新規スフィンゴ糖脂質及びその製造方法
【課題】新規スフィンゴ糖脂質及びその製造方法の提供。
【解決手段】プラシノ藻綱クロロデンドロン目（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）に属する微生物が生合成する下記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質。
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
【解決手段】プラシノ藻綱クロロデンドロン目（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）に属する微生物が生合成する下記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質。
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規スフィンゴ糖脂質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ糖脂質はセラミドと呼ばれる骨格に糖鎖が付加した複合糖脂質であり、水酸基の数や不飽和結合の有無などにより、多様な構造を持つことが知られている。スフィンゴ糖脂質の構造は多様であり、糖鎖や脂肪酸の長さ、及び二重結合や水酸基の有無などの違いによりこれまでに４００種類以上が報告されている（例えば、特許文献１や特許文献２等参照）。
【０００３】
スフィンゴ糖脂質の生産は、多くの真菌類（真核の微生物）において確認されている。
例えば、植物からのスフィンゴ糖脂質の抽出量は０．０８ｍｇ／ｇ乾燥重量〜０．９４ｍｇ／ｇ乾燥重量（非特許文献１）であり、酵母の乾燥質量あたりのスフィンゴ糖脂質の抽出量は０．０３ｍｇ／ｇ乾燥重量〜０．７５ｍｇ／乾燥重量（非特許文献２）とされている。単位面積当たりの収量を考慮すると、酵母を用いた生産が有効であり、酵母は商業生産にも広く用いられている。
一方で、光合成能を持つ真核の微細藻類に由来するスフィンゴ糖脂質に関する報告例は少なく、現在、細胞内で生合成することが確認されているものは、緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、緑藻ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）、ハプト藻エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ ｈｕｘｌｅｙｉ）の３例のみである。しかし、存在は確認されているものの、生産量や構造に関しては不明である（非特許文献３、４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７４７８８号パンフレット
【特許文献２】特開平５−００９１９３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｒｅｓ. Ｔｅｃｈｎｏｌ. (２００５) ９６(９):１０８９−１０９２
【非特許文献２】Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ. Ｔｅｃｈｎｏｌ. Ｒｅｓ. (２００５) １１(２):１８４−１８６
【非特許文献３】Ｃｕｒｒ. Ｂｉｏｌ. （２００６）１６(１１):１１４７−１１５３
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ（１９８６）４６(４):６３３−６３９
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６(５９５４):８６１−８６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規スフィンゴ糖脂質を提供することを課題とする。また、新規スフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供するとともに、新規スフィンゴ糖脂質を省エネルギー及び低コストで製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、詳細な検討をおこなった結果、プラシノ藻類のうち、プラシノ藻綱クロロデンドロン目（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）に属する微生物が新規スフィンゴ糖脂質を生合成するとの知見を得た。また、プラシノ藻綱クロロデンドロン目のうち、特定の微生物がスフィンゴ糖脂質を大量に生合成するとの知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
前記の課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞ 下記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質。
【０００８】
【化１】
【０００９】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
＜２＞ 前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数７〜炭素数１３の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数２〜炭素数２４の置換又は無置換のアルキル基を表す＜１＞に記載のスフィンゴ糖脂質。
＜３＞ 前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数９の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数１０〜炭素数２２の置換又は無置換のアルキル基を表す＜１＞又は＜２＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
＜４＞ 下記式（２）又は（３）で表される＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
＜５＞ 前記一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、置換アルキル基であり、該置換アルキル基はそれぞれ独立にアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
＜６＞ 前記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を経て得られる＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
＜７＞ プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を含むスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜８＞ 前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物である＜７＞に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜９＞前記準備工程が、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程を含む＜７＞又は＜８＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１０＞ 前記分離工程が、前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程と、前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程と、を含む＜７＞から＜９＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１１＞ 前記スフィンゴ糖脂質が、＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質である＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１２＞前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＫＧ４０００１３）及びテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株（ＭＢＩＣ１１１２５株）（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１０３００３）の少なくとも一方である＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１３＞テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、新規スフィンゴ糖脂質を提供することができる。また、新規スフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供するとともに、新規スフィンゴ糖脂質を省エネルギー及び低コストで製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、新規スフィンゴ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の製造方法について詳述する。以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本明細書においては、例えば、「アルキル基」は「直鎖、分岐及び環状」のアルキル基を示す。また、本明細書における基（原子団）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１５】
本発明は、一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質に関する。
【００１６】
≪スフィンゴ糖脂質≫
本発明のスフィンゴ糖脂質は、以下に示す一般式（１）で表される。
【００１７】
【化４】
【００１８】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
【００１９】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換又は無置換のアルキル基としては、置換又は無置換の飽和アルキル基、及び置換又は無置換の不飽和アルキル基が挙げられ、これらのアルキル基中には環状構造を有していてもよい。置換又は無置換の飽和アルキル基としては、例えば、炭素数７〜１３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、２−エチルヘキシル基、２−プロピル基、２−メチルプロピル基、２−ブチル基、１，１−ジメチル基、３−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、４−メチルペンチル基等が挙げられる。炭素数９のアルキル基が好ましく、炭素数９の直鎖アルキル基がより好ましい。
【００２０】
置換又は無置換の不飽和アルキル基としては、例えば、炭素数２〜炭素数１５の不飽和アルキル基が挙げられ、エチレン基、プロペニル基、ペンタエン基、ペンタンジエニル基等が挙げられる。
アルキル基中に含まれる環状構造としては、炭素数３〜炭素数６の環状構造を挙げることができ、例えば、シクロプロパン、シクロブタン等が挙げられる。
【００２１】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換アルキル基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２２】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換又は無置換のアルキリデン基としては、例えば炭素数２〜炭素数１５のアルキリデン基等が挙げられ、具体的にはヘプチリデン基、オクチリデン基、ノニリデン基、デシリデン基、ウンデシリデン基、ドデシリデン基、トリデシリデン基等が挙げられる。なお、置換又は無置換のアルキリデン基は、二重結合を有していてもよい。
【００２３】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換アルキリデン基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２４】
一般式（１）におけるＲ２で表される置換又は無置換のアルキル基としては、置換又は無置換の飽和アルキル基、及び置換又は無置換の不飽和アルキル基が挙げられ、これらのアルキル基中には環状構造を有していてもよい。置換又は無置換の飽和アルキル基としては、例えば、炭素数２〜炭素数２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、ヘンイエイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜炭素数２２の置換又は無置換のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数１２〜炭素数２０の置換又は無置換のアルキル基が挙げられる。
【００２５】
置換又は無置換の不飽和アルキル基としては、例えば、炭素数２〜炭素数２８の不飽和アルキル基が挙げられ、エチレン基、プロペニル基、ペンタエン基、ペンタンジエニル基等が挙げられる。
