新規分解型リモノイド化合物
【課題】(+)-イソフラキシネロン又は(-)-フラキシネロン誘導体を生物変換して得られる化合物、該化合物を有効成分として含有する害虫摂食阻害剤を提供する。
【解決手段】一般式（Ａ）又は（Ｃ）：
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］で表される化合物、並びに該化合物を有効成分として含む害虫摂食阻害剤に関する。
【解決手段】一般式（Ａ）又は（Ｃ）：
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］で表される化合物、並びに該化合物を有効成分として含む害虫摂食阻害剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規分解型リモノイド化合物、該化合物の製造方法、該化合物を有効成分として含有する害虫摂食阻害剤、該化合物を含有する組成物及び該組成物を害虫に適用する害虫防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミカン科の植物に含まれるリモノイドには、種々の分解型リモノイドが知られている。これらは、リモノイドと共通する部分構造を有しており、リモノイドよりも小さく単純な化合物である。このような分解型リモノイドに属し、Rutaceae(ミカン科)から得られる(-)-フラキシネロン（(-)-fraxinellone））は、様々な生物活性を有することが報告されている（非特許文献１〜４）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
本発明者らは、(+)-イソフラキシネロン（(+)-isofraxinellone）の抗変異原活性（antimutagenic activites）について、既に報告している（非特許文献５）。また、Liuらは、(-)-フラキシネロンが、コクゾウムシ(Sitophilus zeamais)の成虫と同様、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）の成虫及び幼虫に対しても摂食阻害活性を有することを報告している（非特許文献６）。さらにMaiqueらは、下記一般式３
【０００５】
【化２】
【０００６】
で表される化合物（以下、化合物(３)ということがある）が、Trypaosoma cruziのトリポマスティゴート型原虫に対して、弱い摂食阻害活性を有することを報告している（非特許文献７）。
【０００７】
生物変換は、生体中に存在する酵素を生体触媒として使用する簡易な手法であり、不活性な天然物から生理活性を有する医薬又は農薬化合物を製造するために用いられる。該手法の製造条件は温和であり、多くの場合、官能基の保護を必要としない。さらに、生物変換の特徴は、位置及び立体選択的反応であり、光学活性な生成物を与えることである。生物変換によって、天然物から生理活性物質を得る方法として、本発明者らは、フラボノイド（非特許文献８及び９）、テルペノイド（非特許文献１０及び１１）及びリグナン（非特許文献１０及び１１）の生物変換について報告している。
【０００８】
現在、過剰な農薬使用が問題視されているが、通常、無農薬で食害を防ぐことは困難であり、環境負荷の少ない害虫防除法が求められている。害虫に対して摂食阻害活性を有する化合物は、低分子でありながら極めて低濃度で生物活性を示すため、安全かつ選択的な害虫防除剤としての利用が期待され、実用化に向けた研究が活発になされている。害虫摂食阻害剤の摂食阻害活性が強ければ害虫は餓死するので、その物質の使用濃度において人体に無害であれば、害虫摂食阻害剤は農薬として使用される可能性もある。
【非特許文献１】Okamura, H.; Yamauchi, K.; Miyawaki, K.; Iwagawa, T.; Nakatani, M. Tetrahedron Letters. 1997, 38, 263-266.
【非特許文献２】Nakatani, M.; Huang, RC.; Okamura, H.; Iwagawa, T.; Tadera, K. Phytochemistry. 1998, 49, 1773-1776.
【非特許文献３】Yu, S. M.; Ko, F. N.; Su, M. J.; Wu, T. S.; Wang, M. L.; Huang, T. F.; Teng, C. M. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. 1992, 345, 349-355.
【非特許文献４】Woo, W. S.; Lee, E. B.; Kang, S. S.; Shin, K. H.; Chi, H. J. Planta Med. 1987, 53, 399-401.
【非特許文献５】Miyazawa, M.; Shimamura, H.; Nakamura, S.; Kameoka, H. J. Agric, Food Chem. 1995, 4, 1428-1431.
【非特許文献６】Liu, Z. L.; Xu, Y. J.; Wu, J.; Goh, S. H.; Ho, S. H. J. Agric, Food Chem. 2002, 50, 1447-1450.
【非特許文献７】Maique, W. B.; Paulo, C. V. M.; Fatima, G. F. D. S.; Joao, B. F.; Sergio, A. Z. Naturforsch. 2001, 56c, 570-574.
【非特許文献８】Miyazawa, M.; Takahashi, K.; Araki, H. J Chem Technol Biotechnol. 2006, 81, 674-678.
【非特許文献９】Okuno, Y.; Miyazawa, M. J Chem Technol Biotechnol. 2006, 81, 29-33.
【非特許文献１０】Miyazawa, M.; Miyamoto, Y. J Mol Catal B. 2004, 27, 83-89.
【非特許文献１１】Miyazawa, M.; Nankai, H.; Kameoka, H. Phytochemistry. 1996, 43, 105-109.
【非特許文献１２】Miyazawa, M.; Kasahara, H.; Kameoka, H. Phytochemistry. 1994, 35, 1191-1193.
【非特許文献１３】Miyazawa, M.; Kasahara, H.; Kameoka, H. Phytochemistry. 1993, 34, 1501-1507.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規分解型リモノイド化合物、該化合物の製造方法、該化合物を有効成分として含有する害虫摂食阻害剤、該化合物を含有する組成物及び該組成物を害虫に適用する害虫防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、(+)-イソフラキシネロン（(+)-isofraxinellone）又は(-)-フラキシネロン（(-)-fraxinellone）誘導体をアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）により生物変換したところ、(+)-イソフラキシネロン又は(-)-フラキシネロン誘導体がヒドロキシル化された新規化合物を得られることを見出した。さらに、これらの新規化合物は、害虫摂食抑制剤を有することを見出した。本発明は、更に検討を加えて完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は以下の化合物、及び該化合物を含む害虫摂食抑制剤を提供する。
項１． 一般式（Ａ）：
【００１２】
【化３】
【００１３】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物。
項２. 一般式（Ａ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する項１に記載の化合物。
項３. 一般式（Ａ−１）：
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式中、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する］
で表される化合物。
項４. 項１〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
項５. 害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である項４に記載の害虫摂食抑制剤。
項６. 一般式（Ａ）：
【００１６】
【化５】
【００１７】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｂ）
【００１８】
【化６】
【００１９】
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
項７． 一般式（Ｃ）：
【００２０】
【化７】
【００２１】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
項８． 一般式（Ｃ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する請求項７に記載の化合物。
項９． 一般式（Ｃ−１）：
【００２２】
【化８】
【００２３】
［式中、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
項１０． 項７〜９のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
項１１． 害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である項８に記載の害虫摂食抑制剤。
項１２． 一般式（Ｃ）：
【００２４】
【化９】
【００２５】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｄ）
【００２６】
【化１０】
【００２７】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
項１３． 項１〜３及び項７〜９のいずれかに記載の化合物を含有する組成物。
項１４． 項１３に記載の組成物を害虫に適用することを特徴とする害虫防除方法。
項１５． 一般式（Ｂ）
【００２８】
【化１１】
【００２９】
及び一般式（Ｄ）
【００３０】
【化１２】
【００３１】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含む害虫摂食抑制剤であって、害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である害虫摂食抑制剤。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の一般式（Ａ）及び（Ｃ）で表される化合物は新規であり、高い害虫摂食抑制活性を有しているため、害虫摂食抑制剤として有用である。また、本発明の一般式（Ｂ）及び（Ｄ）で表される化合物も高い害虫摂食抑制活性を有しているため、害虫摂食抑制剤として有用である。特に、本発明の化合物は、ヨトウムシに対して優れた害虫摂食抑制活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の化合物
本発明の第一の化合物は、下記一般式（Ａ）で表される化合物（以下、化合物（Ａ）ということがある）である。
【００３４】
【化１３】
【００３５】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する）
一般式（Ａ）において、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することがさらに好ましく、６位の炭素に１つ結合することが特に好ましい。
【００３６】
化合物（Ａ）の中でも、下記一般式（Ａ−１）で表される化合物（以下、化合物（Ａ−１）ということがある）が好ましい。
【００３７】
【化１４】
【００３８】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する。）
一般式（Ａ−１）において、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することがさらに好ましく、６位の炭素に１つ結合することが特に好ましい。
【００３９】
また、化合物（Ａ）の中でも、下記一般式（3-1）((+)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-エポキシ-フラキシネロン((+)-(6R)-6-hydroxy-7,7a-epoxy-fraxinellone))の絶対配置で表される化合物（以下、化合物（3-1）ということがある）が特に好ましい。
【００４０】
【化１５】
【００４１】
本発明の第二の化合物は、下記一般式（Ｃ）で表される化合物（以下、化合物（Ｃ）ということがある）である。
【００４２】
【化１６】
【００４３】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。）
一般式（Ｃ）において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である場合、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましい。
