１１を参照のこと）。エピトープ「Ａ」配列およびエピトープ「Ｂ」配列は、直鎖状配列で約８０アミノ酸離れているが、ＩｇＥの三次元構造では互いに近くに位置している。両方とも表面に露出されていて、それらは、ＩｇＥのＦｃεＲＩ結合部位に重複し、両方ともペプチドであり、Ａｒｇの正に荷電した残基およびＰｒｏの疎水性残基が存在する。図１２は、ペプチドスキャンを使用してＥＬＩＳＡにより決定したエピトープＢの結合領域を図示する。
【０１３５】
どのアミノ酸残基が、これらのエピトープ内での高親和性抗体の結合に重要であるかの決定を、アラニンスキャニング変異誘発によって行なった（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、「Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈＧＨ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ａｌａｎｉｎｅ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、ｐ．１０８１〜１０８５）。エピトープＡおよびエピトープＢの各残基の代わりに、アラニンを用い、高親和性モノクローナル抗体の結合を決定した（実施例１２の下ならびに図１３および図１４を参照のこと）。
【０１３６】
（能動免疫および受動免疫）
本発明はまた、薬学的組成物（例えば、配列番号７２および／または配列番号７４を含む本発明のペプチド免疫源分子、ならびに希釈剤、賦形剤、アジュバントまたはキャリアを含有するワクチン）に関する。本発明は、さらに、本発明の少なくとも一つのペプチドを、そのペプチドに対する免疫応答を誘発し得る部分と共有結合させる工程を包含する、本発明の免疫源の調製のためのプロセスに関する。
【０１３７】
本発明はまた、例えば、ＩｇＥ媒介性疾患またはＩｇＥ媒介性状態（例えば、アレルギーおよびアトピー性皮膚炎）の処置における医薬として使用するための上に定義された免疫原性ペプチドに関する。
【０１３８】
本発明はさらに、上に定義する免疫原性ペプチドの治療有効量を、そのような処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、ＩｇＥ媒介性疾患またはＩｇＥ媒介性状態（例えば、アレルギーおよびアトピー性皮膚炎）に対して哺乳動物を免疫状態にする方法に関する。
【０１３９】
本発明の免疫原性ペプチドは、非細胞溶解性のヒスタミン放出を実質的に媒介し得ないが、エピトープＡおよび／またはエピトープＢの標的アミノ酸配列との血清学的な強い交差反応性を抗体に誘発し得る。
【０１４０】
ペプチドの初期用量（例えば、約０．２ｍｇ〜約５ｍｇ）が、例えば、筋肉内に投与され得、その後１４日後〜２８日後に、同じ用量で繰り返し投与される（追加抗原）。用量は、当然のことながらある程度は、患者の年齢、体重、全体的な健康に依存する。免疫処置は、「能動的」または「受動的」であり得る。「能動」免疫において、被験体は、本発明の免疫原性ペプチドを受容し、抗ＩｇＥ応答が、被験体の免疫系によって能動的に誘導される。
【０１４１】
「能動」免疫、これは、ヒト使用について好ましいが、他の哺乳動物種（例えば、イヌ）も同様に処置され得る。用語「免疫原性キャリア」は、本明細書中では、宿主動物内で免疫原性応答を独立に誘発する特性を有し、ポリペプチドおよび免疫原性キャリア物質の対応する基の中の遊離のカルボキシル基、アミノ基またはヒドロキシル基の間のペプチド結合またはエステル結合の形成を介して、または、従来の二官能性連結基を介した結合、または融合タンパク質として直接ポリペプチドに共有結合し得る物質を包含する。
【０１４２】
このような免疫原性キャリアの例としては、以下：アルブミン（例えば、ＢＳＡ）；グロブリン；サイログロブリン；ヘモグロブリン；ヘモシアニン（特に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））；回虫属から抽出したタンパク質（例えば、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１巻、（１９７３）２６０〜２６８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２２巻、（１９７９）３０２〜３０８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、９８巻、（１９６７）８９３〜９００、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９巻、（１９６０）５７５〜５７８に記載される回虫属抽出物またはその精製産物）；ポリリシン；ポリグルタミン酸；リシン−グルタミン酸コポリマー；リシンまたはオルニチンなどを含むコポリマーなどが挙げられる。ワクチンは、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドを免疫原性キャリア物質として使用して産生され（Ｌｅｐｏｗ Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第１５０巻、（１９８４）４０２〜４０６；Ｃｏｅｎ Ｂｅｕｖｅｒｙ，Ｅ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第４０巻、（１９８３）３９〜４５）、これらのトキソイド物質はまた、本発明に使用され得る。ツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）は、（１）それ自体ではＴ細胞応答を誘導せず（すなわち、それは、事実上「Ｔ細胞ハプテン」である）、なお十分にプロセスされた抗原として挙動し、従ってＴ細胞により認識される；（２）連結した認識様式では、最も強力なハプテン「キャリア」の一つであることが公知である；そして（３）さらなる試験を行なわずに、ヒトにおいて使用され得るので、「能動」免疫スキームにおける利用に特に好ましい。
【０１４３】
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクターおよびこのベクターを有する細胞に関する。さらに、能動免疫は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することにより達成され得る。このような治療に適したベクターは、当該分野で公知であり、例えば、アデノウイルスベクターが挙げられる。
【０１４４】
「受動」免疫は、本発明の抗ＩｇＥ抗体を、ＩｇＥ媒介性疾患またはＩｇＥ媒介性状態を罹患する患者に投与することによって達成される。これらの抗体は、本発明の免疫原性ペプチドを非ヒト哺乳動物に投与し、生じた抗血清を収集することにより調製され得る。改善された力価は、長期間にわたる繰り返しの注射によって獲得され得る。抗体を誘発するために使用され得る哺乳動物の種に特に制限はなく、一般的には、ウサギまたはモルモットを使用することが好ましいが、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツジなども使用され得る。抗体は、最後の投与の後、１〜２週間の経過後、免疫状態にした動物から血液を収集し、血液を遠心分離し、血清を血液から単離することにより回収される。モノクローナル抗体は、例えば、ヒトまたはマウスのものであり得る。
【０１４５】
被験体を免疫状態にする場合、本発明の抗体は、哺乳動物に、例えば、筋肉内注射により導入され得る。しかし、抗体投与の任意の形態が使用され得る。被験体に許容され、有害な副作用を有さない任意の従来の液体または固体のビヒクルが、使用され得る。生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ約６．８〜７．２、好ましくはｐＨ約７．０）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、それのみでビヒクルとして、または例えば、水酸化アルミニウムベースのアジュバントなどの適切なアジュバントと一緒にビヒクルとして使用され得る。
