新規トリプシンインヒビター
【課題】 トリプシンに対し、強力な阻害作用を有する新規なトリプシンインヒビターを提供する。
【解決手段】 シロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）の抽出物の分子量７０００〜８０００の画分からなるトリプシンインヒビターとする。
【解決手段】 シロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）の抽出物の分子量７０００〜８０００の画分からなるトリプシンインヒビターとする。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）由来の新規なトリプシンインヒビターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】プロテアーゼインヒビターは、動、植物界にわたって広く存在することが知られている。例えば、動物界においては、ラットの肝臓や表皮、ヒトの白血球や尿、ウシの初乳などの中に見出されているし、植物界においては、大豆、瓜類などの中に見出されている。これらのプロテアーゼインヒビターは、血液凝固のような生理活性作用の制御因子としての機能を有し、脳梗塞、心筋梗塞などの血栓性疾患の治療、予防に用いられている。このプロテアーゼインヒビターの中で、トリプシンに対して強い阻害活性を有するものとしては、これまでウシ膵臓塩基性トリプシンインヒビター［「ジャーナル・オブ・ジェネラル・フィジオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）」，第１９巻，第９９１ページ（１９３６）］、大豆トリプシンインヒビター［同誌，第２９巻，第１４９ページ（１９４６）］、ウシ初乳中のトリプシンインヒビター（「フェデレーション・プロシーディング（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ．）」，第９巻，第１９４ページ（１９５０）］などが知られていたが、最近、牛乳及びホエーに含有される分子量６００００〜７００００の範囲の酸性タンパク質がトリプシンに対して強い阻害活性を有することが見出された（特開平７−８２２９６号公報）。他方、植物由来のトリプシンインヒビターとしては、前記した大豆由来のもののほか、最近苦瓜又はその種子などからの熱湯抽出物が加熱乾燥して得られる粉末又は顆粒が見出されている（特開平８−１４３４６７号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トリプシンに対し、強力な阻害作用を有する新規なトリプシンインヒビターを提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、植物由来の新規なトリプシンインヒビターを得るために、鋭意研究を重ねた結果、日本産のシロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）の抽出物から得られる分子量７０００〜８０００の画分が強力なトリプシンの阻害作用を示すことを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、シロナタマメの抽出物の分子量７０００〜８０００の画分からなるトリプシンインヒビターを提供するものである。これまでのトリプシンインヒビターは、通常１００００以上の分子量を有しているのに対し、本発明のトリプシンインヒビターは、分子量７０００〜８０００という低分子量である上に、二量体構造を有するという点で、明らかに差異が認められる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のトリプシンインヒビターは、例えばシロナタマメ種子を粉砕し、脱脂後、脱イオン水を加えてかきまぜて全タンパク質を抽出し、硫酸アンモニウム飽和溶液により濃縮したのち、ゲルろ過、陰イオン交換樹脂及び逆相カラムを用いたクロマトグラフィーにより分離し、分子量７０００〜８０００の画分を分取することによって得ることができる。この際の脱イオン水による抽出は、弱酸性条件下２〜５℃の温度において１０〜３０時間かきまぜることによって行うのが好ましい。ゲルろ過、陰イオン交換樹脂及び逆相クロマトグラフィーにより、さらに細かく分画すると、分子量７８１０〜７８２０、７９２５〜７９３５及び７９１５〜７９２３の３つの活性画分が得られる。これらの活性画分はいずれも強力なトリプシン阻害作用を示す。
【０００７】
【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【０００８】なお、例中のトリプシンインヒビター活性の測定は次の方法により行った。すなわち、２０ｍＭ−塩化カルシウムを含む１ｍＭ−塩酸中に所定量のトリプシンを溶解し、濃度１ｍｇ／ｍｌのトリプシン溶液を調製した。別に、５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）を用いて０．５ｍＭ−ベンゾイルＬ‐アルギニン‐ｐ‐ニトロアニリドを調製し、基質溶液とした。試料（プロテアーゼインヒビター）の水溶液１０μｌに、上記のトリプシン溶液１５μｌを添加後、３７℃で１０分間インキュベーションを行い、さらに上記の基質溶液１５０μｌを添加して３０分間インキュベーションを行った。次いで、３０％酢酸５０μｌを加えて反応を停止させたのち、４１５ｎｍの吸光度を測定した。この際、反応はすべて９６穴マイクロプレート上で行い、吸光度はマイクロプレートリーダで測定した。
