新規コンジュゲートおよびそれを用いたコルチゾールの分析方法、キット、ならびにそのための装置
【課題】唾液中のコルチゾールの迅速な定量分析が可能であり、かつ、当該分析を行うための装置を小型化できる新規な技術を提供する。
【解決手段】（１）コルチゾールと酸化還元酵素とが特定の構造を有するリンカーを介して連結されたコンジュゲート。（２）液体試料中のコルチゾールと、本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析するコルチゾールの分析方法。（３）基板上に、コンジュゲートパッドとコルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、コンジュゲートパッドからコルチゾールとコンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させるキット。（４）作用極および対極からキットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定するための装置。
【解決手段】（１）コルチゾールと酸化還元酵素とが特定の構造を有するリンカーを介して連結されたコンジュゲート。（２）液体試料中のコルチゾールと、本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析するコルチゾールの分析方法。（３）基板上に、コンジュゲートパッドとコルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、コンジュゲートパッドからコルチゾールとコンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させるキット。（４）作用極および対極からキットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾールを含むコンジュゲート、およびそれを用いたコルチゾールの分析方法、キット、ならびにそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々なストレスを受けた多くの人々が複雑な治療を要する各種疾患にかかっており、予防的に、ストレスの程度を簡易に判定できる方法、キットまたは装置の開発が注目されている。従来、被検者の心拍数、血圧などを測定することにより被検者のストレスを判定する方法が一般的であったが、このようにして判定されるストレスは一過性のものであり、長期的に続くいわゆる慢性ストレスについては判定することが困難であった。
【０００３】
慢性ストレスを判定するための指標として、血液中のコルチゾールなどの副腎皮質ホルモンやアドレナリン、ノルアドレナリンなどの神経伝達物質が知られている。しかし、血液中の成分によってストレスを判定しようとすると、当該成分の採取自体がストレスを伴うという欠点がある。
【０００４】
このため、血液に代えて、採取自体にストレスを伴わない唾液中の成分をストレスの判定の指標とすることが検討されている。たとえば上述したコルチゾールは、唾液中にも微量ではあるが含まれていることが知られている（通常、１０〜１５μｇ／ｄｌ程度）。一般に、生体試料中に含まれる微量タンパクを分析する技術としては、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Asssay）法が多く用いられている。この酵素免疫測定法には、大きく分けて競合法とサンドイッチ法とがあるが、いずれも広く知られており、主に感度向上を主眼とし、標識自体の感度改良に関するものを中心とした種々の改良がなされている（たとえば特開２０００−１８０４４８号公報（特許文献１）、特開２００５−３３７９６０号公報（特許文献２）などを参照。）。
【０００５】
コルチゾールの分析に関しても、上述した酵素免疫測定法を利用して、試料中のコルチゾールを定量分析するためのキットが既に市販されている。しかしながら、このような市販のキットを用いて唾液中のコルチゾールの分析を行う場合には、分析に先立ち、たとえば、遠心分離などによる唾液中の不純物の除去、キット含有試薬の調製および唾液の希釈などの工程数が多く煩雑な作業である前処理が必要であり、また、この前処理や抗原抗体反応を行うためのインキュベーションも長時間を要するため、通常、試料を採取してから定量分析の結果を得るまでに６〜８時間程度かかるという問題があった。また、従来の市販のキットの場合、分光分析を行うための比較的大型の装置が必要となるという問題もあった。
【特許文献１】特開２０００−１８０４４８号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７９６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、唾液中のコルチゾールの迅速な定量分析が可能であり、かつ、当該分析を行うための装置を小型化できる新規な技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するためには、コルチゾールと酸化還元酵素とをリンカーで連結させたコンジュゲートを開発することによって、当該コンジュゲートと試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することができ、これによって試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得、しかも酸化還元酵素で標識していることで、分光分析に代えて、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学計測によりコルチゾールを定量分析できるため、唾液中のコルチゾールのリアルタイムな分析を小型化した装置を用いて行うことが可能となることを見出し、鋭意研究した結果、コルチゾールの新規なコンジュゲートの開発に成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
本発明のコンジュゲートは、コルチゾールと酸化還元酵素とが下記式（Ｉ）で表される構造を有するリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする。
【０００９】
【化１】
【００１０】
（上記式（Ｉ）中、コルチゾール側に配置されるＸはＮＨ、ＮＨＮＨ、ＣＯＮＨＮＨであり、酸化還元酵素側に配置されるＹはＮＨ、ＮＨＮ＝、ＮＨＮＨ、ＣＯ、ＣＯＮＨＮ＝、ＣＯＮＨＮＨであり、Ｒは酸素原子、硫黄原子または窒素原子で中断されていてもよい炭素数２〜２０の炭化水素鎖である。）
本発明のコンジュゲートにおいて、上記式（Ｉ）中におけるＲは炭素数２〜２０のアルキル基であることが好ましい。
【００１１】
また本発明のコンジュゲートにおけるリンカーは、下記式（ＩＩ）で表される構造を有することがより好ましい。
【００１２】
【化２】
【００１３】
また、本発明のコンジュゲートにおいて、酸化還元酵素はグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかであることが好ましく、グルコースオキシダーゼであることが特に好ましい。
【００１４】
本発明はまた、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析する、コルチゾールの分析方法についても提供する。
【００１５】
本発明のコルチゾールの分析方法における液体試料は、唾液から採取したものであることが好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、上述した本発明のコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、コンジュゲートパッドから液体試料中のコルチゾールと前記コンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させるコルチゾール分析用キットについても提供する。
【００１７】
本発明のキットにおける液体試料は、唾液から採取したものであることが好ましい。
本発明のキットは、検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されていることが、好ましい。
【００１８】
本発明はまた、本発明のキットが、検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されている場合、当該キットの検出部の作用極および対極をそれぞれ挿入するための挿入部と、挿入部に電気的に接続され、挿入部に挿入された作用極および対極から前記コルチゾール分析用キットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部とを備える、コルチゾール分析用装置についても提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コンジュゲートと液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することができるようになるため、試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになる。これによって、従来は試料の採取から分析結果を得るまでに６〜８時間ほど要していたのを分オーダー（１０分程度）へと短縮することができ、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。このような本発明により、唾液中のコルチゾールについても簡便・迅速に分析することができるため、ヒトの心身ストレスの研究に有用である。
【００２０】
また本発明によれば、コルチゾールを酸化還元酵素で標識しているコンジュゲートを用いることで、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学計測が可能となり、従来の分光分析を行う場合よりも格段に小型化された装置を用いたリアルタイムな分析の実現が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
＜コンジュゲート＞
本発明のコンジュゲートは、コルチゾール（ＣＯＲＴ）と酸化還元酵素とが特定の構造を有するリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする。コルチゾールは、ストレスによって発散される副腎皮質ホルモンのうちの糖質コルチコイドの１種であり、ヒドロコルチゾンとも呼ばれる。コルチゾールは分子量が３００程度のハプテンであり、このコルチゾールに標識（マーカー）を連結させたコンジュゲートを用いてコルチゾールとの競合反応を利用した酵素免疫測定法を実現する場合には、高感度な標識を用いる必要がある。本発明のコンジュゲートは、この高感度な標識として酸化還元酵素を用い、コルチゾールと酸化還元酵素とを特定の構造を有するリンカーを介して連結させたものであることを特徴とする。
【００２２】
本発明のコンジュゲートに用いられるリンカーが下記式（Ｉ）で表される構造を有することが好ましい。なお、下記式（Ｉ）で表されるリンカーは、Ｘがコルチゾール側に配置され、Ｙが酸化還元酵素側に配置されて連結され、Ｙと酸化還元酵素との間は、Ｙおよび酸化還元酵素の種類に応じて単結合または二重結合で結合され得る。
【００２３】
【化３】
【００２４】
上記式（Ｉ）中、コルチゾール側に配置されるＸはＮＨ、ＮＨＮＨ、ＣＯＮＨＮＨであり、中でも反応の工程数が少ない観点からＮＨまたはＮＨＮＨが好ましく、ＮＨＮＨが特に好ましい。また、上記式（Ｉ）中、酸化還元酵素側に配置されるＹはＮＨ、ＮＨＮ＝、ＮＨＮＨ、ＣＯ、ＣＯＮＨＮ＝、ＣＯＮＨＮＨであり、中でも反応の工程数が少ない観点からＮＨ、ＮＨＮ＝またはＮＨＮＨが好ましく、ＮＨＮ＝が特に好ましい。
【００２５】
上記式（Ｉ）中、Ｒは酸素原子、硫黄原子または窒素原子で中断されていてもよい炭素数２〜２０（好ましくは炭素数５〜１５）の炭化水素鎖である。Ｒにおける炭素数が１である場合には、酸化還元酵素の立体構造（二次構造）が崩れてしまう虞があり、また、Ｒにおける炭素数が２０を超える場合には、反応性が悪くなる傾向にあるためである。またＲは場合によっては二重結合および／または三重結合を含んでいてもよい。抗原抗体反応の効率性の観点からは、上記式（Ｉ）中におけるＲは炭素数２〜２０（より好ましくは炭素数５〜１５）のアルキル基であることが好ましい。
【００２６】
本発明のコンジュゲートに用いられるリンカーは、上記式（Ｉ）で表される構造の中でも、下記式（ＩＩ）で表される構造を有することが好ましい。下記式（ＩＩ）で表される構造を有するリンカーを用いることで、アミノ基、カルボキシル基を有しない酸化還元酵素であるグルコースオキシダーゼをコルチゾールとの連結に好適に用いることができるという利点があるためである。
【００２７】
【化４】
【００２８】
また本発明のコンジュゲートにおける酸化還元酵素は、酸化還元反応を触媒する酵素であれば特に制限されるものではないが、好適な例として、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかを挙げることができる。中でも、酵素活性が高く、安価であることから、グルコースオキシダーゼが特に好ましい。
【００２９】
上述したコルチゾールと酸化還元酵素とをリンカーを介して連結させたコンジュゲートは、その作成方法に特に制限はない。以下に好適な一例として、リンカーが上記式（ＩＩ）で表される構造を有し、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである場合のコンジュゲート（ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート）を作成する場合を挙げる。
【００３０】
まず、下記スキーム１に示すように、ＧＯＤに過ヨウ素酸塩および蒸留水を混合して室温でインキュベートすることで反応させ、ＧＯＤにアルデヒド基を結合させる。なお、下記スキーム１におけるＧＯＤのＲ、Ｒ’は共にアルキル基を示す。得られたＧＯＤ−アルデヒドは、反応後の溶液を１０ｍＭ 炭酸アンモニウム（ｐＨ９．３）で平衡化したカラム（具体的にはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム）に通し、不純物を除去する。
【００３１】
【化５】
【００３２】
次に、下記スキーム２に示すように、精製したＧＯＤ−アルデヒドにアジポジヒドラジド（ＡＤＨ）を混合し、低温（たとえば４℃）でインキュベートした後、水酸化ナトリウムで調製したシアノ水素化ホウ素ナトリウムを混合し、同じく低温（たとえば４℃）でインキュベートする。得られたＧＯＤ−ＡＤＨは、反応後の溶液を１０ｍＭ リン酸緩衝液で平衡化したカラム（具体的にはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム）に通し、不純物（ＡＤＨの両端にＧＯＤが結合したものも含む）を除去する。
【００３３】
【化６】
【００３４】
