新規ターメロン誘導体
【課題】新規なアセチルコリンエステラーゼ(AchE)阻害剤を提供する。
【解決手段】(+)-(S)-ar-ターメロン、又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換することにより得られる新規ターメロン誘導体は、新規なアセチルコリンエステラーゼ(AchE)阻害剤として、アルツハイマー型認知症の予防又は治療となる。
【解決手段】(+)-(S)-ar-ターメロン、又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換することにより得られる新規ターメロン誘導体は、新規なアセチルコリンエステラーゼ(AchE)阻害剤として、アルツハイマー型認知症の予防又は治療となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(+)-(S)-ar-ターメロン（(+)-(S)-ar-Turmerone）又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（(+)-(S)-Dihydro-ar-turmerone）を生物変換（biotransformation）して得られる化合物又はその塩、該化合物又はその塩を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ(以下、AChEともいう)阻害剤及び該化合物又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(-)-α-ビサボロール、(+)-(S)-ar-ターメロン及び(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン等に代表されるビサボラン（bisabolane）型のセスキテルペノイドは、揮発性の天然物質として極めて安定に存在しており、生物学的活性の観点から数多く研究されている（特許文献１及び非特許文献１〜４参照）。
(+)-(S)-ar-ターメロン（１）及び(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）について、以下の式に表す。
【０００３】
【化１】
【０００４】
【化２】
【０００５】
これらのビサボラン型のテルペノイドである、(+)-(S)-ar-ターメロンや(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンは、AChEに対して有力な阻害活性を有することを我々が報告した（非特許文献５参照）。
【０００６】
ところで、先進工業国において、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）は、高齢者人口の急速な増加に伴い、深刻な問題になっており、ＡＤの治療に対してAChE阻害剤が有用であるということが報告されている。AChE阻害剤としては、いくつかの合成化合物(例えば、タクリン、リバスチグミン（rivadtigmine）、ドネペジル及びガランタミン等)が知られているが、これらの化合物は、脳や周辺組織のコリン作動性刺激（cholinergic stimulation）による｛さどう せい しげき｝副作用が懸念される（非特許文献６）。そのため、新規なAChE阻害剤を有する化合物、特に、副作用の低い天然物由来の阻害剤が深く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０９−１５７２０５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Itokawa, H.; Hirayama, F.; Funakoshi, K.; Takeya, K. Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 3488-3492.
【非特許文献２】Jayamasinghe, L.; Kumarihamy, B. M. M.; Jayamarathana, K. H. R. N. Udishani, N. W. M. G. Bandara, B. M. R.; Hara, N.; Fujimoto, Y. Phytochemistry. 2003, 62, 637-641.
【非特許文献３】Imai, S.; Morikiyo, M.; Furihata, K.; Hayakawa, Y.; Seto, H. Agric. Biol. Chem. 1990, 54 (9), 2367-2371.
【非特許文献４】Ferrreira, L. A. F.; Henriques, O. B.; Andreoni, A. A. S.; Vital, G. R. F.; Campos, M. M. C.; Habermehl, G. G.; Moraes, V. L. G. Toxicon. 1992, 30, 1211-1218.
【非特許文献５】Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem. 2010. 58, 2824-2829.
【非特許文献６】Zarotsky, V.; Sramek, J. J.; Cutler, N. R. Am. J. Health-Syst Pharm. 2003, 60(5), 446-452.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換して得られる新規な化合物又はその塩、該化合物又はその塩を有効成分として含有するAChE阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、天然物由来の(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンが強いAChE阻害活性を示すことに着目し、これらの化合物を原料として生物変換することにより、新規な化合物を得た。さらに、この新規化合物は、強いAChE阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の化合物又はその塩、及び該化合物又はその塩を含むAChE阻害及び該化合物又はその塩の製造方法を提供する。
【００１２】
項１．一般式（Ａ１）：
【００１３】
【化３】
【００１４】
（式（Ａ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１〜３の低級アルキル基であり、Ｒ２は、水素又はヒドロキシル基であり、Ｒ３は、
【００１５】
【化４】
【００１６】
（式中、Ｒ３ａは、ヒドロキシル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、又はアセチル基である）、
【００１７】
【化５】
【００１８】
（式中、Ｒ３ａは、前記と同じである）、又は
【００１９】
【化６】
【００２０】
である）
で表される化合物又はその塩。
【００２１】
項２．一般式（Ａ１）が、
【００２２】
【化７】
【００２３】
、又は：
【００２４】
【化８】
【００２５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３は、前記式と同じである）
で表される項１に記載の化合物又はその塩。
【００２６】
項３．一般式（Ａ）が、一般式（３）：
【００２７】
【化９】
【００２８】
一般式（４）：
【００２９】
【化１０】
【００３０】
一般式（５）：
【００３１】
【化１１】
【００３２】
又は
一般式（６）：
【００３３】
【化１２】
【００３４】
で表される項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【００３５】
項４．一般式（７）：
【００３６】
【化１３】
【００３７】
で表される項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【００３８】
項５．項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を有効成分として含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
【００３９】
項６．項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する老人性認知症の予防又は治療薬。
【００４０】
項７．項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型認知症の予防又は治療薬。
【００４１】
項８．項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【００４２】
項９．項１、２又は４に記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【００４３】
項１０．黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌により生物変換する請求項８又は９に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の一般式（Ａ）で表される化合物又はその塩は新規であり、高いAChE阻害活性を有しているため、老人性認知症、特に、アルツハイマー型認知症の治療薬又は予防薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１におけるA. nigerによって(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の生物変換の経時変化を表すグラフである。
【図２】実施例２におけるA. nigerによって(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン(１)の生物変換の経時変化を表すグラフである。
【図３】実施例１で得られた化合物（５）及び（６）について観測されたNOE及びHMBCを示す。
【図４】試験例で実施したAChE活性に対する化合物（３）〜（７）の阻害効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の一般式（Ａ）で表される化合物（以下、化合物（Ａ）ともいう）又はその塩は、以下に示すものである。
【００４７】
【化１４】
【００４８】
式（Ａ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１〜３の低級アルキル基である。
【００４９】
Ｒ２は、水素又はヒドロキシル基であり、より具体的には、Ｒ２が水素である場合には、
【００５０】
【化１５】
【００５１】
であることが好ましく、Ｒ２が、ヒドロキシル基である場合には、
【００５２】
【化１６】
【００５３】
であることが好ましい。
【００５４】
一般式（Ａ）におけるＲ３は、
【００５５】
【化１７】
【００５６】
（式中、Ｒ３ａは、ヒドロキシル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、又はアセチル基である）、
【００５７】
【化１８】
【００５８】
（式中、Ｒ３ａは、前記と同じである）、又は
【００５９】
【化１９】
【００６０】
である。
【００６１】
化合物（Ａ）の具体例としては、一般式（３）：
【００６２】
【化２０】
【００６３】
一般式（４）：
【００６４】
【化２１】
【００６５】
一般式（５）：
【００６６】
【化２２】
【００６７】
一般式（６）：
【００６８】
【化２３】
【００６９】
一般式（７）：
【００７０】
【化２４】
【００７１】
で表される化合物（以下、化合物（３）〜（７））が挙げられ、これらの化合物がAChE阻害活性において、特に有用であるという点から好ましい。
【００７２】
化合物（Ａ）は、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン等から生物変換することにより代謝産物として製造され、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンの生物変換には、黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（Aspergillus niger(以下、A. nigerともいう)）が用いられる。