【０１４６】
以下の実施例は、限定の目的で提供されるのではなく、例示の目的で提供される。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１）
（抗ＩｇＥマウスＭＡｂ ＴＥＳ−Ｃ２１のヒト化）
マウスｍＡｂ ＴＥＳ−Ｃ２１の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を、公開されたデータベースで利用可能なヒト抗体生殖細胞系配列と比較した。上記工程１に記載されるテンプレートを決定する場合、いくつかの基準を用い、これらの基準としては、全長、フレームワーク内の類似したＣＤＲ位置、全体の相同性、ＣＤＲの大きさなどが挙げられる。これらの基準は全てひとまとめにして、ＴＥＳ−Ｃ２１ＭＡｂ重鎖配列とＴＥＳ−Ｃ２１ＭＡｂ軽鎖配列との間の配列アラインメント、ならびに図３Ａおよび図３Ｂに示されるそれぞれのヒトテンプレート配列に示される最適なヒトテンプレートを選択するための結果を提供する。
【０１４８】
この場合、この抗体を設計するために、一種より多いヒトフレームワークテンプレートを使用した。ＶＨ鎖に対して選択されたヒトテンプレートは、ＤＰ８８（アミノ酸残基１〜９５）とＪＨ４ｂ（アミノ酸残基１０３〜１１３）との組合せであった（図３Ｂを参照のこと）。ＶＬ鎖に対して選択されたヒトテンプレートは、ＪＫ４（アミノ酸残基９８〜１０７）と合わせたＬ１６（ＶＫサブグループＩＩＩ、アミノ酸残基１〜８７）の組合せであった（図３Ａを参照のこと）。マウス配列とヒトテンプレートとの間のフレームワーク相同性は、ＶＨに関して約７０％、ＶＬに関して約７４％であった。
【０１４９】
一旦テンプレートを選択すると、ＤＮＡ合成、および上に記載され、そして図２に示されるオーバーラッピングＰＣＲによりＦａｂライブラリーを構築した。このライブラリーは、それぞれ選択されたヒトテンプレートであるＤＰ８８／ＪＨ４ｂおよびＬ１６／ＪＫ４を用いて合成した合成ＴＥＳ−Ｃ２１ ＣＤＲからなった。このライブラリーの複雑さは、４０９６（＝２１２）であった。部分的なＶＨ配列およびＶＬ配列をコードする重複するヌクレオチドを、１８〜２１のヌクレオチドの重複を有する約６３〜約７６のヌクレオチドの範囲で合成した。
【０１５０】
ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅を、フレームワーク領域ＦＲ１に対する特異的配列を含むビオチン化フォワードプライマーおよびリーダー配列（遺伝子ＩＩＩ）の末端にアニーリングした突出配列および保存された定常領域（ＣＫまたはＣＨ１）由来のリバースプライマーを使用して、標準ＰＣＲ条件下で行なった。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動、または市販のＰＣＲ精製キットにより精製し、取り込まれなかったビオチン化プライマーおよび非特異的ＰＣＲ産物を取り除いた。
【０１５１】
ＰＣＲ産物の５’リン酸化を、２μｇのＰＣＲ産物、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μＬ）、２μＬの１０×ＰＮＫ緩衝液、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰを用いて、ｄｄＨ２Ｏで、総体積２０μＬに調節して行なった。３７℃にて４５分間インキュベートした後、６５℃にて１０分間加熱変性し、次の工程のために、ｄｄＨ２Ｏを添加して反応体積を２００μＬに調節した。
【０１５２】
１００μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズを、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２度洗浄し、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液に再懸濁した。リン酸化ＰＣＲ産物を、ビーズと混合し、室温（ＲＴ）で穏やかに振盪しながら１６分間インキュベートした。
【０１５３】
このビーズを、沈降させ、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２度洗浄した。非ビオチン化ｓｓＤＮＡ（マイナス鎖）を、３００μＬの新鮮に調製した０．１５ＭのＮａＯＨで、室温で穏やかに振盪しながら１０分間溶出した。第二のＮａＯＨ溶出は、収率をわずかに増加させ得る（任意）。溶離液を遠心分離して、微量のビーズを完全に取り除いた。
【０１５４】
ｓｓＤＮＡを、１μＬグリコゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）、１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）および２．５体積のＥｔＯＨを添加することにより、上清から沈殿させた。次いで、沈殿したｓｓＤＮＡを、７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、その後、３分間凍結乾燥し、２０μＬのｄｄＨ２Ｏに溶解した。ｓｓＤＮＡを、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）アガロースプレート上に、ＤＮＡ標準と一緒にスポッティングすることにより定量するか、またはＯＤ２６０を測定することにより定量した。
【０１５５】
（実施例２）
（ＶＨおよびＶＬのファージ発現ベクターへのクローニング）
ＶＨおよびＶＬをハイブリダイゼーション変異誘発により、ファージ発現ベクターにクローニングした。ウリジン化テンプレートを、ＣＪ２３６ Ｅ．ｃｏｌｉ株（ｄｕｔ「ｕｎｇ」）を、Ｍ１３ベースのファージで感染させることにより調製した（ファージ発現ベクターＴＮ００３）。
【０１５６】
以下の成分（２００ｎｇのウリジン化ファージベクター（８．４９ｋｂ）；９２ｎｇのリン酸化一本鎖Ｈ鎖（４８９塩基）；１００ｎｇのリン酸化一本鎖Ｌ鎖（５２５塩基）；１μＬの１０×アニーリング緩衝液；ｄｄＨ２Ｏで体積を１０μｌに調整）を、８５℃の温度で５分間ＰＣＲ保持（変性）し、次いで、１時間かけて５５℃に低下させることによって（ベクターに対して約８倍のモル比の挿入物において）アニーリングさせた。そのサンプルを氷上で冷却した。
【０１５７】
アニーリングさせた産物に、以下の成分：１．４μＬの１０×合成緩衝液；０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１ユニット／μＬ）；１μＬ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット／μＬ）を添加し、その後、氷上で５分間インキュベートし、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いで、その産物をエタノール沈殿し、１０μＬのｄｄＨ２ＯまたはＴＥに溶解させた。ＤＮＡを、１μＬ のＸｂａＩ（１０ユニット／μＬ）で２時間消化し、６５℃で２０分間加熱不活性化した。消化したＤＮＡを、エレクトロポレーションにより５０μＬのエレクトロコンピーテントＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクトした。生じたファージを、３７℃で一晩、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細菌ローン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌａｗｎ）上で増殖させることにより、力価を測った。クローンを、組成を確認するために、配列決定した。
