新規乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法
【課題】新規乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法の提供。
【解決手段】ビフィドバクテリウム属菌と下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いて発酵させる発酵乳の製造方法；１）１０％還元脱脂粉乳培地で２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に培地が凝固する発酵性、２）１０％還元脱脂粉乳培地でビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時にビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とするビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、３）１０％還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とするビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
【解決手段】ビフィドバクテリウム属菌と下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いて発酵させる発酵乳の製造方法；１）１０％還元脱脂粉乳培地で２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に培地が凝固する発酵性、２）１０％還元脱脂粉乳培地でビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時にビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とするビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、３）１０％還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とするビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種に属する新規乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトコッカス属菌やビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等の乳酸菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、乳酸菌の食品への利用が盛んになってきている。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、生きているビフィドバクテリウム属菌を含む発酵乳等の食品への需要が高まっている。
【０００３】
ビフィドバクテリウム属菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのビフィドバクテリウム属菌を含有させるために、通常、様々な生育促進物質を添加することが行われている。しかし、該生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。また、ビフィドバクテリウム属菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィドバクテリウム属菌量は加速度的に減少してしまう。
そこで、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィドバクテリウム属菌を多く含有する発酵乳を製造し得るばかりではなく、生きているビフィドバクテリウム属菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造し得ることが期待できる。
【０００４】
ビフィドバクテリウム属菌以外の乳酸菌と混合発酵をさせることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。発酵乳製造におけるビフィドバクテリウム属菌の生育性を改善させる方法については、例えば、（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびビフィドバクテリウム属菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
その他、発酵乳のビフィドバクテリウム属菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、（２）乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスを混合培養することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【特許文献１】特許第３３６４４９１号公報
【特許文献２】特許第３０６８４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）の方法では、特定のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス菌種と特定のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が存在する条件下で、ビフィドバクテリウム属菌の生育が促進され、発酵時間を短縮することができるものの、これらのラクトコッカス属菌によるビフィドバクテリウム属菌の生育促進効果や発酵時間短縮効果は、十分なものではなかった。また、特許文献１には、ビフィドバクテリウム属菌の保存生残性については一切記載がない。
一方、上記（２）の方法では、特定のビフィドバクテリウム属菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィドバクテリウム属菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）については、一切記載がない。
【０００７】
本発明は、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地における発酵性に優れた乳酸菌の菌株について、ビフィドバクテリウム属菌との混合培養による発酵試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム属菌の菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム属菌の生育促進性や、発酵終了後に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム属菌の生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム属菌の保存生残性促進性を有する乳酸菌を見出した。そして、該乳酸菌を用いることにより、ビフィドバクテリウム属菌を大量に含有し、かつ保存生残性にも優れた発酵乳が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、乳酸菌として、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌と、下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、
（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）と混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、
（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０）である、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベである、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌の菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ１５７００である、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌が、前記ビフィドバクテリウム属菌、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）とであることを特徴とする、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の発酵乳の製造方法により、従来に無くビフィドバクテリウム属菌を多く含有する発酵乳を、効率よく製造することができる。また、本発明の発酵乳は、生きているビフィドバクテリウム属菌の含有量が、流通過程においても充分に維持されるため、より整腸効果が高く、健康管理上も有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ビフィドバクテリウム属菌（以下、ビフィズス菌ということがある。）と、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法である。特にビフィドバクテリウム・ロンガムを用いて発酵させる発酵乳の製造に適している。
【００１２】
本発明で用いられるビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等であることが好ましい。特にビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株等であることがより好ましい。
【００１３】
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するものである。
（１）は、発酵性に関するものである。１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、ビフィドバクテリウム属菌（以下、ビフィズス菌ということがある。）の生育性等をより効果的に改善することができるためである。
【００１４】
通常、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種に適した発酵温度範囲は、２０〜３０℃であるが、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、２５〜３０℃の温度範囲で強い発酵性を有する菌である。
【００１５】
（２）は、ビフィズス菌の生育促進性に関するものである。１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地等の乳性培地は、ｐＨが４．６付近になると、通常、含有されるカゼイン等が沈殿し、培地全体が凝固し、風味、食感及び外観が優れたものになる。このため、発酵乳製品を製造する場合には、一般に、ｐＨが４．６付近に達した時に、急冷等をすることにより発酵を停止する。したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上という高濃度にすることができるような生育促進性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、発酵乳中のビフィズス菌含有量をより効果的に改善することができるためである。
【００１６】
（３）は、ビフィズス菌の保存生残性促進性に関するものである。発酵乳製品の品質保持期限は、一般に、１０℃以下の保存条件で２週間程度である。したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であれば、品質保持期限終了間際においても充分量のビフィズス菌を含有し得る発酵乳を製造することができるためである。