アルキル基中に含まれる環状構造としては、炭素数３〜炭素数６の環状構造を挙げることができ、例えば、シクロプロパン、シクロブタン等が挙げられる。
【００２６】
また、一般式（１）におけるＲ２で表される置換アルキル基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２７】
一般式（１）におけるＲ２で表される置換又は無置換のアルキリデン基としては、例えば炭素数３〜炭素数２８のアルキリデン基等が挙げられ、具体的にはエチリデン基、プロピリデン基、ブチリデン基、ペンチリデン基、ヘキシリデン基、ヘプチリデン基、オクチリデン基、ノニリデン基、デシリデン基、ウンデシリデン基、ドデシリデン基、トリデシリデン基、テトラデシリデン基、ペンタデシリデン基、ヘキサデシリデン基、ヘプタデシリデン基、オクタデシリデン基、ノナデシリデン基、エイコシリデン基、ヘンエイコシリデン基、ドコシリデン基、トリコシリデン基、テトラコシリデン基等が挙げられる。なお、置換又は無置換のアルキリデン基は、二重結合を有していてもよい。
【００２８】
一般式（１）におけるＲ２で表される置換アルキリデン基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２９】
本発明におけるスフィンゴ糖脂質の具体例を以下に示す。但し、これらに限定されるわけではない。なお、以下の具体例中、Ｒ３は炭素数１〜炭素数６の置換又は無置換のアルキル基を表す。Ｒ４は炭素数１〜炭素数２０の置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。また、Ｒ４で示される置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基は二重結合を有していてもよい。
【００３０】
【化５】
【００３１】
【化６】
【００３２】
【化７】
【００３３】
【化８】
【００３４】
【化９】
【００３５】
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法については、特に限定されず、化学合成により合成されてもよい。この場合は、類似の構造を有する天然型セラミド又は合成セラミドを用いて、それらの構造の一部を公知の方法により置換する等して改変することにより得ることができる。
類似の構造を有するセラミドとしては、ジヒドロセラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド等とこれらの誘導体を挙げることができる。
【００３６】
また、本発明のスフィンゴ糖脂質を生物学的手法により製造してもよい。
生物学的手法によりスフィンゴ糖脂質を製造する場合には、類似するスフィンゴ糖脂質を生合成することが知られている微生物を用いて、又は当該微生物を遺伝子的に改変することにより得ることができる。
【００３７】
類似するスフィンゴ糖脂質を生合成することが知られている微生物を用いてスフィンゴ糖脂質を製造する場合や、当該微生物を遺伝子的に改変することによりスフィンゴ糖脂質を製造する場合に利用可能な微生物としては、例えば担子菌（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ等）、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｄａｍａｅａ等）、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ等）、真正細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ等）、藍藻、古細菌等が挙げられる。
また、微生物を遺伝子的に改変する方法としては、例えば相同性組換え法、cre/loxシステム等を用いた部位特異的組換え法、自然突然変異体の作製法、変異誘導剤やトランスポゾン等を用いた突然変異体の作製法、ベクター導入による形質転換体の作製法等の方法が挙げられる。また、遺伝子的改変に用いる技術としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、他の微生物を媒介した接合伝達等による遺伝子導入法、細胞に熱などの刺激を与えて遺伝子を導入するヒートショック法、自然形質変換法等が挙げられる。
また、本発明のスフィンゴ糖脂質を化学合成的手法、酵素等を用いた生化学的手法又はその組み合わせから成る手法等により製造してもよい。
【００３８】
本発明のスフィンゴ糖脂質を得る方法のうち、好ましい方法としては以下に述べる微生物を用いた製造方法が挙げられる。これらについては後述する。
【００３９】
≪スフィンゴ糖脂質の製造方法≫
本発明のスフィンゴ糖脂質は、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程とを含む製造方法により製造することができる。
【００４０】
プラシノ藻綱クロロデンドロン目は分類学上、更にクロロデンドロン科プラシノクラデュス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、シェルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）属などに分かれており、本発明のプラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物はそのいずれの属に属する微生物であってもよい。好ましくは、プラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物（以下、単に「テトラセルミス属に属する微生物」という）を挙げることができる。
【００４１】
テトラセルミス属は、テトラセルミス テトラセーレ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｔｅｔｒａｔｈｅｌｅ）、テトラセルミス アラクリス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ａｌａｃｒｉｓ）、テトラセルミス チュイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉ）、テトラセルミス コルディフォルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ）、テトラセルミス コンプラナータ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｏｍｐｌａｎａｔａ）、テトラセルミス グラシリス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、テトラセルミス レヴィス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｌｅｖｉｓ）、テトラセルミス ストリアータ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｔｒｉａｔａ）、テトラセルミス ヴェルルコーサ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）等の種に分類されており、本発明のテトラセルミス属に属する微生物としては、そのいずれであってもよい。
【００４２】
また、本発明のスフィンゴ糖脂質の生産量の観点から、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＫＧ４０００１３）及びテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株（ＭＢＩＣ１１１２５株）（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１０３００３）の少なくとも一方であることが好ましく、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株であることが特に好ましい。
テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株は、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、２０１１年４月５日付で寄託されている（受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）。
【００４３】
＜準備工程＞
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法は、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程を含む。
プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程としては、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程、前記培養工程により得られた細胞を破砕する工程、前記培養工程により得られた細胞を凍結もしくは冷蔵するなどにより保存する工程、前記培養工程により得られた細胞を乾燥する乾燥工程、前記乾燥工程により得られた細胞を破砕する破砕工程、前記破砕工程により破砕した細胞を凍結もしくは冷蔵することにより保存する工程等の工程を含んでいてもよく、これらの工程を適宜組み合わせてもよい。
【００４４】
前記準備工程としては、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程を含んでいてもよい。培養は、海洋性微細藻類の培養に通常用いられる培地及び培養条件をそのまま用いればよい。
培養に用いられる培地としては、天然海水に藻類の生育に必要な栄養源を添加する栄養塩添加培地と、天然海水を模して合成された人工海水に藻類の生育に必要な栄養塩を添加する完全合成培地のいずれであってもよい。
【００４５】
炭素源としては、主として二酸化炭素を用いることができ、通常は空気を培地へ通気すればよい。生育に必要な栄養塩又は補助的な栄養塩としては、硝酸ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化鉄、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化銅、硫酸銅、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、塩化マンガン、硫酸マンガン等の無機塩が挙げられる。
また、その他の炭素源又は窒素源として種々の添加成分を含むものであってもよい。このような、追加の炭素源としては、例えば、炭酸カルシウム、グルコース、フルクトース、サッカロース、デンプン、グリセリン、リンゴ酸、乳酸、酢酸等を挙げることができ、窒素源としては、酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等を挙げることができる。この他、ビタミン、ミネラル、キレートマンガン（ＥＤＴＡ−Ｍｎ）、キレート鉄（ＥＤＴＡ−Ｆｅ）、アスコルビン酸、チオグリコール酸、システイン等を添加してもよい。
【００４６】
海洋藻類培養のための栄養塩添加培地としては、Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ培地、ＥＳ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、Ｋ培地、ＭＮ培地や各々の派生培地を挙げることができ、完全合成培地としては、ＡＳＰ培地、ＡＫ培地、ＩＭＫ培地及び各々の派生培地を挙げることができる。
特に、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物をより良好に培養するためには、ＩＭＫ培地（日本製薬株式会社製）、ｆ／２培地（Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｒ.Ｒ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., １９６２ ）、ＢＧ１１（Ｒｉｐｐｋａ Ｒ. ｅｔ ａｌ., １９７２）等が好適である。
培地は調製後、ｐＨを６．５〜８．０の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により殺菌して培養に用いる。
培養は、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃にて、６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ−７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色灯照射下、１日間〜１４日間、通気撹拌培養、振とう培養、あるいは静置培養で行えばよい。
【００４７】
前記準備工程としては、前記培養工程により得られた細胞を乾燥する乾燥工程を含んでいてもよい。乾燥工程としては、凍結乾燥、真空乾燥、加熱乾燥、自然乾燥、臨界点乾燥等の方法が挙げられ、好ましくは凍結乾燥による方法が挙げられる。
【００４８】
前記準備工程としては、前記乾燥工程により得られた細胞を破砕する破砕工程を含んでいてもよい。破砕工程としては、乳鉢やホモジナイザー等を用いて細胞を物理的に破砕する方法、超音波発生装置等から発せられる電磁波を用いた破砕方法、フレンチプレスやオートクレーブ等を用いた加圧による破砕方法等の方法が挙げられ、これらの方法を適宜組み合わせてもよい。
【００４９】
＜分離工程＞
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法は、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程を含む。