【０１５８】
（実施例３）
（ライブラリースクリーニングのためのディープウェルでの培養）
（Ａ．ファージライブラリーのプレーティング）
ファージライブラリーを、ＬＢ培地に希釈し、プレートあたりの所望のプラーク数を達成した。高力価のファージを、２００μＬのＸＬ−１Ｂ細胞培養物と混合した。３ｍＬのＬＢの表面の寒天を混合し、ＬＢプレートに注ぎ、室温で１０分間そのままにしておいた。そのプレートを、３７℃にて、一晩インキュベートした。
【０１５９】
（Ｂ．ファージ溶出）
１００μＬのファージ溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を滅菌Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一晩後のライブラリープレート由来の単一のファージプラークを、フィルター処理したピペットチップを用いてウェルに移した。ファージ溶出プレートを、３７℃にて１時間インキュベートした。このプレートをインキュベーションに続いて４℃にて保存し得る。
【０１６０】
（Ｃ．ディープウェルプレートでの培養）
５０ｍＬの培養物由来のＸＬ１Ｂ細胞を、２×ＹＴ培地に、１：１００希釈で添加した。その細胞を、Ａ６００が０．９〜１．２の間になるまで、シェーカー内で３７℃にて増殖させた。
【０１６１】
（Ｃ．ディープウェルプレート内でのファージによる感染）
細胞が適切なＯＤに到達したときに、１Ｍ ＩＰＴＧ（１：２０００）をＸＬ １Ｂ培養物に添加した。ＩＰＴＧの最終濃度は、０．５ｍＭであった。７５０μＬの細胞培養物を９６ウェルのディープウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに移した。各ウェルに、２５μＬの溶出ファージを接種した。このディープウェルプレートをシェーカー（２５０ｒｐｍ）内に配置し、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１６２】
（Ｄ．ＥＬＩＳＡスクリーニングのための上清の調製）
インキュベーション後、このディープウェルプレートを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ−５．３プレートローターを使用して、３，２５０ｒｐｍにて２０分間遠心した。ＥＬＩＳＡのために、各ウェルから５０μＬの上清を抜き取った。
【０１６３】
（Ｅ．ＸＬ−１細胞の１５ｍＬの液体培養物の接種）
ＸＬ−１を、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２×ＹＴ中で、シェーカー内で（２５０ｒｐｍ）、３７℃にて、Ａ６００が０．９〜１．２になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの最終濃度で添加し、１５ｍＬの培養物を５０ｍＬの円錐管に、各クローンが特徴付けられるように移した。細胞に、高力価ストック（力価＝約１０１１ｐｆｕ／ｍＬ）由来の１０μＬのファージを接種し、３７℃にて１時間インキュベートした。この細胞を、室温で振盪しながら一晩増殖させた。
【０１６４】
（Ｆ．ペリプラズム由来の可溶性Ｆａｂの単離）
この細胞を、４，５００ｒｐｍでの２０分間のＩＥＣ遠心分離にて、ペレット化した。培養培地を取り除き、ペレットを、６５０μＬの再懸濁緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡおよび５００ｍＭのスクロースを含有する、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ボルテックスし、その後穏やかに振盪しながら１時間氷上に配置した。細胞の破片を、４℃で、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより取り除いた。可溶性Ｆａｂを含む上清を、収集し、そして４℃にて保存した。
【０１６５】
（実施例４）
（フレームワーク改変）
フレームワーク内の上記の潜在的に重要な位置に、１２個のマウス／ヒトのゆらぎ残基が存在する。ＶＨの７３位は、ヒト化ライブラリーでは、マウス残基スレオニンとして維持されていた。なぜならこの位置は、結合に影響を及ぼすと確定されたからである。しかし、ＶＨ７３のスレオニンが、ヒト生殖細胞系ＶＨサブグループ１および２の共通のヒト残基であることが示された。
【０１６６】
ＴＥＳ−Ｃ２１配列とヒトテンプレートとの間で異なるフレームワーク残基を、上記のように無作為に置換し、次いで、標的結合および抗体フォールディングに対するその潜在的な影響について評価した。結合に影響し得る潜在的なフレームワーク残基を同定した。この場合、それらは、ＶＨの残基１２、２７、４３、４８、６７、６９であり、ＶＬの残基１、３、４、４９、６０、８５であった（Ｋａｂａｔ記数法）（図４を参照のこと）。２７位および６９位のみが、ＶＨ領域（クローン番号１１３６−２Ｃ）の結合に顕著に影響することが、後に実証された。
【０１６７】
使用した一次スクリーニングは、培養培地を用いる一点ＥＬＩＳＡ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｏｉｎｔ ＥＬＩＳＡ）（ＳＰＥ）であった（以下の記載を参照のこと）。一次スクリーニングは、抗体の標的分子に結合するクローンを選択した。親分子と等しいか、またはそれより良好なシグナルを与えるクローンを、次のラウンドのスクリーニングのために選択した。
【０１６８】
第２のラウンドのスクリーニングにおいて、個々のファージを、１５ｍｌの細菌培養で増殖させ、ペリプラズム調製物を、ＳＰＥ滴定アッセイおよびＥＬＩＳＡ滴定アッセイのために使用した。このアッセイにおいて、より高い結合を保持しているクローンをさらに特徴付けした。一旦全ての選択された一次クローンを、加工すると、上から１０〜１５％のクローンを配列決定し、そのクローンを配列に従って、配置した。各配列群由来の代表を、互いに比較し、最も良いクローンを選択した。これらの選択されたクローンの配列を合わせ、種々の組合せの効果を評価した。
【０１６９】
構築したライブラリーを、組換えヒトＩｇＥ、ＳＥ４４に対する結合の改善についてＥＬＩＳＡスクリーニングに供した。マウスＴＥＳ−Ｃ２１Ｆａｂより大きい結合親和性を有するクローンを単離し、配列決定した。クローンＩＤ番号４、４９、７２、７６および１３６を、さらに特徴付けした。クローン４、４９、７２、７８および１３６に対するＥＬＩＺＡ滴定曲線を図５Ａおよび図５Ｂに示すが、これは、その親和性が、その親であるＴＥＳ−Ｃ２１に類似していることを示唆する。これらのクローンは、ヒトＩｇＥに対する結合について、マウスＴＥＳ−Ｃ２１と競合し、このことは、結合するエピトープが、ヒト化プロセスの間に変化しなかったことを示唆する。ヒト化Ｆａｂは、ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥに結合せず、このことは、ヒト化抗体が、二価ＩｇＧに構築される場合にヒスタミン放出を引き起こすようにレセプターと架橋するのではなさそうであることを示唆する。ヒト化クローン１３６は、５個のマウス重鎖フレームワーク残基（＝９４．３％のヒトＶＨフレームワークホモロジー）を保持し、親和性成熟により選択された１００％のヒト軽鎖フレームワークを有する。ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合のヒト化Ｆａｂによる阻害を実証した（図６）。
【０１７０】
（実施例５）
（抗ＩｇＥをスクリーニングするための一点ＥＬＩＳＡプロトコル）