次に、下記スキーム３に示すように、ＧＯＤ−ＡＤＨにおけるＡＤＨと、コルチゾール（コルチゾール−２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ）とを反応させ、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを作成する。なお、コルチゾールとＡＤＨとを結合させるためには、コルチゾールの反応性を高める必要性があるため、前処理として、コルチゾール−２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、ジメチルホルムアルデヒド、ジオキサンおよび蒸留水を混合し、さらにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、１−エチル−３−カルボジイミド塩酸塩を混合し、低温（たとえば４℃）でインキュベートすることで、コルチゾールを予め活性化することが好ましい。このように活性化したコルチゾールを精製したＧＯＤ−ＡＤＨと混合し、低温（たとえば４℃）でインキュベートすることで、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートが得られる。得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートは、反応後の溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したカラム（具体的にはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム）に通し、不純物を除去して、精製する。
【００３５】
【化７】
【００３６】
なお、当該ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート以外のコンジュゲートについても、以下の例に従来公知のコンジュゲート作成技術を適宜応用することで作成可能である。上述した例では、コンジュゲートにおけるリンカーを形成する材料としてＡＤＨを用いた場合を挙げたが、本発明のコンジュゲートを作成する際にリンカーを形成するための材料としては勿論これに限定されるものではない。
【００３７】
ここで、リンカーの一方側の官能基は、コルチゾールのカルボキシル基と結合できる官能基である。このような官能基としては、たとえばアミノ基、ヒドラジン基が挙げられる。一方、リンカーの他方側の官能基は、酸化還元酵素と結合させるための官能基であり、酸化還元酵素の末端官能基の種類によって適宜選択される。たとえば、酸化還元酵素の末端官能基がアミノ基である場合、リンカーの他方側の官能基としてはカルボキシル基が選択される。またたとえば酸化還元酵素の末端官能基がカルボキシル基である場合には、リンカーの他方側の官能基はアミノ基またはヒドラジン基が選択される。また、たとえば酸化還元酵素の末端官能基がアルデヒド基である場合には、リンカー分子の他方側の官能基としてはヒドラジン基が選択される。
【００３８】
このようなリンカーを形成するための材料としては、たとえばジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノヘキサン、ジアミノオクタン、２，４−ジアミノキシレン、エチレンジヒドラジン、アディピック酸ジヒドラジン、ｐ−フェニレンジヒドラジン、ジフェニル−オルソ−ジヒドラジン、６−アミノヘキサン酸、１１−アミノウンデカン酸、各種アミノ酸（プロリンおよびヒドロキシプロリンを除く）、各種ジペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはヒドロキシプロリンではないもの）および各種トリペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはヒドロキシプロリンではないもの）が挙げられる。ただし、６−アミノヘキサン酸、１１−アミノウンデカン酸、各種アミノ酸（プロリンおよびヒドロキシプロリンを除く）、各種ジペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはまたはヒドロキシプロリンではない）および各種トリペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはヒドロキシプロリンではない）などのカルボキシル基とアミノ基を有する分子をリンカーとして用いる場合、当該リンカー自体が縮合反応を起こさないようにするために、カルボキシル基またはアミノ基を保護する必要がある。カルボキシル基の保護基としては、たとえばメチル基、エチル基、ベンジル基およびｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。一方、アミノ基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびアリルオキシカルボニル基などが挙げられる。特に、脱保護の反応を容易に行うことができる観点から、カルボキシル基の保護基としてはベンジル基が、アミノ基の保護基としてはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基が好ましいが、本発明は、これらの保護基に限定されるものではない。
【００３９】
このような本発明のコンジュゲートによれば、当該コンジュゲートを用いて、液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することができるようになるため、これによって試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになり、トータルで分オーダー（１０分程度）へと短縮された、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。また本発明のコンジュゲートは、コルチゾールを酸化還元酵素で標識したものであるため、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学計測が可能となり、従来の分光分析を行う場合よりも格段に小型化された分析装置を用いたリアルタイムな分析の実現が可能となる（詳細は後述）。
【００４０】
本発明のコンジュゲートは、上述した液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法に特に好適に用いることができるものであるが、その用途についてはこれに制限されるものではなく、デヒドロアピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、エラトラジオールなどのステロイドホルモンの定量分析などの手法に応用可能である。また、本発明のコンジュゲートは、コルチゾールだけでなく他のホルモンの迅速分析にも寄与すると考えられ、化学分析・医療分野での応用範囲は広いと考えられる。
【００４１】
＜コルチゾール分析方法＞
本発明は、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを定量分析する、コルチゾールの分析方法についても提供する。本発明のコルチゾールの分析方法によれば、上述した本発明のコンジュゲートと、液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することで、従来のコルチゾールの酵素免疫測定法による分析方法とは異なり、試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになるため、トータルで分オーダー（１０分程度）へと短縮された、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。
【００４２】
本発明のコルチゾールの分析方法において、液体試料中のコルチゾールと本発明のコンジュゲートとを競合反応させるために用いる抗体としては、コルチゾールに対する抗体（抗コルチゾール抗体）であれば特に制限されるものではなく、具体的には、Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−３−ＣＭＯ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−２１（コスモバイオ社製）などの市販の抗コルチゾール抗体などが好適な例として挙げられる。
【００４３】
本発明のコルチゾールの分析方法における液体試料は、唾液から得られたものであることが好ましい。ヒトのストレスを判定するために、唾液中のコルチゾールを分析することが従来から試みられてきたことは上述したとおりであるが、本発明のコルチゾールの分析方法はこのストレスの判定に特に有用である。ここで、本発明のコルチゾールの分析方法を応用して有無を判定するストレスは、心身ストレス（肉体的ストレス、精神的ストレスの両方を包含する）を意味し、また、急性ストレス、慢性ストレスの両方を包含するが、慢性ストレスについての判定に特に有用である。
【００４４】
なお、ストレスの有無を判定するという目的上、液体試料の採取自体は、被験者の身体または精神にストレスをかけることなく行われることが望まれる。このため、液体試料が唾液から採取するものである場合には、液体試料が血液である場合などとは異なり、被験者にストレスを与えることなく短時間で採取することができるという利点がある。
【００４５】
唾液の採取には、たとえば特開２００６−３４５８６９号公報に開示されたような、毛細管現象を利用した器具（キャピラリー）を好適に用いることができる。このような器具を用いることで、１回で、本発明のコルチゾールの分析に十分な量（好ましくは１〜５００μＬ、具体的には１００μＬ程度）の唾液を採取することができる。なお、唾液を採取する被験者の口腔内の場所としては、舌下、舌上、頬肉などが挙げられ、特に制限されるものではない。
【００４６】
＜コルチゾール分析用キット＞
本発明はまた、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を行うためのコルチゾール分析用キットについても提供する。ここで、図１は、本発明の好ましい一例のコルチゾール分析用キット１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は斜視図である。図１に示す例の本発明のコルチゾール分析用キット１は、基板２と、基板２上に形成された、試料パッド３と、コンジュゲートパッド４と、検出部５と基本的に備え、検出部５から突出する電極系基板（後述）など、一部を除いたその全体がハウジング７にて覆われるように構成される。なお、図１（ｂ）は、図１（ａ）に示すキット１からハウジング７を取り除いた状態の斜視図を示している。このような本発明のキット１は、免疫測定法、イムノクロマトグラフィ、電気化学測定を１つの試験紙上にドライケミストリーで構成することで、低廉なディスポーザブル・テストストリップを実現することができるという利点がある。
【００４７】
本発明のキット１に用いられる基板２は、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成される。これによって、試料パッド３に滴下された液体試料９中のコルチゾール１０およびコンジュゲートパッド４に予め含浸された上述した本発明のコンジュゲート１１とが、毛細管現象によって試料パッド３およびコンジュゲートパッド４から水平方向に概ね沿って検出部５にまで移動し、検出部５に予め固定された抗体６と競合反応させることによる酵素免疫測定が可能となる。また後述するように当該キット１による酵素免疫測定の結果の電気化学的な測定を可能とする観点からは、当該基板２としてベース基板上に、ニトロセルロース膜、セルロース膜などが形成されたものが好適に用いられる。なお、ベース基板を形成する材料としては、たとえばポリエチレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレンなどが挙げられるが、上述した性質を有する基板２を実現することができるのであれば、これらに限定されるものではない。上記中でも、耐衝撃性、耐寒性、耐水性、耐電性、絶縁性が良好であり、また化学的に安定で耐薬品性にも優れるという観点からはポリエチレンが好ましく、また、成型加工性が高く、さらに材料費が安価であるという観点から、ポリエステルが好ましい。また、本発明のキットにおける基板は、上述したベース基板の表面に溝が形成されることで、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成されていても勿論よいが、液体試料が唾液から採取されたものである場合に液体試料の泡立ちを防止できる観点から、ベース基板上にニトロセルロース膜、セルロース膜などが形成されて実現されてなるのが特に好ましい。
【００４８】
試料パッド３は、ハウジング７に形成された注入口８から液体試料９を注入した際に、当該液体試料９中に含まれる、分析対象であるコルチゾールが当該試料パッド３を通過し、基板２に到達するように構成される。より精度の高い競合反応を行うことができるようになる観点からは、試料パッド３は、液体試料９中に含まれる分子量が比較的大きい夾雑物をろ過し得るような材料で形成されることが好ましい。本発明のキット１においても、液体試料は唾液から採取したものであることが好ましいが、この場合には、ムチンなどがこの夾雑物に該当する。このような分子量が比較的大きい夾雑物をろ過し得るような試料パッド３の形成材料としては、たとえば、ガラス繊維、セルロースなどが挙げられるが、これらに制限されるものではない。なお、図１に示す例では、試料パッド３をコンジュゲートパッド４とは別に設けた例を示しているが、コンジュゲートパッド４に液体試料を直接注入して、コンジュゲートパッド４が試料パッドを兼ねるように構成されていても勿論よい。
【００４９】
コンジュゲートパッド４には、上述した本発明のコンジュゲート１１（好適にはＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート）が予め含浸され、上述した試料パッド３に液体試料９が注入された場合に、この液体試料９中のコルチゾール１０とともに、コンジュゲート１１が毛細管現象によって検出部５にまで移動するように構成される。なお、コンジュゲートパッド４は、図１（ｂ）に示す例のように、基板２と試料パッド３との間に介在されるように形成されることが好ましい。これによって、注入口８から液体試料９が注入された際に、試料パッド３を通過した液体試料９がコンジュゲートパッド４を通過して基板２に到達することになり、液体試料９がコンジュゲートパッド４を通過する際に、当該コンジュゲートパッド４に含浸されていたコンジュゲート１１が液体試料９に溶け込み、コルチゾール１０とコンジュゲート１１とが溶け込んだ液体試料９を検出部５に移動させ、より精度の高い競合反応を行うことができるようになるためである。このようなコンジュゲートパッド４を形成する材料としては、試料パッド３を形成する好適な材料として上述した材料を同様に好適に用いることができる。なお、コンジュゲート１１をコンジュゲートパッド４に予め含浸させておく方法としては、従来公知の適宜の方法を適用でき、特に制限されないが、たとえばコンジュゲートの溶液にコンジュゲートパッドを入れ攪拌する方法、コンジュゲートパッド上にコンジュゲートの溶液を滴下する方法などが好適である。
【００５０】