【００４４】
一般式（Ｃ）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である場合、ＯＨ基は４位又は５位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位の炭素に１つ結合することが好ましい。
【００４５】
化合物（Ｃ）の中でも、下記一般式（Ｃ−１）で表される化合物（以下、化合物（Ｃ−１）ということがある）が好ましい。
【００４６】
【化１７】
【００４７】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。）
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である場合、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましい。
【００４８】
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である場合、ＯＨ基は４位又は５位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位の炭素に１つ結合することが好ましい。
【００４９】
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である化合物の中でも、下記一般式(1-1)((+)-(4S)-4-ヒドロキシイソフラキシネロン）((+)-(4S)-4-hydroxyisofraxinellone))の絶対配置で表される化合物（以下、化合物（1-1）ということがある）が特に好ましい。
【００５０】
【化１８】
【００５１】
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である化合物の中でも下記一般式(2-1)、(2-2)及び(2-3)の絶対配置で表される化合物（以下、それぞれ化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)ということがある）が好ましい。
【００５２】
【化１９】
【００５３】
本発明の製造方法
本発明の一般式（Ａ）で表される化合物は、下式に示すスキームにより得られる。
【００５４】
【化２０】
【００５５】
（式（Ａ）中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する。）
一般式（Ｅ）で表される化合物（以下、化合物（Ｅ）ということがある）は、非特許文献１〜４に記載の方法に準じた方法により得られる。また、化合物（Ｅ）の中でも、(-)-フラキシネロンは、非特許文献１〜４に記載の通り、和漢生薬白鮮皮より得られる。
【００５６】
一般式（Ｂ）で表される化合物（以下、化合物（Ｂ）ということがある）は、例えば、従来公知の方法によって、化合物（Ｅ）をエポキシ化反応することにより得られる。化合物（Ｂ）の中でも、下記一般式（3）(化合物（3）)で表される化合物は、例えば、(-)-フラキシネロンをエポキシ化反応することにより得られる（実施例２）。
【００５７】
【化２１】
【００５８】
当該エポキシ化反応に使用されるエポキシ化反応の条件は、特に限定されず、従来公知の方法を採用すればよい。例えば、アルカリ条件下で、過酸化水素水、t-ブチルヒドロペルオキシド等を使用して分子内の二重結合をエポキシ化する。エポキシ化反応に使用される溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。反応温度は、通常、0℃〜室温程度とすればよく、反応時間は、通常、１０分〜２４時間程度である。必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することができる。
【００５９】
本発明の化合物（Ａ）は、化合物（Ｂ）を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。例えば、本発明の化合物(3-1)は、化合物（3）を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。
【００６０】
また、 本発明の一般式（Ｃ）で表される化合物（以下、化合物（Ｃ）ということがある）は、下式に示すように、化合物（Ｄ）で表される化合物を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。
【００６１】
【化２２】
【００６２】
（式（Ｃ）中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。）
一般式（Ｄ）で表される化合物（以下、化合物（Ｄ）ということがある）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である化合物は、非特許文献５に記載の方法に準じて得られる。化合物（Ｄ）の中でも、化合物（1）((+)-イソフラキシネロン)は、ミカン科（Rutaceae）のハクセン（Dictamnus dasycarpus）の根皮を乾燥した和漢生薬白鮮皮より得られる分解型リモノイドであり、非特許文献５に記載の方法により抽出できる。
【００６３】
一般式（Ｄ）で表される化合物において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である化合物は、例えば、化合物（Ｄ）において６位と７位との炭素結合が二重結合である化合物を水素付加反応することによって得られる。また、上記一般式（Ｅ）で表される化合物の７位と７ａ位の二重結合を水素付加反応することによっても得られる。例えば、化合物(2)は、(-)-フラキシネロンを水素付加反応することにより得られる（実施例１）。
【００６４】
水素付加反応は、従来公知の方法により行えばよい。水素付加反応に使用される試薬は、従来公知の試薬を使用すればよいが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム等を使用すればよい。必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することができる。
【００６５】
本発明の化合物（Ｃ）の中でも、化合物（1-1）は、(+)-イソフラキシネロン（化合物(1)）を生物変換することによりヒドロキシル化して得られる。
【００６６】
また、本発明の化合物（Ｃ）の中でも、化合物(2-1)（(-)-(4S)-4-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）、(2-2)（(-)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）及び(2-3)（(-)-(6S)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）は、下記一般式（2）で表される化合物((-)-7,7a-ジヒドロフラキシネロン)（以下、化合物(２)ということがある）を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。
【００６７】
【化２３】
【００６８】
本発明の生物変換においては、黒麹菌であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を用いる。
【００６９】
具体的には、培養されたアスペルギルス・ニガーを培地に移植し、基質（反応出発物質）を培地に加え、通常１〜１１日間程度、好ましくは１〜１５日間程度放置し、アスペルギルス・ニガー及び培地を抽出することにより、一般式（Ａ）及び（Ｃ）で表される化合物（代謝物）が得られる。温度条件は、通常0〜25℃程度とすればよい。使用する培地は、特に限定されないが、例えば、万能培地（Czapek pepton培地）、寒天培地、ＬＢ培地等が挙げられ、これらの中でも、万能培地が好ましい。培養は、酸素の存在下で行うのが好ましい。必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することができる。具体的には実施例を参照。
【００７０】
一般式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）で表される本発明の化合物は、害虫摂食阻害活性を有している。
【００７１】
本発明の化合物が示す害虫摂食阻害活性とは、害虫の餌となる植物等に付着していると、害虫が餌を食べられなくなる活性をいう。
【００７２】
本発明の化合物が有効に摂食阻害できる対象害虫としては、例えば、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類等に属する昆虫が挙げられる。本発明による摂食阻害は、特に鱗翅目に属する昆虫に対して有効であり、例えば、テンスジツトガ、ツトガ、シバツトガ、ロブノメイガ、ワモンノメイガ、アワノメイガ、アカフツヅリガ等のメイガ科； スゲドクガ等のドクガ科； オビヒトリ、キハラゴマダラヒトリ、シロヒトリ等のヒトリガ科； イネキンウワバ、ヨトウムシ（例えば、エゾチャイロヨトウ、シロシタヨトウ、フタオビキヨトウ、タンポキヨトウ、クサシロキヨトウ、イネヨトウ、スジギリヨトウ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウ、ヨトウガ、アワヨトウ等）等のヤガ科に属する昆虫に対して有効である。これらの中でもヨトウムシに対して特に有効である。対象害虫は、成虫及び幼虫のいずれでも良いが、特に幼虫が好ましい。
【００７３】
本発明の化合物が有効に摂食阻害できる対象植物は、特に限定されないが、例えば、キャベツ、サツマイモ、サトイモ、ネギ、トマト、ピーマン、ナス、レタス、ハクサイ等が挙げられる。
【００７４】
本発明の化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は優れた害虫阻害活性を有している。これらの中でも、化合物（1）、（2）、（3）、(1-1)、(2-1)、(2-2)、(2-3)及び(3-1)は、特に優れた害虫阻害剤活性を有している。
【００７５】
本発明の害虫摂食阻害剤
本発明の害虫摂食阻害剤は、本発明の化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含む。
【００７６】
本発明の化合物は、直接植物の葉、実、茎等に散布、塗布等することにより、そのままでも害虫摂食阻害剤として作用するが、通常は、ローション、エアゾ−ル等の液剤や、クリーム剤等の各種形態に製剤化した組成物として使用される。液剤としては、ローション、エアゾール、油剤等を挙げることができ、これらの液剤に用いられる担体としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、セチルアルコール等のアルコール類、石油ベンジン等の脂肪族炭化水素類、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸セチル等のエステル類があげられる。液剤の種類により、適宜さらに乳化剤、分散剤、展着剤、湿潤剤、懸濁化剤、保存剤、噴射剤等の製剤用補助剤、塗膜形成剤などを加え、所望の製剤とすることができる。
【００７７】
本発明の化合物は、通常用いられる製剤化方法により、害虫摂食阻害剤に製剤化することができる。すなわち、有効成分以外に必要な補助剤を含むことができる。製剤の形態としては、乳剤、水和剤、粉剤、エアロゾルなどを挙げることができる。好ましくは、水和剤である。本発明の害虫摂食阻害剤は、一般に散布によって害虫に適用する。
【００７８】
乳化剤及び分散剤としては、例えば、石鹸類、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等のポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等のソルビタン脂肪酸エステル、高級アルコールの硫酸エステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ等のアルキルアリールスルホン酸塩が挙げられ、展着剤または湿潤剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７９】
また、懸濁化剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ベントナイトが挙げられ、保存剤としては、例えば、サリチル酸、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルが挙げられる。
【００８０】
噴射剤としては、例えば、ジメチルエーテル、クロロフルオロカーボン、炭酸ガス、ＬＰＧが挙げられ、塗膜形成剤としては、例えば、ニトロセルロース、アセチルセルロース、アセチルブチ ルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体、酢酸ビニル樹脂等のビニル系樹脂、ポリビニルアルコール、メチルポリシロキサン、オクチルメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンメチルポリシクロポリシロキサン、ジメチルシロキサン・メチル（ポリオキシエチレン）シロキサン共重合体、ジメチルシロキサン・メチル（ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン）シロキサン共重合体、トリメチルシロキシケイ酸、オクタメチルシクロテトラシロキサンシリコーンポリエーテルポリマー等のシリコーン類が挙げられる。