プレートを、炭酸塩被覆緩衝液中の２μｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＦｄで、４℃で一晩被覆した。被覆溶液を取り除き、そして、そのプレートを、ウェルあたり２００μＬの３％ ＢＳＡ／ＰＢＳで、３７℃にて１時間ブロックした。プレートを、ＰＢＳ／０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＦａｂサンプル（すなわち、高力価ファージおよびＤＭＢブロックから分泌されたＦａｂもしくはペリプラズム調製物、または１５ｍＬの調製物を含む上清）を添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中に０．０１５μｇ／ｍＬで希釈した５０μＬ／ウェルのビオチン化ＳＥ４４および０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）を添加した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、４×ＰＢＳＴで洗浄した。０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）中に１：２０００で希釈した５０μＬ／ウェルのストレプトアビジンＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、６×ＰＢＳＴで洗浄した。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ 基質（Ｓｉｇｍａ）を添加して展開し、次いで、５０μＬ／ウェルの０．２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。
【０１７１】
（実施例６）
（ＥＬＩＳＡ滴定：抗ＩｇＥ）
プレートを、炭酸塩被覆緩衝液中の０．２５μｇ／ｍＬ（精製したＦａｂ ０．１μｇ／ｍｌ）のＳＥ４４で４℃で一晩被覆した。被覆溶液を取り除き、このプレートを、２００μＬ／ウェルの３％のＢＳＡ／ＰＢＳで、３７℃にて１時間ブロックした。
【０１７２】
このプレートを、ＰＢＳ／０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。５０μＬ／ウェルのＦａｂ（１５ｍＬのペリプラズム調製物由来）を添加して、１：２の希釈で開始して、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に連続的に３倍希釈した。プレートを、室温で２時間インキュベートした。
【０１７３】
このプレートを、ＰＢＳＴで４回洗浄し、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のビオチンヒツジ抗ヒトＦｄの１：１０００希釈（０．８μｇ／ｍｌ）を５０μＬ／ウェルで添加した。このプレートを、再度室温で２時間インキュベートした。
【０１７４】
ＰＢＳＴでの４回の洗浄後、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳおよび０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のＮｅｕｔｒａ−アビジン−ＡＰの１：２０００（０．９μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルで添加し、このプレートを、室温で１時間インキュベートした。
【０１７５】
このプレートを、ＰＢＳＴで４回洗浄した。そして、ｐＮＰＰ基質を５０μＬ／ウェルで添加することにより展開した。展開を、５０μＬ／ウェルの３ＭのＮａＯＨを添加することにより停止させた。各ウェルの吸光度を、４０５ｎｍまたは４１０ｎｍで読み取った。
【０１７６】
（実施例７）
（可溶性Ｆａｂを発現するＭ１３ファージの親和性精製のためのプロトコル）
（Ａ．１日目）
１０ｍｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２つの５００ｍＬ培養物（２×ＹＴ）に、５ｍＬの一晩のストックＸＬ１Ｂを接種し、３７℃にてＡ６００が０．９〜１．２になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの濃度まで添加した。次いで、細胞培養物を、培養あたり２００μＬのファージで感染させ、振盪しながら３７℃にて１時間インキュベートした。感染後、その細胞を２５℃にて一晩振盪しながら増殖させた。
【０１７７】
（Ｂ．２日目）
細胞を、２５０ｍＬの遠心管中で、４℃で、３５００×ｇにて３０分間で、ペレット化した。培養培地を吸引し、ペレットを、合計１２〜１５ｍＬの溶解緩衝液（緩衝液Ａ＋プロテアーゼインヒビターの混液）に再懸濁した。
【０１７８】
【化１】
再懸濁した細胞を、５０ｍＬの円錐管に移し、混合物が、小さな塊として一緒に移動する（溶解に起因して）まで、その管を数回逆さにすることによって、１００μＬの１００ｍｇ／ｍＬのリゾチームに溶解した。細胞を氷上で超音波処理し、その後、１０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（約１０００ユニット）を添加し、４℃にて３０分間穏やかに振動させた。破片を、５０ｍＬの遠心管を用いて、４℃にて、１２０００×ｇにて３０分間遠心することによりペレット化した。上清を新しい円錐管に移し、４℃にて保存した。
【０１７９】
Ｎｉ−ＮＴアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉｓ、ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、可溶性Ｆａｂを精製した。この溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡと混合し、カラムにロードした。流れ出たものを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収集した。このカラムを、２０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのイミダゾール、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）で洗浄し、その後５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾールを２０ｍＬ用いて洗浄した。Ｆａｂを、５００μＬの溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、４５０ｍＭのイミダゾール、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）を用いて６回洗浄し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。カラム画分を、４℃にて保存した。カラム画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、Ｆａｂの量が最も多い画分を選択し、ＰＢＳ中に４℃にて透析した。
【０１８０】
（実施例８）
（可溶性レセプターアッセイ）