本発明のキット１における検出部５には、上述したようにコルチゾールの抗体（抗コルチゾール抗体）６が予め固定されている。抗体６としては、市販の抗コルチゾール抗体を特に制限なく用いることができ、具体的には、Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−３−ＣＭＯ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）およびＡｎｔｉ− Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−２１（コスモバイオ社製）などが挙げられる。本発明のキット１の注入口８に液体試料９を注入することで、試料パッド３およびコンジュゲートパッド４から毛細管現象によって移動してきた液体試料中のコルチゾール１０と、コンジュゲート１１とが、検出部５において抗体６と競合反応する（図１（ｂ））。
【００５１】
ここで、上述したように、本発明のキット１で利用する本発明のコンジュゲートは、コルチゾールを酸化還元酵素で標識したものであるため、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学測定を利用することができる。すなわち、上述したように、試料パッド３およびコンジュゲートパッド４から毛細管現象によって移動してきた試料中のコルチゾール１０と、コンジュゲート１１とが、検出部５において抗体６と競合反応する場合、検出部５にグルコース（Ｃ6Ｈ12Ｏ6）が十分量存在する場合には、抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素（好適にはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ））と以下のような反応が起こる。
【００５２】
Ｃ6Ｈ12Ｏ6（グルコース）＋Ｏ2→Ｃ6Ｈ10Ｏ6（グルコノラクトン）＋Ｈ2Ｏ2 （１）
Ｈ2Ｏ2→２Ｈ+＋２ｅ-＋Ｏ2 （２）
上記式（２）における電子の生成量は、酸化還元酵素を含むコンジュゲート１１の量に比例し、液体試料９中に含まれていたコルチゾール１０の濃度には反比例することになる。このため、この電子の生成量を、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定することで、予め求めておいた検量線にプロットすることで、液体試料中のコルチゾールの濃度を算出することが可能となる。
【００５３】
このような電気化学測定を利用する観点から、本発明のキット１は、図１に示す例のように、検出部５に、電気絶縁性の電極系基板２０と、電極系基板２０上に互いに離間して配置された作用極２２と対極２３とを含む電極系２１が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極２２上に予め固定されているように実現されることが、好ましい。このように実現されたキット１を用いることで、従来の分光分析を行う場合よりも、全体として格段に小型化された分析装置（後述）との組み合わせでの分析が可能となる。
【００５４】
ここで、図２は、本発明のキット１に好適に用いられる電極系２１の一例を模式的に示す上面図である。電極系２１は、上述した電気化学的反応で生じた電流を流すことができ、後述する本発明の分析装置に電気的に接続され、液体試料（好適には、唾液より採取した液体試料）が存在することで、分析装置に電気的に接続された状態で当該分析装置と電気的な回路を形成するように実現される。このような電極系２１は、少なくとも作用極２２と対極２３とを備え、さらには、液体試料の存在を確認するための参照的な電極（図１、２に示す参照電極２４）、キット１を分析装置に挿入したことを確認するための電極（図示せず）などの付属的な電極を含んでいてもよい。
【００５５】
電極系２１における作用極２２上には、上述したように抗体６が予め固定されている。これによって、当該抗体６とコルチゾール１０およびコンジュゲート１１との競合反応により抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素が上述した電気化学反応を起こした際には、発生した電流が作用極２２に流れる。このような作用極２２は、導電体で形成されているのであれば、その具体的な形成材料については特に制限されないが、たとえば炭素、白金、酸化ルテニウム、パラジウムなどが挙げられ、中でも、耐腐食性が高いという観点からは白金が好ましく、また、材料費が安いという観点からは黒鉛が好ましい。なお、作用極２２は、電気絶縁性の電極系基板２０（たとえばポリエチレン製）上に、蒸着または塗布などの方法によって形成される。
【００５６】
また電極系２１における対極２３は、電極系基板２０上に作用極２２とは離間して配置され、液体試料（好適には、唾液より採取した液体試料）が存在することで、上述した作用極２２および後述する分析装置と電気的な回路を形成する役割を果たす。このような対極２３も導電体で形成されているのであれば、その具体的な形成材料については特に制限されるものではなく、上述した作用極２２と同様にたとえば炭素、白金、酸化ルテニウム、パラジウムなどが挙げられ、同様の理由から白金が好ましい。また対極２３も、作用極２２と同様に、電気絶縁性の電極系基板２０（たとえばポリエチレン製）上に、蒸着または塗布などの方法によって形成される。
【００５７】
ここで、電極系基板２０を形成する材料としては、たとえばポリエチレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレンなどが挙げられるが、電気絶縁性を有する電極系基板２０を実現することができるのであれば、これらに限定されるものではない。上記中でも、耐衝撃性、耐寒性、耐水性、耐電性、絶縁性が良好であり、また化学的に安定で耐薬品性にも優れるという観点からはポリエチレンが好ましく、また、成型加工性が高く、さらに材料費が安価であるという観点から、ポリエステルが好ましい。
【００５８】
電極系２１における作用極２２および対極２３は、上述したような電極系基板２０上において互いに離間しているのであれば、その配置は特に制限されるものではなく、作用極２２と対極２３とが対向するように配置されていてもよいし、また、同一平面上に配置されていてもよい。図２には、電極系基板２０上に、円形状の作用極２２を中心にして、対極２３および参照極２４が互いに離間して同心円状に配置され、作用極２２の外周側に、当該作用極２２の周方向に沿って対極２３が対向して配置され、さらに、対極２３の外周側に、当該対極２３の周方向に沿って参照極２４が対向するようにして、同一平面上に配置された例が示されている。すなわち、円形状の作用極２２の外周に、周方向の一部に切欠部を有する円弧状に形成された対極２３が、当該切欠部以外の部分で作用極２２を包囲するように形成されている。また、対極２３の外周側を周方向に包囲するように、略半円弧状の参照極２４が形成されている。
【００５９】
図２に示す例では、それぞれ上述した形状を有する作用極２２、対極２３および参照極２４は、配線部が引き出され、その端部に、それぞれ作用極２２、対極２３および参照極２４への電気的な接続を可能とする電極パッドが形成されている。図１に示す例の本発明のキット１は、基板２の検出部５に、電極系２１が形成された電極系基板２０が挿入され、電極系基板２０の上記電極パッドが形成された部分が、キット１から突出するように形成されており、後述する本発明の分析装置への電気的な接続が可能なように実現されている。
【００６０】
また、図１および図２に示す例のキット１において、作用極２２には、上述したコルチゾールの抗体（抗コルチゾール抗体）６の他に、通常、電子メディエータも予め固定される。ここで、電子メディエータとは、還元することで電子の授受が発生し、液体試料９と作用極２２との間の電子伝達を仲介する化合物をいい、ヨウ素、および、ルテニウム、オスミウム、鉄およびコバルトなどの遷移金属を含む化合物であれば、特に限定されるものではない。このような電子メディエータとして、たとえばヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム、フェロセン、１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フォロセンカルボキシアルデヒド、ハイドロキノン、ブロマニル、オクタシアノタングステンおよびオクタシアノモリブデンなどが挙げられる。
【００６１】
また電子メディエータは、ポリマーを含む構造であってもよく、たとえば（ｉ）ポリ（ビニルフェロセン）、（ｉｉ）ポリカチオン−ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩、ポリカチオン−ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩などのイオン性ポリマー、ならびに、（ｉｉｉ）オスミウム−（２，２’−ビピリジン）錯体またはオスミウム−（１，１０−フェナントロリン）錯体などのオスミウム錯体が、ポリ（１−ビニルイミダゾール）またはポリ（４−ビニルピリジン）などのポリマーに配位した化合物などの有機遷移金属錯体ポリマー（オスミウム系錯体ポリマー）などが挙げられる。これらの中でも、電子伝達性が高いことから、オスミウム系錯体ポリマーが好ましい。
【００６２】
また、電子メディエーターは他の高分子との組成物とすることもできる。電子メディエーターと混合する他の高分子としては、たとえばポリビニルピロリドン、ポリ（１−ビニルイミダゾール）および変性アルブミンなどが挙げられる。これらの中でも、材料費が安価である観点からポリビニルピロリドンが好ましいが、これらの高分子に限定されるものではない。
【００６３】
上述した電子メディエータは、抗体６とともに、作用極２２上から流出することを防止できる程度の結合によって作用極２２に固定されていればよく、たとえば共有結合、イオン結合、配位結合、ファンデルワールス力などの化学的な結合による固定、または、コーティングなどの被膜形成によって作用極２２に固定される。また、電子メディエータを上述した作用極２２を形成する金属と材料と混合し、これを電気絶縁性の電極系基板２０上に蒸着または塗布するようにすることで、作用極２２に電子メディエータを固定するようにしてもよい。中でも、安価にしかも容易に製造できるという観点からは、被膜形成により抗体６および電子メディエータを作用極２２上に固定しておくことが好ましい。
【００６４】
ここで、図３は、図２に示す電極系２１における電気化学的反応の検出原理を模式的に示す図であり、図４は図３に示す電気化学的反応により検出され得る電流（検出電流）の一例を模式的に示すグラフである。本発明のキット１は、図２に示したように、検出部５に、電気絶縁性の電極系基板２０と、電極系基板２０上に互いに離間して配置された作用極２２と対極２３とを含む電極系２１が形成され、かつ、作用極２２に抗体６が予め固定されていることで、上述したコルチゾールとコンジュゲートとの競合反応によって、抗体６の一部にコンジュゲートがトラップされる。この際、十分な量のグルコースの存在下で、コンジュゲートの酸化還元酵素によって上述した電気化学的反応が起こり、図３に示したように作用極２２で発生した電子が対極２３へと流れることになる。このとき、図４に示すグラフ（縦軸は電流値（ｍＡ）、横軸は時間（秒））に示すように、作用極２２から対極２３へと流れる電流値が検出されることになる。
【００６５】
なお、本発明の第１のキット１は、通常、図１に示すように、検出部５に関し、試料パッド３とは反対側の基板２の端部に吸収パッド１５が設けられる。この吸収パッド１５は、毛細管現象によって水平方向に概ね沿って移動し、検出部５を通過した後の液体試料を吸収するためのものであり、上述した試料パッド３を形成する好適な材料として上述した材料にて形成された吸収パッド１５を好適に用いることができる。
【００６６】
なお、上述した本発明のキット１は、市販品であるアッセンブリーキット（Assembly Kit）（ミリポア社製）を用いて好適に作成することができる。
【００６７】
＜コルチゾール分析用装置＞
図５は、上述した本発明のキット１と組み合わせて用いられ得る好ましい一例の本発明のコルチゾール分析用装置３１の模式的な概念図である。本発明はさらに、本発明のキットが上述したように、検出部５に、電気絶縁性の電極系基板２０と、電極系基板２０上に互いに離間して配置された作用極２２と対極２３とを含む電極系２１が形成され、かつ、作用極２２に抗体６が予め固定されているように実現される場合に、このキット１と好適に組み合わせて用いられる分析装置についても提供する。本発明の装置３１は、キット１の検出部５の作用極２２および対極２３をそれぞれ挿入するための挿入部３２と、挿入部３２に電気的に接続され、挿入部３２に挿入された作用極２２および対極２３から、本発明のキット１にて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部３３とを備えることを特徴とする。
【００６８】
本発明の装置３１における挿入部３２は、キット１の電極系２１を挿入できる構造であれば特に制限されるものではない。図５には、挿入部３２が、キット１の電極系２１を挿入した際に、作用極２２および対極２３にそれぞれ電気的に接続する端子３２ａ，３２ｂがそれぞれ設けられている例が示されている。勿論、上述したように、キット１の電極系２１が、液体試料の存在を確認するための参照的な電極（図１および図２に示した例の参照電極２４）、キット１が装置３１の挿入部３２に挿入されたことを確認するための電極などの付属的な電極を具備する場合には、これらの電極と電気的に接触する端子が挿入部３２にさらに設けられる。
【００６９】
なお、上述したように、抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素による電気化学的反応は、グルコースが十分量存在する場合に起こる。このため、本発明の装置３１においては、キット１が挿入部３２に挿入された際に、装置３１内に予め仕込まれたグルコースが挿入部３２に供給され、挿入部３２からキット１の電極系２１を介して検出部５に十分な量のグルコースが供給されるように実現されることが好ましい。
【００７０】
また本発明の装置３１における測定部３３は、上述した挿入部３２に設けられた各端子３２ａ，３２ｂの回路上に配置され、抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素による上述した電気化学的反応で得られた電流値または電気量を測定する手段である。当該測定部３３は、具体的には、クーロメトリー、ポテンシオメトリーおよびアンペロメトリーなどを用いて好適に実現することができる。
【００７１】
本発明の装置３１はまた、測定部３３により測定された電流値または電気量をコルチゾール濃度に換算する換算部３４を備えることが好ましい。換算部３４は、あらかじめ作成した検量線による算出によって、電流値または電気量をコルチゾール濃度に換算し得るようなプログラムを記録した媒体であれば特に制限されるものではなく、従来公知の適宜の手段を組み合わせて実現することができる。
【００７２】
また本発明の装置３１は、換算部３４で算定された結果を表示部（図示せず）に表示するように実現されることが好ましい。この場合、表示部には、コルチゾール濃度の値をそのまま表示してもよいし、ストレス度と称した別のパラメーターにさらに換算して表示してもよい。また、数値に限らず、当該数値に対応したキャラクターを表示することもできる。
【００７３】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７４】
＜実験例１：ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートの作成＞
