新規サルビアノール酸化合物Ｌ、その調製方法及び使用
新規サルビアノール酸Ｌ化合物、その調製方法、上記サルビアノール酸Ｌを含有する医薬組成物及び心臓・脳血管疾患を治療するための薬剤を調製するためのその使用が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝統的な漢方薬分野、より具体的には新種のサルビアノール酸化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルビア・ミルチオルヒザ・ブゲ(Salvia miltiorrhiza Bge.)（ファム・ラビアタエ(Fam. Labiatae)）の乾燥根である丹参（Radix Salviae Miltiorrhizae：ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ）（中国生薬、以下「タンジン」と称する）は、苦味があり、少し冷たい感じがし、うっ血を除去することによって疼痛を止める機能を伴って心臓及び肝臓のチャネルに作用し、血流を活性化させて、また心臓を清浄にすることによって不穏状態を軽減する。一連の現在の薬理学的研究がタンジンに対して行われており、タンジンが冠状動脈を拡張させ、微小循環を改善させて、心臓を保護する効果を有し、また血小板凝集を抑制及び除去し、無酸素耐性の身体能力、並びに抗肝炎、抗腫瘍及び抗ウイルス等の活性を高めることが可能であることを示している。
【０００３】
２００１年に、中国医学科学院 北京協和医科大学の薬物研究所(Institute of Materia Madica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College)のL.N. Li et al.（非特許文献１）は、サルビアノール酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、リトスペルミン酸、ロスマリン酸及びイソサルビアノール酸Ｃ等を含むタンジン又は同属の植物から単離されるフェノール酸誘導体の１３個の水溶性生理活性成分が存在することを報告した。さらに、これらの成分の薬理学的作用もまた開示されている。
【０００４】
Rena. Kasimu et al.（非特許文献２）は、サルビアノール酸Ｋの化学構造について報告した。
【０００５】
外国の研究者らもまた、タンジンの水溶性生理活性成分に関して研究してきた。１９９９年には、ジョージ・ワシントン大学(George Washington University)は、抗ＨＩＶインテグラーゼ及び他のウイルスに対する１３個のサルビアノール酸誘導体の効果に関して米国特許を出願して、最終的に付与されている。これらは全て、タンジンが、多大な潜在性を持ち、かつ開発する価値のある医療用植物資源であることを示唆した。
【０００６】
本発明の上記サルビアノール酸Ｌは、大量のスクリーニングのプロセスにおいてタンジン中で見出された、まさに新規の化合物である。これまで、この化合物に関連する構造及び薬理学的効果はいまだに報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bulletin of Medical Research, 2001, Vol 30(7)
【非特許文献２】Journal of Xinjiang Medical University, 2002, Vol. 25(3)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、サルビアノール酸Ｌの新規化合物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、サルビアノール酸Ｌを含む医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、サルビアノール酸Ｌを調製する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、心臓血管疾患を治療するための薬剤の調製におけるサルビアノール酸Ｌの使用を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】サルビアノール酸Ｌの高分解能質量スペクトログラムを示す図である。
【図２】サルビアノール酸Ｌのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトログラムを示す図である。
【図３】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸Ｌの1Ｈ−ＮＭＲダイアグラムを示す図である。
【図４】ＣＤ3ＯＤを使用することによる１２５ＭＨｚでのサルビアノール酸Ｌの13Ｃ−ＮＭＲダイアグラムを示す図である。
【図５】ＣＤ3ＯＤを使用することによる１２５ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのＤＥＰＴダイアグラムを示す図である。
【図６】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのｇＣＯＳＹダイアグラムを示す図である。
【図７】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのｇＨＭＢＣダイアグラムを示す図である。
【図８】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのｇＨＭＱＣダイアグラムを示す図である。
【図９】試験物質のフリーラジカルを捕捉する能力を示す図である。
【図１０】サルビアノール酸とビタミンＣとの間での還元力の比較を示す図である。
【図１１】血管収縮に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果を示す図である。
【図１２】血管拡張に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果を示す図である。
【図１３】ピツイトリンで下垂体を処理した後の心電図（ＥＣＧ）を示す図であり、ここでＡ）は、モデル対照群から得られる正常なＥＣＧであり、Ｂ）は、ピツイトリンを投与した１５秒後のモデル対照群から得られるものであり、Ｃ）は、ピツイトリンを投与した３０秒後のモデル対照群から得られるものである。
【００１３】
本発明は、下記のように一般式（Ｉ）で表わされる新規化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物及び加水分解可能なエステルに関する：
【化１】
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明によれば、フェノール酸の新規化合物の構造は、物理化学的特性、高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ｇＣＯＳＹ、ｇＨＭＢＣ及びｇＨＭＱＣにより特定された。
【００１５】
本発明の化合物は、淡い帯黄色粉末である。
【００１６】
本発明による化合物は、ＦｅＣｌ3による薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）発色反応で陽性の結果を示し、本発明による化合物がフェノール系化合物であり得ることを示唆した。
【００１７】
ｍ／ｚ ５３７．１０３４で擬分子イオンピークを示した高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）により、分子式は、不飽和度Ω １７を有するＣ27Ｈ22Ｏ12であることが確認された。
【００１８】
ＥＳＩ−ＭＳでは、ｍ／ｚ ５３７での本発明による化合物の分子イオンピークは、まず８’’−カルボキシル基を容易に損失することができ（−４４）、その結果ｍ／ｚ ４９３でフラグメントイオンピークを形成し（サルビアノール酸Ａの分子イオンピークと同じ構造を有する）、次にサルビアノール酸Ａのフラグメンテーション規則性に従ってｍ／ｚ ３１３、ｍ／ｚ ２９５で２つのフラグメントイオンピークを形成する。
【００１９】
本発明によれば、サルビアノール酸Ａのフラグメンテーション規則性は下記の通りに提示される：
【化２】
【００２０】
ｍ／ｚ ４９３、ｍ／ｚ ３１３、ｍ／ｚ ２９５での主なフラグメントイオンピークが、その質量スペクトルにおけるサルビアノール酸Ａの主なイオンピークであることは明らかである。したがって、本発明の化合物は、サルビアノール酸Ａの骨格構造と同じ骨格構造を有する。
【００２１】
プロトン核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは、δ ５．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，４．５Ｈｚ）での酸素に結合されたメテニルプロトンの１個のシグナル、δ ６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、δ ７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、δ ７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ）、δ ６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ）、δ ６．６８（１Ｈ，ｓ）、δ ６．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、δ ６．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、δ ６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、δ ６．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．０Ｈｚ）、δ ７．９２（１Ｈ，ｓ）での芳香族プロトンの１１個のシグナル、δ ３．０１（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．０，８．０，４．５Ｈｚ）での脂肪族プロトンの２個のシグナルを示す。
【００２２】
炭素−１３核磁気共鳴（13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルは、δ ３９．６での１個の脂肪族炭素シグナル、δ ７６．４での酸素に結合されたメテニル炭素の１個のシグナル、δ １７０．１、δ １７３．０、δ １７５．１でのカルボニル炭素の３個のシグナル、及びδ １１７．４、δ １１７．８、δ １１７．８、δ １１８．２、δ １１９．２、δ １２０．２、δ １２１．７、δ １２３．７、δ １２５．７、δ １２６．６、δ １２８．０、δ １２８．８、δ １２９．９、δ １３０．９、δ １４６．２、δ １４６．５、δ １４６．９、δ １４７．４、δ １４７．７、δ １４７．８、δ １５０．３、δ １５０．９での二重結合炭素の２２個のシグナルを含む２７個の炭素シグナルを示す。
【００２３】
ＤＥＰＴスペクトルは、分子中に１×ＣＨ2、１２×ＣＨ及び１４×Ｃが存在することを示す。
【００２４】
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより提供される情報とともに、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける芳香族プロトンの化学シフト及び相互結合を踏まえて、本発明の化合物は、２つの１，３，４−三置換ベンゼン環、１つの１，２，３，４−四置換ベンゼン環、１つのトランス型二重結合及び１つの一置換二重結合を有するとみなされる。これらは全て、丹参由来のサルビアノール酸の化合物の分光分析法の特徴と一致する。
【００２５】
上記の結果として、本発明の化合物は最初に、構造的に丹参における報告されたサルビアノール酸化合物に対して類似性を示すフェノール酸化合物である可能性が高いと推論することができた。
【化３】
【００２６】
従来技術及び関連スペクトル研究と比較して、1Ｈ−ＮＭＲがサルビアノール酸Ａでは、２対のトランス型二重結合プロトンを示したのに対して、本発明の化合物では、１対だけのトランス型二重結合プロトン及び１つの一置換二重結合プロトンを示した以外は、本発明の化合物はサルビアノール酸Ａと類似したスペクトル特性を有することが見出されており、また13Ｃ−ＮＭＲは、本発明の化合物ではサルビアノール酸Ａのカルボニル炭素シグナルよりも１つ多いカルボニル炭素シグナルが存在する一方で、Ｃ−７’’及びＣ−８’’は、それぞれ８ｐｐｍ及び６ｐｐｍだけ低磁場へシフトされることを示す。結果として、本発明の化合物と、サルビアノール酸Ａとの差は、Ｃ−７’’又はＣ−８’’がカルボキシル基で置換されていることである。
【００２７】
Ｃ−７’’及びＣ−８’’の置換をさらに確認するために、本発明の化合物の２Ｄ−ＮＭＲ研究を行って、そのＨＭＢＣスペクトルの結果により、Ｈ−７’’とＣ−９’’、Ｈ−７’’とＣ−２’’、Ｈ−７’’とＣ−２及びＨ−７’’とＣ−６’’との間にロングレンジカップリングが存在することが示された。したがって、本発明の化合物ではＣ−８’’がカルボキシル基により置換されていると推測することができた。
【００２８】
したがって、従来技術と比較して、本発明の化合物は、新規のサルビアノール酸化合物であり、これを「サルビアノール酸Ｌ」と称する。
【化４】
【００２９】
実際に、抽出のプロセス中に本発明の化合物で起こる立体配置及び立体配座の変化に起因して、対応する変化がそのスペクトルデータで起こるが、立体配置変化及び立体配座変化により生じる各種異性体は、本発明の保護範囲の範疇にある。
【００３０】
通常の専門知識及び従来技術によれば、本発明のサルビアノール酸Ｌはまた、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物の形態で使用することができる。本発明によるサルビアノール酸Ｌの上記薬学的に許容可能な塩は、従来の塩形成方法により生成される、無機塩基又は有機塩基から生成される従来の薬学的に許容可能な塩を包含する。塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、プロカイン及びベルベリンと反応させることによって生成される塩が挙げられる。以下で記載するサルビアノール酸Ｌには、式（Ｉ）で表わされるサルビアノール酸Ｌ、並びにその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物及び加水分解可能なエステルが含まれている。
【００３１】
本発明の上記サルビアノール酸Ｌは、医薬組成物の形態で適切に投与され、従来、１種類又は複数種類の薬学的に許容可能なキャリア或いは賦形剤とともに使用することができる。さらに、可能であれば、本発明の上記サルビアノール酸Ｌは、原薬、好ましくは医薬調製物として直接使用される活性成分として投与することができる。他の成分との適合性及び患者に対する安全性の観点から、キャリアは薬学的に許容可能でなくてはならない。
【００３２】
したがって、本発明は、他の治療学的成分及び／又は予防学的成分を伴って又は伴わずに、本発明のサルビアノール酸Ｌ及び１種類又は複数種類の薬学的に許容可能なキャリアを含むサルビアノール酸Ｌの医薬調製物を提供する。これらの調製物は、経口的に、非経口的に（皮下（例えば、注射又はリザーバ型錠剤）、皮内、クモ膜下腔内、筋内（例えば、リザーバ型）及び静脈内を含む）、直腸的に、及び局所的に（例えば、舌下）投与することができる。しかしながら、最も望ましい投与形態は、患者の疾患に依存する。
【００３３】
上記医薬調製物は単位調製物であり得る。また、上記医薬調製物は、薬学分野で既知の任意の方法により調製することができる。これらの方法は全て、本発明のサルビアノール酸Ｌを、１種類又は複数種類の補助剤成分を構成するキャリアと組み合わせる工程を包含する。一般的に言えば、本発明の上記調製物は下記の通りに製造される：本発明のサルビアノール酸Ｌを液体若しくは粉砕した固体キャリア又はその混合物と一様かつ密に組み合わせて、その結果半製品が得られ、必要に応じて、次に上記半製品を所望の調製物へ形成させる。
【００３４】
通常、一連の標準的な薬学的技術を使用して、サルビアノール酸Ｌ及び医薬キャリアを利用することによって本発明の医薬組成物を得ることができる。この技術には、混合、造粒及び加圧成型が含まれる。当業者には既知であるように、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤の特徴及び形態は、下記要素に依存する：混合される活性成分の量、投与経路及び他の既知の要素。本明細書中では上記薬学的に許容可能なキャリアは、組成物とともに投与することができる有機キャリア又は無機キャリアの全種、例えば固体調製物に使用される賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤及びコーティング剤、又は着色剤及び甘味剤のような医薬添加物を指す。上記医薬キャリアは、マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩酸システイン、チオグリコール酸、メチオニン、ビタミンＣ、二ナトリウムＥＤＴＡ、ＥＤＴＡカルシウムナトリウム、一価アルカリ金属の炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩又はそれらの水溶液、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸、アミノ酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、乳酸ナトリウム、キシリトール、マルトース、グルコース、フルクトース、デキストラン、グリシン、デンプン、スクロース、ラクトース、マンニトール、ケイ素誘導体、セルロース及びその誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、グリセロール、ツイーン−８０、寒天、炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、界面活性剤、ＰＥＧ、シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、リン脂質材料、カオリン、タルク粉末、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等からなる群から選択される。
【００３５】
上述の医薬組成物は、錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコート錠及び腸溶錠）；カプセル（例えば、硬質カプセル及び軟質カプセル）；経口溶液；バッカル錠；顆粒；沸騰水中に溶解させた後に摂取する顆粒；丸剤；粉末；ペースト；ペレット；懸濁液；散剤；リカー；注射剤；坐剤；ペースト（例えば、軟膏及び硬膏）；クリーム；スプレー剤；ドロップ及びパッチを含む任意の薬学的に許容可能な投薬形態へ配合され得る。好ましくは、調製物は、カプセル、錠剤、経口溶液、顆粒、丸剤、粉末、ペレット及びペーストのような経口投薬形態で、並びに注射可能粉末、注射剤及び輸液等のような注射の形態で存在する。最も好ましくは、調製物は錠剤の形態である。
【００３６】
これらの望ましい調製物の中でも、上記経口調製物は、一般的に使用される賦形剤、結合剤、増量剤、希釈剤、錠剤加圧成型剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、風味剤及び湿潤剤を含有することができ、必要に応じて、錠剤はコーティングすることができる。
【００３７】
上記賦形剤の好ましい例としては、ラクトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン（例えば、α−デンプン）、デキストリン、結晶性セルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、アミロペクチン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム又はケイ酸アルミニウムマグネシウム等が挙げられる。
【００３８】
上記潤滑剤の好ましい例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルカム粉末及びシリカゲル等が挙げられる。
【００３９】
上記結合剤の好ましい例としては、α−デンプン、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、アミロペクチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ピロリドン等が挙げられる。
【００４０】
上記崩壊剤の好ましい例としては、ラクトース、糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、アミノアルキルナトリウム、ナトリウムカルボキシメチルデンプン、軽質無水ケイ酸、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００４１】
上記コーティング剤の好ましい例としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００４２】
上記着色剤の好ましい例としては、水溶性食用タルトラジン色素（食用赤色２号及び３号、食用黄色４号及び５号、食用青色１号及び２号のような食用色素）、水不溶性レーキ顔料（例えば、上述の水溶性食用タルトラジン色素のアンモニウム塩）及び天然色素（例えば、β−カロテン、クロロフィル及びベンガラ）等が挙げられる。
【００４３】
上記甘味剤の好ましい例としては、サッカリンナトリウム、グリシルレチン酸、アスパルテーム及びステビオシド等が挙げられる。
【００４４】
錠剤を調製する従来方法は、本発明のサルビアノール酸Ｌを１種類又は複数種類の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせること、及び続いて加圧成型すること又は成形することを含む。
【００４５】
さらに、本発明のサルビアノール酸Ｌはまた、経口液体調製物、例えば、水溶性又は油溶性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ等に配合することもできる。本発明のサルビアノール酸Ｌはまた、乾燥製品へ調製し、使用前に水又は他の好適なキャリアと再ブレンドすることができる。この種の液体調製物は、沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン又はアラビアゴム）；非水性キャリア（食用油を含む）（例えば、扁桃油、分留ヤシ油、バター性エステル、プロピレングリコール又はエタノール）；並びに防腐剤（例えば、メチルパラベン、ニパソール及びソルビン酸）を含む従来の添加物を含有する。
【００４６】
非経口的に投与される調製物としては、水性及び非水性の滅菌注射剤が挙げられ、任意にこれらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び等張剤等を含有する。また、非経口的に投与される調製剤としては、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられ、任意にこれらの調製物は、沈殿防止剤及び増粘剤を含有する。上記調製物は、単回用量又は複数回用量容器（例えば、密封アンプル及びバイアル）で保存することができ、これは、凍結乾燥条件下で保管することができ、使用前に滅菌液体キャリア、例えば注射用の水で再溶解させることができる。
【００４７】