ＥＬＩＳＡに適した９６ウェルアッセイプレートを、０．０５ｍＬの０．５μｇ／ｍＬ ＦｃεＲＩα鎖レセプター被覆緩衝液（５０ｍＭ 炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６）で、４〜８℃にて１２時間被覆した。このウェルを吸引し、２５０μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。別個のアッセイプレートにおいて、サンプルおよび参照のＴＥＳ−Ｃ２１ ＭＡｂを、２００μｇ／ｍＬ〜０．００１μｇ／ｍＬまで、アッセイ緩衝液（０．５％ ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１：４希釈して滴定し、等量の１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＩｇＥを添加して、そのプレートを２５℃にて、２〜３時間インキュベートした。ＦｃεＲＩ被覆ウェルを、０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳを用いて三回洗浄し、サンプルウェルから５０μＬを移し、２５℃にて、３０分間攪拌しながらインキュベートした。アッセイ緩衝液に１：２０００で希釈した１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを５０μＬ／ウェルで、３０分間攪拌しながらインキュベートし、次いで、そのプレートを既に述べたように洗浄した。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、発色させた。等量の０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させ、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１８１】
（実施例９）
（抗体のＩｇＥ負荷ＦｃεＲＩに対する結合）
ＦｃεＲＩのαサブユニットと結合したヒトＩｇＥに対する抗体の結合を、１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＥと４℃にて３０分間プレインキュベートすることによって、決定した。プレートを三回洗浄し、その後、種々の濃度のマウス抗ヒトＩｇＥ ＭＡｂ Ｅ−１０−１０またはヒト化Ｆａｂ改変体のどちらかと１時間インキュベートした。Ｆａｂの結合を、ビオチン標識した抗ヒトＦｄ抗体を用いて、その後ＳＡ−ＨＲＰにより検出した。マウスＭＡｂ Ｅ−１０−１０を、ヤギ抗マウスＩｇ Ｆｃ ＨＲＰ結合Ａｂにより検出した。
【０１８２】
（実施例１０）
（クローン特徴付け）
各候補を、結合親和性についてアッセイし、ポジティブクローンを配列決定した。結合親和性を増加させる、ＣＤＲ領域における有益な変異を有する抗体改変体をさらに特徴付けした。アッセイには、Ｂｉａｃｏｒｅ分析；ＩｇＥのレセプターに対するＩｇＥ結合の阻害；およびレセプターが結合したＩｇＥの架橋が含まれる。
【０１８３】
改変体のライブラリーを作製した。親和性を改善することが実証された種々のＣＤＲに対するアミノ酸配列を表１に示す。図７は、置換の組合せを有する高親和性の候補を示す。
【０１８４】
【表１】
１９個の重鎖改変体を図９に示し、３５個の軽鎖改変体を、図８に示す。さらに３個の候補を、結合親和性について特徴付けし、これらを表２に示す。
【０１８５】
【表２】
（実施例１１）
（抗ＩｇＥ抗体の発現および精製ならびにＨＲＰ結合）
高親和性ＭＡｂ候補を生成した。インタクトな抗ＩｇＥ ＭＡｂの生成のために、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をファージベクターテンプレートからＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモーターの発現下で、Ｈ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターに別個にサブクローニングした。６個の全長抗体クローンを構築した。これらを図１０Ａ〜図１０Ｆに示す。適切な重鎖プラスミドおよび適切な軽鎖プラスミドを、当該分野で周知の技術によるエレクトロポレーションを使用して、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０に同時トランスフェクトした。例えば、Ｌｉｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４３巻、第１２号：３９６７〜７５（１９８９）を参照のこと。抗体を、プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して単一の安定な細胞株上清から精製した。抗体の濃度を、２８０ｎｍでのスペクトロフォトメーターおよびＦＣＡアッセイ（ＩＤＥＸＸ）を使用して決定した。
【０１８６】
ペルオキシダーゼ結合キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、精製した抗体に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させた。結合した各抗ＩｇＥ ＭＡｂの力価を、モノクローナルヒトＩｇＥ（ＳＥ４４）で被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【０１８７】
以下の培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【０１８８】
【表３】
この寄託を、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約および特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく規則（ブダペスト条約）の下で行なった。このことは、寄託の日から３０年間生存培養の維持を保証する。この生物は、ブダペスト条約の条件の下でＡＴＣＣにより入手可能にされ、このことは、関連する米国特許の発行の際に、培養の子孫の永久的かつ非制限的な利用可能性を公共に保証する。
【０１８９】
本出願の譲受人は、寄託されたこの培養が、適切な条件下で培養された場合に死滅するか、失われるか、破壊される場合に、通知に対して、同一の培養の生存可能な試料により、ただちに取り替えられることに同意した。寄託した株の利用可能性は、特許法に従って任意の政府の当局に認可された権利に違反して、本発明の実施に対する実施権として解釈されるべきではない。
【０１９０】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施可能にするのに十分であると考えられる。本発明は、寄託した培養物によってその範囲が限定されるべきではない。なぜならば、寄託された実施形態は、本発明の一局面の例示として意図され、機能的に等価である任意の培養物が、本発明の範囲内であるからである。本明細書中の材料の寄託は、本明細書中に含まれる記載が、その最良の形態を含めて、本発明の任意の局面の実施を可能にするのに不適切であるという承認を構成せず、特許請求の範囲の、本明細書が示す特定の例示への制限として解釈されるべきではない。実際、本明細書中に示され、記載される改変に加えて、本発明の種々の改変が、前述の記載から当業者に明らかになり、それらは、添付された特許請求の範囲の範囲内である。
【０１９１】
（実施例１２）
（ヒトＩｇＥの高親和性結合エピトープのマッピング）
（Ａ．ペプチド合成および抗ＩｇＥ結合アッセイ）
研究は、ＩｇＥが、そのＣＨ３ドメインを介してそのレセプターに結合することを示した。本発明のＨＡ 抗ＩｇＥ抗体は、非常に効率的にＩｇＥのそのレセプターへの結合をブロックするので、本発明者らは、全長ＣＨ３ドメインを含むペプチドを使用してエピトープをマッピングした。第一に、本発明者らは、二つのＶ５タグ化したペプチドを調製し、その一つは、ヒトＩｇＥの全長定常領域を含み、もう一つは、ヒトＩｇＥのＣＨ２−ＣＨ３領域のみを含んでいた。これらの二つのペプチドは、インビトロ転写翻訳によって発現し、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂ結合を検出するために、ウエスタンブロットアッセイに使用された。ＣＬ−２ ＣＭＡｂおよびＣＬ−５Ｉ ＭＡｂは両方ともインタクトなヒトＩｇＥに結合し得、両方ともそのペプチドに結合し得る。
【０１９２】