コルチゾール（ＣＯＲＴ）との化学結合によるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の酵素活性の低下を抑えるために、アジポジヒドラジド（ＡＤＨ）を介してＧＯＤとＣＯＲＴを結合させ、リンカー分子が上記式（ＩＩ）で表される構造を有し、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼであるＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを作成した。
【００７５】
まず、上記スキーム１に示したように、１０ｍｇのＧＯＤ、１０μＬの０．１Ｍ 過ヨウ素酸塩（Sodium meta-peropdate）および１ｍＬの蒸留水を混合し、室温（約２４℃）で３０分間インキュベートし、ＧＯＤ−アルデヒドを作成した。得られたＧＯＤ−アルデヒドを含む反応後の溶液を、１０ｍＭ 炭酸アンモニウム（ｐＨ９．３）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して不純物を除去し、ＧＯＤ−アルデヒドを精製した。
【００７６】
次に、精製されたＧＯＤ−アルデヒドに、上記スキーム２に示したように、１００ｍｇのアジポジヒドラジド（ＡＤＨ）を混合し、４℃で一晩中インキュベートした後、１Ｍ 水酸化ナトリウムで調製した１０μＬの５Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウムを混合し、４℃で３時間インキュベートし、ＧＯＤ−ＡＤＨを作成した。得られたＧＯＤ−ＡＤＨを含む反応後の溶液を、１０ｍＭ リン酸緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して不純物を除去し、ＧＯＤ−ＡＤＨを精製した。
【００７７】
次に、コルチゾールとＧＯＤ−ＡＤＨとを反応させるために、５ｍｇのコルチゾール−２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、２００μＬのジメチルホルムアルデヒド、２００μＬのジオキサン、１００μＬの蒸留水を混合した後、１０ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、２０ｍｇの１−エチル−３−カルボジイミド塩酸塩を混合し、４℃で一晩インキュベートしてコルチゾールを活性化する前処理を施した。その後、上記スキーム３に示したように、活性化させたコルチゾール５００μＬと、上述のようにして精製されたＧＯＤ−ＡＤＨ１ｍＬとを混合し、４℃で一晩インキュベートしてＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを作成した。得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを含む反応後の溶液を、１０ｍＭ リン酸緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して不純物を除去し、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを精製した。（ａ）酵素免疫測定法、（ｂ）電気泳動をそれぞれ以下のような手順で行い、上述のようにして作成されたのがＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートであることを確認した。
【００７８】
（ａ）酵素免疫測定法を用いた確認
まず、予めプレートに抗コルチゾール抗体が固相化されているＳａｌｉｖａｒｙ Ｃｏｒｔｉｓｏｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ ＬＬＣ製）に、上述のようにして作成した１０ｍＭ リン酸緩衝液中のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを、１．０６ｍｇ／ｍＬ、０．５３ｍｇ／ｍＬ、０．２１ｍｇ／ｍＬ、０．１０６ｍｇ／ｍＬ、０．０５３ｍｇ／ｍＬ、０．０２１ｍｇ／ｍＬ、０．０１０６ｍｇ／ｍＬの濃度に調製して、それぞれ２５ｍＬずつ滴下し、３７℃で１時間インキュベートした後、抗コルチゾール抗体と抗原抗体反応させた。反応後、プレートを洗浄した後に、ＧＯＤ酵素活性溶液を３００ｍＬ滴下し、４９０ｎｍで吸光度の測定を行った。なお、コントロール条件としては、抗体未固相化プレートを用いた。
【００７９】
図６は、実験例１で得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＧＯＤ酵素活性の吸光度を示すグラフである。ＧＯＤ酵素活性溶液滴下３０分後の１．０６ｍｇ／ｍＬのＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートの吸光度は、抗体なしでは１．４２０、抗体ありでは２．３３８であり、抗体の有無により吸光度に顕著な差が見られた。また、全ての濃度のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートにおいて、抗体なしと比較して、抗体ありの吸光度が高かったことから、特異的にＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートが抗コルチゾール抗体に結合したものと考えられる。
【００８０】
（ｂ）電気泳動を用いた確認
上述のようにして作成した１０ｍＭ リン酸緩衝液中のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート４．５ｍＬに０．５ｍＬの２−メルカプトエタノールと５ｍＬのＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒとを混ぜ、９５℃の恒温槽で３分間ボイルしたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルを調製した。コントロールとして市販のＧＯＤ（１ｍｇ／ｍＬ）を用い、当該ＧＯＤをレーン１に、上述のように調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルをレーン２にアプライし、泳動条件２０ｍＡでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルを洗浄し、ＣＢＢ染色液で染色を行った。
【００８１】
図７は、実験例１に得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。図７に示されるように、ＧＯＤは７５ｋＤａ、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートは２５０ｋＤａのバンドとして検出された。この結果から、上述のようにして得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートは、グルコースオキシダーゼにコルチゾールが複数結合した酵素標識体であると考えられる。
【００８２】
＜実験例２：コルチゾール分析用キットの作成＞
以下のようにして図１に示した例の本発明のコルチゾール分析用キット１を作成した。まず、ポリエチレン（ＰＥ）フィルム（厚み：５００μｍ）を電極系基板２０とし、その上に、電極系２１として作用極２２、対極２３および参照極２４を真空蒸着により形成した。具体的には、まず、レーザプリンタ（ＨＰ Ｌａｓｅｒ Ｊｅｔ ４ＬＪ Ｐｒｏ、ヒューレット・パッカード（株）製）を用いて、電極系基板２０上の電極系２１を形成する部分以外の部分にマスクを形成した。次に、電極系基板２０と電極系２１を形成する金属との密着性を向上するために、電極系基板２０上にクロム（Ｃｒ）層を５ｎｍ真空蒸着させ、その上に、金属薄膜の導電率を向上するために、金（Ａｕ）層を４０ｎｍ真空蒸着させた。さらにその上に、白金（Ｐｔ）層を４０ｎｍ、銀（Ａｇ）層を２００ｎｍ真空蒸着させた。
【００８３】
金属薄膜を蒸着させた部分以外のマスクを剥がし落とすために、上述した真空蒸着後の電極系基板２０を１００ｍＬのアセトンに入れ、３〜５分程超音波洗浄を行ってマスクした部分の除去を行った。水で洗浄した後、エタノールを染み込ませた綿で軽く電極をこすって汚れを除去した。
【００８４】
次に、電極系２１を、ポテンショスタット／ガルバノスタット（１１１２型、（株）ビー・ビー・エス製）の参照極に銀／塩化銀、対極に白金（Ｐｔ）、そして作用極に銀（Ａｇ）を溶かして白金にする２本の電極を繋いだ。次に、２％希硝酸７０ｍＬの中に電極系２１の先端部分を２ｃｍ浸し、ポテンショスタット／ガルバノスタットを用いて＋１ｍＡ、１５０秒で通電させ、最上層のＡｇ層を溶解させＰｔを露出させた。反応後、電極系２１を蒸留水で洗い流して洗浄した。ＡｇＣｌは、銀（Ａｇ）を１００ｍＬのＫＣｌ溶液で酸化させ（銀塩化銀処理）、ＡｇＣｌ層を作成した。このようにして、図２に示したような形状を有する、白金（Ｐｔ）製の作用極２２および対極２３、ならびに、銀／塩化銀（ＡｇＣｌ）製の参照極２４を有する電極系２１を形成した。
【００８５】
次に、作用極２２上に、抗コルチゾール抗体６（Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−２１、コスモバイオ社製）および電子メディエータであるヘキサシアノ鉄イオン、ならびに、非酸化還元物質のグルコースを同時に固定した。なお、抗コルチゾール抗体６の固定は、以下の（１）〜（９）の手順で行った。
【００８６】
（１）１．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液に５分間親戚し、作用極２２の表面を洗浄後、純水で洗浄する、
（２）１．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液に５分間浸漬し、作用極２２の表面を洗浄後、純水で洗浄する、
（３）濃塩酸を滴下し、１分後に純水で洗浄する、
（４）１０ｍｍｏｌ／Ｌ １１−メルカプトウンデカン酸のエタノール溶液で洗浄した後、純水で洗浄する、
（５）エタノール中で５分間超音波照射する、
（６）１００ｍｇ／ｍＬ Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液１００ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ １−エチル−３−カルボジイミドヒドロクロライド水溶液１００ｍＬを滴下し、１時間反応させる、
（７）活性化した作用極２２の表面を純水で洗浄し、０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する、
（８）０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を作用極２２に９０ｍＬ滴下し、１００秒後に０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した抗体を１０ｍＬ滴下する、
（９）３０分間インキュベートした後に、緩衝液で洗浄する。
【００８７】
次に、たとえば、アッセンブリーキット（Assembly Kit）（ミリポア社製）を用いて、以下のようにして本発明のキットを作成した。まず、アッセンブリーキットに付属のガラス繊維製パッドに実験例１で作成した１０ｍＭ リン酸緩衝液中のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを数滴滴下し、コンジュゲートパッド４を形成した。これをアッセンブリーキットに付属の基板上に設置し、さらにその上に、付属のガラス繊維製パッドを設置して試料パッド３を形成した。また基板２に、上述のように電極系２１を形成した電極系基板２０を挿入し、検出部５を形成した。この検出部５に関し、試料パッド３とは反対側の基板２の端部には、キットに付属のガラス繊維製パッドを設置して吸収パッド１５を形成した。このようにして、図１に示した本発明のキット１を作成した。
【００８８】
今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内で全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の好ましい一例のコルチゾール分析用キット１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は斜視図である。
【図２】本発明のキット１に好適に用いられる電極系２１の一例を模式的に示す上面図である。
【図３】図２に示す電極系２１における電気化学的反応の検出原理を模式的に示す図である。
【図４】図３に示す電気化学的反応により検出され得る電流（検出電流）の一例を模式的に示すグラフである。
【図５】本発明のキット１と組み合わせて用いられ得る好ましい一例の本発明の分析装置３１の模式的な概念図である。
【図６】実験例１で得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＧＯＤ酵素活性の吸光度を示すグラフである。
【図７】実験例１に得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。
【符号の説明】
【００９０】
１ コルチゾール分析用キット、２ 基板、３ 試料パッド、４ コンジュゲートパッド、５ 検出部、６ 抗体、７ ハウジング、８ 注入部、９ 液体試料、１０ コルチゾール、１１ コンジュゲート、１５ 吸収パッド、２０ 電極系基板、２１ 電極系、２２ 作用極、２３ 対極、２４ 参照極、３１ 分析装置、３２ 挿入部、３３ 測定部、３４ 換算部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾールを含むコンジュゲート、およびそれを用いたコルチゾールの分析方法、キット、ならびにそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々なストレスを受けた多くの人々が複雑な治療を要する各種疾患にかかっており、予防的に、ストレスの程度を簡易に判定できる方法、キットまたは装置の開発が注目されている。従来、被検者の心拍数、血圧などを測定することにより被検者のストレスを判定する方法が一般的であったが、このようにして判定されるストレスは一過性のものであり、長期的に続くいわゆる慢性ストレスについては判定することが困難であった。
【０００３】
慢性ストレスを判定するための指標として、血液中のコルチゾールなどの副腎皮質ホルモンやアドレナリン、ノルアドレナリンなどの神経伝達物質が知られている。しかし、血液中の成分によってストレスを判定しようとすると、当該成分の採取自体がストレスを伴うという欠点がある。
【０００４】
このため、血液に代えて、採取自体にストレスを伴わない唾液中の成分をストレスの判定の指標とすることが検討されている。たとえば上述したコルチゾールは、唾液中にも微量ではあるが含まれていることが知られている（通常、１０〜１５μｇ／ｄｌ程度）。一般に、生体試料中に含まれる微量タンパクを分析する技術としては、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Asssay）法が多く用いられている。この酵素免疫測定法には、大きく分けて競合法とサンドイッチ法とがあるが、いずれも広く知られており、主に感度向上を主眼とし、標識自体の感度改良に関するものを中心とした種々の改良がなされている（たとえば特開２０００−１８０４４８号公報（特許文献１）、特開２００５−３３７９６０号公報（特許文献２）などを参照。）。
