新規ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用
【課題】高マンノース型の糖鎖と高い親和性を有する新規ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの代表的利用を提供する。
【解決手段】食用紅藻であるトサカノリ（Meristothecapapulosa）由来の高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、特定な配列からなるアミノ酸配列；または（ｂ）特定な配列からなるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる坑ウイルス剤。
【解決手段】食用紅藻であるトサカノリ（Meristothecapapulosa）由来の高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、特定な配列からなるアミノ酸配列；または（ｂ）特定な配列からなるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる坑ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高マンノース型糖鎖と高い親和性を有する新規ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの代表的利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（以下「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」）、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス６（以下「ＨＨＶ−６」）、重症急性呼吸症候群（以下「ＳＡＲＳ」）ウイルスなどのウイルスは、しばしば人体に対して重篤な症状を惹起し、その感染拡大が社会問題ともなっていることから、効果的に感染を阻害する薬剤の開発が望まれている。これらのウイルスは、表面に高マンノース型糖鎖を有し、これが宿主への感染に重要な役割を果たすことが知られている（例えば、非特許文献１）。そのため、これらのウイルスが備える高マンノース型糖鎖への結合能を有する物質は、上記ウイルスに対する感染阻害剤として機能することが期待できる。
【０００３】
これまでに、海藻類または藻類（淡水産藍藻）から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。上記レクチンの一部は、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス等の上述のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献２〜１２）。
【０００４】
他にも、レクチンとＨＩＶとの結合に関する発明として、例えば、ＣｏｎＡなどのレクチンが結合した疎水性基材からなる微粒子担体にＨＩＶまたはその一部のタンパクもしくはペプチドを捕捉してなる微粒子を含有するエイズワクチン（特許文献１）、ＧＮＡなどのレクチンを固定した多孔性中空糸膜に血液を通過させ、ウイルスに感染した個体の血液中のウイルス粒子及びそのレクチン結合性フラグメントを減じる方法（特許文献２）、癌患者における感染症の予防および／または処置用の医薬の製造において、マンナン結合レクチンサブユニット等を含むマンナン結合レクチンオリゴマーを含有する組成物を使用する発明（特許文献３）、スクシニル−コンカナバリンＡなどのレクチンを結合成分として用い、ウイルス粒子を含んでなるサンプルのウイルス力価を高める方法（特許文献４）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３３５５１０号公報（２００１年１２月４日公開）
【特許文献２】特表２００７−５２５２３２号公報（２００７年９月６日公表）
【特許文献３】特表２００８−５３５８７２号公報（２００８年９月４日公表）
【特許文献４】特表２００４−５００８３１号公報（２００４年１月１５日公表）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】New England Journal of Medicine, 348, 2228-2238, 2003.
【非特許文献２】Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530, 1997.
【非特許文献３】O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003.
【非特許文献４】Helle, F., .et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006.
【非特許文献５】Barrientos, L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.
【非特許文献６】Dey, B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.
【非特許文献７】O’Keefe, B. R. et al.,J. Virol. 84, 2511-2521, 2010.
【非特許文献８】Hori,K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.
【非特許文献９】Sato,Y., Okuyama, S., and Hori, K., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.
【非特許文献１０】Sato,Y., Morimoto,K., Hirayama, M., and Hori, K. Biochem. Biophys. Res. commun. 405, 291-296, 2011.
【非特許文献１１】佐藤雄一郎、平山 真、藤原佳史、森本金治郎、堀 貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)
【非特許文献１２】Sato,Y., Hirayama, M., Morimoto,K., Yamamoto, N., Okuyama, S., and Hori, K. J. Biol. Chem. 286, No.22, 19446-19458, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、現在のところＨＩＶウイルスやインフルエンザウイルス等が表面に有する高マンノース型糖鎖に特異的に結合し、上記ウイルスの感染を効果的に阻害する物質はまだ十分に知られているとは言いがたく、その数は限られているため、上記物質が十分に供給できる状況にはなっていない。したがって、新規な上記物質がさらに多く見出され、その特性が明らかにされることが必要である。
【０００８】
本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高マンノース型糖鎖と高い親和性を有する新規ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの代表的利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、レクチン、特にトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）由来のレクチンに着目し、ＨＩＶウイルス等が表面に備える高マンノース型糖鎖と特異的に結合しうるレクチンの探索を行った。その結果、従来公知のレクチンとアミノ酸配列の相同性が非常に低い、本発明にかかるポリペプチドを見出すに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、上記課題を解決すべく、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴としている。
【００１１】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１２】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記課題を解決すべく、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであるポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、であってもよい。
【００１３】
本発明にかかる抗ウイルス剤は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドを含有し、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とすることを特徴としている。
【００１４】
上記本発明にかかる抗ウイルス剤は、上記課題を解決すべく、上記抗ウイルス剤の標的であるウイルスが、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス６および重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれるウイルスであってもよい。
【００１５】
本発明にかかるウイルス除去膜は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドが固定されてなることを特徴としている。
【００１６】
本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明にかかるポリペプチドを生産する方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるベクターを用いることを特徴としている。
【００１８】
本発明にかかる形質転換体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１９】
本発明にかかるポリペプチドを生産する方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる形質転換体を用いることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
以上のように、本発明にかかるポリペプチドは、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる構成である。上記アミノ酸配列は従来公知のレクチンと非常に相同性の低いものである。
【００２１】
それゆえ、ＨＩＶやインフルエンザウイルス等が表面に備える高マンノース型糖鎖と効率的に結合することができ、これらのウイルスの感染を効果的に阻害することができるという効果を奏する。
【００２２】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるポリペプチドをコードしている。したがって、本発明にかかるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体を用いることによって、上記本発明にかかるポリペプチドを簡便かつ大量に調製することが可能となる。その結果、上記ウイルスの感染を効果的に阻害することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＭＰＬのｃＤＮＡの全長塩基配列、およびその演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２のＡは固定化したｇｐ１２０とＭＰＬとの相互作用のセンサーグラムであり、図２のＢはｇｐ１２０とＭＰＬとの親和定数を示す図である。
【図３】ＭＰＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。
【図４】２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ステップワイズ溶出）に供した結果を示す図である。
【図５】粗レクチン画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出）に供した結果を示す図である。
【図６】粗レクチン画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出）に供した結果得られた溶出液の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。
【図７】ＭＰＬをTSKgel DEAE-5PWカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。
【図８】ＭＰＬをTSKgel DEAE-5PWカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供して得られた４つのピークを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。
【図９】ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の分子量測定結果を示す図である。
【図１０】ＭＰＬ画分をブロッティングし、ＣＢＢ染色したＰＶＤＦ膜を示す図である。
【図１１】遠心限外ろ過−ＨＰＬＣ法に供試したピリジルアミノ化糖鎖２７種の構造と、当該糖鎖へのＭＰＬ−１の結合活性を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の一形態について説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。本明細書において、範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、Ａ以上Ｂ以下であることを表す。また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献は、本明細書中において参考として援用される。
【００２５】
（１）ポリペプチド
本発明者は、食用紅藻であるトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）から単離した新規ポリペプチド（以下「ＭＰＬ」という）が、高マンノース型糖鎖への結合特異性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。上記ＭＰＬのアミノ酸配列は、後述するように、バナナMusa acuminataレクチンおよび紅藻Griffithsia sp.由来レクチンGriffithsin（GRFT）等の従来公知のレクチンとの相同性が最大３３％と、非常に低いものであった。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００２７】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００２８】
本発明にかかるポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明にかかるポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００２９】
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつ本発明にかかるポリペプチドである。上記ポリペプチドは、従来公知のレクチンのアミノ酸配列との相同性が非常に低い新規ポリペプチドであるという特徴を有する。
【００３０】
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００３１】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が、本発明にかかる所望の変異体であるか否かを容易に決定し得る。
【００３３】
本実施形態にかかるポリペプチドは、高マンノース型の糖鎖と結合するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることが好ましい。
【００３４】
上記「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３５】
なお、本発明にかかるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３６】
また、本発明にかかるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００３７】
また、本発明にかかるポリペプチドは、後述する本発明にかかるポリヌクレオチド（本発明にかかるポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明にかかるポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。
【００３８】
他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明にかかるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００３９】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。
【００４０】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【００４１】
合成ペプチドは化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えばHoughtenは、４週間未満で調製され、そして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような、多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している（Houghten,R.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:5131-5135（1985））。
【００４２】
この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis（SMPS）」プロセスは、さらにHoughtenら（1986）の米国特許第4,631,211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Houghtenら、前出、5134）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００４３】
本発明者は、上記本発明にかかるポリペプチドが高マンノース型糖鎖に特異的に結合することを見出した。ここで、「糖鎖」とは、直鎖または分岐したオリゴ糖または多糖を意味する。また上記糖鎖は、タンパク質との結合様式によって、アスパラギンと結合するＮ−グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｎ型糖鎖」という）およびセリン、スレオニンなどと結合するＯ−グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｏ型糖鎖」という）に大別され、Ｎ型糖鎖には高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、混成型糖鎖がある。
【００４４】
なおオリゴ糖とは、単糖または単糖の置換誘導体が２〜１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。多糖は、構成糖の種類によって異なるが、ウロン酸やエステル硫酸を多く含む糖質を酸性多糖、中性糖のみのものを中性多糖という。多糖のうち、ムコ多糖とよばれる一群の多糖は、ほとんどがタンパク質と結合しており、プロテオグリカンという。単糖とは、糖鎖の構成単位となるもので、加水分解によってそれ以上簡単な分子にならない基本的物質である。
【００４５】
さらに単糖は、カルボキシル基などの酸性側鎖を有する酸性糖、ヒドロキシル基がアミノ基で置換されたアミノ糖、それ以外の中性糖の３つに大別される。生体内に存在する単糖としては、酸性糖はＮ−アセチルノイラミン酸やＮ−グリコリルノイラミン酸（以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」という）などのシアル酸や、ウロン酸などがあり、アミノ糖としてはＮ−アセチルグルコサミン（以下、「ＧｌｃＮＡｃ」という）やＮ−アセチルガラクトサミンなどがあり、中性糖としてはグルコース、マンノース、ガラクトース、フコースなどがあげられる。
【００４６】
Ｎ型糖鎖は全て、「トリマンノシルコア」と呼ばれる〔Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕からなる共通母核構造を持っている。高マンノース型糖鎖は、トリマンノシルコアに加え、分岐構造部分にα−マンノース残基のみを含む。この糖鎖には〔Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3 ）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕という七糖が共通の母核として含まれている。また混成型糖鎖は、複合型と高マンノース型の両方の特徴を併せ持っていることからそう呼ばれている。１つまたは２つのα−マンノシル基が、高マンノース型の場合と同様に、トリマンノシルコアのManα1-6腕と結合し、複合型糖鎖の側鎖と同じものがコアのManα1-3腕に結合している。
【００４７】
トリマンノシルコアの還元末端に位置するGlcNAc のC-6位へのフコースの結合の有無、またβ-マンノシル残基のC-４位へのβ-GlcNAcの結合（バィセクテイングGlcNAc と呼ばれる）の有無は、複合型や混成型糖鎖の構造の多様性に寄与している。３つのＮ型糖鎖の間で、複合型が最も多様な構造を含んでいる。
【００４８】
この多様性は、主に２つの要素で作り出され、トリマンノシルコアに１個から５個の側鎖がそれぞれ異なる結合位置で結合しており、一、二、三、四、または五本側鎖糖鎖を形成している。三本側鎖の複合型糖鎖には、〔GlcNAcβ1-4（GlcNAcβ1-2）Manα1-3〕あるいは〔GlcNAcβ1-6（GlcNAcβ1-2）Manα1-6〕のどちらかを含む２つの異性体が見つかっている。
【００４９】
なお上記トリマンノシルコアにおいて、アスパラギンと結合する糖鎖の末端、すなわちGlcNAc側の末端を還元末端、その反対側、すなわちMan側の末端を非還元末端という。
【００５０】
ポリペプチドが糖鎖と結合するか否かは、例えば標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したカラムに、試験対象であるポリペプチドを通し、当該カラムにポリペプチドが結合したか否かをその通過液に含まれるポリペプチドの量、または特異的溶出剤でカラムから溶出したポリペプチドの量により評価することができる。また標的となる糖鎖が結合した糖タンパク質をメンブレン等に固定化し、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ等で標識したポリペプチドを用いて検出するウエスタンブロット法（法医学の実際と研究、37, 155, 1994 参照）、ドットブロット法（Analytical Biochemistry, 204(1), 198, 1992 参照）を用いて評価することができる。
【００５１】
また標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したチップと、試験対象であるポリペプチドとの親和性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて測定すればよい。上記方法によれば、その親和性の有無のみならず、その強度まで測定できるために好ましい方法であるといえる。このとき得られる結合定数（親和定数）（ＫＡ）が、１０（Ｍ-1）以上、より好ましくは１０３（Ｍ-1）以上、最も好ましくは１０４（Ｍ-1）以上であればポリペプチドと糖鎖とが結合していると判断できる。
【００５２】