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法において、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程としては、細胞構成成分を分離することができればよく、公知の方法を用いることができ、前記準備工程と一体的に行ってもよい。
また、分離工程としては、前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程と、前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程と、スフィンゴ糖脂質濃縮工程等の工程を含んでいてもよく、これらの工程を適宜組み合わせてもよい。
【００５０】
前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程で用いられる方法は、生体材料から脂質を分離するために一般に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法やＦｏｌｃｈ法等、あるいはこれらを組み合わせた方法等が用いられ、好ましくはＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法を用いた方法が挙げられる。
【００５１】
また、弱アルカリ分解処理を組み合わせることにより、スフィンゴ脂質成分を高純度で分離することができる。
弱アルカリ分解処理としては０．０１Ｎ〜０．５Ｎの水酸化カリウムあるいは水酸化ナトリウムを脂質約１ｍｇ〜１００ｍｇにつき０．１ｍｌ〜１０ｍｌ加え、超音波洗浄器を用いて１〜１０分間超音波によりホモジナイズしたのち、３０℃〜５０℃で３０分間〜２時間インキュベートする方法等が挙げられる。
【００５２】
前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程で用いられる方法は、一般に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、クロマトグラフィー、溶媒分画、透析、密度勾配遠心、蒸留、超遠心等が挙げられる。
クロマトグラフィーを用いてスフィンゴ糖脂質を分離する方法としては、ケイ酸カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等公知の方法を使用することができ、これらの方法を適宜組み合わせることができる。さらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置等と組み合わせることにより、より効率的に分離を行うことができる。
【００５３】
このようにして得られた新規スフィンゴ糖脂質は、医薬品、化粧料又は食品等の原料として有用である。
また、本発明によれば光合成微生物であるプラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を用いることにより、従来の酵母や細菌に比べて、省エネルギー及び低コストでスフィンゴ糖脂質を製造することが可能となる。
さらに、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物のなかでもプラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物が好ましく、中でもテトラセルミス属 ＮＫＧ４０００１３株やテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株がより好ましく、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株が最も好ましい。テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株を利用することにより、省エネルギー及び低コストで、大量のスフィンゴ糖脂質を製造することが可能となる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」、「％」は質量基準である。
【００５５】
＜実施例１＞
−培養−
ＩＭＫ液体培地（日本製薬株式会社製）４０ｍＬを添加した１００ｍＬの綿栓付き三角フラスコに、Ｔｒｉｇｇ Ｉｓｌａｎｄ, Ｐｅｒｔｈ市近郊, Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ州, Ａｕｓｔｒａｌｉａより採取単離されたテトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）に由来する微生物を入れて、６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ−７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色灯照射下、室温（２５℃）にて前培養を行った。
この培養液全量を、５００ｍＬの上記液体培地の入った扁平フラスコに加え、上記と同一の白色灯照射下(６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ−７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ)、室温（２５℃）にて通気培養を行った。
空気の流速は５００ｍＬ／ｍｉｎに設定し、７日間〜１４日間培養を行った。
【００５６】
−スフィンゴ糖脂質の分離−
培養後、培養後の藻体を遠心回収(１，０００×ｇ,５分)した後、常法により凍結乾燥を行い、乾燥藻体を調製した。
乾燥藻体２ｇを乳鉢内で破砕し、４０ｍＬのクロロホルム-メタノール(１:１)に懸濁した。同試料に４０ｍＬのＫＯＨ-メタノール溶液(０．８Ｍ)を加え、超音波洗浄機(Ｗ-１７０-ＳＴ, ＨＯＮＤＡ社製)を用いて５分間超音波によりホモジナイズしたのち、ウォーターバスを用いて４２℃、３０分間インキュベートした。
その後クロロホルム１００ｍＬと水４８ｍＬを加え、１,０００×ｇで３分間遠心した後、有機相を分取、乾燥することで脂質成分を乾固し、１０ｍＬのクロロホルム-メタノール(２:１, ｖ／ｖ)に再溶解することで脂質成分を分離した。さらに、この操作を８回繰り返し、乾燥藻体１６ｇから脂質成分を分離した。
【００５７】
酸性脂質とクロロフィル色素の除去を目的として、上記で得た脂質成分１０ｍＬを、イオン交換クロマトグラフィーで分離した。
充填剤はジエチルアミノエチル基が修飾されたデキストランゲル(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｄｅｘ, ＧＥヘルスケア社製)５ｇとし、カラム(２ｘ３０ｃｍ)に充填した。その後２０ｍＬのクロロホルム-メタノール-水 (５:１０:１, ｖ／ｖ／ｖ)を流すことでカラムを平衡化した。サンプルを吸着させた後、同溶媒７０ｍＬを２ｍＬ／ｍｉｎで流し、溶出液を５ｍＬずつ分取した。これをフラクションごとにＴＬＣで分析し、オルシノール−硫酸試薬による染色により、スフィンゴ糖脂質の溶出の確認を行った。その結果、分取開始から約３０ｍＬの溶出液中でスフィンゴ糖脂質の存在が確認された。
なお、ＴＬＣによるスフィンゴ糖脂質の溶出の確認の際には、スフィンゴ糖脂質標品として、大豆由来グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社製）を用いた。ＴＬＣ分析においてスフィンゴ糖脂質標品と移動度（Ｒｆ値）が近く、オルシノール−硫酸試薬により染色されたスポットをスフィンゴ糖脂質として判定した。
【００５８】
次にスフィンゴ糖脂質の分離を目的として、上記で得られたスフィンゴ糖脂質を含む溶出液を１０ｍＬに濃縮し、ケイ酸カラムクロマトグラフィーで分離した。
充填剤はＩａｔｒｏｂｅａｄｓ (６ＲＳ−８０６０,三菱ヤトロン社製) ５０ｇとし７０℃で一時間加熱して活性化した後、クロロホルム１００ｍＬに湿潤させ、２ｘ５０ｃｍのカラムに充填した。その後クロロホルム５００ｍＬを流して平衡化を行い、サンプルを投入した。溶媒はクロロホルム２００ｍＬ、クロロホルム-アセトン(９:１)２００ｍＬ、同(８:２)１００ｍＬ、同(７:３)２００ｍＬ、同(４:６)１００ｍＬ、同(２:８)２００ ｍＬ、アセトン２００ｍＬを順次投入した(Ａｎｄｏ Ｓ. ｅｔ ａｌ., １９７６; Ｍｏｍｉ Ｔ. ｅｔ ａｌ., １９７６)。フラクションの分取は、クロロホルム-アセトン(４:６)の溶液を投入後に開始し、１０ｍＬずつ分取した。分取したフラクションをＴＬＣで分析することで、オルシノール−硫酸試薬染色により、スフィンゴ糖脂質画分を確認した。
その結果、画分番号３０以降よりスフィンゴ糖脂質の溶出が観察され、カロテノイドやステロール配糖体からの分離が観察された。
【００５９】
得られたスフィンゴ糖脂質画分からのスフィンゴ糖脂質の分離を目的として、逆相ＨＰＬＣ (Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５, Ｗａｔｅｒｓ)を用いた分離を行った。カラムには４．６×１５０ｍｍのＣ１８カラム(Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ２, Ｗａｔｅｒｓ)、移動相にはメタノールを用いた。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、２種類のスフィンゴ糖脂質の画分をそれぞれ回収した。
溶出時間は、ＥＳＩ−ＩＴ ＭＳを検出器として用いることで確認し、それぞれの溶出時間は１１分、１８分であり、この保持時間に合わせて分取を行い、ＴＬＣで分析したところ、スフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２の分離が確認された。
【００６０】
−スフィンゴ糖脂質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析−
スフィンゴ糖脂質標品と、上記に従い抽出したスフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２とを、約２００ｎｇ／μＬの濃度となるようそれぞれメタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置(ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ, Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製)を用いてマススペクトルを測定した。
マトリクスには水-アセトニトリル(１:１, ｖ／ｖ)に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸(２, ５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ)を用いた(Ｉｒｉｋｏ Ｈ., ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｌｏｃｈｎｉｔ Ｇ. ｅｔ ａｌ., １９９７)。イオン源には窒素レーザー(波長３３７．１ｎｍ)を用い、加速電圧は２０ｋＶ、測定モードは正イオンモードに設定して測定を行い、以下のような結果を得た。
【００６１】
すなわち、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによりスフィンゴ糖脂質標品のマススペクトルを測定した結果、ｍ／ｚ ７３６．５にベースピークが観察された。このスフィンゴ糖脂質標品の分子式（Ｃ４０Ｈ７５Ｎ１Ｏ９）から算出したモノアイソトピック質量が７１３．５であることから、このピークはナトリウムイオン（質量２３）が付加した［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに由来すると考えられた。
したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いてスフィンゴ糖脂質を分析することで［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンが観察され、ｍ／ｚ値からナトリウムイオンの質量を減算することで、スフィンゴ糖脂質の質量と分子式を求められることが示された。
次にスフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２のマススペクトルを測定したところ、それぞれｍ／ｚ７３４．５と、８４６．６にベースピークが観察され、これらはどちらも［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに由来すると考えられた。よってＧＴ１、ＧＴ２のモノアイソトピック質量は７１１．５と８２３．６であり、分子式はＣ４０Ｈ７３Ｎ１Ｏ９と、Ｃ４８Ｈ８９Ｎ１Ｏ９であると考えられた。
【００６２】
−スフィンゴ糖脂質のＮＭＲ分析−
スフィンゴ糖脂質標品を濃度が５ｍｇ／６００μＬとなるように、重メタノール(０．２５%ＴＭＳ含有)に溶解し、ＮＭＲ分析用の分析管に移した。同サンプルを、５００ＭＨｚのＦＴ−ＮＭＲ装置(ＥＣＡ５００, ＪＥＯＬ社製)により、１Ｈ及びＨＨ−ＣＯＳＹのスペクトルを測定した。積算回数は、１Ｈで４回、ＨＨ−ＣＯＳＹで１回とし、シム調製とロックは自動最適化モードに設定して分析を行った。また、ＧＴ１及びＧＴ２を濃度が約５−１ｍｇ／６００μＬとなるように、重メタノール(０．２５%ＴＭＳ含有)に溶解し、ＮＭＲ分析用の分析管に移した。同サンプルを、５００ＭＨｚのＦＴ−ＮＭＲ装置(ＥＣＡ５００, ＪＥＯＬ)により、１Ｈ及びＨＨ−ＣＯＳＹのスペクトルを測定した。