【０００５】
コルチゾールの分析に関しても、上述した酵素免疫測定法を利用して、試料中のコルチゾールを定量分析するためのキットが既に市販されている。しかしながら、このような市販のキットを用いて唾液中のコルチゾールの分析を行う場合には、分析に先立ち、たとえば、遠心分離などによる唾液中の不純物の除去、キット含有試薬の調製および唾液の希釈などの工程数が多く煩雑な作業である前処理が必要であり、また、この前処理や抗原抗体反応を行うためのインキュベーションも長時間を要するため、通常、試料を採取してから定量分析の結果を得るまでに６〜８時間程度かかるという問題があった。また、従来の市販のキットの場合、分光分析を行うための比較的大型の装置が必要となるという問題もあった。
【特許文献１】特開２０００−１８０４４８号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７９６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、唾液中のコルチゾールの迅速な定量分析が可能であり、かつ、当該分析を行うための装置を小型化できる新規な技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するためには、コルチゾールと酸化還元酵素とをリンカーで連結させたコンジュゲートを開発することによって、当該コンジュゲートと試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することができ、これによって試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得、しかも酸化還元酵素で標識していることで、分光分析に代えて、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学計測によりコルチゾールを定量分析できるため、唾液中のコルチゾールのリアルタイムな分析を小型化した装置を用いて行うことが可能となることを見出し、鋭意研究した結果、コルチゾールの新規なコンジュゲートの開発に成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
本発明のコンジュゲートは、コルチゾールと酸化還元酵素とが下記式（Ｉ）で表される構造を有するリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする。
【０００９】
【化１】
【００１０】
（上記式（Ｉ）中、コルチゾール側に配置されるＸはＮＨ、ＮＨＮＨ、ＣＯＮＨＮＨであり、酸化還元酵素側に配置されるＹはＮＨ、ＮＨＮ＝、ＮＨＮＨ、ＣＯ、ＣＯＮＨＮ＝、ＣＯＮＨＮＨであり、Ｒは酸素原子、硫黄原子または窒素原子で中断されていてもよい炭素数２〜２０の炭化水素鎖である。）
本発明のコンジュゲートにおいて、上記式（Ｉ）中におけるＲは炭素数２〜２０のアルキル基であることが好ましい。
【００１１】
また本発明のコンジュゲートにおけるリンカーは、下記式（ＩＩ）で表される構造を有することがより好ましい。
【００１２】
【化２】
【００１３】
また、本発明のコンジュゲートにおいて、酸化還元酵素はグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかであることが好ましく、グルコースオキシダーゼであることが特に好ましい。
【００１４】
本発明はまた、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析する、コルチゾールの分析方法についても提供する。
【００１５】
本発明のコルチゾールの分析方法における液体試料は、唾液から採取したものであることが好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、上述した本発明のコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、コンジュゲートパッドから液体試料中のコルチゾールと前記コンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させるコルチゾール分析用キットについても提供する。
【００１７】
本発明のキットにおける液体試料は、唾液から採取したものであることが好ましい。
本発明のキットは、検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されていることが、好ましい。
【００１８】
本発明はまた、本発明のキットが、検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されている場合、当該キットの検出部の作用極および対極をそれぞれ挿入するための挿入部と、挿入部に電気的に接続され、挿入部に挿入された作用極および対極から前記コルチゾール分析用キットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部とを備える、コルチゾール分析用装置についても提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コンジュゲートと液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することができるようになるため、試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになる。これによって、従来は試料の採取から分析結果を得るまでに６〜８時間ほど要していたのを分オーダー（１０分程度）へと短縮することができ、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。このような本発明により、唾液中のコルチゾールについても簡便・迅速に分析することができるため、ヒトの心身ストレスの研究に有用である。
【００２０】
また本発明によれば、コルチゾールを酸化還元酵素で標識しているコンジュゲートを用いることで、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学計測が可能となり、従来の分光分析を行う場合よりも格段に小型化された装置を用いたリアルタイムな分析の実現が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
＜コンジュゲート＞
本発明のコンジュゲートは、コルチゾール（ＣＯＲＴ）と酸化還元酵素とが特定の構造を有するリンカーを介して連結されたものであることを特徴とする。コルチゾールは、ストレスによって発散される副腎皮質ホルモンのうちの糖質コルチコイドの１種であり、ヒドロコルチゾンとも呼ばれる。コルチゾールは分子量が３００程度のハプテンであり、このコルチゾールに標識（マーカー）を連結させたコンジュゲートを用いてコルチゾールとの競合反応を利用した酵素免疫測定法を実現する場合には、高感度な標識を用いる必要がある。本発明のコンジュゲートは、この高感度な標識として酸化還元酵素を用い、コルチゾールと酸化還元酵素とを特定の構造を有するリンカーを介して連結させたものであることを特徴とする。
【００２２】
本発明のコンジュゲートに用いられるリンカーが下記式（Ｉ）で表される構造を有することが好ましい。なお、下記式（Ｉ）で表されるリンカーは、Ｘがコルチゾール側に配置され、Ｙが酸化還元酵素側に配置されて連結され、Ｙと酸化還元酵素との間は、Ｙおよび酸化還元酵素の種類に応じて単結合または二重結合で結合され得る。
【００２３】
【化３】
【００２４】
上記式（Ｉ）中、コルチゾール側に配置されるＸはＮＨ、ＮＨＮＨ、ＣＯＮＨＮＨであり、中でも反応の工程数が少ない観点からＮＨまたはＮＨＮＨが好ましく、ＮＨＮＨが特に好ましい。また、上記式（Ｉ）中、酸化還元酵素側に配置されるＹはＮＨ、ＮＨＮ＝、ＮＨＮＨ、ＣＯ、ＣＯＮＨＮ＝、ＣＯＮＨＮＨであり、中でも反応の工程数が少ない観点からＮＨ、ＮＨＮ＝またはＮＨＮＨが好ましく、ＮＨＮ＝が特に好ましい。
【００２５】
上記式（Ｉ）中、Ｒは酸素原子、硫黄原子または窒素原子で中断されていてもよい炭素数２〜２０（好ましくは炭素数５〜１５）の炭化水素鎖である。Ｒにおける炭素数が１である場合には、酸化還元酵素の立体構造（二次構造）が崩れてしまう虞があり、また、Ｒにおける炭素数が２０を超える場合には、反応性が悪くなる傾向にあるためである。またＲは場合によっては二重結合および／または三重結合を含んでいてもよい。抗原抗体反応の効率性の観点からは、上記式（Ｉ）中におけるＲは炭素数２〜２０（より好ましくは炭素数５〜１５）のアルキル基であることが好ましい。
【００２６】
本発明のコンジュゲートに用いられるリンカーは、上記式（Ｉ）で表される構造の中でも、下記式（ＩＩ）で表される構造を有することが好ましい。下記式（ＩＩ）で表される構造を有するリンカーを用いることで、アミノ基、カルボキシル基を有しない酸化還元酵素であるグルコースオキシダーゼをコルチゾールとの連結に好適に用いることができるという利点があるためである。
【００２７】
【化４】
【００２８】
また本発明のコンジュゲートにおける酸化還元酵素は、酸化還元反応を触媒する酵素であれば特に制限されるものではないが、好適な例として、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかを挙げることができる。中でも、酵素活性が高く、安価であることから、グルコースオキシダーゼが特に好ましい。
【００２９】
上述したコルチゾールと酸化還元酵素とをリンカーを介して連結させたコンジュゲートは、その作成方法に特に制限はない。以下に好適な一例として、リンカーが上記式（ＩＩ）で表される構造を有し、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである場合のコンジュゲート（ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート）を作成する場合を挙げる。
【００３０】
まず、下記スキーム１に示すように、ＧＯＤに過ヨウ素酸塩および蒸留水を混合して室温でインキュベートすることで反応させ、ＧＯＤにアルデヒド基を結合させる。なお、下記スキーム１におけるＧＯＤのＲ、Ｒ’は共にアルキル基を示す。得られたＧＯＤ−アルデヒドは、反応後の溶液を１０ｍＭ 炭酸アンモニウム（ｐＨ９．３）で平衡化したカラム（具体的にはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム）に通し、不純物を除去する。
【００３１】
【化５】
【００３２】
次に、下記スキーム２に示すように、精製したＧＯＤ−アルデヒドにアジポジヒドラジド（ＡＤＨ）を混合し、低温（たとえば４℃）でインキュベートした後、水酸化ナトリウムで調製したシアノ水素化ホウ素ナトリウムを混合し、同じく低温（たとえば４℃）でインキュベートする。得られたＧＯＤ−ＡＤＨは、反応後の溶液を１０ｍＭ リン酸緩衝液で平衡化したカラム（具体的にはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム）に通し、不純物（ＡＤＨの両端にＧＯＤが結合したものも含む）を除去する。
【００３３】
【化６】
【００３４】
次に、下記スキーム３に示すように、ＧＯＤ−ＡＤＨにおけるＡＤＨと、コルチゾール（コルチゾール−２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ）とを反応させ、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを作成する。なお、コルチゾールとＡＤＨとを結合させるためには、コルチゾールの反応性を高める必要性があるため、前処理として、コルチゾール−２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、ジメチルホルムアルデヒド、ジオキサンおよび蒸留水を混合し、さらにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、１−エチル−３−カルボジイミド塩酸塩を混合し、低温（たとえば４℃）でインキュベートすることで、コルチゾールを予め活性化することが好ましい。このように活性化したコルチゾールを精製したＧＯＤ−ＡＤＨと混合し、低温（たとえば４℃）でインキュベートすることで、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートが得られる。得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートは、反応後の溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したカラム（具体的にはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム）に通し、不純物を除去して、精製する。
【００３５】
【化７】
【００３６】
なお、当該ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート以外のコンジュゲートについても、以下の例に従来公知のコンジュゲート作成技術を適宜応用することで作成可能である。上述した例では、コンジュゲートにおけるリンカーを形成する材料としてＡＤＨを用いた場合を挙げたが、本発明のコンジュゲートを作成する際にリンカーを形成するための材料としては勿論これに限定されるものではない。
【００３７】
ここで、リンカーの一方側の官能基は、コルチゾールのカルボキシル基と結合できる官能基である。このような官能基としては、たとえばアミノ基、ヒドラジン基が挙げられる。一方、リンカーの他方側の官能基は、酸化還元酵素と結合させるための官能基であり、酸化還元酵素の末端官能基の種類によって適宜選択される。たとえば、酸化還元酵素の末端官能基がアミノ基である場合、リンカーの他方側の官能基としてはカルボキシル基が選択される。またたとえば酸化還元酵素の末端官能基がカルボキシル基である場合には、リンカーの他方側の官能基はアミノ基またはヒドラジン基が選択される。また、たとえば酸化還元酵素の末端官能基がアルデヒド基である場合には、リンカー分子の他方側の官能基としてはヒドラジン基が選択される。
【００３８】