直腸投与される調製物は、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバター、ステアリン酸又は他のグリセリド若しくはエチレングリコール）を含有する坐剤であり得る。
【００４８】
口腔で局所的に投与される調製物、例えばバッカル調製物又は舌下用調製物は、トローチ（ここで、活性成分は、スクロース及びアラビアゴムのような風味付けされた基剤中に包埋される）、同様に香錠（ここで、活性成分は、ゼラチン及びグリセロール、又はスクロース及びアラビアゴムのような基剤中に包埋される）が挙げられる。
【００４９】
本発明のサルビアノール酸Ｌは、リザーバ型調製物へ配合され、かかる持続放出調製物は、移植（例えば、皮下移植又は筋内移植）又は筋内注射により投与することができる。したがって、本発明のサルビアノール酸Ｌは、好適なポリマー、疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）若しくはイオン交換樹脂を用いて調製することができ、又は難溶性誘導体、例えば難溶性塩へと調製することができる。
【００５０】
通常の専門知識及び従来技術によれば、本発明に関連した医療効果は、或る特定の疾患又は症状の予防並びに治療を包含する。本発明のサルビアノール酸Ｌの治療上有効な量は、疾患の特性及び患者個人の状態に依存するか、又は医師の助言に従う。概して、成人に関する治療上有効な量は、０．０２ｍｇ／日〜５０００ｍｇ／日、好ましくは１ｍｇ／日〜１５００ｍｇ／日の範囲内である。上述するように、この量は、単回投与量又は複数回用量（これは、適切な間隔で、例えば１日２回、１日３回、１日４回又はそれ以上で患者に摂取される）であり得る。本発明の上記調製物は、錠剤及びカプセルに関しては０．１ｗｔ％〜９９ｗｔ％、好ましくは３０ｗｔ％〜９５ｗｔ％の活性成分、及び液体調製物に関しては３ｗｔ％〜５０ｗｔ％の活性成分を含む。
【００５１】
本発明は下記のように実施する：
ａ）抽出：丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を水で抽出して、アルコールを添加し沈殿させて上清を得て、続いて上清を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｂ）分離：工程ａ）の抽出物を水中に溶解させて、多孔質吸収性樹脂上に適用させて、続いて樹脂を水で溶出させて、溶出液を得て、溶出液を酸性にして、酸性にした溶出液を再び多孔質吸収性樹脂上に適用し、樹脂を酸性水溶液で洗浄して、不純物を除去して、続いて樹脂をエタノールで溶出させて、エタノール溶出液を得て、エタノール溶出液を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｃ）精製：乾燥方法を使用することにより工程ｂ）の抽出物をシリカゲルカラム上に適用し、クロロホルム、メタノール及びギ酸の移動相で定組成溶出させて、溶出液を収集して、ＴＬＣにより溶出プロセス全体をモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得る工程。
【００５２】
工程ａ）では、上記丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を煎じ片にスライスするか、顆粒又は粉末へと粉砕させ、好ましくは煎じ片にスライスすることができる。好ましくは、丹参の根が、丹参生薬として使用される。上記他の生薬は、丹参と適合性である当業者に既知の中国生薬、好ましくはラディックス・ノトギンセング(Radix Notoginseng)、ラディックス・アストラガリ(Radix Astragali)及び／又はラディックス・ポリゴニ・ムルチフロリ(Radix Polygoni Multiflori)を指す。
【００５３】
工程ａ）では、上記水抽出は下記の通り：生薬を、生薬の容積の４倍〜８倍の水で、好ましくは生薬の容積の４倍の水で、１．５時間〜３．５時間、好ましくは２時間煎じて、濾過して、薬物残渣を、薬物残渣の容積の３倍〜６倍の水で１時間〜３時間、好ましくは薬物残渣の容積の３倍の水で１時間煎じて、濾過して、濾液を組み合わせて、濾液を濃縮して、相対密度１．１１〜１．２８（８０℃）、好ましくは１．２（８０℃）を有する抽出物を得ることである。より簡単に単離されるようにフェノール酸物質を塩化するために、アルカリ水溶液が上記水抽出工程で使用されることが好ましく、好ましくは上記アルカリは、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム及び水酸化カリウム、より好ましくは重炭酸ナトリウム又は水酸化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つである。上記アルカリ水溶液は、０．３０％〜０．６８％の濃度での重炭酸ナトリウム水溶液、又は０．００２５‰〜０．００４‰の濃度での水酸化ナトリウム水溶液、好ましくは０．４５％の濃度での重炭酸ナトリウム水溶液である。
【００５４】
工程ａ）では、上記アルコール沈殿は下記の通り：エタノールの含有量が６５％〜７０％（２５℃）、好ましくは７０％になるまで９５％エタノールを抽出物に添加し、沈殿させて、１２時間〜３６時間、好ましくは２４時間静置して、減圧条件下でエタノールを回収することによって上清を濃縮して、相対密度１．３０〜１．３８（６０℃）、好ましくは１．３７（６０℃）を有する抽出物を得ることである。
【００５５】
脂溶性不純物をより良好に排除するために、アルコール抽出が、水抽出工程の前に実施されることが好ましい。アルコール抽出工程では、生薬の容積の５倍〜８倍の５０％〜９５％エタノールで２回、各回毎に１時間〜２時間煎じて、濾過して、エタノール抽出溶液を廃棄して、上述の水抽出として薬物残渣を抽出する。
【００５６】
工程ｂ）では、上記多孔質樹脂カラムは、無極性又は微極性の樹脂、例えば、ＡＢ−８、ＨＰＤ４５０、ＨＰＤ７００、Ｄ１０１、Ｄ４０２０又はＸ５、好ましくはＡＢ−８であり得る。生薬対多孔質吸収性樹脂の重量比は、５：１〜１：１、好ましくは４：１である。樹脂カラムは、総容積の８倍〜１５倍、好ましくは総容積の１２倍の水で洗浄し、それにより水溶出液が得られる。
【００５７】
塩酸を、水溶出液のｐＨ値を２．２〜３．５、好ましくは３．０へ調整するために水溶出液に添加する。
【００５８】
上記酸性溶出液を、再度多孔質吸収性樹脂上へ適用して、生薬対多孔質吸収性樹脂の重量比は５：１〜１：１、好ましくは４：１であり、カラムを、溶出液がほぼ無色になるまで、ｐＨ値２．２〜３．５、好ましくは３．０を有する塩酸で洗浄する。
【００５９】
さらに、３倍〜８倍の５０％〜９５％エタノール、好ましくは４倍の９５％エタノールを使用して、カラムを洗浄し、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない抽出物を得る。
【００６０】
工程ｃ）では、工程ｂ）で濃縮された抽出物を有機溶媒、好ましくはメタノールで溶解し、クロマトグラフィシリカゲルと混合して、好ましくは添加される２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。十分に混合されたサンプルを、十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、好ましくは充填されるシリカゲルは、２００メッシュ〜３００メッシュのシリカゲルであり、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は９０：１０：３〜４０：１０：０．５である）、好ましくはクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。上記溶出は、定組成溶出（溶出液の比は不変である）又は勾配溶出（溶出液の比は、時間の経過とともに変化する）であり得る。ここで、上記勾配溶出は、当該技術分野における常識を使用することによって、収集される物質の極性に従って調整することができ、例えば、溶出液の極性が徐々に増大した。溶出プロセスを正確にモニタリングするために、クロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は５０：１０：２である）の展開溶媒を用いたＴＬＣが好ましい。
【００６１】
特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌが得られる。
【００６２】
より良好な分離効果を達成するために、分取用液体クロマトグラフィを分離ツールとして使用することができる。例えば、サルビアノール酸Ｌは、下記分離条件で調製される：Waters製のＤｅｌｔａ ｐｒｅｐ ４０００半分取用液体クロマトグラフィ、カラム：Aglient製のＺｏｒｂａｘ ＸＤＢ−Ｃ１８（２１．２ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）、移動相：アセトニトリル：０．１％ギ酸水溶液（１５：８５）、流速：２０ｍｌ／分、検出波長：２８０ｎｍ。
【００６３】
薬力学的試験で示されるように、サルビアノール酸Ｌのフリーラジカルを捕捉する(scavenging)能力は、ビタミンＣの能力よりもはるかに高い（表３、図９を参照）。さらに、本発明のサルビアノール酸Ｌの還元力は、ビタミンＣの還元力よりも高い（図１０を参照）。本発明のサルビアノール酸Ｌは、抗酸化及びフリーラジカル捕捉の活性を保有する。結果として、本発明のサルビアノール酸Ｌは、フリーラジカルを捕捉する活性及び予防的抗酸化機能を有する薬へ調製することができる。
【００６４】
さらに、本発明はまた、心臓血管疾患を治療するための薬の調製における上記サルビアノール酸Ｌの使用に関する。上記心臓血管疾患が、低酸素誘導性血管拡張機能不全、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化状態により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン障害、並びに急性心筋虚血からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である。
【００６５】
本発明の薬力学的試験で示されるように、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、ノルエピネフリンの血管収縮曲線の或る特定の右側シフトを引き起こし得るが、有意な差はない。サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、３つのＡｃｈ濃度（１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ、１０-3ｍｏｌ／Ｌ）で無酸素性血管輪に対して血管拡張効果を有意に増強した（Ｐ＜０．０５）。サルビアノール酸Ｌが、低酸素により引き起こされる血管拡張機能不全を改善させるのに重要な役割を果たすことが示される（表７〜表８、及び図１１〜図１２を参照）。
【００６６】
本発明のサルビアノール酸Ｌは、虚血及び低酸素症により引き起こされる血管内皮傷害の寛解、血管内皮過形成の促進、虚血及び低酸素により引き起こされる心筋細胞傷害の改善、アテローム性動脈硬化症に対する抵抗性、血小板凝縮の阻害及び血栓形成に対する抵抗性を含む心臓血管系に対する広範な薬力学的効果を有する。さらに、上記サルビアノール酸Ｌは、冠状動脈を拡張させる効果、冠血流を増大させる効果及び脳虚血により引き起こされる傷害を防止する効果を有する。
【００６７】
本発明の薬力学的試験で示されるように、本発明のサルビアノール酸Ｌは、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化水素により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経系細胞傷害に対して有意な改善効果を有し、細胞生存率を高めることができ、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化状態から神経細胞を保護する機能を有する（表１２〜表１５を参照）。さらに、本発明のサルビアノール酸Ｌは、急性心筋虚血を治療する効果を有する（表１６〜表１７を参照）。
【実施例】
【００６８】
抗酸化及びフリーラジカル捕捉に対する本発明のサルビアノール酸Ｌの好適な効果はさらに、下記の具体的な実験データにより示される。
【００６９】
別記されない限り、本発明で言及される単位％及び‰は重量比を表す。
【００７０】
実施例１ サルビアノール酸Ｌの調製
タンジン煎じ片を、抽出器中に入れた。生薬の容積の４倍の水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）を抽出器へ加えて、２時間煎じて、濾過した。薬物残渣は、薬物残渣の容積の３倍の水で１時間煎じ続けて、濾過して、濾液を組み合わせて、濃縮して、相対密度１．２（８０℃）を有する抽出物を得た。最終エタノール含有量が７０％（２５℃）になるまで９５％エタノールを抽出物に添加して、沈殿を実施して、１２時間以上の間、静置させた。エタノールを減圧条件下で回収して、相対密度１．３７（６０℃）を有する抽出物を得た。
【００７１】
上述の抽出物を水で溶解させた後、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上に適用させて、カラムを総容積の１２倍の水で溶出させて、水溶出液を得た。水溶出液のｐＨは、塩酸でｐＨ３．０に調整した。再び、酸性にした水溶出液をＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用させた。ｐＨ値３．０を有する酸性水溶液を使用して、溶出液がほぼ無色になるまで、カラムを洗浄した。さらに、総容積の４倍の容積を有する９５％エタノールを使用して、溶出させて、溶出液を得た後、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない粘度の高い抽出物を得た。
【００７２】
得られた抽出物をメタノールで溶解させて、ここで２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルを添加して、混合して、添加されるクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。混合サンプルを十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。ＴＬＣを使用して、全溶出プロセスをモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得た。
【００７３】
高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）を使用することによって、擬分子イオンピークは［Ｍ−Ｈ］+ｍ／ｚ ５３７．１０３４であった。
【００７４】
【表１】
【００７５】
ＤＥＰＴスペクトルは、分子中に１×ＣＨ2、１２×ＣＨ及び１４×Ｃが存在することを示した。
【００７６】
実施例２ サルビアノール酸Ｌの調製
タンジン及びサンシチ（Sanqi）の煎じ片を、抽出器中に入れた。生薬の容積の６倍の水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）を抽出器へ加えて、３時間煎じて、濾過した。薬物残渣は、薬物残渣の容積の５倍の水で２時間煎じ続けて、濾過して、濾液を組み合わせて、濃縮して、相対密度１．２５（８０℃）を有する抽出物を得た。最終エタノール含有量が６８％（２５℃）になるまで９５％エタノールを抽出物に添加して、沈殿を実施して、１２時間以上の間、静置させた。エタノールを減圧条件下で回収して、相対密度１．３２（６０℃）を有する抽出物を得た。
【００７７】
上述の抽出物を水で溶解させた後、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上に適用させて、カラムを総容積の１２倍の水で溶出させて、水溶出液を得た。水溶出液のｐＨは、塩酸でｐＨ２．５に調整した。再び、酸性にした水溶出液をＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用させた。ｐＨ値３．０を有する酸性水溶液を使用して、溶出液がほぼ無色になるまで、カラムを洗浄した。さらに、総容積の５倍の９５％エタノールを使用して、溶出させて、溶出液を得た後、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない粘度の高い抽出物を得た。
【００７８】
得られた抽出物をメタノールで溶解させて、ここで２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルを添加して、混合して、添加されるクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。混合サンプルを十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。ＴＬＣを使用して、全溶出プロセスをモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得た。
【００７９】
高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）を使用することによって、擬分子イオンピークは［Ｍ−Ｈ］+ｍ／ｚ ５３７．１０２７であった。
【００８０】
【表２】
【００８１】
ＤＥＰＴスペクトルは、分子中に１×ＣＨ2、１２×ＣＨ及び１４×Ｃが存在することを示した。
【００８２】
実施例３ サルビアノール酸Ｌの調製
タンジン煎じ片を抽出器に入れた。生薬の容積の６倍の８５％エタノールを抽出器に加えて２回、各回毎に２時間煎じて、濾過した。エタノール抽出溶液は廃棄した。
【００８３】
薬物残渣を、薬物残渣の容積の４倍の水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）で２時間煎じて、濾過し、薬物残渣を、薬物残渣の容積の３倍の水で１時間、煎じ続けて、濾過した。濾液を組み合わせて、濃縮して、相対密度１．２（８０℃）を有する抽出物を得た。最終エタノール含有量が７０％（２５℃）になるまで９５％エタノールを抽出物に添加して、沈殿を実施して、１２時間以上の間、静置させた。エタノールを減圧条件下で回収して、相対密度１．３７（６０℃）を有する抽出物を得た。
【００８４】
上述で得られた抽出物を水で溶解させた後、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上に適用させて、カラムを総容積の１２倍の水で溶出させて、水溶出液を得た。水溶出液のｐＨは、塩酸でｐＨ３．０に調整した。再び、酸性にした水溶出液をＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用させた。ｐＨ値３．０を有する酸性水溶液を使用して、溶出液がほぼ無色になるまで、カラムを洗浄した。さらに、総容積の４倍の９５％エタノールを使用して、溶出させて、溶出液を得て、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない粘度の高い抽出物を得た。
【００８５】
得られた抽出物をメタノールで溶解させて、ここで２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルを添加して、混合して、添加されるクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。混合サンプルを十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。ＴＬＣを使用して、全溶出プロセスをモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得た。
【００８６】
実施例４ サルビアノール酸Ｌの錠剤の調製
配合：
サルビアノール酸Ｌ １００ｇ
微結晶性セルロース ５０ｇ
ラクトース ５０ｇ
デンプン ５１ｇ
ナトリウムカルボキシメチルデンプン １２ｇ
５％ ＰＶＰ無水エタノール 適量
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
【００８７】
上記配合物を１０００個の錠剤に調製した。
【００８８】
調製プロセス：
１．造粒
サルビアノール酸Ｌ及び配合中に列挙した他の補助剤を、それぞれ１００メッシュの篩に通して篩過した。配合投与量に従って、サルビアノール酸Ｌ、微結晶性セルロース、デンプン及びナトリウムカルボキシメチルデンプンを、同等に漸増する方法を用いることによって十分ブレンドした。適量の５％ ＰＶＰ無水エタノールを使用して、軟質材料を製造して、１４メッシュの篩を用いて造粒して、５０℃〜６０℃で１時間乾燥させた。配合投与量に従ってステアリン酸マグネシウムを添加して、１４メッシュの篩で顆粒を篩過した。
【００８９】
２．錠剤の加圧成型
得られた顆粒を、特定のダイアモンド形状のパンチで加圧成型して、錠剤を調製した。
【００９０】
実施例５ サルビアノール酸Ｌのカプセルの調製
配合：
サルビアノール酸 １００ｇ
デンプン ２００ｇ
ナトリウムカルボキシメチルデンプン １２ｇ
５％ ＰＶＰ無水エタノール 適量
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
【００９１】
上記配合物を１０００個のカプセルに調製した。
【００９２】
調製プロセス：
１．造粒
サルビアノール酸Ｌ及び配合中に列挙した他の補助剤を、それぞれ１００メッシュの篩に通して篩過した。配合投与量に従って、サルビアノール酸Ｌ、デンプン及びナトリウムカルボキシメチルデンプンを、同等に漸増する方法に従って十分ブレンドした。適量の５％ ＰＶＰ無水エタノールを使用して、軟質材料を製造して、１４メッシュの篩を用いて造粒して、５０℃〜６０℃で１時間乾燥させた。配合投与量に従ってステアリン酸マグネシウムを添加して、１４メッシュの篩で顆粒を篩過した。
【００９３】
２．封入
得られた顆粒をカプセルへ充填した。
【００９４】
実施例６ サルビアノール酸Ｌの注射剤の調製
配合：
サルビアノール酸Ｌ １００ｇ
マンニトール １００ｇ
注射用の水 ２５００ｍｌまで
【００９５】
上記配合物を１０００ユニットに調製した。
【００９６】
調製プロセス：
サルビアノール酸Ｌを取り出して、注射用の水１０００ｍｌで溶解させて、一様に攪拌した。マンニトールを、注射用の水５００ｍｌで溶解させて、上述のサルビアノール酸Ｌ溶液に添加して、一様に攪拌して、そこへ活性炭０．５ｇを添加して、不変温度で２０分間攪拌して濾過した。濾液のｐＨを４．５〜５．０へ調整して、注射用の水で２５００ｍｌまで希釈して、滅菌濾過して、別個に充填して製品を得た。
【００９７】
実施例７ サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の調製
配合：
サルビアノール酸Ｌ １００ｇ
マンニトール １００ｇ
注射用の水 ２０００ｍｌ
【００９８】
上記配合物を１０００ユニットに調製した。
【００９９】
調製プロセス：
サルビアノール酸Ｌ及びマンニトールを秤量して、攪拌することによって注射用の水１５００ｍｌで溶解させて、そこへ２０分間攪拌することにより脱色のために活性炭０．５ｇを添加して、溶液を微小空洞フィルターフィルム（０．４５μｍ）に通して濾過して、炭素を除去して、注射用の水で２０００ｍｌまで希釈した。得られた溶液を滅菌濾過して、別個に充填して、凍結乾燥させて、製品を得た。
【０１００】
薬力学的実施例
薬力学的実施例１ フサルビアノール酸Ｌのフリーラジカル捕捉反応