積算回数は、１Ｈで１６回、適化モードにＨＨ−ＣＯＳＹで１回とし、シム調製とロックは自動最設定して分析を行った。
【００６３】
スフィンゴ糖脂質標品の１Ｈのスペクトルを測定した結果、０．９０ｐｐｍ〜８．００ｐｐｍにピークが観察された。
０．９０ｐｐｍのｔｒｉｐｌｅｔのピークは、スフィンゴイド鎖と脂肪酸鎖のアシル基末端のＣＨ３由来であると考えられた。よってこのピーク面積を６．０とし、他の全てのピーク面積を算出した。
５．００ｐｐｍ〜６．００ｐｐｍに２つのピークが見られ、それぞれの面積が約１であったため、これらは二重結合しているＣＨ由来のピークであると考えられた。
次にＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルを測定した結果、相関ピークが観察された。これにより一次元のスペクトルからは帰属できなかったグルコース由来のピークが全て帰属され、アノマー水素のピークが４．２５ｐｐｍに検出されたことから糖の結合様式がβ−グリコシド結合であることを判断できた。また、スフィンゴイド塩基における二重結合炭素が、水酸基の結合している炭素と隣接していることを判断できた。
以上より、ＮＭＲによってスフィンゴ糖脂質の糖の結合様式や二重結合の位置を決定できることが示唆された。
次に、ＮＫＧ４０００１３株より分離されたスフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した結果、単糖のアノマー水素のピークが４．２５ｐｐｍに検出されたため、β−グルコースの結合が示された。さらにＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルを測定した結果、脂肪酸鎖におけるα水素のピーク（４．４０ｐｐｍ）と不飽和結合由来の水素のピーク（５．８２ｐｐｍ）の間に交差ピークが見られたため、脂肪酸鎖のα炭素における水酸基の付加、およびβ−γ炭素間の不飽和結合が示された。
【００６４】
−スフィンゴ糖脂質のＧＣ／ＭＳ分析−
脂肪酸鎖の組成が異なるスフィンゴ糖脂質標品４種類(Ｃ１６:０、２ｈ Ｃ１６:０、Ｃ２４:０、Ｃ２４:１, Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ) (Ｔａｂｌｅ ４)をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようクロロホルム-メタノール(２:１, ｖ／ｖ)に溶解した。これらをそれぞれ２ＭのＨＣｌ-メタノール溶液 １ｍＬに４０ μＬ加え、９０℃で２０時間加熱することでＭｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓを行った(Ｉｔｏｎｏｔｉ Ｓ. ｅｔ ａｌ., ２００８)。その後１ ＭのＮａＯＨ水溶液 １ ｍＬを加えて反応を停止し、２ ｍＬのヘキサンを添加して１分間混合した。混合後、上層のヘキサンを分取してＧＣ／ＭＳ分析用サンプルとした。また２−ｈｙｄｒｏｘｙ Ｃ１６:０のスフィンゴ糖脂質については、さらに等量のＮ,Ｏ−Ｂｉｓ (ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ) ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ (ＢＳＴＦＡ)を添加し、７０℃で１時間インキュベートすることで水酸基をトリメチルシリル化した(Ｚａｕｎｅｒ Ｓ. ｅｔ ａｌ., ２００８)。同試料をＧＣ／ＭＳ (ＧＣＭＳ ＱＰ−２０１０, Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製)により分析した。カラムはフェニルニルメチルで修飾したシリカカラム(ＨｉＣａｐ ＣＢＰ５, Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製)を用いた。カラムオーブンの温度は、サンプルを注入した直後から８０℃で２分間維持した後、１７０℃まで２０℃／ｍｉｎで昇温、１７０℃から２４０℃まで４℃／ｍｉｎで昇温し、２４０℃で２０分間維持した。ＭＳによる検出はサンプル注入の１０分後から開始し、４５分間測定した。また、ＧＴ１、ＧＴ２をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようクロロホルム-メタノール(２:１, ｖ／ｖ)に溶解した後、スフィンゴ糖脂質標品と同様の操作によりＭｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓし、ＧＣ／ＭＳにより分析した。
【００６５】
その結果、それぞれ保持時間１７．０ｍｉｎと３８．５ｍｉｎに単一のピークが検出された。またそれらのマススペクトルを解析したところ、α炭素に水酸基の付加したＣ１６：１、Ｃ：２４：１の脂肪酸に由来する脂肪酸メチスエステルのピークであると考えられた。よってＴＧ１、ＴＧ２のセラミド部位におけるこれらの脂肪酸の存在が示唆された。
以上より、ＧＴ１（下記式（２））とＧＴ２（下記式（３））はそれぞれＧｌｃ−ｄ１８：２／２−ｈｙｄｒｏｘｙ １６：１Δ３、Ｇｌｃ−ｄ１８：２／２−ｈｙｄｒｏｘｙ ２４：１Δ３という下記構造をもつグルコシルセラミドであると考えられた。
【００６６】
【化１０】
【００６７】
【化１１】
【００６８】
−テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株由来のスフィンゴ糖脂質の含有量測定−
ＮＫＧ４０００１３株の乾燥藻体５０ｍｇを１ｍＬのクロロホルム-メタノール(１:１)に懸濁し、内部標準としてスフィンゴ糖脂質標品２０μｇを加えた後、上述のスフィンゴ糖脂質の分離と同様の操作で細胞から脂質を抽出した。
有機相を分取後、残った水相に再度クロロホルム ２ｍＬを加えてホモジナイズし、有機相を分取した。分取した有機相を集め、メタノールを加えて２０ｍＬに調整した。
調整したサンプル１μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ(４０００ ＱＴＲＡＰ, ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製)により分析し、ＮＫＧ４０００１３株抽出したＧＴ１、ＧＴ２を定量した。
【００６９】
カラムには２．０×５０ｍｍのＣ１８逆相カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ ３ μｍ, ＴＯＳＯＨ社製）、移動相Ａには５ｍＭギ酸アンモニウムを含むメタノール-水-ギ酸(５８:４８:１)、移動相Ｂには５ｍＭギ酸アンモニウムを含むメタノール-ギ酸(９９:１)を用いた。
移動相の割合は、移動相Ｂを４０％で１分間保持した後、３．６分間かけて１００％に上げ、１００％のまま１０．６分間保持して溶出した (Ｓｈａｎｅｒ ＲＬ. ｅｔ ａｌ., ２００９)。流速は０．２ ｍＬ／ｍｉｎに設定した。検出は最適化されたＭｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇモードで行った。
スフィンゴ糖脂質の細胞内含有量は、濃度を調整したスフィンゴ糖脂質標品(０, ０．１, ０．２５, ０．５, １, ２ ｐｐｍ)を用いて作成した検量線により算出した。
【００７０】
その結果、乾燥藻体１ｇあたりのＧＴ１及びＧＴ２の含有量は、それぞれ０．５４±０．０５ ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ、０．１３±０．０１ ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌであった。
【００７１】
＜実施例２＞
−テトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株を用いて製造したスフィンゴ糖脂質の分析−
ＮＫＧ４０００１３株と同属であるＮＢＲＣ１０３００３株を、実施例１に記載の方法に従い培養し、実施例１に記載の方法に従いスフィンゴ糖脂質を分離し、スフィンゴ糖脂質の分析を行った。
ＮＢＲＣ１０３００３株はＮＩＴＥより提供され、ＩＭＫを培地として培養を行った。
【００７２】
まず、ＴＬＣを用いて分析を行った。その結果、ＮＫＧ４０００１３株におけるステリルグリコシド及びＧＴ２と同じ位置に、糖脂質のスポット（ＳＴ、ＧＴｓ）が観察された。
次にこれら２種類の糖脂質を回収し、ＥＳＩ−ＩＴ ＭＳによりマススペクトルを測定した。その結果、ＳＴからはスフィンゴ糖脂質に相当するピークは観察されなかったが、ＧＴｓからはＧＴ１、ＧＴ２と同じくｍ／ｚ７４７、８５９にピークが観察された。
さらにこれらのイオンについてＭＳ２、ＭＳ３スペクトルを測定したところ、どちらもＧＴ１（上記一般式（２））、ＧＴ２（上記一般式（３））と同じフラグメントイオンが観察された。
したがってＮＢＲＣ１０３００３株もスフィンゴ糖脂質（ＧＴ１とＧＴ２）を合成することが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規スフィンゴ糖脂質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ糖脂質はセラミドと呼ばれる骨格に糖鎖が付加した複合糖脂質であり、水酸基の数や不飽和結合の有無などにより、多様な構造を持つことが知られている。スフィンゴ糖脂質の構造は多様であり、糖鎖や脂肪酸の長さ、及び二重結合や水酸基の有無などの違いによりこれまでに４００種類以上が報告されている（例えば、特許文献１や特許文献２等参照）。
【０００３】
スフィンゴ糖脂質の生産は、多くの真菌類（真核の微生物）において確認されている。
例えば、植物からのスフィンゴ糖脂質の抽出量は０．０８ｍｇ／ｇ乾燥重量〜０．９４ｍｇ／ｇ乾燥重量（非特許文献１）であり、酵母の乾燥質量あたりのスフィンゴ糖脂質の抽出量は０．０３ｍｇ／ｇ乾燥重量〜０．７５ｍｇ／乾燥重量（非特許文献２）とされている。単位面積当たりの収量を考慮すると、酵母を用いた生産が有効であり、酵母は商業生産にも広く用いられている。
一方で、光合成能を持つ真核の微細藻類に由来するスフィンゴ糖脂質に関する報告例は少なく、現在、細胞内で生合成することが確認されているものは、緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、緑藻ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）、ハプト藻エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ ｈｕｘｌｅｙｉ）の３例のみである。しかし、存在は確認されているものの、生産量や構造に関しては不明である（非特許文献３、４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７４７８８号パンフレット
【特許文献２】特開平５−００９１９３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｒｅｓ. Ｔｅｃｈｎｏｌ. (２００５) ９６(９):１０８９−１０９２
【非特許文献２】Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ. Ｔｅｃｈｎｏｌ. Ｒｅｓ. (２００５) １１(２):１８４−１８６
【非特許文献３】Ｃｕｒｒ. Ｂｉｏｌ. （２００６）１６(１１):１１４７−１１５３
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ（１９８６）４６(４):６３３−６３９
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６(５９５４):８６１−８６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規スフィンゴ糖脂質を提供することを課題とする。また、新規スフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供するとともに、新規スフィンゴ糖脂質を省エネルギー及び低コストで製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、詳細な検討をおこなった結果、プラシノ藻類のうち、プラシノ藻綱クロロデンドロン目（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）に属する微生物が新規スフィンゴ糖脂質を生合成するとの知見を得た。また、プラシノ藻綱クロロデンドロン目のうち、特定の微生物がスフィンゴ糖脂質を大量に生合成するとの知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
前記の課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞ 下記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質。
【０００８】
【化１】
【０００９】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
＜２＞ 前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数７〜炭素数１３の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数２〜炭素数２４の置換又は無置換のアルキル基を表す＜１＞に記載のスフィンゴ糖脂質。