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種においては、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と混合培養しなかった場合の生残率の３倍以上、好ましくは４．５倍以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であることが好ましい。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上、好ましくは４５％以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であることがより好ましい。
【００１７】
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、例えば以下の方法により得ることができる。まず、各種の試料から菌株を分離し、この中から１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性が優れたもの、すなわち、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択する。次いで、選択された菌とビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、優れたビフィズス菌の生育促進性及び保存生残性促進性を有する菌株を選択することにより得ることができる。
【００１８】
以下、さらに詳細に説明する。
１．菌株の取得
本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。以下、参考文献１と記載する。）で希釈し、Ｂｒｉｇｇｓ ｌｉｖｅｒ ｂｒｏｔｈ（前記参考文献１、３１９ページ）の平板に塗布し、３０℃で嫌気培養した。そして得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。該釣菌した菌を、ＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。これらの菌株を下記の方法を用いて、まず、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地中での発酵試験を行い、優れた発酵性を有する菌株を２０株得た。続いて、ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる生育促進性と、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる保存生残性促進性を有する菌株を２株取得した。該２菌株はそれぞれ、ＭＣＣ−８７６、ＭＣＣ−８８０と名付けられた。
【００１９】
２．菌学的性質
前記２菌株の菌学的性質を、表１及び表２に示す。比較対象として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５（＝ＮＣＩＢ８１３９）株、及び特許文献２に記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株の菌学的性質も示した。なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter H. A. Sneath編、第２巻、Williams and Wilkins Company、１９８６年）にほぼ従って行った。また、糖の発酵性は、光岡の糖発酵性用培地（１９７４年、光岡知足著「乳酸菌の細菌学」、臨床検査１８、１１６３〜１１７２ページ）を用いて、２８種類の糖について試験を行った。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
上記１〜１５に示す菌学的性質は、前記２菌株にほぼ共通しており、かつ、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５とも共通していた。一方で、糖の発酵性については、表２より明らかであるように、各菌株で異なる性質を示した。
【００２３】
以上の結果から、前記２菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌学的性質を共通して有していることが明らかである。すなわち、前記２菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種であることが確認された。一方、糖の発酵性から、前記２菌株は、公知のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスとは異なる性質を有することが明らかである。
【００２４】
そこで、出願人は、前記２菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に新規菌株として寄託した。このうち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０である（寄託日：平成２０年１月２４日）。
【００２５】
３．１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性試験
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９５℃で３０分間殺菌し、各菌株のスターターを３％接種し、２５及び３０℃の各温度で１６時間培養した。得られた培養液を急冷し、凝固状況、ｐＨ、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研機材社製）平板で行った。測定結果を表３に示す。
なお、対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
【００２６】
【表３】
【００２７】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株又はＭＣＣ−８８０株、すなわち、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが４．４〜４．６まで低下して培地が凝固した。また、含有される乳酸菌数も５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上であり、非常に増殖・発酵性の良いことが分かった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが５．５以上であり、培地は凝固しなかった。また、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と比較して、特に３０℃において、乳酸菌数が顕著に少なかった。
【００２８】
４．ビフィズス菌との混合培養試験
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株との混合培養試験
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株を用いて確認した。
対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャーを調製した。
また、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株のカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株のカルチャーを調製した。ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーも同様に調製した。
【００２９】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス属菌の各菌株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行なった。測定結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株又は８８０株をそれぞれ用いた発酵乳は、発酵後ｐＨがおよそ４．６であり、ビフィズス菌数が５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上に達した。また、該発酵乳を１０℃で２週間保存した場合のビフィズス菌生残率は、何れも４５％以上であった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた発酵乳は、発酵が進まず、発酵後ｐＨが５．０以上であり、１０℃での保存試験が不可能であった。また、発酵終了直後のビフィズス菌数もおよそ１×１０８ＣＦＵ／ｇであり、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と比較して、顕著に少なかった。
【００３２】
すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの公知の他の菌株よりも、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性が優れていることが明らかである。
【００３３】
（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株との混合培養試験
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株とビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株を用いて確認した。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャーを調製した。
また、後記実施例９に記載の方法で、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の混合カルチャーを調製した。
さらに、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地を９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のスターターを１０％接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャーを調製した。
【００３４】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー１％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１．５％又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー１．５％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．４％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。測定結果を表５に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株と、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株の両株とも、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、発酵乳中のビフィズス菌数は顕著に増大した。
また、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株の場合、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養しなかった場合には約１３％であったのに対して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養した場合には約６０％であった。つまり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は４．５倍以上改善された。