【００８１】
クリーム剤において用いられる担体としては、例えば、パラフィン、流動パラフィン、ワセリン等の炭化水素類、ジメチルシロキサン、コロイド状シリカ、ベントナイト等のケイ素化合物、エタノール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ラウリン酸、ステアリン酸等のカルボン酸類、蜜蝋、ラノリン等のエステル類等が挙げられる。さらに、液剤の製剤の際に用いられるのと同様の製剤用補助剤を適宜加えることにより目的の製剤とすることができる。
【００８２】
これら製剤中の本発明の化合物の含有量は、製剤形態や適用方法等により異なるが、例えば、液剤として使用する場合、通常０．０００１〜０．０５重量％、より好ましくは０．０００２〜０．００２重量％の割合で含まれる。また、その処理量は、通常植物の葉表面積１cm2 当り本発明の化合物の量で０．５〜２５０ μg、好ましくは１〜１００ μｇ相当量である。勿論、該処理量は、製剤形態や適用方法、対象とする害虫の種類や密度等により異なり、適宜上記の範囲にかかわることなく増加または減少させることもできる。
【００８３】
本発明の害虫防除方法
本発明の害虫防除方法は、植物体内又は植物体の表面もしくは周辺に存在する害虫に対して本発明の化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）からなる群から選ばれた少なくとも１種を適用することにより、上記害虫による該植物体の摂食を阻害する方法である。本発明の害虫防除方法には、本発明の化合物をそのまま適用しても良いが、本発明の化合物を含む上記組成物又は害虫摂食抑制剤を使用する。
【００８４】
次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００８５】
化合物(１)は、Miyazawa, M.; Shimamura, H.; Nakamura, S.; Kameoka, H. J. Agric, Food Chem. 1995, 43, 1428-1431.に記載の方法と同様の方法により、ミカン科（Rutaceae）のハクセン（Dictamnus dasycarpus）の根皮から抽出した。
【００８６】
実施例で使用した機器は、以下の通りである。
【００８７】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
炎イオン化検出器（flame ionization detecotor(FID)）を備えたヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)社製5890A gas chromatographを使用した。カラムは、溶融石英（DB-5, 30m length, 0.25mm i.d.）を使用した。クロマトグラフィーのコンディションは以下の通りである。
オーブン温度は１５０℃から３００℃に４℃／分で上昇するようにプログラムした。インジェクターと検出部の温度はそれぞれ２７０℃と２８０℃とした。スプリットインジェクションは19:1とした。ヘリウムガスのフローレートは、1.8 ml/minとした。
【００８８】
ＥＩ−ＭＳ
ＥＩ−ＭＳ測定は、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用した。ＧＣ−ＭＳは、キャピラリーカラム（DB-5MS, 30 m length, 0.25 mm i.d.）を備えたヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)社製5890A gas chromatograph−ヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)社製5972A gas chromatographを使用した。クロマトグラフィーの条件は、上記のDB-5と同じとした。イオン源の温度は、230℃とし、電子エネルギーは70 eVとした。
【００８９】
赤外線吸収スペクトル（ＩＲスペクトル）
ＩＲスペクトル測定は、日本分光株式会社製のJASCO FT/IR-470 plus fourier transform infrared spectrometerを使用した。
【００９０】
ＮＭＲスペクトル
ＮＭＲスペクトル測定は、JEOL FX-500 (500.00 MHz, 1H; 125.65 MHz, 13C)spectrometerを使用した。CDCl3中のテトラメチルシラン(TMS)を標準物質として使用した。多重度は、DEPT pulse sequenceにより決定した。
【００９１】
比旋光度
比旋光度の測定は、日本分光株式会社製のJASCO DIP-1000 digital polarimeterを使用した。
【００９２】
実施例１（化合物(2)の合成）
化合物(２)は、(-)-フラキシネロンを以下の手順により還元して得た。(-)-フラキシネロン１００ｍｇを１００％エタノール１０ｍｌ中に溶かし、６０ｍｇのNaBH4を加えた。室温下に２４時間攪拌下反応させた後、エバポレーターによりエタノールを留去し、得られた残渣に２５ｍｌの水を加えた。得られた混合物を３０ｍｌのCHCl3で４回で抽出した。得られたCHCl3溶液を中性になるまで水で洗浄し、エバポレーションを行い、明るい黄色のオイルを得た。得られたオイルをシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒は、ヘキサン／酢酸エチルを９：１〜７：３に変化させた）で精製して、化合物(2)（５２．４ｍｇ）を得た。化合物(2)が主生成物であり、収率は５２％であった。化合物(2)の構造は、Weimin, Z.; Jean, L. W.; Kurt, H.; Rensheng, X.; Guowei, Q. Phytochemistry. 1998, 47, 7-11.に記載のスペクトルデータと比較して、(-)-7,7a-ジヒドロフラキシネロン（(-)-7,7a-Dihydrofraxinellone）と決定された。
【００９３】
実施例２（化合物(3)の合成）
化合物(3)は、(-)-フラキシネロンを以下の手順によりエポキシ化して得た。フラキシネロン５０ｍｇをメタノール１ｍｌに溶解し、過酸化水素水（３０％）６０μｌ及び6N水酸化ナトリウム水溶液２０μｌを加えた。室温下に２４時間攪拌下反応させた後、反応混合液に1N塩酸を加えてpH2に調整し、得られた混合液を１０ｍｌの水中に加えた。得られた混合液をジエチルエーテル１０ｍｌで４回抽出した。得られたエーテル溶液をエバポレーターで乾燥させると、無色の針状結晶が得られた。得られた結晶をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒は、ヘキサン／酢酸エチルを９：１〜７：３に変化させた）で精製して、化合物(3)（５１ｍｇ）を得た。化合物(3)が主生成物であり、収率は９５％（１００％ｅｅ）であった。化合物(3)の構造は、Maique, W. B.; Paulo, C. V. M.; Fatima, G. F. D. S.; Joao, B. F.; Sergio, A. Z. Naturforsch. 2001, 56c, 570-574.に記載のスペクトルデータと比較して、(-)-7,7a-エポキシ-フラキシネロン（(-)-7,7a-epoxy-fraxinellone）と決定された。
【００９４】
実施例３（生物変換の手順）
アスペルギルス・ニガー（A.niger）による生物変換は、以下の手順により行った。万能培地（Czapek pepton培地）を用いて培養されたA. nigerを培養器中に２日間保持した（２８℃攪拌下）。菌体（A.niger）を、万能培地(Czapek pepton培地)（５０ｍｌのペトリディッシュに２０ｍｌ）に移植し、２８℃静止下で培養した。１日後、成熟した生物体及び反応出発物質である各基質（０．４ｍｇ／ｍｌ）を培地に加え、生物体を4日〜12日培養した。ペトリディッシュ中の培地に1N塩酸を加えpH2に調整し、ジエチルエーテルで抽出し、エーテル層をエバポレーションした。得られた抽出物は、TLC、GC及びGC-MSで分析した。基質及び代謝生成物の比は、ガスクロマトグラフィーのピークエリアに基づき決定した。
【００９５】
実施例４（化合物(1-1)の単離）
化合物(1)（90 mg）を実施例３の手順による生物変換の後、万能培地(Czapek pepton培地)と菌体をフィルターで分離した。培地に1N塩酸を加えてpH2に調整し、NaClで飽和し、ジエチルエーテルで抽出した。菌体もジエチルエーテルで抽出した。そして、両抽出物を混合した。この抽出物をジエチルエーテルと共に分液漏斗に入れて、水相とジエチルエーテル相とに分離した。ジエチルエーテル相を、Na2SO4で乾燥し、エバポレーターにかけ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1：1）で溶出液を分割した。化合物(１)（48.6 mg）と代謝物である化合物(1-1)（31.4 mg）を分割したヘキサン／酢酸エチル溶出液から単離した。
【００９６】
化合物(1-1)（(+)-(4S)-4-ヒドロキシイソフラキシネロン）: オイル; [α]25D -73.0o (c 0.19, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 248([M]+,6), 230(30), 203(5), 160(15), 145(27), 107(100), 95(41); IR(film, νmaxcm-1); 3442(OH), 1755(γ-lactone). 1H, 13C NMR (表１及び２)。
【００９７】
実施例５（化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)の単離）
化合物(2)(100 mg)を実施例４と同様の操作により、化合物(2)（53.0 mg）と代謝物である化合物(2-1)（23.2mg）、化合物(2-2)（17.8mg）及び化合物(2-3)（6.0mg）を分割したヘキサン／酢酸エチル溶出液から単離した。
【００９８】
化合物(2-1)（(-)-(4S)-4-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）: 黄色オイル; [α]25D-20.1o (c 0.40, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 250([M]+,25), 222(3), 204(3), 126(100), 108(91), 95(47), 84(64), 69(36); IR(film, νmaxcm-1); 3477(OH), 1765(γ-lactone). 1H, 13C NMR(表１及び２)。
【００９９】
化合物(2-2)（(-)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）:黄色オイル; [α]25D-45.5o (c 0.34, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 250([M]+,10), 204(4), 126(10), 108(100), 93(26), 82(73), 67(28); IR(film, νmaxcm-1); 3485(OH), 1766(γ-lactone). 1H, 13C NMR(表１及び２)。
【０１００】
化合物(2-3)（(-)-(6S)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）: 黄色オイル; [α]25D-25.0o (c 0.22, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 250([M]+,11), 204(30), 154(10), 124(16), 109(67), 95(37), 82(100), 67(41); IR(film, νmaxcm-1); 3423(OH), 1766(γ-lactone). 1H, 13C NMR (表１及び２)。
【０１０１】
実施例６（化合物(3-1)の単離）
化合物(3)（90 mg）を同様の操作により、化合物(3)（31.5 mg）と代謝物である化合物(3-1)（18.5 mg）を分割したヘキサン／酢酸エチル溶出液から単離した。
【０１０２】
化合物(3-1)((+)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-エポキシ-フラキシネロン): 無色針状結晶; [α]25D+ 1.0o (c 1.00, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 264([M]+,13), 140(29), 124(31), 96(100), 77(15), 43(32); IR(film, νmaxcm-1); 3273(OH), 1780(γ-lactone). 1H, 13C NMR (表１及び２)。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
実施例７（害虫摂食阻害作用の評価方法）
