新規ジオスメチン化合物、その製造法、およびそれを含有する薬学的組成物
【課題】新規ジオスメチン（diosmetin）化合物およびその製造法の提供。
【解決手段】式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであるか、または異なってもよく、それぞれ、水素原子、またはグルクロン酸を表す］で示される化合物。慢性静脈疾患の予防または治療に有用な医薬組成物。
【解決手段】式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであるか、または異なってもよく、それぞれ、水素原子、またはグルクロン酸を表す］で示される化合物。慢性静脈疾患の予防または治療に有用な医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なジオスメチン（diosmetin）化合物、その製造法、およびそれを含有する薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジオスメチン化合物、および静脈機能不全の処置におけるその活性は、欧州特許出願公開第０ ７０９ ３８３号公報（EP 0 709 383）に記載されている。
【０００３】
本発明の化合物は、接着分子インヒビター、ＮＡＤＰＨ酸化酵素インヒビターおよび抗血小板凝集剤である。
【０００４】
白血球接着阻害およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害という特性は、その病理学では、下肢微小循環ネットワークの白血球浸潤を伴う炎症が広範囲に記載されていることを考慮すると、慢性静脈疾患の処置に重要である［Verbeuren, T.J., Bouskela, E., Cohen, R.A. et al., Regulation of adhesion molecules: a new target for the treatment of chronic venous insufficiency, 2000, Microcirculation, 7, S41-S48］。
【０００５】
血小板凝集阻害という特性は、静脈および動脈血栓症の予防および治療だけでなく、血小板が炎症性メジエーターによって活性化されることがあるか、または血栓症後症候群の患者に見られる、慢性静脈疾患の治療においても、本発明の化合物の抗血栓作用の可能性を立証するものである。
【０００６】
慢性静脈疾患では、毛細血管／小静脈の細小血管障害の存在が立証されている。この細小血管障害は、静脈性高血圧の結果であり、毛細血管／小静脈濾過による問題（高浸透圧）、したがってまた微小浮腫による問題を生じる［Barbier et al., Microcirculation and rheology, 1994, Presse med., 23, 213-224］。無数の研究から、接着分子の循環レベルでの増加に付随する静脈性高血圧への内皮細胞の活性化の関与が示されている［Saharay, M., Shields, D.A., Georgiannos, S.N. et al., Endothelial activation in patients with chronic venous disease, 1998, Eur. J. Vasc. Surg., 15, 342-349；Verbeuren, T.J., Bouskela, E., Cohen, R.A. et al., Regulation of adhesion molecules: a new target for the treatment of chronic venous insufficiency, 2000, Microcirculation, 7, S41-S48］。本発明の化合物は、抗炎症活性ばかりでなく、抗高浸透圧活性も有する。
【０００７】
更に、慢性静脈疾患では、フリーラジカル、したがってまたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化の増大も立証されている。この酸化ストレスは、内皮細胞活性化および白血球浸潤と関連すると考えられる［Glowinski, J. & Glowinski, S., Generation of reactive oxygen metabolites by the varicose vein wall, 2002, Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., 23, 5550-555］。
【０００８】
内皮細胞の浸潤、ならびに接着分子およびＮＡＤＰＨオキシダーゼの誘導は、数多くの血管病理学で立証されている［Bedard, K. & Krause, K.H., The NOX family of ROS-generating oxidases: Physiology and pathophysiology, 2007, Physiol. Rev. 87, 245-313］。
【発明の概要】
【０００９】
上記により、本発明の化合物は、静脈疾患、特に慢性静脈疾患のそのすべての段階（疼痛、毛細血管拡張症、静脈瘤、浮腫、栄養失調、潰瘍）での予防または治療；また血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎または脳血管発作の予防もしくは治療；主として静脈性または混合性脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に用いることができる。
【００１０】
より具体的には、本発明は、式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
【００１２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであるか、または異なってもよく、それぞれ、水素原子、または式（Ａ）：
【００１３】
【化２】
【００１４】
で示される基を表す］
で示される化合物に関する。
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち少なくとも一つが基（Ａ）を表す化合物は、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、それぞれ、水素原子を表す式（Ｉａ）の化合物の代謝産物である。
【００１５】
本発明は、式（Ｉ）の化合物を製造する方法であって、式（II）：
【００１６】
【化３】
【００１７】
のジオスメチンから出発して、これを臭化メタリルと反応させて、式（III）：
【００１８】
【化４】
【００１９】
で示される化合物を得て、これを加熱して、式（Ｉ）の化合物の、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3がそれぞれ水素原子を表す特定の場合である、式（Ｉａ）：
【００２０】
【化５】
【００２１】
の化合物を得て、式（Ｉ）のその他の化合物を得るのが望ましいときは、これを、式（IV）：
【００２２】
【化６】
【００２３】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物と反応させて、基（Ａ）の酸官能基およびアルコール官能基を脱保護した後に、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち少なくとも一つがＨ以外である、式（Ｉ）の化合物を得る方法にも関する。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物が混合物として得られたときは、たとえば分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、それらを分離し得る。
【００２５】
Ｒ1およびＲ3がそれぞれ水素原子を表し、Ｒ2が式（Ａ）の基を表す、式（Ｉｂ）の化合物は、式（Ｉａ）の化合物をアセチル化して、式（Ｖ）：
【００２６】
【化７】
【００２７】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物を得て、これを式（IV）の化合物と反応させて、式（VI）：
【００２８】
【化８】
【００２９】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物を得て、その酸官能基およびアルコール官能基を脱保護して、得ることもできる。
【００３０】
本発明の化合物は、接着分子およびＮＡＤＰＨオキシダーゼインヒビター、ならびに抗血小板凝集剤である。