【０００９】実施例シロナタマメ種子を粉砕し、石油エーテルで処理して脱脂し、乾燥することにより、シロナタマメ種子の脱脂粉末を得た。このようにして得たシロナタマメ種子の脱脂粉末１００ｇに、脱イオン水５００ｍｌを添加し、塩酸を加えてｐＨ４．０に調整したのち、４℃において１夜かきまぜることにより、全タンパク質の抽出を行った。次いで、この抽出液５００ｍｌに、硫酸アンモニウム粉末４５０ｇを加えてかきまぜたのち、全タンパクを沈殿として回収した。
【００１０】次に、このようにして得た全タンパクの沈殿物を少量の脱イオン水に溶解後、脱イオン水及び０．２Ｍ−塩化ナトリウム含有リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．１）を用いて、それぞれ２４時間透析処理したのち、セントリプラス（アミコン社製）を用いて１０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液の４ｍｌを分取し、上記リン酸緩衝溶液で平衡化したハイロード２６／６０スーパーデックス２００（ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）カラム（アマーシャム・ファルマシア社製、２６×６００ｍｍ）に、流速２ｍｌ／分で通し、上記リン酸緩衝溶液を溶出バッファーとして用いて溶出することにより、ゲルろ過した。このようにして得た溶出パターンを図１に示す。各画分についてトリプシンインヒビター活性を測定したところ、６０から６７本目の画分に活性が認められたので、この画分を回収した。
【００１１】次いで、この画分を５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に対して２４時間透析後、セントリプラスを用いて１０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液５ｍｌを分取し、トリス塩酸緩衝溶液で平衡化したＵＮＯ−Ｑ１カラム（バイオ−ラッド社製、７×３５ｍｍ）に流速１ｍｌ／分で通し、５０ｍＭ−トリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）及び０．５Ｍ−塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ−トリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）を溶出バッファーとして用いて溶出することにより、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。この結果、図２に示す溶出パターンが得られた。この際、溶出は０．５Ｍ−塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ−トリス塩酸溶液の濃度を鎖線で示すように直線的に増加させて行った。各画分について、トリプシンインヒビター活性を測定したところ、４５〜４８本目の画分に活性が認められたので、これらの画分を回収し、さらに逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付して精製した。
【００１２】すなわち、これらの画分を遠心エバポレータで乾固したのち、０．１％−トリフルオロ酢酸に溶解し、それぞれ１０μｌずつを０．１％−トリフルオロ酢酸で平衡化したＲＰ−ＨＰＬＣ−プアシル（Ｐｕｒｅｓｉｌ）Ｃ１８−１２０Åカラム（ウォーターズ社製、４．６×１５０ｍｍ）に流速０．５ｍｌ／分で通し、０．１％−トリフルオロ酢酸及び０．１％−トリフルオロ酢酸２０％とアセトニトリル８０％との混合物を溶出バッファーとして用いて溶出することにより、逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。この結果を図３に示す。この際、溶出はトリフルオロ酢酸とアセトニトリルの混合物の濃度を図３の鎖線に示すように、直線的に増加させて行った。このようにして、図３に星印で示したように、４５画分と４６画分の合併画分からはＡ、４７画分からはＢ、４８画分からはＣのトリプシンインヒビターが得られた。これらのトリプシンインヒビターの分子量を、ＴＯＦ−ＭＳで測定したところ、Ａは７８１３、Ｂは７９２９、Ｃは７９１９であった。
【００１３】
【発明の効果】本発明によれば、シロナタマメから強力なトリプシン阻害作用を示す新規なトリプシンインヒビターが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シロナタマメ抽出物のゲルろ過による溶出パターン
【図２】 ゲルろ過により得られた活性画分の陰イオン交換クロマトグラム
【図３】 陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分の逆相ＨＰＬＣの溶出パターン