日産化学工業（株）より入手したハスモンヨトウ（Spodoptera litura）を使用した。ハスモンヨトウの幼虫をナイロンメッシュスクリーンでカバーしたプラスチックケース（幅200 mm×300 mm, 高さ100 mm, １容器当たり幼虫100個）内で飼育した。飼育環境は、２５℃下、相対湿度７０％、光周期：１６時間を明、８時間を暗とした。市販食餌（Insecta LFS; 日本農産工業株式会社）を初齢の幼虫に与えた。実験方法は、Mallavadhani, U. V.; Mahapatra, A.; Raja, S. S.; Manjula, C. J. Agric, Food Chem. 2003, 51, 1952-1955、 Morimoto, M.; Kumeda, S.; Komai, K. J. Agric, Food Chem. 2000, 48, 1888-1891及びKumari, G. N. K.; Balachandran, J.; Aravind, S.; Ganesh, M. R. J. Agric, Food Chem. 2003, 51, 1555-1559に記載の方法に基づき行った。穿孔器を用いて直径２ｃｍのリーフディスクを生のキャベツ（Brassica oleracea）の葉から準備した。２枚のディスクをアセトン溶液中の試験物質で処理し、他の２枚のディスクはコントロールとしてアセトンで処理した。４枚のディスクは同じペトリディッシュ内に交互に置いた。溶媒を完全に除去した後、１０個の幼虫（三齢）を２５℃、暗闇下、３〜５時間ペトリディッシュ内に置いた。モノトーンデータ変換のため、部分的に摂食されたリーフディスクをコピー用紙上にテープで貼り付けた。モノトーンデータをコピーし、エラーがないことを確認して、デジタルスキャナーを使用してデジタルデータに変換した。デジタルデータの分析は、public-domain NIH Image program (米国国立衛生研究所（U.S. National Institutes of Health）開発によってされ、インターネットを介しzippy, nimh, nih, govで匿名FTPで利用可能、又はthe National Technical Information Serice, Springfiled, Virginia, part number PB95-500195GEIによりフロッピー（登録商標）ディスクにより利用可能である)をマッキントッシュコンピューターを使用して行った。
【０１０６】
それぞれの実験は、摂食されていないディスクのデータファイルを測定し、処理されたディスクのものと比較して行った。摂食阻害活性パーセンテージ（％）の評価は、下式を用いて計算した。
【０１０７】
摂食阻害活性パーセンテージ（％）＝１００−（試験物質で処理されたディスクの摂食された部分（％）／コントロールディスクの摂食された部分（％））×１０
試験物質として、化合物(1)、(2)、(3)、(1-1)、(2-1)、(2-2)、(2-3)、及び(3-1)を、葉面積当たり、それぞれ25、10及び5 μg/cm2使用して評価した。また、各試験物質について、ED50(μg/cm2)も測定した。
以上の結果を表３に示す。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
この結果から、化合物(1)、(2)、(3)、(1-1)、(2-1)、(2-2)、(2-3)、及び(3-1)はいずれも害虫摂食阻害活性が高いことがわかる。化合物(3-1)の害虫摂食阻害活性が最も高いと考えられる。
【０１１０】
実施例８（化合物(１)の生物変換）
アスペルギルス・ニガーによる化合物(１)の生物変換の経時変化を調査するために、アスペルギルス・ニガーと共に少量の化合物(１)を９日間培養した。得られた代謝物は、ＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳスペクトル分析で確認した。化合物(1)から(1-1)への変換の経時変化は、ＴＬＣ及びＧＣ（ガスクロマトグラフィー）による定量測定によってモニターした。結果を図１に示す。9日後、出発基質である化合物(１)がca35 %変換されたことがわかる。
【０１１１】
得られた代謝物を単離するために、アスペルギルス・ニガーを用いて大スケールで９日間培養した（実施例３の手順）。生物変換の後、実施例４に記載の通り、培地を抽出し、抽出液から代謝物である化合物(1-1)を得た。スペクトルデータから、化合物(1-1)の構造を確認した（実施例９）。
【０１１２】
実施例９（化合物(1-1)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(1-1)の分子式はC14H16O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3442 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(1-1)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−４位のメチレン基の消失以外は、化合物(1)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.46 ppm)が、H-4’(6.32 ppm)とH-2’(7.42 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.6 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１１３】
COSYスペクトルは、H-4 (3.85 ppm)とδ2.37 及びδ2.12 (それぞれHα-5 及び Hβ-5,)並びにH-6 (5.48 ppm)とδ 2.37及びδ1.97 (それぞれHα-5及びH-8) に相関クロスピークが観測された。
【０１１４】
プロトンＮＭＲスペクトルは、２つのメチル基がδ 1.97及びδ 0.88 (それぞれH-8 及び H-9)に観測され、２つのメチン基がδ5.56及びδ2.86 (それぞれH-3及びH-7a)に観測された。
【０１１５】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(68.1 ppm; C-4)と１つのメチル基(0.88 ppm; H-9)及び２つのメチン基（δ5.56及びδ2.86 (それぞれH-3及びH-7a)）とに観測された。
【０１１６】
NOE差スペクトルは、H-4 (3.85 ppm)と１つのメチン基（δ 5.56 ppm (H-3)）及びH-7a (2.86 ppm)と１つのメチル基（0.88 ppm (H-9)）との間にNOEを観測した。
【０１１７】
従って、化合物(1-1)は、化合物(1)のC-4位をヒドロキシル化して得られるものである。C-4位の第２級アルコールの絶対配置を確認するため、Kusumi, T.; Fujita, Y.; Ohtani, I.; Kakisawa, H. Tetrahedron Letters. 1991, 32, 2923-2926に記載の手法に従い、化合物(1-1)を(S)-及び(R)-MTPAエステルに変換した。改良モッシャー法（Mosher's method）により、C-4位はS-配置を有することが確認された。以上の結果から、化合物(1-1)の構造が(-)-(4S)-4-ヒドロキシイソフラキシネロンであると確認された。
【０１１８】
実施例10（化合物(2)の生物変換）
アスペルギルス・ニガーによる化合物(2)の生物変換の経時変化を調査するために、アスペルギルス・ニガーと共に少量の化合物(2)を１１日間培養した。得られた代謝物は、ＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳスペクトル分析で確認した。化合物(2)から(2-1)、(2-2)及び(2-3)への変換の経時変化は、ＴＬＣ及びＧＣ（ガスクロマトグラフィー）による定量測定によってモニターした。結果を図１に示す。１１日後、出発基質である化合物(2)がca53 %変換された。代謝物である化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)は、１１日後にはそれぞれca23 % 、ca18 % 及びca6 %であった。
【０１１９】
これらの代謝物を単離するために、アスペルギルス・ニガーを用いて大スケールで１１日間培養した（実施例３の手順）。生物変換の後、実施例５に記載の通り、培地を抽出し、抽出液から代謝物である化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)を得た。スペクトルデータから、化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)の構造を確認した（実施例11）。
【０１２０】
実施例11（化合物(2-1)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(2-1)の分子式はC14H18O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3477 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(2-1)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−４位のメチレン基の消失以外は、化合物(2)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.43 ppm)が、H-4’(6.30 ppm)とH-2’(7.39 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.7 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１２１】
COSYスペクトルは、H-4 (3.68 ppm)とδ 1.81、δ 1.77、δ 1.64及びδ 1.54 (それぞれH-5β、H-7、H-6α及びH-5α)に相関クロスピークが観測された。
【０１２２】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.32及びδ 0.92 (それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 5.56、δ 2.50及びδ 1.77(それぞれH-3、H-7a及びH-7)に観測された。
【０１２３】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(71.9 ppm; C-4)と１つのメチル基(0.92 ppm; H-9)及び２つのメチン基（δ 5.40及びδ 2.50(それぞれH-3及びH-7a)）とに観測された。従って、化合物(2-1)は、化合物(2)のC-4位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１２４】
NOE差スペクトルにおいて、H-4とH-3との間にNOEが観測されることから、OH基の立体化学はα配置と確認した。
【０１２５】
以上の結果から、化合物(2-1)の構造が(-)-(4S)-4-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロンであると確認された。
【０１２６】
実施例12（化合物(2-2)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(2-2)の分子式はC14H18O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3485 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(2-2)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−6位のメチレン基の消失以外は、化合物(2)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.44 ppm)が、H-4’(6.28 ppm)とH-2’(7.38 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.6 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１２７】
COSYスペクトルは、H-6 (3.50 ppm)とδ 1.92、δ 1.74及びδ 1.51 (それぞれH-5β、H-7及びH-5α)に相関クロスピークが観測された。
【０１２８】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.43及びδ 1.00(それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 4.92、δ 2.52及びδ 1.74(それぞれH-3、H-7a及びH-7)に観測された。
【０１２９】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(72.0 ppm; C-6)と１つのメチル基(1.43 ppm; H-8)及び１つのメチン基（δ 2.52(H-7a)）とに観測された。従って、化合物(2-2)は、化合物(2)のC-6位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１３０】
H-7aに照射すると、H-9の面積強度が強調されることから、C-7aの立体化学はNOE差によりα配置と決定した。
【０１３１】
C-7メチンプロトンのアキシアル（α）配置及びC-6メチンプロトンのアキシアル（β）配置は、1H NMRスペクトルにおけるH-7a、H-8及びH-6シグナルから観測されるH-7シグナルのスプリッティングパターン(H-7; ddq, J= 4.8, 7.0, 10.7 Hz)により判断した。