＜３＞ 前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数９の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数１０〜炭素数２２の置換又は無置換のアルキル基を表す＜１＞又は＜２＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
＜４＞ 下記式（２）又は（３）で表される＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
＜５＞ 前記一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、置換アルキル基であり、該置換アルキル基はそれぞれ独立にアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
＜６＞ 前記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を経て得られる＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
＜７＞ プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を含むスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜８＞ 前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物である＜７＞に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜９＞前記準備工程が、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程を含む＜７＞又は＜８＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１０＞ 前記分離工程が、前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程と、前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程と、を含む＜７＞から＜９＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１１＞ 前記スフィンゴ糖脂質が、＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質である＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１２＞前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＫＧ４０００１３）及びテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株（ＭＢＩＣ１１１２５株）（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１０３００３）の少なくとも一方である＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜１３＞テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、新規スフィンゴ糖脂質を提供することができる。また、新規スフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供するとともに、新規スフィンゴ糖脂質を省エネルギー及び低コストで製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、新規スフィンゴ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の製造方法について詳述する。以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本明細書においては、例えば、「アルキル基」は「直鎖、分岐及び環状」のアルキル基を示す。また、本明細書における基（原子団）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１５】
本発明は、一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質に関する。
【００１６】
≪スフィンゴ糖脂質≫
本発明のスフィンゴ糖脂質は、以下に示す一般式（１）で表される。
【００１７】
【化４】
【００１８】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
【００１９】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換又は無置換のアルキル基としては、置換又は無置換の飽和アルキル基、及び置換又は無置換の不飽和アルキル基が挙げられ、これらのアルキル基中には環状構造を有していてもよい。置換又は無置換の飽和アルキル基としては、例えば、炭素数７〜１３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、２−エチルヘキシル基、２−プロピル基、２−メチルプロピル基、２−ブチル基、１，１−ジメチル基、３−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、４−メチルペンチル基等が挙げられる。炭素数９のアルキル基が好ましく、炭素数９の直鎖アルキル基がより好ましい。
【００２０】
置換又は無置換の不飽和アルキル基としては、例えば、炭素数２〜炭素数１５の不飽和アルキル基が挙げられ、エチレン基、プロペニル基、ペンタエン基、ペンタンジエニル基等が挙げられる。
アルキル基中に含まれる環状構造としては、炭素数３〜炭素数６の環状構造を挙げることができ、例えば、シクロプロパン、シクロブタン等が挙げられる。
【００２１】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換アルキル基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２２】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換又は無置換のアルキリデン基としては、例えば炭素数２〜炭素数１５のアルキリデン基等が挙げられ、具体的にはヘプチリデン基、オクチリデン基、ノニリデン基、デシリデン基、ウンデシリデン基、ドデシリデン基、トリデシリデン基等が挙げられる。なお、置換又は無置換のアルキリデン基は、二重結合を有していてもよい。
【００２３】
一般式（１）におけるＲ１で表される置換アルキリデン基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２４】
一般式（１）におけるＲ２で表される置換又は無置換のアルキル基としては、置換又は無置換の飽和アルキル基、及び置換又は無置換の不飽和アルキル基が挙げられ、これらのアルキル基中には環状構造を有していてもよい。置換又は無置換の飽和アルキル基としては、例えば、炭素数２〜炭素数２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、ヘンイエイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜炭素数２２の置換又は無置換のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数１２〜炭素数２０の置換又は無置換のアルキル基が挙げられる。
【００２５】
置換又は無置換の不飽和アルキル基としては、例えば、炭素数２〜炭素数２８の不飽和アルキル基が挙げられ、エチレン基、プロペニル基、ペンタエン基、ペンタンジエニル基等が挙げられる。
アルキル基中に含まれる環状構造としては、炭素数３〜炭素数６の環状構造を挙げることができ、例えば、シクロプロパン、シクロブタン等が挙げられる。
【００２６】
また、一般式（１）におけるＲ２で表される置換アルキル基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２７】
一般式（１）におけるＲ２で表される置換又は無置換のアルキリデン基としては、例えば炭素数３〜炭素数２８のアルキリデン基等が挙げられ、具体的にはエチリデン基、プロピリデン基、ブチリデン基、ペンチリデン基、ヘキシリデン基、ヘプチリデン基、オクチリデン基、ノニリデン基、デシリデン基、ウンデシリデン基、ドデシリデン基、トリデシリデン基、テトラデシリデン基、ペンタデシリデン基、ヘキサデシリデン基、ヘプタデシリデン基、オクタデシリデン基、ノナデシリデン基、エイコシリデン基、ヘンエイコシリデン基、ドコシリデン基、トリコシリデン基、テトラコシリデン基等が挙げられる。なお、置換又は無置換のアルキリデン基は、二重結合を有していてもよい。
【００２８】
一般式（１）におけるＲ２で表される置換アルキリデン基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する。
置換基としてのアルキル基の例には、炭素数１〜炭素数６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基が挙げられる。
置換基としてのアルコキシ基の例には、炭素数１〜炭素数６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基が挙げられる。
置換基としてのアシル基の例には、炭素数１〜炭素数６のアシル基が挙げられ、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基が挙げられる。
【００２９】
本発明におけるスフィンゴ糖脂質の具体例を以下に示す。但し、これらに限定されるわけではない。なお、以下の具体例中、Ｒ３は炭素数１〜炭素数６の置換又は無置換のアルキル基を表す。Ｒ４は炭素数１〜炭素数２０の置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。また、Ｒ４で示される置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基は二重結合を有していてもよい。
【００３０】
【化５】
【００３１】
【化６】
【００３２】
【化７】
【００３３】
【化８】
【００３４】
【化９】
【００３５】
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法については、特に限定されず、化学合成により合成されてもよい。この場合は、類似の構造を有する天然型セラミド又は合成セラミドを用いて、それらの構造の一部を公知の方法により置換する等して改変することにより得ることができる。
類似の構造を有するセラミドとしては、ジヒドロセラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド等とこれらの誘導体を挙げることができる。
【００３６】
また、本発明のスフィンゴ糖脂質を生物学的手法により製造してもよい。
生物学的手法によりスフィンゴ糖脂質を製造する場合には、類似するスフィンゴ糖脂質を生合成することが知られている微生物を用いて、又は当該微生物を遺伝子的に改変することにより得ることができる。
【００３７】
類似するスフィンゴ糖脂質を生合成することが知られている微生物を用いてスフィンゴ糖脂質を製造する場合や、当該微生物を遺伝子的に改変することによりスフィンゴ糖脂質を製造する場合に利用可能な微生物としては、例えば担子菌（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ等）、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｄａｍａｅａ等）、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ等）、真正細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ等）、藍藻、古細菌等が挙げられる。
また、微生物を遺伝子的に改変する方法としては、例えば相同性組換え法、cre/loxシステム等を用いた部位特異的組換え法、自然突然変異体の作製法、変異誘導剤やトランスポゾン等を用いた突然変異体の作製法、ベクター導入による形質転換体の作製法等の方法が挙げられる。また、遺伝子的改変に用いる技術としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、他の微生物を媒介した接合伝達等による遺伝子導入法、細胞に熱などの刺激を与えて遺伝子を導入するヒートショック法、自然形質変換法等が挙げられる。
また、本発明のスフィンゴ糖脂質を化学合成的手法、酵素等を用いた生化学的手法又はその組み合わせから成る手法等により製造してもよい。
【００３８】
本発明のスフィンゴ糖脂質を得る方法のうち、好ましい方法としては以下に述べる微生物を用いた製造方法が挙げられる。これらについては後述する。
【００３９】
≪スフィンゴ糖脂質の製造方法≫
本発明のスフィンゴ糖脂質は、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程とを含む製造方法により製造することができる。
【００４０】