一方、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株の場合には、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養しなかった場合の１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は約０．０２％であったのに対して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養した場合には約５％であり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は著しく改善されていた。
なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株に代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた場合にも同様の結果が得られた。
【００３７】
すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及びＭＣＣ−８８０株は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等の、ビフィドバクテリウム・ロンガム以外のビフィズス菌に対しても、優れた生育促進性及び保存生残性促進性を有することが明らかである。
【００３８】
５．特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物との比較試験
まず、上記４（２）記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー、及び、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャーを調製した。
【００３９】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％と、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）２％を接種し、３８℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。なお、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」は、特許文献１に記載の「ＥＺＡＬ ＭＲ０１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）に相当する混合物である。
【００４０】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株を用いた発酵乳では、ビフィズス菌数は５．７×１０８ＣＦＵ／ｇであった。これに対し、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」を用いた発酵乳を１０６倍に希釈した希釈溶液からは、ビフィズス菌が全く検出されず、該発酵乳に含有されるビフィズス菌数は１×１０６ＣＦＵ／ｇ以下であることが判明した。
【００４１】
すなわち、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、特許文献１に記載されているようなビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を得ることができないことが明らかである。
【００４２】
以上のように、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、特に、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株の２菌株は、ビフィズス菌に適した発酵温度範囲における１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、強い発酵性を示し、さらに、ビフィズス菌と混合培養した場合に、ビフィズス菌の生育及び保存生残に対し、優れた促進効果を示すことから、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの公知の菌株にみられなかった性質を持っていることは明らかである。また、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、ダイアセチル及びアセトインを生成しないため、風味の良い発酵物を製造することも期待できる。
【００４３】
本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の前培養に用いられる培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。
【００４４】
本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いた発酵に用いられる発酵用ベースは、発酵乳の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではない。該ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。
【００４５】
ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のスターターの発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１が特に好ましい。また、発酵用ベースへ添加する量も、特に限定されるものではないが、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を合わせた添加量が、発酵用ベースに対して０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％が特に好ましい。
【００４６】
本発明に用いられる乳酸菌には、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のビフィズス菌に対する生育促進効果及び保存生残性促進効果を阻害しない範囲において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の他に、他の乳酸菌を含有してもよい。該他の乳酸菌は、通常発酵乳の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスが好ましい。ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を合わせた摂取量と、その他の乳酸菌を合わせた摂取量の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のビフィズス菌に対する効果を阻害しない限り、特に限定されるものではないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。
【００４７】
本発明の発酵乳の製造方法における、混合培養の温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。本発明に用いられるビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の両方が充分に生育可能な温度範囲であるためである。また、培養時間は、製造する発酵乳の種類によって適宜決定されるが、５〜１８時間が好ましい。
【００４８】
培養後得られた発酵乳は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状に加工してもよい。その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実施例１］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖５．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー５０ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６であり、６．０×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は３．２×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は５３％であった。
【００５１】
［実施例２］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃５時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．０％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株のカルチャー５００ｍＬ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー５００ｍＬ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５ｍＬを接種し、３７℃７時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳は乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．５であり、６．８×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この発酵乳を１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は３．８×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は５６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の製造方法により、消費期限終了直前であっても、生きているビフィズス菌を従来に無く多く含有する発酵乳を製造することができるため、発酵乳等の製造分野で利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種に属する新規乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトコッカス属菌やビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等の乳酸菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、乳酸菌の食品への利用が盛んになってきている。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、生きているビフィドバクテリウム属菌を含む発酵乳等の食品への需要が高まっている。
【０００３】
ビフィドバクテリウム属菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのビフィドバクテリウム属菌を含有させるために、通常、様々な生育促進物質を添加することが行われている。しかし、該生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。また、ビフィドバクテリウム属菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。このため、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィドバクテリウム属菌量は加速度的に減少してしまう。
そこで、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィドバクテリウム属菌を多く含有する発酵乳を製造し得るばかりではなく、生きているビフィドバクテリウム属菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造し得ることが期待できる。
【０００４】
ビフィドバクテリウム属菌以外の乳酸菌と混合発酵をさせることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。発酵乳製造におけるビフィドバクテリウム属菌の生育性を改善させる方法については、例えば、（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびビフィドバクテリウム属菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