【０１３２】
以上の結果から、化合物(2-2)の構造が(-)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロンであると確認された。
【０１３３】
実施例13（化合物(2-3)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(2-3)の分子式はC14H18O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3423 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(2-3)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−6位のメチレン基の消失以外は、化合物(2)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.43 ppm)が、H-4’(6.28 ppm)とH-2’(7.38 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.6 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１３４】
COSYスペクトルは、H-6 (3.88 ppm)とδ 1.94、δ1.90及びδ1.61 (それぞれH-7、Hβ-5及びHα-5)に相関クロスピークが観測された。
【０１３５】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.46及びδ 0.96(それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 4.99、δ 2.31及びδ 1.94(それぞれH-3、H-7a及びH-7)に観測された。
【０１３６】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(69.6 ppm; C-6)と１つのメチル基(1.46 ppm; H-8)及び１つのメチン基（δ 2.31(H-7a)）とに観測された。従って、化合物(2-3)は、化合物(2)のC-6位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１３７】
H-7aに照射すると、H-9の面積強度が強調されることから、C-7aの立体化学はNOE差によりα配置と決定した。
【０１３８】
C-7メチンプロトンのアキシアル（α）配置及びC-6メチンプロトンのエカトリアル（α）配置は、1H NMRスペクトルにおけるH-5α、H-6、H-7a及びH-8シグナルから観測されるH-7シグナルのスプリッティングパターン(H-7; dddq, J= 2.2, 2.2, 5.2, 7.4 Hz)により判断した。
【０１３９】
以上の結果から、化合物(2-3)の構造が(-)-(6S)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロンであると確認された。
【０１４０】
実施例14（化合物(3)の生物変換）
アスペルギルス・ニガーによる化合物(3)の生物変換の経時変化を調査するために、アスペルギルス・ニガーと共に少量の化合物(3)を１１日間培養した。得られた代謝物は、ＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳスペクトル分析で確認した。化合物(3)から(3-1)への変換の経時変化は、ＴＬＣ及びＧＣ（ガスクロマトグラフィー）による定量測定によってモニターした。結果を図１に示す。１１日後、出発基質である化合物(3)がca37 %変換されたことがわかる。
【０１４１】
これらの代謝物を単離するために、アスペルギルス・ニガーを用いて大スケールで１１日間培養した（実施例３の手順）。生物変換の後、実施例6に記載の通り、培地を抽出し、抽出液から代謝物である化合物(3-1)を得た。スペクトルデータから、化合物(3-1)の構造を確認した（実施例１５）。
【０１４２】
実施例15（化合物(3-1)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(3-1)の分子式はC14H16O5と確認された。ＩＲスペクトルより、3273 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（+）を示した。化合物(3-1)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−6位のメチレン基の消失以外は、化合物(3)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.47 ppm)が、H-4’(6.33 ppm)とH-2’(7.48 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.7 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１４３】
COSYスペクトルは、H-6 (3.91 ppm)とδ 1.83、δ 1.59、δ 1.51及びδ 1.51 (それぞれHα-5、Hα-4、Hβ-5及びHβ-4)に相関クロスピークが観測された。
【０１４４】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.68及びδ 0.93(それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 5.19 (H-3)に観測された。
【０１４５】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(72.1 ppm; C-6)と１つのメチル基(1.68 ppm; H-8)及び２つのメチレン基（δ 1.83、δ 1.59、δ 1.51及びδ 1.51(それぞれHα-5、Hα-4、Hβ-5及びHβ-4)）とに観測された。従って、化合物(3-1)は、化合物(3)のC-6位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１４６】
C-6位の第２級アルコールの絶対配置を確認するため、上述のKusumi, T.; Fujita, Y.; Ohtani, I.; Kakisawa, H. Tetrahedron Letters. 1991, 32, 2923-2926に記載の手法に従い、化合物(3-1)を(S)-及び(R)-MTPAエステル誘導体に変換した。
【０１４７】
化合物(3-1)の(S)-及び(R)-MTPAエステル誘導体は、Me-8に対してnegative Δδ（=δR-δS）values(- 0.15)及び Hα-5、Hβ-5及びH-4に対してそれぞれpositive values（H-5α(+ 0.11)、H-5β(+ 0.11)及びH-4(+ 0.03)）を与えた。以上の改良モッシャー法（Mosher's method）により、C-6位はR-配置を有することが確認された。
【０１４８】
NOE差による化合物(3-1)の絶対配置の確認は、シグナルがオーバーラップしたことと、それぞれの水素に照射することの困難性により、行うことができなかった。
【０１４９】
以上の結果から、化合物(3-1)の構造が(+)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-エポキシ-フラキシネロンであると確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】アスペルギルス・ニガーによる化合物(1)、(2)及び(3)の生物変換の経時変化を示す図である
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規分解型リモノイド化合物、該化合物の製造方法、該化合物を有効成分として含有する害虫摂食阻害剤、該化合物を含有する組成物及び該組成物を害虫に適用する害虫防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミカン科の植物に含まれるリモノイドには、種々の分解型リモノイドが知られている。これらは、リモノイドと共通する部分構造を有しており、リモノイドよりも小さく単純な化合物である。このような分解型リモノイドに属し、Rutaceae(ミカン科)から得られる(-)-フラキシネロン（(-)-fraxinellone））は、様々な生物活性を有することが報告されている（非特許文献１〜４）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
本発明者らは、(+)-イソフラキシネロン（(+)-isofraxinellone）の抗変異原活性（antimutagenic activites）について、既に報告している（非特許文献５）。また、Liuらは、(-)-フラキシネロンが、コクゾウムシ(Sitophilus zeamais)の成虫と同様、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）の成虫及び幼虫に対しても摂食阻害活性を有することを報告している（非特許文献６）。さらにMaiqueらは、下記一般式３
【０００５】
【化２】
【０００６】
で表される化合物（以下、化合物(３)ということがある）が、Trypaosoma cruziのトリポマスティゴート型原虫に対して、弱い摂食阻害活性を有することを報告している（非特許文献７）。
【０００７】
生物変換は、生体中に存在する酵素を生体触媒として使用する簡易な手法であり、不活性な天然物から生理活性を有する医薬又は農薬化合物を製造するために用いられる。該手法の製造条件は温和であり、多くの場合、官能基の保護を必要としない。さらに、生物変換の特徴は、位置及び立体選択的反応であり、光学活性な生成物を与えることである。生物変換によって、天然物から生理活性物質を得る方法として、本発明者らは、フラボノイド（非特許文献８及び９）、テルペノイド（非特許文献１０及び１１）及びリグナン（非特許文献１０及び１１）の生物変換について報告している。
【０００８】
現在、過剰な農薬使用が問題視されているが、通常、無農薬で食害を防ぐことは困難であり、環境負荷の少ない害虫防除法が求められている。害虫に対して摂食阻害活性を有する化合物は、低分子でありながら極めて低濃度で生物活性を示すため、安全かつ選択的な害虫防除剤としての利用が期待され、実用化に向けた研究が活発になされている。害虫摂食阻害剤の摂食阻害活性が強ければ害虫は餓死するので、その物質の使用濃度において人体に無害であれば、害虫摂食阻害剤は農薬として使用される可能性もある。
【非特許文献１】Okamura, H.; Yamauchi, K.; Miyawaki, K.; Iwagawa, T.; Nakatani, M. Tetrahedron Letters. 1997, 38, 263-266.
【非特許文献２】Nakatani, M.; Huang, RC.; Okamura, H.; Iwagawa, T.; Tadera, K. Phytochemistry. 1998, 49, 1773-1776.
【非特許文献３】Yu, S. M.; Ko, F. N.; Su, M. J.; Wu, T. S.; Wang, M. L.; Huang, T. F.; Teng, C. M. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. 1992, 345, 349-355.
【非特許文献４】Woo, W. S.; Lee, E. B.; Kang, S. S.; Shin, K. H.; Chi, H. J. Planta Med. 1987, 53, 399-401.
【非特許文献５】Miyazawa, M.; Shimamura, H.; Nakamura, S.; Kameoka, H. J. Agric, Food Chem. 1995, 4, 1428-1431.
【非特許文献６】Liu, Z. L.; Xu, Y. J.; Wu, J.; Goh, S. H.; Ho, S. H. J. Agric, Food Chem. 2002, 50, 1447-1450.
【非特許文献７】Maique, W. B.; Paulo, C. V. M.; Fatima, G. F. D. S.; Joao, B. F.; Sergio, A. Z. Naturforsch. 2001, 56c, 570-574.
【非特許文献８】Miyazawa, M.; Takahashi, K.; Araki, H. J Chem Technol Biotechnol. 2006, 81, 674-678.
【非特許文献９】Okuno, Y.; Miyazawa, M. J Chem Technol Biotechnol. 2006, 81, 29-33.
【非特許文献１０】Miyazawa, M.; Miyamoto, Y. J Mol Catal B. 2004, 27, 83-89.
【非特許文献１１】Miyazawa, M.; Nankai, H.; Kameoka, H. Phytochemistry. 1996, 43, 105-109.
【非特許文献１２】Miyazawa, M.; Kasahara, H.; Kameoka, H. Phytochemistry. 1994, 35, 1191-1193.