フリーラジカルは、活性の高い物質の一種であると考えられている。フリーラジカルは、細胞の代謝プロセス中に順次生成され得る。それらの直接的又は間接的な酸化効果に起因して、フリーラジカルは、生理学的プロセス及び病理学的プロセスに広く関与することが示されている。過剰量のフリーラジカルの存在下で、フリーラジカルは常に、酸化により身体中の高分子（例えば、核酸、タンパク質、糖類及び脂質等）を攻撃する。酸化によるこれらの物質の変性（架橋及び破壊）により、フリーラジカルは細胞構造及び機能に損傷を引き起こして、身体の組織破壊及び変性変化をもたらす。多くの研究により示されているように、フリーラジカルは、多数の疾患の病理学的プロセスに寄与しており、心臓血管疾患、幾つかのがん、老人性白内障及び黄斑変性症、幾つかの炎症及び多様なタイプのニューロン疾患のような多くの疾患を引き起こす。
【０１０１】
化学構造分析は、サルビアノール酸化合物がフェノール性ヒドロキシル基の供与体であり、それらの抗酸化活性に対する構造基盤を有することを示す。この研究では、サルビアノール酸Ｌのフリーラジカル捕捉活性を観察するのに、１，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカル捕捉反応モデルを使用している。
【０１０２】
１．試薬及び装置
９５％を超える純度を有するサルビアノール酸Ｌは、Tianjin Tasly Group Academyにより提供され、実施例１の方法に従って調製した。
【０１０３】
ビタミンＣ及びＤＰＰＨは、SIGMA Inc.から購入した。
【０１０４】
紫外線分光光度計（ＵＶ−１８００）は、Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.から購入した。
【０１０５】
２．実験方法
総反応容積は２ｍｌであった。８０％メタノール（ｖ／ｖ）中の種々の濃度でのサンプル溶液１ｍｌを、１００μＭのＤＰＰＨメタノール溶液に添加して、一様に混合して、暗所で２５℃で２０分間溶液を反応させた。反応溶液の吸光度を５１７ｎｍで測定した。この研究では、ビタミンＣを陽性対照とみなした。フリーラジカル捕捉率を下記方程式に従って算出した：
フリーラジカル捕捉率（％）＝［１−Ａサンプル／Ａ対照）／Ａ対照］×１００％
（式中、Ａサンプルは、試験サンプルの吸光度を意味し、Ａ対照は、ブランク対照の吸光度を意味する）。
【０１０６】
３．実験結果
表３及び図９は、種々の濃度でのサルビアノール酸Ｌ及びビタミンＣのＤＰＰＨフリーラジカル捕捉率を示す。サルビアノール酸Ｌは、ビタミンＣのフリーラジカル捕捉率よりもはるかに高いフリーラジカル捕捉率を有していた。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
薬力学的実施例２ サルビアノール酸Ｌの還元力の測定
或る程度までは、予防的抗酸化に関する潜在能力は、薬物の還元力により表わされる。本発明のサルビアノール酸Ｌの還元力に関して研究が行われた。
【０１０９】
１．試薬及び装置
９５％を超える純度を有するサルビアノール酸Ｌは、Tianjin Tasly Group Academyにより提供され、実施例１の方法に従って調製した。
【０１１０】
分析上純粋なフェリシアン化カリウムは、Tianjin No.1 Chemical Reagent Factoryから購入した。
【０１１１】
分析上純粋なトリクロロ酢酸は、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.から購入した。
【０１１２】
分析上純粋な塩化第二鉄は、Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Science and Technology Co., Ltd.から購入した。
【０１１３】
ビタミンＣは、SIGMA Inc.から購入した。
【０１１４】
紫外線分光光度計（ＵＶ−１８００）は、Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.から購入した。
【０１１５】
冷却遠心機（Ｚ３２３Ｋ）は、HEMMLE（ドイツ）から購入した。
【０１１６】
２．実験方法
種々の濃度のサルビアノール酸Ｌ及び１．０％フェリシアン化カリウム溶液を含有する２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍｌを、それぞれ吸い取って、水浴（５０℃）で２０分間加熱した後に氷浴上で冷却した。トリクロロ酢酸溶液（１０％）０．５ｍｌを添加して、１０００ｇ／分で１０分間遠心分離した。得られた上清１．０ｍｌを採取して、そこへ蒸留水１．０ｍｌ及び塩化第二鉄溶液（０．１％）０．２ｍｌを添加して、さらに１０分間静置させて、吸光度を７００ｎｍで測定した。同時に、ブランク実験を実行した。ビタミンＣは、強力な還元物質であり、この研究において陽性対照として役割を果たす。サンプルの還元力は、試験サンプルの吸光度から、ブランク対照の吸光度を差し引くことにより表わされる。したがって、吸光度が高いほど、還元力が強力であることを意味する。
【０１１７】
３．実験結果
図１０に示されるように、両方の物質が濃度依存的な吸光度を有し、サルビアノール酸Ｌの還元力は、ビタミンＣの還元力よりもはるかに強力であった。
【０１１８】
下記薬力学的実験例３〜５で使用されるＮｏ．１抽出物及びＮｏ．２抽出物の成分の決定並びに調製
実験で使用される材料は全て、Tianjin Tasly Group Academy TCM Instituteにより提供された。Ｎｏ．１抽出物の含有量は、生薬 ６．８２５ｇ／ｇ（Ｎｏ．１抽出物）であり、Ｎｏ．２抽出物は、生薬 ４．１６２ｇ／ｇ（Ｎｏ．２抽出物）であった。
【０１１９】
調製プロセス
Ｎｏ．１抽出物の調製プロセス：
８９．８ｗｔ％の丹参（中国名：タンジン）及び９．６ｗｔ％のラディックス・ノトギンセング（中国名：サンシチ）の混合物を水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）で２回（５倍の水で２時間、また４倍の水で１時間）、順次抽出した。９５％エタノール（ｖ／ｖ）を使用して、還流を用いて水抽出溶液を濃縮した。エタノール抽出溶液中の最終エタノール含有量が７０％になるまで、エタノール沈殿を実施した。さらに一晩静置した後、上清を採取して、濃縮して、Ｎｏ．１抽出物を得た。
【０１２０】
Ｎｏ．２抽出物の調製プロセス：
８９．８ｗｔ％の丹参（中国名：タンジン）及び９．６ｗｔ％のラディックス・ノトギンセング（中国名：サンシチ）の混合物を水で２回（５倍の水で２時間、また４倍の水で１時間）、順次抽出した。９５％エタノール（ｖ／ｖ）を使用して、還流を用いて水抽出溶液を濃縮した。エタノール抽出溶液中の最終エタノール含有量が７０％になるまで、エタノール沈殿を実施した。さらに一晩静置した後、上清を採取して、濃縮して、Ｎｏ．２抽出物を得た。
【０１２１】
サルビアノール酸Ｌを本発明の実施例１の方法により調製した。
【０１２２】
検出方法
分析条件は下記の通りであった：Waters製の２６９５ ＨＰＬＣ、Agilent製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）クロマトグラフィカラム、０．０２％リン酸水溶液を移動相Ａとして使用し、０．０２％リン酸を含有する８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を移動相Ｂとして使用し、勾配溶出は、下記表４に従って実施し、流速は１ｍｌ／分であり、検出波長は２８０ｎｍであり、カラム温度は３０℃であり、記録時間は５０分であった。
【０１２３】
【表４】
【０１２４】
Ｎｏ．１抽出物及びＮｏ．２抽出物中の各成分の含有量を、下記表５及び表６に提示した。
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
薬力学的実施例３ 単離ラット胸部大動脈に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果
実験材料
１．試験材料及び試薬：サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、Tianjin Tasly Group Academy TCM Instituteにより提供された。クエン酸ノルエピネフリン（ＮＡ）及びアセチルコリン（ＡＣＨ）はSigma Inc.から購入して、バッチ番号は、１３７７５１１及び４４９０８１３１であった。クレブス溶液を調製するための原材料には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、グルコース及び塩化カルシウムが含まれていた。
【０１２８】
２．主な装置：ＭｅｄＬａｂ（登録商標）単離組織トラフ及びＭｅｄｌａｂ−Ｕ／８Ｃ獲得システムは、Nanjing Medease Science and Technology Co., Ltd.により製造された。他の装置としては、張力変換器、デジタル制御超恒温槽ＳＣ−１５、化学天秤、浄水器及び酸素ボンベが挙げられた。
【０１２９】
３．実験動物：適正な体重のＳＤラット（雄又は雌）は、証明書番号ＳＣＸＫ（Jing）２００７−０００１とともにBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から提供された。ラットは全て、動物給餌室で室温２０℃〜２５℃でラット特別食（Beijing Keaoxieli Diet CO., Ltd.により製造）及び水道水が与えられ、１２時間照射した。
【０１３０】
実験方法
１．投与用量の設計
サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の用量は、他のサルビアノール酸の薬力学的実験に基づいて確認された。この研究では、用量は、０．１ｍｇ／ｍｌであった。
クレブス溶液（ｍｏｌ／Ｌ）：ＮａＣl（１２０）、ＮａＨＣＯ3（２５）、ＫＨ2ＰＯ4（１．２）、ＭｇＳＯ4（１．２）、ＫＣｌ（４．５）、ＣａＣｌ2（１．２５）、Ｃ6Ｈ12Ｏ6（グルコース１１．１）。
ＫＣｌ：各時点でＫＣｌ（３ｍｏｌ／Ｌ）１００μｌを添加した（最終濃度は６０ｍｍｏｌ／Ｌ）。
ＮＡ：１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度は１０-6ｍｏｌ／Ｌ）は、総計４つの勾配で希釈した。
ＡＣＨ：１０-3ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度は１０-5ｍｏｌ／Ｌ）は、総計４つの勾配で希釈した。
【０１３１】
２．グループ分け
ラットには、その日に薬物の調製に従って、無作為に群に配置した自由食を与えた。各群には８匹のラットが存在し、各ラットから入手可能な４つの血管輪データが存在することを確認した。この研究では、ラットを３つの群：正常群、低酸素モデル群及びサルビアノール酸Ｌ＋低酸素モデル群に分けた。
【０１３２】
３．実験方法
ＳＤラットには、その日に薬物の調製に従って、無作為に群に配置した自由食を与えた。各群には８匹のラットが存在した。ラットを頸椎の脱臼により屠殺して、迅速に開胸して、胸部大動脈を取り出した。０℃で、胸部大動脈を、酸素を吹き込んだクレブス溶液へ入れて、ここで結合組織を除去して、胸部大動脈を、直径約２ｍｍを有する血管輪にして、血管輪を、一定温度３７℃で分離浴トラフ中で慎重に付した。酸素をトラフへ吹き込み、そこへ張力変換器及びマルチチャネル生理学的記録計を接続させた。基礎張力は２ｇであり、血管輪は４５ｍｉｎ-1時間平衡化させて、クレブス溶液を１５分間隔で交換した。平衡化させた後、血管輪を塩化カリウム溶液で２０分間前処理して、溶出させた。１５分の平衡化後、血管輪を再び塩化カリウム溶液でもう１回前処理して、生理学的に極値の血管収縮を達成した。次に、種々の勾配レベル（１０-7ｍｏｌ／Ｌ、１０-6ｍｏｌ／Ｌ、１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ）を踏まえてＮＡを添加して、血管収縮を観察した。ピーク値に到達すると、値は定常期で安定化した。続いて、種々の勾配レベル（１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ、１０-3ｍｏｌ／Ｌ、１０-2ｍｏｌ／Ｌ）を踏まえてＡＣＨを添加して、血管拡張を観察した。ＮＡ及びＡＣＨを添加するプロセス中は、クレブス溶液は交換することができない。
【０１３３】
低酸素モデル群では、酸素の供給は、塩化カリウム溶液により２回前処理した後に、２０分間懸濁した。同時に、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末又はクレブス溶液（等量で）を添加して、一緒に浸して、その後種々の勾配レベルを踏まえてＮＡ及びＡＣＨを添加した。クレブス溶液は、低酸素の始まりから、ＡＣＨの最終濃度勾配の添加の終わりまで交換することができない。
【０１３４】
結果は、ｔ検定を使用することにより統計学的に解析した。
【０１３５】
実験結果
１．血管収縮に対する効果
結果で示されるように、サルビアノール酸Ｌの乾燥粉末は、本実験条件下では正常群と比較して血管収縮に対して有意な効果が見られず、血管−張力曲線の明らかな右側シフトが見られた。データは表７に見られた。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
血管収縮に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果は図１１に見られた。
【０１３８】
２．血管拡張に対する効果
この結果で示されるように、正常群と比較して、血管拡張は、本実験条件下では低酸素モデル群における４つのＡＣＨ勾配レベルで明らかに減衰した（Ｐ＜０．０１）のに対して、サルビアノール酸Ｌ群及び正常群において有意な差は見られなかった。低酸素モデル群と比較して、血管拡張は、サルビアノール酸Ｌ群における３つのＡＣＨ勾配レベルで明らかに増強した（Ｐ＜０．０５）。このことにより、サルビアノール酸Ｌ群が、低酸素誘導性血管拡張の機能不全を有意に改善させることができることが示唆された。データは表８に見られた。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
血管拡張に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果は図１２に見られた。
【０１４１】
実験的な結論：
サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、或る程度はＮＡの血管収縮曲線の右側シフトを引き起こすことに対して効果があったが、有意な差は観察されなかった。２０分間の低酸素は、モデル群においてＡＣＨにより引き起こされる血管輪の勾配拡張において有意な低下を引き起こす可能性があり（Ｐ＜０．０１）、拡張機能障害が発生した。対比して、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、ＡＣＨの３つの勾配レベル（１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ、１０-3ｍｏｌ／Ｌ）で無酸素血管輪の拡張において有意な増強を示した（ｐ＜０．０５）。サルビアノール酸Ｌが、低酸素により引き起こされる血管拡張機能障害に対して有意な改善効果を有することが確認された。
【０１４２】
注意点に関する論述：
１．クレブス溶液を調製する際、混濁を防止するために他の物質を全て添加するまで、塩化カルシウム及びグルコースは添加しなかった。クレブス溶液は綿状沈殿を回避するため、長時間、室温で維持することができない。最終的に、クレブス溶液は要時調製した。
【０１４３】
２．心臓大動脈は、できる限り早く、氷浴中に取り出して、装置により引き起こされる血管輪への傷害を低減させるべきである。心臓大動脈は、血管活性の低減を防止する目的で、血管アーチに十分に密接して取り出されるべきである。
【０１４４】
３．酸素は、小泡の形態で排気され、特大の泡が、張力変換器に影響を与える場合があり、データの歪みをもたらすため、できるだけ小さくなければならない。
【０１４５】
薬力学的実施例４ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末及びその抽出物の保護効果
実験材料
１．主な装置：スーパークリーンベンチは、Antai Cleaning Equipment Inc.により製造され、定温ＣＯ2インキュベータは、Heraeus（ドイツ）から購入し、ＥＬＩＳＡ読取計は、BIO-RAD Inc.（米国）から購入し、平坦振とう台は、Jiangsu Guangming Experimental Apparatus Manufacturerで購入し、倒立生物顕微鏡は、オリンパス株式会社（日本）から購入した。
【０１４６】
２．主な試薬：ＤＭＥＭ高グルコース培地及びＤＭＥＭグルコース非含有培地は、GIBCOにより調製され、トリプシンは、SIGMAから購入し、ウシ胎児血清は、PAAから購入し、ＭＴＴ及びＤＭＳＯは、Sigmaから購入し、ＬＤＨ試験キットは、Nanjing Jiangcheng Bioengineering Instituteから購入した。
【０１４７】
３．使い捨て材料：９６ウェル細胞培養マイクロプレートは、CORNINGにより調製された。
４．細胞染色：ＰＣ１２。
【０１４８】
実験方法：
１．ＭＴＴ法
ａ．ＭＴＴを、各ウェル中に２０μｌで９６ウェルマイクロプレートに添加して、インキュベータ中で４時間反応させた。
ｂ．上清を廃棄して、続いて各ウェル中でＤＭＳＯ １５０μｌを添加して、平坦振とう台上で１０分間振とうさせた。
ｃ．各ウェルの吸光度を波長５７０ｎｍでＥＬＩＳＡ読取計により測定して、細胞生存率を算出した。
細胞生存率％＝（薬物投与群のＯＤ値／陰性対照群のＯＤ値）×１００％
【０１４９】
２．ＬＤＨ活性の測定
測定実験は、Nanjing Jiangcheng Bioengineering Instituteにより提供されるＬＤＨ試験キットの仕様に従って実行した。詳細な工程は表９に提示した。
【０１５０】
【表９】
【０１５１】
ＬＤＨ活性（Ｕ／Ｌ）＝（ＯＤU−ＯＤC）／（ＯＤS−ＯＤB）×ＣS×Ｎ×１０００
（式中、ＯＤUは、試験サンプルの吸光度を表し、ＯＤCは、対照サンプルの吸光度を表し、ＯＤBは、ブランクの吸光度を表し、ＯＤSは、標準溶液の吸光度を表し、ＣSは、２ｍｍｏｌ／Ｌの標準濃度を表し、Ｎは、測定前のサンプルの希釈倍数を表す）。
【０１５２】
実験結果：
１．過酸化水素で損傷させたモデルの確立
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（ＰＢＳ）、溶媒対照群（ＤＭＳＯ）、モデル群（Ｈ2Ｏ2）及び陽性対照群（エダラボン）の４つの群が存在した。
ブランク対照群：ＰＢＳの添加のみ。
溶媒対照群：０．１％ＤＭＳＯの添加。
モデル群：過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の濃度はそれぞれ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭあり、反応時間は１時間であった。
陽性対照群：エダラボン（２μｇ／ｍｌ）を陽性薬物として添加して、続いて６時間前処理して、そこへ０．５ｍＭ過酸化水素を添加して、１時間損傷させて、新たに調製したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培養培地（ウェル１つ当たり２００μｌ）と交換した。
ｄ．細胞活性をＭＴＴ法により測定した。
【０１５３】
【表１０】
【０１５４】
表１０で示されるように、０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2で１時間処理した後に、ＰＣ１２細胞生存率は４０％であり、阻害率は６０％であった。過酸化水素で損傷させたモデルは、０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2で１時間処理したＰＣ１２細胞であった。
【０１５５】
２．酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの確立
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（酸素正常状態＋０．１％ＤＭＳＯ）、モデル群（ＯＧＤ＋０．１％ＤＭＳＯ、酸素−グルコース欠乏）及び陽性対照群（エダラボン）の３つの群が存在した。
モデル群：培養マイクロプレート中の細胞を、グルコース非含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養し、これを低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移した。インキュベーションの期間後に、測定を実行した。
陽性対照群：エダラボン（２μｇ／ｍｌ）を陽性薬物として使用した。薬物を添加して、６時間前処理した後、グルコース非含有培地（ウェル１つ当たり１８０μｌ）と交換した。薬物を再び添加して、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移した。インキュベーションの期間後に、測定を実行した。
ｄ．細胞活性はＭＴＴ法により測定した。
【０１５６】
【表１１】
【０１５７】
表１１に示されるように、酸素−グルコース欠乏で損傷させたＰＣ１２細胞の生存率は、ちょうど４２％であり、阻害率は５８％であった。したがって、この研究での酸素−グルコース欠乏モデルは、細胞を培養するように選択されたグルコース非含有ＤＭＥＭであり、これを低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移した。インキュベーションの期間後に、測定を実行した。
【０１５８】
３．Ｈ2Ｏ2で損傷させたＰＣ１２細胞の細胞生存率に対する薬物の効果
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（ＰＢＳ）、溶媒対照群（ＤＭＳＯ又は酢酸エチル）、モデル群（Ｈ2Ｏ2）、陽性対照群（エダラボン）及び薬物処理群の５つの群が存在した。
モデル群：０．５ｍＭ過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を使用して、１時間処理した。
陽性対照群：陽性薬物として使用されるエダラボン（２μｇ／ｍｌ）を細胞に添加して、６時間前処理して、そこへ０．５ｍＭ過酸化水素を添加して、１時間損傷させて、新たに調製したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地と交換した。
薬物処理群：細胞を培養マイクロプレートへ接種して、まず種々の濃度での種々の試験薬物を添加して、ウェル１つ当たり２０μｌで６時間前処理して、そこへ０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2を添加して、１時間損傷させて、続いて新たに調製したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培養培地と交換した。
ｄ．ＬＤＨ活性の測定のために、上清を収集した（ウェル１つ当たり２０μｌ）。
ｅ．細胞マイクロプレートにおける細胞の活性をＭＴＴ法により測定した。
【０１５９】
【表１２】
【０１６０】
薬物濃度はそれぞれ、０．１％、０．０１％及び０．００１％でＤＭＳＯを用いて調製し、これらは、相当する濃度を有する溶媒対照群と比較するものとする。ここで、薬物処理群はモデル群（０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）と比較し、モデル群（Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）は溶媒対照群（ＥｔＯＡｃ）と比較した。
【０１６１】
【表１３】
【０１６２】