プラシノ藻綱クロロデンドロン目は分類学上、更にクロロデンドロン科プラシノクラデュス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、シェルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）属などに分かれており、本発明のプラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物はそのいずれの属に属する微生物であってもよい。好ましくは、プラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物（以下、単に「テトラセルミス属に属する微生物」という）を挙げることができる。
【００４１】
テトラセルミス属は、テトラセルミス テトラセーレ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｔｅｔｒａｔｈｅｌｅ）、テトラセルミス アラクリス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ａｌａｃｒｉｓ）、テトラセルミス チュイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉ）、テトラセルミス コルディフォルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ）、テトラセルミス コンプラナータ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｏｍｐｌａｎａｔａ）、テトラセルミス グラシリス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、テトラセルミス レヴィス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｌｅｖｉｓ）、テトラセルミス ストリアータ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｔｒｉａｔａ）、テトラセルミス ヴェルルコーサ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）等の種に分類されており、本発明のテトラセルミス属に属する微生物としては、そのいずれであってもよい。
【００４２】
また、本発明のスフィンゴ糖脂質の生産量の観点から、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＫＧ４０００１３）及びテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株（ＭＢＩＣ１１１２５株）（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１０３００３）の少なくとも一方であることが好ましく、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株であることが特に好ましい。
テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株は、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、２０１１年４月５日付で寄託されている（受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）。
【００４３】
＜準備工程＞
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法は、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程を含む。
プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程としては、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程、前記培養工程により得られた細胞を破砕する工程、前記培養工程により得られた細胞を凍結もしくは冷蔵するなどにより保存する工程、前記培養工程により得られた細胞を乾燥する乾燥工程、前記乾燥工程により得られた細胞を破砕する破砕工程、前記破砕工程により破砕した細胞を凍結もしくは冷蔵することにより保存する工程等の工程を含んでいてもよく、これらの工程を適宜組み合わせてもよい。
【００４４】
前記準備工程としては、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程を含んでいてもよい。培養は、海洋性微細藻類の培養に通常用いられる培地及び培養条件をそのまま用いればよい。
培養に用いられる培地としては、天然海水に藻類の生育に必要な栄養源を添加する栄養塩添加培地と、天然海水を模して合成された人工海水に藻類の生育に必要な栄養塩を添加する完全合成培地のいずれであってもよい。
【００４５】
炭素源としては、主として二酸化炭素を用いることができ、通常は空気を培地へ通気すればよい。生育に必要な栄養塩又は補助的な栄養塩としては、硝酸ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化鉄、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化銅、硫酸銅、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、塩化マンガン、硫酸マンガン等の無機塩が挙げられる。
また、その他の炭素源又は窒素源として種々の添加成分を含むものであってもよい。このような、追加の炭素源としては、例えば、炭酸カルシウム、グルコース、フルクトース、サッカロース、デンプン、グリセリン、リンゴ酸、乳酸、酢酸等を挙げることができ、窒素源としては、酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等を挙げることができる。この他、ビタミン、ミネラル、キレートマンガン（ＥＤＴＡ−Ｍｎ）、キレート鉄（ＥＤＴＡ−Ｆｅ）、アスコルビン酸、チオグリコール酸、システイン等を添加してもよい。
【００４６】
海洋藻類培養のための栄養塩添加培地としては、Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ培地、ＥＳ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、Ｋ培地、ＭＮ培地や各々の派生培地を挙げることができ、完全合成培地としては、ＡＳＰ培地、ＡＫ培地、ＩＭＫ培地及び各々の派生培地を挙げることができる。
特に、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物をより良好に培養するためには、ＩＭＫ培地（日本製薬株式会社製）、ｆ／２培地（Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｒ.Ｒ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., １９６２ ）、ＢＧ１１（Ｒｉｐｐｋａ Ｒ. ｅｔ ａｌ., １９７２）等が好適である。
培地は調製後、ｐＨを６．５〜８．０の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により殺菌して培養に用いる。
培養は、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃にて、６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ−７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色灯照射下、１日間〜１４日間、通気撹拌培養、振とう培養、あるいは静置培養で行えばよい。
【００４７】
前記準備工程としては、前記培養工程により得られた細胞を乾燥する乾燥工程を含んでいてもよい。乾燥工程としては、凍結乾燥、真空乾燥、加熱乾燥、自然乾燥、臨界点乾燥等の方法が挙げられ、好ましくは凍結乾燥による方法が挙げられる。
【００４８】
前記準備工程としては、前記乾燥工程により得られた細胞を破砕する破砕工程を含んでいてもよい。破砕工程としては、乳鉢やホモジナイザー等を用いて細胞を物理的に破砕する方法、超音波発生装置等から発せられる電磁波を用いた破砕方法、フレンチプレスやオートクレーブ等を用いた加圧による破砕方法等の方法が挙げられ、これらの方法を適宜組み合わせてもよい。
【００４９】
＜分離工程＞
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法は、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程を含む。
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法において、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程としては、細胞構成成分を分離することができればよく、公知の方法を用いることができ、前記準備工程と一体的に行ってもよい。
また、分離工程としては、前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程と、前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程と、スフィンゴ糖脂質濃縮工程等の工程を含んでいてもよく、これらの工程を適宜組み合わせてもよい。
【００５０】
前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程で用いられる方法は、生体材料から脂質を分離するために一般に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法やＦｏｌｃｈ法等、あるいはこれらを組み合わせた方法等が用いられ、好ましくはＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法を用いた方法が挙げられる。
【００５１】
また、弱アルカリ分解処理を組み合わせることにより、スフィンゴ脂質成分を高純度で分離することができる。
弱アルカリ分解処理としては０．０１Ｎ〜０．５Ｎの水酸化カリウムあるいは水酸化ナトリウムを脂質約１ｍｇ〜１００ｍｇにつき０．１ｍｌ〜１０ｍｌ加え、超音波洗浄器を用いて１〜１０分間超音波によりホモジナイズしたのち、３０℃〜５０℃で３０分間〜２時間インキュベートする方法等が挙げられる。
【００５２】
前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程で用いられる方法は、一般に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、クロマトグラフィー、溶媒分画、透析、密度勾配遠心、蒸留、超遠心等が挙げられる。
クロマトグラフィーを用いてスフィンゴ糖脂質を分離する方法としては、ケイ酸カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等公知の方法を使用することができ、これらの方法を適宜組み合わせることができる。さらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置等と組み合わせることにより、より効率的に分離を行うことができる。
【００５３】
このようにして得られた新規スフィンゴ糖脂質は、医薬品、化粧料又は食品等の原料として有用である。
また、本発明によれば光合成微生物であるプラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を用いることにより、従来の酵母や細菌に比べて、省エネルギー及び低コストでスフィンゴ糖脂質を製造することが可能となる。
さらに、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物のなかでもプラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物が好ましく、中でもテトラセルミス属 ＮＫＧ４０００１３株やテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株がより好ましく、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株が最も好ましい。テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株を利用することにより、省エネルギー及び低コストで、大量のスフィンゴ糖脂質を製造することが可能となる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」、「％」は質量基準である。
【００５５】
＜実施例１＞
−培養−
ＩＭＫ液体培地（日本製薬株式会社製）４０ｍＬを添加した１００ｍＬの綿栓付き三角フラスコに、Ｔｒｉｇｇ Ｉｓｌａｎｄ, Ｐｅｒｔｈ市近郊, Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ州, Ａｕｓｔｒａｌｉａより採取単離されたテトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）に由来する微生物を入れて、６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ−７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの白色灯照射下、室温（２５℃）にて前培養を行った。