【００７３】
原料として用いられる(+)-(S)-ar-ターメロン（１）及び(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）は、以下のような構造式を有する化合物であって、「Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem.2010. 58, 2824-2829.」に記載される方法により、イエローバタイ（P. dasyrachis）から単離することができる。
【００７４】
【化２５】
【００７５】
【化２６】
【００７６】
生物変換する方法としては、前記(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを添加した培地中に菌糸体をさらに加えることによって行われる。
【００７７】
菌糸体としては、Aspergillus niger等のAspergillus属、Chaetonium globosum等のChaetomium属、Cladosporium cladosporioides等のCladosporium属、Gliocladium virens等のGliocladium属、Aureobasidium pullulans等のAureobasidium属、Penicillium funiculosum等のPenicillium属、Rhizopus oryzae等のRhizopus属、Fusarium属、Alternaria属、Tyromyces属、Coriolus属、Myrothecium属、Mucor属、Epicoccuｍ属、Trychoderma属、Phoma属、Geotrichum属、Monilia属等が挙げられ、これらの中で、Aspergillus属が好ましく、Aspergillus nigerがより好ましい。
【００７８】
生物変換後、生成物と菌糸体を分離し、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することにより得られる。
【００７９】
また、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン等の原料を生物変換して得られる化合物において、置換基として有するカルボン酸基やヒドロキシル基を既知の反応により、エステル化、アルコキシ化、アセチル化することにより、前記化合物（Ａ）を得ることが可能であり、また、既知の塩基と反応させることによって、化合物（Ａ）の塩を得ることが可能である。
【００８０】
なお前述のように、(+)-(S)-ar-ターメロンを生物変換することによって前記化合物（３）〜（６）を製造した場合、化合物（３）〜（６）から化合物（３）を分離し、分離した化合物（３）をさらに生物変換することによって、化合物（５）及び化合物（６）を製造することも可能である。また、化合物（３）〜（６）から化合物（４）を分離し、分離した化合物（４）をさらに生物変換することによって、化合物（５）を製造することも可能である。
【００８１】
ここで、(+)-(S)-ar-ターメロン（１）を出発物質とした場合の生物変換経路を以下に示す。(+)-(S)-ar-ターメロン（１）は、生物変換によって、15位の炭素で酸化、及び7位の炭素で立体特異的に酸化され、化合物（３）が生成される。化合物（３）は、さらに生物変換により、12位の炭素で化合物（３）と同じタイプの酸化により化合物（５）が得られ、また、化合物（３）において４−メチル−フラノ環が形成されることにより化合物（６）が生成されるものと推測される（経路a）。
【００８２】
また、(+)-(S)-ar-ターメロン（１）は、生物変換によって、12位の炭素及び15位の炭素で、前記と同じようなタイプの酸化が生じ、化合物（４）が生成される。化合物（４）は、さらに生物変換によって、7位の炭素で立体特異的な酸化され化合物（５）が生成されるものと推測される(経路b)。
【００８３】
【化２７】
【００８４】
本発明の化合物（Ａ）又はその塩は、AChE阻害活性を有している。そのため、化合物（Ａ）又はその塩はそのままAChE阻害剤として用いることが可能である。
【００８５】
ACE阻害剤は、各種用途に用いることができる。例えば、AChE阻害剤を医薬品として用いる場合、哺乳動物（特に、ヒト）における老人性痴呆患症の予防薬又は治療薬、特にアルツハイマー型認知症の予防薬又は治療薬として用いられる。
【００８６】
AChE阻害剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。
【００８７】
製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、及び必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。
【００８８】
医薬製剤を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明にかかる医薬の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて、製剤学的な有効量を適宜選ぶことができる。
【００８９】
AChE阻害剤は、製剤全体に対し、通常０．０１〜１００重量％程度（好ましくは、０．１〜５重量％程度）含有していればよい。
【００９０】
また、AChE阻害剤は、例えば、清涼飲料、乳製品（加工乳、ヨーグルト）、菓子類（ゼリー、チョコレート、ビスケット、ガム、錠菓）等の各種飲食品に配合することもできる。
【実施例】
【００９１】
次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００９２】
実施例１
・黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（fungus aspergillus niger）の培養
蒸留水1L中に、ショ糖（15g）、グルコース（15g）、ポリペプトン（5g）、塩化カリウム（500mg）、硫酸マグネシウム（500mg）、リン酸二水素カリウム（1g）及び硫酸第二鉄（10mg）を含むオートクレーブした培養液を調製し、500ml三角フラスコに前記培養液を250ml添加し、さらに、４℃で寒天培地上で保持した黒色｛こくしょく｝アスペルギルスNBRC 4414 (（独）製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から購入)の胞子を添加し、培養した。培養液は、２日間インキュベーターで、28℃の温度で振とうしながら保持した。50mlペトリ皿に培養地30mlをのせ、さらに得られた菌糸体を移植させ、36〜48時間（菌糸体が培養地の表面積の60〜80％を占めるまで）培養した。
【００９３】
・(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の代謝化合物の製造
前記培養した培地に、さらにジメチルスルホキシド（DMSO）200μlに溶解させた(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を3mg添加した。なお、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)は、「Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem.2010. 58, 2824-2829.」に記載される方法により、P. dasyrachisから単離したものであり、以下に示すものである。
【００９４】
(+)-(S)-ar-ターメロン（１）;
淡黄色オイル;
[α]29D+ 63.7° (c = 1.00, CHCl3);
IR (film) cm-1: 1685, 1620;
1H-NMR (CDCl3, 700 MHz) δTM 7.10 (4H, brs, ArH), 6.02 (1H, m, H-10), 3.29 (1H, m, H-7), 2.71 (1H, dd, J = 15.5, 6.0 Hz, H-8), 2.61 (1H, dd, J = 15.5, 8.3 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-15), 2.10 (3H, s, H-13), 1.85 (3H, d, J =1.2, H-12), 1.24 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-14); 13C NMR,; （表２参照）
EIMS m/z (relative intensity) 216 (M+ 30 %), 201 (23 %), 132 (22 %), 119 (75 %), 117 (14 %), 91 (16 %), 83 (100 %), 77 (7 %), 55 (18 %);
HR-EIMS 216.1602 (M+, C15 H20O, calcd. 216.1582).
前記(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を添加した培地を28℃、静置条件下で培養し、ペトリ皿中の培地及び菌糸体を濾過することにより分離した。分離した菌糸体は、pH4にまで酸性にし、酢酸エチル30mlで3回抽出した。得られた抽出物を、無水Na2SO4によって乾燥し、減圧することによって酢酸エチルを除去した。
【００９５】
(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の代謝産物の存在を確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた。なお、ＴＬＣ分析は、プレコートされたシリカゲルプレート（60 F254）(Merck社製)を用いて行い、スポットは、バニリン硫酸塩（vanillic sulphate）試薬を散布した後、加熱することによって可視化することにより確認した。また、HPLCの条件を以下に示す。
・LC-10Ai装置（（株）島津製作所製）
・UV ディテクター(SPD-M10A)
・カラム（AR-IIカラム(4.6×250 mm) (ナカライテスク（株）製) ）
・移動層（1ml/min）（CH3CN-H2O liner gradient (0 min, 70:30; 50 min, 30:70, v/v)）
図１に、培養したA. nigerによる(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の生物変換の経時的変化を示す。図１におけるプロット（■）は、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を表し、プロット（○）は化合物（３）を表し、プロット（□）は、化合物（４）を表し、プロット（●）は化合物（５）を表し、プロット（▲）は化合物（６）を表す。
【００９６】
前記の結果より、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を生物変換した代謝産物において、化合物（５）及び化合物(６)が主生成物であり、化合物（３）及び化合物(４)が少量、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)から生物変換されることにより得られたことが確認できた。
【００９７】
・(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の代謝産物の単離