【００３１】
そのため、それらは、静脈疾患、特に慢性静脈疾患のそのすべての段階（疼痛、毛細血管拡張症、静脈瘤、浮腫、栄養失調、潰瘍）での予防または治療；また血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎または脳血管発作の予防もしくは治療；主として静脈もしくは混合脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に有用である。
【００３２】
本発明は、活性成分として、式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容され得る、非毒性かつ不活性の担体または賦形剤の一つもしくはそれ以上と組み合わせて含む薬学的組成物にも関するものである。
【００３３】
本発明の薬学的組成物のうち、より特別には、経口、非経口（静脈内、筋内または皮下）、経皮もしくは貫皮、経鼻、直腸、舌下、眼内、または呼吸器投与に適したもの、また特に錠剤もしくは糖衣錠、舌下錠、ハードゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏、経皮ゲル剤、注射もしくは飲用可能な製剤、エアゾル、点眼剤および点鼻剤を挙げることができる。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物に加えて、本発明の薬学的組成物は、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、吸収剤、着色料、甘味料のような賦形剤または担体の一つもしくはそれ以上を含む。
【００３５】
賦形剤または担体の例としては、
・希釈剤として：乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリセリンを、
・潤滑剤として：シリカ、タルク、ステアリン酸ならびにそのマグネシウムおよびカルシウム塩、ポリエチレングリコールを、
・結合剤として：ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、でん粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびポリビニルピロリドンを、
・崩壊剤として：寒天、アルギン酸およびそのナトリウム塩、発泡性混合物を
列挙し得る。
【００３６】
この薬学的組成物中の式（Ｉ）の活性成分の百分率は、好ましくは５〜５０重量％である。
【００３７】
有用な投与量は、患者の年齢および体重、投与経路、障害の性質および重篤度、ならびに付随するいかなる処置の投与にも応じて変化し、１回またはそれ以上の投与で１日あたり０．５〜１，０００mgの範囲にわたる。
【００３８】
下記の実施例は、本発明を例示する。実施例に記載された化合物の構造は、慣用の分光分析の手法（赤外線、核磁気共鳴、質量分析）に従って決定した。
【００３９】
略語
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＮＡＤＰＨ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元形
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
【実施例１】
【００４０】
６，８，２’−トリス（イソブタ−２−エン−１−イル）ジオスメチン
【００４１】
【化９】
【００４２】
工程Ａ：２−｛４−メトキシ−３−［（イソブタ−２−エン−１−イル）オキシ］フェニル｝−５，７−ビス［（イソブタ−２−エン−１−イル）オキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン
ジオスメチン３０gに、炭酸カリウム６９．３gおよびアセトン４５０mlを加えた。混合物を、還流にて４時間３０分加熱し、次いで環境温度に戻し；次いで臭化メタリル５４gを加えた。次いで、反応混合物を、還流にて一晩加熱し、次いで環境温度に戻し、濾過した。フィルターケーキを、アセトンで洗浄し、次いで濾液を蒸発させて、残渣を得て、これをトルエンから再結晶させて、標記化合物を得た。
【００４３】
工程Ｂ：６，８，２’−トリス（イソブタ−２−エン−１−イル）ジオスメチン
前工程で得た化合物１０gに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン１２０mlを加え、次いで、混合物を還流にて１時間加熱した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた残渣を、イソプロパノールから再結晶させて、標記化合物を得た。
融点：１４１℃
【実施例２】
【００４４】
（５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）−β−Ｄ−グルクロン酸
【００４５】
【化１０】
【００４６】
工程Ａ：５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル−２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルクロン酸メチル
標記化合物は、刊行物Synth. Commun., 1999, 29(16), 2775-2781に記載の手順に従い、相間移動触媒反応によって、実施例１の化合物（２５０mg）を式（IV）の化合物（４２９mg）と反応させることによって得た。
【００４７】
工程Ｂ：（５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）−β−Ｄ−グルクロン酸
工程Ａで得られた化合物をメタノールに溶解し、次いで水酸化ナトリウムを加えた。混合物を、１時間３０分還流させ、次いで、２Ｎ塩酸溶液で中和してから、蒸発乾固して、標記化合物を得た。
【実施例３】
【００４８】
３−［５，７−ジヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロン酸
【００４９】
【化１１】
【００５０】
工程Ａ：５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル＝アセタート
実施例１の化合物（３g）をピリジンに溶解し、次いで、環境温度で無水酢酸（０．６１ml）を加えた。次いで、反応混合物を１６時間撹拌した後、蒸発乾固した。残渣を氷冷水に溶解し、次いでジクロロメタンで抽出し、乾燥、濾過、そして蒸発させた。それによって得られた未精製生成物を、シリカゲル上で、次いで逆相分取ＨＰＬＣによって精製して、標記化合物を得た。
【００５１】
工程Ｂ：３−［７−（アセチルオキシ）−５−ヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルクロン酸メチル
前工程で得た化合物から出発して、実施例２の工程Ａの手順に従って、標記化合物を得た。
【００５２】
工程Ｃ：３−［５，７−ジヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロン酸
前工程で得た化合物から出発して、実施例２の工程Ｂの手順に従って、標記化合物を得た。
【００５３】
薬理学的研究
以下の実施例で、用語「参照化合物」は、欧州特許出願公開第０ ７０９ ３８３号公報（EP 0 709 383）の実施例６９を意味する。
【実施例４】
【００５４】
血小板凝集のin vitro阻害
麻酔したNew Zealand系ウサギの頸動脈から、血液サンプルを０．１０９Mクエン酸塩に採取した。遠心分離によって、血小板に富む血漿を得た。次いで、遠心分離によって、血小板を洗浄した。
【００５５】
洗浄した血小板を、タイロード緩衝液に再懸濁させた。この血小板懸濁液を、それぞれ同じ溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）中で希釈した実施例１の化合物（３０μM）または参照化合物（３０μM）の存在下で、セルに入れ、次いで３７℃の凝集検出計に撹拌しつつ入れた。２分後、コラーゲン（４μg/ml）を用いて凝集を生起し；次いで、応答を６分間記録した。血小板凝集を、濁度測定を用いて、すなわち、タイロードを入れたセル、および溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）を入れたセルについて、血小板懸濁液を透過する光の百分率によって定量した。
【００５６】