本発明にかかるポリペプチドには上記（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と、特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも含まれることに留意すべきである。また、上記（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と、当該任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００５３】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される本発明にかかるポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００５４】
（２）ポリヌクレオチド
本発明は、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００５５】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００５７】
本発明にかかるポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は、配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。
【００５８】
例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Applied Biosystems Incorporated（ABI，850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404）392型シンセサイザーなどによって合成される。
【００５９】
合成的に作製した上記フラグメントとしては、例えば宿主のコドンに対して配列を最適化した合成ポリヌクレオチドを挙げることができる。このような合成ポリヌクレオチドは、各種の発現系を用いる場合に利用可能である。
【００６０】
また本発明にかかるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００６１】
本発明はさらに、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００６２】
このような変異体としては、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００６３】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
一実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、かつ、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
【００６５】
他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
【００６６】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６７】
上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６８】
ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００６９】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００７０】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００７１】
あるいは、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００７２】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、所望のポリヌクレオチドを含む生物材料であることが好ましい。特に、本発明にかかるポリペプチドの起源であるトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）が好ましい。ただし、これに限定されるものではない。
【００７３】
なお本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７４】
（３）本発明にかかるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの利用
（３−１）抗ウイルス剤
本発明にかかる抗ウイルス剤は、上記本発明にかかるポリペプチドを含有し、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とする。上記ウイルスは、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスであれば特に限定されるものではなく、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＨＨＶ−６、ＳＡＲＳウイルス等を挙げることができる。
【００７５】
上記ウイルスには、表面に備える高マンノース型糖鎖を宿主細胞の表面レセプターに結合させることによって宿主に感染するものが存在する。例えばＨＩＶは、表面にｇｐ１２０という糖タンパク質を備えており、ｇｐ１２０が有する高マンノース型糖鎖が宿主リンパ細胞表面レセプターであるＣＤ４を認識することによって宿主に感染する。
【００７６】
一方、上記抗ウイルス剤に含まれる本発明にかかるポリペプチドは、高マンノース型糖鎖と特異的に結合することができる。それゆえ、上記抗ウイルス剤を用いれば上記ウイルスの感染を効果的に阻害することができる。
【００７７】
また、ウイルスの宿主への感染が、ｇｐ１２０とＣＤ４との関係のような、ウイルス表面糖タンパク質の高マンノース型糖鎖と、宿主側の高マンノース型糖鎖のレセプターとの直接結合によるものではない場合もある。例えば、高マンノース型糖鎖を有するものの、高マンノース型糖鎖は宿主のレセプターと直接結合せず、糖タンパク質によって上記レセプターに結合するタイプのウイルスを挙げることができる。このようなウイルスとしては例えばインフルエンザウイルスを挙げることができる。
【００７８】
上記抗ウイルス剤に含まれる本発明にかかるポリペプチドは、高マンノース型糖鎖と特異的に結合することができる。これにより糖タンパク質に対するアロステリック効果が得られ、高マンノース型糖鎖がレセプターとの結合に直接関与しない場合でもウイルスの感染を防ぐことができると考えられる。よって、上記抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルス等の感染も有効に阻害することができる。
【００７９】
なお、ウイルスの型は特に限定されるものではない。例えばＨＩＶは１型でも２型でもよく、インフルエンザウイルスはＡ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれであってもよい。
【００８０】
「高マンノース型糖鎖を備える」とは、高マンノース型糖鎖がウイルスの表面に存在することを言う。例えば、高マンノース型糖鎖がキャプシドの外部へ露出した状態や、ウイルスの表面糖タンパク質の構成成分として存在する場合を挙げることができる。
【００８１】
高マンノース型糖鎖は、上述のように、宿主細胞のレセプターへ直接結合するものであってもよいし、宿主細胞のレセプターへ直接結合しないものであってもよい。上述のように、本発明にかかる抗ウイルス剤は、いずれの高マンノース型糖鎖を有するウイルスであっても有効に感染を阻害することが可能である。
【００８２】
本発明にかかる抗ウイルス剤は経口製剤、非経口製剤のいずれであってもよい。また、剤型は特に限定されるものではなく、常法に従い、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤、マイクロカプセル剤あるいは懸濁液剤等に製剤化して用いることができる。
【００８３】
非経口的に投与する場合には、例えば、本発明にかかるポリペプチドを含有する溶液を点鼻噴霧することや、注射剤として投与することができる。経口的に投与する場合には、食前、食後、食間のいずれに投与してもよい。
【００８４】
本発明にかかる抗ウイルス剤は、必要に応じて、担体、賦形剤、結合剤、膨化剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、防腐剤、安定剤、被覆剤等の材料を含有することができる。
【００８５】
本発明にかかる抗ウイルス剤において、例えば錠剤、カプセル剤等に含有することができる具体的な成分としては、トラガント、アラビアゴム、コーンスターチおよびゼラチンのような結合剤； 微晶性セルロース、結晶セルロースのような賦形剤； コーンスターチ、前ゼラチン化デンプン、アルギン酸、デキストリンのような膨化剤； ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤； 微粒二酸化ケイ素のような流動性改善剤； グリセリン脂肪酸エステルのような滑沢剤； ショ糖、乳糖およびアスパルテームのような甘味剤； ペパーミント、ワニラ香料およびチェリーのような香味剤等を挙げることができる。
【００８６】
調剤単位形態がカプセル剤である場合には上記のタイプの材料にさらに油脂のような液
状担体を含有することができる。
【００８７】
また、種々の他の材料を、被覆剤としてまたは調剤単位の物理的形態を変化させるために含有させることができる。錠剤の被覆剤としては、例えば、シェラック、砂糖またはその両方が挙げられる。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ香味等を含有することができる。その他、各種ビタミン類、各種アミノ酸類を含有しても良い。
【００８８】
本発明にかかる抗ウイルス剤の適用対象は、ヒト、ヒト以外の動物〔例えば、ヒト以外の哺乳類（ブタ、ウシ、ウマ、イヌ等の家畜） 、鳥類（ニワトリ等の家禽）等〕のいずれであってもよい。家畜や家禽等へ適用することにより、それらの経済的損失を軽減することができる。また、それらを食用とする場合も多いため、ヒトへの感染予防という点からも重要である。
【００８９】
本発明にかかる抗ウイルス剤の投与量は、適用対象が必要とする量を確保できるように設定すればよく、製剤化して用いたり、飲食品に配合して上記抗ウイルス剤を用いることができる。
【００９０】
（３−２）ウイルス除去膜
本発明にかかるウイルス除去膜は、本発明にかかる上記ポリペプチドが固定されてなるものである。上記ウイルス除去膜は、例えば従来公知の限外ろ過膜に上記ポリペプチドを固定することによって作製することができる。
【００９１】
上記限外ろ過膜としては、従来公知のポリマー、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド類、ポリイミド類、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド等によって形成された膜を挙げることができ、平膜型であっても多孔性中空糸膜型であってもよい。
【００９２】
上記限外ろ過膜に上記ポリペプチドを結合するためには、従来公知のプロセスを用いて、限外ろ過膜のポリマーをまず賦活化し、タンパク質と化学的に結合しやすい状態にする。上記ポリマーとしては複数の異なるポリマーを用いてもよい。
【００９３】
ポリマーを賦活化させた後、本発明にかかる上記ポリペプチドを直接あるいはリンカーを用いて付着させ、アフィニティーマトリクスを形成する。好ましいリンカーとして、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
上記ポリペプチドは、二価性試薬のようなカップリング剤を用いて、限外ろ過膜のポリマーに直接結合されてもよく、あるいは間接的に結合されてもよい。アフィニティーマトリクスを形成するためには、アガロースに共有結合的に連結されたＭＰＬを使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００９５】
ＨＩＶのような、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスの粒子および／またはそのフラグメントを含有する血液等を上記ウイルス除去膜にアプライすると、上記ウイルス除去膜に固定された本発明にかかるポリペプチドが、ウイルスの粒子および／またはそのフラグメントが有する高マンノース型糖鎖と結合するため、血液は孔を通過し、ウイルスの粒子および／またはそのフラグメントは捕捉されるため孔を通過することができない。それゆえ、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを血液等から除去することができる。
【００９６】
（３−３）ベクター
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明にかかるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００９７】
本発明にかかるベクターは、上述した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００９８】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９９】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１００】
上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明にかかるポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明にかかるポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１０１】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１０２】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明にかかるポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１０３】
このように、本発明にかかるベクターは、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１０４】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０５】
（３−４）形質転換体または細胞
本発明は、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。ここで「形質転換体」とは、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
【０１０６】
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。
【０１０７】
本発明にかかる形質転換体または細胞は、海藻類もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、トサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）であることが特に好ましい。
【０１０８】
本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。
【０１０９】
このように、本発明にかかる形質転換体または細胞は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体または細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１１０】
本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体または細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体または細胞も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１１】
（３−５）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法を提供する。
【０１１２】
一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【０１１３】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【０１１４】
本実施形態の他の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明にかかるポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１１５】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１１６】
本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１１７】
ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述したオリゴヌクレオチドを用いて、本発明にかかるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１１９】
さらに他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明にかかるポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【０１２０】
以上のように、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【０１２１】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Hashimoto-Gotoh, Gene, 152，271-275（1995）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
【０１２２】
このように、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列、または本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【０１２３】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【実施例】
【０１２４】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２５】
〔実施例１：トサカノリからのポリペプチド（ＭＰＬ）の単離〕
（抽出液の調製および硫安沈殿）
九州西岸にて採集したトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）の凍結藻体５００ｇを液体窒素下で粉末とした。これに５００ｍｌの２０ｍＭ ＰＢＳＡ（Phosphate-buffered saline sodium azide；０．０２％アジ化ナトリウム入り２０ｍＭ ＰＢＳ；ｐＨ７．０）を加え、４℃で一晩撹拌した後、遠心分離を行なって一次抽出液を得た。残渣を７００ｍｌの２０ｍＭ ＰＢＳＡで同様に抽出し、二次抽出液を得た。両抽出液を合一し、ＵＶ２８０ｎｍの吸収および凝集活性を測定した。
【０１２６】
上記抽出液に硫安粉末を２０％飽和となるように少しずつ撹拌しながら加え、この混合液を４℃で一晩静置した。これを遠心分離（８５００ｒｐｍ、３０分間）して得られた沈殿を、ＰＢＳＡに溶解後、同溶媒に対し十分透析した。透析終了後、内液を遠心分離し、得られた上清を２０％飽和硫安塩析沈殿画分とした。一方、２０％飽和硫安塩析処理で得られた上清に、硫安粉末を６０％飽和となるように加え、同様に処理して、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を得た。当該画分につき、ＵＶ２８０ｎｍの吸収および凝集活性を測定した。
【０１２７】
（疎水クロマトグラフィー）
上記２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分１０６ｍｌのうち、１０ｍｌについて、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行ない、内液６ｍｌを得た。得られた内液を遠心分離(10,000 rpm、１０分間)して上清を回収した。得られた上清５ｍｌを同緩衝液で平衡化したHiPrep Phenyl FFカラム（16×100ｍｍ, Vt=20 ml）に注入し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７.０（溶媒Ａ）と、蒸留水（溶媒Ｂ）の２液を用いる濃度勾配法により溶出した。濃度勾配［溶媒Ｂ１００％（１０分）、溶媒：Ｂ０％−溶媒Ａ１００％（１０−６０分）、溶媒Ａ１００％（６０−１１０分）］は、グラジェントプログラマー（ＣＣＰコントローラー、東ソー社製）を用いて設定し、流速は４ｍｌ／分とした。溶出液は５ｍｌずつ分取し、ＵＶ２８０ｎｍの吸光度を測定するとともに凝集活性を測定した。
【０１２８】
（ゲルろ過）
疎水クロマトグラフィーで分取した活性画分を合一し、限外濾過により５ｍｌに濃縮した。そのうち１ｍｌを、0.3 M NaCl を含む２０ｍＭ ＰＢ (pH 7.0)で平衡化したTSKgel G3SWxLゲルろ過カラム（東ソー社製、7.8 x 300 mm、Vt＝14.7 ml）に供した。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH 7.0）を用いて流速１ml／minで溶出した。溶出液は１ｍｌずつ分取し、各フラクションのＵＶ２８０ｎｍの吸光度および凝集活性を測定した。
【０１２９】
（凝集活性の検討）
赤血球凝集活性は、マイクロタイター法を用いて測定した。生理食塩水にて調製した各精製画分溶液の２倍段階希釈液、各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製した。各希釈液に２％赤血球浮遊液２５μlを加えて軽く撹拌し、室温で１．５時間静置後、凝集能を観察した。凝集能は肉眼で判定し、赤血球の５０％以上が凝集している場合を陽性とした。凝集活性は、赤血球凝集活性（力価）、すなわち凝集活性を示す最大希釈液の希釈倍数の逆数、および凝集素価（力価）、すなわち凝集活性を示す最大希釈液のタンパク質の濃度（最小凝集濃度）で示した。
【０１３０】
本実施例においては、赤血球としてトリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）を用いた。なお、赤血球浮遊液の調製は次のように行なった。まず、実験室で飼育中のウサギの耳から血液２ｍｌを採取し、これを約５０ｍｌの生理食塩水で３回洗浄後、５０ｍｌの生理食塩水を加えて２％のウサギ赤血球浮遊液を調製した。これに１／１０容の０．５％トリプシン−生理食塩水を加え、３７℃で１．５時間静置した。このトリプシン処理赤血球を生理食塩水で３回洗浄後、４５ｍｌの生理食塩水を加え、トリプシン処理２％ウサギ赤血球浮遊液（ＴＲＢＣ）とした。
【０１３１】
トリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）に対する凝集活性成分を検討したところ、表１に示すように、上記抽出液、上記２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分、上記疎水クロマトグラフィーによって得られた画分、および上記ゲルろ過によって得られた画分に強い赤血球凝集活性が検出された。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
表１中、「タンパク質濃度」は、「ａ」を付したものについてはＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ280）を測定し、Ａ280（１ｍｇ／ｍｌ）＝１．０より算出した。「ｂ」を付したものについてはＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ280）を測定し、本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列から求めた分子吸光係数を用いてＡ280（１ｍｇ／ｍｌ）＝０．９７より算出した。