この培養液全量を、５００ｍＬの上記液体培地の入った扁平フラスコに加え、上記と同一の白色灯照射下(６０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ−７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ)、室温（２５℃）にて通気培養を行った。
空気の流速は５００ｍＬ／ｍｉｎに設定し、７日間〜１４日間培養を行った。
【００５６】
−スフィンゴ糖脂質の分離−
培養後、培養後の藻体を遠心回収(１，０００×ｇ,５分)した後、常法により凍結乾燥を行い、乾燥藻体を調製した。
乾燥藻体２ｇを乳鉢内で破砕し、４０ｍＬのクロロホルム-メタノール(１:１)に懸濁した。同試料に４０ｍＬのＫＯＨ-メタノール溶液(０．８Ｍ)を加え、超音波洗浄機(Ｗ-１７０-ＳＴ, ＨＯＮＤＡ社製)を用いて５分間超音波によりホモジナイズしたのち、ウォーターバスを用いて４２℃、３０分間インキュベートした。
その後クロロホルム１００ｍＬと水４８ｍＬを加え、１,０００×ｇで３分間遠心した後、有機相を分取、乾燥することで脂質成分を乾固し、１０ｍＬのクロロホルム-メタノール(２:１, ｖ／ｖ)に再溶解することで脂質成分を分離した。さらに、この操作を８回繰り返し、乾燥藻体１６ｇから脂質成分を分離した。
【００５７】
酸性脂質とクロロフィル色素の除去を目的として、上記で得た脂質成分１０ｍＬを、イオン交換クロマトグラフィーで分離した。
充填剤はジエチルアミノエチル基が修飾されたデキストランゲル(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｄｅｘ, ＧＥヘルスケア社製)５ｇとし、カラム(２ｘ３０ｃｍ)に充填した。その後２０ｍＬのクロロホルム-メタノール-水 (５:１０:１, ｖ／ｖ／ｖ)を流すことでカラムを平衡化した。サンプルを吸着させた後、同溶媒７０ｍＬを２ｍＬ／ｍｉｎで流し、溶出液を５ｍＬずつ分取した。これをフラクションごとにＴＬＣで分析し、オルシノール−硫酸試薬による染色により、スフィンゴ糖脂質の溶出の確認を行った。その結果、分取開始から約３０ｍＬの溶出液中でスフィンゴ糖脂質の存在が確認された。
なお、ＴＬＣによるスフィンゴ糖脂質の溶出の確認の際には、スフィンゴ糖脂質標品として、大豆由来グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社製）を用いた。ＴＬＣ分析においてスフィンゴ糖脂質標品と移動度（Ｒｆ値）が近く、オルシノール−硫酸試薬により染色されたスポットをスフィンゴ糖脂質として判定した。
【００５８】
次にスフィンゴ糖脂質の分離を目的として、上記で得られたスフィンゴ糖脂質を含む溶出液を１０ｍＬに濃縮し、ケイ酸カラムクロマトグラフィーで分離した。
充填剤はＩａｔｒｏｂｅａｄｓ (６ＲＳ−８０６０,三菱ヤトロン社製) ５０ｇとし７０℃で一時間加熱して活性化した後、クロロホルム１００ｍＬに湿潤させ、２ｘ５０ｃｍのカラムに充填した。その後クロロホルム５００ｍＬを流して平衡化を行い、サンプルを投入した。溶媒はクロロホルム２００ｍＬ、クロロホルム-アセトン(９:１)２００ｍＬ、同(８:２)１００ｍＬ、同(７:３)２００ｍＬ、同(４:６)１００ｍＬ、同(２:８)２００ ｍＬ、アセトン２００ｍＬを順次投入した(Ａｎｄｏ Ｓ. ｅｔ ａｌ., １９７６; Ｍｏｍｉ Ｔ. ｅｔ ａｌ., １９７６)。フラクションの分取は、クロロホルム-アセトン(４:６)の溶液を投入後に開始し、１０ｍＬずつ分取した。分取したフラクションをＴＬＣで分析することで、オルシノール−硫酸試薬染色により、スフィンゴ糖脂質画分を確認した。
その結果、画分番号３０以降よりスフィンゴ糖脂質の溶出が観察され、カロテノイドやステロール配糖体からの分離が観察された。
【００５９】
得られたスフィンゴ糖脂質画分からのスフィンゴ糖脂質の分離を目的として、逆相ＨＰＬＣ (Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５, Ｗａｔｅｒｓ)を用いた分離を行った。カラムには４．６×１５０ｍｍのＣ１８カラム(Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ２, Ｗａｔｅｒｓ)、移動相にはメタノールを用いた。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、２種類のスフィンゴ糖脂質の画分をそれぞれ回収した。
溶出時間は、ＥＳＩ−ＩＴ ＭＳを検出器として用いることで確認し、それぞれの溶出時間は１１分、１８分であり、この保持時間に合わせて分取を行い、ＴＬＣで分析したところ、スフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２の分離が確認された。
【００６０】
−スフィンゴ糖脂質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析−
スフィンゴ糖脂質標品と、上記に従い抽出したスフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２とを、約２００ｎｇ／μＬの濃度となるようそれぞれメタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置(ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ, Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製)を用いてマススペクトルを測定した。
マトリクスには水-アセトニトリル(１:１, ｖ／ｖ)に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸(２, ５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ)を用いた(Ｉｒｉｋｏ Ｈ., ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｌｏｃｈｎｉｔ Ｇ. ｅｔ ａｌ., １９９７)。イオン源には窒素レーザー(波長３３７．１ｎｍ)を用い、加速電圧は２０ｋＶ、測定モードは正イオンモードに設定して測定を行い、以下のような結果を得た。
【００６１】
すなわち、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによりスフィンゴ糖脂質標品のマススペクトルを測定した結果、ｍ／ｚ ７３６．５にベースピークが観察された。このスフィンゴ糖脂質標品の分子式（Ｃ４０Ｈ７５Ｎ１Ｏ９）から算出したモノアイソトピック質量が７１３．５であることから、このピークはナトリウムイオン（質量２３）が付加した［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに由来すると考えられた。
したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いてスフィンゴ糖脂質を分析することで［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンが観察され、ｍ／ｚ値からナトリウムイオンの質量を減算することで、スフィンゴ糖脂質の質量と分子式を求められることが示された。
次にスフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２のマススペクトルを測定したところ、それぞれｍ／ｚ７３４．５と、８４６．６にベースピークが観察され、これらはどちらも［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンに由来すると考えられた。よってＧＴ１、ＧＴ２のモノアイソトピック質量は７１１．５と８２３．６であり、分子式はＣ４０Ｈ７３Ｎ１Ｏ９と、Ｃ４８Ｈ８９Ｎ１Ｏ９であると考えられた。
【００６２】
−スフィンゴ糖脂質のＮＭＲ分析−
スフィンゴ糖脂質標品を濃度が５ｍｇ／６００μＬとなるように、重メタノール(０．２５%ＴＭＳ含有)に溶解し、ＮＭＲ分析用の分析管に移した。同サンプルを、５００ＭＨｚのＦＴ−ＮＭＲ装置(ＥＣＡ５００, ＪＥＯＬ社製)により、１Ｈ及びＨＨ−ＣＯＳＹのスペクトルを測定した。積算回数は、１Ｈで４回、ＨＨ−ＣＯＳＹで１回とし、シム調製とロックは自動最適化モードに設定して分析を行った。また、ＧＴ１及びＧＴ２を濃度が約５−１ｍｇ／６００μＬとなるように、重メタノール(０．２５%ＴＭＳ含有)に溶解し、ＮＭＲ分析用の分析管に移した。同サンプルを、５００ＭＨｚのＦＴ−ＮＭＲ装置(ＥＣＡ５００, ＪＥＯＬ)により、１Ｈ及びＨＨ−ＣＯＳＹのスペクトルを測定した。
積算回数は、１Ｈで１６回、適化モードにＨＨ−ＣＯＳＹで１回とし、シム調製とロックは自動最設定して分析を行った。
【００６３】
スフィンゴ糖脂質標品の１Ｈのスペクトルを測定した結果、０．９０ｐｐｍ〜８．００ｐｐｍにピークが観察された。
０．９０ｐｐｍのｔｒｉｐｌｅｔのピークは、スフィンゴイド鎖と脂肪酸鎖のアシル基末端のＣＨ３由来であると考えられた。よってこのピーク面積を６．０とし、他の全てのピーク面積を算出した。
５．００ｐｐｍ〜６．００ｐｐｍに２つのピークが見られ、それぞれの面積が約１であったため、これらは二重結合しているＣＨ由来のピークであると考えられた。
次にＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルを測定した結果、相関ピークが観察された。これにより一次元のスペクトルからは帰属できなかったグルコース由来のピークが全て帰属され、アノマー水素のピークが４．２５ｐｐｍに検出されたことから糖の結合様式がβ−グリコシド結合であることを判断できた。また、スフィンゴイド塩基における二重結合炭素が、水酸基の結合している炭素と隣接していることを判断できた。
以上より、ＮＭＲによってスフィンゴ糖脂質の糖の結合様式や二重結合の位置を決定できることが示唆された。
次に、ＮＫＧ４０００１３株より分離されたスフィンゴ糖脂質と推定されるＧＴ１及びＧＴ２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定した結果、単糖のアノマー水素のピークが４．２５ｐｐｍに検出されたため、β−グルコースの結合が示された。さらにＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルを測定した結果、脂肪酸鎖におけるα水素のピーク（４．４０ｐｐｍ）と不飽和結合由来の水素のピーク（５．８２ｐｐｍ）の間に交差ピークが見られたため、脂肪酸鎖のα炭素における水酸基の付加、およびβ−γ炭素間の不飽和結合が示された。
【００６４】
−スフィンゴ糖脂質のＧＣ／ＭＳ分析−
脂肪酸鎖の組成が異なるスフィンゴ糖脂質標品４種類(Ｃ１６:０、２ｈ Ｃ１６:０、Ｃ２４:０、Ｃ２４:１, Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ) (Ｔａｂｌｅ ４)をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようクロロホルム-メタノール(２:１, ｖ／ｖ)に溶解した。これらをそれぞれ２ＭのＨＣｌ-メタノール溶液 １ｍＬに４０ μＬ加え、９０℃で２０時間加熱することでＭｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓを行った(Ｉｔｏｎｏｔｉ Ｓ. ｅｔ ａｌ., ２００８)。その後１ ＭのＮａＯＨ水溶液 １ ｍＬを加えて反応を停止し、２ ｍＬのヘキサンを添加して１分間混合した。混合後、上層のヘキサンを分取してＧＣ／ＭＳ分析用サンプルとした。また２−ｈｙｄｒｏｘｙ Ｃ１６:０のスフィンゴ糖脂質については、さらに等量のＮ,Ｏ−Ｂｉｓ (ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ) ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ (ＢＳＴＦＡ)を添加し、７０℃で１時間インキュベートすることで水酸基をトリメチルシリル化した(Ｚａｕｎｅｒ Ｓ. ｅｔ ａｌ., ２００８)。同試料をＧＣ／ＭＳ (ＧＣＭＳ ＱＰ−２０１０, Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製)により分析した。カラムはフェニルニルメチルで修飾したシリカカラム(ＨｉＣａｐ ＣＢＰ５, Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製)を用いた。カラムオーブンの温度は、サンプルを注入した直後から８０℃で２分間維持した後、１７０℃まで２０℃／ｍｉｎで昇温、１７０℃から２４０℃まで４℃／ｍｉｎで昇温し、２４０℃で２０分間維持した。ＭＳによる検出はサンプル注入の１０分後から開始し、４５分間測定した。また、ＧＴ１、ＧＴ２をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようクロロホルム-メタノール(２:１, ｖ／ｖ)に溶解した後、スフィンゴ糖脂質標品と同様の操作によりＭｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓし、ＧＣ／ＭＳにより分析した。
【００６５】
その結果、それぞれ保持時間１７．０ｍｉｎと３８．５ｍｉｎに単一のピークが検出された。またそれらのマススペクトルを解析したところ、α炭素に水酸基の付加したＣ１６：１、Ｃ：２４：１の脂肪酸に由来する脂肪酸メチスエステルのピークであると考えられた。よってＴＧ１、ＴＧ２のセラミド部位におけるこれらの脂肪酸の存在が示唆された。