DMSO(20 ml)に溶解させた(+)-(S)-ar-ターメロン（１）(300 mg)を上記培地に添加した。培養時間（３日間）の経過後、培地と菌糸体を濾過によって分離した。培養液をpH4まで酸性にし、酢酸エチル500 mlで3回抽出した。得られた抽出物を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、粗成生物(400 mg）を得た。抽出物をNaHCO3の5％水溶液及び酢酸エチルで分液し、酢酸エチル層を取り出し、減圧することによって乾燥して、中性分画（neutral fraction）を得た。アルカリ層を、2NのHClでpH3になるまで酸性にし、水と酢酸エチルにより抽出した。抽出物（酢酸エチル層）を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、酸性分画（acid fraction）を得た。酸性分画（acid fraction）をさらに、CH2Cl2/MeOHでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200〜300メッシュのシリカゲル60（Merck社製））により精製することにより、２つの分画を得た。分画したフラクションを、さらに、semi-preparative reversed-phase HPLC（CH3CN-H2O (60:40, v/v + 0.05% CH3COOH)）によって、分画することによって、化合物（３）(30 mg)、化合物（４）(25mg)、化合物（５）(90 mg)及び化合物（６）(66 mg)をそれぞれ得た。
【００９８】
・化合物（３）の同定
化合物（３）について、HR-FABMS、ＩＲスペクトル、1H NMR、13C NMR、HMBC、及び旋光度測定により同定した。なお、HR-FABMSは、日本電子（株）製のJEOL the Tandem MS station JMS-700を用い、IRスペクトルは日本分光（株）製のFT/IR-470 Plus Fourier Transform Infrared Spectrometerを用い、1H- and 13C-NMR, COSY, heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC), heteronucler multiple bond coherence (HMBC), NOESYは、日本分光（株）製のJEOL ECA spectrometers （600 MHz 及び700 MHz の1H NMR並びに 150 MHz and 175 MHz の13C-NMR）によって、旋光度は、日本分光（株）製のCo. LTDDIP-1000によってそれぞれ測定した。
【００９９】
HR-FABMSにより測定した[M+H] +は、m/z 263.1284 (calcd. 263.3105 for C15H19O4)であり、親基質である(+)-(S)-ar-ターメロン(１)より４６atomic mass unit（amu）大きく、C15H18O4であると示唆される。
【０１００】
ＩＲスペクトル測定により、3440ｃｍ−１、及び1685 cm-1に吸収ピークが観測された。これにより、化合物（３）には、ヒドロキシル基及びカルボニル基が存在することが確認できた。
【０１０１】
(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の1H NMR と比較して、化合物（３）の1H NMRは、15位のメチル基と7位のメチン基のピークの消失が確認できた。
【０１０２】
化合物（３）と(+)-(S)-ar-ターメロン(１)との13C NMRの比較により、13個のピークは互いに類似したケミカルシフトを示した。残りの２つの１３Ｃのケミカルシフトにおいて、化合物（３）のピークには、オキシ基を有する四級炭素（δC 73.7）と、カルボン酸基の炭素(δC170.4)が確認できた。
【０１０３】
13C NMRにより、カルボン酸基の15位の炭素でカップリングされた芳香族化合物の4位の四級炭素のupfield shift及び芳香族化合物の1位の四級炭素のdownfield shiftが観測され、化合物（３）においてα,β-共役カルボキル基が存在することを示唆した。
【０１０４】
化合物（３）のHMBC測定によって、8位の炭素のプロトン(δH 3.17及び2.89)／7位の炭素、14位のプロトン(δH 1.52)/7位の炭素との間のHMBCにより、8位の炭素において２つの炭素との結合を有し、また、2位、6位の炭素のプロトン(δH 7.55)／7位の炭素との間のHMBCにより、7位の炭素において３つの炭素との結合を有することを確認した。
【０１０５】
なお、プロトンと炭素の同定は、H-H COSY, HSQC及びHMBCにより確認できた。
【０１０６】
以上の結果から、化合物（３）の構造は、新規化合物である(+)-7-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが確認できた。
【０１０７】
次に、化合物（３）の7位の炭素の絶対配置について、「Reiter, M.; Turner, H.; Gouverneur, V. Chem. Eur. J. 2006, 12, 7190-7203. 」に記載される方法によって同定した。化合物（３）を以下に示すテトラヒドロ-2-(4-カルボメトキシフェニル)-2,6,6-トリメチル-4H-ピラン-4-オン(８)へと変換した後、ＣＤスペクトル測定を行った。その結果、S体であることを特定した。なお、CDスペクトルは、（株）堀場製作所製のHoriba SEPA-200 polarimeterを用いて測定した。CDスペクトルにより、化合物（８）は、負のコットン効果を示した[262 nm (△e−7.67), 290 nm (△e−40.7), 355 nm (△e−2.01)]。
【０１０８】
【化２８】
【０１０９】
以上より、化合物（３）は、(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが同定できた。
【０１１０】
化合物（３）（(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸）;
無色粉末;
[α]24.1D+ 5.93° (c = 0.30, CHCl3);
IR (KBr) νmax: 3440, 1685 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR; （表１及び２参照）
HR-FABMS m/z 263.1284 [M+H]+ (calcd. C15H19O4, for 263.1283).
【０１１１】
・化合物（４）の同定
化合物（４）について、以下の方法により同定した。
【０１１２】
HR-FABMSより、親基質である(+)-(S)-ar-ターメロン(１)より４６amu大きく、分子式C15H18O4を有していることが示唆される。
【０１１３】
化合物（４）のＩＲスペクトルは、3392 cm-1及び1689 cm-1であり、ヒドロキシル基及びカルボニル基の存在が確認できた。(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の1H NMRとの比較で、CH2OH基の存在及び２つのメチル基の消失が確認できた。このことから、化合物（４）が、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)のヒドロキシル化によって生成されたことを示唆している。
【０１１４】
1H NMR 及び13C NMRの測定結果より、化合物（３）及び化合物（４）は類似の化合物であることが確認できた。1H NMR 及び13C NMRの測定結果より、化合物（３）と同様、化合物（４）においても15位の炭素にカルボキシル基を有することが確認できた。
【０１１５】
核オーバーハウザー効果（NOE）の測定で、化合物（４）は、１０位のプロトン(δH6.43)と12位のプロトン(δH4.04)との間でNOEが観測された。
【０１１６】
以上の結果より、化合物（４）の構造が、(+)-(10E)-12-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが同定できた。
化合物（４）（(+)-(10E)-12-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸）;
無色オイル;
[α]28.4D+ 48.6° (c = 0.34, Acetone);
IR (film) νmax: 3392, 1689 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR;（表１及び２参照）
HR-FABMS m/z 263.1287 [M+H]+ (calcd. C15H19O4, for 263.1283).
【０１１７】
・化合物（５）の同定
化合物（５）について、以下の方法により同定した。
【０１１８】
HR-FABMSより、親基質である(+)-(S)-ar-ターメロン(１)より62 amu大きく、分子式C15H18O5を有していることが示唆される。
【０１１９】
1H NMR 及び13C NMRの測定結果より、化合物（５）はメチル基の消失及び12位の炭素(δH 4.02)の付加的なdownfield shiftの出現以外は、化合物（３）と類似した結果となった。このことから、12位の炭素であるメチル基が、選択的にヒドロキシメチル基へとヒドロキシル化していることがわかった。
【０１２０】
NOE実験で、化合物（５）は、10位の炭素のプロトン(δH 6.43)と12位の炭素のプロトン(δH 4.02)との間に、NOEが観測された（図３参照）。
【０１２１】
以上の結果より、化合物（５）の構造が、(+)-(10E)-7,12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが同定できた。
【０１２２】
(+)-(10E)-(7S)-7,12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸（５）;
無色オイル;
[α]27.0D+ 2.04° (c = 1.37, Acetone);
IR (film) νmax: 3395, 1692 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR（表１及び２参照）; HR-FABMS m/z 279.1234 [M+H]+ (calcd. C15H19O5, for 279.1232).
【０１２３】
・化合物（６）の同定
化合物（６）について、以下の方法により同定した。
【０１２４】
HR-FABMSより、分子式C15H16O4を有することを示した。
【０１２５】
1H NMRの測定結果より、化合物（３）及び化合物（６）は類似の化合物であることが確認できた。化合物（３）と化合物（６）との1H NMRの比較により、δH1.87の13位の炭素のメチルプロトンが消失し、オレフィンのプロトン(δH 7.06)が現れたことが確認できた。以上の結果より、化合物（６）は、15位の炭素に、α,β−共役カルボキシ基を有していることが確認できた。
【０１２６】
また、化合物（３）と化合物（６）との13C NMRの比較により、9位の炭素においてケトンシグナルの消失を示した。
【０１２７】
HMBC測定により、(i)8位の炭素のプロトン/1、7、9、10及び14位の炭素のHMBC、(ii)12位の炭素のプロトン/10、11及び13位の炭素のHMBC、(iii)13位の炭素のプロトン/9、10及び11位の炭素のHMBCの関係を示した。
【０１２８】
以上のHMBCの関係の結果より、化合物（６）には、4-メチル-フラノ環の存在が確認できた（図３）。また、化合物（６）の構造が、(+)-15-カルボキシ-9,13-エポキシ-7-ヒドロキシ-9,13-デヒドロ-ar-クルクメンであることが分かった。
【０１２９】
化合物（６）（(+)-15-カルボキシ-9,13-エポキシ-(7S)-ヒドロキシ-9,13-デヒドロ-ar-クルクメン）;
無色粉末;
[α]24.2D+ 78.1° (c = 0.53, CHCl3);
IR (KBr)νmax: 3562, 1682 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR;（表１及び２参照）
HR-FABMS m/z 261.1154 [M+H]+ (calcd. C15H17O4, for 261.1126).