【０１３４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記ゲルろ過で得られた凝集活性を有する画分（精製画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。結果を図３に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分（非還元下）、レーン３は２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分（還元下）、レーン４は上記精製画分（非還元下）、レーン５は上記精製画分（還元下）を示す。なお、タンパク染色はＣＢＢ（Coomassie brilliant blue R-250）染色を行なった。
【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、精製画分は、還元下で１４ｋＤａの、非還元下で２６ｋＤａの単一バンドを与えるものであることが確認されたことから、同一サブユニット（１４ｋＤａ）がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）した２量体からなると推定される。以上のように、上記抽出液を硫安塩析、疎水クロマトグラフィーおよびゲルろ過に順次供した精製過程により最終的に０．４ｍｇの精製画分が得られた。表１に示す収量６ｍｇは藻体５００ｇ（湿重量）当たりに換算した値である。本発明者らは、当該精製画分を「ＭＰＬ」と命名した。
【０１３６】
なお、本発明者は、上記ＭＰＬは、上記２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供することによって効果的に調製できることも確認した。陰イオン交換クロマトグラフィーによって、トサカノリに含まれる他のレクチン（ＭＰＡと称する）と上記ＭＰＬとを効果的に分離することができる。
【０１３７】
上記陰イオン交換クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
【０１３８】
ＭＰＡとＭＰＬの両レクチンを同時に精製することを意図して、先に調製した２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、HiPrep QXL 16/10カラム（φ1.6×10 cm、Vt = 20 ml、GE Healthcare社）を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。
【０１３９】
すなわち、上記カラムを０．０２Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡化し、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分５ｍｌを添加した。カラムを上記緩衝液で十分洗浄した後、上記緩衝液中０Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で溶出した。流速は５ｍｌ／ｍｉｎとした。洗浄液は１０ｍｌずつ、濃度勾配溶出液は５ｍｌずつ分取した。
【０１４０】
各フラクションにつき、Ａ２８０吸光度および赤血球凝集活性を測定した。赤血球凝集活性が見られた画分は、還元下SDS-PAGEに付した。その結果より、各フラクションを５つの画分に分けた。各画分につき、Folin-Lowry法によるタンパク質量の測定および赤血球凝集活性試験に供した。
【０１４１】
その結果、両レクチンはカラムに吸着し、ＭＰＡは０．３７Ｍ ＮａＣｌ付近、ＭＰＬは０.５７Ｍ ＮａＣｌ付近にそれぞれ活性ピークとして溶出した。このように、陰イオンクロトマトグラフィーを用いることにより、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分に混在する２種類のレクチン、ＭＰＡ（２９ｋＤａ）とＭＰＬ（２６ｋＤａ）とを分離することができる。
【０１４２】
〔実施例２：ＭＰＬのｃＤＮＡのクローニング〕
以下に示すように、実施例１で得られた精製画分「ＭＰＬ」の１４ｋＤａサブユニットの２３Ｎ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（Procise 492HT, Applied Biosystems）を用いてGVVDQLIVTYSDGTRVSHGQPGS（配列番号１２）と決定した。当該配列の情報を参考に縮重プライマーを設計した。別途調製したトサカノリ由来1st strand cDNA溶液を鋳型にRapid Amplification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法を行うことにより、ＭＰＬのｃＤＮＡの全長塩基配列 ９４９ｂｐを明らかにした。
【０１４３】
まず、ＭＰＬの上記２３Ｎ末端のアミノ酸配列を参考にして、MPL_d_R1およびMPL_d_R2の各プライマーを作製した。
【０１４４】
MPL_d_R1の塩基配列は、CCRTGISWIACICKIGTICCRTC（配列番号３）であり、MPL_d_R2の塩基配列は、TAIGTIACDATIARYTGRTC（配列番号４）である。ここで、ＤはＧ、ＡまたはＴを、Ｉはイノシンを、ＫはＧまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＷはＡまたはＴを示すＩＵＢコードである。
【０１４５】
RNAlater 中に−２０℃で保存したトサカノリ藻体より Plant RNA Isolation Reagent（Life Technologies Corp.）を用いて全ＲＮＡを抽出後、NucleoTrap mRNA（Macherey-Nagel）によりｍＲＮＡを精製し、さらに GeneRacer Kit（Life Technologies Corp.）により完全長ｃＤＮＡを調製した。
【０１４６】
次に、上記完全長ｃＤＮＡを鋳型に GeneRacer_5'_Primer および MPL_d_R1のプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。GeneRacer_5'_Primer の塩基配列はCGACTGGAGCACGAGGACACTGA（配列番号５）である。
【０１４７】
上記ＰＣＲにより得られた産物の１００倍希釈溶液を鋳型に、GeneRacer_5’_Nested_PrimerおよびMPL_d_R2のプライマーペアを用いてNested ＰＣＲを行った。GeneRacer_5’_Nested_Primerの塩基配列は、GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA（配列番号６）である。
【０１４８】
得られたNested ＰＣＲの産物を低融点アガロースにより精製後、pGEM-T Easy Vector System（PROMEGA製）を用いてサブクローニングを行い、得られたクローンから精製プラスミドを回収して、ダイデオキシ法により塩基配列の決定を行った（以上5’RACE）。
【０１４９】
得られた塩基配列に基づいて新たにプライマーMPL_F1を作製した。MPL_F1の塩基配列はTGTAGCAGCCATGTCTTTGC（配列番号７）である。
【０１５０】
上記完全長ｃＤＮＡを鋳型として、MPL_F1およびGeneRacer_3’_Primerのプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を低融点アガロースにより精製後、pGEM-T Easy Vector System（PROMEGA製）を用いてサブクローニングを行い、得られたクローンから精製プラスミドを回収して、ダイデオキシ法により塩基配列の決定を行った（以上、3’RACE）。
【０１５１】
GeneRacer_3’_Primerの塩基配列はGCTGTCAACGATACGCTACGTAACG（配列番号８）である。
【０１５２】
上記5’RACEおよび3’RACEから明らかとなったMPL cDNAの5’および3’末端配列から作製したMPL_5'_End_FおよびMPL_3'_End_Rのプライマーペア、ならびに高正確性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、増幅産物につき塩基配列を決定することで、ＭＰＬ ｃＤＮＡの全長塩基配列を確認した。
【０１５３】
MPL_5'_End_Fプライマーの塩基配列はAATCCACATTCAACTGCACTG（配列番号９）であり、MPL_3'_End_Rプライマーの塩基配列はAAATCGACGCACACAGAAGTC（配列番号１０）である。
【０１５４】
ＭＰＬのｃＤＮＡの全長塩基配列、およびその演繹アミノ酸配列を図１に示す。図１において、星印は終止コドン、破線はシグナルペプチド（SignalP 3.0を用いて予測）、実線は実施例１で得られた精製画分「ＭＰＬ」の１４ｋＤａサブユニットの２３Ｎ末端配列を示す。
【０１５５】
演繹アミノ酸配列の解析から、図１に示すｃＤＮＡは、シグナルペプチド領域２２残基（１−２２）を含め、計１９８残基をコードすることがわかった。一方、演繹アミノ酸配列の解析から、図１に示すｃＤＮＡは、プロペプチド領域７４残基（２３−９６）および成熟タンパク質領域１０２残基（９７−１９８）をコードすると考えられたが、後述する実施例６においてさらに詳細に検討したところ、成熟タンパク質領域は５３番目−１９８番目の１４６アミノ酸残基であることが分かった。
【０１５６】
〔実施例３：ＭＰＬの糖結合特異性〕
ＭＰＬの糖結合特異性を赤血球凝集阻止試験により明らかにした。本赤血球凝集阻止試験には、実施例１で調製した２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分および実施例１で調製したＭＰＬを供試し、これらの赤血球凝集活性（力価４）を阻止する糖化合物を検索した。
【０１５７】
赤血球凝集阻止試験は以下のようにして行った。まず生理食塩水にて調製した糖溶液の２倍段階希釈液、各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製した。なお、使用した糖類の原液の濃度は単糖類および二糖類の場合は１００ｍＭ、糖タンパク質の場合は２ｍｇ／ｍｌとした。これに、それぞれ凝集素価（力価）４に調整した上記飽和硫安塩析沈殿画分の溶液およびＭＰＬ溶液、各２５μｌを加えて軽く撹拌後、室温で１．５時間静置した。これに２５μｌのＴＲＢＣを加え、室温で２時間静置後、凝集阻止能を観察した。
【０１５８】
凝集阻止能の有無は肉眼で判定し、赤血球の約１００％が凝集していない場合を陽性とした。凝集阻止能（凝集阻止活性）は、最小阻止濃度すなわち凝集阻止能を示す最小濃度（ｍＭまたはμｇ／ｍｌ）で表示した。結果を表２に示した。表２において、「最小凝集阻止濃度」は、上述の力価４の検液の赤血球凝集活性を阻止する糖化合物の最小濃度を表し、「ＮＴ」は未測定であることを表す。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
表２に示すように、本赤血球凝集阻止試験には、単糖類および二糖類としてＤ−グルコース（表中Glcと表示。以下、糖の名称に続く括弧内には、表２に示した略称を記載する。）、Ｄ−マンノース（Man）、Ｄ−ガラクトース（Gal）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuAc）、Ｌ−フコース（Fuc）、Ｄ−キシロース（Xyl）、Ｌ−ラムノース（Rha）、ラクトースを用いた。
【０１６１】
糖タンパク質としては、複合型糖鎖を含有するものとして、トランスフェリン、アシアロトランスフェリンを用いた。また、高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質として、イーストマンナンを用い、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質として、ブタチログロブリン、アシアロブタチログロブリンを用いた。
【０１６２】
表２から明らかなように、ＭＰＬの赤血球凝集活性は供試した単糖類および二糖類では阻止されず、高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質、並びに、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質によってのみ阻止された。このように、ＭＰＬは従来公知のレクチンとの配列相同性が非常に低く、かつ、高マンノース型糖鎖に高い親和性を有することが示された。
〔実施例４：エイズウイルスの表面糖タンパク質・ｇｐ１２０とＭＰＬとの相互作用〕
ＨＩＶの宿主への感染は、ＨＩＶの表面糖タンパク質であるｇｐ１２０と宿主リンパ細胞の表面レセプターＣＤ４との相互作用により成立する。該相互作用にはｇｐ１２０の高マンノース型糖鎖が不可欠である。そのため、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するレクチンはＨＩＶ感染の有力な阻害剤となりうる。
【０１６３】
そこで、ＭＰＬと市販品のリコンビナント糖付加HIV-1 IIIB gp120 (バキュロウイルス；１分子あたり１５本の高マンノース型糖鎖を有する。ImmunoDiagnostics製)との相互作用を表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)法を用いて定量解析した。ＳＰＲ法にはBIAcore2000（GE Healthcare社製）を用いて、リコンビナント糖付加HIV-1 IIIB gp120をＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社製）上に固定化し、ＭＰＬの溶液をアナライトとして用いて、マニュアルに従って測定、解析した。
【０１６４】
上記固定化はマニュアルに従って行った。具体的には、アミンカップリング法を用いて固定化を行った。なお、固定化量は３００〜４００ＲＵの範囲になるよう、マニュアルインジェクション法によって調整した。
【０１６５】
ＳＰＲ法では、生体分子を標識することなく、生体分子間の特異的な相互作用を微量かつ短時間で定量的に測定できる。本法では、リガンドをセンサーチップ表面上に固定化し、これに作用する物質（アナライト）を含む溶液を添加すると、分子の結合・解離により生ずる微量の質量変化がＳＰＲシグナルの変化として検出される。
【０１６６】
質量変化はレゾナンスユニット（ＲＵ）で表され、１０００ＲＵは共鳴による反射角度０．１°の変化に相当し、アナライトがリガンドに 1 ng/mm2 結合したことを意味する。センサーチップ表面の金薄膜上にはデキストランがコーティングされており、主としてこのデキストラン内に導入されたカルボキシル基を介してリガンドを固定化する。
【０１６７】
ＭＰＬと上記リコンビナントｇｐ１２０とのＳＰＲ法による親和性解析に先立ち、予備実験で解析法を検討し、非線形最小二乗法によるカイネティクス解析が適当と判断した。そこで、得られたセンサーグラムからおおよそのＫＤ値を算出し、０．１〜１０ＫＤ［Ｍ］を濃度の目安として、２倍希釈列で５段階以上のアナライト（ＭＰＬ）溶液を調製した。
【０１６８】
分析プログラムの作成には、マニュアルに従って“Customaized Application”を用い、センサーチップ内の４つのフローセルのうち、何も固定化していないフローセル１をコントロールとして、リコンビナントｇｐ１２０を固定化したフローセルからの差し引き機能を使用した。本分析プログラム下で、アナライト（ＭＰＬ）溶液をそれぞれセンサーチップ上に流速３０μｌ/minで３分間流した後、バッファーを３分間流し、レクチンの結合・解離量を測定した。なお、アナライト添加開始後５秒から添加終了５秒前までのＲＵの増加量を結合量、バッファー添加開始後１０秒から添加終了１０秒前までのＲＵ減少量を解離量とした。
【０１６９】
次に、１００ｍＭ ＨＣｌおよび１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて、センサーチップを洗浄して再生した。得られたセンサーグラムについて、結合相と解離相を同時にカーブフィッティングさせ、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋd、親和定数ＫＡ、および解離定数ＫＤを算出した。
【０１７０】
結果を図２に示す。図２のＡは固定化したｇｐ１２０とＭＰＬとの相互作用のセンサーグラムであり、図２のＢはｇｐ１２０とＭＰＬとの親和定数を示す。図２のＢには、結合速度定数Ｋa(M-1s-1)、解離速度定数Ｋd(s-1)、親和定数ＫA(M-1)、および解離定数ＫD(M)を示した。なお親和定数は、その値が大きくなればなるほど、親和性が高い（結合力が強い）ことを意味する。
【０１７１】
図２に示すように、ＭＰＬはｇｐ１２０に強い親和性（KD= 4.50×10-9 M）を持つことが認められた。このことから、ＭＰＬは、従来公知のレクチンとの配列相同性が非常に低い上に、ＨＩＶのｇｐ１２０と宿主リンパ細胞のＣＤ４との相互作用を十分に阻害できるといえる。それゆえ、ＭＰＬは新たな抗ＨＩＶ剤として有望である。
【０１７２】
また、実施例３に示したように、ＭＰＬは高マンノース型糖鎖に高い親和性を有する。そのため、ＭＰＬは抗ＨＩＶ剤として有望である。また、高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質が宿主のレセプターと結合することによって感染するタイプのウイルスに対しても有力な感染阻害剤となりうる。
【０１７３】
〔実施例５：ＭＰＬのさらなる精製〕
（実施例５−１：陰イオン交換クロマトグラフィーによるトサカノリレクチンの精製）
実施例１で述べたように、ＭＰＡとＭＰＬとの分離に陰イオン交換クロマトグラフィーが有用であることが判明したので、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製についてさらなる検討を行い、精製方法を改良した。
【０１７４】
実施例１で調製した２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分６８ｍｌを、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、当該緩衝液を「ＴＢ」と称する）で平衡化したHiPrep QXL 16/10カラム（φ1.6×10 cm、Vt = 20 ml、GE Healthcare社）に添加し、カラムをＴＢで十分洗浄後、ＴＢ中０．２Ｍおよび１Ｍ ＮａＣｌで順次、段階的に溶出した（ステップワイズ溶出）。その結果、活性成分は０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分に認められた。
【０１７５】
図４は、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ステップワイズ溶出）に供した結果を示す図である。
【０１７６】
図４中、横軸はフラクション番号であり、縦軸は左側が２８０ｎｍの吸光度を表し、右側が赤血球凝集活性（力価）を表す。図中、当該吸光度測定結果を丸印で示し、赤血球凝集活性（力価）の測定結果を三角印で示した。
【０１７７】
括弧書き数字１は、上記カラムに２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を添加し、非吸着成分を洗浄後、ＴＢ中０．２Ｍ ＮａＣｌにより吸着成分の溶出を開始した位置を示している。括弧書き数字２は、上記溶出後、ＴＢ中１Ｍ ＮａＣｌにより他の吸着成分の洗浄を開始した位置を示している。
【０１７８】
図４に示すように、赤血球凝集活性成分は０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分に認められた。この赤血球凝集活性成分（粗レクチン画分）７０ｍｌを、ＴＢで平衡化したHiPrep QXL 16/10カラムに添加し、カラムをＴＢで洗浄後、ＴＢ中ＮａＣｌの濃度勾配（０〜０．２Ｍ）で溶出させた（グラジエント溶出法）。
【０１７９】
溶出液は２８０ｎｍの吸光度をモニターするとともに、２ｍｌずつ分取し、各画分の赤血球凝集活性を測定した。図５は、上記粗レクチン画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出）に供した結果を示す図である。図５に実線で示すように、上記溶出液は、凝集活性を示す３つのタンパク質のピークに分離した。
【０１８０】
図５において、横軸はフラクション番号である。左側の縦軸は２８０ｎｍの吸光度を表し、吸光度の測定結果は実線で示されている。右側の縦軸では、「ＨＡ」が赤血球凝集活性（力価）を表し、赤血球凝集活性（力価）の測定結果は三角印で示されている。右側の縦軸のうち、”ＮａＣｌ ｉｎ ＴＢ”は、ＮａＣｌ（ＴＢ中）の濃度勾配を示し、図中、濃度勾配は点線で示されている。
【０１８１】
上記溶出液を、図５に示す４つの画分（Ｉ〜ＩＶ）に分画し、各画分とも、２０μｇのタンパク質に相当する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。結果を図６に示す。なお、タンパク染色はＣＢＢ（Coomassie brilliant blue R-250）染色を行なった。
【０１８２】
図６のＡは非還元下における泳動結果を示し、図６のＢは還元下における泳動結果を示す。Ｍは分子量マーカー、レーン１は２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分、レーン２はHiPrep QXL 16/10カラム（ステップワイズ溶出）で得られた赤血球凝集活性成分（０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分）、レーン３は画分Ｉ、レーン４は画分ＩＩ、レーン５は画分ＩＩＩ、レーン６は画分ＩＶを示す。なお、上記赤血球凝集活性成分は、「粗レクチン画分」とも称される。
【０１８３】
画分ＩおよびＩＩは、図６のＢに示すように、還元下で２９ｋＤａのほぼ単一のバンドを与えることが確認された。そこで、画分ＩをＭＰＡ−１、画分ＩＩをＭＰＡ−２と命名し、最終精製レクチンとした。
【０１８４】
ＭＰＡ−１およびＭＰＡ−２は、詳細は示さないが、分子量測定、Ｎ末端アミノ酸配列解析およびｃＤＮＡクローニングの結果から、実施例１で述べたＭＰＡ（２９ｋＤａ）のアイソフォームであることが分かった。
【０１８５】
実施例１で述べたＭＰＬは画分ＩＶに溶出した。画分ＩＶは、非還元下では２６ｋＤａおよび５５ｋＤａの２つのバンド成分を与え（図６のＡ）、還元下では１４ｋＤａの主要バンド成分と、８ｋＤａおよび５ｋＤａの微量バンド成分を与えた。なお、画分ＩＩＩは還元下で２９ｋＤａおよび１４ｋＤａのバンド成分を与えることから、ＭＰＬとＭＰＡとを混有すると考えられる。
【０１８６】
（実施例５−２：陰イオン交換クロマトグラフィーによるＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の単離）
上記ＭＰＬ画分（画分ＩＶ）５ｍｌを、ＴＢで平衡化したTSKgel DEAE-5PWカラム（7.5×75 mm、東ソー社）に添加し、ＴＢ中ＮａＣｌの濃度勾配（０−０．２Ｍ）によるグラジエント溶出を行った。操作中、２８０ｎｍの吸光度をモニターしながらピークをそれぞれ分取した。
【０１８７】
図７は、ＭＰＬのTSKgel DEAE-5PWカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製結果を示す図である。図中、横軸は溶出時間を表し、左側の縦軸は２８０ｎｍの吸光度、右側の縦軸はＮａＣｌの濃度を示す。また、実線は２８０ｎｍの吸光度の測定結果を示し、点線はＮａＣｌの濃度を示す。（１）〜（４）はピーク番号である。
【０１８８】
TSKgel DEAE-5PWカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーの結果、図７に示すように、ＭＰＬは４つのピーク（ピーク（１）〜（４））に分離された。そこで次に、ピーク（１）〜（４）をそれぞれ分取後、２０μｇのタンパク質に相当する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。結果を図８に示す。
【０１８９】
