新規フェノール性２量体化合物
【課題】優れた抗癌活性を有する新規フェノール性２量体化合物、その効率的で安全な製造方法、並びに前記新規フェノール性２量体化合物を有効成分として含有する抗癌剤、食品、医薬品、及び医薬部外品を提供する。
【解決手段】ｐ−クマル酸とフェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより製造される下記（１）で表される新規フェノール性２量体化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【解決手段】ｐ−クマル酸とフェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理することにより製造される下記（１）で表される新規フェノール性２量体化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する新規フェノール性２量体化合物及びその製造方法、前記新規フェノール性２量体化合物を含む抗癌剤、食品、医薬品又は医薬部外品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｐ−クマル酸とフェルラ酸は共に植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となり、天然界に比較的多く存在する成分である。ｐ−クマル酸としては、プラムをはじめとして、多くの果物の果実や果皮、プロポリス等にも含まれていることが知られている。一方、フェルラ酸は米糠やジャガイモの皮層部に多く含まれている。これらは全て食経験があり人に対する安全性も高い成分である。
【０００３】
ｐ−クマル酸については、その生理機能に関連した先行技術がある。例えば、ｐ−クマル酸をはじめ、桂皮酸類を有効成分とする抗ヘリコバクター・ピロリ剤（特許文献１）、フェルラ酸及び／又はｐ−クマル酸を有効成分とする皮膚改善剤（特許文献２）、クマル酸をはじめ、プロポリスの抽出物に含まれる桂皮酸類を有効成分とする血管新生抑制剤（特許文献３）が挙げられる。フェルラ酸についても、その生理機能に関連した先行技術がある。例えば、フェルラ酸を有効成分とする細胞分化促進剤（特許文献４）、フェルラ酸を有効成分とする美白用皮膚外用薬（特許文献５）、フェルラ酸を有効成分とする酸化防止剤（特許文献６）、フェルラ酸とニコチン酸アミドからなる魚卵の発色助剤（特許文献７）、フェルラ酸を有効成分とする抗菌剤（特許文献８）、フェルラ酸のアルツハイマー病予防効果（非特許文献１）が知られている。
【０００４】
また、ｐ−クマル酸誘導体に関連した先行技術がある。例えば、クマル酸を化学合成させたリグニン類を有効成分とする抗菌剤（特許文献９）、カフェイン酸アミド誘導体又はエステル誘導体を有効成分とするアディポネクチン産生増強剤（特許文献１０）、ｐ−クマル酸二量体を原料とした抗菌剤であるベンゾフランカルボキサミド誘導体の合成方法（特許文献１１）が挙げられる。
また、ｐ−クマル酸誘導体は、植物中にも多く含まれていることから、リンゴ、ナシ又はモモの未熟果実の果実ポリフェノールとして、ｐ−クマル酸誘導体等を含む酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤（特許文献１２）が挙げられる。また、フェルラ酸誘導体に関連した先行技術としては、例えば、フェルラ酸エステル誘導体を有効成分とする紫外線吸収剤（特許文献１３）、フィトステロール類のフェルラ酸エステルを有効成分とする皮膚外用薬（特許文献１４）が知られている。
【０００５】
また、ｐ−クマル酸、フェルラ酸、それらの誘導体は、優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術の提案もなされている。ｐ−クマル酸の製造方法の例としては、組み換え体を用いた微生物によるｐ−ヒドロキシ桂皮酸（ｐ−クマル酸）等の製造方法（特許文献１５）が示される。フェルラ酸の製造方法の例としては、バニリンとマロン酸の縮合反応による製造（非特許文献２）、米糠からの製造方法（特許文献１６）、オイゲノールを原料とした菌体での製造法（特許文献１７）、コニフェリルアルデヒドからの酵素での製造法（特許文献１８）等が知られている。
【０００６】
以上のように、原料としての、ｐ−クマル酸、フェルラ酸及びそれらの誘導体や、これらの化合物の製造方法は多数提案されているが、ｐ−クマル酸、フェルラ酸及びそれらの誘導体を用いた更なる新規素材の開発や素材の更なる用途拡大が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−１０６３３５公報
【特許文献２】特許第３３３０９６１号
【特許文献３】特開２００７−２２３９４８号公報
【特許文献４】特開平５−３１０５２６号公報
【特許文献５】特開平６−２５６１３７号公報
【特許文献６】特開平９−２２１６６７号公報
【特許文献７】特開２０００−３２５０４９号公報
【特許文献８】特開２０００−２４７９００号公報
【特許文献９】特許第４３９５６２３号
【特許文献１０】特開２００７−２６２０５０号公報
【特許文献１１】特開２００８−１８９５５４号公報
【特許文献１２】特開２００２−４７１９６号公報
【特許文献１３】特開２００３−１２８６３２号公報
【特許文献１４】特開平８−８１３５２号公報
【特許文献１５】特表２００５−５２２１８０号公報
【特許文献１６】特公平７−７８０３２号公報
【特許文献１７】特開平９−１５４５９１号公報
【特許文献１８】特開平１０−１５５４９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、 １３３、 ８９−９６（２００１）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、 ７４、 ５３４６―５３４８（１９５２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、前記の状況を鑑みて、新規な生理活性を有するｐ−クマル酸、フェルラ酸の関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することのみで、原料であるｐ−クマル酸及びフェルラ酸には認められない抗癌活性を有する化合物を初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
したがって、本発明は、優れた抗癌活性を有する新規フェノール性２量体化合物を提供し、さらにこれを効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規フェノール性２量体化合物を有効成分として含有する抗癌剤、さらには前記式（１）で示した新規フェノール性２量体化合物を含有する食品、医薬品、医薬部外品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
で表される新規フェノール性２量体化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕前記〔１〕記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤、