【非特許文献１３】Miyazawa, M.; Kasahara, H.; Kameoka, H. Phytochemistry. 1993, 34, 1501-1507.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規分解型リモノイド化合物、該化合物の製造方法、該化合物を有効成分として含有する害虫摂食阻害剤、該化合物を含有する組成物及び該組成物を害虫に適用する害虫防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、(+)-イソフラキシネロン（(+)-isofraxinellone）又は(-)-フラキシネロン（(-)-fraxinellone）誘導体をアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）により生物変換したところ、(+)-イソフラキシネロン又は(-)-フラキシネロン誘導体がヒドロキシル化された新規化合物を得られることを見出した。さらに、これらの新規化合物は、害虫摂食抑制剤を有することを見出した。本発明は、更に検討を加えて完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は以下の化合物、及び該化合物を含む害虫摂食抑制剤を提供する。
項１． 一般式（Ａ）：
【００１２】
【化３】
【００１３】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物。
項２. 一般式（Ａ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する項１に記載の化合物。
項３. 一般式（Ａ−１）：
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式中、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する］
で表される化合物。
項４. 項１〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
項５. 害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である項４に記載の害虫摂食抑制剤。
項６. 一般式（Ａ）：
【００１６】
【化５】
【００１７】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｂ）
【００１８】
【化６】
【００１９】
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
項７． 一般式（Ｃ）：
【００２０】
【化７】
【００２１】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
項８． 一般式（Ｃ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する請求項７に記載の化合物。
項９． 一般式（Ｃ−１）：
【００２２】
【化８】
【００２３】
［式中、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
項１０． 項７〜９のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
項１１． 害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である項８に記載の害虫摂食抑制剤。
項１２． 一般式（Ｃ）：
【００２４】
【化９】
【００２５】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｄ）
【００２６】
【化１０】
【００２７】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
項１３． 項１〜３及び項７〜９のいずれかに記載の化合物を含有する組成物。
項１４． 項１３に記載の組成物を害虫に適用することを特徴とする害虫防除方法。
項１５． 一般式（Ｂ）
【００２８】
【化１１】
【００２９】
及び一般式（Ｄ）
【００３０】
【化１２】
【００３１】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含む害虫摂食抑制剤であって、害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である害虫摂食抑制剤。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の一般式（Ａ）及び（Ｃ）で表される化合物は新規であり、高い害虫摂食抑制活性を有しているため、害虫摂食抑制剤として有用である。また、本発明の一般式（Ｂ）及び（Ｄ）で表される化合物も高い害虫摂食抑制活性を有しているため、害虫摂食抑制剤として有用である。特に、本発明の化合物は、ヨトウムシに対して優れた害虫摂食抑制活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の化合物
本発明の第一の化合物は、下記一般式（Ａ）で表される化合物（以下、化合物（Ａ）ということがある）である。
【００３４】
【化１３】
【００３５】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する）
一般式（Ａ）において、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することがさらに好ましく、６位の炭素に１つ結合することが特に好ましい。
【００３６】
化合物（Ａ）の中でも、下記一般式（Ａ−１）で表される化合物（以下、化合物（Ａ−１）ということがある）が好ましい。
【００３７】
【化１４】
【００３８】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する。）
一般式（Ａ−１）において、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することがさらに好ましく、６位の炭素に１つ結合することが特に好ましい。
【００３９】
また、化合物（Ａ）の中でも、下記一般式（3-1）((+)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-エポキシ-フラキシネロン((+)-(6R)-6-hydroxy-7,7a-epoxy-fraxinellone))の絶対配置で表される化合物（以下、化合物（3-1）ということがある）が特に好ましい。
【００４０】
【化１５】
【００４１】
本発明の第二の化合物は、下記一般式（Ｃ）で表される化合物（以下、化合物（Ｃ）ということがある）である。
【００４２】
【化１６】
【００４３】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。）
一般式（Ｃ）において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である場合、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましい。
【００４４】
一般式（Ｃ）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である場合、ＯＨ基は４位又は５位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位の炭素に１つ結合することが好ましい。
【００４５】
化合物（Ｃ）の中でも、下記一般式（Ｃ−１）で表される化合物（以下、化合物（Ｃ−１）ということがある）が好ましい。
【００４６】
【化１７】
【００４７】
（式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。）
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である場合、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましい。
【００４８】
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である場合、ＯＨ基は４位又は５位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合することが好ましく、特に４位の炭素に１つ結合することが好ましい。
【００４９】
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である化合物の中でも、下記一般式(1-1)((+)-(4S)-4-ヒドロキシイソフラキシネロン）((+)-(4S)-4-hydroxyisofraxinellone))の絶対配置で表される化合物（以下、化合物（1-1）ということがある）が特に好ましい。
【００５０】
【化１８】
【００５１】
一般式（Ｃ−１）において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である化合物の中でも下記一般式(2-1)、(2-2)及び(2-3)の絶対配置で表される化合物（以下、それぞれ化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)ということがある）が好ましい。
【００５２】
【化１９】
【００５３】
本発明の製造方法
本発明の一般式（Ａ）で表される化合物は、下式に示すスキームにより得られる。
【００５４】
【化２０】
【００５５】
（式（Ａ）中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する。）
一般式（Ｅ）で表される化合物（以下、化合物（Ｅ）ということがある）は、非特許文献１〜４に記載の方法に準じた方法により得られる。また、化合物（Ｅ）の中でも、(-)-フラキシネロンは、非特許文献１〜４に記載の通り、和漢生薬白鮮皮より得られる。
【００５６】
一般式（Ｂ）で表される化合物（以下、化合物（Ｂ）ということがある）は、例えば、従来公知の方法によって、化合物（Ｅ）をエポキシ化反応することにより得られる。化合物（Ｂ）の中でも、下記一般式（3）(化合物（3）)で表される化合物は、例えば、(-)-フラキシネロンをエポキシ化反応することにより得られる（実施例２）。
【００５７】
【化２１】
【００５８】
当該エポキシ化反応に使用されるエポキシ化反応の条件は、特に限定されず、従来公知の方法を採用すればよい。例えば、アルカリ条件下で、過酸化水素水、t-ブチルヒドロペルオキシド等を使用して分子内の二重結合をエポキシ化する。エポキシ化反応に使用される溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。反応温度は、通常、0℃〜室温程度とすればよく、反応時間は、通常、１０分〜２４時間程度である。必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することができる。
【００５９】
本発明の化合物（Ａ）は、化合物（Ｂ）を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。例えば、本発明の化合物(3-1)は、化合物（3）を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。
【００６０】
また、 本発明の一般式（Ｃ）で表される化合物（以下、化合物（Ｃ）ということがある）は、下式に示すように、化合物（Ｄ）で表される化合物を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。
【００６１】
【化２２】
【００６２】
（式（Ｃ）中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。）
一般式（Ｄ）で表される化合物（以下、化合物（Ｄ）ということがある）において、６位と７位との炭素間結合が二重結合である化合物は、非特許文献５に記載の方法に準じて得られる。化合物（Ｄ）の中でも、化合物（1）((+)-イソフラキシネロン)は、ミカン科（Rutaceae）のハクセン（Dictamnus dasycarpus）の根皮を乾燥した和漢生薬白鮮皮より得られる分解型リモノイドであり、非特許文献５に記載の方法により抽出できる。
【００６３】
一般式（Ｄ）で表される化合物において、６位と７位との炭素間結合が一重結合である化合物は、例えば、化合物（Ｄ）において６位と７位との炭素結合が二重結合である化合物を水素付加反応することによって得られる。また、上記一般式（Ｅ）で表される化合物の７位と７ａ位の二重結合を水素付加反応することによっても得られる。例えば、化合物(2)は、(-)-フラキシネロンを水素付加反応することにより得られる（実施例１）。
【００６４】
水素付加反応は、従来公知の方法により行えばよい。水素付加反応に使用される試薬は、従来公知の試薬を使用すればよいが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム等を使用すればよい。必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することができる。
【００６５】
本発明の化合物（Ｃ）の中でも、化合物（1-1）は、(+)-イソフラキシネロン（化合物(1)）を生物変換することによりヒドロキシル化して得られる。
【００６６】
また、本発明の化合物（Ｃ）の中でも、化合物(2-1)（(-)-(4S)-4-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）、(2-2)（(-)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）及び(2-3)（(-)-(6S)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）は、下記一般式（2）で表される化合物((-)-7,7a-ジヒドロフラキシネロン)（以下、化合物(２)ということがある）を生物変換によりヒドロキシル化して得られる。
【００６７】
【化２３】
【００６８】
本発明の生物変換においては、黒麹菌であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を用いる。