図中、「非還元」は非還元下における泳動結果を示し、「還元」は還元下における泳動結果を示す。Ｍは分子量マーカーを示し、ＳはＭＰＬ、レーン１〜４はそれぞれピーク（１）〜（４）を泳動させた結果を示す。
【０１９０】
還元下において、ピーク（１）および（３）で１４ｋＤａのほぼ単一のバンドが認められた。ピーク（１）および（３）は、非還元下において２６ｋＤａ付近のタンパク質性バンドを与えた。
【０１９１】
ピーク（２）および（４）については、非還元下で５５ｋＤａ、還元下では１４ｋＤａの他に８ｋＤａおよび５ｋＤａのペプチドの存在が確認された。全ピークに共通して非還元下で２６ｋＤａおよび５５ｋＤａにタンパク質性バンドの存在が認められたが、ピーク（１）および（３）では２６ｋＤａ成分、ピーク（２）および（４）では５５ｋＤａ成分を主成分としていることがわかった。
【０１９２】
そこで、ピーク（１）をＭＰＬ−１、ピーク（３）をＭＰＬ−２と命名し、最終精製標品とした。ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２につき、LTQ Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific）を用いる ESI-MSにより分子量の測定を行った。図９はＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の分子量測定結果を示すものである。
【０１９３】
図９のＡ，Ｂより、ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の分子量はそれぞれ31,104.1 Ｄａおよび31,132.0 Ｄａであることが分かった。
【０１９４】
ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２について、実施例３と同様の方法により、赤血球凝集阻止試験を行った。結果を表３に示す。
【０１９５】
【表３】
【０１９６】
表３では「単糖類および二糖類」と記載しているが、これは、実施例３と同様に、単糖類としてＤ−グルコース（Glc）、Ｄ−マンノース（Man）、Ｄ−ガラクトース（Gal）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuAc）、Ｌ−フコース（Fuc）、Ｄ−キシロース（Xyl）またはＬ−ラムノース（Rha）を各１００ｍＭで用い、二糖類としてラクトース（Lac）を１００ｍＭ用いたことを示す。
【０１９７】
複合型糖鎖を含有する糖タンパク質、高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質、並びに、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質としては、実施例３と同じものを用いた。加えて、Ｎ型糖鎖（複合型）およびＯ型糖鎖を含有する糖タンパク質としてフェツイン、アシアロフェツインを用い、Ｏ型糖鎖を含有する糖タンパク質としてウシ顎下線ムチン、アシアロウシ顎下線ムチンを用いた。
【０１９８】
表３から明らかなように、ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の赤血球凝集活性は、実施例３に示したＭＰＬと同様に、高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質、並びに、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質によってのみ阻止された。このように、ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２は、ＭＰＬと同様に、高マンノース型糖鎖に高い親和性を有することが示された。
【０１９９】
〔実施例６：ＭＰＬの構造解析〕
（実施例６−１：ＭＰＬ画分のブロッティング）
実施例１で得られたＭＰＬ画分（２６ｋＤａ）を非還元下および還元下（2-メルカプトエタノール添加）で１２％トリス-トリシン系ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、Polyvinylidene difluoride（ＰＶＤＦ）膜（Immobilon-P（登録商標）、Millipore）へ転写した。
【０２００】
ＰＶＤＦ膜への転写は、セミドライブロッティング装置（AE-6677：ATTO CORPORATION）を用いてブロッティング緩衝液（CAPS buffer：メタノール：超純水= 1:1:8）中、１４４ｍＡの定電流で１時間通電することによって行った。
【０２０１】
CAPS bufferはCAPS（3-Cyclohexylaminopropane sulfonic acid、和光純薬工業）１１．１ｇを４５０ｍｌの超純水に溶解し、ＮａＯＨを用いてｐＨ１１．０に調整した後、超純水で５５０ ｍｌにメスアップしたものを使用した。転写後のＰＶＤＦ膜はＣＢＢ染色を行い、一晩風乾後、目的とする１４ｋＤａ成分および８ｋＤａの成分を切り出して、実施例２同様に、Procise（登録商標）４９２ＨＴを用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。
【０２０２】
図１０は、ＭＰＬ画分をブロッティングし、ＣＢＢ染色したＰＶＤＦ膜を示す図である。図１０において、Ｍは分子量マーカーを示し、「非還元」は非還元下において得られたバンド、「還元」は還元下において得られたバンドを示す。
【０２０３】
（実施例６−２：Ｎ末端アミノ酸配列の解析およびＭＰＬ−１のアミノ酸配列の決定）
図１０に示す８ｋＤａの成分のＮ末端アミノ酸配列はGVVDQLI（配列番号１４）と決定された。この配列は、実施例２で決定された配列番号１２に示すアミノ酸配列のＮ末端と一致した。
【０２０４】
一方、１４ｋＤａの成分については、配列が解析できず、Ｎ末端がブロッキングされていると推測された。そこで、ピログルタミル基によるＮ末端ブロッキングと予測し、脱ピログルタミル化を試みた。
【０２０５】
すなわち、１４ｋＤａ成分を転写したＰＶＤＦ膜を６０％メタノール１ｍｌで２回洗浄後、９０％メタノール１ｍｌで１回洗浄し、これを０．５％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（PVP）-55含有１００ｍＭ 酢酸５００μｌに浸漬し、３７℃で３０分間静置した。次に、蒸留水で膜を１０回以上洗浄し、膜をメタノールで湿らせ、酵素消化を行った。
【０２０６】
酵素消化は、Pfu Pyroglutamate Aminopeptitase（TAKARA）２ｍＵを、酵素反応緩衝液（１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ ７．０））２００μｌ中に溶解し、本溶液中に膜を浸漬後、５０℃で５時間反応させることによって行った。本反応によりピログルタミル基を除去後、膜を蒸留水で３回洗浄し、Procise（登録商標）４９２ ＨＴを用いて分析した。
【０２０７】
その結果、２残基以降の配列がTGSCNTFQRS（配列番号１５）と決定された。これらの結果から、１４ｋＤａの成分のＮ末端はグルタミンがピログルタミル化することによりブロッキングされ、そのＮ末端アミノ酸配列は、QTGSCNTFQRS（配列番号１６）であることがわかった。
【０２０８】
本配列は、図１に示すように、実施例２においてｃＤＮＡクローニングにより明らかとされたＭＰＬ ｃＤＮＡの演繹アミノ酸配列中、実施例２でプロペプチドと予想された領域（２３−９６）の５３番目の残基以降に認められた。図１において、今回決定した１４ ｋＤａ成分のＮ末端アミノ酸配列をボックスで示す。
【０２０９】
ＭＰＬ ｃＤＮＡの演繹アミノ酸配列うち、５３−１９８残基からなる領域の算出分子量は15,553.3 Daであるが、ＥＳＩ−ＭＳによるＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の測定分子量は、実施例５−２で求めたように、それぞれ31,104.1 Daおよび31,132.0 Daである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図６、８）から、ＭＰＬはＳ−Ｓ結合によるホモダイマーであると考えられることから、５３−１９８残基からなる成分が１つのＳ−Ｓ結合により二量体を形成していると仮定すると、その算出分子量は31,104.6となり、ＭＰＬ−１の測定分子量と一致する。
【０２１０】
これらの結果から、実施例２で得られたｃＤＮＡはＭＰＬ−１をコードするものであり、ＭＰＬ−１は１５．６ｋＤａサブユニットのジスルフィド結合による二量体であることがわかった。
【０２１１】
すなわち、ＭＰＬ−１のサブユニット（上記１５．６ｋＤａサブユニット）のｃＤＮＡの全長塩基配列は配列番号１１に示される配列であり、当該塩基配列の演繹アミノ酸配列は配列番号１３に示される配列である。また、ＭＰＬ−１のサブユニットの成熟タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に示し、その演繹アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０２１２】
このことから、ＭＰＬ−１は、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドの二量体であるということができる。
【０２１３】
そして、当該二量体を含有する抗ウイルス剤も、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とする抗ウイルス剤として用いることができる。また、当該二量体を例えば限外ろ過膜などに固定されてなる膜も、ウイルス除去膜として用いることができる。
【０２１４】
加えて、実施例２で得られたＭＰＬのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１２）は８ｋＤａ成分のものであることがわかった。この８ｋＤａ成分は１５．６ｋＤａ成分に由来することが明らかであるが、１５．６ｋＤａ成分の分解産物であるか、ＭＰＬの構成成分として機能しているかどうかについてはさらなる解析が必要である。
【０２１５】
なお、ＥＳＩ−ＭＳによる測定分子量とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の推定分子量に差異がみられたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によるタンパク質の移動度は、成分の性質（電荷、疎水性、構造等）により実際の分子量と数ｋＤａのズレが生じることがある。
【０２１６】
そのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の成分について、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の推定分子量である１４ｋＤａと、ＥＳＩ−ＭＳによる測定分子量である１５．６ｋＤａ成分とにずれがあることは特に問題はないと考えられる。
【０２１７】
Ｐｆａｍプログラムによる分子内ドメイン検索にＭＰＬ−１を供したところ、ＭＰＬ−１はJacalin-like lectinドメインを含み、紅藻 Griffithsia sp.由来レクチン Griffithsin（GRFT）およびバナナ Musa acuminataレクチンとの配列相同性（同一率）はそれぞれ３３％および２７％と非常に低いものであった。
【０２１８】
成熟タンパク質領域につきBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）を用いて相同配列検索を行ったところ、上記２種のレクチンを含むJacalin-like lectinドメインを有するものが見られたが、その多くはhypothetical proteinであり、ＭＰＬ−１と最も高い同一率を示したものは細菌Brevibacillus laterosporus由来hypothetical protein（３５％）であった。
【０２１９】
このように、ＭＰＬ−１には、部分的には既知レクチンのモチーフと類似するモチーフが存在することが示されたが、従来公知のレクチンとの配列相同性は非常に低く、全体配列から新規タンパク質であることが分かった。
【０２２０】
〔実施例７：ＭＰＬ−１の糖鎖結合特異性〕
（実施例７−１：遠心限外ろ過−ＨＰＬＣ法）
上述のように精製されたＭＰＬ−１につき、糖鎖結合特異性を調べた。すなわち、まず、５０ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の５００ｎＭ ＭＰＬ−１溶液９０μｌ（４５ｐｍｏｌ）と３００ｎＭ ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖水溶液１０μｌ（３ｐｍｏｌ）を軽く混合後、室温で６０分間保温した。
【０２２１】
この反応液を微量遠心限外ろ過器（Nanosep 10K Omega、PALL）を用いて遠心ろ過（10,000×g、30秒）し、ろ液の２０μｌをＨＰＬＣに供し、溶出するＰＡ化糖鎖の量を測定し遊離糖鎖量とした。
【０２２２】
次に、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の９０ｍｌとＰＡ化糖鎖水溶液１０μｌを混合後、同様に処理し、そのろ液の２０μｌをＨＰＬＣに供し、溶出するＰＡ化糖鎖の量を測定して添加糖鎖量とした。
【０２２３】
結合糖鎖量は、添加糖鎖量から反応液の遊離糖鎖量を差し引いた値として算出した。レクチンの糖鎖結合活性は結合率、すなわち添加糖鎖量に対する結合糖鎖量の割合（％）で表示した。なお、結合試験は各糖鎖につき２回行い、結合率は平均値として算出した。
【０２２４】
ＰＡ化糖鎖の分離、定量は逆相系ＨＰＬＣを用いて行った。すなわち、検液を４０℃のカラムオーブン中、TSKgel ODS-80TM カラム（4.6×150 mm）に注入し、０．１Ｍ 酢酸アンモニウム−１５％メタノールで溶出した。流速は１．０ ｍｌ／ｍｉｎとし、溶出液は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍでモニターし、各糖鎖のピーク面積をEZChrom Elite（アジレントテクノロジー）で解析、定量した。
【０２２５】
供試糖鎖としてＰＡ化糖鎖２７種：Ｎ−グリコシド型糖鎖の複合型６種（PA-Sugar Chain 001、002、004、009、010、023、TAKARA）、高マンノース型１１種（PA-Sugar Chain 017、018、019、020、051、052、053、054、055、056、058、TAKARA）、共通コア構造１種（PA-Sugar Chain 016、TAKARA）、共通コア関連糖鎖１種（PA-042、増田化学工業）、糖脂質系糖鎖３種（PA-Sugar Chain 027、028、038、TAKARA）、およびオリゴマンノース５種を用いた。このうち、ＰＡ−オリゴマンノースを除き、市販品（TAKARA）を用いた。
【０２２６】
ＰＡ−オリゴマンノースは、ＰＡ化装置（PALSTATION、TAKARA）を用いて以下のように調製した。
【０２２７】
すなわち、各５０ｎｍｏｌのManα1-2Man、Manα1-3Man、Manα1-6Man、Manα1-6(Manα1-3)Man、Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Man（DextraLaboratories、Funakoshi）を凍結乾燥後、カップリング試薬（2-アミノピリジン／酢酸溶液、Pyridylamination Reagent Kit、TAKARA）２０μｌを加え、９０℃で６０分間反応させた。これに還元試薬（ボラン-ジメチルアミン/酢酸溶液）２０μｌを加え、８０℃で６０分間反応させた。この反応液にトリエチルアミン-メタノール２０μｌを加えてよく撹拌した後、トルエン４０ μｌを加えて撹拌し、窒素気流化で６０℃、１０分間減圧乾固した。
【０２２８】
これにメタノール２０μｌとトルエン４０μｌとを加えて撹拌し、同様に減圧乾固した後、トルエン５０μｌを加えて再び減圧乾固した。過剰の試薬は順相系ＨＰＬＣにより除去した。
【０２２９】
すなわち、上記ＰＡ化物を２５μｌの超純水に溶解した後、４０℃のカラムオーブン中、５０ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（pH7.3）/アセトニトリル（25/75）で平衡化したTSKgel NH2-60カラム（4.6×250 mm）に注入し、５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（pH7.3）/アセトニトリル（25/75）（溶媒Ａ）と５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（pH7.3）/アセトニトリル（50/50）（溶媒Ｂ）の２液による濃度勾配［溶媒Ａ １００％（０−５分）、溶媒Ａ ０％−溶媒Ｂ １００％（５−５５分）]を用いて、流速1.0ml/minで溶出した。溶出液は励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍでモニターし、ＰＡ化糖鎖（オリゴマンノース）ピークを分取した。
【０２３０】
得られたＰＡ−オリゴマンノースの定量は以下のようにして行った。すなわち、上記の各オリゴマンノース画分の５０μｌを減圧乾固後、4N HCl/4M TFA（1/1（v/v））中１００℃で４時間、気相酸加水分解した。
【０２３１】
この加水分解物を５０μｌの超純水に溶解し、その１０μｌを４０℃のカラムオーブン中、TSKgel ODS-80TMカラム（4.6×150 mm）に注入し、０．１ Ｍ 酢酸アンモニウム−１０％メタノールで溶出した。流速は1.0ml/minとし、溶出液は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｍｍでモニターした。
【０２３２】
これにより、ＰＡ−オリゴマンノースから加水分解により遊離したＰＡ−マンノースのピーク面積を測定した。このＰＡ−マンノースの定量は、１０ｐｍｏｌの標準ＰＡ−マンノース（TAKARA）の同カラムからの溶出ピーク面積との比較により行い、ＰＡ−オリゴマンノース量とした。
【０２３３】
（実施例７−２：糖鎖結合特異性試験結果）
遠心限外ろ過−ＨＰＬＣ法により２７種類のピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖に対するＭＰＬ−１の結合性を精査した。図１１は、ＰＡ化糖鎖２７種の構造と、当該糖鎖へのＭＰＬ−１の結合活性を示すものである。図中、結合活性（単位％、結合糖鎖量/添加糖鎖量×１００）が１０％以下ものはハイフンで示した。
【０２３４】
図１１に示すように、ＭＰＬ−１は供試した糖鎖中、Ｎ−グリコシド型糖鎖のうち高マンノース型糖鎖とのみ特異的に結合することがわかった。複合型（図１１に示す１−６）、共通コア構造（図１１に示す２３−２４）とは結合しなかったことから、本レクチンは高マンノース型糖鎖構造のオリゴマンノースで構成される分岐糖鎖部分を認識することが判明した。さらに興味深いことに、高マンノース型糖鎖（図１１に示す７−１７）に対する結合性について、分岐糖鎖部分のオリゴマンノース構造の違いにより結合活性に明瞭な差異が認められた。
【０２３５】
ここで、高マンノース型糖鎖の非還元末端は、トリマンノースコアのMan(α1-3)アーム（Ｄ１アーム）、同コアのMan(α1-6)アームから分岐したMan(α1-3)アーム（Ｄ２アーム）および同Man(α1-6)アームから分岐したMan(α1-6)アーム（Ｄ３アーム）の３つのアームからなる。
【０２３６】
ＭＰＬ−１はＤ３アームの非還元末端にα1-2Manを有するもの（図１１に示す９、１０、１３、１５）とのみ高い結合活性が認められ、その結合率は９６％以上であった。一方、同Man残基を含まない高マンノース型糖鎖（図１１に示す７、８、１１、１２、１４、１６、１７）およびオリゴマンノース（図１１に示す１８−２２）に対するＭＰＬ−１の結合活性は、図１１に示す糖鎖１２を除いて１０％以下であった。糖鎖１２はＤ３アームにα1-2Manを含まず、Ｄ１アームの非還元末端にMan(α1-2)Man(α1-2)を有するＭ７糖鎖であるが、同様の構造を有するＭ８糖鎖（図１１に示す１４）では結合がみられないことから、ＭＰＬ−１の主要認識糖鎖構造ではないと考えられる。
【０２３７】
これらの結果から、ＭＰＬ−１はＤ３アームの非還元末端にα1-2Man残基を有する高マンノース型糖鎖とのみ結合すると考えられる。単糖類（マンノースを含む）に結合せず、このような厳密な高マンノース型糖鎖認識をもつものは既知レクチン中に見出されていない。糖化合物による赤血球凝集阻止試験でＭＰＬ−１と同様のプロファイル（表３）を示したイソレクチンＭＰＬ−２においても同様の糖鎖結合特異性を有すると予測される。
【０２３８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０２３９】
本発明にかかるポリペプチドは、ＨＩＶなどのウイルスが備える高マンノース型糖鎖と特異的に結合することができる新規ポリペプチドであり、抗ウイルス剤、ウイルス除去膜等への適用が可能である。それゆえ、医療産業、薬品産業等において広く利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高マンノース型糖鎖と高い親和性を有する新規ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの代表的利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（以下「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」）、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス６（以下「ＨＨＶ−６」）、重症急性呼吸症候群（以下「ＳＡＲＳ」）ウイルスなどのウイルスは、しばしば人体に対して重篤な症状を惹起し、その感染拡大が社会問題ともなっていることから、効果的に感染を阻害する薬剤の開発が望まれている。これらのウイルスは、表面に高マンノース型糖鎖を有し、これが宿主への感染に重要な役割を果たすことが知られている（例えば、非特許文献１）。そのため、これらのウイルスが備える高マンノース型糖鎖への結合能を有する物質は、上記ウイルスに対する感染阻害剤として機能することが期待できる。
【０００３】
これまでに、海藻類または藻類（淡水産藍藻）から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。上記レクチンの一部は、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス等の上述のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献２〜１２）。
【０００４】
他にも、レクチンとＨＩＶとの結合に関する発明として、例えば、ＣｏｎＡなどのレクチンが結合した疎水性基材からなる微粒子担体にＨＩＶまたはその一部のタンパクもしくはペプチドを捕捉してなる微粒子を含有するエイズワクチン（特許文献１）、ＧＮＡなどのレクチンを固定した多孔性中空糸膜に血液を通過させ、ウイルスに感染した個体の血液中のウイルス粒子及びそのレクチン結合性フラグメントを減じる方法（特許文献２）、癌患者における感染症の予防および／または処置用の医薬の製造において、マンナン結合レクチンサブユニット等を含むマンナン結合レクチンオリゴマーを含有する組成物を使用する発明（特許文献３）、スクシニル−コンカナバリンＡなどのレクチンを結合成分として用い、ウイルス粒子を含んでなるサンプルのウイルス力価を高める方法（特許文献４）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３３５５１０号公報（２００１年１２月４日公開）
【特許文献２】特表２００７−５２５２３２号公報（２００７年９月６日公表）
【特許文献３】特表２００８−５３５８７２号公報（２００８年９月４日公表）
【特許文献４】特表２００４−５００８３１号公報（２００４年１月１５日公表）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】New England Journal of Medicine, 348, 2228-2238, 2003.