ここで、薬物処理群はモデル群（０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）と比較した一方で、モデル群（Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）は溶媒対照群（ＥｔＯＡｃ）と比較した。
【０１６３】
４．酸素−グルコース欠乏のＰＣ１２細胞の生存率に対する薬物の効果
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（酸素正常状態＋０．１％ＤＭＳＯ）、モデル群（ＯＧＤ＋ＤＭＳＯ、酸素−グルコース欠乏）、陽性対照群（エダラボン）及び薬物処理群の４つの群が存在した。
モデル群：マイクロプレート中の細胞用の培養培地を、グルコース非含有ＤＭＥＭへ変更し、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移して、一晩培養した。
陽性対照群：エダラボン（２μｇ／ｍｌ）を陽性薬物として使用した。薬物を添加して、６時間前処理した後、培養培地を、グルコース非含有ＤＭＥＭ培地（ウェル１つ当たり１８０μｌ）と交換した。薬物を再び添加して、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移して、一晩培養した。
薬物処理群：種々の濃度での薬物を添加して、６時間前処理して、培養培地をグルコース非含有ＤＭＥＭ培地（ウェル１つ当たり１８０μｌ）へ変更した。薬物を再び添加して、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移して、一晩培養した。
ｄ．翌日に、得られた上清をウェル１つ当たり２０μｌ収集して、これをＬＤＨ活性の測定に使用した。
ｅ．細胞の活性をＭＴＴ法により測定した。
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
ここで、薬物処理群をブランク対照群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）と比較し、モデル群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）をブランク対照群（酸素正常状態＋ＤＭＳＯ）と比較した。
【０１６６】
ｆ．ＬＤＨ活性
【０１６７】
【表１５】
【０１６８】
ここで、薬物処理群をブランク対照群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）と比較した一方で、モデル群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）をブランク対照群（酸素正常状態＋ＥｔＯＡｃ）と比較した。
【０１６９】
結論：
実験の結果：０．０２μｇ／ｍｌの投与量でサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末を用いて処理した場合、Ｈ2Ｏ2で損傷させたＰＣ１２細胞の細胞生存率は４７％（Ｐ＜０．０５）であったのに対して、０．２μｇ／ｍｌの投与量では、ＬＤＨ活性は４７４（Ｐ＜０．０５）であった。０．０２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．１抽出物に関しては、ＬＤＨ活性はそれぞれ、４８３（Ｐ＜０．０１）、４１６（Ｐ＜０．０１）及び４６５（Ｐ＜０．０５）であったのに対して、０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．２抽出物に関しては、ＬＤＨ活性はそれぞれ、４０７（Ｐ＜０．０１）及び４８８（Ｐ＜０．０１）であり、モデル群と比較して、ともにＬＤＨ活性を低減させる効果を有していた。
【０１７０】
０．０２μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌの投与量でサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末を用いて処理した場合、ＯＧＤ細胞の細胞生存率はそれぞれ、４８％（Ｐ＜０．０１）及び３７％（Ｐ＜０．０５）であった。０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．１抽出物に関して、生存率はそれぞれ、４０％（Ｐ＜０．０１）及び４２％（Ｐ＜０．０１）であったのに対して、０．０２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．２抽出物については、生存率はそれぞれ、４７％（Ｐ＜０．０１）、４７％（Ｐ＜０．０１）及び４１％（Ｐ＜０．０５）であった。２μｇ／ｍｌの投与量でサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末を用いて処理した場合、ＬＤＨ活性は４０（Ｐ＜０．０５）であった。さらに、２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．１抽出物に関して、ＬＤＨ活性は３１（Ｐ＜０．０１）であったのに対して、０．２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．２抽出物については、ＬＤＨ活性は３１（Ｐ＜０．０５）であった。
【０１７１】
実験で示されるように、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、ＯＧＤ又はＨ2Ｏ2により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経障害に対して有意な改善効果を有していただけでなく、細胞の生存率も増加させた。したがって、サルビアノール酸Ｌは、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化の条件において神経細胞を保護する機能を有することが確認された。
【０１７２】
薬力学的実施例５ ラットにおける実験的急性心筋虚血に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末及び抽出物の保護効果
実験材料：
１．試験材料及び試薬：ピツイトリン（Ｐｉｔ）注射剤は、Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd.により製造され、バッチ番号は０７０３０２であった。生理食塩水は、Tianjin Tian’an Pharmaceutical Co., Ltd.により製造され、バッチ番号は２００６０５２４１（仕様：５００ｍｌ／瓶）であった。
【０１７３】
２．主な装置：ＭｅｄＬａｂ（登録商標）８チャネル生理学的記録計は、Nanjing Medease Science and Technology Co., Ltd.により製造された。
【０１７４】
３．動物：ＳＤラット（適正な体重の雄又は雌）は、証明書番号ＳＣＸＫ（Jing）２００７−０００１とともにBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.により提供された。ラットには全て、２０℃〜２５℃の室温での動物給餌室中でラット特別食（Beijing Keaoxieli Diet Co., Ltd.により製造）及び水道水が与えられ、１２時間照射した。
【０１７５】
実験方法
１．投与用量の設計
Ｎｏ．１抽出物の含有量は、生薬６．８２５ｇ／ｇであり、Ｎｏ．２抽出物の含有量は、生薬４．１６２ｇ／ｇであった。
【０１７６】
Ｎｏ．１抽出物及びＮｏ．２抽出物の両方に関して、高用量及び低用量：それぞれ生薬１．０８６ｇ／ｋｇ及び生薬０．５４３ｇ／ｋｇの２つの群が存在した。生薬の用量変換に従って、高用量Ｎｏ．１抽出物中のサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の投与用量は４．６７ｍｇ／ｋｇであり、低用量群では２．３３ｍｇ／ｋｇであった。サルビアノール酸Ｌは、Ｎｏ．２抽出物では見出されなかった。
【０１７７】
サルビアノール酸の凍結乾燥粉末の投与用量は１０．０ｍｇ／ｋｇ及び５．０ｍｇ／ｋｇであった。
【０１７８】
２．グループ分け
２．１ 動物のスクリーニング
正式の実験の前に、ラットに尾側静脈を介してピツイトリン（Ｐｉｔ）（１Ｕ／ｋｇ）を注射した。正常ＥＣＧ及び注射の５分後のＥＣＧを記録して、Ｊ点の上昇及びＴ波異常を観察した。注射前に異常ＥＣＧが見られた動物又はＰｉｔに対して非感受性である動物は拒絶した。
【０１７９】
２．２ 動物のグループ分け
望ましいラットを７群に分けた：（１）モデル対照群、（２）タンジンのＮｏ．１抽出物低用量群（Ａ群）、（３）タンジンのＮｏ.１抽出物高用量群（Ｂ群）、（４）タンジンのＮｏ．２抽出物低用量群（Ｃ群）、（５）タンジンのＮｏ．２抽出物高用量群（Ｄ群）、（６）サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末低用量群（Ｅ群）及び（７）サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群（Ｆ群）。
【０１８０】
３．実験方法
ＳＤラット（半分が雄で、半分が雌）を、無作為に群に分けた（各群中に動物８匹）。処理群中のラットを、種々のサンプルの水性懸濁液を毎日投与したのに対して、モデル対照群中のラットは、等量の生理食塩水を投与した。動物は全て、７日間連続して投与された。最終投与の４０分後に、ラットに麻酔して、リードＩＩ正常ＥＣＧを記録するためのデバイスに接続した。ピツイトリン（Ｐｉｔ）を、尾側静脈を介して１Ｕ／ｋｇ（体重）の投与量で一定速度で約１０秒以内に注射した。ＥＣＧ変化を、投与の０秒後、５秒後、１０秒後、１５秒後、３０秒後、４５秒後、１分後、２分後、３分後、４分後、５分後、１０分後及び１５分後に記録した。各群のＰｉｔの注射前と注射後との間の差、並びに処理群とモデル対照群との差を比較して、Ｊ点及びＴ波の変化を分析して、データをｔ検定により解析した。
【０１８１】
実験結果
１．Ｊ点に対する効果
結果で示されるように、モデル対照群と比較して、Ｆ群（サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群）におけるＥＣＧのＪ点の上昇度は、ピツイトリンにより引き起こされる急性心筋虚血において１５秒、３０秒及び４５秒でより小さく、その差は、本実験条件下では統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。モデル対照群と比較して、Ｂ群（タンジンのＮｏ.１抽出物高用量群）におけるＥＣＧのＪ点の上昇度は１５秒でより小さく、その差は統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、モデル対照群と比較して、他の群は、各時点で有意な差を示さなかった。データは表１６に見られた。
【０１８２】
【表１６】
【０１８３】
２．Ｔ波に対する効果
結果で示されるように、モデル対照群と比較して、１５秒及び３０秒でのＦ群（サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群）のＥＣＧのＴ波の上昇度はより小さく、その差は、本実験条件下では統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。同様に、モデル対照群と比較して、１５秒でのＢ群（タンジンのＮｏ．１抽出物高用量群）におけるＥＣＧのＴ波の上昇度はより小さく、その差は統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、モデル対照群と比較して、他の群は、各時点で有意な差を示さなかった。データは表１７に見られた。
【０１８４】
【表１７】
【０１８５】
結論：
モデル対照群と比較して、Ｆ群（サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群）におけるＥＣＧのＪ点及びＴ波の上昇度は、１５秒及び３０秒でより小さく、その差は統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
モデル対照群と比較して、１５秒でのＪ点及びＴ波はともに、Ｂ群（タンジンのＮｏ．１抽出物高用量群）において有意に減少する（Ｐ＜０．０５）。
【０１８７】
モデル対照群と比較して、他の群は、各時点でＪ点及びＴ波において有意な減少を示さなかった。
【０１８８】
結果で示されるように、この研究の下では、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末（１０ｍｇ／ｋｇ）及び４．６７ｍｇ／ｋｇの濃度でのサルビアノール酸Ｌを含有するＮｏ．１抽出物は、抗急性心筋虚血の効果を有していたが、サルビアノール酸Ｌを含有しないＮｏ．２抽出物における実験的投与量の下では、抗急性心筋虚血の効果は観察されなかった。
【０１８９】
注意点に関する論述：
１．Ｊ点の定義：ＱＲＳ波群の終点とＳＴセグメントとの組合せ点。
【０１９０】
２．ピツイトリンの冠状血管に対する収縮効果に起因して、ピツイトリンの静脈内注射は、正常ラットにおいて急性心筋虚血を誘導することができ、ＥＣＧにおけるＪ点及びＴ波の両方の明らかな上昇をもたらす。薬物処理群においてＪ点のシフトが有意に回復し、Ｔ波は、試験薬物が投与された後に徐々に正常レベルへ減少しており、これにより、薬物が、冠状血管に対するピツイトリンの収縮効果により誘導される急性心筋虚血に対して拮抗作用を有することが示唆された。Ｉ期異常（０秒〜４５秒以内でピツイトリンにより誘導される）に対してもＩＩ期異常（４５秒〜１５分以内でピツイトリンにより誘導される）に対しても治療上の効果を有する薬物は通常、抗心筋虚血の効果を有すると考えられた。
【０１９１】
３．実験中、同じバッチ番号のピツイトリンを使用して、実験結果に対する薬物の効力単位の影響を回避すべきである。ピツイトリンは、２時間を超える間隔で注射して、薬物耐性を回避すべきである。好ましくは、選択した動物を１日おきに使用する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝統的な漢方薬分野、より具体的には新種のサルビアノール酸化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルビア・ミルチオルヒザ・ブゲ(Salvia miltiorrhiza Bge.)（ファム・ラビアタエ(Fam. Labiatae)）の乾燥根である丹参（Radix Salviae Miltiorrhizae：ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ）（中国生薬、以下「タンジン」と称する）は、苦味があり、少し冷たい感じがし、うっ血を除去することによって疼痛を止める機能を伴って心臓及び肝臓のチャネルに作用し、血流を活性化させて、また心臓を清浄にすることによって不穏状態を軽減する。一連の現在の薬理学的研究がタンジンに対して行われており、タンジンが冠状動脈を拡張させ、微小循環を改善させて、心臓を保護する効果を有し、また血小板凝集を抑制及び除去し、無酸素耐性の身体能力、並びに抗肝炎、抗腫瘍及び抗ウイルス等の活性を高めることが可能であることを示している。
【０００３】
２００１年に、中国医学科学院 北京協和医科大学の薬物研究所(Institute of Materia Madica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College)のL.N. Li et al.（非特許文献１）は、サルビアノール酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、リトスペルミン酸、ロスマリン酸及びイソサルビアノール酸Ｃ等を含むタンジン又は同属の植物から単離されるフェノール酸誘導体の１３個の水溶性生理活性成分が存在することを報告した。さらに、これらの成分の薬理学的作用もまた開示されている。
【０００４】
Rena. Kasimu et al.（非特許文献２）は、サルビアノール酸Ｋの化学構造について報告した。
【０００５】
外国の研究者らもまた、タンジンの水溶性生理活性成分に関して研究してきた。１９９９年には、ジョージ・ワシントン大学(George Washington University)は、抗ＨＩＶインテグラーゼ及び他のウイルスに対する１３個のサルビアノール酸誘導体の効果に関して米国特許を出願して、最終的に付与されている。これらは全て、タンジンが、多大な潜在性を持ち、かつ開発する価値のある医療用植物資源であることを示唆した。
【０００６】
本発明の上記サルビアノール酸Ｌは、大量のスクリーニングのプロセスにおいてタンジン中で見出された、まさに新規の化合物である。これまで、この化合物に関連する構造及び薬理学的効果はいまだに報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bulletin of Medical Research, 2001, Vol 30(7)
【非特許文献２】Journal of Xinjiang Medical University, 2002, Vol. 25(3)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、サルビアノール酸Ｌの新規化合物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、サルビアノール酸Ｌを含む医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、サルビアノール酸Ｌを調製する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、心臓血管疾患を治療するための薬剤の調製におけるサルビアノール酸Ｌの使用を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】サルビアノール酸Ｌの高分解能質量スペクトログラムを示す図である。
【図２】サルビアノール酸Ｌのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトログラムを示す図である。
【図３】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸Ｌの1Ｈ−ＮＭＲダイアグラムを示す図である。
【図４】ＣＤ3ＯＤを使用することによる１２５ＭＨｚでのサルビアノール酸Ｌの13Ｃ−ＮＭＲダイアグラムを示す図である。
【図５】ＣＤ3ＯＤを使用することによる１２５ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのＤＥＰＴダイアグラムを示す図である。
【図６】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのｇＣＯＳＹダイアグラムを示す図である。
【図７】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのｇＨＭＢＣダイアグラムを示す図である。
【図８】ＣＤ3ＯＤを使用することによる５００ＭＨｚでのサルビアノール酸ＬのｇＨＭＱＣダイアグラムを示す図である。
【図９】試験物質のフリーラジカルを捕捉する能力を示す図である。
【図１０】サルビアノール酸とビタミンＣとの間での還元力の比較を示す図である。
【図１１】血管収縮に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果を示す図である。
【図１２】血管拡張に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果を示す図である。
【図１３】ピツイトリンで下垂体を処理した後の心電図（ＥＣＧ）を示す図であり、ここでＡ）は、モデル対照群から得られる正常なＥＣＧであり、Ｂ）は、ピツイトリンを投与した１５秒後のモデル対照群から得られるものであり、Ｃ）は、ピツイトリンを投与した３０秒後のモデル対照群から得られるものである。
【００１３】
本発明は、下記のように一般式（Ｉ）で表わされる新規化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物及び加水分解可能なエステルに関する：
【化１】
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明によれば、フェノール酸の新規化合物の構造は、物理化学的特性、高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ｇＣＯＳＹ、ｇＨＭＢＣ及びｇＨＭＱＣにより特定された。
【００１５】
本発明の化合物は、淡い帯黄色粉末である。
【００１６】
本発明による化合物は、ＦｅＣｌ3による薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）発色反応で陽性の結果を示し、本発明による化合物がフェノール系化合物であり得ることを示唆した。
【００１７】
ｍ／ｚ ５３７．１０３４で擬分子イオンピークを示した高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）により、分子式は、不飽和度Ω １７を有するＣ27Ｈ22Ｏ12であることが確認された。
【００１８】
ＥＳＩ−ＭＳでは、ｍ／ｚ ５３７での本発明による化合物の分子イオンピークは、まず８’’−カルボキシル基を容易に損失することができ（−４４）、その結果ｍ／ｚ ４９３でフラグメントイオンピークを形成し（サルビアノール酸Ａの分子イオンピークと同じ構造を有する）、次にサルビアノール酸Ａのフラグメンテーション規則性に従ってｍ／ｚ ３１３、ｍ／ｚ ２９５で２つのフラグメントイオンピークを形成する。
【００１９】
本発明によれば、サルビアノール酸Ａのフラグメンテーション規則性は下記の通りに提示される：
【化２】
【００２０】
ｍ／ｚ ４９３、ｍ／ｚ ３１３、ｍ／ｚ ２９５での主なフラグメントイオンピークが、その質量スペクトルにおけるサルビアノール酸Ａの主なイオンピークであることは明らかである。したがって、本発明の化合物は、サルビアノール酸Ａの骨格構造と同じ骨格構造を有する。
【００２１】
プロトン核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは、δ ５．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，４．５Ｈｚ）での酸素に結合されたメテニルプロトンの１個のシグナル、δ ６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、δ ７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、δ ７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ）、δ ６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ）、δ ６．６８（１Ｈ，ｓ）、δ ６．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、δ ６．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、δ ６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、δ ６．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．０Ｈｚ）、δ ７．９２（１Ｈ，ｓ）での芳香族プロトンの１１個のシグナル、δ ３．０１（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．０，８．０，４．５Ｈｚ）での脂肪族プロトンの２個のシグナルを示す。