本発明のジオスメチン化合物、特に実施例１の化合物、および参照化合物の抗凝集効果を、血小板凝集の阻害百分率の関数として評価した（阻害百分率が高いほど、活性が高い）。実施例１の化合物（３０μM）は、３６．６±９．９％の阻害を生じたのに対し、参照化合物は、有意な効果を生じなかった（４．１±１．８％）；（Ｐ＜０．０１、参照化合物に対する実施例１の化合物、スチューデントのｔ検定、ｎ＝７）。
【００５７】
この試験は、実施例１の化合物の抗血小板凝集活性、したがってまた抗血栓作用の可能性を立証するものである。
【実施例５】
【００５８】
白血球接着のin vivo阻害
体重９０〜１１０gのハムスター３匹の３群を、この研究に用いた。麻酔３０分前に、プラセボ（１０％アラビアゴム）、実施例１の化合物（３mg/kg）または参照化合物（３mg/kg）の１回投与分をハムスターに経口的に与えた。動物は腹腔内投与により、５０mg/kgのペントバルビタールで麻酔した。ハムスターを顕微鏡下に置き、頬袋を単離し、潅流液（ＮａＣｌ：１１０．０mM、ＫＣｌ：４．７mM、ＣａＣｌ2：２．０mM、ＭｇＳＯ4：１．２mM、ＮａＨＣＯ3：１８．０mM、Ｈｅｐｅｓ：１５．３９mM、およびＨｅｐｅｓＮａ+塩：１４．６１mM）中に浸漬した［Duling, The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation, 1973, Microvasc. Res., 5: 423-429；Svensjo et al., The hamster cheek pouch preparation as a model for studies of macromolecular permeability of the microvasculature, 1978, Uppsala J. Med. Sci., 83: 71-79］。
【００５９】
頬袋への入口に取り付けたラテックス管を用いて、局所虚血を生起した。目盛り付き注射器を用いて、管の管内圧を２００〜２２０mmHgに高めた。この全閉塞を３０分間実施し、次いで、再潅流を４５分間実施した。虚血の開始直後（１００％として定義）、次いで再潅流後の異なる時間（０、１５、３０および４５分）に、後毛細血管細静脈内の内皮細胞への白血球接着を６mm2の視野内で定量した。
【００６０】
虚血再潅流によって生起される、ハムスター頬袋内の白血球接着のモデルにより、抗接着剤としての本発明のジオスメチン化合物、特に実施例１の化合物、および参照化合物の効果を確認することができる。
【００６１】
実施例１の化合物および参照化合物の活性を、虚血／再潅流後の６mm2の視野について内皮細胞に接着する白血球の数の関数として評価したが、活性が高いほど、白血球数が少なく、したがって虚血後の接着白血球の数に対する接着白血球の百分率が低い。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１：虚血後（白血球数を１００％と考える）、ならびに再潅流０、１５、３０および４５分後の、頬袋の後毛細血管細静脈内の内皮細胞に接着する白血球の数に対する、実施例１の化合物または参照化合物のハムスターへの経口投与の効果。
**：ｐ＜０．０１；***：ｐ＜０．００１、プラセボ投与に対して、二元（時間および投与）分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでボンフェローニ検定（ｎ＝３）。
【００６４】
実施例１の化合物は、虚血／再潅流後の内皮細胞に接着する白血球の数を、プラセボに比して明確かつ有意に低減することができる。実施例１の化合物の活性は、参照化合物のそれより強力であった。
【００６５】
この試験は、実施例１の化合物の白血球接着に対する阻害活性、したがってまた静脈疾患、アテローム性動脈硬化症のような動脈性血管疾患、または糖尿病に付随する血管併発症の処置の可能性を立証するものである。
【実施例６】
【００６６】
血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の発現のin vivo阻害
この研究では、アポリポタンパク質Ｅを欠くマウス（ＡｐｏＥ-/-、その大動脈に粥状班を自発的に発症する）８匹からなる４群を用いた。９週齢で、１００mg/kgのストレプトゾトシンの５日間にわたる５回の腹腔内注射によって、マウスを糖尿病にさせた。第１０週に、動物を４群、すなわち実施例１の化合物の対照群、実施例１の化合物の投与群（食餌中に１３０mg/kg／日を６週間）、参照化合物の対照群、参照化合物の投与群（食餌中に１３０mg/kg／日を６週間）に分けた。第１５週に、イソフルランを用いて麻酔した後、動物を殺処分した。大動脈を取り出し、切開し、液体窒素中で凍結した。
【００６７】
大動脈を凍結摩砕し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）なるマイクロキット（Qiagen）を用いて、総ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）IIIなる第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Invitrogen）を用い、総ＲＮＡ１μgに対して逆転写を実施した。ＶＣＡＭ−１の発現を、現時式ＰＣＲによって定量し、３種類の参照遺伝子：すなわち、β−アクチン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）について正規化した。ＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなるスーパーミックスキット(Biorad)を、ｃＤＮＡ２μl、および各プライマー１５０nMで用いた。サンプルを、９５℃で５分間変性させ、下記のプロトコルに従って、４０サイクルにわたって増幅した：９５℃で２０秒間の変性、そしてＶＣＡＭ−１、β−アクチンおよびＨＰＲＴについては５４℃、ＧＡＰＤＨについては５６℃で１分間のハイブリダイゼーションおよび伸長。非投与動物のＶＣＡＭ−１についてのしきいサイクル（それについての蛍光が、バックグラウンドノイズより有意に強いと見なされるサイクルとして定義される）を、参照遺伝子について正規化し（かつ１００％であると見なし）、そうして投与動物のそれと比較した。
【００６８】
用いた特異的プライマーは、下記のとおりである：
ＶＣＡＭ−１：５’−ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＡＣ−３’（センス）および５’−ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＴＴ Ｃ−３’（アンチセンス）；
β−アクチン：５’−ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＡＧ−３’（センス）および５’−ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＧ−３’（アンチセンス）；
ＨＰＲＴ：５’−ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＣＧ−３’（アンチセンス）；
ＧＡＰＤＨ：５’−ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＴＴ ＣＣＴ ＡＣＣ Ｃ−３’（センス）および５’−ＴＧＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＴＴ−３’（アンチセンス）。
【００６９】
ＡｐｏＥを欠くマウスに糖尿病を生起するモデルにより、本発明のジオスメチン化合物の抗接着剤としての効果を確認することができる。
【００７０】
実施例１の化合物および参照化合物の活性を、非投与動物と比較した大動脈内でのＶＣＡＭ−１発現レベルの関数として評価した（この活性が高いほど、ＶＣＡＭ−１発現レベルが低い）。実施例１の化合物を投与したマウスは、非投与マウスに比して６５．９±１０．１％のＶＣＡＭ−１発現レベルを有した（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定、ｎ＝８）のに対して、参照化合物を与えたものは、８３．０±６．６％のＶＣＡＭ−１発現レベルを有した（Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定、ｎ＝８）。
【００７１】
実施例１の化合物は、糖尿病のＡｐｏＥ-/-マウスの大動脈内でのＶＣＡＭ−１発現を、非投与群に比して明確かつ有意に低減することができる。実施例１の化合物の活性は、参照化合物のそれより強力である。