【非特許文献２】Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530, 1997.
【非特許文献３】O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003.
【非特許文献４】Helle, F., .et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006.
【非特許文献５】Barrientos, L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.
【非特許文献６】Dey, B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.
【非特許文献７】O’Keefe, B. R. et al.,J. Virol. 84, 2511-2521, 2010.
【非特許文献８】Hori,K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.
【非特許文献９】Sato,Y., Okuyama, S., and Hori, K., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.
【非特許文献１０】Sato,Y., Morimoto,K., Hirayama, M., and Hori, K. Biochem. Biophys. Res. commun. 405, 291-296, 2011.
【非特許文献１１】佐藤雄一郎、平山 真、藤原佳史、森本金治郎、堀 貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)
【非特許文献１２】Sato,Y., Hirayama, M., Morimoto,K., Yamamoto, N., Okuyama, S., and Hori, K. J. Biol. Chem. 286, No.22, 19446-19458, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、現在のところＨＩＶウイルスやインフルエンザウイルス等が表面に有する高マンノース型糖鎖に特異的に結合し、上記ウイルスの感染を効果的に阻害する物質はまだ十分に知られているとは言いがたく、その数は限られているため、上記物質が十分に供給できる状況にはなっていない。したがって、新規な上記物質がさらに多く見出され、その特性が明らかにされることが必要である。
【０００８】
本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高マンノース型糖鎖と高い親和性を有する新規ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの代表的利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、レクチン、特にトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）由来のレクチンに着目し、ＨＩＶウイルス等が表面に備える高マンノース型糖鎖と特異的に結合しうるレクチンの探索を行った。その結果、従来公知のレクチンとアミノ酸配列の相同性が非常に低い、本発明にかかるポリペプチドを見出すに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、上記課題を解決すべく、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴としている。
【００１１】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１２】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記課題を解決すべく、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであるポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、であってもよい。
【００１３】
本発明にかかる抗ウイルス剤は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドを含有し、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とすることを特徴としている。
【００１４】
上記本発明にかかる抗ウイルス剤は、上記課題を解決すべく、上記抗ウイルス剤の標的であるウイルスが、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス６および重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれるウイルスであってもよい。
【００１５】
本発明にかかるウイルス除去膜は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリペプチドが固定されてなることを特徴としている。
【００１６】
本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明にかかるポリペプチドを生産する方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるベクターを用いることを特徴としている。
【００１８】
本発明にかかる形質転換体は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかるポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１９】
本発明にかかるポリペプチドを生産する方法は、上記課題を解決すべく、上記本発明にかかる形質転換体を用いることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
以上のように、本発明にかかるポリペプチドは、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなる構成である。上記アミノ酸配列は従来公知のレクチンと非常に相同性の低いものである。
【００２１】
それゆえ、ＨＩＶやインフルエンザウイルス等が表面に備える高マンノース型糖鎖と効率的に結合することができ、これらのウイルスの感染を効果的に阻害することができるという効果を奏する。
【００２２】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるポリペプチドをコードしている。したがって、本発明にかかるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体を用いることによって、上記本発明にかかるポリペプチドを簡便かつ大量に調製することが可能となる。その結果、上記ウイルスの感染を効果的に阻害することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＭＰＬのｃＤＮＡの全長塩基配列、およびその演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２のＡは固定化したｇｐ１２０とＭＰＬとの相互作用のセンサーグラムであり、図２のＢはｇｐ１２０とＭＰＬとの親和定数を示す図である。
【図３】ＭＰＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。
【図４】２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ステップワイズ溶出）に供した結果を示す図である。
【図５】粗レクチン画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出）に供した結果を示す図である。
【図６】粗レクチン画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出）に供した結果得られた溶出液の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。
【図７】ＭＰＬをTSKgel DEAE-5PWカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。
【図８】ＭＰＬをTSKgel DEAE-5PWカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供して得られた４つのピークを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した結果を示す図である。
【図９】ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の分子量測定結果を示す図である。
【図１０】ＭＰＬ画分をブロッティングし、ＣＢＢ染色したＰＶＤＦ膜を示す図である。
【図１１】遠心限外ろ過−ＨＰＬＣ法に供試したピリジルアミノ化糖鎖２７種の構造と、当該糖鎖へのＭＰＬ−１の結合活性を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の一形態について説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。本明細書において、範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、Ａ以上Ｂ以下であることを表す。また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献は、本明細書中において参考として援用される。
【００２５】
（１）ポリペプチド
本発明者は、食用紅藻であるトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）から単離した新規ポリペプチド（以下「ＭＰＬ」という）が、高マンノース型糖鎖への結合特異性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。上記ＭＰＬのアミノ酸配列は、後述するように、バナナMusa acuminataレクチンおよび紅藻Griffithsia sp.由来レクチンGriffithsin（GRFT）等の従来公知のレクチンとの相同性が最大３３％と、非常に低いものであった。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００２７】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００２８】
本発明にかかるポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明にかかるポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００２９】
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつ本発明にかかるポリペプチドである。上記ポリペプチドは、従来公知のレクチンのアミノ酸配列との相同性が非常に低い新規ポリペプチドであるという特徴を有する。
【００３０】
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００３１】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が、本発明にかかる所望の変異体であるか否かを容易に決定し得る。
【００３３】
本実施形態にかかるポリペプチドは、高マンノース型の糖鎖と結合するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることが好ましい。
【００３４】
上記「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３５】
なお、本発明にかかるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３６】
また、本発明にかかるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００３７】
また、本発明にかかるポリペプチドは、後述する本発明にかかるポリヌクレオチド（本発明にかかるポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明にかかるポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。
【００３８】
他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明にかかるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００３９】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。
【００４０】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【００４１】
合成ペプチドは化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えばHoughtenは、４週間未満で調製され、そして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような、多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している（Houghten,R.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:5131-5135（1985））。
【００４２】
この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis（SMPS）」プロセスは、さらにHoughtenら（1986）の米国特許第4,631,211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Houghtenら、前出、5134）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００４３】
本発明者は、上記本発明にかかるポリペプチドが高マンノース型糖鎖に特異的に結合することを見出した。ここで、「糖鎖」とは、直鎖または分岐したオリゴ糖または多糖を意味する。また上記糖鎖は、タンパク質との結合様式によって、アスパラギンと結合するＮ−グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｎ型糖鎖」という）およびセリン、スレオニンなどと結合するＯ−グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｏ型糖鎖」という）に大別され、Ｎ型糖鎖には高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、混成型糖鎖がある。
【００４４】
なおオリゴ糖とは、単糖または単糖の置換誘導体が２〜１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。多糖は、構成糖の種類によって異なるが、ウロン酸やエステル硫酸を多く含む糖質を酸性多糖、中性糖のみのものを中性多糖という。多糖のうち、ムコ多糖とよばれる一群の多糖は、ほとんどがタンパク質と結合しており、プロテオグリカンという。単糖とは、糖鎖の構成単位となるもので、加水分解によってそれ以上簡単な分子にならない基本的物質である。
【００４５】
さらに単糖は、カルボキシル基などの酸性側鎖を有する酸性糖、ヒドロキシル基がアミノ基で置換されたアミノ糖、それ以外の中性糖の３つに大別される。生体内に存在する単糖としては、酸性糖はＮ−アセチルノイラミン酸やＮ−グリコリルノイラミン酸（以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」という）などのシアル酸や、ウロン酸などがあり、アミノ糖としてはＮ−アセチルグルコサミン（以下、「ＧｌｃＮＡｃ」という）やＮ−アセチルガラクトサミンなどがあり、中性糖としてはグルコース、マンノース、ガラクトース、フコースなどがあげられる。
【００４６】
Ｎ型糖鎖は全て、「トリマンノシルコア」と呼ばれる〔Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕からなる共通母核構造を持っている。高マンノース型糖鎖は、トリマンノシルコアに加え、分岐構造部分にα−マンノース残基のみを含む。この糖鎖には〔Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3 ）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕という七糖が共通の母核として含まれている。また混成型糖鎖は、複合型と高マンノース型の両方の特徴を併せ持っていることからそう呼ばれている。１つまたは２つのα−マンノシル基が、高マンノース型の場合と同様に、トリマンノシルコアのManα1-6腕と結合し、複合型糖鎖の側鎖と同じものがコアのManα1-3腕に結合している。
【００４７】
トリマンノシルコアの還元末端に位置するGlcNAc のC-6位へのフコースの結合の有無、またβ-マンノシル残基のC-４位へのβ-GlcNAcの結合（バィセクテイングGlcNAc と呼ばれる）の有無は、複合型や混成型糖鎖の構造の多様性に寄与している。３つのＮ型糖鎖の間で、複合型が最も多様な構造を含んでいる。
【００４８】
この多様性は、主に２つの要素で作り出され、トリマンノシルコアに１個から５個の側鎖がそれぞれ異なる結合位置で結合しており、一、二、三、四、または五本側鎖糖鎖を形成している。三本側鎖の複合型糖鎖には、〔GlcNAcβ1-4（GlcNAcβ1-2）Manα1-3〕あるいは〔GlcNAcβ1-6（GlcNAcβ1-2）Manα1-6〕のどちらかを含む２つの異性体が見つかっている。
【００４９】
なお上記トリマンノシルコアにおいて、アスパラギンと結合する糖鎖の末端、すなわちGlcNAc側の末端を還元末端、その反対側、すなわちMan側の末端を非還元末端という。
【００５０】
ポリペプチドが糖鎖と結合するか否かは、例えば標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したカラムに、試験対象であるポリペプチドを通し、当該カラムにポリペプチドが結合したか否かをその通過液に含まれるポリペプチドの量、または特異的溶出剤でカラムから溶出したポリペプチドの量により評価することができる。また標的となる糖鎖が結合した糖タンパク質をメンブレン等に固定化し、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ等で標識したポリペプチドを用いて検出するウエスタンブロット法（法医学の実際と研究、37, 155, 1994 参照）、ドットブロット法（Analytical Biochemistry, 204(1), 198, 1992 参照）を用いて評価することができる。
【００５１】
また標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したチップと、試験対象であるポリペプチドとの親和性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて測定すればよい。上記方法によれば、その親和性の有無のみならず、その強度まで測定できるために好ましい方法であるといえる。このとき得られる結合定数（親和定数）（ＫＡ）が、１０（Ｍ-1）以上、より好ましくは１０３（Ｍ-1）以上、最も好ましくは１０４（Ｍ-1）以上であればポリペプチドと糖鎖とが結合していると判断できる。
【００５２】
本発明にかかるポリペプチドには上記（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と、特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも含まれることに留意すべきである。また、上記（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と、当該任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００５３】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される本発明にかかるポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００５４】
（２）ポリヌクレオチド
本発明は、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００５５】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００５７】
本発明にかかるポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は、配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。
【００５８】
例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Applied Biosystems Incorporated（ABI，850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404）392型シンセサイザーなどによって合成される。
【００５９】
合成的に作製した上記フラグメントとしては、例えば宿主のコドンに対して配列を最適化した合成ポリヌクレオチドを挙げることができる。このような合成ポリヌクレオチドは、各種の発現系を用いる場合に利用可能である。
【００６０】
また本発明にかかるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００６１】
本発明はさらに、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００６２】
このような変異体としては、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００６３】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
一実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、かつ、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
【００６５】
他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
【００６６】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６７】
上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６８】
ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００６９】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００７０】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００７１】
あるいは、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００７２】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、所望のポリヌクレオチドを含む生物材料であることが好ましい。特に、本発明にかかるポリペプチドの起源であるトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）が好ましい。ただし、これに限定されるものではない。
【００７３】
なお本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７４】
（３）本発明にかかるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの利用
（３−１）抗ウイルス剤
本発明にかかる抗ウイルス剤は、上記本発明にかかるポリペプチドを含有し、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とする。上記ウイルスは、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスであれば特に限定されるものではなく、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＨＨＶ−６、ＳＡＲＳウイルス等を挙げることができる。
【００７５】
上記ウイルスには、表面に備える高マンノース型糖鎖を宿主細胞の表面レセプターに結合させることによって宿主に感染するものが存在する。例えばＨＩＶは、表面にｇｐ１２０という糖タンパク質を備えており、ｇｐ１２０が有する高マンノース型糖鎖が宿主リンパ細胞表面レセプターであるＣＤ４を認識することによって宿主に感染する。
【００７６】
一方、上記抗ウイルス剤に含まれる本発明にかかるポリペプチドは、高マンノース型糖鎖と特異的に結合することができる。それゆえ、上記抗ウイルス剤を用いれば上記ウイルスの感染を効果的に阻害することができる。
【００７７】
また、ウイルスの宿主への感染が、ｇｐ１２０とＣＤ４との関係のような、ウイルス表面糖タンパク質の高マンノース型糖鎖と、宿主側の高マンノース型糖鎖のレセプターとの直接結合によるものではない場合もある。例えば、高マンノース型糖鎖を有するものの、高マンノース型糖鎖は宿主のレセプターと直接結合せず、糖タンパク質によって上記レセプターに結合するタイプのウイルスを挙げることができる。このようなウイルスとしては例えばインフルエンザウイルスを挙げることができる。
【００７８】
上記抗ウイルス剤に含まれる本発明にかかるポリペプチドは、高マンノース型糖鎖と特異的に結合することができる。これにより糖タンパク質に対するアロステリック効果が得られ、高マンノース型糖鎖がレセプターとの結合に直接関与しない場合でもウイルスの感染を防ぐことができると考えられる。よって、上記抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルス等の感染も有効に阻害することができる。
【００７９】
なお、ウイルスの型は特に限定されるものではない。例えばＨＩＶは１型でも２型でもよく、インフルエンザウイルスはＡ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれであってもよい。
【００８０】
「高マンノース型糖鎖を備える」とは、高マンノース型糖鎖がウイルスの表面に存在することを言う。例えば、高マンノース型糖鎖がキャプシドの外部へ露出した状態や、ウイルスの表面糖タンパク質の構成成分として存在する場合を挙げることができる。
【００８１】
高マンノース型糖鎖は、上述のように、宿主細胞のレセプターへ直接結合するものであってもよいし、宿主細胞のレセプターへ直接結合しないものであってもよい。上述のように、本発明にかかる抗ウイルス剤は、いずれの高マンノース型糖鎖を有するウイルスであっても有効に感染を阻害することが可能である。
【００８２】
本発明にかかる抗ウイルス剤は経口製剤、非経口製剤のいずれであってもよい。また、剤型は特に限定されるものではなく、常法に従い、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤、マイクロカプセル剤あるいは懸濁液剤等に製剤化して用いることができる。
【００８３】
非経口的に投与する場合には、例えば、本発明にかかるポリペプチドを含有する溶液を点鼻噴霧することや、注射剤として投与することができる。経口的に投与する場合には、食前、食後、食間のいずれに投与してもよい。
【００８４】
本発明にかかる抗ウイルス剤は、必要に応じて、担体、賦形剤、結合剤、膨化剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、防腐剤、安定剤、被覆剤等の材料を含有することができる。
【００８５】
本発明にかかる抗ウイルス剤において、例えば錠剤、カプセル剤等に含有することができる具体的な成分としては、トラガント、アラビアゴム、コーンスターチおよびゼラチンのような結合剤； 微晶性セルロース、結晶セルロースのような賦形剤； コーンスターチ、前ゼラチン化デンプン、アルギン酸、デキストリンのような膨化剤； ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤； 微粒二酸化ケイ素のような流動性改善剤； グリセリン脂肪酸エステルのような滑沢剤； ショ糖、乳糖およびアスパルテームのような甘味剤； ペパーミント、ワニラ香料およびチェリーのような香味剤等を挙げることができる。
【００８６】
調剤単位形態がカプセル剤である場合には上記のタイプの材料にさらに油脂のような液
状担体を含有することができる。
【００８７】
また、種々の他の材料を、被覆剤としてまたは調剤単位の物理的形態を変化させるために含有させることができる。錠剤の被覆剤としては、例えば、シェラック、砂糖またはその両方が挙げられる。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ香味等を含有することができる。その他、各種ビタミン類、各種アミノ酸類を含有しても良い。
【００８８】
本発明にかかる抗ウイルス剤の適用対象は、ヒト、ヒト以外の動物〔例えば、ヒト以外の哺乳類（ブタ、ウシ、ウマ、イヌ等の家畜） 、鳥類（ニワトリ等の家禽）等〕のいずれであってもよい。家畜や家禽等へ適用することにより、それらの経済的損失を軽減することができる。また、それらを食用とする場合も多いため、ヒトへの感染予防という点からも重要である。
【００８９】
本発明にかかる抗ウイルス剤の投与量は、適用対象が必要とする量を確保できるように設定すればよく、製剤化して用いたり、飲食品に配合して上記抗ウイルス剤を用いることができる。
【００９０】
（３−２）ウイルス除去膜
本発明にかかるウイルス除去膜は、本発明にかかる上記ポリペプチドが固定されてなるものである。上記ウイルス除去膜は、例えば従来公知の限外ろ過膜に上記ポリペプチドを固定することによって作製することができる。
【００９１】
上記限外ろ過膜としては、従来公知のポリマー、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド類、ポリイミド類、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド等によって形成された膜を挙げることができ、平膜型であっても多孔性中空糸膜型であってもよい。
【００９２】
上記限外ろ過膜に上記ポリペプチドを結合するためには、従来公知のプロセスを用いて、限外ろ過膜のポリマーをまず賦活化し、タンパク質と化学的に結合しやすい状態にする。上記ポリマーとしては複数の異なるポリマーを用いてもよい。
【００９３】
ポリマーを賦活化させた後、本発明にかかる上記ポリペプチドを直接あるいはリンカーを用いて付着させ、アフィニティーマトリクスを形成する。好ましいリンカーとして、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
上記ポリペプチドは、二価性試薬のようなカップリング剤を用いて、限外ろ過膜のポリマーに直接結合されてもよく、あるいは間接的に結合されてもよい。アフィニティーマトリクスを形成するためには、アガロースに共有結合的に連結されたＭＰＬを使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００９５】
ＨＩＶのような、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスの粒子および／またはそのフラグメントを含有する血液等を上記ウイルス除去膜にアプライすると、上記ウイルス除去膜に固定された本発明にかかるポリペプチドが、ウイルスの粒子および／またはそのフラグメントが有する高マンノース型糖鎖と結合するため、血液は孔を通過し、ウイルスの粒子および／またはそのフラグメントは捕捉されるため孔を通過することができない。それゆえ、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを血液等から除去することができる。
【００９６】
（３−３）ベクター
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明にかかるベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００９７】
本発明にかかるベクターは、上述した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００９８】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９９】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１００】
上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明にかかるポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明にかかるポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１０１】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１０２】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明にかかるポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１０３】
このように、本発明にかかるベクターは、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１０４】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０５】
（３−４）形質転換体または細胞
本発明は、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。ここで「形質転換体」とは、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
【０１０６】
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。
【０１０７】
本発明にかかる形質転換体または細胞は、海藻類もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、トサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）であることが特に好ましい。
【０１０８】
本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。
【０１０９】
このように、本発明にかかる形質転換体または細胞は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体または細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１１０】
本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体または細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体または細胞も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１１】
（３−５）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法を提供する。
【０１１２】
一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【０１１３】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【０１１４】
本実施形態の他の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明にかかるポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１１５】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１１６】
本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１１７】
ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述したオリゴヌクレオチドを用いて、本発明にかかるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１１９】
さらに他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明にかかるポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【０１２０】
以上のように、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【０１２１】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Hashimoto-Gotoh, Gene, 152，271-275（1995）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
【０１２２】
このように、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、少なくとも、本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列、または本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【０１２３】
つまり、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【実施例】
【０１２４】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２５】
〔実施例１：トサカノリからのポリペプチド（ＭＰＬ）の単離〕
（抽出液の調製および硫安沈殿）
九州西岸にて採集したトサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）の凍結藻体５００ｇを液体窒素下で粉末とした。これに５００ｍｌの２０ｍＭ ＰＢＳＡ（Phosphate-buffered saline sodium azide；０．０２％アジ化ナトリウム入り２０ｍＭ ＰＢＳ；ｐＨ７．０）を加え、４℃で一晩撹拌した後、遠心分離を行なって一次抽出液を得た。残渣を７００ｍｌの２０ｍＭ ＰＢＳＡで同様に抽出し、二次抽出液を得た。両抽出液を合一し、ＵＶ２８０ｎｍの吸収および凝集活性を測定した。
【０１２６】
上記抽出液に硫安粉末を２０％飽和となるように少しずつ撹拌しながら加え、この混合液を４℃で一晩静置した。これを遠心分離（８５００ｒｐｍ、３０分間）して得られた沈殿を、ＰＢＳＡに溶解後、同溶媒に対し十分透析した。透析終了後、内液を遠心分離し、得られた上清を２０％飽和硫安塩析沈殿画分とした。一方、２０％飽和硫安塩析処理で得られた上清に、硫安粉末を６０％飽和となるように加え、同様に処理して、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を得た。当該画分につき、ＵＶ２８０ｎｍの吸収および凝集活性を測定した。
【０１２７】
（疎水クロマトグラフィー）
上記２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分１０６ｍｌのうち、１０ｍｌについて、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行ない、内液６ｍｌを得た。得られた内液を遠心分離(10,000 rpm、１０分間)して上清を回収した。得られた上清５ｍｌを同緩衝液で平衡化したHiPrep Phenyl FFカラム（16×100ｍｍ, Vt=20 ml）に注入し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７.０（溶媒Ａ）と、蒸留水（溶媒Ｂ）の２液を用いる濃度勾配法により溶出した。濃度勾配［溶媒Ｂ１００％（１０分）、溶媒：Ｂ０％−溶媒Ａ１００％（１０−６０分）、溶媒Ａ１００％（６０−１１０分）］は、グラジェントプログラマー（ＣＣＰコントローラー、東ソー社製）を用いて設定し、流速は４ｍｌ／分とした。溶出液は５ｍｌずつ分取し、ＵＶ２８０ｎｍの吸光度を測定するとともに凝集活性を測定した。
【０１２８】
（ゲルろ過）
疎水クロマトグラフィーで分取した活性画分を合一し、限外濾過により５ｍｌに濃縮した。そのうち１ｍｌを、0.3 M NaCl を含む２０ｍＭ ＰＢ (pH 7.0)で平衡化したTSKgel G3SWxLゲルろ過カラム（東ソー社製、7.8 x 300 mm、Vt＝14.7 ml）に供した。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH 7.0）を用いて流速１ml／minで溶出した。溶出液は１ｍｌずつ分取し、各フラクションのＵＶ２８０ｎｍの吸光度および凝集活性を測定した。
【０１２９】
（凝集活性の検討）
赤血球凝集活性は、マイクロタイター法を用いて測定した。生理食塩水にて調製した各精製画分溶液の２倍段階希釈液、各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製した。各希釈液に２％赤血球浮遊液２５μlを加えて軽く撹拌し、室温で１．５時間静置後、凝集能を観察した。凝集能は肉眼で判定し、赤血球の５０％以上が凝集している場合を陽性とした。凝集活性は、赤血球凝集活性（力価）、すなわち凝集活性を示す最大希釈液の希釈倍数の逆数、および凝集素価（力価）、すなわち凝集活性を示す最大希釈液のタンパク質の濃度（最小凝集濃度）で示した。
【０１３０】
本実施例においては、赤血球としてトリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）を用いた。なお、赤血球浮遊液の調製は次のように行なった。まず、実験室で飼育中のウサギの耳から血液２ｍｌを採取し、これを約５０ｍｌの生理食塩水で３回洗浄後、５０ｍｌの生理食塩水を加えて２％のウサギ赤血球浮遊液を調製した。これに１／１０容の０．５％トリプシン−生理食塩水を加え、３７℃で１．５時間静置した。このトリプシン処理赤血球を生理食塩水で３回洗浄後、４５ｍｌの生理食塩水を加え、トリプシン処理２％ウサギ赤血球浮遊液（ＴＲＢＣ）とした。
【０１３１】
トリプシン処理ウサギ赤血球（ＴＲＢＣ）に対する凝集活性成分を検討したところ、表１に示すように、上記抽出液、上記２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分、上記疎水クロマトグラフィーによって得られた画分、および上記ゲルろ過によって得られた画分に強い赤血球凝集活性が検出された。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
表１中、「タンパク質濃度」は、「ａ」を付したものについてはＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ280）を測定し、Ａ280（１ｍｇ／ｍｌ）＝１．０より算出した。「ｂ」を付したものについてはＵＶ２８０ｎｍの吸収（Ａ280）を測定し、本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列から求めた分子吸光係数を用いてＡ280（１ｍｇ／ｍｌ）＝０．９７より算出した。
【０１３４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記ゲルろ過で得られた凝集活性を有する画分（精製画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。結果を図３に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分（非還元下）、レーン３は２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分（還元下）、レーン４は上記精製画分（非還元下）、レーン５は上記精製画分（還元下）を示す。なお、タンパク染色はＣＢＢ（Coomassie brilliant blue R-250）染色を行なった。
【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、精製画分は、還元下で１４ｋＤａの、非還元下で２６ｋＤａの単一バンドを与えるものであることが確認されたことから、同一サブユニット（１４ｋＤａ）がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）した２量体からなると推定される。以上のように、上記抽出液を硫安塩析、疎水クロマトグラフィーおよびゲルろ過に順次供した精製過程により最終的に０．４ｍｇの精製画分が得られた。表１に示す収量６ｍｇは藻体５００ｇ（湿重量）当たりに換算した値である。本発明者らは、当該精製画分を「ＭＰＬ」と命名した。
【０１３６】
なお、本発明者は、上記ＭＰＬは、上記２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供することによって効果的に調製できることも確認した。陰イオン交換クロマトグラフィーによって、トサカノリに含まれる他のレクチン（ＭＰＡと称する）と上記ＭＰＬとを効果的に分離することができる。
【０１３７】
上記陰イオン交換クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