このようなリンカーを形成するための材料としては、たとえばジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノヘキサン、ジアミノオクタン、２，４−ジアミノキシレン、エチレンジヒドラジン、アディピック酸ジヒドラジン、ｐ−フェニレンジヒドラジン、ジフェニル−オルソ−ジヒドラジン、６−アミノヘキサン酸、１１−アミノウンデカン酸、各種アミノ酸（プロリンおよびヒドロキシプロリンを除く）、各種ジペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはヒドロキシプロリンではないもの）および各種トリペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはヒドロキシプロリンではないもの）が挙げられる。ただし、６−アミノヘキサン酸、１１−アミノウンデカン酸、各種アミノ酸（プロリンおよびヒドロキシプロリンを除く）、各種ジペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはまたはヒドロキシプロリンではない）および各種トリペプチド（Ｎ末端側はプロリンまたはヒドロキシプロリンではない）などのカルボキシル基とアミノ基を有する分子をリンカーとして用いる場合、当該リンカー自体が縮合反応を起こさないようにするために、カルボキシル基またはアミノ基を保護する必要がある。カルボキシル基の保護基としては、たとえばメチル基、エチル基、ベンジル基およびｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。一方、アミノ基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびアリルオキシカルボニル基などが挙げられる。特に、脱保護の反応を容易に行うことができる観点から、カルボキシル基の保護基としてはベンジル基が、アミノ基の保護基としてはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基が好ましいが、本発明は、これらの保護基に限定されるものではない。
【００３９】
このような本発明のコンジュゲートによれば、当該コンジュゲートを用いて、液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することができるようになるため、これによって試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになり、トータルで分オーダー（１０分程度）へと短縮された、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。また本発明のコンジュゲートは、コルチゾールを酸化還元酵素で標識したものであるため、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学計測が可能となり、従来の分光分析を行う場合よりも格段に小型化された分析装置を用いたリアルタイムな分析の実現が可能となる（詳細は後述）。
【００４０】
本発明のコンジュゲートは、上述した液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法に特に好適に用いることができるものであるが、その用途についてはこれに制限されるものではなく、デヒドロアピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、エラトラジオールなどのステロイドホルモンの定量分析などの手法に応用可能である。また、本発明のコンジュゲートは、コルチゾールだけでなく他のホルモンの迅速分析にも寄与すると考えられ、化学分析・医療分野での応用範囲は広いと考えられる。
【００４１】
＜コルチゾール分析方法＞
本発明は、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを定量分析する、コルチゾールの分析方法についても提供する。本発明のコルチゾールの分析方法によれば、上述した本発明のコンジュゲートと、液体試料中のコルチゾールとの競合反応による酵素免疫測定法を利用することで、従来のコルチゾールの酵素免疫測定法による分析方法とは異なり、試料の前処理が不要となるとともに、抗原抗体反応自体も迅速に行い得るようになるため、トータルで分オーダー（１０分程度）へと短縮された、コルチゾールの即時的で特異性の高い定量分析が可能となる。
【００４２】
本発明のコルチゾールの分析方法において、液体試料中のコルチゾールと本発明のコンジュゲートとを競合反応させるために用いる抗体としては、コルチゾールに対する抗体（抗コルチゾール抗体）であれば特に制限されるものではなく、具体的には、Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−３−ＣＭＯ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−２１（コスモバイオ社製）などの市販の抗コルチゾール抗体などが好適な例として挙げられる。
【００４３】
本発明のコルチゾールの分析方法における液体試料は、唾液から得られたものであることが好ましい。ヒトのストレスを判定するために、唾液中のコルチゾールを分析することが従来から試みられてきたことは上述したとおりであるが、本発明のコルチゾールの分析方法はこのストレスの判定に特に有用である。ここで、本発明のコルチゾールの分析方法を応用して有無を判定するストレスは、心身ストレス（肉体的ストレス、精神的ストレスの両方を包含する）を意味し、また、急性ストレス、慢性ストレスの両方を包含するが、慢性ストレスについての判定に特に有用である。
【００４４】
なお、ストレスの有無を判定するという目的上、液体試料の採取自体は、被験者の身体または精神にストレスをかけることなく行われることが望まれる。このため、液体試料が唾液から採取するものである場合には、液体試料が血液である場合などとは異なり、被験者にストレスを与えることなく短時間で採取することができるという利点がある。
【００４５】
唾液の採取には、たとえば特開２００６−３４５８６９号公報に開示されたような、毛細管現象を利用した器具（キャピラリー）を好適に用いることができる。このような器具を用いることで、１回で、本発明のコルチゾールの分析に十分な量（好ましくは１〜５００μＬ、具体的には１００μＬ程度）の唾液を採取することができる。なお、唾液を採取する被験者の口腔内の場所としては、舌下、舌上、頬肉などが挙げられ、特に制限されるものではない。
【００４６】
＜コルチゾール分析用キット＞
本発明はまた、液体試料中のコルチゾールと、上述した本発明のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を行うためのコルチゾール分析用キットについても提供する。ここで、図１は、本発明の好ましい一例のコルチゾール分析用キット１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は斜視図である。図１に示す例の本発明のコルチゾール分析用キット１は、基板２と、基板２上に形成された、試料パッド３と、コンジュゲートパッド４と、検出部５と基本的に備え、検出部５から突出する電極系基板（後述）など、一部を除いたその全体がハウジング７にて覆われるように構成される。なお、図１（ｂ）は、図１（ａ）に示すキット１からハウジング７を取り除いた状態の斜視図を示している。このような本発明のキット１は、免疫測定法、イムノクロマトグラフィ、電気化学測定を１つの試験紙上にドライケミストリーで構成することで、低廉なディスポーザブル・テストストリップを実現することができるという利点がある。
【００４７】
本発明のキット１に用いられる基板２は、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成される。これによって、試料パッド３に滴下された液体試料９中のコルチゾール１０およびコンジュゲートパッド４に予め含浸された上述した本発明のコンジュゲート１１とが、毛細管現象によって試料パッド３およびコンジュゲートパッド４から水平方向に概ね沿って検出部５にまで移動し、検出部５に予め固定された抗体６と競合反応させることによる酵素免疫測定が可能となる。また後述するように当該キット１による酵素免疫測定の結果の電気化学的な測定を可能とする観点からは、当該基板２としてベース基板上に、ニトロセルロース膜、セルロース膜などが形成されたものが好適に用いられる。なお、ベース基板を形成する材料としては、たとえばポリエチレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレンなどが挙げられるが、上述した性質を有する基板２を実現することができるのであれば、これらに限定されるものではない。上記中でも、耐衝撃性、耐寒性、耐水性、耐電性、絶縁性が良好であり、また化学的に安定で耐薬品性にも優れるという観点からはポリエチレンが好ましく、また、成型加工性が高く、さらに材料費が安価であるという観点から、ポリエステルが好ましい。また、本発明のキットにおける基板は、上述したベース基板の表面に溝が形成されることで、毛細管現象によって液体が移動し得るように構成されていても勿論よいが、液体試料が唾液から採取されたものである場合に液体試料の泡立ちを防止できる観点から、ベース基板上にニトロセルロース膜、セルロース膜などが形成されて実現されてなるのが特に好ましい。
【００４８】
試料パッド３は、ハウジング７に形成された注入口８から液体試料９を注入した際に、当該液体試料９中に含まれる、分析対象であるコルチゾールが当該試料パッド３を通過し、基板２に到達するように構成される。より精度の高い競合反応を行うことができるようになる観点からは、試料パッド３は、液体試料９中に含まれる分子量が比較的大きい夾雑物をろ過し得るような材料で形成されることが好ましい。本発明のキット１においても、液体試料は唾液から採取したものであることが好ましいが、この場合には、ムチンなどがこの夾雑物に該当する。このような分子量が比較的大きい夾雑物をろ過し得るような試料パッド３の形成材料としては、たとえば、ガラス繊維、セルロースなどが挙げられるが、これらに制限されるものではない。なお、図１に示す例では、試料パッド３をコンジュゲートパッド４とは別に設けた例を示しているが、コンジュゲートパッド４に液体試料を直接注入して、コンジュゲートパッド４が試料パッドを兼ねるように構成されていても勿論よい。
【００４９】
コンジュゲートパッド４には、上述した本発明のコンジュゲート１１（好適にはＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート）が予め含浸され、上述した試料パッド３に液体試料９が注入された場合に、この液体試料９中のコルチゾール１０とともに、コンジュゲート１１が毛細管現象によって検出部５にまで移動するように構成される。なお、コンジュゲートパッド４は、図１（ｂ）に示す例のように、基板２と試料パッド３との間に介在されるように形成されることが好ましい。これによって、注入口８から液体試料９が注入された際に、試料パッド３を通過した液体試料９がコンジュゲートパッド４を通過して基板２に到達することになり、液体試料９がコンジュゲートパッド４を通過する際に、当該コンジュゲートパッド４に含浸されていたコンジュゲート１１が液体試料９に溶け込み、コルチゾール１０とコンジュゲート１１とが溶け込んだ液体試料９を検出部５に移動させ、より精度の高い競合反応を行うことができるようになるためである。このようなコンジュゲートパッド４を形成する材料としては、試料パッド３を形成する好適な材料として上述した材料を同様に好適に用いることができる。なお、コンジュゲート１１をコンジュゲートパッド４に予め含浸させておく方法としては、従来公知の適宜の方法を適用でき、特に制限されないが、たとえばコンジュゲートの溶液にコンジュゲートパッドを入れ攪拌する方法、コンジュゲートパッド上にコンジュゲートの溶液を滴下する方法などが好適である。
【００５０】
本発明のキット１における検出部５には、上述したようにコルチゾールの抗体（抗コルチゾール抗体）６が予め固定されている。抗体６としては、市販の抗コルチゾール抗体を特に制限なく用いることができ、具体的には、Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−３−ＣＭＯ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）およびＡｎｔｉ− Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−２１（コスモバイオ社製）などが挙げられる。本発明のキット１の注入口８に液体試料９を注入することで、試料パッド３およびコンジュゲートパッド４から毛細管現象によって移動してきた液体試料中のコルチゾール１０と、コンジュゲート１１とが、検出部５において抗体６と競合反応する（図１（ｂ））。
【００５１】
ここで、上述したように、本発明のキット１で利用する本発明のコンジュゲートは、コルチゾールを酸化還元酵素で標識したものであるため、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定する電気化学測定を利用することができる。すなわち、上述したように、試料パッド３およびコンジュゲートパッド４から毛細管現象によって移動してきた試料中のコルチゾール１０と、コンジュゲート１１とが、検出部５において抗体６と競合反応する場合、検出部５にグルコース（Ｃ6Ｈ12Ｏ6）が十分量存在する場合には、抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素（好適にはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ））と以下のような反応が起こる。
【００５２】
Ｃ6Ｈ12Ｏ6（グルコース）＋Ｏ2→Ｃ6Ｈ10Ｏ6（グルコノラクトン）＋Ｈ2Ｏ2 （１）
Ｈ2Ｏ2→２Ｈ+＋２ｅ-＋Ｏ2 （２）
上記式（２）における電子の生成量は、酸化還元酵素を含むコンジュゲート１１の量に比例し、液体試料９中に含まれていたコルチゾール１０の濃度には反比例することになる。このため、この電子の生成量を、コルチゾール濃度に比例した電気信号を電極測定することで、予め求めておいた検量線にプロットすることで、液体試料中のコルチゾールの濃度を算出することが可能となる。
【００５３】
このような電気化学測定を利用する観点から、本発明のキット１は、図１に示す例のように、検出部５に、電気絶縁性の電極系基板２０と、電極系基板２０上に互いに離間して配置された作用極２２と対極２３とを含む電極系２１が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極２２上に予め固定されているように実現されることが、好ましい。このように実現されたキット１を用いることで、従来の分光分析を行う場合よりも、全体として格段に小型化された分析装置（後述）との組み合わせでの分析が可能となる。
【００５４】
ここで、図２は、本発明のキット１に好適に用いられる電極系２１の一例を模式的に示す上面図である。電極系２１は、上述した電気化学的反応で生じた電流を流すことができ、後述する本発明の分析装置に電気的に接続され、液体試料（好適には、唾液より採取した液体試料）が存在することで、分析装置に電気的に接続された状態で当該分析装置と電気的な回路を形成するように実現される。このような電極系２１は、少なくとも作用極２２と対極２３とを備え、さらには、液体試料の存在を確認するための参照的な電極（図１、２に示す参照電極２４）、キット１を分析装置に挿入したことを確認するための電極（図示せず）などの付属的な電極を含んでいてもよい。
【００５５】
電極系２１における作用極２２上には、上述したように抗体６が予め固定されている。これによって、当該抗体６とコルチゾール１０およびコンジュゲート１１との競合反応により抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素が上述した電気化学反応を起こした際には、発生した電流が作用極２２に流れる。このような作用極２２は、導電体で形成されているのであれば、その具体的な形成材料については特に制限されないが、たとえば炭素、白金、酸化ルテニウム、パラジウムなどが挙げられ、中でも、耐腐食性が高いという観点からは白金が好ましく、また、材料費が安いという観点からは黒鉛が好ましい。なお、作用極２２は、電気絶縁性の電極系基板２０（たとえばポリエチレン製）上に、蒸着または塗布などの方法によって形成される。