その他、発酵乳のビフィドバクテリウム属菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、（２）乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスを混合培養することを特徴とするビフィドバクテリウム属菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【特許文献１】特許第３３６４４９１号公報
【特許文献２】特許第３０６８４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）の方法では、特定のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス菌種と特定のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が存在する条件下で、ビフィドバクテリウム属菌の生育が促進され、発酵時間を短縮することができるものの、これらのラクトコッカス属菌によるビフィドバクテリウム属菌の生育促進効果や発酵時間短縮効果は、十分なものではなかった。また、特許文献１には、ビフィドバクテリウム属菌の保存生残性については一切記載がない。
一方、上記（２）の方法では、特定のビフィドバクテリウム属菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィドバクテリウム属菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）については、一切記載がない。
【０００７】
本発明は、ビフィドバクテリウム属菌の生育性や保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地における発酵性に優れた乳酸菌の菌株について、ビフィドバクテリウム属菌との混合培養による発酵試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム属菌の菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム属菌の生育促進性や、発酵終了後に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム属菌の生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム属菌の保存生残性促進性を有する乳酸菌を見出した。そして、該乳酸菌を用いることにより、ビフィドバクテリウム属菌を大量に含有し、かつ保存生残性にも優れた発酵乳が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、乳酸菌として、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌と、下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、
（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）と混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、
（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０）である、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベである、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌の菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ１５７００である、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌が、前記ビフィドバクテリウム属菌、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）とであることを特徴とする、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の発酵乳の製造方法により、従来に無くビフィドバクテリウム属菌を多く含有する発酵乳を、効率よく製造することができる。また、本発明の発酵乳は、生きているビフィドバクテリウム属菌の含有量が、流通過程においても充分に維持されるため、より整腸効果が高く、健康管理上も有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ビフィドバクテリウム属菌（以下、ビフィズス菌ということがある。）と、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法である。特にビフィドバクテリウム・ロンガムを用いて発酵させる発酵乳の製造に適している。
【００１２】
本発明で用いられるビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等であることが好ましい。特にビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株等であることがより好ましい。
【００１３】
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するものである。
（１）は、発酵性に関するものである。１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、ビフィドバクテリウム属菌（以下、ビフィズス菌ということがある。）の生育性等をより効果的に改善することができるためである。
【００１４】
通常、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種に適した発酵温度範囲は、２０〜３０℃であるが、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、２５〜３０℃の温度範囲で強い発酵性を有する菌である。
【００１５】
（２）は、ビフィズス菌の生育促進性に関するものである。１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地等の乳性培地は、ｐＨが４．６付近になると、通常、含有されるカゼイン等が沈殿し、培地全体が凝固し、風味、食感及び外観が優れたものになる。このため、発酵乳製品を製造する場合には、一般に、ｐＨが４．６付近に達した時に、急冷等をすることにより発酵を停止する。したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上という高濃度にすることができるような生育促進性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、発酵乳中のビフィズス菌含有量をより効果的に改善することができるためである。
【００１６】
（３）は、ビフィズス菌の保存生残性促進性に関するものである。発酵乳製品の品質保持期限は、一般に、１０℃以下の保存条件で２週間程度である。したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であれば、品質保持期限終了間際においても充分量のビフィズス菌を含有し得る発酵乳を製造することができるためである。
本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種においては、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を、本発明のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と混合培養しなかった場合の生残率の３倍以上、好ましくは４．５倍以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であることが好ましい。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上、好ましくは４５％以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であることがより好ましい。
【００１７】
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、例えば以下の方法により得ることができる。まず、各種の試料から菌株を分離し、この中から１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性が優れたもの、すなわち、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択する。次いで、選択された菌とビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、優れたビフィズス菌の生育促進性及び保存生残性促進性を有する菌株を選択することにより得ることができる。
【００１８】
以下、さらに詳細に説明する。
１．菌株の取得
本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。以下、参考文献１と記載する。）で希釈し、Ｂｒｉｇｇｓ ｌｉｖｅｒ ｂｒｏｔｈ（前記参考文献１、３１９ページ）の平板に塗布し、３０℃で嫌気培養した。そして得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。該釣菌した菌を、ＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。これらの菌株を下記の方法を用いて、まず、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地中での発酵試験を行い、優れた発酵性を有する菌株を２０株得た。続いて、ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる生育促進性と、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる保存生残性促進性を有する菌株を２株取得した。該２菌株はそれぞれ、ＭＣＣ−８７６、ＭＣＣ−８８０と名付けられた。
【００１９】
２．菌学的性質
前記２菌株の菌学的性質を、表１及び表２に示す。比較対象として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５（＝ＮＣＩＢ８１３９）株、及び特許文献２に記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株の菌学的性質も示した。なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter H. A. Sneath編、第２巻、Williams and Wilkins Company、１９８６年）にほぼ従って行った。また、糖の発酵性は、光岡の糖発酵性用培地（１９７４年、光岡知足著「乳酸菌の細菌学」、臨床検査１８、１１６３〜１１７２ページ）を用いて、２８種類の糖について試験を行った。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
上記１〜１５に示す菌学的性質は、前記２菌株にほぼ共通しており、かつ、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５とも共通していた。一方で、糖の発酵性については、表２より明らかであるように、各菌株で異なる性質を示した。
【００２３】
以上の結果から、前記２菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌学的性質を共通して有していることが明らかである。すなわち、前記２菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種であることが確認された。一方、糖の発酵性から、前記２菌株は、公知のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスとは異なる性質を有することが明らかである。