【００２２】
炭素−１３核磁気共鳴（13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルは、δ ３９．６での１個の脂肪族炭素シグナル、δ ７６．４での酸素に結合されたメテニル炭素の１個のシグナル、δ １７０．１、δ １７３．０、δ １７５．１でのカルボニル炭素の３個のシグナル、及びδ １１７．４、δ １１７．８、δ １１７．８、δ １１８．２、δ １１９．２、δ １２０．２、δ １２１．７、δ １２３．７、δ １２５．７、δ １２６．６、δ １２８．０、δ １２８．８、δ １２９．９、δ １３０．９、δ １４６．２、δ １４６．５、δ １４６．９、δ １４７．４、δ １４７．７、δ １４７．８、δ １５０．３、δ １５０．９での二重結合炭素の２２個のシグナルを含む２７個の炭素シグナルを示す。
【００２３】
ＤＥＰＴスペクトルは、分子中に１×ＣＨ2、１２×ＣＨ及び１４×Ｃが存在することを示す。
【００２４】
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより提供される情報とともに、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける芳香族プロトンの化学シフト及び相互結合を踏まえて、本発明の化合物は、２つの１，３，４−三置換ベンゼン環、１つの１，２，３，４−四置換ベンゼン環、１つのトランス型二重結合及び１つの一置換二重結合を有するとみなされる。これらは全て、丹参由来のサルビアノール酸の化合物の分光分析法の特徴と一致する。
【００２５】
上記の結果として、本発明の化合物は最初に、構造的に丹参における報告されたサルビアノール酸化合物に対して類似性を示すフェノール酸化合物である可能性が高いと推論することができた。
【化３】
【００２６】
従来技術及び関連スペクトル研究と比較して、1Ｈ−ＮＭＲがサルビアノール酸Ａでは、２対のトランス型二重結合プロトンを示したのに対して、本発明の化合物では、１対だけのトランス型二重結合プロトン及び１つの一置換二重結合プロトンを示した以外は、本発明の化合物はサルビアノール酸Ａと類似したスペクトル特性を有することが見出されており、また13Ｃ−ＮＭＲは、本発明の化合物ではサルビアノール酸Ａのカルボニル炭素シグナルよりも１つ多いカルボニル炭素シグナルが存在する一方で、Ｃ−７’’及びＣ−８’’は、それぞれ８ｐｐｍ及び６ｐｐｍだけ低磁場へシフトされることを示す。結果として、本発明の化合物と、サルビアノール酸Ａとの差は、Ｃ−７’’又はＣ−８’’がカルボキシル基で置換されていることである。
【００２７】
Ｃ−７’’及びＣ−８’’の置換をさらに確認するために、本発明の化合物の２Ｄ−ＮＭＲ研究を行って、そのＨＭＢＣスペクトルの結果により、Ｈ−７’’とＣ−９’’、Ｈ−７’’とＣ−２’’、Ｈ−７’’とＣ−２及びＨ−７’’とＣ−６’’との間にロングレンジカップリングが存在することが示された。したがって、本発明の化合物ではＣ−８’’がカルボキシル基により置換されていると推測することができた。
【００２８】
したがって、従来技術と比較して、本発明の化合物は、新規のサルビアノール酸化合物であり、これを「サルビアノール酸Ｌ」と称する。
【化４】
【００２９】
実際に、抽出のプロセス中に本発明の化合物で起こる立体配置及び立体配座の変化に起因して、対応する変化がそのスペクトルデータで起こるが、立体配置変化及び立体配座変化により生じる各種異性体は、本発明の保護範囲の範疇にある。
【００３０】
通常の専門知識及び従来技術によれば、本発明のサルビアノール酸Ｌはまた、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物の形態で使用することができる。本発明によるサルビアノール酸Ｌの上記薬学的に許容可能な塩は、従来の塩形成方法により生成される、無機塩基又は有機塩基から生成される従来の薬学的に許容可能な塩を包含する。塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、プロカイン及びベルベリンと反応させることによって生成される塩が挙げられる。以下で記載するサルビアノール酸Ｌには、式（Ｉ）で表わされるサルビアノール酸Ｌ、並びにその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物及び加水分解可能なエステルが含まれている。
【００３１】
本発明の上記サルビアノール酸Ｌは、医薬組成物の形態で適切に投与され、従来、１種類又は複数種類の薬学的に許容可能なキャリア或いは賦形剤とともに使用することができる。さらに、可能であれば、本発明の上記サルビアノール酸Ｌは、原薬、好ましくは医薬調製物として直接使用される活性成分として投与することができる。他の成分との適合性及び患者に対する安全性の観点から、キャリアは薬学的に許容可能でなくてはならない。
【００３２】
したがって、本発明は、他の治療学的成分及び／又は予防学的成分を伴って又は伴わずに、本発明のサルビアノール酸Ｌ及び１種類又は複数種類の薬学的に許容可能なキャリアを含むサルビアノール酸Ｌの医薬調製物を提供する。これらの調製物は、経口的に、非経口的に（皮下（例えば、注射又はリザーバ型錠剤）、皮内、クモ膜下腔内、筋内（例えば、リザーバ型）及び静脈内を含む）、直腸的に、及び局所的に（例えば、舌下）投与することができる。しかしながら、最も望ましい投与形態は、患者の疾患に依存する。
【００３３】
上記医薬調製物は単位調製物であり得る。また、上記医薬調製物は、薬学分野で既知の任意の方法により調製することができる。これらの方法は全て、本発明のサルビアノール酸Ｌを、１種類又は複数種類の補助剤成分を構成するキャリアと組み合わせる工程を包含する。一般的に言えば、本発明の上記調製物は下記の通りに製造される：本発明のサルビアノール酸Ｌを液体若しくは粉砕した固体キャリア又はその混合物と一様かつ密に組み合わせて、その結果半製品が得られ、必要に応じて、次に上記半製品を所望の調製物へ形成させる。
【００３４】
通常、一連の標準的な薬学的技術を使用して、サルビアノール酸Ｌ及び医薬キャリアを利用することによって本発明の医薬組成物を得ることができる。この技術には、混合、造粒及び加圧成型が含まれる。当業者には既知であるように、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤の特徴及び形態は、下記要素に依存する：混合される活性成分の量、投与経路及び他の既知の要素。本明細書中では上記薬学的に許容可能なキャリアは、組成物とともに投与することができる有機キャリア又は無機キャリアの全種、例えば固体調製物に使用される賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤及びコーティング剤、又は着色剤及び甘味剤のような医薬添加物を指す。上記医薬キャリアは、マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩酸システイン、チオグリコール酸、メチオニン、ビタミンＣ、二ナトリウムＥＤＴＡ、ＥＤＴＡカルシウムナトリウム、一価アルカリ金属の炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩又はそれらの水溶液、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸、アミノ酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、乳酸ナトリウム、キシリトール、マルトース、グルコース、フルクトース、デキストラン、グリシン、デンプン、スクロース、ラクトース、マンニトール、ケイ素誘導体、セルロース及びその誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、グリセロール、ツイーン−８０、寒天、炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、界面活性剤、ＰＥＧ、シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、リン脂質材料、カオリン、タルク粉末、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等からなる群から選択される。
【００３５】
上述の医薬組成物は、錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコート錠及び腸溶錠）；カプセル（例えば、硬質カプセル及び軟質カプセル）；経口溶液；バッカル錠；顆粒；沸騰水中に溶解させた後に摂取する顆粒；丸剤；粉末；ペースト；ペレット；懸濁液；散剤；リカー；注射剤；坐剤；ペースト（例えば、軟膏及び硬膏）；クリーム；スプレー剤；ドロップ及びパッチを含む任意の薬学的に許容可能な投薬形態へ配合され得る。好ましくは、調製物は、カプセル、錠剤、経口溶液、顆粒、丸剤、粉末、ペレット及びペーストのような経口投薬形態で、並びに注射可能粉末、注射剤及び輸液等のような注射の形態で存在する。最も好ましくは、調製物は錠剤の形態である。
【００３６】
これらの望ましい調製物の中でも、上記経口調製物は、一般的に使用される賦形剤、結合剤、増量剤、希釈剤、錠剤加圧成型剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、風味剤及び湿潤剤を含有することができ、必要に応じて、錠剤はコーティングすることができる。
【００３７】
上記賦形剤の好ましい例としては、ラクトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン（例えば、α−デンプン）、デキストリン、結晶性セルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、アミロペクチン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム又はケイ酸アルミニウムマグネシウム等が挙げられる。
【００３８】
上記潤滑剤の好ましい例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルカム粉末及びシリカゲル等が挙げられる。
【００３９】
上記結合剤の好ましい例としては、α−デンプン、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、アミロペクチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ピロリドン等が挙げられる。
【００４０】
上記崩壊剤の好ましい例としては、ラクトース、糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、アミノアルキルナトリウム、ナトリウムカルボキシメチルデンプン、軽質無水ケイ酸、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００４１】
上記コーティング剤の好ましい例としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００４２】
上記着色剤の好ましい例としては、水溶性食用タルトラジン色素（食用赤色２号及び３号、食用黄色４号及び５号、食用青色１号及び２号のような食用色素）、水不溶性レーキ顔料（例えば、上述の水溶性食用タルトラジン色素のアンモニウム塩）及び天然色素（例えば、β−カロテン、クロロフィル及びベンガラ）等が挙げられる。
【００４３】
上記甘味剤の好ましい例としては、サッカリンナトリウム、グリシルレチン酸、アスパルテーム及びステビオシド等が挙げられる。
【００４４】
錠剤を調製する従来方法は、本発明のサルビアノール酸Ｌを１種類又は複数種類の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせること、及び続いて加圧成型すること又は成形することを含む。
【００４５】
さらに、本発明のサルビアノール酸Ｌはまた、経口液体調製物、例えば、水溶性又は油溶性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ等に配合することもできる。本発明のサルビアノール酸Ｌはまた、乾燥製品へ調製し、使用前に水又は他の好適なキャリアと再ブレンドすることができる。この種の液体調製物は、沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン又はアラビアゴム）；非水性キャリア（食用油を含む）（例えば、扁桃油、分留ヤシ油、バター性エステル、プロピレングリコール又はエタノール）；並びに防腐剤（例えば、メチルパラベン、ニパソール及びソルビン酸）を含む従来の添加物を含有する。
【００４６】
非経口的に投与される調製物としては、水性及び非水性の滅菌注射剤が挙げられ、任意にこれらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び等張剤等を含有する。また、非経口的に投与される調製剤としては、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられ、任意にこれらの調製物は、沈殿防止剤及び増粘剤を含有する。上記調製物は、単回用量又は複数回用量容器（例えば、密封アンプル及びバイアル）で保存することができ、これは、凍結乾燥条件下で保管することができ、使用前に滅菌液体キャリア、例えば注射用の水で再溶解させることができる。
【００４７】
直腸投与される調製物は、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバター、ステアリン酸又は他のグリセリド若しくはエチレングリコール）を含有する坐剤であり得る。
【００４８】
口腔で局所的に投与される調製物、例えばバッカル調製物又は舌下用調製物は、トローチ（ここで、活性成分は、スクロース及びアラビアゴムのような風味付けされた基剤中に包埋される）、同様に香錠（ここで、活性成分は、ゼラチン及びグリセロール、又はスクロース及びアラビアゴムのような基剤中に包埋される）が挙げられる。
【００４９】
本発明のサルビアノール酸Ｌは、リザーバ型調製物へ配合され、かかる持続放出調製物は、移植（例えば、皮下移植又は筋内移植）又は筋内注射により投与することができる。したがって、本発明のサルビアノール酸Ｌは、好適なポリマー、疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）若しくはイオン交換樹脂を用いて調製することができ、又は難溶性誘導体、例えば難溶性塩へと調製することができる。
【００５０】
通常の専門知識及び従来技術によれば、本発明に関連した医療効果は、或る特定の疾患又は症状の予防並びに治療を包含する。本発明のサルビアノール酸Ｌの治療上有効な量は、疾患の特性及び患者個人の状態に依存するか、又は医師の助言に従う。概して、成人に関する治療上有効な量は、０．０２ｍｇ／日〜５０００ｍｇ／日、好ましくは１ｍｇ／日〜１５００ｍｇ／日の範囲内である。上述するように、この量は、単回投与量又は複数回用量（これは、適切な間隔で、例えば１日２回、１日３回、１日４回又はそれ以上で患者に摂取される）であり得る。本発明の上記調製物は、錠剤及びカプセルに関しては０．１ｗｔ％〜９９ｗｔ％、好ましくは３０ｗｔ％〜９５ｗｔ％の活性成分、及び液体調製物に関しては３ｗｔ％〜５０ｗｔ％の活性成分を含む。
【００５１】
本発明は下記のように実施する：
ａ）抽出：丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を水で抽出して、アルコールを添加し沈殿させて上清を得て、続いて上清を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｂ）分離：工程ａ）の抽出物を水中に溶解させて、多孔質吸収性樹脂上に適用させて、続いて樹脂を水で溶出させて、溶出液を得て、溶出液を酸性にして、酸性にした溶出液を再び多孔質吸収性樹脂上に適用し、樹脂を酸性水溶液で洗浄して、不純物を除去して、続いて樹脂をエタノールで溶出させて、エタノール溶出液を得て、エタノール溶出液を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｃ）精製：乾燥方法を使用することにより工程ｂ）の抽出物をシリカゲルカラム上に適用し、クロロホルム、メタノール及びギ酸の移動相で定組成溶出させて、溶出液を収集して、ＴＬＣにより溶出プロセス全体をモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得る工程。
【００５２】
工程ａ）では、上記丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を煎じ片にスライスするか、顆粒又は粉末へと粉砕させ、好ましくは煎じ片にスライスすることができる。好ましくは、丹参の根が、丹参生薬として使用される。上記他の生薬は、丹参と適合性である当業者に既知の中国生薬、好ましくはラディックス・ノトギンセング(Radix Notoginseng)、ラディックス・アストラガリ(Radix Astragali)及び／又はラディックス・ポリゴニ・ムルチフロリ(Radix Polygoni Multiflori)を指す。
【００５３】
工程ａ）では、上記水抽出は下記の通り：生薬を、生薬の容積の４倍〜８倍の水で、好ましくは生薬の容積の４倍の水で、１．５時間〜３．５時間、好ましくは２時間煎じて、濾過して、薬物残渣を、薬物残渣の容積の３倍〜６倍の水で１時間〜３時間、好ましくは薬物残渣の容積の３倍の水で１時間煎じて、濾過して、濾液を組み合わせて、濾液を濃縮して、相対密度１．１１〜１．２８（８０℃）、好ましくは１．２（８０℃）を有する抽出物を得ることである。より簡単に単離されるようにフェノール酸物質を塩化するために、アルカリ水溶液が上記水抽出工程で使用されることが好ましく、好ましくは上記アルカリは、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム及び水酸化カリウム、より好ましくは重炭酸ナトリウム又は水酸化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つである。上記アルカリ水溶液は、０．３０％〜０．６８％の濃度での重炭酸ナトリウム水溶液、又は０．００２５‰〜０．００４‰の濃度での水酸化ナトリウム水溶液、好ましくは０．４５％の濃度での重炭酸ナトリウム水溶液である。
【００５４】
工程ａ）では、上記アルコール沈殿は下記の通り：エタノールの含有量が６５％〜７０％（２５℃）、好ましくは７０％になるまで９５％エタノールを抽出物に添加し、沈殿させて、１２時間〜３６時間、好ましくは２４時間静置して、減圧条件下でエタノールを回収することによって上清を濃縮して、相対密度１．３０〜１．３８（６０℃）、好ましくは１．３７（６０℃）を有する抽出物を得ることである。
【００５５】
脂溶性不純物をより良好に排除するために、アルコール抽出が、水抽出工程の前に実施されることが好ましい。アルコール抽出工程では、生薬の容積の５倍〜８倍の５０％〜９５％エタノールで２回、各回毎に１時間〜２時間煎じて、濾過して、エタノール抽出溶液を廃棄して、上述の水抽出として薬物残渣を抽出する。
【００５６】
工程ｂ）では、上記多孔質樹脂カラムは、無極性又は微極性の樹脂、例えば、ＡＢ−８、ＨＰＤ４５０、ＨＰＤ７００、Ｄ１０１、Ｄ４０２０又はＸ５、好ましくはＡＢ−８であり得る。生薬対多孔質吸収性樹脂の重量比は、５：１〜１：１、好ましくは４：１である。樹脂カラムは、総容積の８倍〜１５倍、好ましくは総容積の１２倍の水で洗浄し、それにより水溶出液が得られる。
【００５７】
塩酸を、水溶出液のｐＨ値を２．２〜３．５、好ましくは３．０へ調整するために水溶出液に添加する。
【００５８】
上記酸性溶出液を、再度多孔質吸収性樹脂上へ適用して、生薬対多孔質吸収性樹脂の重量比は５：１〜１：１、好ましくは４：１であり、カラムを、溶出液がほぼ無色になるまで、ｐＨ値２．２〜３．５、好ましくは３．０を有する塩酸で洗浄する。
【００５９】
さらに、３倍〜８倍の５０％〜９５％エタノール、好ましくは４倍の９５％エタノールを使用して、カラムを洗浄し、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない抽出物を得る。
【００６０】
工程ｃ）では、工程ｂ）で濃縮された抽出物を有機溶媒、好ましくはメタノールで溶解し、クロマトグラフィシリカゲルと混合して、好ましくは添加される２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。十分に混合されたサンプルを、十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、好ましくは充填されるシリカゲルは、２００メッシュ〜３００メッシュのシリカゲルであり、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は９０：１０：３〜４０：１０：０．５である）、好ましくはクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。上記溶出は、定組成溶出（溶出液の比は不変である）又は勾配溶出（溶出液の比は、時間の経過とともに変化する）であり得る。ここで、上記勾配溶出は、当該技術分野における常識を使用することによって、収集される物質の極性に従って調整することができ、例えば、溶出液の極性が徐々に増大した。溶出プロセスを正確にモニタリングするために、クロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は５０：１０：２である）の展開溶媒を用いたＴＬＣが好ましい。
【００６１】
特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌが得られる。
【００６２】
より良好な分離効果を達成するために、分取用液体クロマトグラフィを分離ツールとして使用することができる。例えば、サルビアノール酸Ｌは、下記分離条件で調製される：Waters製のＤｅｌｔａ ｐｒｅｐ ４０００半分取用液体クロマトグラフィ、カラム：Aglient製のＺｏｒｂａｘ ＸＤＢ−Ｃ１８（２１．２ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）、移動相：アセトニトリル：０．１％ギ酸水溶液（１５：８５）、流速：２０ｍｌ／分、検出波長：２８０ｎｍ。
【００６３】
薬力学的試験で示されるように、サルビアノール酸Ｌのフリーラジカルを捕捉する(scavenging)能力は、ビタミンＣの能力よりもはるかに高い（表３、図９を参照）。さらに、本発明のサルビアノール酸Ｌの還元力は、ビタミンＣの還元力よりも高い（図１０を参照）。本発明のサルビアノール酸Ｌは、抗酸化及びフリーラジカル捕捉の活性を保有する。結果として、本発明のサルビアノール酸Ｌは、フリーラジカルを捕捉する活性及び予防的抗酸化機能を有する薬へ調製することができる。
【００６４】
さらに、本発明はまた、心臓血管疾患を治療するための薬の調製における上記サルビアノール酸Ｌの使用に関する。上記心臓血管疾患が、低酸素誘導性血管拡張機能不全、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化状態により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン障害、並びに急性心筋虚血からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である。
【００６５】