〔３〕前記〔１〕記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品、医薬品、又は医薬部外品、
〔４〕ｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することにより目的の化合物を生成させることを特徴とする、前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、前記のように生理活性に優れた新規フェノール性２量体化合物及びその製造方法を提供することができる。また、本発明により原料のｐ−クマル酸及びフェルラ酸には認められない抗癌活性を有する化合物を製造することができることから優れた抗癌剤を提供することができる。
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、前記のような生理活性に優れることに加えて、安全性にも優れることから、食品、医薬品、又は医薬部外品に配合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。上からｐ−クマル酸のみの反応後、フェルラ酸のみの反応後、ｐ−クマル酸とフェルラ酸の混合液の反応後の結果であり、「Ａ」がｐ−クマル酸とフェルラ酸を原料として出来た新規フェノール性２量体化合物のピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、式（１）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
で表される構造式を有する。
【００２０】
また、本発明では、前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２１】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、ｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することで生成させることができる。
【００２２】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、ｐ−クマル酸とフェルラ酸以外の原料を用いて化学合成することも可能ではあるが、その場合には反応工程が複雑であり有害な試薬や工程を必要とする。また、不純物を除去するという安全性の観点から精製を徹底する必要もあり、工業的には不向きな方法である。これに対して、前記の本発明の新規フェノール性２量体化合物の製造方法は、安価で入手できるｐ−クマル酸とフェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理する工程を有するものであり、有害な試薬や、危険な工程を必要としない効率的で安全な製造方法である。
【００２３】
本発明の新規フェノール性２量体化合物の前駆体としてｐ−クマル酸及びフェルラ酸が必要である。これらは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のものを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に新規フェノール性２量体化合物が得られるなら、ｐ−クマル酸、フェルラ酸に加えて他の成分を含む混合物であってもよい。ただし、回収量の観点からは、ｐ−クマル酸及びフェルラ酸がそれぞれ５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、様々な果実やジュース、濃縮果汁又は破棄されることの多い果皮の抽出物、プロポリス又はその抽出物、フェルラ酸では、米糠又は食品添加物としてのフェルラ酸、あるいは先行技術に示されるような微生物発酵によるｐ−クマル酸又はフェルラ酸を含有する培養液や酵素反応後のｐ−クマル酸又はフェルラ酸を含有する溶液等が挙げられる。
【００２４】
ｐ−クマル酸及びフェルラ酸の純品、あるいはｐ−クマル酸とフェルラ酸とを含有する混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればｐ−クマル酸及びフェルラ酸の溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類に特に制限はなく、ｐ−クマル酸及びフェルラ酸が十分に溶解すれば良い。望ましくは、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。前記溶媒としては、最終的な精製を十分に適用せずに得られた反応液を食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールが望ましい。
【００２５】
上記で得られたｐ−クマル酸とフェルラ酸の混合物を含有する溶液（以下、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液という）を、アルカリ性に調整する。例えば、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加しｐＨを調整しても良いし、前述のｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ｐＨは最終的に７．１以上であれば生成反応が進むが、ｐＨ１３．０を超えると生成反応と同時に、他の化合物の生成反応や目的化合物の分解も一方で生じるために本発明のフェノール性重合化合物の最終的な回収量が低下する。したがって、本発明の製造方法において生成反応開始時のｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐＨはアルカリ性、中でも、７．０〜１３．０に調整することが好ましい。
また、本発明の製造方法では、生成反応中におけるｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐＨも、７．０〜１３．０に調整することで生成反応を効率よく進めることができるので好ましい。
【００２６】
また、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐ−クマル酸やフェルラ酸の濃度に制限はない。濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットがあるため、濃度は各々の溶媒に対し飽和する濃度近辺が好ましい。また、ｐ−クマル酸やフェルラ酸を飽和する濃度以上で含有させてもよい。この場合、生成反応前の時点では、ｐ−クマル酸やフェルラ酸は前記溶媒中に完全に溶解していなくともよい。溶解していないｐ−クマル酸やフェルラ酸は生成反応が進むにつれて徐々に溶解することになる。
【００２７】
ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液をアルカリ性に調整するために使用できるｐＨ調整剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が望ましい。特に、炭酸水素ナトリウムは、過剰に加えてもｐＨが１３を超えることはないのでさらに望ましい。また、生成反応時のｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐＨ変化を極力抑える場合には、緩衝溶液を用いても良い。
【００２８】
本発明において、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液をアルカリ条件下で加熱する。所望の生成反応を効率的に進ませるために、加熱温度は９０℃以上が必要である。溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。開放容器に前記混合溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器に前記混合溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が９０℃以上に達することが必要である。回収効率面から、溶液温度が均一に９０〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜３００分の加熱時間が望ましい。また、加熱反応は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良く、効率面から判断すればよい。
【００２９】
前記ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液を加熱することにより、詳細な反応機構は明確ではないが、ｐ−クマル酸とフェルラ酸とが反応し、前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物を含有した混合物が得られる。安全な原料のみを用いた場合には、新規フェノール性２量体化合物を含有した混合物の状態でも使用することが可能である。例えば、天然由来のｐ−クマル酸とフェルラ酸を含水エタノール溶媒に溶解し、炭酸水素ナトリウムを加え、加熱反応させた場合には、新規フェノール性２量体化合物を含有した反応後の混合物を食品原料の一つとして使用することが可能である。
【００３０】
なお、前記加熱処理による前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の生成量を確認して判断すればよい。
【００３１】
風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応後の混合物から本発明の新規フェノール性２量体化合物を濃縮して濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して濃縮できる。カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の本発明の新規フェノール性２量体化合物の純品を得ることができる。
【００３２】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、後述のように、優れた抗癌活性を有する。
【００３３】
また、本発明の新規フェノール性２量体化合物は、抗癌効果を目的として、液状、ペースト状、ゲル状、固形状等の様々な形態の食品、医薬品、又は医薬部外品として使用することができる。
【００３４】
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤等のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤等と組み合わせて、本発明の新規フェノール性２量体化合物を使用することができる。特に、本発明の新規フェノール性２量体化合物の有する生理活性分野を考慮すると、癌予防・癌治療等の健康維持増進のために用いることが好ましい。
【００３５】
本発明の新規フェノール性２量体化合物が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００３６】
本発明の新規フェノール性２量体化合物を医薬用途で使用する場合、例えば、本発明の新規フェノール性２量体化合物の摂取量は、所望の改善効果、治療効果又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。前記摂取量は１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００３７】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。
【００３８】
また、本発明の新規フェノール性２量体化合物を医薬品、医薬部外品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。又は胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００３９】
前記の医薬品、医薬部外品、又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤、予防剤又は飼料に配合してもよい。
【００４０】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１：新規フェノール性２量体化合物の生成）
ｐ−クマル酸（和光純薬工業（株）製）、フェルラ酸（和光純薬工業（株）製）各１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍＬを加えた混合液（ｐＨ＝７．５）をオートクレーブ（商品名「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、三洋電機（株）製）にて１３０℃、４０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００４２】
実施例１で得られたクロマトグラムを図１に示す。上から、ｐ−クマル酸のみ反応後の溶液、フェルラ酸のみの反応物の溶液、ｐ−クマル酸とフェルラ酸の混合物の生成反応後の溶液のクロマトグラムを示している。ｐ−クマル酸、フェルラ酸単独で反応したものとは異なったＡのピークが観測されている。よってＡのピークで示された化合物は、フェルラ酸とｐ−クマル酸の両方に由来する生成物と考えられる。
【００４３】
（実施例２：新規フェノール性２量体化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物における図１のＡで示したピークに含まれる化合物を、分取ＨＰＬＣにより単離した。常法に従って、乾燥したところ、黄色粉末状の新規化合物（以下、ＵＨＡ８０１５）が９５ｍｇ得られた。
【００４４】
次いで、前記ＵＨＡ８０１５の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は２７０．３２３６であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