【００７２】
この試験は、接着分子の発現に対する実施例１の化合物の阻害活性、したがってまた静脈疾患の処置のための、かつ動脈の病理、たとえば糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎、および脳血管発作における、可能性を立証するものである。
【実施例７】
【００７３】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性のin vitro阻害
この研究は、ヒト内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Clonetics Co.）について実施した。２％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）およびＥＧＭ２（内皮成長培地、Clonetics Co.）で強化したＥＢＭ２培地（内皮基礎培地、Clonetics Co.）中で、細胞を培養した。
【００７４】
細胞を、溶媒（０．１％ＤＭＳＯ、実施例１の化合物の対照）、ＥＢＭ２（実施例２の化合物の対照、および実施例３の化合物の対照）、実施例１の化合物（１００μM）、実施例２の化合物（１００μM）、または実施例３の化合物（１００μM）の存在下で１５分間インキュベートし、次いでアンギオテンシンII（１μM）を３０分間用いて活性化して、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化した。細胞を、ＥＢＭ２で洗浄し、次いでＮＡＤＰＨオキシダーゼの基質（ＮＡＤＰＨ、２００μM）およびルシゲニン（lucigenin）（２５μM）を加えた。ＮＡＤＰＨオキシダーゼが生成するスーパーオキシド陰イオンによるルシゲニンの減少を、照度計を用いて定量した。対照群の毎秒カウント数（ｃｐｓ）を、投与群と比較した。対照群により得られたｃｐｓを、１００％のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性と見なした。
【００７５】
アンギオテンシンIIによって生起される内皮ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を測定するというモデルにより、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のインヒビターである薬剤としての本発明のジオスメチン化合物の効果を確認することができる。
【００７６】
実施例１、２および３の化合物の活性を、得られたｃｐｓの数の関数として評価した（この活性が高いほど、ｃｐｓの数が少ない）。
【００７７】
【表２】
【００７８】
表３：アンギオテンシンIIを用いた誘導後のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に対する、ヒト内皮細胞への実施例１、２および３の化合物の投与の効果（［化合物なしの］対照群の活性を１００％と見なす）。
***ｐ＜０．０１、実施例１の化合物の対照群、または実施例２および３の化合物の対照群に比して、スチューデントのｔ検定（ｎ＝３）
【００７９】
実施例１、２および３の化合物は、ヒト内皮細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を明確かつ有意に低下させることができる。
【００８０】
この試験は、血管ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に対する実施例１、２および３の化合物の阻害活性、したがってまた静脈疾患、ならびに動脈の病理、たとえばアテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病に付随する血管併発症、および虚血性疾患におけるフリーラジカルを阻害するための可能性を立証するものである。
【実施例８】
【００８１】
薬学的組成物
それぞれ活性成分１０mgを含有する１，０００錠を調合するための処方：
実施例１の化合物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０g
ヒドロキシプロピルセルロース．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２g
コムギデンプン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０g
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００g
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３g
タルク．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３g
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なジオスメチン（diosmetin）化合物、その製造法、およびそれを含有する薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジオスメチン化合物、および静脈機能不全の処置におけるその活性は、欧州特許出願公開第０ ７０９ ３８３号公報（EP 0 709 383）に記載されている。
【０００３】
本発明の化合物は、接着分子インヒビター、ＮＡＤＰＨ酸化酵素インヒビターおよび抗血小板凝集剤である。
【０００４】
白血球接着阻害およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害という特性は、その病理学では、下肢微小循環ネットワークの白血球浸潤を伴う炎症が広範囲に記載されていることを考慮すると、慢性静脈疾患の処置に重要である［Verbeuren, T.J., Bouskela, E., Cohen, R.A. et al., Regulation of adhesion molecules: a new target for the treatment of chronic venous insufficiency, 2000, Microcirculation, 7, S41-S48］。
【０００５】
血小板凝集阻害という特性は、静脈および動脈血栓症の予防および治療だけでなく、血小板が炎症性メジエーターによって活性化されることがあるか、または血栓症後症候群の患者に見られる、慢性静脈疾患の治療においても、本発明の化合物の抗血栓作用の可能性を立証するものである。
【０００６】
慢性静脈疾患では、毛細血管／小静脈の細小血管障害の存在が立証されている。この細小血管障害は、静脈性高血圧の結果であり、毛細血管／小静脈濾過による問題（高浸透圧）、したがってまた微小浮腫による問題を生じる［Barbier et al., Microcirculation and rheology, 1994, Presse med., 23, 213-224］。無数の研究から、接着分子の循環レベルでの増加に付随する静脈性高血圧への内皮細胞の活性化の関与が示されている［Saharay, M., Shields, D.A., Georgiannos, S.N. et al., Endothelial activation in patients with chronic venous disease, 1998, Eur. J. Vasc. Surg., 15, 342-349；Verbeuren, T.J., Bouskela, E., Cohen, R.A. et al., Regulation of adhesion molecules: a new target for the treatment of chronic venous insufficiency, 2000, Microcirculation, 7, S41-S48］。本発明の化合物は、抗炎症活性ばかりでなく、抗高浸透圧活性も有する。
【０００７】
更に、慢性静脈疾患では、フリーラジカル、したがってまたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化の増大も立証されている。この酸化ストレスは、内皮細胞活性化および白血球浸潤と関連すると考えられる［Glowinski, J. & Glowinski, S., Generation of reactive oxygen metabolites by the varicose vein wall, 2002, Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., 23, 5550-555］。