【０１３８】
ＭＰＡとＭＰＬの両レクチンを同時に精製することを意図して、先に調製した２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、HiPrep QXL 16/10カラム（φ1.6×10 cm、Vt = 20 ml、GE Healthcare社）を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。
【０１３９】
すなわち、上記カラムを０．０２Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡化し、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分５ｍｌを添加した。カラムを上記緩衝液で十分洗浄した後、上記緩衝液中０Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で溶出した。流速は５ｍｌ／ｍｉｎとした。洗浄液は１０ｍｌずつ、濃度勾配溶出液は５ｍｌずつ分取した。
【０１４０】
各フラクションにつき、Ａ２８０吸光度および赤血球凝集活性を測定した。赤血球凝集活性が見られた画分は、還元下SDS-PAGEに付した。その結果より、各フラクションを５つの画分に分けた。各画分につき、Folin-Lowry法によるタンパク質量の測定および赤血球凝集活性試験に供した。
【０１４１】
その結果、両レクチンはカラムに吸着し、ＭＰＡは０．３７Ｍ ＮａＣｌ付近、ＭＰＬは０.５７Ｍ ＮａＣｌ付近にそれぞれ活性ピークとして溶出した。このように、陰イオンクロトマトグラフィーを用いることにより、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分に混在する２種類のレクチン、ＭＰＡ（２９ｋＤａ）とＭＰＬ（２６ｋＤａ）とを分離することができる。
【０１４２】
〔実施例２：ＭＰＬのｃＤＮＡのクローニング〕
以下に示すように、実施例１で得られた精製画分「ＭＰＬ」の１４ｋＤａサブユニットの２３Ｎ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（Procise 492HT, Applied Biosystems）を用いてGVVDQLIVTYSDGTRVSHGQPGS（配列番号１２）と決定した。当該配列の情報を参考に縮重プライマーを設計した。別途調製したトサカノリ由来1st strand cDNA溶液を鋳型にRapid Amplification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法を行うことにより、ＭＰＬのｃＤＮＡの全長塩基配列 ９４９ｂｐを明らかにした。
【０１４３】
まず、ＭＰＬの上記２３Ｎ末端のアミノ酸配列を参考にして、MPL_d_R1およびMPL_d_R2の各プライマーを作製した。
【０１４４】
MPL_d_R1の塩基配列は、CCRTGISWIACICKIGTICCRTC（配列番号３）であり、MPL_d_R2の塩基配列は、TAIGTIACDATIARYTGRTC（配列番号４）である。ここで、ＤはＧ、ＡまたはＴを、Ｉはイノシンを、ＫはＧまたはＴを、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＷはＡまたはＴを示すＩＵＢコードである。
【０１４５】
RNAlater 中に−２０℃で保存したトサカノリ藻体より Plant RNA Isolation Reagent（Life Technologies Corp.）を用いて全ＲＮＡを抽出後、NucleoTrap mRNA（Macherey-Nagel）によりｍＲＮＡを精製し、さらに GeneRacer Kit（Life Technologies Corp.）により完全長ｃＤＮＡを調製した。
【０１４６】
次に、上記完全長ｃＤＮＡを鋳型に GeneRacer_5'_Primer および MPL_d_R1のプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。GeneRacer_5'_Primer の塩基配列はCGACTGGAGCACGAGGACACTGA（配列番号５）である。
【０１４７】
上記ＰＣＲにより得られた産物の１００倍希釈溶液を鋳型に、GeneRacer_5’_Nested_PrimerおよびMPL_d_R2のプライマーペアを用いてNested ＰＣＲを行った。GeneRacer_5’_Nested_Primerの塩基配列は、GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA（配列番号６）である。
【０１４８】
得られたNested ＰＣＲの産物を低融点アガロースにより精製後、pGEM-T Easy Vector System（PROMEGA製）を用いてサブクローニングを行い、得られたクローンから精製プラスミドを回収して、ダイデオキシ法により塩基配列の決定を行った（以上5’RACE）。
【０１４９】
得られた塩基配列に基づいて新たにプライマーMPL_F1を作製した。MPL_F1の塩基配列はTGTAGCAGCCATGTCTTTGC（配列番号７）である。
【０１５０】
上記完全長ｃＤＮＡを鋳型として、MPL_F1およびGeneRacer_3’_Primerのプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を低融点アガロースにより精製後、pGEM-T Easy Vector System（PROMEGA製）を用いてサブクローニングを行い、得られたクローンから精製プラスミドを回収して、ダイデオキシ法により塩基配列の決定を行った（以上、3’RACE）。
【０１５１】
GeneRacer_3’_Primerの塩基配列はGCTGTCAACGATACGCTACGTAACG（配列番号８）である。
【０１５２】
上記5’RACEおよび3’RACEから明らかとなったMPL cDNAの5’および3’末端配列から作製したMPL_5'_End_FおよびMPL_3'_End_Rのプライマーペア、ならびに高正確性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、増幅産物につき塩基配列を決定することで、ＭＰＬ ｃＤＮＡの全長塩基配列を確認した。
【０１５３】
MPL_5'_End_Fプライマーの塩基配列はAATCCACATTCAACTGCACTG（配列番号９）であり、MPL_3'_End_Rプライマーの塩基配列はAAATCGACGCACACAGAAGTC（配列番号１０）である。
【０１５４】
ＭＰＬのｃＤＮＡの全長塩基配列、およびその演繹アミノ酸配列を図１に示す。図１において、星印は終止コドン、破線はシグナルペプチド（SignalP 3.0を用いて予測）、実線は実施例１で得られた精製画分「ＭＰＬ」の１４ｋＤａサブユニットの２３Ｎ末端配列を示す。
【０１５５】
演繹アミノ酸配列の解析から、図１に示すｃＤＮＡは、シグナルペプチド領域２２残基（１−２２）を含め、計１９８残基をコードすることがわかった。一方、演繹アミノ酸配列の解析から、図１に示すｃＤＮＡは、プロペプチド領域７４残基（２３−９６）および成熟タンパク質領域１０２残基（９７−１９８）をコードすると考えられたが、後述する実施例６においてさらに詳細に検討したところ、成熟タンパク質領域は５３番目−１９８番目の１４６アミノ酸残基であることが分かった。
【０１５６】
〔実施例３：ＭＰＬの糖結合特異性〕
ＭＰＬの糖結合特異性を赤血球凝集阻止試験により明らかにした。本赤血球凝集阻止試験には、実施例１で調製した２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分および実施例１で調製したＭＰＬを供試し、これらの赤血球凝集活性（力価４）を阻止する糖化合物を検索した。
【０１５７】
赤血球凝集阻止試験は以下のようにして行った。まず生理食塩水にて調製した糖溶液の２倍段階希釈液、各２５μｌをマイクロタイタープレート上に作製した。なお、使用した糖類の原液の濃度は単糖類および二糖類の場合は１００ｍＭ、糖タンパク質の場合は２ｍｇ／ｍｌとした。これに、それぞれ凝集素価（力価）４に調整した上記飽和硫安塩析沈殿画分の溶液およびＭＰＬ溶液、各２５μｌを加えて軽く撹拌後、室温で１．５時間静置した。これに２５μｌのＴＲＢＣを加え、室温で２時間静置後、凝集阻止能を観察した。
【０１５８】
凝集阻止能の有無は肉眼で判定し、赤血球の約１００％が凝集していない場合を陽性とした。凝集阻止能（凝集阻止活性）は、最小阻止濃度すなわち凝集阻止能を示す最小濃度（ｍＭまたはμｇ／ｍｌ）で表示した。結果を表２に示した。表２において、「最小凝集阻止濃度」は、上述の力価４の検液の赤血球凝集活性を阻止する糖化合物の最小濃度を表し、「ＮＴ」は未測定であることを表す。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
表２に示すように、本赤血球凝集阻止試験には、単糖類および二糖類としてＤ−グルコース（表中Glcと表示。以下、糖の名称に続く括弧内には、表２に示した略称を記載する。）、Ｄ−マンノース（Man）、Ｄ−ガラクトース（Gal）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuAc）、Ｌ−フコース（Fuc）、Ｄ−キシロース（Xyl）、Ｌ−ラムノース（Rha）、ラクトースを用いた。
【０１６１】
糖タンパク質としては、複合型糖鎖を含有するものとして、トランスフェリン、アシアロトランスフェリンを用いた。また、高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質として、イーストマンナンを用い、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質として、ブタチログロブリン、アシアロブタチログロブリンを用いた。
【０１６２】
表２から明らかなように、ＭＰＬの赤血球凝集活性は供試した単糖類および二糖類では阻止されず、高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質、並びに、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質によってのみ阻止された。このように、ＭＰＬは従来公知のレクチンとの配列相同性が非常に低く、かつ、高マンノース型糖鎖に高い親和性を有することが示された。
〔実施例４：エイズウイルスの表面糖タンパク質・ｇｐ１２０とＭＰＬとの相互作用〕
ＨＩＶの宿主への感染は、ＨＩＶの表面糖タンパク質であるｇｐ１２０と宿主リンパ細胞の表面レセプターＣＤ４との相互作用により成立する。該相互作用にはｇｐ１２０の高マンノース型糖鎖が不可欠である。そのため、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するレクチンはＨＩＶ感染の有力な阻害剤となりうる。
【０１６３】
そこで、ＭＰＬと市販品のリコンビナント糖付加HIV-1 IIIB gp120 (バキュロウイルス；１分子あたり１５本の高マンノース型糖鎖を有する。ImmunoDiagnostics製)との相互作用を表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)法を用いて定量解析した。ＳＰＲ法にはBIAcore2000（GE Healthcare社製）を用いて、リコンビナント糖付加HIV-1 IIIB gp120をＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社製）上に固定化し、ＭＰＬの溶液をアナライトとして用いて、マニュアルに従って測定、解析した。
【０１６４】
上記固定化はマニュアルに従って行った。具体的には、アミンカップリング法を用いて固定化を行った。なお、固定化量は３００〜４００ＲＵの範囲になるよう、マニュアルインジェクション法によって調整した。
【０１６５】
ＳＰＲ法では、生体分子を標識することなく、生体分子間の特異的な相互作用を微量かつ短時間で定量的に測定できる。本法では、リガンドをセンサーチップ表面上に固定化し、これに作用する物質（アナライト）を含む溶液を添加すると、分子の結合・解離により生ずる微量の質量変化がＳＰＲシグナルの変化として検出される。
【０１６６】
質量変化はレゾナンスユニット（ＲＵ）で表され、１０００ＲＵは共鳴による反射角度０．１°の変化に相当し、アナライトがリガンドに 1 ng/mm2 結合したことを意味する。センサーチップ表面の金薄膜上にはデキストランがコーティングされており、主としてこのデキストラン内に導入されたカルボキシル基を介してリガンドを固定化する。
【０１６７】
ＭＰＬと上記リコンビナントｇｐ１２０とのＳＰＲ法による親和性解析に先立ち、予備実験で解析法を検討し、非線形最小二乗法によるカイネティクス解析が適当と判断した。そこで、得られたセンサーグラムからおおよそのＫＤ値を算出し、０．１〜１０ＫＤ［Ｍ］を濃度の目安として、２倍希釈列で５段階以上のアナライト（ＭＰＬ）溶液を調製した。
【０１６８】
分析プログラムの作成には、マニュアルに従って“Customaized Application”を用い、センサーチップ内の４つのフローセルのうち、何も固定化していないフローセル１をコントロールとして、リコンビナントｇｐ１２０を固定化したフローセルからの差し引き機能を使用した。本分析プログラム下で、アナライト（ＭＰＬ）溶液をそれぞれセンサーチップ上に流速３０μｌ/minで３分間流した後、バッファーを３分間流し、レクチンの結合・解離量を測定した。なお、アナライト添加開始後５秒から添加終了５秒前までのＲＵの増加量を結合量、バッファー添加開始後１０秒から添加終了１０秒前までのＲＵ減少量を解離量とした。
【０１６９】
次に、１００ｍＭ ＨＣｌおよび１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて、センサーチップを洗浄して再生した。得られたセンサーグラムについて、結合相と解離相を同時にカーブフィッティングさせ、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋd、親和定数ＫＡ、および解離定数ＫＤを算出した。
【０１７０】
結果を図２に示す。図２のＡは固定化したｇｐ１２０とＭＰＬとの相互作用のセンサーグラムであり、図２のＢはｇｐ１２０とＭＰＬとの親和定数を示す。図２のＢには、結合速度定数Ｋa(M-1s-1)、解離速度定数Ｋd(s-1)、親和定数ＫA(M-1)、および解離定数ＫD(M)を示した。なお親和定数は、その値が大きくなればなるほど、親和性が高い（結合力が強い）ことを意味する。
【０１７１】
図２に示すように、ＭＰＬはｇｐ１２０に強い親和性（KD= 4.50×10-9 M）を持つことが認められた。このことから、ＭＰＬは、従来公知のレクチンとの配列相同性が非常に低い上に、ＨＩＶのｇｐ１２０と宿主リンパ細胞のＣＤ４との相互作用を十分に阻害できるといえる。それゆえ、ＭＰＬは新たな抗ＨＩＶ剤として有望である。
【０１７２】
また、実施例３に示したように、ＭＰＬは高マンノース型糖鎖に高い親和性を有する。そのため、ＭＰＬは抗ＨＩＶ剤として有望である。また、高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質が宿主のレセプターと結合することによって感染するタイプのウイルスに対しても有力な感染阻害剤となりうる。
【０１７３】
〔実施例５：ＭＰＬのさらなる精製〕
（実施例５−１：陰イオン交換クロマトグラフィーによるトサカノリレクチンの精製）
実施例１で述べたように、ＭＰＡとＭＰＬとの分離に陰イオン交換クロマトグラフィーが有用であることが判明したので、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製についてさらなる検討を行い、精製方法を改良した。
【０１７４】
実施例１で調製した２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分６８ｍｌを、２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、当該緩衝液を「ＴＢ」と称する）で平衡化したHiPrep QXL 16/10カラム（φ1.6×10 cm、Vt = 20 ml、GE Healthcare社）に添加し、カラムをＴＢで十分洗浄後、ＴＢ中０．２Ｍおよび１Ｍ ＮａＣｌで順次、段階的に溶出した（ステップワイズ溶出）。その結果、活性成分は０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分に認められた。
【０１７５】
図４は、２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ステップワイズ溶出）に供した結果を示す図である。
【０１７６】
図４中、横軸はフラクション番号であり、縦軸は左側が２８０ｎｍの吸光度を表し、右側が赤血球凝集活性（力価）を表す。図中、当該吸光度測定結果を丸印で示し、赤血球凝集活性（力価）の測定結果を三角印で示した。
【０１７７】
括弧書き数字１は、上記カラムに２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分を添加し、非吸着成分を洗浄後、ＴＢ中０．２Ｍ ＮａＣｌにより吸着成分の溶出を開始した位置を示している。括弧書き数字２は、上記溶出後、ＴＢ中１Ｍ ＮａＣｌにより他の吸着成分の洗浄を開始した位置を示している。
【０１７８】
図４に示すように、赤血球凝集活性成分は０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分に認められた。この赤血球凝集活性成分（粗レクチン画分）７０ｍｌを、ＴＢで平衡化したHiPrep QXL 16/10カラムに添加し、カラムをＴＢで洗浄後、ＴＢ中ＮａＣｌの濃度勾配（０〜０．２Ｍ）で溶出させた（グラジエント溶出法）。
【０１７９】
溶出液は２８０ｎｍの吸光度をモニターするとともに、２ｍｌずつ分取し、各画分の赤血球凝集活性を測定した。図５は、上記粗レクチン画分を、HiPrep QXL 16/10カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出）に供した結果を示す図である。図５に実線で示すように、上記溶出液は、凝集活性を示す３つのタンパク質のピークに分離した。
【０１８０】
図５において、横軸はフラクション番号である。左側の縦軸は２８０ｎｍの吸光度を表し、吸光度の測定結果は実線で示されている。右側の縦軸では、「ＨＡ」が赤血球凝集活性（力価）を表し、赤血球凝集活性（力価）の測定結果は三角印で示されている。右側の縦軸のうち、”ＮａＣｌ ｉｎ ＴＢ”は、ＮａＣｌ（ＴＢ中）の濃度勾配を示し、図中、濃度勾配は点線で示されている。
【０１８１】
上記溶出液を、図５に示す４つの画分（Ｉ〜ＩＶ）に分画し、各画分とも、２０μｇのタンパク質に相当する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。結果を図６に示す。なお、タンパク染色はＣＢＢ（Coomassie brilliant blue R-250）染色を行なった。
【０１８２】
図６のＡは非還元下における泳動結果を示し、図６のＢは還元下における泳動結果を示す。Ｍは分子量マーカー、レーン１は２０〜６０％飽和硫安塩析沈殿画分、レーン２はHiPrep QXL 16/10カラム（ステップワイズ溶出）で得られた赤血球凝集活性成分（０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分）、レーン３は画分Ｉ、レーン４は画分ＩＩ、レーン５は画分ＩＩＩ、レーン６は画分ＩＶを示す。なお、上記赤血球凝集活性成分は、「粗レクチン画分」とも称される。
【０１８３】
画分ＩおよびＩＩは、図６のＢに示すように、還元下で２９ｋＤａのほぼ単一のバンドを与えることが確認された。そこで、画分ＩをＭＰＡ−１、画分ＩＩをＭＰＡ−２と命名し、最終精製レクチンとした。
【０１８４】
ＭＰＡ−１およびＭＰＡ−２は、詳細は示さないが、分子量測定、Ｎ末端アミノ酸配列解析およびｃＤＮＡクローニングの結果から、実施例１で述べたＭＰＡ（２９ｋＤａ）のアイソフォームであることが分かった。
【０１８５】
実施例１で述べたＭＰＬは画分ＩＶに溶出した。画分ＩＶは、非還元下では２６ｋＤａおよび５５ｋＤａの２つのバンド成分を与え（図６のＡ）、還元下では１４ｋＤａの主要バンド成分と、８ｋＤａおよび５ｋＤａの微量バンド成分を与えた。なお、画分ＩＩＩは還元下で２９ｋＤａおよび１４ｋＤａのバンド成分を与えることから、ＭＰＬとＭＰＡとを混有すると考えられる。
【０１８６】
（実施例５−２：陰イオン交換クロマトグラフィーによるＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の単離）
上記ＭＰＬ画分（画分ＩＶ）５ｍｌを、ＴＢで平衡化したTSKgel DEAE-5PWカラム（7.5×75 mm、東ソー社）に添加し、ＴＢ中ＮａＣｌの濃度勾配（０−０．２Ｍ）によるグラジエント溶出を行った。操作中、２８０ｎｍの吸光度をモニターしながらピークをそれぞれ分取した。
【０１８７】
図７は、ＭＰＬのTSKgel DEAE-5PWカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製結果を示す図である。図中、横軸は溶出時間を表し、左側の縦軸は２８０ｎｍの吸光度、右側の縦軸はＮａＣｌの濃度を示す。また、実線は２８０ｎｍの吸光度の測定結果を示し、点線はＮａＣｌの濃度を示す。（１）〜（４）はピーク番号である。
【０１８８】
TSKgel DEAE-5PWカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーの結果、図７に示すように、ＭＰＬは４つのピーク（ピーク（１）〜（４））に分離された。そこで次に、ピーク（１）〜（４）をそれぞれ分取後、２０μｇのタンパク質に相当する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供した。結果を図８に示す。
【０１８９】
図中、「非還元」は非還元下における泳動結果を示し、「還元」は還元下における泳動結果を示す。Ｍは分子量マーカーを示し、ＳはＭＰＬ、レーン１〜４はそれぞれピーク（１）〜（４）を泳動させた結果を示す。
【０１９０】
還元下において、ピーク（１）および（３）で１４ｋＤａのほぼ単一のバンドが認められた。ピーク（１）および（３）は、非還元下において２６ｋＤａ付近のタンパク質性バンドを与えた。
【０１９１】
ピーク（２）および（４）については、非還元下で５５ｋＤａ、還元下では１４ｋＤａの他に８ｋＤａおよび５ｋＤａのペプチドの存在が確認された。全ピークに共通して非還元下で２６ｋＤａおよび５５ｋＤａにタンパク質性バンドの存在が認められたが、ピーク（１）および（３）では２６ｋＤａ成分、ピーク（２）および（４）では５５ｋＤａ成分を主成分としていることがわかった。
【０１９２】
そこで、ピーク（１）をＭＰＬ−１、ピーク（３）をＭＰＬ−２と命名し、最終精製標品とした。ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２につき、LTQ Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific）を用いる ESI-MSにより分子量の測定を行った。図９はＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の分子量測定結果を示すものである。