【００６９】
具体的には、培養されたアスペルギルス・ニガーを培地に移植し、基質（反応出発物質）を培地に加え、通常１〜１１日間程度、好ましくは１〜１５日間程度放置し、アスペルギルス・ニガー及び培地を抽出することにより、一般式（Ａ）及び（Ｃ）で表される化合物（代謝物）が得られる。温度条件は、通常0〜25℃程度とすればよい。使用する培地は、特に限定されないが、例えば、万能培地（Czapek pepton培地）、寒天培地、ＬＢ培地等が挙げられ、これらの中でも、万能培地が好ましい。培養は、酸素の存在下で行うのが好ましい。必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することができる。具体的には実施例を参照。
【００７０】
一般式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）で表される本発明の化合物は、害虫摂食阻害活性を有している。
【００７１】
本発明の化合物が示す害虫摂食阻害活性とは、害虫の餌となる植物等に付着していると、害虫が餌を食べられなくなる活性をいう。
【００７２】
本発明の化合物が有効に摂食阻害できる対象害虫としては、例えば、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類等に属する昆虫が挙げられる。本発明による摂食阻害は、特に鱗翅目に属する昆虫に対して有効であり、例えば、テンスジツトガ、ツトガ、シバツトガ、ロブノメイガ、ワモンノメイガ、アワノメイガ、アカフツヅリガ等のメイガ科； スゲドクガ等のドクガ科； オビヒトリ、キハラゴマダラヒトリ、シロヒトリ等のヒトリガ科； イネキンウワバ、ヨトウムシ（例えば、エゾチャイロヨトウ、シロシタヨトウ、フタオビキヨトウ、タンポキヨトウ、クサシロキヨトウ、イネヨトウ、スジギリヨトウ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウ、ヨトウガ、アワヨトウ等）等のヤガ科に属する昆虫に対して有効である。これらの中でもヨトウムシに対して特に有効である。対象害虫は、成虫及び幼虫のいずれでも良いが、特に幼虫が好ましい。
【００７３】
本発明の化合物が有効に摂食阻害できる対象植物は、特に限定されないが、例えば、キャベツ、サツマイモ、サトイモ、ネギ、トマト、ピーマン、ナス、レタス、ハクサイ等が挙げられる。
【００７４】
本発明の化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は優れた害虫阻害活性を有している。これらの中でも、化合物（1）、（2）、（3）、(1-1)、(2-1)、(2-2)、(2-3)及び(3-1)は、特に優れた害虫阻害剤活性を有している。
【００７５】
本発明の害虫摂食阻害剤
本発明の害虫摂食阻害剤は、本発明の化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含む。
【００７６】
本発明の化合物は、直接植物の葉、実、茎等に散布、塗布等することにより、そのままでも害虫摂食阻害剤として作用するが、通常は、ローション、エアゾ−ル等の液剤や、クリーム剤等の各種形態に製剤化した組成物として使用される。液剤としては、ローション、エアゾール、油剤等を挙げることができ、これらの液剤に用いられる担体としては、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、セチルアルコール等のアルコール類、石油ベンジン等の脂肪族炭化水素類、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸セチル等のエステル類があげられる。液剤の種類により、適宜さらに乳化剤、分散剤、展着剤、湿潤剤、懸濁化剤、保存剤、噴射剤等の製剤用補助剤、塗膜形成剤などを加え、所望の製剤とすることができる。
【００７７】
本発明の化合物は、通常用いられる製剤化方法により、害虫摂食阻害剤に製剤化することができる。すなわち、有効成分以外に必要な補助剤を含むことができる。製剤の形態としては、乳剤、水和剤、粉剤、エアロゾルなどを挙げることができる。好ましくは、水和剤である。本発明の害虫摂食阻害剤は、一般に散布によって害虫に適用する。
【００７８】
乳化剤及び分散剤としては、例えば、石鹸類、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等のポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等のソルビタン脂肪酸エステル、高級アルコールの硫酸エステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ等のアルキルアリールスルホン酸塩が挙げられ、展着剤または湿潤剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７９】
また、懸濁化剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ベントナイトが挙げられ、保存剤としては、例えば、サリチル酸、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルが挙げられる。
【００８０】
噴射剤としては、例えば、ジメチルエーテル、クロロフルオロカーボン、炭酸ガス、ＬＰＧが挙げられ、塗膜形成剤としては、例えば、ニトロセルロース、アセチルセルロース、アセチルブチ ルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体、酢酸ビニル樹脂等のビニル系樹脂、ポリビニルアルコール、メチルポリシロキサン、オクチルメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンメチルポリシクロポリシロキサン、ジメチルシロキサン・メチル（ポリオキシエチレン）シロキサン共重合体、ジメチルシロキサン・メチル（ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン）シロキサン共重合体、トリメチルシロキシケイ酸、オクタメチルシクロテトラシロキサンシリコーンポリエーテルポリマー等のシリコーン類が挙げられる。
【００８１】
クリーム剤において用いられる担体としては、例えば、パラフィン、流動パラフィン、ワセリン等の炭化水素類、ジメチルシロキサン、コロイド状シリカ、ベントナイト等のケイ素化合物、エタノール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ラウリン酸、ステアリン酸等のカルボン酸類、蜜蝋、ラノリン等のエステル類等が挙げられる。さらに、液剤の製剤の際に用いられるのと同様の製剤用補助剤を適宜加えることにより目的の製剤とすることができる。
【００８２】
これら製剤中の本発明の化合物の含有量は、製剤形態や適用方法等により異なるが、例えば、液剤として使用する場合、通常０．０００１〜０．０５重量％、より好ましくは０．０００２〜０．００２重量％の割合で含まれる。また、その処理量は、通常植物の葉表面積１cm2 当り本発明の化合物の量で０．５〜２５０ μg、好ましくは１〜１００ μｇ相当量である。勿論、該処理量は、製剤形態や適用方法、対象とする害虫の種類や密度等により異なり、適宜上記の範囲にかかわることなく増加または減少させることもできる。
【００８３】
本発明の害虫防除方法
本発明の害虫防除方法は、植物体内又は植物体の表面もしくは周辺に存在する害虫に対して本発明の化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）からなる群から選ばれた少なくとも１種を適用することにより、上記害虫による該植物体の摂食を阻害する方法である。本発明の害虫防除方法には、本発明の化合物をそのまま適用しても良いが、本発明の化合物を含む上記組成物又は害虫摂食抑制剤を使用する。
【００８４】
次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００８５】
化合物(１)は、Miyazawa, M.; Shimamura, H.; Nakamura, S.; Kameoka, H. J. Agric, Food Chem. 1995, 43, 1428-1431.に記載の方法と同様の方法により、ミカン科（Rutaceae）のハクセン（Dictamnus dasycarpus）の根皮から抽出した。
【００８６】
実施例で使用した機器は、以下の通りである。
【００８７】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
炎イオン化検出器（flame ionization detecotor(FID)）を備えたヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)社製5890A gas chromatographを使用した。カラムは、溶融石英（DB-5, 30m length, 0.25mm i.d.）を使用した。クロマトグラフィーのコンディションは以下の通りである。
オーブン温度は１５０℃から３００℃に４℃／分で上昇するようにプログラムした。インジェクターと検出部の温度はそれぞれ２７０℃と２８０℃とした。スプリットインジェクションは19:1とした。ヘリウムガスのフローレートは、1.8 ml/minとした。
【００８８】
ＥＩ−ＭＳ
ＥＩ−ＭＳ測定は、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用した。ＧＣ−ＭＳは、キャピラリーカラム（DB-5MS, 30 m length, 0.25 mm i.d.）を備えたヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)社製5890A gas chromatograph−ヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)社製5972A gas chromatographを使用した。クロマトグラフィーの条件は、上記のDB-5と同じとした。イオン源の温度は、230℃とし、電子エネルギーは70 eVとした。
【００８９】
赤外線吸収スペクトル（ＩＲスペクトル）
ＩＲスペクトル測定は、日本分光株式会社製のJASCO FT/IR-470 plus fourier transform infrared spectrometerを使用した。
【００９０】
ＮＭＲスペクトル
ＮＭＲスペクトル測定は、JEOL FX-500 (500.00 MHz, 1H; 125.65 MHz, 13C)spectrometerを使用した。CDCl3中のテトラメチルシラン(TMS)を標準物質として使用した。多重度は、DEPT pulse sequenceにより決定した。
【００９１】
比旋光度
比旋光度の測定は、日本分光株式会社製のJASCO DIP-1000 digital polarimeterを使用した。
【００９２】
実施例１（化合物(2)の合成）
化合物(２)は、(-)-フラキシネロンを以下の手順により還元して得た。(-)-フラキシネロン１００ｍｇを１００％エタノール１０ｍｌ中に溶かし、６０ｍｇのNaBH4を加えた。室温下に２４時間攪拌下反応させた後、エバポレーターによりエタノールを留去し、得られた残渣に２５ｍｌの水を加えた。得られた混合物を３０ｍｌのCHCl3で４回で抽出した。得られたCHCl3溶液を中性になるまで水で洗浄し、エバポレーションを行い、明るい黄色のオイルを得た。得られたオイルをシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒は、ヘキサン／酢酸エチルを９：１〜７：３に変化させた）で精製して、化合物(2)（５２．４ｍｇ）を得た。化合物(2)が主生成物であり、収率は５２％であった。化合物(2)の構造は、Weimin, Z.; Jean, L. W.; Kurt, H.; Rensheng, X.; Guowei, Q. Phytochemistry. 1998, 47, 7-11.に記載のスペクトルデータと比較して、(-)-7,7a-ジヒドロフラキシネロン（(-)-7,7a-Dihydrofraxinellone）と決定された。
【００９３】
実施例２（化合物(3)の合成）
化合物(3)は、(-)-フラキシネロンを以下の手順によりエポキシ化して得た。フラキシネロン５０ｍｇをメタノール１ｍｌに溶解し、過酸化水素水（３０％）６０μｌ及び6N水酸化ナトリウム水溶液２０μｌを加えた。室温下に２４時間攪拌下反応させた後、反応混合液に1N塩酸を加えてpH2に調整し、得られた混合液を１０ｍｌの水中に加えた。得られた混合液をジエチルエーテル１０ｍｌで４回抽出した。得られたエーテル溶液をエバポレーターで乾燥させると、無色の針状結晶が得られた。得られた結晶をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒は、ヘキサン／酢酸エチルを９：１〜７：３に変化させた）で精製して、化合物(3)（５１ｍｇ）を得た。化合物(3)が主生成物であり、収率は９５％（１００％ｅｅ）であった。化合物(3)の構造は、Maique, W. B.; Paulo, C. V. M.; Fatima, G. F. D. S.; Joao, B. F.; Sergio, A. Z. Naturforsch. 2001, 56c, 570-574.に記載のスペクトルデータと比較して、(-)-7,7a-エポキシ-フラキシネロン（(-)-7,7a-epoxy-fraxinellone）と決定された。
【００９４】
実施例３（生物変換の手順）
アスペルギルス・ニガー（A.niger）による生物変換は、以下の手順により行った。万能培地（Czapek pepton培地）を用いて培養されたA. nigerを培養器中に２日間保持した（２８℃攪拌下）。菌体（A.niger）を、万能培地(Czapek pepton培地)（５０ｍｌのペトリディッシュに２０ｍｌ）に移植し、２８℃静止下で培養した。１日後、成熟した生物体及び反応出発物質である各基質（０．４ｍｇ／ｍｌ）を培地に加え、生物体を4日〜12日培養した。ペトリディッシュ中の培地に1N塩酸を加えpH2に調整し、ジエチルエーテルで抽出し、エーテル層をエバポレーションした。得られた抽出物は、TLC、GC及びGC-MSで分析した。基質及び代謝生成物の比は、ガスクロマトグラフィーのピークエリアに基づき決定した。