【０００８】
内皮細胞の浸潤、ならびに接着分子およびＮＡＤＰＨオキシダーゼの誘導は、数多くの血管病理学で立証されている［Bedard, K. & Krause, K.H., The NOX family of ROS-generating oxidases: Physiology and pathophysiology, 2007, Physiol. Rev. 87, 245-313］。
【発明の概要】
【０００９】
上記により、本発明の化合物は、静脈疾患、特に慢性静脈疾患のそのすべての段階（疼痛、毛細血管拡張症、静脈瘤、浮腫、栄養失調、潰瘍）での予防または治療；また血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎または脳血管発作の予防もしくは治療；主として静脈性または混合性脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に用いることができる。
【００１０】
より具体的には、本発明は、式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
【００１２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであるか、または異なってもよく、それぞれ、水素原子、または式（Ａ）：
【００１３】
【化２】
【００１４】
で示される基を表す］
で示される化合物に関する。
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち少なくとも一つが基（Ａ）を表す化合物は、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、それぞれ、水素原子を表す式（Ｉａ）の化合物の代謝産物である。
【００１５】
本発明は、式（Ｉ）の化合物を製造する方法であって、式（II）：
【００１６】
【化３】
【００１７】
のジオスメチンから出発して、これを臭化メタリルと反応させて、式（III）：
【００１８】
【化４】
【００１９】
で示される化合物を得て、これを加熱して、式（Ｉ）の化合物の、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3がそれぞれ水素原子を表す特定の場合である、式（Ｉａ）：
【００２０】
【化５】
【００２１】
の化合物を得て、式（Ｉ）のその他の化合物を得るのが望ましいときは、これを、式（IV）：
【００２２】
【化６】
【００２３】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物と反応させて、基（Ａ）の酸官能基およびアルコール官能基を脱保護した後に、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち少なくとも一つがＨ以外である、式（Ｉ）の化合物を得る方法にも関する。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物が混合物として得られたときは、たとえば分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、それらを分離し得る。
【００２５】
Ｒ1およびＲ3がそれぞれ水素原子を表し、Ｒ2が式（Ａ）の基を表す、式（Ｉｂ）の化合物は、式（Ｉａ）の化合物をアセチル化して、式（Ｖ）：
【００２６】
【化７】
【００２７】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物を得て、これを式（IV）の化合物と反応させて、式（VI）：
【００２８】
【化８】
【００２９】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物を得て、その酸官能基およびアルコール官能基を脱保護して、得ることもできる。
【００３０】
本発明の化合物は、接着分子およびＮＡＤＰＨオキシダーゼインヒビター、ならびに抗血小板凝集剤である。
【００３１】
そのため、それらは、静脈疾患、特に慢性静脈疾患のそのすべての段階（疼痛、毛細血管拡張症、静脈瘤、浮腫、栄養失調、潰瘍）での予防または治療；また血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎または脳血管発作の予防もしくは治療；主として静脈もしくは混合脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に有用である。
【００３２】
本発明は、活性成分として、式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容され得る、非毒性かつ不活性の担体または賦形剤の一つもしくはそれ以上と組み合わせて含む薬学的組成物にも関するものである。
【００３３】
本発明の薬学的組成物のうち、より特別には、経口、非経口（静脈内、筋内または皮下）、経皮もしくは貫皮、経鼻、直腸、舌下、眼内、または呼吸器投与に適したもの、また特に錠剤もしくは糖衣錠、舌下錠、ハードゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏、経皮ゲル剤、注射もしくは飲用可能な製剤、エアゾル、点眼剤および点鼻剤を挙げることができる。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物に加えて、本発明の薬学的組成物は、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、吸収剤、着色料、甘味料のような賦形剤または担体の一つもしくはそれ以上を含む。
【００３５】
賦形剤または担体の例としては、
・希釈剤として：乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリセリンを、
・潤滑剤として：シリカ、タルク、ステアリン酸ならびにそのマグネシウムおよびカルシウム塩、ポリエチレングリコールを、
・結合剤として：ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、でん粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびポリビニルピロリドンを、
・崩壊剤として：寒天、アルギン酸およびそのナトリウム塩、発泡性混合物を
列挙し得る。
【００３６】
この薬学的組成物中の式（Ｉ）の活性成分の百分率は、好ましくは５〜５０重量％である。
【００３７】
有用な投与量は、患者の年齢および体重、投与経路、障害の性質および重篤度、ならびに付随するいかなる処置の投与にも応じて変化し、１回またはそれ以上の投与で１日あたり０．５〜１，０００mgの範囲にわたる。
【００３８】
下記の実施例は、本発明を例示する。実施例に記載された化合物の構造は、慣用の分光分析の手法（赤外線、核磁気共鳴、質量分析）に従って決定した。
【００３９】
略語
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＮＡＤＰＨ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元形
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
【実施例１】
【００４０】
６，８，２’−トリス（イソブタ−２−エン−１−イル）ジオスメチン
【００４１】
【化９】
【００４２】
工程Ａ：２−｛４−メトキシ−３−［（イソブタ−２−エン−１−イル）オキシ］フェニル｝−５，７−ビス［（イソブタ−２−エン−１−イル）オキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン
ジオスメチン３０gに、炭酸カリウム６９．３gおよびアセトン４５０mlを加えた。混合物を、還流にて４時間３０分加熱し、次いで環境温度に戻し；次いで臭化メタリル５４gを加えた。次いで、反応混合物を、還流にて一晩加熱し、次いで環境温度に戻し、濾過した。フィルターケーキを、アセトンで洗浄し、次いで濾液を蒸発させて、残渣を得て、これをトルエンから再結晶させて、標記化合物を得た。
【００４３】
工程Ｂ：６，８，２’−トリス（イソブタ−２−エン−１−イル）ジオスメチン