【０１３０】
実施例２
(+)-(S)-ar-ターメロン(１)に代えて、実施例１と同様に、化合物（３）である(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸及び化合物（４）である(+)-(10E)-2-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸を用いた以外は、実施例１と同様に、培養したA. nigerを用いて同じ生物変換をおこなった。
【０１３１】
培養後、化合物（３）である(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸からは化合物（５）及び化合物（６）が、化合物（４）である(+)-(10E)-2-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸からは化合物（５）がそれぞれ酢酸エチルの抽出により単離された。
【０１３２】
両方の化合物（５）は、実施例１において単離された(+)-(10E)-(7S)-7,12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸と同様の旋光度を示した。
【０１３３】
前述のとおり、7位の炭素において、化合物（５）及び化合物（６）の絶対配置は、S体であることが確認できた。以上より、化合物（５）が(+)-(10E)-(7S)-12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸、及び化合物（６）が(+)-15-カルボキシ-9,13-エポキシ-(7S)-ヒドロキシ-9,13-デヒドロ-ar-クルクメンであることが同定できた。
【０１３４】
実施例３
実施例１と同様の方法で培養した培地に、さらにDMSO１８ｍｌに溶かした(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）２７０ｍｇを添加した。なお、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン(２)は、「Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem. 2010. 58, 2824-2829.」に記載される方法により、P. dasyrachisから単離したものであり、以下に示すものである。
【０１３５】
(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン(２);
無色オイル;
[α]29D+ 32.1°(c = 1.01, CHCl3);
IR (film) cm-1: 1712, 1514;
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.10 (4H, brs, ArH), 3.28 (1H, ddd, J = 8.0, 7.2, 6.3 Hz, H-7), 2.68 (1H, dd, J = 16.1, 6.3 Hz, H-8), 2.58 (1H, dd, J = 16.1, 8.0 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-15), 2.19 (2H, m, H-10), 2.08 (1H, m, H-11), 1.23 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-14), 0.85 (6H, d, J = 4.6 Hz, H-12,13);
13C NMR; （表２参照）
EIMS m/z (相対強度) 218 (M+ 26 %), 203 (25 %), 161 (19 %), 119 (100 %), 105 (13 %), 91 (13 %), 85 (13 %), 57 (18 %);
HR-EIMS 218.1777 (M+, C15H22O, calcd. 218.1741).
【０１３６】
・(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)の化合物（７）の単離
ＤＭＳＯに溶解させた(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)を実施例１で調製した培地に添加した。培養時間（3日間）の経過後、培地と菌糸体を濾過によって分離した。培養液をpH4まで酸性にし、酢酸エチル500mlで3回抽出した。得られた抽出物を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、粗成生物(350mg)を得た。
【０１３７】
図２に、培養したA. nigerによる(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)の生物変換の経時的変化を示す。図２におけるプロット（■）は、(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)を表し、プロット（●）は化合物（７）を表す。
【０１３８】
抽出物をNaHCO3の5％水溶液及び酢酸エチルで分液し、酢酸エチル層を取り出し、減圧することによって乾燥して、中性分画（neutral fraction）（123mg）を得た。アルカリ層を、2NのHClでpH3になるまで酸性にし、水と酢酸エチルにより抽出した。抽出物（酢酸エチル層）を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、酸性分画（acid fraction）（190mg）を得た。酸性分画（acid fraction）をさらに、CH2Cl2/MeOHでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200〜300メッシュのシリカゲル60（Merck社製））により精製することにより、２つの分画を得た。分画したフラクションを、さらに、semi-preparative reversed-phase HPLC（CH3CN-H2O (60:40, v/v + 0.05% CH3COOH)）によって分画し、化合物（７）を得た。
【０１３９】
・化合物（７）の同定
HR-FABMSにより、化合物（７）は分子式C15H20O5であることが同定できた。
【０１４０】
化合物（７）の1H NMR データは、10位、11位の炭素の二重結合が消失し、10位、11位の炭素のプロトンが観測できた以外は、化合物（３）と類似した。13C NMRの10位、11位のupfield shiftより、二重結合の消失及びヒドロキシル基の存在が示唆された。
【０１４１】
化合物（７）のHMBC測定により、11位の炭素において、ヒドロキシル基を有することを示唆する11位の炭素(10位、12位及び13位の炭素のプロトンとともに)に対するHMBC関係を示した。
【０１４２】
以上の結果より、化合物（７）が(+)-7,11-ジヒドロキシ-ar-トドマツ酸であることを確認した。
【０１４３】
化合物（７）（(+)-7,11-ジヒドロキシ-ar-トドマツ酸）;
無色オイル;
[α]25.2D-7.11° (c =1.62, CHCl3);
IR (film)νmax: 3431, 1695 cm-1;
1H NMR 及び 13C NMR（表１及び２参照）;
HR-FABMS m/z 281.1400 [M+H]+ (calcd. C15H21O5, for 281.1389).
表１に、(+)-(S)-ar-ターメロン（１）、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）、及び化合物（３）〜（７）の１H NMRスペクトルのデータを表１に、13C NMRスペクトルのデータを表２に示す。
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
試験例
ACｈE阻害試験法
AChE阻害試験は、Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem. 2010. 58, 2824-2829.の方法に従って行った。
【０１４７】
ヒト赤血球AChE 溶液(0.037 unit/mL in 0.01 M リン酸緩衝液, pH 7.4)20μl、阻害剤（化合物（３）〜（７）の各メタノール水溶液）２０μｌ、発色剤（５-５’ジチオビス（２-ニトロ安息香酸）（DTNB）、(0.15 mM in 0.1 M リン酸緩衝液, pH 7.4)）200 ml、基質（アセチルコリン アイオダイド（ATC）水溶液(最終濃度0.25 mM)）30 mlを含むウェルをそれぞれ調製した。
【０１４８】
なお、コントロールウェルとして、阻害剤に代えてメタノールを用いて前記のウェルを調製した。
【０１４９】
実験方法としては、基質を添加し終えた時間を起点とし、前記混合物を室温で１５分間インキュベートし、混合物の405nmにおける吸光度を測定した。AChE活性の阻害割合を以下の式によって算出した。なお、吸収光度は、（株）日立製作所製のU-2000A UV-Vis spectrophotometerによるUVスペクトルを測定することによって求めた。
【０１５０】
Ｉ(％) ＝ ｛（Ａcontrol − Ａsample) ／ Ａcontrol} × １００％
式中、Ａsampleは、各阻害剤を含むサンプルの各吸光度を表し、Ａcontrolはコントロールウェルの吸光度を表す。なお、各サンプルについて少なくとも３回測定を行いその平均値を示した。測定結果を図４に示す。図４に示すように、化合物３〜７は、強いAChE阻害活性値を示していることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(+)-(S)-ar-ターメロン（(+)-(S)-ar-Turmerone）又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（(+)-(S)-Dihydro-ar-turmerone）を生物変換（biotransformation）して得られる化合物又はその塩、該化合物又はその塩を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ(以下、AChEともいう)阻害剤及び該化合物又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(-)-α-ビサボロール、(+)-(S)-ar-ターメロン及び(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン等に代表されるビサボラン（bisabolane）型のセスキテルペノイドは、揮発性の天然物質として極めて安定に存在しており、生物学的活性の観点から数多く研究されている（特許文献１及び非特許文献１〜４参照）。
(+)-(S)-ar-ターメロン（１）及び(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）について、以下の式に表す。
【０００３】
【化１】
【０００４】
【化２】
【０００５】
これらのビサボラン型のテルペノイドである、(+)-(S)-ar-ターメロンや(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンは、AChEに対して有力な阻害活性を有することを我々が報告した（非特許文献５参照）。
【０００６】
ところで、先進工業国において、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）は、高齢者人口の急速な増加に伴い、深刻な問題になっており、ＡＤの治療に対してAChE阻害剤が有用であるということが報告されている。AChE阻害剤としては、いくつかの合成化合物(例えば、タクリン、リバスチグミン（rivadtigmine）、ドネペジル及びガランタミン等)が知られているが、これらの化合物は、脳や周辺組織のコリン作動性刺激（cholinergic stimulation）による｛さどう せい しげき｝副作用が懸念される（非特許文献６）。そのため、新規なAChE阻害剤を有する化合物、特に、副作用の低い天然物由来の阻害剤が深く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０９−１５７２０５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Itokawa, H.; Hirayama, F.; Funakoshi, K.; Takeya, K. Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 3488-3492.