【００２４】
そこで、出願人は、前記２菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に新規菌株として寄託した。このうち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株の受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０である（寄託日：平成２０年１月２４日）。
【００２５】
３．１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性試験
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９５℃で３０分間殺菌し、各菌株のスターターを３％接種し、２５及び３０℃の各温度で１６時間培養した。得られた培養液を急冷し、凝固状況、ｐＨ、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研機材社製）平板で行った。測定結果を表３に示す。
なお、対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
【００２６】
【表３】
【００２７】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株又はＭＣＣ−８８０株、すなわち、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが４．４〜４．６まで低下して培地が凝固した。また、含有される乳酸菌数も５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上であり、非常に増殖・発酵性の良いことが分かった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが５．５以上であり、培地は凝固しなかった。また、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と比較して、特に３０℃において、乳酸菌数が顕著に少なかった。
【００２８】
４．ビフィズス菌との混合培養試験
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株との混合培養試験
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株を用いて確認した。
対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャーを調製した。
また、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株のカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株のカルチャーを調製した。ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーも同様に調製した。
【００２９】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス属菌の各菌株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行なった。測定結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株又は８８０株をそれぞれ用いた発酵乳は、発酵後ｐＨがおよそ４．６であり、ビフィズス菌数が５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上に達した。また、該発酵乳を１０℃で２週間保存した場合のビフィズス菌生残率は、何れも４５％以上であった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ９６２５株又はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス タイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた発酵乳は、発酵が進まず、発酵後ｐＨが５．０以上であり、１０℃での保存試験が不可能であった。また、発酵終了直後のビフィズス菌数もおよそ１×１０８ＣＦＵ／ｇであり、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種と比較して、顕著に少なかった。
【００３２】
すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの公知の他の菌株よりも、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性が優れていることが明らかである。
【００３３】
（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株との混合培養試験
本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の、ビフィズス菌に対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株とビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株を用いて確認した。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャーを調製した。
また、後記実施例９に記載の方法で、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の混合カルチャーを調製した。
さらに、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地を９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のスターターを１０％接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャーを調製した。
【００３４】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー１％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１．５％又はビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー１．５％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．４％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。測定結果を表５に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株と、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株の両株とも、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、発酵乳中のビフィズス菌数は顕著に増大した。
また、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株の場合、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養しなかった場合には約１３％であったのに対して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養した場合には約６０％であった。つまり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は４．５倍以上改善された。
一方、ビフィドバクテリウム・ブレーベ タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株の場合には、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養しなかった場合の１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は約０．０２％であったのに対して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養した場合には約５％であり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株と混合培養することにより、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は著しく改善されていた。
なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株に代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株を用いた場合にも同様の結果が得られた。
【００３７】
すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及びＭＣＣ−８８０株は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等の、ビフィドバクテリウム・ロンガム以外のビフィズス菌に対しても、優れた生育促進性及び保存生残性促進性を有することが明らかである。
【００３８】
５．特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物との比較試験
まず、上記４（２）記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー、及び、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャーを調製した。
【００３９】
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー１％と、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）２％を接種し、３８℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。なお、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」は、特許文献１に記載の「ＥＺＡＬ ＭＲ０１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）に相当する混合物である。
【００４０】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株を用いた発酵乳では、ビフィズス菌数は５．７×１０８ＣＦＵ／ｇであった。これに対し、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」を用いた発酵乳を１０６倍に希釈した希釈溶液からは、ビフィズス菌が全く検出されず、該発酵乳に含有されるビフィズス菌数は１×１０６ＣＦＵ／ｇ以下であることが判明した。
【００４１】
すなわち、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、特許文献１に記載されているようなビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を得ることができないことが明らかである。
【００４２】