前工程で得た化合物１０gに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン１２０mlを加え、次いで、混合物を還流にて１時間加熱した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた残渣を、イソプロパノールから再結晶させて、標記化合物を得た。
融点：１４１℃
【実施例２】
【００４４】
（５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）−β−Ｄ−グルクロン酸
【００４５】
【化１０】
【００４６】
工程Ａ：５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル−２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルクロン酸メチル
標記化合物は、刊行物Synth. Commun., 1999, 29(16), 2775-2781に記載の手順に従い、相間移動触媒反応によって、実施例１の化合物（２５０mg）を式（IV）の化合物（４２９mg）と反応させることによって得た。
【００４７】
工程Ｂ：（５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）−β−Ｄ−グルクロン酸
工程Ａで得られた化合物をメタノールに溶解し、次いで水酸化ナトリウムを加えた。混合物を、１時間３０分還流させ、次いで、２Ｎ塩酸溶液で中和してから、蒸発乾固して、標記化合物を得た。
【実施例３】
【００４８】
３−［５，７−ジヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロン酸
【００４９】
【化１１】
【００５０】
工程Ａ：５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル＝アセタート
実施例１の化合物（３g）をピリジンに溶解し、次いで、環境温度で無水酢酸（０．６１ml）を加えた。次いで、反応混合物を１６時間撹拌した後、蒸発乾固した。残渣を氷冷水に溶解し、次いでジクロロメタンで抽出し、乾燥、濾過、そして蒸発させた。それによって得られた未精製生成物を、シリカゲル上で、次いで逆相分取ＨＰＬＣによって精製して、標記化合物を得た。
【００５１】
工程Ｂ：３−［７−（アセチルオキシ）−５−ヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルクロン酸メチル
前工程で得た化合物から出発して、実施例２の工程Ａの手順に従って、標記化合物を得た。
【００５２】
工程Ｃ：３−［５，７−ジヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロン酸
前工程で得た化合物から出発して、実施例２の工程Ｂの手順に従って、標記化合物を得た。
【００５３】
薬理学的研究
以下の実施例で、用語「参照化合物」は、欧州特許出願公開第０ ７０９ ３８３号公報（EP 0 709 383）の実施例６９を意味する。
【実施例４】
【００５４】
血小板凝集のin vitro阻害
麻酔したNew Zealand系ウサギの頸動脈から、血液サンプルを０．１０９Mクエン酸塩に採取した。遠心分離によって、血小板に富む血漿を得た。次いで、遠心分離によって、血小板を洗浄した。
【００５５】
洗浄した血小板を、タイロード緩衝液に再懸濁させた。この血小板懸濁液を、それぞれ同じ溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）中で希釈した実施例１の化合物（３０μM）または参照化合物（３０μM）の存在下で、セルに入れ、次いで３７℃の凝集検出計に撹拌しつつ入れた。２分後、コラーゲン（４μg/ml）を用いて凝集を生起し；次いで、応答を６分間記録した。血小板凝集を、濁度測定を用いて、すなわち、タイロードを入れたセル、および溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）を入れたセルについて、血小板懸濁液を透過する光の百分率によって定量した。
【００５６】
本発明のジオスメチン化合物、特に実施例１の化合物、および参照化合物の抗凝集効果を、血小板凝集の阻害百分率の関数として評価した（阻害百分率が高いほど、活性が高い）。実施例１の化合物（３０μM）は、３６．６±９．９％の阻害を生じたのに対し、参照化合物は、有意な効果を生じなかった（４．１±１．８％）；（Ｐ＜０．０１、参照化合物に対する実施例１の化合物、スチューデントのｔ検定、ｎ＝７）。
【００５７】
この試験は、実施例１の化合物の抗血小板凝集活性、したがってまた抗血栓作用の可能性を立証するものである。
【実施例５】
【００５８】
白血球接着のin vivo阻害
体重９０〜１１０gのハムスター３匹の３群を、この研究に用いた。麻酔３０分前に、プラセボ（１０％アラビアゴム）、実施例１の化合物（３mg/kg）または参照化合物（３mg/kg）の１回投与分をハムスターに経口的に与えた。動物は腹腔内投与により、５０mg/kgのペントバルビタールで麻酔した。ハムスターを顕微鏡下に置き、頬袋を単離し、潅流液（ＮａＣｌ：１１０．０mM、ＫＣｌ：４．７mM、ＣａＣｌ2：２．０mM、ＭｇＳＯ4：１．２mM、ＮａＨＣＯ3：１８．０mM、Ｈｅｐｅｓ：１５．３９mM、およびＨｅｐｅｓＮａ+塩：１４．６１mM）中に浸漬した［Duling, The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation, 1973, Microvasc. Res., 5: 423-429；Svensjo et al., The hamster cheek pouch preparation as a model for studies of macromolecular permeability of the microvasculature, 1978, Uppsala J. Med. Sci., 83: 71-79］。
【００５９】
頬袋への入口に取り付けたラテックス管を用いて、局所虚血を生起した。目盛り付き注射器を用いて、管の管内圧を２００〜２２０mmHgに高めた。この全閉塞を３０分間実施し、次いで、再潅流を４５分間実施した。虚血の開始直後（１００％として定義）、次いで再潅流後の異なる時間（０、１５、３０および４５分）に、後毛細血管細静脈内の内皮細胞への白血球接着を６mm2の視野内で定量した。
【００６０】
虚血再潅流によって生起される、ハムスター頬袋内の白血球接着のモデルにより、抗接着剤としての本発明のジオスメチン化合物、特に実施例１の化合物、および参照化合物の効果を確認することができる。
【００６１】
実施例１の化合物および参照化合物の活性を、虚血／再潅流後の６mm2の視野について内皮細胞に接着する白血球の数の関数として評価したが、活性が高いほど、白血球数が少なく、したがって虚血後の接着白血球の数に対する接着白血球の百分率が低い。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１：虚血後（白血球数を１００％と考える）、ならびに再潅流０、１５、３０および４５分後の、頬袋の後毛細血管細静脈内の内皮細胞に接着する白血球の数に対する、実施例１の化合物または参照化合物のハムスターへの経口投与の効果。
**：ｐ＜０．０１；***：ｐ＜０．００１、プラセボ投与に対して、二元（時間および投与）分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでボンフェローニ検定（ｎ＝３）。
【００６４】
実施例１の化合物は、虚血／再潅流後の内皮細胞に接着する白血球の数を、プラセボに比して明確かつ有意に低減することができる。実施例１の化合物の活性は、参照化合物のそれより強力であった。
【００６５】
この試験は、実施例１の化合物の白血球接着に対する阻害活性、したがってまた静脈疾患、アテローム性動脈硬化症のような動脈性血管疾患、または糖尿病に付随する血管併発症の処置の可能性を立証するものである。
【実施例６】
【００６６】
血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の発現のin vivo阻害
この研究では、アポリポタンパク質Ｅを欠くマウス（ＡｐｏＥ-/-、その大動脈に粥状班を自発的に発症する）８匹からなる４群を用いた。９週齢で、１００mg/kgのストレプトゾトシンの５日間にわたる５回の腹腔内注射によって、マウスを糖尿病にさせた。第１０週に、動物を４群、すなわち実施例１の化合物の対照群、実施例１の化合物の投与群（食餌中に１３０mg/kg／日を６週間）、参照化合物の対照群、参照化合物の投与群（食餌中に１３０mg/kg／日を６週間）に分けた。第１５週に、イソフルランを用いて麻酔した後、動物を殺処分した。大動脈を取り出し、切開し、液体窒素中で凍結した。