【非特許文献２】Jayamasinghe, L.; Kumarihamy, B. M. M.; Jayamarathana, K. H. R. N. Udishani, N. W. M. G. Bandara, B. M. R.; Hara, N.; Fujimoto, Y. Phytochemistry. 2003, 62, 637-641.
【非特許文献３】Imai, S.; Morikiyo, M.; Furihata, K.; Hayakawa, Y.; Seto, H. Agric. Biol. Chem. 1990, 54 (9), 2367-2371.
【非特許文献４】Ferrreira, L. A. F.; Henriques, O. B.; Andreoni, A. A. S.; Vital, G. R. F.; Campos, M. M. C.; Habermehl, G. G.; Moraes, V. L. G. Toxicon. 1992, 30, 1211-1218.
【非特許文献５】Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem. 2010. 58, 2824-2829.
【非特許文献６】Zarotsky, V.; Sramek, J. J.; Cutler, N. R. Am. J. Health-Syst Pharm. 2003, 60(5), 446-452.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換して得られる新規な化合物又はその塩、該化合物又はその塩を有効成分として含有するAChE阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、天然物由来の(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンが強いAChE阻害活性を示すことに着目し、これらの化合物を原料として生物変換することにより、新規な化合物を得た。さらに、この新規化合物は、強いAChE阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の化合物又はその塩、及び該化合物又はその塩を含むAChE阻害及び該化合物又はその塩の製造方法を提供する。
【００１２】
項１．一般式（Ａ１）：
【００１３】
【化３】
【００１４】
（式（Ａ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１〜３の低級アルキル基であり、Ｒ２は、水素又はヒドロキシル基であり、Ｒ３は、
【００１５】
【化４】
【００１６】
（式中、Ｒ３ａは、ヒドロキシル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、又はアセチル基である）、
【００１７】
【化５】
【００１８】
（式中、Ｒ３ａは、前記と同じである）、又は
【００１９】
【化６】
【００２０】
である）
で表される化合物又はその塩。
【００２１】
項２．一般式（Ａ１）が、
【００２２】
【化７】
【００２３】
、又は：
【００２４】
【化８】
【００２５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３は、前記式と同じである）
で表される項１に記載の化合物又はその塩。
【００２６】
項３．一般式（Ａ）が、一般式（３）：
【００２７】
【化９】
【００２８】
一般式（４）：
【００２９】
【化１０】
【００３０】
一般式（５）：
【００３１】
【化１１】
【００３２】
又は
一般式（６）：
【００３３】
【化１２】
【００３４】
で表される項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【００３５】
項４．一般式（７）：
【００３６】
【化１３】
【００３７】
で表される項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【００３８】
項５．項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を有効成分として含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
【００３９】
項６．項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する老人性認知症の予防又は治療薬。
【００４０】
項７．項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型認知症の予防又は治療薬。
【００４１】
項８．項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【００４２】
項９．項１、２又は４に記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【００４３】
項１０．黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌により生物変換する請求項８又は９に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の一般式（Ａ）で表される化合物又はその塩は新規であり、高いAChE阻害活性を有しているため、老人性認知症、特に、アルツハイマー型認知症の治療薬又は予防薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１におけるA. nigerによって(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の生物変換の経時変化を表すグラフである。
【図２】実施例２におけるA. nigerによって(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン(１)の生物変換の経時変化を表すグラフである。
【図３】実施例１で得られた化合物（５）及び（６）について観測されたNOE及びHMBCを示す。
【図４】試験例で実施したAChE活性に対する化合物（３）〜（７）の阻害効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の一般式（Ａ）で表される化合物（以下、化合物（Ａ）ともいう）又はその塩は、以下に示すものである。
【００４７】
【化１４】
【００４８】
式（Ａ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１〜３の低級アルキル基である。
【００４９】
Ｒ２は、水素又はヒドロキシル基であり、より具体的には、Ｒ２が水素である場合には、
【００５０】
【化１５】
【００５１】
であることが好ましく、Ｒ２が、ヒドロキシル基である場合には、
【００５２】
【化１６】
【００５３】
であることが好ましい。
【００５４】
一般式（Ａ）におけるＲ３は、
【００５５】
【化１７】
【００５６】
（式中、Ｒ３ａは、ヒドロキシル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、又はアセチル基である）、
【００５７】
【化１８】
【００５８】
（式中、Ｒ３ａは、前記と同じである）、又は
【００５９】
【化１９】
【００６０】
である。
【００６１】
化合物（Ａ）の具体例としては、一般式（３）：
【００６２】
【化２０】
【００６３】
一般式（４）：
【００６４】
【化２１】
【００６５】
一般式（５）：
【００６６】
【化２２】
【００６７】
一般式（６）：
【００６８】
【化２３】
【００６９】
一般式（７）：
【００７０】
【化２４】
【００７１】
で表される化合物（以下、化合物（３）〜（７））が挙げられ、これらの化合物がAChE阻害活性において、特に有用であるという点から好ましい。
【００７２】
化合物（Ａ）は、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン等から生物変換することにより代謝産物として製造され、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンの生物変換には、黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（Aspergillus niger(以下、A. nigerともいう)）が用いられる。
【００７３】
原料として用いられる(+)-(S)-ar-ターメロン（１）及び(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）は、以下のような構造式を有する化合物であって、「Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem.2010. 58, 2824-2829.」に記載される方法により、イエローバタイ（P. dasyrachis）から単離することができる。
【００７４】
【化２５】
【００７５】
【化２６】
【００７６】
生物変換する方法としては、前記(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを添加した培地中に菌糸体をさらに加えることによって行われる。
【００７７】
菌糸体としては、Aspergillus niger等のAspergillus属、Chaetonium globosum等のChaetomium属、Cladosporium cladosporioides等のCladosporium属、Gliocladium virens等のGliocladium属、Aureobasidium pullulans等のAureobasidium属、Penicillium funiculosum等のPenicillium属、Rhizopus oryzae等のRhizopus属、Fusarium属、Alternaria属、Tyromyces属、Coriolus属、Myrothecium属、Mucor属、Epicoccuｍ属、Trychoderma属、Phoma属、Geotrichum属、Monilia属等が挙げられ、これらの中で、Aspergillus属が好ましく、Aspergillus nigerがより好ましい。
【００７８】
生物変換後、生成物と菌糸体を分離し、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することにより得られる。
【００７９】
また、(+)-(S)-ar-ターメロン又は(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン等の原料を生物変換して得られる化合物において、置換基として有するカルボン酸基やヒドロキシル基を既知の反応により、エステル化、アルコキシ化、アセチル化することにより、前記化合物（Ａ）を得ることが可能であり、また、既知の塩基と反応させることによって、化合物（Ａ）の塩を得ることが可能である。
【００８０】
なお前述のように、(+)-(S)-ar-ターメロンを生物変換することによって前記化合物（３）〜（６）を製造した場合、化合物（３）〜（６）から化合物（３）を分離し、分離した化合物（３）をさらに生物変換することによって、化合物（５）及び化合物（６）を製造することも可能である。また、化合物（３）〜（６）から化合物（４）を分離し、分離した化合物（４）をさらに生物変換することによって、化合物（５）を製造することも可能である。
【００８１】
ここで、(+)-(S)-ar-ターメロン（１）を出発物質とした場合の生物変換経路を以下に示す。(+)-(S)-ar-ターメロン（１）は、生物変換によって、15位の炭素で酸化、及び7位の炭素で立体特異的に酸化され、化合物（３）が生成される。化合物（３）は、さらに生物変換により、12位の炭素で化合物（３）と同じタイプの酸化により化合物（５）が得られ、また、化合物（３）において４−メチル−フラノ環が形成されることにより化合物（６）が生成されるものと推測される（経路a）。
【００８２】
また、(+)-(S)-ar-ターメロン（１）は、生物変換によって、12位の炭素及び15位の炭素で、前記と同じようなタイプの酸化が生じ、化合物（４）が生成される。化合物（４）は、さらに生物変換によって、7位の炭素で立体特異的な酸化され化合物（５）が生成されるものと推測される(経路b)。
【００８３】
【化２７】
【００８４】
本発明の化合物（Ａ）又はその塩は、AChE阻害活性を有している。そのため、化合物（Ａ）又はその塩はそのままAChE阻害剤として用いることが可能である。
【００８５】
ACE阻害剤は、各種用途に用いることができる。例えば、AChE阻害剤を医薬品として用いる場合、哺乳動物（特に、ヒト）における老人性痴呆患症の予防薬又は治療薬、特にアルツハイマー型認知症の予防薬又は治療薬として用いられる。
【００８６】
AChE阻害剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。
【００８７】
製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、及び必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。
【００８８】