本発明の薬力学的試験で示されるように、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、ノルエピネフリンの血管収縮曲線の或る特定の右側シフトを引き起こし得るが、有意な差はない。サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、３つのＡｃｈ濃度（１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ、１０-3ｍｏｌ／Ｌ）で無酸素性血管輪に対して血管拡張効果を有意に増強した（Ｐ＜０．０５）。サルビアノール酸Ｌが、低酸素により引き起こされる血管拡張機能不全を改善させるのに重要な役割を果たすことが示される（表７〜表８、及び図１１〜図１２を参照）。
【００６６】
本発明のサルビアノール酸Ｌは、虚血及び低酸素症により引き起こされる血管内皮傷害の寛解、血管内皮過形成の促進、虚血及び低酸素により引き起こされる心筋細胞傷害の改善、アテローム性動脈硬化症に対する抵抗性、血小板凝縮の阻害及び血栓形成に対する抵抗性を含む心臓血管系に対する広範な薬力学的効果を有する。さらに、上記サルビアノール酸Ｌは、冠状動脈を拡張させる効果、冠血流を増大させる効果及び脳虚血により引き起こされる傷害を防止する効果を有する。
【００６７】
本発明の薬力学的試験で示されるように、本発明のサルビアノール酸Ｌは、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化水素により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経系細胞傷害に対して有意な改善効果を有し、細胞生存率を高めることができ、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化状態から神経細胞を保護する機能を有する（表１２〜表１５を参照）。さらに、本発明のサルビアノール酸Ｌは、急性心筋虚血を治療する効果を有する（表１６〜表１７を参照）。
【実施例】
【００６８】
抗酸化及びフリーラジカル捕捉に対する本発明のサルビアノール酸Ｌの好適な効果はさらに、下記の具体的な実験データにより示される。
【００６９】
別記されない限り、本発明で言及される単位％及び‰は重量比を表す。
【００７０】
実施例１ サルビアノール酸Ｌの調製
タンジン煎じ片を、抽出器中に入れた。生薬の容積の４倍の水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）を抽出器へ加えて、２時間煎じて、濾過した。薬物残渣は、薬物残渣の容積の３倍の水で１時間煎じ続けて、濾過して、濾液を組み合わせて、濃縮して、相対密度１．２（８０℃）を有する抽出物を得た。最終エタノール含有量が７０％（２５℃）になるまで９５％エタノールを抽出物に添加して、沈殿を実施して、１２時間以上の間、静置させた。エタノールを減圧条件下で回収して、相対密度１．３７（６０℃）を有する抽出物を得た。
【００７１】
上述の抽出物を水で溶解させた後、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上に適用させて、カラムを総容積の１２倍の水で溶出させて、水溶出液を得た。水溶出液のｐＨは、塩酸でｐＨ３．０に調整した。再び、酸性にした水溶出液をＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用させた。ｐＨ値３．０を有する酸性水溶液を使用して、溶出液がほぼ無色になるまで、カラムを洗浄した。さらに、総容積の４倍の容積を有する９５％エタノールを使用して、溶出させて、溶出液を得た後、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない粘度の高い抽出物を得た。
【００７２】
得られた抽出物をメタノールで溶解させて、ここで２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルを添加して、混合して、添加されるクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。混合サンプルを十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。ＴＬＣを使用して、全溶出プロセスをモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得た。
【００７３】
高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）を使用することによって、擬分子イオンピークは［Ｍ−Ｈ］+ｍ／ｚ ５３７．１０３４であった。
【００７４】
【表１】
【００７５】
ＤＥＰＴスペクトルは、分子中に１×ＣＨ2、１２×ＣＨ及び１４×Ｃが存在することを示した。
【００７６】
実施例２ サルビアノール酸Ｌの調製
タンジン及びサンシチ（Sanqi）の煎じ片を、抽出器中に入れた。生薬の容積の６倍の水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）を抽出器へ加えて、３時間煎じて、濾過した。薬物残渣は、薬物残渣の容積の５倍の水で２時間煎じ続けて、濾過して、濾液を組み合わせて、濃縮して、相対密度１．２５（８０℃）を有する抽出物を得た。最終エタノール含有量が６８％（２５℃）になるまで９５％エタノールを抽出物に添加して、沈殿を実施して、１２時間以上の間、静置させた。エタノールを減圧条件下で回収して、相対密度１．３２（６０℃）を有する抽出物を得た。
【００７７】
上述の抽出物を水で溶解させた後、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上に適用させて、カラムを総容積の１２倍の水で溶出させて、水溶出液を得た。水溶出液のｐＨは、塩酸でｐＨ２．５に調整した。再び、酸性にした水溶出液をＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用させた。ｐＨ値３．０を有する酸性水溶液を使用して、溶出液がほぼ無色になるまで、カラムを洗浄した。さらに、総容積の５倍の９５％エタノールを使用して、溶出させて、溶出液を得た後、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない粘度の高い抽出物を得た。
【００７８】
得られた抽出物をメタノールで溶解させて、ここで２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルを添加して、混合して、添加されるクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。混合サンプルを十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。ＴＬＣを使用して、全溶出プロセスをモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得た。
【００７９】
高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）を使用することによって、擬分子イオンピークは［Ｍ−Ｈ］+ｍ／ｚ ５３７．１０２７であった。
【００８０】
【表２】
【００８１】
ＤＥＰＴスペクトルは、分子中に１×ＣＨ2、１２×ＣＨ及び１４×Ｃが存在することを示した。
【００８２】
実施例３ サルビアノール酸Ｌの調製
タンジン煎じ片を抽出器に入れた。生薬の容積の６倍の８５％エタノールを抽出器に加えて２回、各回毎に２時間煎じて、濾過した。エタノール抽出溶液は廃棄した。
【００８３】
薬物残渣を、薬物残渣の容積の４倍の水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）で２時間煎じて、濾過し、薬物残渣を、薬物残渣の容積の３倍の水で１時間、煎じ続けて、濾過した。濾液を組み合わせて、濃縮して、相対密度１．２（８０℃）を有する抽出物を得た。最終エタノール含有量が７０％（２５℃）になるまで９５％エタノールを抽出物に添加して、沈殿を実施して、１２時間以上の間、静置させた。エタノールを減圧条件下で回収して、相対密度１．３７（６０℃）を有する抽出物を得た。
【００８４】
上述で得られた抽出物を水で溶解させた後、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上に適用させて、カラムを総容積の１２倍の水で溶出させて、水溶出液を得た。水溶出液のｐＨは、塩酸でｐＨ３．０に調整した。再び、酸性にした水溶出液をＡＢ−８多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用させた。ｐＨ値３．０を有する酸性水溶液を使用して、溶出液がほぼ無色になるまで、カラムを洗浄した。さらに、総容積の４倍の９５％エタノールを使用して、溶出させて、溶出液を得て、溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない粘度の高い抽出物を得た。
【００８５】
得られた抽出物をメタノールで溶解させて、ここで２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルを添加して、混合して、添加されるクロマトグラフィシリカゲルの重量は、抽出物の重量に等しい。混合サンプルを十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、カラムをクロロホルム：メタノール：ギ酸（容積比は８５：１５：３である）の移動相で溶出させる。ＴＬＣを使用して、全溶出プロセスをモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、サルビアノール酸Ｌを得た。
【００８６】
実施例４ サルビアノール酸Ｌの錠剤の調製
配合：
サルビアノール酸Ｌ １００ｇ
微結晶性セルロース ５０ｇ
ラクトース ５０ｇ
デンプン ５１ｇ
ナトリウムカルボキシメチルデンプン １２ｇ
５％ ＰＶＰ無水エタノール 適量
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
【００８７】
上記配合物を１０００個の錠剤に調製した。
【００８８】
調製プロセス：
１．造粒
サルビアノール酸Ｌ及び配合中に列挙した他の補助剤を、それぞれ１００メッシュの篩に通して篩過した。配合投与量に従って、サルビアノール酸Ｌ、微結晶性セルロース、デンプン及びナトリウムカルボキシメチルデンプンを、同等に漸増する方法を用いることによって十分ブレンドした。適量の５％ ＰＶＰ無水エタノールを使用して、軟質材料を製造して、１４メッシュの篩を用いて造粒して、５０℃〜６０℃で１時間乾燥させた。配合投与量に従ってステアリン酸マグネシウムを添加して、１４メッシュの篩で顆粒を篩過した。
【００８９】
２．錠剤の加圧成型
得られた顆粒を、特定のダイアモンド形状のパンチで加圧成型して、錠剤を調製した。
【００９０】
実施例５ サルビアノール酸Ｌのカプセルの調製
配合：
サルビアノール酸 １００ｇ
デンプン ２００ｇ
ナトリウムカルボキシメチルデンプン １２ｇ
５％ ＰＶＰ無水エタノール 適量
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
【００９１】
上記配合物を１０００個のカプセルに調製した。
【００９２】
調製プロセス：
１．造粒
サルビアノール酸Ｌ及び配合中に列挙した他の補助剤を、それぞれ１００メッシュの篩に通して篩過した。配合投与量に従って、サルビアノール酸Ｌ、デンプン及びナトリウムカルボキシメチルデンプンを、同等に漸増する方法に従って十分ブレンドした。適量の５％ ＰＶＰ無水エタノールを使用して、軟質材料を製造して、１４メッシュの篩を用いて造粒して、５０℃〜６０℃で１時間乾燥させた。配合投与量に従ってステアリン酸マグネシウムを添加して、１４メッシュの篩で顆粒を篩過した。
【００９３】
２．封入
得られた顆粒をカプセルへ充填した。
【００９４】
実施例６ サルビアノール酸Ｌの注射剤の調製
配合：
サルビアノール酸Ｌ １００ｇ
マンニトール １００ｇ
注射用の水 ２５００ｍｌまで
【００９５】
上記配合物を１０００ユニットに調製した。
【００９６】
調製プロセス：
サルビアノール酸Ｌを取り出して、注射用の水１０００ｍｌで溶解させて、一様に攪拌した。マンニトールを、注射用の水５００ｍｌで溶解させて、上述のサルビアノール酸Ｌ溶液に添加して、一様に攪拌して、そこへ活性炭０．５ｇを添加して、不変温度で２０分間攪拌して濾過した。濾液のｐＨを４．５〜５．０へ調整して、注射用の水で２５００ｍｌまで希釈して、滅菌濾過して、別個に充填して製品を得た。
【００９７】
実施例７ サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の調製
配合：
サルビアノール酸Ｌ １００ｇ
マンニトール １００ｇ
注射用の水 ２０００ｍｌ
【００９８】
上記配合物を１０００ユニットに調製した。
【００９９】
調製プロセス：
サルビアノール酸Ｌ及びマンニトールを秤量して、攪拌することによって注射用の水１５００ｍｌで溶解させて、そこへ２０分間攪拌することにより脱色のために活性炭０．５ｇを添加して、溶液を微小空洞フィルターフィルム（０．４５μｍ）に通して濾過して、炭素を除去して、注射用の水で２０００ｍｌまで希釈した。得られた溶液を滅菌濾過して、別個に充填して、凍結乾燥させて、製品を得た。
【０１００】
薬力学的実施例
薬力学的実施例１ フサルビアノール酸Ｌのフリーラジカル捕捉反応
フリーラジカルは、活性の高い物質の一種であると考えられている。フリーラジカルは、細胞の代謝プロセス中に順次生成され得る。それらの直接的又は間接的な酸化効果に起因して、フリーラジカルは、生理学的プロセス及び病理学的プロセスに広く関与することが示されている。過剰量のフリーラジカルの存在下で、フリーラジカルは常に、酸化により身体中の高分子（例えば、核酸、タンパク質、糖類及び脂質等）を攻撃する。酸化によるこれらの物質の変性（架橋及び破壊）により、フリーラジカルは細胞構造及び機能に損傷を引き起こして、身体の組織破壊及び変性変化をもたらす。多くの研究により示されているように、フリーラジカルは、多数の疾患の病理学的プロセスに寄与しており、心臓血管疾患、幾つかのがん、老人性白内障及び黄斑変性症、幾つかの炎症及び多様なタイプのニューロン疾患のような多くの疾患を引き起こす。
【０１０１】
化学構造分析は、サルビアノール酸化合物がフェノール性ヒドロキシル基の供与体であり、それらの抗酸化活性に対する構造基盤を有することを示す。この研究では、サルビアノール酸Ｌのフリーラジカル捕捉活性を観察するのに、１，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカル捕捉反応モデルを使用している。
【０１０２】
１．試薬及び装置
９５％を超える純度を有するサルビアノール酸Ｌは、Tianjin Tasly Group Academyにより提供され、実施例１の方法に従って調製した。
【０１０３】
ビタミンＣ及びＤＰＰＨは、SIGMA Inc.から購入した。
【０１０４】
紫外線分光光度計（ＵＶ−１８００）は、Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.から購入した。
【０１０５】
２．実験方法
総反応容積は２ｍｌであった。８０％メタノール（ｖ／ｖ）中の種々の濃度でのサンプル溶液１ｍｌを、１００μＭのＤＰＰＨメタノール溶液に添加して、一様に混合して、暗所で２５℃で２０分間溶液を反応させた。反応溶液の吸光度を５１７ｎｍで測定した。この研究では、ビタミンＣを陽性対照とみなした。フリーラジカル捕捉率を下記方程式に従って算出した：
フリーラジカル捕捉率（％）＝［１−Ａサンプル／Ａ対照）／Ａ対照］×１００％
（式中、Ａサンプルは、試験サンプルの吸光度を意味し、Ａ対照は、ブランク対照の吸光度を意味する）。
【０１０６】
３．実験結果
表３及び図９は、種々の濃度でのサルビアノール酸Ｌ及びビタミンＣのＤＰＰＨフリーラジカル捕捉率を示す。サルビアノール酸Ｌは、ビタミンＣのフリーラジカル捕捉率よりもはるかに高いフリーラジカル捕捉率を有していた。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
薬力学的実施例２ サルビアノール酸Ｌの還元力の測定
或る程度までは、予防的抗酸化に関する潜在能力は、薬物の還元力により表わされる。本発明のサルビアノール酸Ｌの還元力に関して研究が行われた。
【０１０９】
１．試薬及び装置
９５％を超える純度を有するサルビアノール酸Ｌは、Tianjin Tasly Group Academyにより提供され、実施例１の方法に従って調製した。
【０１１０】
分析上純粋なフェリシアン化カリウムは、Tianjin No.1 Chemical Reagent Factoryから購入した。
【０１１１】
分析上純粋なトリクロロ酢酸は、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.から購入した。
【０１１２】
分析上純粋な塩化第二鉄は、Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Science and Technology Co., Ltd.から購入した。
【０１１３】
ビタミンＣは、SIGMA Inc.から購入した。
【０１１４】
紫外線分光光度計（ＵＶ−１８００）は、Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.から購入した。
【０１１５】
冷却遠心機（Ｚ３２３Ｋ）は、HEMMLE（ドイツ）から購入した。
【０１１６】
２．実験方法
種々の濃度のサルビアノール酸Ｌ及び１．０％フェリシアン化カリウム溶液を含有する２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍｌを、それぞれ吸い取って、水浴（５０℃）で２０分間加熱した後に氷浴上で冷却した。トリクロロ酢酸溶液（１０％）０．５ｍｌを添加して、１０００ｇ／分で１０分間遠心分離した。得られた上清１．０ｍｌを採取して、そこへ蒸留水１．０ｍｌ及び塩化第二鉄溶液（０．１％）０．２ｍｌを添加して、さらに１０分間静置させて、吸光度を７００ｎｍで測定した。同時に、ブランク実験を実行した。ビタミンＣは、強力な還元物質であり、この研究において陽性対照として役割を果たす。サンプルの還元力は、試験サンプルの吸光度から、ブランク対照の吸光度を差し引くことにより表わされる。したがって、吸光度が高いほど、還元力が強力であることを意味する。
【０１１７】
３．実験結果
図１０に示されるように、両方の物質が濃度依存的な吸光度を有し、サルビアノール酸Ｌの還元力は、ビタミンＣの還元力よりもはるかに強力であった。
【０１１８】
下記薬力学的実験例３〜５で使用されるＮｏ．１抽出物及びＮｏ．２抽出物の成分の決定並びに調製
実験で使用される材料は全て、Tianjin Tasly Group Academy TCM Instituteにより提供された。Ｎｏ．１抽出物の含有量は、生薬 ６．８２５ｇ／ｇ（Ｎｏ．１抽出物）であり、Ｎｏ．２抽出物は、生薬 ４．１６２ｇ／ｇ（Ｎｏ．２抽出物）であった。
【０１１９】
調製プロセス
Ｎｏ．１抽出物の調製プロセス：
８９．８ｗｔ％の丹参（中国名：タンジン）及び９．６ｗｔ％のラディックス・ノトギンセング（中国名：サンシチ）の混合物を水（０．４５％重炭酸ナトリウムを含有する）で２回（５倍の水で２時間、また４倍の水で１時間）、順次抽出した。９５％エタノール（ｖ／ｖ）を使用して、還流を用いて水抽出溶液を濃縮した。エタノール抽出溶液中の最終エタノール含有量が７０％になるまで、エタノール沈殿を実施した。さらに一晩静置した後、上清を採取して、濃縮して、Ｎｏ．１抽出物を得た。
【０１２０】
Ｎｏ．２抽出物の調製プロセス：
８９．８ｗｔ％の丹参（中国名：タンジン）及び９．６ｗｔ％のラディックス・ノトギンセング（中国名：サンシチ）の混合物を水で２回（５倍の水で２時間、また４倍の水で１時間）、順次抽出した。９５％エタノール（ｖ／ｖ）を使用して、還流を用いて水抽出溶液を濃縮した。エタノール抽出溶液中の最終エタノール含有量が７０％になるまで、エタノール沈殿を実施した。さらに一晩静置した後、上清を採取して、濃縮して、Ｎｏ．２抽出物を得た。
【０１２１】
サルビアノール酸Ｌを本発明の実施例１の方法により調製した。
【０１２２】
検出方法
分析条件は下記の通りであった：Waters製の２６９５ ＨＰＬＣ、Agilent製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）クロマトグラフィカラム、０．０２％リン酸水溶液を移動相Ａとして使用し、０．０２％リン酸を含有する８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を移動相Ｂとして使用し、勾配溶出は、下記表４に従って実施し、流速は１ｍｌ／分であり、検出波長は２８０ｎｍであり、カラム温度は３０℃であり、記録時間は５０分であった。
【０１２３】
【表４】
【０１２４】
Ｎｏ．１抽出物及びＮｏ．２抽出物中の各成分の含有量を、下記表５及び表６に提示した。
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
薬力学的実施例３ 単離ラット胸部大動脈に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果
実験材料
１．試験材料及び試薬：サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、Tianjin Tasly Group Academy TCM Instituteにより提供された。クエン酸ノルエピネフリン（ＮＡ）及びアセチルコリン（ＡＣＨ）はSigma Inc.から購入して、バッチ番号は、１３７７５１１及び４４９０８１３１であった。クレブス溶液を調製するための原材料には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、グルコース及び塩化カルシウムが含まれていた。
【０１２８】
２．主な装置：ＭｅｄＬａｂ（登録商標）単離組織トラフ及びＭｅｄｌａｂ−Ｕ／８Ｃ獲得システムは、Nanjing Medease Science and Technology Co., Ltd.により製造された。他の装置としては、張力変換器、デジタル制御超恒温槽ＳＣ−１５、化学天秤、浄水器及び酸素ボンベが挙げられた。
【０１２９】
３．実験動物：適正な体重のＳＤラット（雄又は雌）は、証明書番号ＳＣＸＫ（Jing）２００７−０００１とともにBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から提供された。ラットは全て、動物給餌室で室温２０℃〜２５℃でラット特別食（Beijing Keaoxieli Diet CO., Ltd.により製造）及び水道水が与えられ、１２時間照射した。
【０１３０】
実験方法
１．投与用量の設計
サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の用量は、他のサルビアノール酸の薬力学的実験に基づいて確認された。この研究では、用量は、０．１ｍｇ／ｍｌであった。
クレブス溶液（ｍｏｌ／Ｌ）：ＮａＣl（１２０）、ＮａＨＣＯ3（２５）、ＫＨ2ＰＯ4（１．２）、ＭｇＳＯ4（１．２）、ＫＣｌ（４．５）、ＣａＣｌ2（１．２５）、Ｃ6Ｈ12Ｏ6（グルコース１１．１）。
ＫＣｌ：各時点でＫＣｌ（３ｍｏｌ／Ｌ）１００μｌを添加した（最終濃度は６０ｍｍｏｌ／Ｌ）。
ＮＡ：１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度は１０-6ｍｏｌ／Ｌ）は、総計４つの勾配で希釈した。