【００６７】
大動脈を凍結摩砕し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）なるマイクロキット（Qiagen）を用いて、総ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）IIIなる第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Invitrogen）を用い、総ＲＮＡ１μgに対して逆転写を実施した。ＶＣＡＭ−１の発現を、現時式ＰＣＲによって定量し、３種類の参照遺伝子：すなわち、β−アクチン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）について正規化した。ＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなるスーパーミックスキット(Biorad)を、ｃＤＮＡ２μl、および各プライマー１５０nMで用いた。サンプルを、９５℃で５分間変性させ、下記のプロトコルに従って、４０サイクルにわたって増幅した：９５℃で２０秒間の変性、そしてＶＣＡＭ−１、β−アクチンおよびＨＰＲＴについては５４℃、ＧＡＰＤＨについては５６℃で１分間のハイブリダイゼーションおよび伸長。非投与動物のＶＣＡＭ−１についてのしきいサイクル（それについての蛍光が、バックグラウンドノイズより有意に強いと見なされるサイクルとして定義される）を、参照遺伝子について正規化し（かつ１００％であると見なし）、そうして投与動物のそれと比較した。
【００６８】
用いた特異的プライマーは、下記のとおりである：
ＶＣＡＭ−１：５’−ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＡＣ−３’（センス）および５’−ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＴＴ Ｃ−３’（アンチセンス）；
β−アクチン：５’−ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＡＧ−３’（センス）および５’−ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＧ−３’（アンチセンス）；
ＨＰＲＴ：５’−ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＣＧ−３’（アンチセンス）；
ＧＡＰＤＨ：５’−ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＧＴ ＧＴＴ ＣＣＴ ＡＣＣ Ｃ−３’（センス）および５’−ＴＧＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＴＴ−３’（アンチセンス）。
【００６９】
ＡｐｏＥを欠くマウスに糖尿病を生起するモデルにより、本発明のジオスメチン化合物の抗接着剤としての効果を確認することができる。
【００７０】
実施例１の化合物および参照化合物の活性を、非投与動物と比較した大動脈内でのＶＣＡＭ−１発現レベルの関数として評価した（この活性が高いほど、ＶＣＡＭ−１発現レベルが低い）。実施例１の化合物を投与したマウスは、非投与マウスに比して６５．９±１０．１％のＶＣＡＭ−１発現レベルを有した（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定、ｎ＝８）のに対して、参照化合物を与えたものは、８３．０±６．６％のＶＣＡＭ−１発現レベルを有した（Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定、ｎ＝８）。
【００７１】
実施例１の化合物は、糖尿病のＡｐｏＥ-/-マウスの大動脈内でのＶＣＡＭ−１発現を、非投与群に比して明確かつ有意に低減することができる。実施例１の化合物の活性は、参照化合物のそれより強力である。
【００７２】
この試験は、接着分子の発現に対する実施例１の化合物の阻害活性、したがってまた静脈疾患の処置のための、かつ動脈の病理、たとえば糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎、および脳血管発作における、可能性を立証するものである。
【実施例７】
【００７３】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性のin vitro阻害
この研究は、ヒト内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Clonetics Co.）について実施した。２％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）およびＥＧＭ２（内皮成長培地、Clonetics Co.）で強化したＥＢＭ２培地（内皮基礎培地、Clonetics Co.）中で、細胞を培養した。
【００７４】
細胞を、溶媒（０．１％ＤＭＳＯ、実施例１の化合物の対照）、ＥＢＭ２（実施例２の化合物の対照、および実施例３の化合物の対照）、実施例１の化合物（１００μM）、実施例２の化合物（１００μM）、または実施例３の化合物（１００μM）の存在下で１５分間インキュベートし、次いでアンギオテンシンII（１μM）を３０分間用いて活性化して、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化した。細胞を、ＥＢＭ２で洗浄し、次いでＮＡＤＰＨオキシダーゼの基質（ＮＡＤＰＨ、２００μM）およびルシゲニン（lucigenin）（２５μM）を加えた。ＮＡＤＰＨオキシダーゼが生成するスーパーオキシド陰イオンによるルシゲニンの減少を、照度計を用いて定量した。対照群の毎秒カウント数（ｃｐｓ）を、投与群と比較した。対照群により得られたｃｐｓを、１００％のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性と見なした。
【００７５】
アンギオテンシンIIによって生起される内皮ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を測定するというモデルにより、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のインヒビターである薬剤としての本発明のジオスメチン化合物の効果を確認することができる。
【００７６】
実施例１、２および３の化合物の活性を、得られたｃｐｓの数の関数として評価した（この活性が高いほど、ｃｐｓの数が少ない）。
【００７７】
【表２】
【００７８】
表３：アンギオテンシンIIを用いた誘導後のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に対する、ヒト内皮細胞への実施例１、２および３の化合物の投与の効果（［化合物なしの］対照群の活性を１００％と見なす）。
***ｐ＜０．０１、実施例１の化合物の対照群、または実施例２および３の化合物の対照群に比して、スチューデントのｔ検定（ｎ＝３）
【００７９】
実施例１、２および３の化合物は、ヒト内皮細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を明確かつ有意に低下させることができる。
【００８０】
この試験は、血管ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に対する実施例１、２および３の化合物の阻害活性、したがってまた静脈疾患、ならびに動脈の病理、たとえばアテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病に付随する血管併発症、および虚血性疾患におけるフリーラジカルを阻害するための可能性を立証するものである。
【実施例８】
【００８１】
薬学的組成物
それぞれ活性成分１０mgを含有する１，０００錠を調合するための処方：
実施例１の化合物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０g
ヒドロキシプロピルセルロース．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２g
コムギデンプン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０g