エピトープをより詳細にマッピングするために、ヒトＩｇＥの残基１４１〜３６８のアミノ酸を含み、全長ＣＨ３ドメインを含む７３個の重複するペプチドを合成した。各ペプチドは、上記ペプチドの３’末端と重複する３アミノ酸を有する１２アミノ酸残基からなる。ＳＰＯＴ膜を、セルロース膜上に、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸を用いて合成した。その膜をメタノール中でリンスし、次いで、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）中で、１０分間、３回洗浄した。ブロック溶液（ＴＢＳ中５％乳汁または３％ＢＳＡ）中で一晩インキュベートした後、ブロック溶液に希釈したＨＲＰ標識抗ＩｇＥ ＭＡｂを、膜と一緒に３時間インキュベートした。ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ（登録商標）中で１５分間、３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＩｇＥ反応性を、所望の時間ＢｉｏＭａｘ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ）の化学発光露光することにより測定した。
【０１９３】
この実験の結果は、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂが、ＩｇＥのＣＨ３部分の二つの領域に結合することを示唆し、この二つの領域は、以下の二つのペプチド配列ＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰ（エピトープ「Ａ」）およびＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴ（エピトープ「Ｂ」）により表される（図１２を参照のこと）。エピトープＡに対する結合は、エピトープＢに対する結合より数倍弱かった。
【０１９４】
（Ｂ．アラニンスキャニング変異誘発）
ＩｇＧ１に見出されるアミノ酸とペプチド内のアミノ酸との置換に伴うアラニンスキャニングを、どのアミノ酸が、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂのこれらのペプチドへの結合に決定的に関与しているかを決定するために行なった。ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂ結合に重要であることが決定されたアミノ酸を、ＩｇＥのε鎖におけるインビトロ変異誘発方法を使用して置換した。上に記載されるＣε２領域およびＣε３領域をカバーする別のペプチドをまた、この研究に使用した（図１３および図１４を参照のこと）。
【０１９５】
ヒトＩｇＥアミノ酸残基に対してＥＵ番号付けスキームを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＩｇＥの全長Ｆｃ領域および、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのみを含むＩｇＥ Ｆｃの短縮形態を増幅した。このＤＮＡ産物を、ＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に直接クローニングした。
【０１９６】
ＩｇＥ−Ｆｃにおける変異誘発を、オーバーラッピングＰＣＲ（Ｈｏら、１９８９）を使用して行った。このＤＮＡ産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、適切な制限酵素を用いて消化し、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターにサブクローニングした。各改変体構築物について、ＰＣＲ増幅領域を、ＤＮＡの両方の鎖から、ジデオキシヌクレオチド方法を使用して完全に配列決定した。組換えヒトＩｇＥ Ｆｃおよびその変異体を、網赤血球溶解物ベースのインビトロ転写とインビトロ翻訳との結合システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して発現させた。
【０１９７】
このインビトロ転写とインビトロ翻訳との結合システム（１０μｌの反応混合物）由来の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）に供し、次いで、ニトロセルロース膜に移した。この膜を、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の５％脱脂粉乳を用いてブロックし、その後一次抗体、抗ＩｇＥ ＭＡｂで染色した。特異的な反応バンドを、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）を使用して検出し、その免疫応答性バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ウェスタンブロッティング検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化した。抗Ｖ５抗体を、これらのペプチドのＣ末端に導入されたＶ５タグを検出するポジティブコントロールとして使用した。抗Ｖ５抗体を用いたウエスタンブロットは、全てのペプチドが、ほぼ等しいレベルで発現したことを実証した。興味深いことに、ＨＡ抗ＩｇＥ ＭＡｂは、エピトープ「Ａ」に変異を保有するペプチドに結合し得たが、それらは、エピトープ「Ｂ」に変異を保有するペプチドには結合しなかった。このことは、この第２の部位が、結合に関してより重要であったことを示唆する（図１５を参照のこと）。
【０１９８】
（実施例１３）
（エピトープＢの免疫原性ペプチドを使用するトランスジェニックマウスの能動免疫）
ヒトＩｇＥを構成的に発現するトランスジェニックマウスを使用して、エピトープＢのヒト免疫原性ペプチドに対する抗体の能動的な産生を実証した。二つの融合ペプチド（それぞれが、本発明の免疫原性ペプチドであるシステイン残基およびＫＬＨを含む）を化学的に合成した。ペプチド１の配列は、以下：
（ＫＬＨ−Ｃｙｓ）−Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
であり、ペプチド２の配列は、以下：
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ−（Ｃｙｓ−ＫＬＨ）
であった。
【０１９９】
そのトランスジェニックマウスに、２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）中の２０μｇの免疫原性ペプチドを皮下に注射した。２週間の間隔で２度、不完全フロイントアジュバント中の２０μｇのペプチド免疫源を、そのマウスに、皮下に注射した。次いで、二週間後、屠殺の３日前に、そのマウスに再度、腹腔内に、ＰＢＳ中の２０μｇの同じ免疫源を注射した。血清を収集し、エピトープＢに特異的な抗ＩｇＥ抗体の存在について試験した。図１６に見られるように、このペプチドは、これらのトランスジェニックマウスにおいて、抗ＩｇＥ抗体を誘発した。
【０２００】
当業者は、慣例的にすぎない実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、抗体クローニングおよび抗体スクリーニングに使用されるファージベクターの模式的表現である。
【図２】図２は、抗体改変体を生成するために有用なオリゴヌクレオチドの模式的表現である。
【図３】図３Ａは、マウス抗ＩｇＥ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の軽鎖とＬ１６およびＪＫ４の混合ヒトテンプレートとの比較を示す。図３Ｂは、ＴＥＳ−Ｃ２１の重鎖とＤＰ８８およびＪＨ４ｂの混合ヒトテンプレートとの比較を示す。
【図４】図４は、親ＴＥＳ−Ｃ２１と比較して高親和性を有する、フレームワーク残基改変体の表を提示する。