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）由来の新規なトリプシンインヒビターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】プロテアーゼインヒビターは、動、植物界にわたって広く存在することが知られている。例えば、動物界においては、ラットの肝臓や表皮、ヒトの白血球や尿、ウシの初乳などの中に見出されているし、植物界においては、大豆、瓜類などの中に見出されている。これらのプロテアーゼインヒビターは、血液凝固のような生理活性作用の制御因子としての機能を有し、脳梗塞、心筋梗塞などの血栓性疾患の治療、予防に用いられている。このプロテアーゼインヒビターの中で、トリプシンに対して強い阻害活性を有するものとしては、これまでウシ膵臓塩基性トリプシンインヒビター［「ジャーナル・オブ・ジェネラル・フィジオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）」，第１９巻，第９９１ページ（１９３６）］、大豆トリプシンインヒビター［同誌，第２９巻，第１４９ページ（１９４６）］、ウシ初乳中のトリプシンインヒビター（「フェデレーション・プロシーディング（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ．）」，第９巻，第１９４ページ（１９５０）］などが知られていたが、最近、牛乳及びホエーに含有される分子量６００００〜７００００の範囲の酸性タンパク質がトリプシンに対して強い阻害活性を有することが見出された（特開平７−８２２９６号公報）。他方、植物由来のトリプシンインヒビターとしては、前記した大豆由来のもののほか、最近苦瓜又はその種子などからの熱湯抽出物が加熱乾燥して得られる粉末又は顆粒が見出されている（特開平８−１４３４６７号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トリプシンに対し、強力な阻害作用を有する新規なトリプシンインヒビターを提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、植物由来の新規なトリプシンインヒビターを得るために、鋭意研究を重ねた結果、日本産のシロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）の抽出物から得られる分子量７０００〜８０００の画分が強力なトリプシンの阻害作用を示すことを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、シロナタマメの抽出物の分子量７０００〜８０００の画分からなるトリプシンインヒビターを提供するものである。これまでのトリプシンインヒビターは、通常１００００以上の分子量を有しているのに対し、本発明のトリプシンインヒビターは、分子量７０００〜８０００という低分子量である上に、二量体構造を有するという点で、明らかに差異が認められる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のトリプシンインヒビターは、例えばシロナタマメ種子を粉砕し、脱脂後、脱イオン水を加えてかきまぜて全タンパク質を抽出し、硫酸アンモニウム飽和溶液により濃縮したのち、ゲルろ過、陰イオン交換樹脂及び逆相カラムを用いたクロマトグラフィーにより分離し、分子量７０００〜８０００の画分を分取することによって得ることができる。この際の脱イオン水による抽出は、弱酸性条件下２〜５℃の温度において１０〜３０時間かきまぜることによって行うのが好ましい。ゲルろ過、陰イオン交換樹脂及び逆相クロマトグラフィーにより、さらに細かく分画すると、分子量７８１０〜７８２０、７９２５〜７９３５及び７９１５〜７９２３の３つの活性画分が得られる。これらの活性画分はいずれも強力なトリプシン阻害作用を示す。
【０００７】
【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【０００８】なお、例中のトリプシンインヒビター活性の測定は次の方法により行った。すなわち、２０ｍＭ−塩化カルシウムを含む１ｍＭ−塩酸中に所定量のトリプシンを溶解し、濃度１ｍｇ／ｍｌのトリプシン溶液を調製した。別に、５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）を用いて０．５ｍＭ−ベンゾイルＬ‐アルギニン‐ｐ‐ニトロアニリドを調製し、基質溶液とした。試料（プロテアーゼインヒビター）の水溶液１０μｌに、上記のトリプシン溶液１５μｌを添加後、３７℃で１０分間インキュベーションを行い、さらに上記の基質溶液１５０μｌを添加して３０分間インキュベーションを行った。次いで、３０％酢酸５０μｌを加えて反応を停止させたのち、４１５ｎｍの吸光度を測定した。この際、反応はすべて９６穴マイクロプレート上で行い、吸光度はマイクロプレートリーダで測定した。
【０００９】実施例シロナタマメ種子を粉砕し、石油エーテルで処理して脱脂し、乾燥することにより、シロナタマメ種子の脱脂粉末を得た。このようにして得たシロナタマメ種子の脱脂粉末１００ｇに、脱イオン水５００ｍｌを添加し、塩酸を加えてｐＨ４．０に調整したのち、４℃において１夜かきまぜることにより、全タンパク質の抽出を行った。次いで、この抽出液５００ｍｌに、硫酸アンモニウム粉末４５０ｇを加えてかきまぜたのち、全タンパクを沈殿として回収した。
【００１０】次に、このようにして得た全タンパクの沈殿物を少量の脱イオン水に溶解後、脱イオン水及び０．２Ｍ−塩化ナトリウム含有リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．１）を用いて、それぞれ２４時間透析処理したのち、セントリプラス（アミコン社製）を用いて１０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液の４ｍｌを分取し、上記リン酸緩衝溶液で平衡化したハイロード２６／６０スーパーデックス２００（ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）カラム（アマーシャム・ファルマシア社製、２６×６００ｍｍ）に、流速２ｍｌ／分で通し、上記リン酸緩衝溶液を溶出バッファーとして用いて溶出することにより、ゲルろ過した。このようにして得た溶出パターンを図１に示す。各画分についてトリプシンインヒビター活性を測定したところ、６０から６７本目の画分に活性が認められたので、この画分を回収した。