医薬製剤を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明にかかる医薬の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて、製剤学的な有効量を適宜選ぶことができる。
【００８９】
AChE阻害剤は、製剤全体に対し、通常０．０１〜１００重量％程度（好ましくは、０．１〜５重量％程度）含有していればよい。
【００９０】
また、AChE阻害剤は、例えば、清涼飲料、乳製品（加工乳、ヨーグルト）、菓子類（ゼリー、チョコレート、ビスケット、ガム、錠菓）等の各種飲食品に配合することもできる。
【実施例】
【００９１】
次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００９２】
実施例１
・黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（fungus aspergillus niger）の培養
蒸留水1L中に、ショ糖（15g）、グルコース（15g）、ポリペプトン（5g）、塩化カリウム（500mg）、硫酸マグネシウム（500mg）、リン酸二水素カリウム（1g）及び硫酸第二鉄（10mg）を含むオートクレーブした培養液を調製し、500ml三角フラスコに前記培養液を250ml添加し、さらに、４℃で寒天培地上で保持した黒色｛こくしょく｝アスペルギルスNBRC 4414 (（独）製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から購入)の胞子を添加し、培養した。培養液は、２日間インキュベーターで、28℃の温度で振とうしながら保持した。50mlペトリ皿に培養地30mlをのせ、さらに得られた菌糸体を移植させ、36〜48時間（菌糸体が培養地の表面積の60〜80％を占めるまで）培養した。
【００９３】
・(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の代謝化合物の製造
前記培養した培地に、さらにジメチルスルホキシド（DMSO）200μlに溶解させた(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を3mg添加した。なお、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)は、「Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem.2010. 58, 2824-2829.」に記載される方法により、P. dasyrachisから単離したものであり、以下に示すものである。
【００９４】
(+)-(S)-ar-ターメロン（１）;
淡黄色オイル;
[α]29D+ 63.7° (c = 1.00, CHCl3);
IR (film) cm-1: 1685, 1620;
1H-NMR (CDCl3, 700 MHz) δTM 7.10 (4H, brs, ArH), 6.02 (1H, m, H-10), 3.29 (1H, m, H-7), 2.71 (1H, dd, J = 15.5, 6.0 Hz, H-8), 2.61 (1H, dd, J = 15.5, 8.3 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-15), 2.10 (3H, s, H-13), 1.85 (3H, d, J =1.2, H-12), 1.24 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-14); 13C NMR,; （表２参照）
EIMS m/z (relative intensity) 216 (M+ 30 %), 201 (23 %), 132 (22 %), 119 (75 %), 117 (14 %), 91 (16 %), 83 (100 %), 77 (7 %), 55 (18 %);
HR-EIMS 216.1602 (M+, C15 H20O, calcd. 216.1582).
前記(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を添加した培地を28℃、静置条件下で培養し、ペトリ皿中の培地及び菌糸体を濾過することにより分離した。分離した菌糸体は、pH4にまで酸性にし、酢酸エチル30mlで3回抽出した。得られた抽出物を、無水Na2SO4によって乾燥し、減圧することによって酢酸エチルを除去した。
【００９５】
(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の代謝産物の存在を確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた。なお、ＴＬＣ分析は、プレコートされたシリカゲルプレート（60 F254）(Merck社製)を用いて行い、スポットは、バニリン硫酸塩（vanillic sulphate）試薬を散布した後、加熱することによって可視化することにより確認した。また、HPLCの条件を以下に示す。
・LC-10Ai装置（（株）島津製作所製）
・UV ディテクター(SPD-M10A)
・カラム（AR-IIカラム(4.6×250 mm) (ナカライテスク（株）製) ）
・移動層（1ml/min）（CH3CN-H2O liner gradient (0 min, 70:30; 50 min, 30:70, v/v)）
図１に、培養したA. nigerによる(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の生物変換の経時的変化を示す。図１におけるプロット（■）は、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を表し、プロット（○）は化合物（３）を表し、プロット（□）は、化合物（４）を表し、プロット（●）は化合物（５）を表し、プロット（▲）は化合物（６）を表す。
【００９６】
前記の結果より、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)を生物変換した代謝産物において、化合物（５）及び化合物(６)が主生成物であり、化合物（３）及び化合物(４)が少量、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)から生物変換されることにより得られたことが確認できた。
【００９７】
・(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の代謝産物の単離
DMSO(20 ml)に溶解させた(+)-(S)-ar-ターメロン（１）(300 mg)を上記培地に添加した。培養時間（３日間）の経過後、培地と菌糸体を濾過によって分離した。培養液をpH4まで酸性にし、酢酸エチル500 mlで3回抽出した。得られた抽出物を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、粗成生物(400 mg）を得た。抽出物をNaHCO3の5％水溶液及び酢酸エチルで分液し、酢酸エチル層を取り出し、減圧することによって乾燥して、中性分画（neutral fraction）を得た。アルカリ層を、2NのHClでpH3になるまで酸性にし、水と酢酸エチルにより抽出した。抽出物（酢酸エチル層）を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、酸性分画（acid fraction）を得た。酸性分画（acid fraction）をさらに、CH2Cl2/MeOHでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200〜300メッシュのシリカゲル60（Merck社製））により精製することにより、２つの分画を得た。分画したフラクションを、さらに、semi-preparative reversed-phase HPLC（CH3CN-H2O (60:40, v/v + 0.05% CH3COOH)）によって、分画することによって、化合物（３）(30 mg)、化合物（４）(25mg)、化合物（５）(90 mg)及び化合物（６）(66 mg)をそれぞれ得た。
【００９８】
・化合物（３）の同定
化合物（３）について、HR-FABMS、ＩＲスペクトル、1H NMR、13C NMR、HMBC、及び旋光度測定により同定した。なお、HR-FABMSは、日本電子（株）製のJEOL the Tandem MS station JMS-700を用い、IRスペクトルは日本分光（株）製のFT/IR-470 Plus Fourier Transform Infrared Spectrometerを用い、1H- and 13C-NMR, COSY, heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC), heteronucler multiple bond coherence (HMBC), NOESYは、日本分光（株）製のJEOL ECA spectrometers （600 MHz 及び700 MHz の1H NMR並びに 150 MHz and 175 MHz の13C-NMR）によって、旋光度は、日本分光（株）製のCo. LTDDIP-1000によってそれぞれ測定した。
【００９９】
HR-FABMSにより測定した[M+H] +は、m/z 263.1284 (calcd. 263.3105 for C15H19O4)であり、親基質である(+)-(S)-ar-ターメロン(１)より４６atomic mass unit（amu）大きく、C15H18O4であると示唆される。
【０１００】
ＩＲスペクトル測定により、3440ｃｍ−１、及び1685 cm-1に吸収ピークが観測された。これにより、化合物（３）には、ヒドロキシル基及びカルボニル基が存在することが確認できた。
【０１０１】
(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の1H NMR と比較して、化合物（３）の1H NMRは、15位のメチル基と7位のメチン基のピークの消失が確認できた。
【０１０２】
化合物（３）と(+)-(S)-ar-ターメロン(１)との13C NMRの比較により、13個のピークは互いに類似したケミカルシフトを示した。残りの２つの１３Ｃのケミカルシフトにおいて、化合物（３）のピークには、オキシ基を有する四級炭素（δC 73.7）と、カルボン酸基の炭素(δC170.4)が確認できた。
【０１０３】
13C NMRにより、カルボン酸基の15位の炭素でカップリングされた芳香族化合物の4位の四級炭素のupfield shift及び芳香族化合物の1位の四級炭素のdownfield shiftが観測され、化合物（３）においてα,β-共役カルボキル基が存在することを示唆した。
【０１０４】
化合物（３）のHMBC測定によって、8位の炭素のプロトン(δH 3.17及び2.89)／7位の炭素、14位のプロトン(δH 1.52)/7位の炭素との間のHMBCにより、8位の炭素において２つの炭素との結合を有し、また、2位、6位の炭素のプロトン(δH 7.55)／7位の炭素との間のHMBCにより、7位の炭素において３つの炭素との結合を有することを確認した。
【０１０５】
なお、プロトンと炭素の同定は、H-H COSY, HSQC及びHMBCにより確認できた。
【０１０６】
以上の結果から、化合物（３）の構造は、新規化合物である(+)-7-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが確認できた。
【０１０７】
次に、化合物（３）の7位の炭素の絶対配置について、「Reiter, M.; Turner, H.; Gouverneur, V. Chem. Eur. J. 2006, 12, 7190-7203. 」に記載される方法によって同定した。化合物（３）を以下に示すテトラヒドロ-2-(4-カルボメトキシフェニル)-2,6,6-トリメチル-4H-ピラン-4-オン(８)へと変換した後、ＣＤスペクトル測定を行った。その結果、S体であることを特定した。なお、CDスペクトルは、（株）堀場製作所製のHoriba SEPA-200 polarimeterを用いて測定した。CDスペクトルにより、化合物（８）は、負のコットン効果を示した[262 nm (△e−7.67), 290 nm (△e−40.7), 355 nm (△e−2.01)]。
【０１０８】
【化２８】
【０１０９】
以上より、化合物（３）は、(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが同定できた。
【０１１０】
化合物（３）（(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸）;
無色粉末;
[α]24.1D+ 5.93° (c = 0.30, CHCl3);
IR (KBr) νmax: 3440, 1685 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR; （表１及び２参照）
HR-FABMS m/z 263.1284 [M+H]+ (calcd. C15H19O4, for 263.1283).