【図５】図５ＡおよびＢは、ＴＥＳ−Ｃ２１の親Ｆａｂとネガティブコントロール（５Ｄ１２）と比較した、クローン４、４９、７２、７８および１３６についてのＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図６】図６は、親ＴＥＳ−Ｃ２１およびネガティブコントロール抗体と比較した、クローン２Ｃ、５Ａおよび５Ｉの阻害アッセイを示す。
【図７】図７Ａは、ＩｇＥに対するさらに高い親和性をもたらす有益な変異の組み合わせを有するクローンの配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、クローン１３６、１、２、４、８、１３、１５、２１、３０、３１、３５、４３、４４、５３、８１、９０および１１３についての全軽鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、クローン１３６、１、２、４、８、１３、１５、２１、３０、３１、３５、４３、４４、５３、８１、９０および１１３についての全軽鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、３５個のクローンについての全重鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、３５個のクローンについての全重鎖可変領域のフレームワーク配列を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜Ｆは、クローン１３６、２Ｃ、５Ｉ、５Ａ、２Ｂおよび１１３６〜２Ｃについての完全重鎖配列および完全軽鎖配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒトＩｇＥのＣＨ３領域アミノ酸配列を示し、そしてエピトープ「Ａ」およびエピトープ「Ｂ」を強調表示する。
【図１２】図１２は、エピトープＢを同定するために使用される重複ペプチドを示す。
【図１３】図１３は、エピトープＡの結合領域中の重要な残基の識別を示す。
【図１４】図１４は、エピトープＢの結合領域中の重要な残基の識別を示す。
【図１５】図１５は、変異体ペプチドの結合するＭＡｂのウエスタンブロット分析を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＩｇＥを発現するトランスジェニック動物における抗ＩｇＥ抗体の産生を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｘａａ Ａｒｇ Ｘａａ（配列番号７２）のアミノ酸配列から実質的に構成される、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ（配列番号７３）である、請求項１に記載のアミノ酸。
【請求項３】
以下：Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号７４）のアミノ酸配列から実質的に構成される、単離されたペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、以下：
ａ）Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７５）；
ｂ）Ｈｉ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７６）；または
ｃ）Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ（配列番号７７）
である、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１または３に記載のペプチドと、生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、安定剤、または賦形剤とを含む、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、免疫原性キャリアをさらに含む、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記免疫原性キャリアが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドからなる群より選択される、組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項９】
標識をさらに含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体であって、該抗体は、以下：
ａ）キメラ抗体、
ｂ）単鎖抗体、
ｃ）Ｆａｂフラグメント、
ｄ）Ｆ（ａｂ’）、フラグメント、
ｅ）ヒト抗体、または
ｆ）ヒト化抗体
である、抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の抗体と、受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項１２】
ポリクローナル抗体を調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）抗体応答を誘発する条件下において、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドで、動物を免疫する工程、
ｂ）該動物から抗体を単離する工程、および
ｃ）該単離された抗体を前記ポリペプチドによってスクリーニングし、該スクリーニングによって、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、高親和性に特異的に結合するポリクローナル抗体を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって生成されるポリクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリクローナル抗体と適切なキャリアとを含む、組成物。
【請求項１５】
モノクローナル抗体を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）抗体応答を誘発する条件下において、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列から実質的に構成されるポリペプチドで、動物を免疫する工程、
ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離する工程、
ｃ）該抗体産生細胞と不死化細胞とを融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成する工程、
ｄ）該ハイブリドーマ細胞を培養する工程、および
ｅ）該培養から、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して高親和性に特異的に結合するモノクローナル抗体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって生成されるモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１６に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む、組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、Ｆａｂ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることによって生成される、請求項８に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項８〜１９のいずれか１項に記載の抗体を含む、キット。