ＡＣＨ：１０-3ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度は１０-5ｍｏｌ／Ｌ）は、総計４つの勾配で希釈した。
【０１３１】
２．グループ分け
ラットには、その日に薬物の調製に従って、無作為に群に配置した自由食を与えた。各群には８匹のラットが存在し、各ラットから入手可能な４つの血管輪データが存在することを確認した。この研究では、ラットを３つの群：正常群、低酸素モデル群及びサルビアノール酸Ｌ＋低酸素モデル群に分けた。
【０１３２】
３．実験方法
ＳＤラットには、その日に薬物の調製に従って、無作為に群に配置した自由食を与えた。各群には８匹のラットが存在した。ラットを頸椎の脱臼により屠殺して、迅速に開胸して、胸部大動脈を取り出した。０℃で、胸部大動脈を、酸素を吹き込んだクレブス溶液へ入れて、ここで結合組織を除去して、胸部大動脈を、直径約２ｍｍを有する血管輪にして、血管輪を、一定温度３７℃で分離浴トラフ中で慎重に付した。酸素をトラフへ吹き込み、そこへ張力変換器及びマルチチャネル生理学的記録計を接続させた。基礎張力は２ｇであり、血管輪は４５ｍｉｎ-1時間平衡化させて、クレブス溶液を１５分間隔で交換した。平衡化させた後、血管輪を塩化カリウム溶液で２０分間前処理して、溶出させた。１５分の平衡化後、血管輪を再び塩化カリウム溶液でもう１回前処理して、生理学的に極値の血管収縮を達成した。次に、種々の勾配レベル（１０-7ｍｏｌ／Ｌ、１０-6ｍｏｌ／Ｌ、１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ）を踏まえてＮＡを添加して、血管収縮を観察した。ピーク値に到達すると、値は定常期で安定化した。続いて、種々の勾配レベル（１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ、１０-3ｍｏｌ／Ｌ、１０-2ｍｏｌ／Ｌ）を踏まえてＡＣＨを添加して、血管拡張を観察した。ＮＡ及びＡＣＨを添加するプロセス中は、クレブス溶液は交換することができない。
【０１３３】
低酸素モデル群では、酸素の供給は、塩化カリウム溶液により２回前処理した後に、２０分間懸濁した。同時に、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末又はクレブス溶液（等量で）を添加して、一緒に浸して、その後種々の勾配レベルを踏まえてＮＡ及びＡＣＨを添加した。クレブス溶液は、低酸素の始まりから、ＡＣＨの最終濃度勾配の添加の終わりまで交換することができない。
【０１３４】
結果は、ｔ検定を使用することにより統計学的に解析した。
【０１３５】
実験結果
１．血管収縮に対する効果
結果で示されるように、サルビアノール酸Ｌの乾燥粉末は、本実験条件下では正常群と比較して血管収縮に対して有意な効果が見られず、血管−張力曲線の明らかな右側シフトが見られた。データは表７に見られた。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
血管収縮に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果は図１１に見られた。
【０１３８】
２．血管拡張に対する効果
この結果で示されるように、正常群と比較して、血管拡張は、本実験条件下では低酸素モデル群における４つのＡＣＨ勾配レベルで明らかに減衰した（Ｐ＜０．０１）のに対して、サルビアノール酸Ｌ群及び正常群において有意な差は見られなかった。低酸素モデル群と比較して、血管拡張は、サルビアノール酸Ｌ群における３つのＡＣＨ勾配レベルで明らかに増強した（Ｐ＜０．０５）。このことにより、サルビアノール酸Ｌ群が、低酸素誘導性血管拡張の機能不全を有意に改善させることができることが示唆された。データは表８に見られた。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
血管拡張に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の効果は図１２に見られた。
【０１４１】
実験的な結論：
サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、或る程度はＮＡの血管収縮曲線の右側シフトを引き起こすことに対して効果があったが、有意な差は観察されなかった。２０分間の低酸素は、モデル群においてＡＣＨにより引き起こされる血管輪の勾配拡張において有意な低下を引き起こす可能性があり（Ｐ＜０．０１）、拡張機能障害が発生した。対比して、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、ＡＣＨの３つの勾配レベル（１０-5ｍｏｌ／Ｌ、１０-4ｍｏｌ／Ｌ、１０-3ｍｏｌ／Ｌ）で無酸素血管輪の拡張において有意な増強を示した（ｐ＜０．０５）。サルビアノール酸Ｌが、低酸素により引き起こされる血管拡張機能障害に対して有意な改善効果を有することが確認された。
【０１４２】
注意点に関する論述：
１．クレブス溶液を調製する際、混濁を防止するために他の物質を全て添加するまで、塩化カルシウム及びグルコースは添加しなかった。クレブス溶液は綿状沈殿を回避するため、長時間、室温で維持することができない。最終的に、クレブス溶液は要時調製した。
【０１４３】
２．心臓大動脈は、できる限り早く、氷浴中に取り出して、装置により引き起こされる血管輪への傷害を低減させるべきである。心臓大動脈は、血管活性の低減を防止する目的で、血管アーチに十分に密接して取り出されるべきである。
【０１４４】
３．酸素は、小泡の形態で排気され、特大の泡が、張力変換器に影響を与える場合があり、データの歪みをもたらすため、できるだけ小さくなければならない。
【０１４５】
薬力学的実施例４ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末及びその抽出物の保護効果
実験材料
１．主な装置：スーパークリーンベンチは、Antai Cleaning Equipment Inc.により製造され、定温ＣＯ2インキュベータは、Heraeus（ドイツ）から購入し、ＥＬＩＳＡ読取計は、BIO-RAD Inc.（米国）から購入し、平坦振とう台は、Jiangsu Guangming Experimental Apparatus Manufacturerで購入し、倒立生物顕微鏡は、オリンパス株式会社（日本）から購入した。
【０１４６】
２．主な試薬：ＤＭＥＭ高グルコース培地及びＤＭＥＭグルコース非含有培地は、GIBCOにより調製され、トリプシンは、SIGMAから購入し、ウシ胎児血清は、PAAから購入し、ＭＴＴ及びＤＭＳＯは、Sigmaから購入し、ＬＤＨ試験キットは、Nanjing Jiangcheng Bioengineering Instituteから購入した。
【０１４７】
３．使い捨て材料：９６ウェル細胞培養マイクロプレートは、CORNINGにより調製された。
４．細胞染色：ＰＣ１２。
【０１４８】
実験方法：
１．ＭＴＴ法
ａ．ＭＴＴを、各ウェル中に２０μｌで９６ウェルマイクロプレートに添加して、インキュベータ中で４時間反応させた。
ｂ．上清を廃棄して、続いて各ウェル中でＤＭＳＯ １５０μｌを添加して、平坦振とう台上で１０分間振とうさせた。
ｃ．各ウェルの吸光度を波長５７０ｎｍでＥＬＩＳＡ読取計により測定して、細胞生存率を算出した。
細胞生存率％＝（薬物投与群のＯＤ値／陰性対照群のＯＤ値）×１００％
【０１４９】
２．ＬＤＨ活性の測定
測定実験は、Nanjing Jiangcheng Bioengineering Instituteにより提供されるＬＤＨ試験キットの仕様に従って実行した。詳細な工程は表９に提示した。
【０１５０】
【表９】
【０１５１】
ＬＤＨ活性（Ｕ／Ｌ）＝（ＯＤU−ＯＤC）／（ＯＤS−ＯＤB）×ＣS×Ｎ×１０００
（式中、ＯＤUは、試験サンプルの吸光度を表し、ＯＤCは、対照サンプルの吸光度を表し、ＯＤBは、ブランクの吸光度を表し、ＯＤSは、標準溶液の吸光度を表し、ＣSは、２ｍｍｏｌ／Ｌの標準濃度を表し、Ｎは、測定前のサンプルの希釈倍数を表す）。
【０１５２】
実験結果：
１．過酸化水素で損傷させたモデルの確立
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（ＰＢＳ）、溶媒対照群（ＤＭＳＯ）、モデル群（Ｈ2Ｏ2）及び陽性対照群（エダラボン）の４つの群が存在した。
ブランク対照群：ＰＢＳの添加のみ。
溶媒対照群：０．１％ＤＭＳＯの添加。
モデル群：過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の濃度はそれぞれ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭあり、反応時間は１時間であった。
陽性対照群：エダラボン（２μｇ／ｍｌ）を陽性薬物として添加して、続いて６時間前処理して、そこへ０．５ｍＭ過酸化水素を添加して、１時間損傷させて、新たに調製したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培養培地（ウェル１つ当たり２００μｌ）と交換した。
ｄ．細胞活性をＭＴＴ法により測定した。
【０１５３】
【表１０】
【０１５４】
表１０で示されるように、０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2で１時間処理した後に、ＰＣ１２細胞生存率は４０％であり、阻害率は６０％であった。過酸化水素で損傷させたモデルは、０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2で１時間処理したＰＣ１２細胞であった。
【０１５５】
２．酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの確立
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（酸素正常状態＋０．１％ＤＭＳＯ）、モデル群（ＯＧＤ＋０．１％ＤＭＳＯ、酸素−グルコース欠乏）及び陽性対照群（エダラボン）の３つの群が存在した。
モデル群：培養マイクロプレート中の細胞を、グルコース非含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養し、これを低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移した。インキュベーションの期間後に、測定を実行した。
陽性対照群：エダラボン（２μｇ／ｍｌ）を陽性薬物として使用した。薬物を添加して、６時間前処理した後、グルコース非含有培地（ウェル１つ当たり１８０μｌ）と交換した。薬物を再び添加して、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移した。インキュベーションの期間後に、測定を実行した。
ｄ．細胞活性はＭＴＴ法により測定した。
【０１５６】
【表１１】
【０１５７】
表１１に示されるように、酸素−グルコース欠乏で損傷させたＰＣ１２細胞の生存率は、ちょうど４２％であり、阻害率は５８％であった。したがって、この研究での酸素−グルコース欠乏モデルは、細胞を培養するように選択されたグルコース非含有ＤＭＥＭであり、これを低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移した。インキュベーションの期間後に、測定を実行した。
【０１５８】
３．Ｈ2Ｏ2で損傷させたＰＣ１２細胞の細胞生存率に対する薬物の効果
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（ＰＢＳ）、溶媒対照群（ＤＭＳＯ又は酢酸エチル）、モデル群（Ｈ2Ｏ2）、陽性対照群（エダラボン）及び薬物処理群の５つの群が存在した。
モデル群：０．５ｍＭ過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を使用して、１時間処理した。
陽性対照群：陽性薬物として使用されるエダラボン（２μｇ／ｍｌ）を細胞に添加して、６時間前処理して、そこへ０．５ｍＭ過酸化水素を添加して、１時間損傷させて、新たに調製したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地と交換した。
薬物処理群：細胞を培養マイクロプレートへ接種して、まず種々の濃度での種々の試験薬物を添加して、ウェル１つ当たり２０μｌで６時間前処理して、そこへ０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2を添加して、１時間損傷させて、続いて新たに調製したＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培養培地と交換した。
ｄ．ＬＤＨ活性の測定のために、上清を収集した（ウェル１つ当たり２０μｌ）。
ｅ．細胞マイクロプレートにおける細胞の活性をＭＴＴ法により測定した。
【０１５９】
【表１２】
【０１６０】
薬物濃度はそれぞれ、０．１％、０．０１％及び０．００１％でＤＭＳＯを用いて調製し、これらは、相当する濃度を有する溶媒対照群と比較するものとする。ここで、薬物処理群はモデル群（０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）と比較し、モデル群（Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）は溶媒対照群（ＥｔＯＡｃ）と比較した。
【０１６１】
【表１３】
【０１６２】
ここで、薬物処理群はモデル群（０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）と比較した一方で、モデル群（Ｈ2Ｏ2＋ＥｔＯＡｃ）は溶媒対照群（ＥｔＯＡｃ）と比較した。
【０１６３】
４．酸素−グルコース欠乏のＰＣ１２細胞の生存率に対する薬物の効果
ａ．良好な条件での指数増殖期にあるＰＣ１２細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．２５％トリプシン消化溶液を添加して、３７℃で約１分間消化を実施した。この反応は、血清含有培養培地の添加により終了させて、遠心分離して再懸濁させて、続いて細胞を計数して、２×１０4細胞／ｍｌ〜４×１０4細胞／ｍｌの細胞密度を有する懸濁液を調製した。
ｂ．得られた細胞懸濁液を、各ウェル中に１８０μｌで９６ウェルマイクロプレートへ接種して（ｎ＝３）、定温ＣＯ2インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。
ｃ．グループ分け及び処理：ブランク対照群（酸素正常状態＋０．１％ＤＭＳＯ）、モデル群（ＯＧＤ＋ＤＭＳＯ、酸素−グルコース欠乏）、陽性対照群（エダラボン）及び薬物処理群の４つの群が存在した。
モデル群：マイクロプレート中の細胞用の培養培地を、グルコース非含有ＤＭＥＭへ変更し、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移して、一晩培養した。
陽性対照群：エダラボン（２μｇ／ｍｌ）を陽性薬物として使用した。薬物を添加して、６時間前処理した後、培養培地を、グルコース非含有ＤＭＥＭ培地（ウェル１つ当たり１８０μｌ）と交換した。薬物を再び添加して、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移して、一晩培養した。
薬物処理群：種々の濃度での薬物を添加して、６時間前処理して、培養培地をグルコース非含有ＤＭＥＭ培地（ウェル１つ当たり１８０μｌ）へ変更した。薬物を再び添加して、低酸素チャンバ中に入れて、Ｏ2％が２．６未満になったら０．５時間、時間を数え始めて、続いて日常的なインキュベータへ移して、一晩培養した。
ｄ．翌日に、得られた上清をウェル１つ当たり２０μｌ収集して、これをＬＤＨ活性の測定に使用した。
ｅ．細胞の活性をＭＴＴ法により測定した。
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
ここで、薬物処理群をブランク対照群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）と比較し、モデル群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）をブランク対照群（酸素正常状態＋ＤＭＳＯ）と比較した。
【０１６６】
ｆ．ＬＤＨ活性
【０１６７】
【表１５】
【０１６８】
ここで、薬物処理群をブランク対照群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）と比較した一方で、モデル群（ＯＧＤ＋ＥｔＯＡｃ）をブランク対照群（酸素正常状態＋ＥｔＯＡｃ）と比較した。
【０１６９】
結論：
実験の結果：０．０２μｇ／ｍｌの投与量でサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末を用いて処理した場合、Ｈ2Ｏ2で損傷させたＰＣ１２細胞の細胞生存率は４７％（Ｐ＜０．０５）であったのに対して、０．２μｇ／ｍｌの投与量では、ＬＤＨ活性は４７４（Ｐ＜０．０５）であった。０．０２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．１抽出物に関しては、ＬＤＨ活性はそれぞれ、４８３（Ｐ＜０．０１）、４１６（Ｐ＜０．０１）及び４６５（Ｐ＜０．０５）であったのに対して、０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．２抽出物に関しては、ＬＤＨ活性はそれぞれ、４０７（Ｐ＜０．０１）及び４８８（Ｐ＜０．０１）であり、モデル群と比較して、ともにＬＤＨ活性を低減させる効果を有していた。
【０１７０】
０．０２μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌの投与量でサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末を用いて処理した場合、ＯＧＤ細胞の細胞生存率はそれぞれ、４８％（Ｐ＜０．０１）及び３７％（Ｐ＜０．０５）であった。０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．１抽出物に関して、生存率はそれぞれ、４０％（Ｐ＜０．０１）及び４２％（Ｐ＜０．０１）であったのに対して、０．０２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．２抽出物については、生存率はそれぞれ、４７％（Ｐ＜０．０１）、４７％（Ｐ＜０．０１）及び４１％（Ｐ＜０．０５）であった。２μｇ／ｍｌの投与量でサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末を用いて処理した場合、ＬＤＨ活性は４０（Ｐ＜０．０５）であった。さらに、２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．１抽出物に関して、ＬＤＨ活性は３１（Ｐ＜０．０１）であったのに対して、０．２μｇ／ｍｌの投与量でのサルビアノール酸ＬのＮｏ．２抽出物については、ＬＤＨ活性は３１（Ｐ＜０．０５）であった。
【０１７１】
実験で示されるように、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末は、ＯＧＤ又はＨ2Ｏ2により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経障害に対して有意な改善効果を有していただけでなく、細胞の生存率も増加させた。したがって、サルビアノール酸Ｌは、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化の条件において神経細胞を保護する機能を有することが確認された。
【０１７２】
薬力学的実施例５ ラットにおける実験的急性心筋虚血に対するサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末及び抽出物の保護効果
実験材料：
１．試験材料及び試薬：ピツイトリン（Ｐｉｔ）注射剤は、Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd.により製造され、バッチ番号は０７０３０２であった。生理食塩水は、Tianjin Tian’an Pharmaceutical Co., Ltd.により製造され、バッチ番号は２００６０５２４１（仕様：５００ｍｌ／瓶）であった。
【０１７３】
２．主な装置：ＭｅｄＬａｂ（登録商標）８チャネル生理学的記録計は、Nanjing Medease Science and Technology Co., Ltd.により製造された。
【０１７４】
３．動物：ＳＤラット（適正な体重の雄又は雌）は、証明書番号ＳＣＸＫ（Jing）２００７−０００１とともにBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.により提供された。ラットには全て、２０℃〜２５℃の室温での動物給餌室中でラット特別食（Beijing Keaoxieli Diet Co., Ltd.により製造）及び水道水が与えられ、１２時間照射した。
【０１７５】
実験方法
１．投与用量の設計
Ｎｏ．１抽出物の含有量は、生薬６．８２５ｇ／ｇであり、Ｎｏ．２抽出物の含有量は、生薬４．１６２ｇ／ｇであった。
【０１７６】
Ｎｏ．１抽出物及びＮｏ．２抽出物の両方に関して、高用量及び低用量：それぞれ生薬１．０８６ｇ／ｋｇ及び生薬０．５４３ｇ／ｋｇの２つの群が存在した。生薬の用量変換に従って、高用量Ｎｏ．１抽出物中のサルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末の投与用量は４．６７ｍｇ／ｋｇであり、低用量群では２．３３ｍｇ／ｋｇであった。サルビアノール酸Ｌは、Ｎｏ．２抽出物では見出されなかった。
【０１７７】
サルビアノール酸の凍結乾燥粉末の投与用量は１０．０ｍｇ／ｋｇ及び５．０ｍｇ／ｋｇであった。
【０１７８】
２．グループ分け
２．１ 動物のスクリーニング
正式の実験の前に、ラットに尾側静脈を介してピツイトリン（Ｐｉｔ）（１Ｕ／ｋｇ）を注射した。正常ＥＣＧ及び注射の５分後のＥＣＧを記録して、Ｊ点の上昇及びＴ波異常を観察した。注射前に異常ＥＣＧが見られた動物又はＰｉｔに対して非感受性である動物は拒絶した。
【０１７９】
２．２ 動物のグループ分け
望ましいラットを７群に分けた：（１）モデル対照群、（２）タンジンのＮｏ．１抽出物低用量群（Ａ群）、（３）タンジンのＮｏ.１抽出物高用量群（Ｂ群）、（４）タンジンのＮｏ．２抽出物低用量群（Ｃ群）、（５）タンジンのＮｏ．２抽出物高用量群（Ｄ群）、（６）サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末低用量群（Ｅ群）及び（７）サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群（Ｆ群）。
【０１８０】
３．実験方法
ＳＤラット（半分が雄で、半分が雌）を、無作為に群に分けた（各群中に動物８匹）。処理群中のラットを、種々のサンプルの水性懸濁液を毎日投与したのに対して、モデル対照群中のラットは、等量の生理食塩水を投与した。動物は全て、７日間連続して投与された。最終投与の４０分後に、ラットに麻酔して、リードＩＩ正常ＥＣＧを記録するためのデバイスに接続した。ピツイトリン（Ｐｉｔ）を、尾側静脈を介して１Ｕ／ｋｇ（体重）の投与量で一定速度で約１０秒以内に注射した。ＥＣＧ変化を、投与の０秒後、５秒後、１０秒後、１５秒後、３０秒後、４５秒後、１分後、２分後、３分後、４分後、５分後、１０分後及び１５分後に記録した。各群のＰｉｔの注射前と注射後との間の差、並びに処理群とモデル対照群との差を比較して、Ｊ点及びＴ波の変化を分析して、データをｔ検定により解析した。