ＵＨＡ８０１５
理論値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ３（Ｍ+）： ２７０．３２３０
分子式Ｃ17Ｈ18Ｏ3
【００４５】
次に、前記ＵＨＡ８０１５を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、ＵＨＡ８０１５が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。このことから、式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００４６】
なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表されるＵＨＡ８０１５の各部位を
【００４７】
【化３】
【００４８】
とし、１Ｈ核磁気共鳴スペクトル、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１で示す。
値はδ、ｐｐｍで、メタノール−ｄ３で測定した値である。
【００４９】
【表１】
【００５０】
また、ＵＨＡ８０１５の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶
【００５１】
（実施例３：ＵＨＡ８０１５の抗癌作用）
次に癌細胞に対する各化合物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。
【００５２】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン（株）製）、１０％ＦＢＳ（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、バイオロジカルインダストリーズ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６４０」（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。
試料は、ｐ−クマル酸、フェルラ酸と精製済みであるＵＨＡ８０１５の３種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び１００μＭとなるように調整し、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」（（株）同仁化学研究所製）を用いたＭＴＴ法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。１時間の遮光反応後にプレートリーダー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製「ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０」）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表２）。これらの結果から、ＵＨＡ８０１５は原料であるｐ−クマル酸やフェルラ酸にはない癌細胞増殖抑制能が認められた。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（実施例４：加熱温度によるＵＨＡ８０１５の生成量の違い）
ｐ−クマル酸５０ｍｇ、フェルラ酸５０ｍｇ、エタノール１ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた混合液（ｐＨ＝７．５）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５５】
その結果、９０℃を超える条件下においてＵＨＡ８０１５の生成は確認できた。ｐ−クマル酸、フェルラ酸からのＵＨＡ８０１５の生成比率は７０℃で非生成、９０℃で極微量、１１０℃で１重量％、１３０℃で４．７重量％であった。すなわち、１３０℃での加熱が最も効率的であった。
【００５６】
（実施例５：ＵＨＡ８０１５含有エキスの調製）
プロポリス（ｐ−クマル酸含有原料）１０ｇ、フェルラ酸（食品添加物、築野ライスファインケミカル（株）製）０．５ｇ、エタノール１０ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝７．６）を、オートクレーブにて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ８０１５含有エキスを１２ｇ得た。得られたＵＨＡ８０１５含有エキス１２ｇ中には、実施例１と同様の手法で確認したところＵＨＡ８０１５が０．０５ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００５７】
以下、実施例１、２で得られたＵＨＡ８０１５及び実施例５で得られたＵＨＡ８０１５含有エキス（以下、ＵＨＡ８０１５含有エキス）を配合した処方例を実施例として以下に示した。
【００５８】
（実施例６：ＵＨＡ８０１５を含有する食品）
ＵＨＡ８０１５含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、抗癌作用による癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００５９】
（実施例７：ＵＨＡ８０１５を含有する医薬品）
実施例１、２の方法で得たＵＨＡ８０１５をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ８０１５ １０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌治療を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【００６０】
（実施例８：ＵＨＡ８０１５を含有する医薬部外品）
実施例１、２の方法で得たＵＨＡ８０１５ １．２ｇを１０ｍＬのエタノールに溶解し、タウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇを全て精製水に溶解させ、１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防することを目的とする医薬部外品として有効に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する新規フェノール性２量体化合物及びその製造方法、前記新規フェノール性２量体化合物を含む抗癌剤、食品、医薬品又は医薬部外品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｐ−クマル酸とフェルラ酸は共に植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となり、天然界に比較的多く存在する成分である。ｐ−クマル酸としては、プラムをはじめとして、多くの果物の果実や果皮、プロポリス等にも含まれていることが知られている。一方、フェルラ酸は米糠やジャガイモの皮層部に多く含まれている。これらは全て食経験があり人に対する安全性も高い成分である。