【０１９３】
図９のＡ，Ｂより、ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の分子量はそれぞれ31,104.1 Ｄａおよび31,132.0 Ｄａであることが分かった。
【０１９４】
ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２について、実施例３と同様の方法により、赤血球凝集阻止試験を行った。結果を表３に示す。
【０１９５】
【表３】
【０１９６】
表３では「単糖類および二糖類」と記載しているが、これは、実施例３と同様に、単糖類としてＤ−グルコース（Glc）、Ｄ−マンノース（Man）、Ｄ−ガラクトース（Gal）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuAc）、Ｌ−フコース（Fuc）、Ｄ−キシロース（Xyl）またはＬ−ラムノース（Rha）を各１００ｍＭで用い、二糖類としてラクトース（Lac）を１００ｍＭ用いたことを示す。
【０１９７】
複合型糖鎖を含有する糖タンパク質、高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質、並びに、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含有する糖タンパク質としては、実施例３と同じものを用いた。加えて、Ｎ型糖鎖（複合型）およびＯ型糖鎖を含有する糖タンパク質としてフェツイン、アシアロフェツインを用い、Ｏ型糖鎖を含有する糖タンパク質としてウシ顎下線ムチン、アシアロウシ顎下線ムチンを用いた。
【０１９８】
表３から明らかなように、ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の赤血球凝集活性は、実施例３に示したＭＰＬと同様に、高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質、並びに、複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質によってのみ阻止された。このように、ＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２は、ＭＰＬと同様に、高マンノース型糖鎖に高い親和性を有することが示された。
【０１９９】
〔実施例６：ＭＰＬの構造解析〕
（実施例６−１：ＭＰＬ画分のブロッティング）
実施例１で得られたＭＰＬ画分（２６ｋＤａ）を非還元下および還元下（2-メルカプトエタノール添加）で１２％トリス-トリシン系ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、Polyvinylidene difluoride（ＰＶＤＦ）膜（Immobilon-P（登録商標）、Millipore）へ転写した。
【０２００】
ＰＶＤＦ膜への転写は、セミドライブロッティング装置（AE-6677：ATTO CORPORATION）を用いてブロッティング緩衝液（CAPS buffer：メタノール：超純水= 1:1:8）中、１４４ｍＡの定電流で１時間通電することによって行った。
【０２０１】
CAPS bufferはCAPS（3-Cyclohexylaminopropane sulfonic acid、和光純薬工業）１１．１ｇを４５０ｍｌの超純水に溶解し、ＮａＯＨを用いてｐＨ１１．０に調整した後、超純水で５５０ ｍｌにメスアップしたものを使用した。転写後のＰＶＤＦ膜はＣＢＢ染色を行い、一晩風乾後、目的とする１４ｋＤａ成分および８ｋＤａの成分を切り出して、実施例２同様に、Procise（登録商標）４９２ＨＴを用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。
【０２０２】
図１０は、ＭＰＬ画分をブロッティングし、ＣＢＢ染色したＰＶＤＦ膜を示す図である。図１０において、Ｍは分子量マーカーを示し、「非還元」は非還元下において得られたバンド、「還元」は還元下において得られたバンドを示す。
【０２０３】
（実施例６−２：Ｎ末端アミノ酸配列の解析およびＭＰＬ−１のアミノ酸配列の決定）
図１０に示す８ｋＤａの成分のＮ末端アミノ酸配列はGVVDQLI（配列番号１４）と決定された。この配列は、実施例２で決定された配列番号１２に示すアミノ酸配列のＮ末端と一致した。
【０２０４】
一方、１４ｋＤａの成分については、配列が解析できず、Ｎ末端がブロッキングされていると推測された。そこで、ピログルタミル基によるＮ末端ブロッキングと予測し、脱ピログルタミル化を試みた。
【０２０５】
すなわち、１４ｋＤａ成分を転写したＰＶＤＦ膜を６０％メタノール１ｍｌで２回洗浄後、９０％メタノール１ｍｌで１回洗浄し、これを０．５％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（PVP）-55含有１００ｍＭ 酢酸５００μｌに浸漬し、３７℃で３０分間静置した。次に、蒸留水で膜を１０回以上洗浄し、膜をメタノールで湿らせ、酵素消化を行った。
【０２０６】
酵素消化は、Pfu Pyroglutamate Aminopeptitase（TAKARA）２ｍＵを、酵素反応緩衝液（１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ ７．０））２００μｌ中に溶解し、本溶液中に膜を浸漬後、５０℃で５時間反応させることによって行った。本反応によりピログルタミル基を除去後、膜を蒸留水で３回洗浄し、Procise（登録商標）４９２ ＨＴを用いて分析した。
【０２０７】
その結果、２残基以降の配列がTGSCNTFQRS（配列番号１５）と決定された。これらの結果から、１４ｋＤａの成分のＮ末端はグルタミンがピログルタミル化することによりブロッキングされ、そのＮ末端アミノ酸配列は、QTGSCNTFQRS（配列番号１６）であることがわかった。
【０２０８】
本配列は、図１に示すように、実施例２においてｃＤＮＡクローニングにより明らかとされたＭＰＬ ｃＤＮＡの演繹アミノ酸配列中、実施例２でプロペプチドと予想された領域（２３−９６）の５３番目の残基以降に認められた。図１において、今回決定した１４ ｋＤａ成分のＮ末端アミノ酸配列をボックスで示す。
【０２０９】
ＭＰＬ ｃＤＮＡの演繹アミノ酸配列うち、５３−１９８残基からなる領域の算出分子量は15,553.3 Daであるが、ＥＳＩ−ＭＳによるＭＰＬ−１およびＭＰＬ−２の測定分子量は、実施例５−２で求めたように、それぞれ31,104.1 Daおよび31,132.0 Daである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図６、８）から、ＭＰＬはＳ−Ｓ結合によるホモダイマーであると考えられることから、５３−１９８残基からなる成分が１つのＳ−Ｓ結合により二量体を形成していると仮定すると、その算出分子量は31,104.6となり、ＭＰＬ−１の測定分子量と一致する。
【０２１０】
これらの結果から、実施例２で得られたｃＤＮＡはＭＰＬ−１をコードするものであり、ＭＰＬ−１は１５．６ｋＤａサブユニットのジスルフィド結合による二量体であることがわかった。
【０２１１】
すなわち、ＭＰＬ−１のサブユニット（上記１５．６ｋＤａサブユニット）のｃＤＮＡの全長塩基配列は配列番号１１に示される配列であり、当該塩基配列の演繹アミノ酸配列は配列番号１３に示される配列である。また、ＭＰＬ−１のサブユニットの成熟タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に示し、その演繹アミノ酸配列を配列番号２に示した。
【０２１２】
このことから、ＭＰＬ−１は、高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドの二量体であるということができる。
【０２１３】
そして、当該二量体を含有する抗ウイルス剤も、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とする抗ウイルス剤として用いることができる。また、当該二量体を例えば限外ろ過膜などに固定されてなる膜も、ウイルス除去膜として用いることができる。
【０２１４】
加えて、実施例２で得られたＭＰＬのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１２）は８ｋＤａ成分のものであることがわかった。この８ｋＤａ成分は１５．６ｋＤａ成分に由来することが明らかであるが、１５．６ｋＤａ成分の分解産物であるか、ＭＰＬの構成成分として機能しているかどうかについてはさらなる解析が必要である。
【０２１５】
なお、ＥＳＩ−ＭＳによる測定分子量とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の推定分子量に差異がみられたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によるタンパク質の移動度は、成分の性質（電荷、疎水性、構造等）により実際の分子量と数ｋＤａのズレが生じることがある。
【０２１６】
そのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の成分について、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の推定分子量である１４ｋＤａと、ＥＳＩ−ＭＳによる測定分子量である１５．６ｋＤａ成分とにずれがあることは特に問題はないと考えられる。
【０２１７】
Ｐｆａｍプログラムによる分子内ドメイン検索にＭＰＬ−１を供したところ、ＭＰＬ−１はJacalin-like lectinドメインを含み、紅藻 Griffithsia sp.由来レクチン Griffithsin（GRFT）およびバナナ Musa acuminataレクチンとの配列相同性（同一率）はそれぞれ３３％および２７％と非常に低いものであった。
【０２１８】
成熟タンパク質領域につきBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）を用いて相同配列検索を行ったところ、上記２種のレクチンを含むJacalin-like lectinドメインを有するものが見られたが、その多くはhypothetical proteinであり、ＭＰＬ−１と最も高い同一率を示したものは細菌Brevibacillus laterosporus由来hypothetical protein（３５％）であった。
【０２１９】
このように、ＭＰＬ−１には、部分的には既知レクチンのモチーフと類似するモチーフが存在することが示されたが、従来公知のレクチンとの配列相同性は非常に低く、全体配列から新規タンパク質であることが分かった。
【０２２０】
〔実施例７：ＭＰＬ−１の糖鎖結合特異性〕
（実施例７−１：遠心限外ろ過−ＨＰＬＣ法）
上述のように精製されたＭＰＬ−１につき、糖鎖結合特異性を調べた。すなわち、まず、５０ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の５００ｎＭ ＭＰＬ−１溶液９０μｌ（４５ｐｍｏｌ）と３００ｎＭ ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖水溶液１０μｌ（３ｐｍｏｌ）を軽く混合後、室温で６０分間保温した。
【０２２１】
この反応液を微量遠心限外ろ過器（Nanosep 10K Omega、PALL）を用いて遠心ろ過（10,000×g、30秒）し、ろ液の２０μｌをＨＰＬＣに供し、溶出するＰＡ化糖鎖の量を測定し遊離糖鎖量とした。
【０２２２】
次に、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の９０ｍｌとＰＡ化糖鎖水溶液１０μｌを混合後、同様に処理し、そのろ液の２０μｌをＨＰＬＣに供し、溶出するＰＡ化糖鎖の量を測定して添加糖鎖量とした。
【０２２３】
結合糖鎖量は、添加糖鎖量から反応液の遊離糖鎖量を差し引いた値として算出した。レクチンの糖鎖結合活性は結合率、すなわち添加糖鎖量に対する結合糖鎖量の割合（％）で表示した。なお、結合試験は各糖鎖につき２回行い、結合率は平均値として算出した。
【０２２４】
ＰＡ化糖鎖の分離、定量は逆相系ＨＰＬＣを用いて行った。すなわち、検液を４０℃のカラムオーブン中、TSKgel ODS-80TM カラム（4.6×150 mm）に注入し、０．１Ｍ 酢酸アンモニウム−１５％メタノールで溶出した。流速は１．０ ｍｌ／ｍｉｎとし、溶出液は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍでモニターし、各糖鎖のピーク面積をEZChrom Elite（アジレントテクノロジー）で解析、定量した。
【０２２５】
供試糖鎖としてＰＡ化糖鎖２７種：Ｎ−グリコシド型糖鎖の複合型６種（PA-Sugar Chain 001、002、004、009、010、023、TAKARA）、高マンノース型１１種（PA-Sugar Chain 017、018、019、020、051、052、053、054、055、056、058、TAKARA）、共通コア構造１種（PA-Sugar Chain 016、TAKARA）、共通コア関連糖鎖１種（PA-042、増田化学工業）、糖脂質系糖鎖３種（PA-Sugar Chain 027、028、038、TAKARA）、およびオリゴマンノース５種を用いた。このうち、ＰＡ−オリゴマンノースを除き、市販品（TAKARA）を用いた。
【０２２６】
ＰＡ−オリゴマンノースは、ＰＡ化装置（PALSTATION、TAKARA）を用いて以下のように調製した。
【０２２７】
すなわち、各５０ｎｍｏｌのManα1-2Man、Manα1-3Man、Manα1-6Man、Manα1-6(Manα1-3)Man、Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Man（DextraLaboratories、Funakoshi）を凍結乾燥後、カップリング試薬（2-アミノピリジン／酢酸溶液、Pyridylamination Reagent Kit、TAKARA）２０μｌを加え、９０℃で６０分間反応させた。これに還元試薬（ボラン-ジメチルアミン/酢酸溶液）２０μｌを加え、８０℃で６０分間反応させた。この反応液にトリエチルアミン-メタノール２０μｌを加えてよく撹拌した後、トルエン４０ μｌを加えて撹拌し、窒素気流化で６０℃、１０分間減圧乾固した。
【０２２８】
これにメタノール２０μｌとトルエン４０μｌとを加えて撹拌し、同様に減圧乾固した後、トルエン５０μｌを加えて再び減圧乾固した。過剰の試薬は順相系ＨＰＬＣにより除去した。
【０２２９】
すなわち、上記ＰＡ化物を２５μｌの超純水に溶解した後、４０℃のカラムオーブン中、５０ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（pH7.3）/アセトニトリル（25/75）で平衡化したTSKgel NH2-60カラム（4.6×250 mm）に注入し、５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（pH7.3）/アセトニトリル（25/75）（溶媒Ａ）と５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（pH7.3）/アセトニトリル（50/50）（溶媒Ｂ）の２液による濃度勾配［溶媒Ａ １００％（０−５分）、溶媒Ａ ０％−溶媒Ｂ １００％（５−５５分）]を用いて、流速1.0ml/minで溶出した。溶出液は励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍでモニターし、ＰＡ化糖鎖（オリゴマンノース）ピークを分取した。
【０２３０】
得られたＰＡ−オリゴマンノースの定量は以下のようにして行った。すなわち、上記の各オリゴマンノース画分の５０μｌを減圧乾固後、4N HCl/4M TFA（1/1（v/v））中１００℃で４時間、気相酸加水分解した。
【０２３１】
この加水分解物を５０μｌの超純水に溶解し、その１０μｌを４０℃のカラムオーブン中、TSKgel ODS-80TMカラム（4.6×150 mm）に注入し、０．１ Ｍ 酢酸アンモニウム−１０％メタノールで溶出した。流速は1.0ml/minとし、溶出液は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｍｍでモニターした。
【０２３２】
これにより、ＰＡ−オリゴマンノースから加水分解により遊離したＰＡ−マンノースのピーク面積を測定した。このＰＡ−マンノースの定量は、１０ｐｍｏｌの標準ＰＡ−マンノース（TAKARA）の同カラムからの溶出ピーク面積との比較により行い、ＰＡ−オリゴマンノース量とした。
【０２３３】
（実施例７−２：糖鎖結合特異性試験結果）
遠心限外ろ過−ＨＰＬＣ法により２７種類のピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖に対するＭＰＬ−１の結合性を精査した。図１１は、ＰＡ化糖鎖２７種の構造と、当該糖鎖へのＭＰＬ−１の結合活性を示すものである。図中、結合活性（単位％、結合糖鎖量/添加糖鎖量×１００）が１０％以下ものはハイフンで示した。
【０２３４】
図１１に示すように、ＭＰＬ−１は供試した糖鎖中、Ｎ−グリコシド型糖鎖のうち高マンノース型糖鎖とのみ特異的に結合することがわかった。複合型（図１１に示す１−６）、共通コア構造（図１１に示す２３−２４）とは結合しなかったことから、本レクチンは高マンノース型糖鎖構造のオリゴマンノースで構成される分岐糖鎖部分を認識することが判明した。さらに興味深いことに、高マンノース型糖鎖（図１１に示す７−１７）に対する結合性について、分岐糖鎖部分のオリゴマンノース構造の違いにより結合活性に明瞭な差異が認められた。
【０２３５】
ここで、高マンノース型糖鎖の非還元末端は、トリマンノースコアのMan(α1-3)アーム（Ｄ１アーム）、同コアのMan(α1-6)アームから分岐したMan(α1-3)アーム（Ｄ２アーム）および同Man(α1-6)アームから分岐したMan(α1-6)アーム（Ｄ３アーム）の３つのアームからなる。
【０２３６】
ＭＰＬ−１はＤ３アームの非還元末端にα1-2Manを有するもの（図１１に示す９、１０、１３、１５）とのみ高い結合活性が認められ、その結合率は９６％以上であった。一方、同Man残基を含まない高マンノース型糖鎖（図１１に示す７、８、１１、１２、１４、１６、１７）およびオリゴマンノース（図１１に示す１８−２２）に対するＭＰＬ−１の結合活性は、図１１に示す糖鎖１２を除いて１０％以下であった。糖鎖１２はＤ３アームにα1-2Manを含まず、Ｄ１アームの非還元末端にMan(α1-2)Man(α1-2)を有するＭ７糖鎖であるが、同様の構造を有するＭ８糖鎖（図１１に示す１４）では結合がみられないことから、ＭＰＬ−１の主要認識糖鎖構造ではないと考えられる。
【０２３７】
これらの結果から、ＭＰＬ−１はＤ３アームの非還元末端にα1-2Man残基を有する高マンノース型糖鎖とのみ結合すると考えられる。単糖類（マンノースを含む）に結合せず、このような厳密な高マンノース型糖鎖認識をもつものは既知レクチン中に見出されていない。糖化合物による赤血球凝集阻止試験でＭＰＬ−１と同様のプロファイル（表３）を示したイソレクチンＭＰＬ−２においても同様の糖鎖結合特異性を有すると予測される。
【０２３８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０２３９】
本発明にかかるポリペプチドは、ＨＩＶなどのウイルスが備える高マンノース型糖鎖と特異的に結合することができる新規ポリペプチドであり、抗ウイルス剤、ウイルス除去膜等への適用が可能である。それゆえ、医療産業、薬品産業等において広く利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを含有し、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とすることを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項５】
上記ウイルスは、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス６および重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれるウイルスであることを特徴とする請求項４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドが固定されてなることを特徴とするウイルス除去膜。
【請求項７】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法。
【請求項１】
高マンノース型糖鎖と結合するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを含有し、高マンノース型糖鎖を備えるウイルスを標的とすることを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項５】
上記ウイルスは、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス６および重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれるウイルスであることを特徴とする請求項４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドが固定されてなることを特徴とするウイルス除去膜。
【請求項７】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図３】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図３】
【図６】
【図８】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−２１３３８２（Ｐ２０１２−２１３３８２Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−３２２０５（Ｐ２０１２−３２２０５）
【出願日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ・刊行物名 平成２３年度日本水産学会秋季大会（日本農学大会水産部会）講演要旨集 発行日 平成２３年９月２８日 発行所 平成２３年度日本水産学会秋季大会 ・研究集会名 平成２３年度日本水産学会秋季大会（日本農学大会水産部会） 主催者名 公益社団法人 日本水産学会 開催日 平成２３年９月２８日〜１０月２日
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ・刊行物名 平成２３年度日本水産学会秋季大会（日本農学大会水産部会）講演要旨集 発行日 平成２３年９月２８日 発行所 平成２３年度日本水産学会秋季大会 ・研究集会名 平成２３年度日本水産学会秋季大会（日本農学大会水産部会） 主催者名 公益社団法人 日本水産学会 開催日 平成２３年９月２８日〜１０月２日
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]