以上のように、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、特に、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株及び８８０株の２菌株は、ビフィズス菌に適した発酵温度範囲における１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、強い発酵性を示し、さらに、ビフィズス菌と混合培養した場合に、ビフィズス菌の生育及び保存生残に対し、優れた促進効果を示すことから、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの公知の菌株にみられなかった性質を持っていることは明らかである。また、本発明で用いられるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種は、ダイアセチル及びアセトインを生成しないため、風味の良い発酵物を製造することも期待できる。
【００４３】
本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の前培養に用いられる培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。
【００４４】
本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を用いた発酵に用いられる発酵用ベースは、発酵乳の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではない。該ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。
【００４５】
ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のスターターの発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１が特に好ましい。また、発酵用ベースへ添加する量も、特に限定されるものではないが、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を合わせた添加量が、発酵用ベースに対して０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％が特に好ましい。
【００４６】
本発明に用いられる乳酸菌には、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のビフィズス菌に対する生育促進効果及び保存生残性促進効果を阻害しない範囲において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の他に、他の乳酸菌を含有してもよい。該他の乳酸菌は、通常発酵乳の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスが好ましい。ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種を合わせた摂取量と、その他の乳酸菌を合わせた摂取量の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種のビフィズス菌に対する効果を阻害しない限り、特に限定されるものではないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。
【００４７】
本発明の発酵乳の製造方法における、混合培養の温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。本発明に用いられるビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の両方が充分に生育可能な温度範囲であるためである。また、培養時間は、製造する発酵乳の種類によって適宜決定されるが、５〜１８時間が好ましい。
【００４８】
培養後得られた発酵乳は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状に加工してもよい。その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実施例１］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖５．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６株のカルチャー５０ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー５００ｍＬを接種し、３７℃１６時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６であり、６．０×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。このドリンクヨーグルトを１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は３．２×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は５３％であった。
【００５１】
［実施例２］
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃５時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．０％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８８０株のカルチャー５００ｍＬ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株のカルチャー５００ｍＬ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５ｍＬを接種し、３７℃７時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳は乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．５であり、６．８×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この発酵乳を１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は３．８×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は５６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の製造方法により、消費期限終了直前であっても、生きているビフィズス菌を従来に無く多く含有する発酵乳を製造することができるため、発酵乳等の製造分野で利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌として、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌と、下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法。
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、
（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）と混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、
（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
【請求項２】
前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする請求項１記載の発酵乳の製造方法。
【請求項３】
前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０）である、請求項１又は２記載の発酵乳の製造方法。
【請求項４】
前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）である、請求項１〜３のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
【請求項５】
前記ビフィドバクテリウム属菌の菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ１５７００である、請求項１〜３のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
【請求項６】
前記乳酸菌が、前記ビフィドバクテリウム属菌、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）とであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳。
【請求項１】
乳酸菌として、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌と、下記の菌学的性質を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）菌種を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法。
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、
（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）と混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０８ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、
（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
【請求項２】
前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種が、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする請求項１記載の発酵乳の製造方法。
【請求項３】
前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種の菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＭＣＣ−８７６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４９０）である、請求項１又は２記載の発酵乳の製造方法。
【請求項４】
前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）である、請求項１〜３のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
【請求項５】
前記ビフィドバクテリウム属菌の菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣＢＡＡ−９９９及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベＡＴＣＣ１５７００である、請求項１〜３のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
【請求項６】
前記乳酸菌が、前記ビフィドバクテリウム属菌、前記ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス菌種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）とであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳。
【公開番号】特開２００９−２３２７１７（Ｐ２００９−２３２７１７Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８１１５２（Ｐ２００８−８１１５２）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]