【０００３】
ｐ−クマル酸については、その生理機能に関連した先行技術がある。例えば、ｐ−クマル酸をはじめ、桂皮酸類を有効成分とする抗ヘリコバクター・ピロリ剤（特許文献１）、フェルラ酸及び／又はｐ−クマル酸を有効成分とする皮膚改善剤（特許文献２）、クマル酸をはじめ、プロポリスの抽出物に含まれる桂皮酸類を有効成分とする血管新生抑制剤（特許文献３）が挙げられる。フェルラ酸についても、その生理機能に関連した先行技術がある。例えば、フェルラ酸を有効成分とする細胞分化促進剤（特許文献４）、フェルラ酸を有効成分とする美白用皮膚外用薬（特許文献５）、フェルラ酸を有効成分とする酸化防止剤（特許文献６）、フェルラ酸とニコチン酸アミドからなる魚卵の発色助剤（特許文献７）、フェルラ酸を有効成分とする抗菌剤（特許文献８）、フェルラ酸のアルツハイマー病予防効果（非特許文献１）が知られている。
【０００４】
また、ｐ−クマル酸誘導体に関連した先行技術がある。例えば、クマル酸を化学合成させたリグニン類を有効成分とする抗菌剤（特許文献９）、カフェイン酸アミド誘導体又はエステル誘導体を有効成分とするアディポネクチン産生増強剤（特許文献１０）、ｐ−クマル酸二量体を原料とした抗菌剤であるベンゾフランカルボキサミド誘導体の合成方法（特許文献１１）が挙げられる。
また、ｐ−クマル酸誘導体は、植物中にも多く含まれていることから、リンゴ、ナシ又はモモの未熟果実の果実ポリフェノールとして、ｐ−クマル酸誘導体等を含む酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤（特許文献１２）が挙げられる。また、フェルラ酸誘導体に関連した先行技術としては、例えば、フェルラ酸エステル誘導体を有効成分とする紫外線吸収剤（特許文献１３）、フィトステロール類のフェルラ酸エステルを有効成分とする皮膚外用薬（特許文献１４）が知られている。
【０００５】
また、ｐ−クマル酸、フェルラ酸、それらの誘導体は、優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術の提案もなされている。ｐ−クマル酸の製造方法の例としては、組み換え体を用いた微生物によるｐ−ヒドロキシ桂皮酸（ｐ−クマル酸）等の製造方法（特許文献１５）が示される。フェルラ酸の製造方法の例としては、バニリンとマロン酸の縮合反応による製造（非特許文献２）、米糠からの製造方法（特許文献１６）、オイゲノールを原料とした菌体での製造法（特許文献１７）、コニフェリルアルデヒドからの酵素での製造法（特許文献１８）等が知られている。
【０００６】
以上のように、原料としての、ｐ−クマル酸、フェルラ酸及びそれらの誘導体や、これらの化合物の製造方法は多数提案されているが、ｐ−クマル酸、フェルラ酸及びそれらの誘導体を用いた更なる新規素材の開発や素材の更なる用途拡大が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−１０６３３５公報
【特許文献２】特許第３３３０９６１号
【特許文献３】特開２００７−２２３９４８号公報
【特許文献４】特開平５−３１０５２６号公報
【特許文献５】特開平６−２５６１３７号公報
【特許文献６】特開平９−２２１６６７号公報
【特許文献７】特開２０００−３２５０４９号公報
【特許文献８】特開２０００−２４７９００号公報
【特許文献９】特許第４３９５６２３号
【特許文献１０】特開２００７−２６２０５０号公報
【特許文献１１】特開２００８−１８９５５４号公報
【特許文献１２】特開２００２−４７１９６号公報
【特許文献１３】特開２００３−１２８６３２号公報
【特許文献１４】特開平８−８１３５２号公報
【特許文献１５】特表２００５−５２２１８０号公報
【特許文献１６】特公平７−７８０３２号公報
【特許文献１７】特開平９−１５４５９１号公報
【特許文献１８】特開平１０−１５５４９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、 １３３、 ８９−９６（２００１）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、 ７４、 ５３４６―５３４８（１９５２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、前記の状況を鑑みて、新規な生理活性を有するｐ−クマル酸、フェルラ酸の関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することのみで、原料であるｐ−クマル酸及びフェルラ酸には認められない抗癌活性を有する化合物を初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
したがって、本発明は、優れた抗癌活性を有する新規フェノール性２量体化合物を提供し、さらにこれを効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規フェノール性２量体化合物を有効成分として含有する抗癌剤、さらには前記式（１）で示した新規フェノール性２量体化合物を含有する食品、医薬品、医薬部外品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
で表される新規フェノール性２量体化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕前記〔１〕記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤、
〔３〕前記〔１〕記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品、医薬品、又は医薬部外品、
〔４〕ｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することにより目的の化合物を生成させることを特徴とする、前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、前記のように生理活性に優れた新規フェノール性２量体化合物及びその製造方法を提供することができる。また、本発明により原料のｐ−クマル酸及びフェルラ酸には認められない抗癌活性を有する化合物を製造することができることから優れた抗癌剤を提供することができる。
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、前記のような生理活性に優れることに加えて、安全性にも優れることから、食品、医薬品、又は医薬部外品に配合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。上からｐ−クマル酸のみの反応後、フェルラ酸のみの反応後、ｐ−クマル酸とフェルラ酸の混合液の反応後の結果であり、「Ａ」がｐ−クマル酸とフェルラ酸を原料として出来た新規フェノール性２量体化合物のピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、式（１）：