【０１１１】
・化合物（４）の同定
化合物（４）について、以下の方法により同定した。
【０１１２】
HR-FABMSより、親基質である(+)-(S)-ar-ターメロン(１)より４６amu大きく、分子式C15H18O4を有していることが示唆される。
【０１１３】
化合物（４）のＩＲスペクトルは、3392 cm-1及び1689 cm-1であり、ヒドロキシル基及びカルボニル基の存在が確認できた。(+)-(S)-ar-ターメロン(１)の1H NMRとの比較で、CH2OH基の存在及び２つのメチル基の消失が確認できた。このことから、化合物（４）が、(+)-(S)-ar-ターメロン(１)のヒドロキシル化によって生成されたことを示唆している。
【０１１４】
1H NMR 及び13C NMRの測定結果より、化合物（３）及び化合物（４）は類似の化合物であることが確認できた。1H NMR 及び13C NMRの測定結果より、化合物（３）と同様、化合物（４）においても15位の炭素にカルボキシル基を有することが確認できた。
【０１１５】
核オーバーハウザー効果（NOE）の測定で、化合物（４）は、１０位のプロトン(δH6.43)と12位のプロトン(δH4.04)との間でNOEが観測された。
【０１１６】
以上の結果より、化合物（４）の構造が、(+)-(10E)-12-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが同定できた。
化合物（４）（(+)-(10E)-12-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸）;
無色オイル;
[α]28.4D+ 48.6° (c = 0.34, Acetone);
IR (film) νmax: 3392, 1689 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR;（表１及び２参照）
HR-FABMS m/z 263.1287 [M+H]+ (calcd. C15H19O4, for 263.1283).
【０１１７】
・化合物（５）の同定
化合物（５）について、以下の方法により同定した。
【０１１８】
HR-FABMSより、親基質である(+)-(S)-ar-ターメロン(１)より62 amu大きく、分子式C15H18O5を有していることが示唆される。
【０１１９】
1H NMR 及び13C NMRの測定結果より、化合物（５）はメチル基の消失及び12位の炭素(δH 4.02)の付加的なdownfield shiftの出現以外は、化合物（３）と類似した結果となった。このことから、12位の炭素であるメチル基が、選択的にヒドロキシメチル基へとヒドロキシル化していることがわかった。
【０１２０】
NOE実験で、化合物（５）は、10位の炭素のプロトン(δH 6.43)と12位の炭素のプロトン(δH 4.02)との間に、NOEが観測された（図３参照）。
【０１２１】
以上の結果より、化合物（５）の構造が、(+)-(10E)-7,12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸であることが同定できた。
【０１２２】
(+)-(10E)-(7S)-7,12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸（５）;
無色オイル;
[α]27.0D+ 2.04° (c = 1.37, Acetone);
IR (film) νmax: 3395, 1692 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR（表１及び２参照）; HR-FABMS m/z 279.1234 [M+H]+ (calcd. C15H19O5, for 279.1232).
【０１２３】
・化合物（６）の同定
化合物（６）について、以下の方法により同定した。
【０１２４】
HR-FABMSより、分子式C15H16O4を有することを示した。
【０１２５】
1H NMRの測定結果より、化合物（３）及び化合物（６）は類似の化合物であることが確認できた。化合物（３）と化合物（６）との1H NMRの比較により、δH1.87の13位の炭素のメチルプロトンが消失し、オレフィンのプロトン(δH 7.06)が現れたことが確認できた。以上の結果より、化合物（６）は、15位の炭素に、α,β−共役カルボキシ基を有していることが確認できた。
【０１２６】
また、化合物（３）と化合物（６）との13C NMRの比較により、9位の炭素においてケトンシグナルの消失を示した。
【０１２７】
HMBC測定により、(i)8位の炭素のプロトン/1、7、9、10及び14位の炭素のHMBC、(ii)12位の炭素のプロトン/10、11及び13位の炭素のHMBC、(iii)13位の炭素のプロトン/9、10及び11位の炭素のHMBCの関係を示した。
【０１２８】
以上のHMBCの関係の結果より、化合物（６）には、4-メチル-フラノ環の存在が確認できた（図３）。また、化合物（６）の構造が、(+)-15-カルボキシ-9,13-エポキシ-7-ヒドロキシ-9,13-デヒドロ-ar-クルクメンであることが分かった。
【０１２９】
化合物（６）（(+)-15-カルボキシ-9,13-エポキシ-(7S)-ヒドロキシ-9,13-デヒドロ-ar-クルクメン）;
無色粉末;
[α]24.2D+ 78.1° (c = 0.53, CHCl3);
IR (KBr)νmax: 3562, 1682 cm-1;
1H NMR 及び13C NMR;（表１及び２参照）
HR-FABMS m/z 261.1154 [M+H]+ (calcd. C15H17O4, for 261.1126).