【請求項２１】
哺乳動物においてＩｇＥに対する免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物に、応答を誘導するのに十分な量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドまたは組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１】
以下：Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｘａａ Ａｒｇ Ｘａａ（配列番号７２）のアミノ酸配列から実質的に構成される、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ（配列番号７３）である、請求項１に記載のアミノ酸。
【請求項３】
以下：Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号７４）のアミノ酸配列から実質的に構成される、単離されたペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、以下：
ａ）Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７５）；
ｂ）Ｈｉ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号７６）；または
ｃ）Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ（配列番号７７）
である、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１または３に記載のペプチドと、生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、安定剤、または賦形剤とを含む、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、免疫原性キャリアをさらに含む、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記免疫原性キャリアが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドからなる群より選択される、組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項９】
標識をさらに含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体であって、該抗体は、以下：
ａ）キメラ抗体、
ｂ）単鎖抗体、
ｃ）Ｆａｂフラグメント、
ｄ）Ｆ（ａｂ’）、フラグメント、
ｅ）ヒト抗体、または
ｆ）ヒト化抗体
である、抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の抗体と、受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項１２】
ポリクローナル抗体を調製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）抗体応答を誘発する条件下において、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドで、動物を免疫する工程、
ｂ）該動物から抗体を単離する工程、および
ｃ）該単離された抗体を前記ポリペプチドによってスクリーニングし、該スクリーニングによって、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、高親和性に特異的に結合するポリクローナル抗体を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって生成されるポリクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリクローナル抗体と適切なキャリアとを含む、組成物。
【請求項１５】
モノクローナル抗体を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）抗体応答を誘発する条件下において、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列から実質的に構成されるポリペプチドで、動物を免疫する工程、
ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離する工程、
ｃ）該抗体産生細胞と不死化細胞とを融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成する工程、
ｄ）該ハイブリドーマ細胞を培養する工程、および
ｅ）該培養から、配列番号７２または配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して高親和性に特異的に結合するモノクローナル抗体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって生成されるモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１６に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む、組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、Ｆａｂ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることによって生成される、請求項８に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項８〜１９のいずれか１項に記載の抗体を含む、キット。
【請求項２１】
哺乳動物においてＩｇＥに対する免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物に、応答を誘導するのに十分な量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドまたは組成物を投与する工程を包含する、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００８−５０７４７４（Ｐ２００８−５０７４７４Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１０３５（Ｐ２００６−５５１０３５）
【出願日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２４３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５５０４
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５００３５２５７９）タノックス インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２４３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５５０４
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５００３５２５７９）タノックス インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
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