【００１８】
【化２】
【００１９】
で表される構造式を有する。
【００２０】
また、本発明では、前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２１】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、ｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することで生成させることができる。
【００２２】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、ｐ−クマル酸とフェルラ酸以外の原料を用いて化学合成することも可能ではあるが、その場合には反応工程が複雑であり有害な試薬や工程を必要とする。また、不純物を除去するという安全性の観点から精製を徹底する必要もあり、工業的には不向きな方法である。これに対して、前記の本発明の新規フェノール性２量体化合物の製造方法は、安価で入手できるｐ−クマル酸とフェルラ酸をアルカリ条件下で加熱処理する工程を有するものであり、有害な試薬や、危険な工程を必要としない効率的で安全な製造方法である。
【００２３】
本発明の新規フェノール性２量体化合物の前駆体としてｐ−クマル酸及びフェルラ酸が必要である。これらは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のものを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に新規フェノール性２量体化合物が得られるなら、ｐ−クマル酸、フェルラ酸に加えて他の成分を含む混合物であってもよい。ただし、回収量の観点からは、ｐ−クマル酸及びフェルラ酸がそれぞれ５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、様々な果実やジュース、濃縮果汁又は破棄されることの多い果皮の抽出物、プロポリス又はその抽出物、フェルラ酸では、米糠又は食品添加物としてのフェルラ酸、あるいは先行技術に示されるような微生物発酵によるｐ−クマル酸又はフェルラ酸を含有する培養液や酵素反応後のｐ−クマル酸又はフェルラ酸を含有する溶液等が挙げられる。
【００２４】
ｐ−クマル酸及びフェルラ酸の純品、あるいはｐ−クマル酸とフェルラ酸とを含有する混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればｐ−クマル酸及びフェルラ酸の溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類に特に制限はなく、ｐ−クマル酸及びフェルラ酸が十分に溶解すれば良い。望ましくは、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。前記溶媒としては、最終的な精製を十分に適用せずに得られた反応液を食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールが望ましい。
【００２５】
上記で得られたｐ−クマル酸とフェルラ酸の混合物を含有する溶液（以下、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液という）を、アルカリ性に調整する。例えば、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加しｐＨを調整しても良いし、前述のｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ｐＨは最終的に７．１以上であれば生成反応が進むが、ｐＨ１３．０を超えると生成反応と同時に、他の化合物の生成反応や目的化合物の分解も一方で生じるために本発明のフェノール性重合化合物の最終的な回収量が低下する。したがって、本発明の製造方法において生成反応開始時のｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐＨはアルカリ性、中でも、７．０〜１３．０に調整することが好ましい。
また、本発明の製造方法では、生成反応中におけるｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐＨも、７．０〜１３．０に調整することで生成反応を効率よく進めることができるので好ましい。
【００２６】
また、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐ−クマル酸やフェルラ酸の濃度に制限はない。濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットがあるため、濃度は各々の溶媒に対し飽和する濃度近辺が好ましい。また、ｐ−クマル酸やフェルラ酸を飽和する濃度以上で含有させてもよい。この場合、生成反応前の時点では、ｐ−クマル酸やフェルラ酸は前記溶媒中に完全に溶解していなくともよい。溶解していないｐ−クマル酸やフェルラ酸は生成反応が進むにつれて徐々に溶解することになる。
【００２７】
ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液をアルカリ性に調整するために使用できるｐＨ調整剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が望ましい。特に、炭酸水素ナトリウムは、過剰に加えてもｐＨが１３を超えることはないのでさらに望ましい。また、生成反応時のｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液のｐＨ変化を極力抑える場合には、緩衝溶液を用いても良い。
【００２８】
本発明において、ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液をアルカリ条件下で加熱する。所望の生成反応を効率的に進ませるために、加熱温度は９０℃以上が必要である。溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。開放容器に前記混合溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器に前記混合溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が９０℃以上に達することが必要である。回収効率面から、溶液温度が均一に９０〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜３００分の加熱時間が望ましい。また、加熱反応は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良く、効率面から判断すればよい。
【００２９】