以上より、ＧＴ１（下記式（２））とＧＴ２（下記式（３））はそれぞれＧｌｃ−ｄ１８：２／２−ｈｙｄｒｏｘｙ １６：１Δ３、Ｇｌｃ−ｄ１８：２／２−ｈｙｄｒｏｘｙ ２４：１Δ３という下記構造をもつグルコシルセラミドであると考えられた。
【００６６】
【化１０】
【００６７】
【化１１】
【００６８】
−テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株由来のスフィンゴ糖脂質の含有量測定−
ＮＫＧ４０００１３株の乾燥藻体５０ｍｇを１ｍＬのクロロホルム-メタノール(１:１)に懸濁し、内部標準としてスフィンゴ糖脂質標品２０μｇを加えた後、上述のスフィンゴ糖脂質の分離と同様の操作で細胞から脂質を抽出した。
有機相を分取後、残った水相に再度クロロホルム ２ｍＬを加えてホモジナイズし、有機相を分取した。分取した有機相を集め、メタノールを加えて２０ｍＬに調整した。
調整したサンプル１μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ(４０００ ＱＴＲＡＰ, ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製)により分析し、ＮＫＧ４０００１３株抽出したＧＴ１、ＧＴ２を定量した。
【００６９】
カラムには２．０×５０ｍｍのＣ１８逆相カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ ３ μｍ, ＴＯＳＯＨ社製）、移動相Ａには５ｍＭギ酸アンモニウムを含むメタノール-水-ギ酸(５８:４８:１)、移動相Ｂには５ｍＭギ酸アンモニウムを含むメタノール-ギ酸(９９:１)を用いた。
移動相の割合は、移動相Ｂを４０％で１分間保持した後、３．６分間かけて１００％に上げ、１００％のまま１０．６分間保持して溶出した (Ｓｈａｎｅｒ ＲＬ. ｅｔ ａｌ., ２００９)。流速は０．２ ｍＬ／ｍｉｎに設定した。検出は最適化されたＭｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇモードで行った。
スフィンゴ糖脂質の細胞内含有量は、濃度を調整したスフィンゴ糖脂質標品(０, ０．１, ０．２５, ０．５, １, ２ ｐｐｍ)を用いて作成した検量線により算出した。
【００７０】
その結果、乾燥藻体１ｇあたりのＧＴ１及びＧＴ２の含有量は、それぞれ０．５４±０．０５ ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ、０．１３±０．０１ ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌであった。
【００７１】
＜実施例２＞
−テトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株を用いて製造したスフィンゴ糖脂質の分析−
ＮＫＧ４０００１３株と同属であるＮＢＲＣ１０３００３株を、実施例１に記載の方法に従い培養し、実施例１に記載の方法に従いスフィンゴ糖脂質を分離し、スフィンゴ糖脂質の分析を行った。
ＮＢＲＣ１０３００３株はＮＩＴＥより提供され、ＩＭＫを培地として培養を行った。
【００７２】
まず、ＴＬＣを用いて分析を行った。その結果、ＮＫＧ４０００１３株におけるステリルグリコシド及びＧＴ２と同じ位置に、糖脂質のスポット（ＳＴ、ＧＴｓ）が観察された。
次にこれら２種類の糖脂質を回収し、ＥＳＩ−ＩＴ ＭＳによりマススペクトルを測定した。その結果、ＳＴからはスフィンゴ糖脂質に相当するピークは観察されなかったが、ＧＴｓからはＧＴ１、ＧＴ２と同じくｍ／ｚ７４７、８５９にピークが観察された。
さらにこれらのイオンについてＭＳ２、ＭＳ３スペクトルを測定したところ、どちらもＧＴ１（上記一般式（２））、ＧＴ２（上記一般式（３））と同じフラグメントイオンが観察された。
したがってＮＢＲＣ１０３００３株もスフィンゴ糖脂質（ＧＴ１とＧＴ２）を合成することが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質。
【化１】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
【請求項２】
前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数７〜炭素数１３の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数２〜炭素数２４の置換又は無置換のアルキル基を表す請求項１に記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項３】
前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数９の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数１０〜炭素数２２の置換又は無置換のアルキル基を表す請求項１又は請求項２のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項４】
下記式（２）又は（３）で表される請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質。
【化２】
【化３】
【請求項５】
前記一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、置換アルキル基であり、該置換アルキル基はそれぞれ独立にアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項６】
前記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を経て得られる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項７】
プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を含むスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項８】
前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物である請求項７に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項９】
前記準備工程が、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程を含む請求項７又は請求項８のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１０】
前記分離工程が、前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程と、前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程と、を含む請求項７から請求項９のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１１】
前記スフィンゴ糖脂質が、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質である請求項７から請求項１０のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１２】
前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＫＧ４０００１３）及びテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株（ＭＢＩＣ１１１２５株）（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１０３００３）の少なくとも一方である請求項７から請求項１１のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１３】
テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）。
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質。
【化１】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に置換若しくは無置換のアルキル基又は置換若しくは無置換のアルキリデン基を表す。
【請求項２】
前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数７〜炭素数１３の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数２〜炭素数２４の置換又は無置換のアルキル基を表す請求項１に記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項３】
前記一般式（１）中、Ｒ１は炭素数９の置換又は無置換のアルキル基を表し、Ｒ２は炭素数１０〜炭素数２２の置換又は無置換のアルキル基を表す請求項１又は請求項２のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項４】
下記式（２）又は（３）で表される請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質。
【化２】
【化３】
【請求項５】
前記一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、置換アルキル基であり、該置換アルキル基はそれぞれ独立にアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基及びオキソ基からなる群より選ばれる置換基を有する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項６】
前記一般式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を経て得られる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質。
【請求項７】
プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物の細胞構成成分を準備する準備工程と、前記準備工程で得られた細胞構成成分からスフィンゴ糖脂質を分離する分離工程と、を含むスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項８】
前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、プラシノ藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科テトラセルミス属に属する微生物である請求項７に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項９】
前記準備工程が、前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物を培養する培養工程を含む請求項７又は請求項８のいずれかに記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１０】
前記分離工程が、前記細胞構成成分から脂質成分を分離する脂質分離工程と、前記脂質成分からスフィンゴ糖脂質を分離するスフィンゴ糖脂質分離工程と、を含む請求項７から請求項９のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１１】
前記スフィンゴ糖脂質が、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質である請求項７から請求項１０のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１２】
前記プラシノ藻綱クロロデンドロン目に属する微生物が、テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＫＧ４０００１３）及びテトラセルミス属ＮＢＲＣ１０３００３株（ＭＢＩＣ１１１２５株）（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１０３００３）の少なくとも一方である請求項７から請求項１１のいずれか１項に記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項１３】
テトラセルミス属ＮＫＧ４０００１３株（受領番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１０１）。
【公開番号】特開２０１２−２２４５６４（Ｐ２０１２−２２４５６４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９２１３１（Ｐ２０１１−９２１３１）
【出願日】平成２３年４月１８日（２０１１．４．１８）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１８日（２０１１．４．１８）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
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