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００g
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３g
タルク．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３g
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであるか、または異なってもよく、それぞれ、水素原子、または式（Ａ）：
【化１３】
で示される基を表す］
で示される化合物。
【請求項２】
６，８，２’−トリス（イソブタ−２−エン−１−イル）ジオスメチン、
（５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）−β−Ｄ−グルクロン酸、および
３−［５，７−ジヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロン酸
から選ばれる、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
請求項１記載の式（Ｉ）の化合物を合成する方法であって、式（II）：
【化１４】
のジオスメチンから出発して、これを臭化メタリルと反応させて、式（III）：
【化１５】
で示される化合物を得て、これを加熱して、式（Ｉ）の化合物の、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、それぞれ、水素原子を表す特定の場合である、式（Ｉａ）：
【化１６】
の化合物を得て、式（Ｉ）のその他の化合物を得るのが望ましいときは、これを、式（IV）：
【化１７】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物と反応させて、請求項１に定義されたとおりの基（Ａ）の酸官能基およびアルコール官能基を脱保護した後に、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち少なくとも一つがＨ以外である、式（Ｉ）の化合物を得る方法。
【請求項４】
活性成分として、請求項１または２のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容され得る、非毒性かつ不活性の担体または賦形剤の一つもしくはそれ以上と組み合わせて含む薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の化合物の使用であって、静脈疾患の予防または治療；血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎もしくは脳血管発作の予防または治療；主として静脈もしくは混合脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に有用な医薬の製造の際の使用。
【請求項６】
請求項１または２に記載の化合物の使用であって、慢性静脈疾患の予防または治療に有用な医薬の製造における使用。
【請求項７】
静脈疾患の予防または治療；血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎もしくは脳血管発作の予防または治療；主として静脈もしくは混合脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に用いるための、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
慢性静脈疾患の予防または治療に用いるための、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであるか、または異なってもよく、それぞれ、水素原子、または式（Ａ）：
【化１３】
で示される基を表す］
で示される化合物。
【請求項２】
６，８，２’−トリス（イソブタ−２−エン−１−イル）ジオスメチン、
（５−ヒドロキシ−２−［３−ヒドロキシ−４−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル］−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）−β−Ｄ−グルクロン酸、および
３−［５，７−ジヒドロキシ−６，８−ビス（イソブタ−２−エン−１−イル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル］−６−メトキシ−２−（イソブタ−２−エン−１−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロン酸
から選ばれる、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
請求項１記載の式（Ｉ）の化合物を合成する方法であって、式（II）：
【化１４】
のジオスメチンから出発して、これを臭化メタリルと反応させて、式（III）：
【化１５】
で示される化合物を得て、これを加熱して、式（Ｉ）の化合物の、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、それぞれ、水素原子を表す特定の場合である、式（Ｉａ）：
【化１６】
の化合物を得て、式（Ｉ）のその他の化合物を得るのが望ましいときは、これを、式（IV）：
【化１７】
［式中、Ａｃはアセチル基を表す］
で示される化合物と反応させて、請求項１に定義されたとおりの基（Ａ）の酸官能基およびアルコール官能基を脱保護した後に、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち少なくとも一つがＨ以外である、式（Ｉ）の化合物を得る方法。
【請求項４】
活性成分として、請求項１または２のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容され得る、非毒性かつ不活性の担体または賦形剤の一つもしくはそれ以上と組み合わせて含む薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の化合物の使用であって、静脈疾患の予防または治療；血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎もしくは脳血管発作の予防または治療；主として静脈もしくは混合脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に有用な医薬の製造の際の使用。
【請求項６】
請求項１または２に記載の化合物の使用であって、慢性静脈疾患の予防または治療に有用な医薬の製造における使用。
【請求項７】
静脈疾患の予防または治療；血栓後症候群、糖尿病に付随する血管併発症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、炎症、肥満に付随するメタボリック症候群、肥満に付随する血管併発症、狭心症、下肢の動脈炎もしくは脳血管発作の予防または治療；主として静脈もしくは混合脚潰瘍および糖尿足を含む慢性創傷の治癒；痔核発作の治療または予防；圧力潰瘍の治療または予防；ならびに多発性硬化症の治療に用いるための、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
慢性静脈疾患の予防または治療に用いるための、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【公開番号】特開２００９−２６３３５４（Ｐ２００９−２６３３５４Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−８４０８０（Ｐ２００９−８４０８０）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５００２８７０１９）レ ラボラトワール セルヴィエ (166)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８４０８０（Ｐ２００９−８４０８０）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５００２８７０１９）レ ラボラトワール セルヴィエ (166)
【Ｆターム（参考）】
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