前記ｐ−クマル酸、フェルラ酸混合溶液を加熱することにより、詳細な反応機構は明確ではないが、ｐ−クマル酸とフェルラ酸とが反応し、前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物を含有した混合物が得られる。安全な原料のみを用いた場合には、新規フェノール性２量体化合物を含有した混合物の状態でも使用することが可能である。例えば、天然由来のｐ−クマル酸とフェルラ酸を含水エタノール溶媒に溶解し、炭酸水素ナトリウムを加え、加熱反応させた場合には、新規フェノール性２量体化合物を含有した反応後の混合物を食品原料の一つとして使用することが可能である。
【００３０】
なお、前記加熱処理による前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により前記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の生成量を確認して判断すればよい。
【００３１】
風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応後の混合物から本発明の新規フェノール性２量体化合物を濃縮して濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して濃縮できる。カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の本発明の新規フェノール性２量体化合物の純品を得ることができる。
【００３２】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、後述のように、優れた抗癌活性を有する。
【００３３】
また、本発明の新規フェノール性２量体化合物は、抗癌効果を目的として、液状、ペースト状、ゲル状、固形状等の様々な形態の食品、医薬品、又は医薬部外品として使用することができる。
【００３４】
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤等のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤等と組み合わせて、本発明の新規フェノール性２量体化合物を使用することができる。特に、本発明の新規フェノール性２量体化合物の有する生理活性分野を考慮すると、癌予防・癌治療等の健康維持増進のために用いることが好ましい。
【００３５】
本発明の新規フェノール性２量体化合物が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００３６】
本発明の新規フェノール性２量体化合物を医薬用途で使用する場合、例えば、本発明の新規フェノール性２量体化合物の摂取量は、所望の改善効果、治療効果又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。前記摂取量は１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００３７】
本発明の新規フェノール性２量体化合物は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。
【００３８】
また、本発明の新規フェノール性２量体化合物を医薬品、医薬部外品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。又は胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００３９】
前記の医薬品、医薬部外品、又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤、予防剤又は飼料に配合してもよい。
【００４０】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１：新規フェノール性２量体化合物の生成）
ｐ−クマル酸（和光純薬工業（株）製）、フェルラ酸（和光純薬工業（株）製）各１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍＬを加えた混合液（ｐＨ＝７．５）をオートクレーブ（商品名「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、三洋電機（株）製）にて１３０℃、４０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００４２】
実施例１で得られたクロマトグラムを図１に示す。上から、ｐ−クマル酸のみ反応後の溶液、フェルラ酸のみの反応物の溶液、ｐ−クマル酸とフェルラ酸の混合物の生成反応後の溶液のクロマトグラムを示している。ｐ−クマル酸、フェルラ酸単独で反応したものとは異なったＡのピークが観測されている。よってＡのピークで示された化合物は、フェルラ酸とｐ−クマル酸の両方に由来する生成物と考えられる。
【００４３】
（実施例２：新規フェノール性２量体化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物における図１のＡで示したピークに含まれる化合物を、分取ＨＰＬＣにより単離した。常法に従って、乾燥したところ、黄色粉末状の新規化合物（以下、ＵＨＡ８０１５）が９５ｍｇ得られた。
【００４４】
次いで、前記ＵＨＡ８０１５の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は２７０．３２３６であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
ＵＨＡ８０１５
理論値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ３（Ｍ+）： ２７０．３２３０
分子式Ｃ17Ｈ18Ｏ3
【００４５】
次に、前記ＵＨＡ８０１５を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、ＵＨＡ８０１５が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。このことから、式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００４６】
なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表されるＵＨＡ８０１５の各部位を
【００４７】
【化３】
【００４８】
とし、１Ｈ核磁気共鳴スペクトル、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１で示す。
値はδ、ｐｐｍで、メタノール−ｄ３で測定した値である。
【００４９】
【表１】
【００５０】
また、ＵＨＡ８０１５の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶
【００５１】
（実施例３：ＵＨＡ８０１５の抗癌作用）
次に癌細胞に対する各化合物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。