【０１３０】
実施例２
(+)-(S)-ar-ターメロン(１)に代えて、実施例１と同様に、化合物（３）である(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸及び化合物（４）である(+)-(10E)-2-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸を用いた以外は、実施例１と同様に、培養したA. nigerを用いて同じ生物変換をおこなった。
【０１３１】
培養後、化合物（３）である(+)-(7S)-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸からは化合物（５）及び化合物（６）が、化合物（４）である(+)-(10E)-2-ヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸からは化合物（５）がそれぞれ酢酸エチルの抽出により単離された。
【０１３２】
両方の化合物（５）は、実施例１において単離された(+)-(10E)-(7S)-7,12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸と同様の旋光度を示した。
【０１３３】
前述のとおり、7位の炭素において、化合物（５）及び化合物（６）の絶対配置は、S体であることが確認できた。以上より、化合物（５）が(+)-(10E)-(7S)-12-ジヒドロキシ-デヒドロ-ar-トドマツ酸、及び化合物（６）が(+)-15-カルボキシ-9,13-エポキシ-(7S)-ヒドロキシ-9,13-デヒドロ-ar-クルクメンであることが同定できた。
【０１３４】
実施例３
実施例１と同様の方法で培養した培地に、さらにDMSO１８ｍｌに溶かした(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）２７０ｍｇを添加した。なお、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン(２)は、「Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem. 2010. 58, 2824-2829.」に記載される方法により、P. dasyrachisから単離したものであり、以下に示すものである。
【０１３５】
(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン(２);
無色オイル;
[α]29D+ 32.1°(c = 1.01, CHCl3);
IR (film) cm-1: 1712, 1514;
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.10 (4H, brs, ArH), 3.28 (1H, ddd, J = 8.0, 7.2, 6.3 Hz, H-7), 2.68 (1H, dd, J = 16.1, 6.3 Hz, H-8), 2.58 (1H, dd, J = 16.1, 8.0 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-15), 2.19 (2H, m, H-10), 2.08 (1H, m, H-11), 1.23 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-14), 0.85 (6H, d, J = 4.6 Hz, H-12,13);
13C NMR; （表２参照）
EIMS m/z (相対強度) 218 (M+ 26 %), 203 (25 %), 161 (19 %), 119 (100 %), 105 (13 %), 91 (13 %), 85 (13 %), 57 (18 %);
HR-EIMS 218.1777 (M+, C15H22O, calcd. 218.1741).
【０１３６】
・(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)の化合物（７）の単離
ＤＭＳＯに溶解させた(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)を実施例１で調製した培地に添加した。培養時間（3日間）の経過後、培地と菌糸体を濾過によって分離した。培養液をpH4まで酸性にし、酢酸エチル500mlで3回抽出した。得られた抽出物を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、粗成生物(350mg)を得た。
【０１３７】
図２に、培養したA. nigerによる(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)の生物変換の経時的変化を示す。図２におけるプロット（■）は、(+)-(S)-ar-ジヒドロ-ターメロン(２)を表し、プロット（●）は化合物（７）を表す。
【０１３８】
抽出物をNaHCO3の5％水溶液及び酢酸エチルで分液し、酢酸エチル層を取り出し、減圧することによって乾燥して、中性分画（neutral fraction）（123mg）を得た。アルカリ層を、2NのHClでpH3になるまで酸性にし、水と酢酸エチルにより抽出した。抽出物（酢酸エチル層）を、減圧することによって酢酸エチルを除去し、酸性分画（acid fraction）（190mg）を得た。酸性分画（acid fraction）をさらに、CH2Cl2/MeOHでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200〜300メッシュのシリカゲル60（Merck社製））により精製することにより、２つの分画を得た。分画したフラクションを、さらに、semi-preparative reversed-phase HPLC（CH3CN-H2O (60:40, v/v + 0.05% CH3COOH)）によって分画し、化合物（７）を得た。
【０１３９】
・化合物（７）の同定
HR-FABMSにより、化合物（７）は分子式C15H20O5であることが同定できた。
【０１４０】
化合物（７）の1H NMR データは、10位、11位の炭素の二重結合が消失し、10位、11位の炭素のプロトンが観測できた以外は、化合物（３）と類似した。13C NMRの10位、11位のupfield shiftより、二重結合の消失及びヒドロキシル基の存在が示唆された。
【０１４１】
化合物（７）のHMBC測定により、11位の炭素において、ヒドロキシル基を有することを示唆する11位の炭素(10位、12位及び13位の炭素のプロトンとともに)に対するHMBC関係を示した。
【０１４２】
以上の結果より、化合物（７）が(+)-7,11-ジヒドロキシ-ar-トドマツ酸であることを確認した。
【０１４３】
化合物（７）（(+)-7,11-ジヒドロキシ-ar-トドマツ酸）;
無色オイル;
[α]25.2D-7.11° (c =1.62, CHCl3);
IR (film)νmax: 3431, 1695 cm-1;
1H NMR 及び 13C NMR（表１及び２参照）;
HR-FABMS m/z 281.1400 [M+H]+ (calcd. C15H21O5, for 281.1389).
表１に、(+)-(S)-ar-ターメロン（１）、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロン（２）、及び化合物（３）〜（７）の１H NMRスペクトルのデータを表１に、13C NMRスペクトルのデータを表２に示す。
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
試験例
ACｈE阻害試験法
AChE阻害試験は、Fujiwara, M.; Yagi, N.; Miyazawa, M. J. Agric. Food Chem. 2010. 58, 2824-2829.の方法に従って行った。
【０１４７】
ヒト赤血球AChE 溶液(0.037 unit/mL in 0.01 M リン酸緩衝液, pH 7.4)20μl、阻害剤（化合物（３）〜（７）の各メタノール水溶液）２０μｌ、発色剤（５-５’ジチオビス（２-ニトロ安息香酸）（DTNB）、(0.15 mM in 0.1 M リン酸緩衝液, pH 7.4)）200 ml、基質（アセチルコリン アイオダイド（ATC）水溶液(最終濃度0.25 mM)）30 mlを含むウェルをそれぞれ調製した。
【０１４８】
なお、コントロールウェルとして、阻害剤に代えてメタノールを用いて前記のウェルを調製した。
【０１４９】
実験方法としては、基質を添加し終えた時間を起点とし、前記混合物を室温で１５分間インキュベートし、混合物の405nmにおける吸光度を測定した。AChE活性の阻害割合を以下の式によって算出した。なお、吸収光度は、（株）日立製作所製のU-2000A UV-Vis spectrophotometerによるUVスペクトルを測定することによって求めた。
【０１５０】
Ｉ(％) ＝ ｛（Ａcontrol − Ａsample) ／ Ａcontrol} × １００％
式中、Ａsampleは、各阻害剤を含むサンプルの各吸光度を表し、Ａcontrolはコントロールウェルの吸光度を表す。なお、各サンプルについて少なくとも３回測定を行いその平均値を示した。測定結果を図４に示す。図４に示すように、化合物３〜７は、強いAChE阻害活性値を示していることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ａ）：
【化１】
（式（Ａ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１〜３の低級アルキル基であり、Ｒ２は、水素又はヒドロキシル基であり、Ｒ３は、
【化２】
（式中、Ｒ３ａは、ヒドロキシル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、又はアセチル基である）、
【化３】
（式中、Ｒ３ａは、前記と同じである）、又は
【化４】
である）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
一般式（Ａ）が、式：
【化５】
、又は
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３は、前記式と同じである）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
一般式（Ａ）が、一般式（３）：
【化７】
一般式（４）：
【化８】
一般式（５）：
【化９】
又は
一般式（６）：
【化１０】
で表される請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式（７）：
【化１１】
で表される請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を有効成分として含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する老人性認知症の予防又は治療薬。
【請求項７】
請求項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型認知症の予防又は治療薬。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
請求項１、２又は４に記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項１０】
黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌により生物変換する請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１】
一般式（Ａ）：
【化１】
（式（Ａ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１〜３の低級アルキル基であり、Ｒ２は、水素又はヒドロキシル基であり、Ｒ３は、
【化２】
（式中、Ｒ３ａは、ヒドロキシル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、又はアセチル基である）、
【化３】
（式中、Ｒ３ａは、前記と同じである）、又は
【化４】
である）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
一般式（Ａ）が、式：
【化５】
、又は
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３は、前記式と同じである）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
一般式（Ａ）が、一般式（３）：
【化７】
一般式（４）：
【化８】
一般式（５）：
【化９】
又は
一般式（６）：
【化１０】
で表される請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式（７）：
【化１１】
で表される請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はその塩を有効成分として含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する老人性認知症の予防又は治療薬。
【請求項７】
請求項５に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型認知症の予防又は治療薬。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
請求項１、２又は４に記載の化合物又はその塩の製造方法であって、(+)-(S)-ジヒドロ-ar-ターメロンを生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項１０】
黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌により生物変換する請求項８又は９に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−２２５４７８（Ｐ２０１１−２２５４７８Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９５９９６（Ｐ２０１０−９５９９６）
【出願日】平成２２年４月１９日（２０１０．４．１９）
【出願人】（３９９０９１１２０）株式会社ピカソ美化学研究所 (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１９日（２０１０．４．１９）
【出願人】（３９９０９１１２０）株式会社ピカソ美化学研究所 (29)
【Ｆターム（参考）】
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