【００５６】
また電極系２１における対極２３は、電極系基板２０上に作用極２２とは離間して配置され、液体試料（好適には、唾液より採取した液体試料）が存在することで、上述した作用極２２および後述する分析装置と電気的な回路を形成する役割を果たす。このような対極２３も導電体で形成されているのであれば、その具体的な形成材料については特に制限されるものではなく、上述した作用極２２と同様にたとえば炭素、白金、酸化ルテニウム、パラジウムなどが挙げられ、同様の理由から白金が好ましい。また対極２３も、作用極２２と同様に、電気絶縁性の電極系基板２０（たとえばポリエチレン製）上に、蒸着または塗布などの方法によって形成される。
【００５７】
ここで、電極系基板２０を形成する材料としては、たとえばポリエチレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレンなどが挙げられるが、電気絶縁性を有する電極系基板２０を実現することができるのであれば、これらに限定されるものではない。上記中でも、耐衝撃性、耐寒性、耐水性、耐電性、絶縁性が良好であり、また化学的に安定で耐薬品性にも優れるという観点からはポリエチレンが好ましく、また、成型加工性が高く、さらに材料費が安価であるという観点から、ポリエステルが好ましい。
【００５８】
電極系２１における作用極２２および対極２３は、上述したような電極系基板２０上において互いに離間しているのであれば、その配置は特に制限されるものではなく、作用極２２と対極２３とが対向するように配置されていてもよいし、また、同一平面上に配置されていてもよい。図２には、電極系基板２０上に、円形状の作用極２２を中心にして、対極２３および参照極２４が互いに離間して同心円状に配置され、作用極２２の外周側に、当該作用極２２の周方向に沿って対極２３が対向して配置され、さらに、対極２３の外周側に、当該対極２３の周方向に沿って参照極２４が対向するようにして、同一平面上に配置された例が示されている。すなわち、円形状の作用極２２の外周に、周方向の一部に切欠部を有する円弧状に形成された対極２３が、当該切欠部以外の部分で作用極２２を包囲するように形成されている。また、対極２３の外周側を周方向に包囲するように、略半円弧状の参照極２４が形成されている。
【００５９】
図２に示す例では、それぞれ上述した形状を有する作用極２２、対極２３および参照極２４は、配線部が引き出され、その端部に、それぞれ作用極２２、対極２３および参照極２４への電気的な接続を可能とする電極パッドが形成されている。図１に示す例の本発明のキット１は、基板２の検出部５に、電極系２１が形成された電極系基板２０が挿入され、電極系基板２０の上記電極パッドが形成された部分が、キット１から突出するように形成されており、後述する本発明の分析装置への電気的な接続が可能なように実現されている。
【００６０】
また、図１および図２に示す例のキット１において、作用極２２には、上述したコルチゾールの抗体（抗コルチゾール抗体）６の他に、通常、電子メディエータも予め固定される。ここで、電子メディエータとは、還元することで電子の授受が発生し、液体試料９と作用極２２との間の電子伝達を仲介する化合物をいい、ヨウ素、および、ルテニウム、オスミウム、鉄およびコバルトなどの遷移金属を含む化合物であれば、特に限定されるものではない。このような電子メディエータとして、たとえばヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム、フェロセン、１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フォロセンカルボキシアルデヒド、ハイドロキノン、ブロマニル、オクタシアノタングステンおよびオクタシアノモリブデンなどが挙げられる。
【００６１】
また電子メディエータは、ポリマーを含む構造であってもよく、たとえば（ｉ）ポリ（ビニルフェロセン）、（ｉｉ）ポリカチオン−ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩、ポリカチオン−ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩などのイオン性ポリマー、ならびに、（ｉｉｉ）オスミウム−（２，２’−ビピリジン）錯体またはオスミウム−（１，１０−フェナントロリン）錯体などのオスミウム錯体が、ポリ（１−ビニルイミダゾール）またはポリ（４−ビニルピリジン）などのポリマーに配位した化合物などの有機遷移金属錯体ポリマー（オスミウム系錯体ポリマー）などが挙げられる。これらの中でも、電子伝達性が高いことから、オスミウム系錯体ポリマーが好ましい。
【００６２】
また、電子メディエーターは他の高分子との組成物とすることもできる。電子メディエーターと混合する他の高分子としては、たとえばポリビニルピロリドン、ポリ（１−ビニルイミダゾール）および変性アルブミンなどが挙げられる。これらの中でも、材料費が安価である観点からポリビニルピロリドンが好ましいが、これらの高分子に限定されるものではない。
【００６３】
上述した電子メディエータは、抗体６とともに、作用極２２上から流出することを防止できる程度の結合によって作用極２２に固定されていればよく、たとえば共有結合、イオン結合、配位結合、ファンデルワールス力などの化学的な結合による固定、または、コーティングなどの被膜形成によって作用極２２に固定される。また、電子メディエータを上述した作用極２２を形成する金属と材料と混合し、これを電気絶縁性の電極系基板２０上に蒸着または塗布するようにすることで、作用極２２に電子メディエータを固定するようにしてもよい。中でも、安価にしかも容易に製造できるという観点からは、被膜形成により抗体６および電子メディエータを作用極２２上に固定しておくことが好ましい。
【００６４】
ここで、図３は、図２に示す電極系２１における電気化学的反応の検出原理を模式的に示す図であり、図４は図３に示す電気化学的反応により検出され得る電流（検出電流）の一例を模式的に示すグラフである。本発明のキット１は、図２に示したように、検出部５に、電気絶縁性の電極系基板２０と、電極系基板２０上に互いに離間して配置された作用極２２と対極２３とを含む電極系２１が形成され、かつ、作用極２２に抗体６が予め固定されていることで、上述したコルチゾールとコンジュゲートとの競合反応によって、抗体６の一部にコンジュゲートがトラップされる。この際、十分な量のグルコースの存在下で、コンジュゲートの酸化還元酵素によって上述した電気化学的反応が起こり、図３に示したように作用極２２で発生した電子が対極２３へと流れることになる。このとき、図４に示すグラフ（縦軸は電流値（ｍＡ）、横軸は時間（秒））に示すように、作用極２２から対極２３へと流れる電流値が検出されることになる。
【００６５】
なお、本発明の第１のキット１は、通常、図１に示すように、検出部５に関し、試料パッド３とは反対側の基板２の端部に吸収パッド１５が設けられる。この吸収パッド１５は、毛細管現象によって水平方向に概ね沿って移動し、検出部５を通過した後の液体試料を吸収するためのものであり、上述した試料パッド３を形成する好適な材料として上述した材料にて形成された吸収パッド１５を好適に用いることができる。
【００６６】
なお、上述した本発明のキット１は、市販品であるアッセンブリーキット（Assembly Kit）（ミリポア社製）を用いて好適に作成することができる。
【００６７】
＜コルチゾール分析用装置＞
図５は、上述した本発明のキット１と組み合わせて用いられ得る好ましい一例の本発明のコルチゾール分析用装置３１の模式的な概念図である。本発明はさらに、本発明のキットが上述したように、検出部５に、電気絶縁性の電極系基板２０と、電極系基板２０上に互いに離間して配置された作用極２２と対極２３とを含む電極系２１が形成され、かつ、作用極２２に抗体６が予め固定されているように実現される場合に、このキット１と好適に組み合わせて用いられる分析装置についても提供する。本発明の装置３１は、キット１の検出部５の作用極２２および対極２３をそれぞれ挿入するための挿入部３２と、挿入部３２に電気的に接続され、挿入部３２に挿入された作用極２２および対極２３から、本発明のキット１にて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部３３とを備えることを特徴とする。
【００６８】
本発明の装置３１における挿入部３２は、キット１の電極系２１を挿入できる構造であれば特に制限されるものではない。図５には、挿入部３２が、キット１の電極系２１を挿入した際に、作用極２２および対極２３にそれぞれ電気的に接続する端子３２ａ，３２ｂがそれぞれ設けられている例が示されている。勿論、上述したように、キット１の電極系２１が、液体試料の存在を確認するための参照的な電極（図１および図２に示した例の参照電極２４）、キット１が装置３１の挿入部３２に挿入されたことを確認するための電極などの付属的な電極を具備する場合には、これらの電極と電気的に接触する端子が挿入部３２にさらに設けられる。
【００６９】
なお、上述したように、抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素による電気化学的反応は、グルコースが十分量存在する場合に起こる。このため、本発明の装置３１においては、キット１が挿入部３２に挿入された際に、装置３１内に予め仕込まれたグルコースが挿入部３２に供給され、挿入部３２からキット１の電極系２１を介して検出部５に十分な量のグルコースが供給されるように実現されることが好ましい。
【００７０】
また本発明の装置３１における測定部３３は、上述した挿入部３２に設けられた各端子３２ａ，３２ｂの回路上に配置され、抗体６にトラップされたコンジュゲート１１の酸化還元酵素による上述した電気化学的反応で得られた電流値または電気量を測定する手段である。当該測定部３３は、具体的には、クーロメトリー、ポテンシオメトリーおよびアンペロメトリーなどを用いて好適に実現することができる。
【００７１】
本発明の装置３１はまた、測定部３３により測定された電流値または電気量をコルチゾール濃度に換算する換算部３４を備えることが好ましい。換算部３４は、あらかじめ作成した検量線による算出によって、電流値または電気量をコルチゾール濃度に換算し得るようなプログラムを記録した媒体であれば特に制限されるものではなく、従来公知の適宜の手段を組み合わせて実現することができる。
【００７２】
また本発明の装置３１は、換算部３４で算定された結果を表示部（図示せず）に表示するように実現されることが好ましい。この場合、表示部には、コルチゾール濃度の値をそのまま表示してもよいし、ストレス度と称した別のパラメーターにさらに換算して表示してもよい。また、数値に限らず、当該数値に対応したキャラクターを表示することもできる。
【００７３】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７４】
＜実験例１：ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートの作成＞
コルチゾール（ＣＯＲＴ）との化学結合によるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の酵素活性の低下を抑えるために、アジポジヒドラジド（ＡＤＨ）を介してＧＯＤとＣＯＲＴを結合させ、リンカー分子が上記式（ＩＩ）で表される構造を有し、酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼであるＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを作成した。
【００７５】
まず、上記スキーム１に示したように、１０ｍｇのＧＯＤ、１０μＬの０．１Ｍ 過ヨウ素酸塩（Sodium meta-peropdate）および１ｍＬの蒸留水を混合し、室温（約２４℃）で３０分間インキュベートし、ＧＯＤ−アルデヒドを作成した。得られたＧＯＤ−アルデヒドを含む反応後の溶液を、１０ｍＭ 炭酸アンモニウム（ｐＨ９．３）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して不純物を除去し、ＧＯＤ−アルデヒドを精製した。
【００７６】
次に、精製されたＧＯＤ−アルデヒドに、上記スキーム２に示したように、１００ｍｇのアジポジヒドラジド（ＡＤＨ）を混合し、４℃で一晩中インキュベートした後、１Ｍ 水酸化ナトリウムで調製した１０μＬの５Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウムを混合し、４℃で３時間インキュベートし、ＧＯＤ−ＡＤＨを作成した。得られたＧＯＤ−ＡＤＨを含む反応後の溶液を、１０ｍＭ リン酸緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して不純物を除去し、ＧＯＤ−ＡＤＨを精製した。
【００７７】
次に、コルチゾールとＧＯＤ−ＡＤＨとを反応させるために、５ｍｇのコルチゾール−２１−ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、２００μＬのジメチルホルムアルデヒド、２００μＬのジオキサン、１００μＬの蒸留水を混合した後、１０ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、２０ｍｇの１−エチル−３−カルボジイミド塩酸塩を混合し、４℃で一晩インキュベートしてコルチゾールを活性化する前処理を施した。その後、上記スキーム３に示したように、活性化させたコルチゾール５００μＬと、上述のようにして精製されたＧＯＤ−ＡＤＨ１ｍＬとを混合し、４℃で一晩インキュベートしてＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを作成した。得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを含む反応後の溶液を、１０ｍＭ リン酸緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して不純物を除去し、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを精製した。（ａ）酵素免疫測定法、（ｂ）電気泳動をそれぞれ以下のような手順で行い、上述のようにして作成されたのがＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートであることを確認した。
【００７８】
（ａ）酵素免疫測定法を用いた確認