【００５２】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン（株）製）、１０％ＦＢＳ（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、バイオロジカルインダストリーズ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６４０」（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。
試料は、ｐ−クマル酸、フェルラ酸と精製済みであるＵＨＡ８０１５の３種類を用いた。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び１００μＭとなるように調整し、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」（（株）同仁化学研究所製）を用いたＭＴＴ法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。１時間の遮光反応後にプレートリーダー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製「ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０」）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表２）。これらの結果から、ＵＨＡ８０１５は原料であるｐ−クマル酸やフェルラ酸にはない癌細胞増殖抑制能が認められた。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（実施例４：加熱温度によるＵＨＡ８０１５の生成量の違い）
ｐ−クマル酸５０ｍｇ、フェルラ酸５０ｍｇ、エタノール１ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた混合液（ｐＨ＝７．５）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５５】
その結果、９０℃を超える条件下においてＵＨＡ８０１５の生成は確認できた。ｐ−クマル酸、フェルラ酸からのＵＨＡ８０１５の生成比率は７０℃で非生成、９０℃で極微量、１１０℃で１重量％、１３０℃で４．７重量％であった。すなわち、１３０℃での加熱が最も効率的であった。
【００５６】
（実施例５：ＵＨＡ８０１５含有エキスの調製）
プロポリス（ｐ−クマル酸含有原料）１０ｇ、フェルラ酸（食品添加物、築野ライスファインケミカル（株）製）０．５ｇ、エタノール１０ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝７．６）を、オートクレーブにて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ８０１５含有エキスを１２ｇ得た。得られたＵＨＡ８０１５含有エキス１２ｇ中には、実施例１と同様の手法で確認したところＵＨＡ８０１５が０．０５ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００５７】
以下、実施例１、２で得られたＵＨＡ８０１５及び実施例５で得られたＵＨＡ８０１５含有エキス（以下、ＵＨＡ８０１５含有エキス）を配合した処方例を実施例として以下に示した。
【００５８】
（実施例６：ＵＨＡ８０１５を含有する食品）
ＵＨＡ８０１５含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、抗癌作用による癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００５９】
（実施例７：ＵＨＡ８０１５を含有する医薬品）
実施例１、２の方法で得たＵＨＡ８０１５をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ８０１５ １０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌治療を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【００６０】
（実施例８：ＵＨＡ８０１５を含有する医薬部外品）
実施例１、２の方法で得たＵＨＡ８０１５ １．２ｇを１０ｍＬのエタノールに溶解し、タウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇを全て精製水に溶解させ、１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防することを目的とする医薬部外品として有効に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
【請求項２】
請求項１記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤。
【請求項３】
請求項１に記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品、医薬品、又は医薬部外品。
【請求項４】
ｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することにより目的の化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の製造方法。
【化２】
【請求項１】
下記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
【請求項２】
請求項１記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤。
【請求項３】
請求項１に記載の新規フェノール性２量体化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品、医薬品、又は医薬部外品。
【請求項４】
ｐ−クマル酸とフェルラ酸とをアルカリ条件下で加熱処理することにより目的の化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される新規フェノール性２量体化合物の製造方法。
【化２】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２２４６０３（Ｐ２０１２−２２４６０３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９６２１６（Ｐ２０１１−９６２１６）
【出願日】平成２３年４月２２日（２０１１．４．２２）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２２日（２０１１．４．２２）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
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