【０１８１】
実験結果
１．Ｊ点に対する効果
結果で示されるように、モデル対照群と比較して、Ｆ群（サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群）におけるＥＣＧのＪ点の上昇度は、ピツイトリンにより引き起こされる急性心筋虚血において１５秒、３０秒及び４５秒でより小さく、その差は、本実験条件下では統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。モデル対照群と比較して、Ｂ群（タンジンのＮｏ.１抽出物高用量群）におけるＥＣＧのＪ点の上昇度は１５秒でより小さく、その差は統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、モデル対照群と比較して、他の群は、各時点で有意な差を示さなかった。データは表１６に見られた。
【０１８２】
【表１６】
【０１８３】
２．Ｔ波に対する効果
結果で示されるように、モデル対照群と比較して、１５秒及び３０秒でのＦ群（サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群）のＥＣＧのＴ波の上昇度はより小さく、その差は、本実験条件下では統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。同様に、モデル対照群と比較して、１５秒でのＢ群（タンジンのＮｏ．１抽出物高用量群）におけるＥＣＧのＴ波の上昇度はより小さく、その差は統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、モデル対照群と比較して、他の群は、各時点で有意な差を示さなかった。データは表１７に見られた。
【０１８４】
【表１７】
【０１８５】
結論：
モデル対照群と比較して、Ｆ群（サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末高用量群）におけるＥＣＧのＪ点及びＴ波の上昇度は、１５秒及び３０秒でより小さく、その差は統計学的有意性を有していた（Ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
モデル対照群と比較して、１５秒でのＪ点及びＴ波はともに、Ｂ群（タンジンのＮｏ．１抽出物高用量群）において有意に減少する（Ｐ＜０．０５）。
【０１８７】
モデル対照群と比較して、他の群は、各時点でＪ点及びＴ波において有意な減少を示さなかった。
【０１８８】
結果で示されるように、この研究の下では、サルビアノール酸Ｌの凍結乾燥粉末（１０ｍｇ／ｋｇ）及び４．６７ｍｇ／ｋｇの濃度でのサルビアノール酸Ｌを含有するＮｏ．１抽出物は、抗急性心筋虚血の効果を有していたが、サルビアノール酸Ｌを含有しないＮｏ．２抽出物における実験的投与量の下では、抗急性心筋虚血の効果は観察されなかった。
【０１８９】
注意点に関する論述：
１．Ｊ点の定義：ＱＲＳ波群の終点とＳＴセグメントとの組合せ点。
【０１９０】
２．ピツイトリンの冠状血管に対する収縮効果に起因して、ピツイトリンの静脈内注射は、正常ラットにおいて急性心筋虚血を誘導することができ、ＥＣＧにおけるＪ点及びＴ波の両方の明らかな上昇をもたらす。薬物処理群においてＪ点のシフトが有意に回復し、Ｔ波は、試験薬物が投与された後に徐々に正常レベルへ減少しており、これにより、薬物が、冠状血管に対するピツイトリンの収縮効果により誘導される急性心筋虚血に対して拮抗作用を有することが示唆された。Ｉ期異常（０秒〜４５秒以内でピツイトリンにより誘導される）に対してもＩＩ期異常（４５秒〜１５分以内でピツイトリンにより誘導される）に対しても治療上の効果を有する薬物は通常、抗心筋虚血の効果を有すると考えられた。
【０１９１】
３．実験中、同じバッチ番号のピツイトリンを使用して、実験結果に対する薬物の効力単位の影響を回避すべきである。ピツイトリンは、２時間を超える間隔で注射して、薬物耐性を回避すべきである。好ましくは、選択した動物を１日おきに使用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）を有するサルビアノール酸Ｌの新規化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物及び加水分解可能なエステル：
【化１】
【請求項２】
下記工程：
ａ）抽出：丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を水で抽出して、アルコールを添加し沈殿させて上清を得て、続いて該上清を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｂ）分離：前記工程ａ）の前記抽出物を水中に溶解させて、多孔質吸収性樹脂上に適用し、続いて該樹脂を水で溶出させて、溶出液を得て、該溶出液を酸性にして、該酸性にした溶出液を再び該多孔質吸収性樹脂上に適用し、該樹脂を酸性水溶液で洗浄して、不純物を除去して、続いて該樹脂をエタノールで溶出させて、エタノール溶出液を得て、該エタノール溶出液を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｃ）精製：前記工程ｂ）の前記抽出物をシリカゲルカラム上に適用し、クロロホルム、メタノール及びギ酸の移動相で定組成溶出させて、溶出液を収集して、ＴＬＣにより溶出プロセス全体をモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、前記サルビアノール酸Ｌを得る工程
を含む、請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌを調製する方法。
【請求項３】
前記ａ）において、前記丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を煎じ片にスライスし、前記水抽出が下記の通り：
前記生薬を、該生薬の容積の４倍〜８倍の水で１．５時間〜３．５時間煎じて、濾過して、薬物残渣を、該薬物残渣の容積の３倍〜６倍容量の水で１時間〜３時間煎じて、濾過して、濾液を組み合わせて、該濾液を濃縮して、相対密度１．１１〜１．２８（８０℃）を有する抽出物を得る、煎じることであり、前記アルコール沈殿が下記の通り：
エタノールの含有量が６５％〜７０％になるまで９５％エタノールを前記抽出物に添加して、沈殿させて、１２時間〜３６時間静置して、減圧条件下でエタノールを回収することによって前記上清を濃縮して、相対密度１．３０〜１．３８（６０℃）を有する抽出物を得ることであり、
前記工程ｂ）において、工程（ａ）の最終精製物を多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用し、前記生薬物対該多孔質吸収性樹脂の重量比が５：１〜１：１であり、該樹脂カラムを総容積の８倍〜１５倍の水で洗浄して、水溶出液を得て、塩酸を該水溶出液に添加して、そのｐＨ値を２．２〜３．５へ調整して、前記酸性溶出液を再び該多孔質吸収性樹脂上に適用し、前記生薬対該多孔質吸収性樹脂の重量比が５：１〜１：１であり、該カラムを、該溶出液がほぼ無色になるまでｐＨ値２．２〜３．５を有する塩酸で洗浄して、総容積の３倍〜８倍の５０％〜９０％エタノールを用いて、該カラムを洗浄し、該溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない抽出物を得て、前記多孔質吸収性樹脂が、ＡＢ−８、ＨＰＤ４５０、ＨＰＤ７００、Ｄ１０１、Ｄ４０２０又はＸ５からなる群から選択される多孔質吸収性樹脂の１つであり、
前記工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）において濃縮により得られる前記抽出物を、有機溶媒で溶解し、クロマトグラフィシリカゲルと混合して、十分に混合されたサンプルを、十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、該カラムを、９０：１０：３〜４０：１０：０．５の容積比を有するクロロホルム：メタノール：ギ酸の移動相で溶出させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）において、前記水抽出は下記の通り：
前記生薬を、該生薬の容積の４倍の水で２時間煎じて、濾過して、薬物残渣を、該薬物残渣の容積の３倍の水で１時間煎じて、濾過して、該濾液を組み合わせて、該濾液を濃縮して、相対密度１．２を有する抽出物を得ることであり、前記アルコール沈殿が下記の通り：
エタノールの含有量が７０％になるまで９５％エタノールを前記抽出物に添加して、沈殿させて、さらに２４時間静置して、減圧条件下でエタノールを回収することによって前記上清を濃縮して、相対密度１．３７を有する抽出物を得ることであり、
前記工程（ｂ）において、工程（ａ）の前記最終抽出物を多孔質吸収性樹脂カラム上に適用し、前記生薬対該多孔質吸収性樹脂の重量比が４：１であり、該樹脂カラムを総容積の１２倍の水で洗浄して、水溶出液を得て、塩酸を該水溶出液に添加して、そのｐＨ値を３．０へ調整して、該酸性溶出液を再び該多孔質吸収性樹脂カラム上に適用し、前記生薬対該多孔質吸収性樹脂の重量比が４：１であり、該カラムを、該溶出液がほぼ無色になるまでｐＨ値３．０を有する塩酸で洗浄して、総容積の４倍の９５％エタノールを用いて、該カラムを洗浄して、該溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない抽出物を得て、前記多孔質吸収性樹脂がＡＢ−８であり、
前記工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）において濃縮により得られる前記抽出物を、メタノールで溶解し、２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルカラムと混合して、十分に混合されたサンプルを、十分に充填された２００メッシュ〜３００メッシュのシリカゲルカラム上に置き、前記カラムを、５０：１０：２の容積比を有するクロロホルム：メタノール：ギ酸の移動相で溶出させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
アルカリ水溶液を、前記工程（ａ）における前記水抽出に使用し、該アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム及び水酸化カリウムからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ水溶液が、重炭酸ナトリウム水溶液又は水酸化ナトリウム水溶液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ水溶液が、０．３０％〜０．６８％の濃度の重炭酸ナトリウム水溶液、又は０．００２５‰〜０．００４‰の濃度の水酸化ナトリウム水溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ水溶液が、０．４５％の濃度の重炭酸ナトリウム水溶液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）が、前記水抽出の前にアルコール抽出をさらに含むことを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルコール抽出が、下記の通り：
前記生薬の容積の５倍〜８倍の５０％〜９５％エタノールで２回、各回毎に１時間〜２時間煎じて、濾過して、前記エタノール抽出溶液を廃棄して、薬物残渣を水で抽出する、煎じることであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌ及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項１２】
心臓血管疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌの使用。
【請求項１３】
前記心臓血管疾患が、低酸素誘導性血管拡張機能不全、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化状態により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン障害、並びに急性心筋虚血からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
フリーラジカルを捕捉する活性を有する薬剤の調製における請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌの使用。
【請求項１５】
予防的抗酸化機能の活性を有する薬剤の調製における請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌの使用。
【請求項１】
一般式（Ｉ）を有するサルビアノール酸Ｌの新規化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物及び加水分解可能なエステル：
【化１】
【請求項２】
下記工程：
ａ）抽出：丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を水で抽出して、アルコールを添加し沈殿させて上清を得て、続いて該上清を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｂ）分離：前記工程ａ）の前記抽出物を水中に溶解させて、多孔質吸収性樹脂上に適用し、続いて該樹脂を水で溶出させて、溶出液を得て、該溶出液を酸性にして、該酸性にした溶出液を再び該多孔質吸収性樹脂上に適用し、該樹脂を酸性水溶液で洗浄して、不純物を除去して、続いて該樹脂をエタノールで溶出させて、エタノール溶出液を得て、該エタノール溶出液を濃縮して、抽出物を得る工程、
ｃ）精製：前記工程ｂ）の前記抽出物をシリカゲルカラム上に適用し、クロロホルム、メタノール及びギ酸の移動相で定組成溶出させて、溶出液を収集して、ＴＬＣにより溶出プロセス全体をモニタリングして、特徴的に類似した溶出液を組み合わせて、前記サルビアノール酸Ｌを得る工程
を含む、請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌを調製する方法。
【請求項３】
前記ａ）において、前記丹参生薬又は丹参及び他の生薬の混合物を煎じ片にスライスし、前記水抽出が下記の通り：
前記生薬を、該生薬の容積の４倍〜８倍の水で１．５時間〜３．５時間煎じて、濾過して、薬物残渣を、該薬物残渣の容積の３倍〜６倍容量の水で１時間〜３時間煎じて、濾過して、濾液を組み合わせて、該濾液を濃縮して、相対密度１．１１〜１．２８（８０℃）を有する抽出物を得る、煎じることであり、前記アルコール沈殿が下記の通り：
エタノールの含有量が６５％〜７０％になるまで９５％エタノールを前記抽出物に添加して、沈殿させて、１２時間〜３６時間静置して、減圧条件下でエタノールを回収することによって前記上清を濃縮して、相対密度１．３０〜１．３８（６０℃）を有する抽出物を得ることであり、
前記工程ｂ）において、工程（ａ）の最終精製物を多孔質吸収性樹脂カラム上へ適用し、前記生薬物対該多孔質吸収性樹脂の重量比が５：１〜１：１であり、該樹脂カラムを総容積の８倍〜１５倍の水で洗浄して、水溶出液を得て、塩酸を該水溶出液に添加して、そのｐＨ値を２．２〜３．５へ調整して、前記酸性溶出液を再び該多孔質吸収性樹脂上に適用し、前記生薬対該多孔質吸収性樹脂の重量比が５：１〜１：１であり、該カラムを、該溶出液がほぼ無色になるまでｐＨ値２．２〜３．５を有する塩酸で洗浄して、総容積の３倍〜８倍の５０％〜９０％エタノールを用いて、該カラムを洗浄し、該溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない抽出物を得て、前記多孔質吸収性樹脂が、ＡＢ−８、ＨＰＤ４５０、ＨＰＤ７００、Ｄ１０１、Ｄ４０２０又はＸ５からなる群から選択される多孔質吸収性樹脂の１つであり、
前記工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）において濃縮により得られる前記抽出物を、有機溶媒で溶解し、クロマトグラフィシリカゲルと混合して、十分に混合されたサンプルを、十分に充填されたシリカゲルカラム上に置き、該カラムを、９０：１０：３〜４０：１０：０．５の容積比を有するクロロホルム：メタノール：ギ酸の移動相で溶出させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）において、前記水抽出は下記の通り：
前記生薬を、該生薬の容積の４倍の水で２時間煎じて、濾過して、薬物残渣を、該薬物残渣の容積の３倍の水で１時間煎じて、濾過して、該濾液を組み合わせて、該濾液を濃縮して、相対密度１．２を有する抽出物を得ることであり、前記アルコール沈殿が下記の通り：
エタノールの含有量が７０％になるまで９５％エタノールを前記抽出物に添加して、沈殿させて、さらに２４時間静置して、減圧条件下でエタノールを回収することによって前記上清を濃縮して、相対密度１．３７を有する抽出物を得ることであり、
前記工程（ｂ）において、工程（ａ）の前記最終抽出物を多孔質吸収性樹脂カラム上に適用し、前記生薬対該多孔質吸収性樹脂の重量比が４：１であり、該樹脂カラムを総容積の１２倍の水で洗浄して、水溶出液を得て、塩酸を該水溶出液に添加して、そのｐＨ値を３．０へ調整して、該酸性溶出液を再び該多孔質吸収性樹脂カラム上に適用し、前記生薬対該多孔質吸収性樹脂の重量比が４：１であり、該カラムを、該溶出液がほぼ無色になるまでｐＨ値３．０を有する塩酸で洗浄して、総容積の４倍の９５％エタノールを用いて、該カラムを洗浄して、該溶出液を濃縮して、アルコール臭を伴わない抽出物を得て、前記多孔質吸収性樹脂がＡＢ−８であり、
前記工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）において濃縮により得られる前記抽出物を、メタノールで溶解し、２００メッシュ〜３００メッシュのクロマトグラフィシリカゲルカラムと混合して、十分に混合されたサンプルを、十分に充填された２００メッシュ〜３００メッシュのシリカゲルカラム上に置き、前記カラムを、５０：１０：２の容積比を有するクロロホルム：メタノール：ギ酸の移動相で溶出させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
アルカリ水溶液を、前記工程（ａ）における前記水抽出に使用し、該アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム及び水酸化カリウムからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ水溶液が、重炭酸ナトリウム水溶液又は水酸化ナトリウム水溶液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ水溶液が、０．３０％〜０．６８％の濃度の重炭酸ナトリウム水溶液、又は０．００２５‰〜０．００４‰の濃度の水酸化ナトリウム水溶液であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ水溶液が、０．４５％の濃度の重炭酸ナトリウム水溶液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）が、前記水抽出の前にアルコール抽出をさらに含むことを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルコール抽出が、下記の通り：
前記生薬の容積の５倍〜８倍の５０％〜９５％エタノールで２回、各回毎に１時間〜２時間煎じて、濾過して、前記エタノール抽出溶液を廃棄して、薬物残渣を水で抽出する、煎じることであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌ及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項１２】
心臓血管疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌの使用。
【請求項１３】
前記心臓血管疾患が、低酸素誘導性血管拡張機能不全、酸素欠乏、グルコース欠乏及び過酸化状態により引き起こされるｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン障害、並びに急性心筋虚血からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
フリーラジカルを捕捉する活性を有する薬剤の調製における請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌの使用。
【請求項１５】
予防的抗酸化機能の活性を有する薬剤の調製における請求項１に記載のサルビアノール酸Ｌの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５２２０２２（Ｐ２０１２−５２２０２２Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２４３７（Ｐ２０１２−５０２４３７）
【出願日】平成２２年３月２９日（２０１０．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７１３８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１９３５
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１２３７８７４）タスリー・ファーマシューティカル・グループ・カンパニー・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＳＬＹ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｔａｓｌｙ Ｍｏｄｅｒｎ ＴＣＭ Ｇａｒｄｅｎ， Ｐｕ Ｊｉｈｅ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ Ｎｏ．２， Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４１０， Ｃｈｉｎａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２９日（２０１０．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７１３８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１９３５
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１２３７８７４）タスリー・ファーマシューティカル・グループ・カンパニー・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＳＬＹ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｔａｓｌｙ Ｍｏｄｅｒｎ ＴＣＭ Ｇａｒｄｅｎ， Ｐｕ Ｊｉｈｅ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ Ｎｏ．２， Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４１０， Ｃｈｉｎａ
【Ｆターム（参考）】
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