【００１１】次いで、この画分を５０ｍＭ−トリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に対して２４時間透析後、セントリプラスを用いて１０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液５ｍｌを分取し、トリス塩酸緩衝溶液で平衡化したＵＮＯ−Ｑ１カラム（バイオ−ラッド社製、７×３５ｍｍ）に流速１ｍｌ／分で通し、５０ｍＭ−トリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）及び０．５Ｍ−塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ−トリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）を溶出バッファーとして用いて溶出することにより、陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。この結果、図２に示す溶出パターンが得られた。この際、溶出は０．５Ｍ−塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ−トリス塩酸溶液の濃度を鎖線で示すように直線的に増加させて行った。各画分について、トリプシンインヒビター活性を測定したところ、４５〜４８本目の画分に活性が認められたので、これらの画分を回収し、さらに逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付して精製した。
【００１２】すなわち、これらの画分を遠心エバポレータで乾固したのち、０．１％−トリフルオロ酢酸に溶解し、それぞれ１０μｌずつを０．１％−トリフルオロ酢酸で平衡化したＲＰ−ＨＰＬＣ−プアシル（Ｐｕｒｅｓｉｌ）Ｃ１８−１２０Åカラム（ウォーターズ社製、４．６×１５０ｍｍ）に流速０．５ｍｌ／分で通し、０．１％−トリフルオロ酢酸及び０．１％−トリフルオロ酢酸２０％とアセトニトリル８０％との混合物を溶出バッファーとして用いて溶出することにより、逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。この結果を図３に示す。この際、溶出はトリフルオロ酢酸とアセトニトリルの混合物の濃度を図３の鎖線に示すように、直線的に増加させて行った。このようにして、図３に星印で示したように、４５画分と４６画分の合併画分からはＡ、４７画分からはＢ、４８画分からはＣのトリプシンインヒビターが得られた。これらのトリプシンインヒビターの分子量を、ＴＯＦ−ＭＳで測定したところ、Ａは７８１３、Ｂは７９２９、Ｃは７９１９であった。
【００１３】
【発明の効果】本発明によれば、シロナタマメから強力なトリプシン阻害作用を示す新規なトリプシンインヒビターが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シロナタマメ抽出物のゲルろ過による溶出パターン
【図２】 ゲルろ過により得られた活性画分の陰イオン交換クロマトグラム
【図３】 陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分の逆相ＨＰＬＣの溶出パターン
【特許請求の範囲】
【請求項１】 シロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）の抽出物の分子量７０００〜８０００の画分からなるトリプシンインヒビター。
【請求項１】 シロナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）の抽出物の分子量７０００〜８０００の画分からなるトリプシンインヒビター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０００−８６５３０（Ｐ２０００−８６５３０Ａ）
【公開日】平成１２年３月２８日（２０００．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１０−２７９３０２
【出願日】平成１０年９月１６日（１９９８．９．１６）
【出願人】（０００００１１４４）工業技術院長 (75)
【指定代理人】
【識別番号】２２０１０００１４
【氏名又は名称】工業技術院九州工業技術研究所長
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１２年３月２８日（２０００．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１０年９月１６日（１９９８．９．１６）
【出願人】（０００００１１４４）工業技術院長 (75)
【指定代理人】
【識別番号】２２０１０００１４
【氏名又は名称】工業技術院九州工業技術研究所長
【Ｆターム（参考）】
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