まず、予めプレートに抗コルチゾール抗体が固相化されているＳａｌｉｖａｒｙ Ｃｏｒｔｉｓｏｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ ＬＬＣ製）に、上述のようにして作成した１０ｍＭ リン酸緩衝液中のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを、１．０６ｍｇ／ｍＬ、０．５３ｍｇ／ｍＬ、０．２１ｍｇ／ｍＬ、０．１０６ｍｇ／ｍＬ、０．０５３ｍｇ／ｍＬ、０．０２１ｍｇ／ｍＬ、０．０１０６ｍｇ／ｍＬの濃度に調製して、それぞれ２５ｍＬずつ滴下し、３７℃で１時間インキュベートした後、抗コルチゾール抗体と抗原抗体反応させた。反応後、プレートを洗浄した後に、ＧＯＤ酵素活性溶液を３００ｍＬ滴下し、４９０ｎｍで吸光度の測定を行った。なお、コントロール条件としては、抗体未固相化プレートを用いた。
【００７９】
図６は、実験例１で得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＧＯＤ酵素活性の吸光度を示すグラフである。ＧＯＤ酵素活性溶液滴下３０分後の１．０６ｍｇ／ｍＬのＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートの吸光度は、抗体なしでは１．４２０、抗体ありでは２．３３８であり、抗体の有無により吸光度に顕著な差が見られた。また、全ての濃度のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートにおいて、抗体なしと比較して、抗体ありの吸光度が高かったことから、特異的にＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートが抗コルチゾール抗体に結合したものと考えられる。
【００８０】
（ｂ）電気泳動を用いた確認
上述のようにして作成した１０ｍＭ リン酸緩衝液中のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲート４．５ｍＬに０．５ｍＬの２−メルカプトエタノールと５ｍＬのＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒとを混ぜ、９５℃の恒温槽で３分間ボイルしたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルを調製した。コントロールとして市販のＧＯＤ（１ｍｇ／ｍＬ）を用い、当該ＧＯＤをレーン１に、上述のように調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルをレーン２にアプライし、泳動条件２０ｍＡでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルを洗浄し、ＣＢＢ染色液で染色を行った。
【００８１】
図７は、実験例１に得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。図７に示されるように、ＧＯＤは７５ｋＤａ、ＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートは２５０ｋＤａのバンドとして検出された。この結果から、上述のようにして得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートは、グルコースオキシダーゼにコルチゾールが複数結合した酵素標識体であると考えられる。
【００８２】
＜実験例２：コルチゾール分析用キットの作成＞
以下のようにして図１に示した例の本発明のコルチゾール分析用キット１を作成した。まず、ポリエチレン（ＰＥ）フィルム（厚み：５００μｍ）を電極系基板２０とし、その上に、電極系２１として作用極２２、対極２３および参照極２４を真空蒸着により形成した。具体的には、まず、レーザプリンタ（ＨＰ Ｌａｓｅｒ Ｊｅｔ ４ＬＪ Ｐｒｏ、ヒューレット・パッカード（株）製）を用いて、電極系基板２０上の電極系２１を形成する部分以外の部分にマスクを形成した。次に、電極系基板２０と電極系２１を形成する金属との密着性を向上するために、電極系基板２０上にクロム（Ｃｒ）層を５ｎｍ真空蒸着させ、その上に、金属薄膜の導電率を向上するために、金（Ａｕ）層を４０ｎｍ真空蒸着させた。さらにその上に、白金（Ｐｔ）層を４０ｎｍ、銀（Ａｇ）層を２００ｎｍ真空蒸着させた。
【００８３】
金属薄膜を蒸着させた部分以外のマスクを剥がし落とすために、上述した真空蒸着後の電極系基板２０を１００ｍＬのアセトンに入れ、３〜５分程超音波洗浄を行ってマスクした部分の除去を行った。水で洗浄した後、エタノールを染み込ませた綿で軽く電極をこすって汚れを除去した。
【００８４】
次に、電極系２１を、ポテンショスタット／ガルバノスタット（１１１２型、（株）ビー・ビー・エス製）の参照極に銀／塩化銀、対極に白金（Ｐｔ）、そして作用極に銀（Ａｇ）を溶かして白金にする２本の電極を繋いだ。次に、２％希硝酸７０ｍＬの中に電極系２１の先端部分を２ｃｍ浸し、ポテンショスタット／ガルバノスタットを用いて＋１ｍＡ、１５０秒で通電させ、最上層のＡｇ層を溶解させＰｔを露出させた。反応後、電極系２１を蒸留水で洗い流して洗浄した。ＡｇＣｌは、銀（Ａｇ）を１００ｍＬのＫＣｌ溶液で酸化させ（銀塩化銀処理）、ＡｇＣｌ層を作成した。このようにして、図２に示したような形状を有する、白金（Ｐｔ）製の作用極２２および対極２３、ならびに、銀／塩化銀（ＡｇＣｌ）製の参照極２４を有する電極系２１を形成した。
【００８５】
次に、作用極２２上に、抗コルチゾール抗体６（Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ−２１、コスモバイオ社製）および電子メディエータであるヘキサシアノ鉄イオン、ならびに、非酸化還元物質のグルコースを同時に固定した。なお、抗コルチゾール抗体６の固定は、以下の（１）〜（９）の手順で行った。
【００８６】
（１）１．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液に５分間親戚し、作用極２２の表面を洗浄後、純水で洗浄する、
（２）１．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液に５分間浸漬し、作用極２２の表面を洗浄後、純水で洗浄する、
（３）濃塩酸を滴下し、１分後に純水で洗浄する、
（４）１０ｍｍｏｌ／Ｌ １１−メルカプトウンデカン酸のエタノール溶液で洗浄した後、純水で洗浄する、
（５）エタノール中で５分間超音波照射する、
（６）１００ｍｇ／ｍＬ Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液１００ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ １−エチル−３−カルボジイミドヒドロクロライド水溶液１００ｍＬを滴下し、１時間反応させる、
（７）活性化した作用極２２の表面を純水で洗浄し、０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する、
（８）０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を作用極２２に９０ｍＬ滴下し、１００秒後に０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した抗体を１０ｍＬ滴下する、
（９）３０分間インキュベートした後に、緩衝液で洗浄する。
【００８７】
次に、たとえば、アッセンブリーキット（Assembly Kit）（ミリポア社製）を用いて、以下のようにして本発明のキットを作成した。まず、アッセンブリーキットに付属のガラス繊維製パッドに実験例１で作成した１０ｍＭ リン酸緩衝液中のＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートを数滴滴下し、コンジュゲートパッド４を形成した。これをアッセンブリーキットに付属の基板上に設置し、さらにその上に、付属のガラス繊維製パッドを設置して試料パッド３を形成した。また基板２に、上述のように電極系２１を形成した電極系基板２０を挿入し、検出部５を形成した。この検出部５に関し、試料パッド３とは反対側の基板２の端部には、キットに付属のガラス繊維製パッドを設置して吸収パッド１５を形成した。このようにして、図１に示した本発明のキット１を作成した。
【００８８】
今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内で全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の好ましい一例のコルチゾール分析用キット１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は斜視図である。
【図２】本発明のキット１に好適に用いられる電極系２１の一例を模式的に示す上面図である。
【図３】図２に示す電極系２１における電気化学的反応の検出原理を模式的に示す図である。
【図４】図３に示す電気化学的反応により検出され得る電流（検出電流）の一例を模式的に示すグラフである。
【図５】本発明のキット１と組み合わせて用いられ得る好ましい一例の本発明の分析装置３１の模式的な概念図である。
【図６】実験例１で得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＧＯＤ酵素活性の吸光度を示すグラフである。
【図７】実験例１に得られたＣＯＲＴ−ＧＯＤコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。
【符号の説明】
【００９０】
１ コルチゾール分析用キット、２ 基板、３ 試料パッド、４ コンジュゲートパッド、５ 検出部、６ 抗体、７ ハウジング、８ 注入部、９ 液体試料、１０ コルチゾール、１１ コンジュゲート、１５ 吸収パッド、２０ 電極系基板、２１ 電極系、２２ 作用極、２３ 対極、２４ 参照極、３１ 分析装置、３２ 挿入部、３３ 測定部、３４ 換算部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチゾールと酸化還元酵素とが下記式（Ｉ）で表される構造を有するリンカーを介して連結された、コンジュゲート。
【化１】
（上記式（Ｉ）中、コルチゾール側に配置されるＸはＮＨ、ＮＨＮＨ、ＣＯＮＨＮＨであり、酸化還元酵素側に配置されるＹはＮＨ、ＮＨＮ＝、ＮＨＮＨ、ＣＯ、ＣＯＮＨＮ＝、ＣＯＮＨＮＨであり、Ｒは酸素原子、硫黄原子または窒素原子で中断されていてもよい炭素数２〜２０の炭化水素鎖である。）
【請求項２】
上記式（Ｉ）中におけるＲが炭素数２〜２０のアルキル基である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
リンカーが下記式（ＩＩ）で表される構造を有する、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【化２】
【請求項４】
酸化還元酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
液体試料中のコルチゾールと、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析する、コルチゾールの分析方法。
【請求項７】
液体試料が唾液から採取したものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、
コンジュゲートパッドから液体試料中のコルチゾールと前記コンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させる、コルチゾール分析用キット。
【請求項９】
液体試料が唾液から採取したものである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されている、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットの検出部の作用極および対極をそれぞれ挿入するための挿入部と、
挿入部に電気的に接続され、挿入部に挿入された作用極および対極から前記コルチゾール分析用キットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部とを備える、コルチゾール分析用装置。
【請求項１】
コルチゾールと酸化還元酵素とが下記式（Ｉ）で表される構造を有するリンカーを介して連結された、コンジュゲート。
【化１】
（上記式（Ｉ）中、コルチゾール側に配置されるＸはＮＨ、ＮＨＮＨ、ＣＯＮＨＮＨであり、酸化還元酵素側に配置されるＹはＮＨ、ＮＨＮ＝、ＮＨＮＨ、ＣＯ、ＣＯＮＨＮ＝、ＣＯＮＨＮＨであり、Ｒは酸素原子、硫黄原子または窒素原子で中断されていてもよい炭素数２〜２０の炭化水素鎖である。）
【請求項２】
上記式（Ｉ）中におけるＲが炭素数２〜２０のアルキル基である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
リンカーが下記式（ＩＩ）で表される構造を有する、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【化２】
【請求項４】
酸化還元酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼから選ばれるいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
液体試料中のコルチゾールと、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートとの競合反応による酵素免疫測定法を利用して液体試料中のコルチゾールを分析する、コルチゾールの分析方法。
【請求項７】
液体試料が唾液から採取したものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
毛細管現象によって液体が移動し得るように構成された基板上に、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートが予め含浸されたコンジュゲートパッドと、コルチゾールの抗体が予め固定された検出部とが形成され、
コンジュゲートパッドから液体試料中のコルチゾールと前記コンジュゲートとをそれぞれ毛細管現象で検出部まで移動させ、検出部においてコルチゾールの抗体と競合反応させる、コルチゾール分析用キット。
【請求項９】
液体試料が唾液から採取したものである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
検出部に、電気絶縁性の電極系基板と、電極系基板上に互いに離間して配置された作用極と対極とを含む電極系が形成され、前記コルチゾールの抗体が作用極上に予め固定されている、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットの検出部の作用極および対極をそれぞれ挿入するための挿入部と、
挿入部に電気的に接続され、挿入部に挿入された作用極および対極から前記コルチゾール分析用キットにて行われた競合反応の結果を電気化学的に測定する測定部とを備える、コルチゾール分析用装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２１０４１７（Ｐ２００９−２１０４１７Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３７２３（Ｐ２００８−５３７２３）
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
[ Back to top ]