【００９５】
実施例４（化合物(1-1)の単離）
化合物(1)（90 mg）を実施例３の手順による生物変換の後、万能培地(Czapek pepton培地)と菌体をフィルターで分離した。培地に1N塩酸を加えてpH2に調整し、NaClで飽和し、ジエチルエーテルで抽出した。菌体もジエチルエーテルで抽出した。そして、両抽出物を混合した。この抽出物をジエチルエーテルと共に分液漏斗に入れて、水相とジエチルエーテル相とに分離した。ジエチルエーテル相を、Na2SO4で乾燥し、エバポレーターにかけ、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1：1）で溶出液を分割した。化合物(１)（48.6 mg）と代謝物である化合物(1-1)（31.4 mg）を分割したヘキサン／酢酸エチル溶出液から単離した。
【００９６】
化合物(1-1)（(+)-(4S)-4-ヒドロキシイソフラキシネロン）: オイル; [α]25D -73.0o (c 0.19, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 248([M]+,6), 230(30), 203(5), 160(15), 145(27), 107(100), 95(41); IR(film, νmaxcm-1); 3442(OH), 1755(γ-lactone). 1H, 13C NMR (表１及び２)。
【００９７】
実施例５（化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)の単離）
化合物(2)(100 mg)を実施例４と同様の操作により、化合物(2)（53.0 mg）と代謝物である化合物(2-1)（23.2mg）、化合物(2-2)（17.8mg）及び化合物(2-3)（6.0mg）を分割したヘキサン／酢酸エチル溶出液から単離した。
【００９８】
化合物(2-1)（(-)-(4S)-4-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）: 黄色オイル; [α]25D-20.1o (c 0.40, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 250([M]+,25), 222(3), 204(3), 126(100), 108(91), 95(47), 84(64), 69(36); IR(film, νmaxcm-1); 3477(OH), 1765(γ-lactone). 1H, 13C NMR(表１及び２)。
【００９９】
化合物(2-2)（(-)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）:黄色オイル; [α]25D-45.5o (c 0.34, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 250([M]+,10), 204(4), 126(10), 108(100), 93(26), 82(73), 67(28); IR(film, νmaxcm-1); 3485(OH), 1766(γ-lactone). 1H, 13C NMR(表１及び２)。
【０１００】
化合物(2-3)（(-)-(6S)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロン）: 黄色オイル; [α]25D-25.0o (c 0.22, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 250([M]+,11), 204(30), 154(10), 124(16), 109(67), 95(37), 82(100), 67(41); IR(film, νmaxcm-1); 3423(OH), 1766(γ-lactone). 1H, 13C NMR (表１及び２)。
【０１０１】
実施例６（化合物(3-1)の単離）
化合物(3)（90 mg）を同様の操作により、化合物(3)（31.5 mg）と代謝物である化合物(3-1)（18.5 mg）を分割したヘキサン／酢酸エチル溶出液から単離した。
【０１０２】
化合物(3-1)((+)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-エポキシ-フラキシネロン): 無色針状結晶; [α]25D+ 1.0o (c 1.00, CHCl3); EI-MS: m/z (rel int %): 264([M]+,13), 140(29), 124(31), 96(100), 77(15), 43(32); IR(film, νmaxcm-1); 3273(OH), 1780(γ-lactone). 1H, 13C NMR (表１及び２)。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
実施例７（害虫摂食阻害作用の評価方法）
日産化学工業（株）より入手したハスモンヨトウ（Spodoptera litura）を使用した。ハスモンヨトウの幼虫をナイロンメッシュスクリーンでカバーしたプラスチックケース（幅200 mm×300 mm, 高さ100 mm, １容器当たり幼虫100個）内で飼育した。飼育環境は、２５℃下、相対湿度７０％、光周期：１６時間を明、８時間を暗とした。市販食餌（Insecta LFS; 日本農産工業株式会社）を初齢の幼虫に与えた。実験方法は、Mallavadhani, U. V.; Mahapatra, A.; Raja, S. S.; Manjula, C. J. Agric, Food Chem. 2003, 51, 1952-1955、 Morimoto, M.; Kumeda, S.; Komai, K. J. Agric, Food Chem. 2000, 48, 1888-1891及びKumari, G. N. K.; Balachandran, J.; Aravind, S.; Ganesh, M. R. J. Agric, Food Chem. 2003, 51, 1555-1559に記載の方法に基づき行った。穿孔器を用いて直径２ｃｍのリーフディスクを生のキャベツ（Brassica oleracea）の葉から準備した。２枚のディスクをアセトン溶液中の試験物質で処理し、他の２枚のディスクはコントロールとしてアセトンで処理した。４枚のディスクは同じペトリディッシュ内に交互に置いた。溶媒を完全に除去した後、１０個の幼虫（三齢）を２５℃、暗闇下、３〜５時間ペトリディッシュ内に置いた。モノトーンデータ変換のため、部分的に摂食されたリーフディスクをコピー用紙上にテープで貼り付けた。モノトーンデータをコピーし、エラーがないことを確認して、デジタルスキャナーを使用してデジタルデータに変換した。デジタルデータの分析は、public-domain NIH Image program (米国国立衛生研究所（U.S. National Institutes of Health）開発によってされ、インターネットを介しzippy, nimh, nih, govで匿名FTPで利用可能、又はthe National Technical Information Serice, Springfiled, Virginia, part number PB95-500195GEIによりフロッピー（登録商標）ディスクにより利用可能である)をマッキントッシュコンピューターを使用して行った。
【０１０６】
それぞれの実験は、摂食されていないディスクのデータファイルを測定し、処理されたディスクのものと比較して行った。摂食阻害活性パーセンテージ（％）の評価は、下式を用いて計算した。
【０１０７】
摂食阻害活性パーセンテージ（％）＝１００−（試験物質で処理されたディスクの摂食された部分（％）／コントロールディスクの摂食された部分（％））×１０
試験物質として、化合物(1)、(2)、(3)、(1-1)、(2-1)、(2-2)、(2-3)、及び(3-1)を、葉面積当たり、それぞれ25、10及び5 μg/cm2使用して評価した。また、各試験物質について、ED50(μg/cm2)も測定した。
以上の結果を表３に示す。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
この結果から、化合物(1)、(2)、(3)、(1-1)、(2-1)、(2-2)、(2-3)、及び(3-1)はいずれも害虫摂食阻害活性が高いことがわかる。化合物(3-1)の害虫摂食阻害活性が最も高いと考えられる。
【０１１０】
実施例８（化合物(１)の生物変換）
アスペルギルス・ニガーによる化合物(１)の生物変換の経時変化を調査するために、アスペルギルス・ニガーと共に少量の化合物(１)を９日間培養した。得られた代謝物は、ＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳスペクトル分析で確認した。化合物(1)から(1-1)への変換の経時変化は、ＴＬＣ及びＧＣ（ガスクロマトグラフィー）による定量測定によってモニターした。結果を図１に示す。9日後、出発基質である化合物(１)がca35 %変換されたことがわかる。
【０１１１】
得られた代謝物を単離するために、アスペルギルス・ニガーを用いて大スケールで９日間培養した（実施例３の手順）。生物変換の後、実施例４に記載の通り、培地を抽出し、抽出液から代謝物である化合物(1-1)を得た。スペクトルデータから、化合物(1-1)の構造を確認した（実施例９）。
【０１１２】
実施例９（化合物(1-1)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(1-1)の分子式はC14H16O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3442 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(1-1)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−４位のメチレン基の消失以外は、化合物(1)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.46 ppm)が、H-4’(6.32 ppm)とH-2’(7.42 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.6 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１１３】
COSYスペクトルは、H-4 (3.85 ppm)とδ2.37 及びδ2.12 (それぞれHα-5 及び Hβ-5,)並びにH-6 (5.48 ppm)とδ 2.37及びδ1.97 (それぞれHα-5及びH-8) に相関クロスピークが観測された。
【０１１４】
プロトンＮＭＲスペクトルは、２つのメチル基がδ 1.97及びδ 0.88 (それぞれH-8 及び H-9)に観測され、２つのメチン基がδ5.56及びδ2.86 (それぞれH-3及びH-7a)に観測された。
【０１１５】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(68.1 ppm; C-4)と１つのメチル基(0.88 ppm; H-9)及び２つのメチン基（δ5.56及びδ2.86 (それぞれH-3及びH-7a)）とに観測された。
【０１１６】
NOE差スペクトルは、H-4 (3.85 ppm)と１つのメチン基（δ 5.56 ppm (H-3)）及びH-7a (2.86 ppm)と１つのメチル基（0.88 ppm (H-9)）との間にNOEを観測した。
【０１１７】
従って、化合物(1-1)は、化合物(1)のC-4位をヒドロキシル化して得られるものである。C-4位の第２級アルコールの絶対配置を確認するため、Kusumi, T.; Fujita, Y.; Ohtani, I.; Kakisawa, H. Tetrahedron Letters. 1991, 32, 2923-2926に記載の手法に従い、化合物(1-1)を(S)-及び(R)-MTPAエステルに変換した。改良モッシャー法（Mosher's method）により、C-4位はS-配置を有することが確認された。以上の結果から、化合物(1-1)の構造が(-)-(4S)-4-ヒドロキシイソフラキシネロンであると確認された。
【０１１８】
実施例10（化合物(2)の生物変換）
アスペルギルス・ニガーによる化合物(2)の生物変換の経時変化を調査するために、アスペルギルス・ニガーと共に少量の化合物(2)を１１日間培養した。得られた代謝物は、ＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳスペクトル分析で確認した。化合物(2)から(2-1)、(2-2)及び(2-3)への変換の経時変化は、ＴＬＣ及びＧＣ（ガスクロマトグラフィー）による定量測定によってモニターした。結果を図１に示す。１１日後、出発基質である化合物(2)がca53 %変換された。代謝物である化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)は、１１日後にはそれぞれca23 % 、ca18 % 及びca6 %であった。
【０１１９】
これらの代謝物を単離するために、アスペルギルス・ニガーを用いて大スケールで１１日間培養した（実施例３の手順）。生物変換の後、実施例５に記載の通り、培地を抽出し、抽出液から代謝物である化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)を得た。スペクトルデータから、化合物(2-1)、(2-2)及び(2-3)の構造を確認した（実施例11）。
【０１２０】
実施例11（化合物(2-1)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(2-1)の分子式はC14H18O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3477 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(2-1)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−４位のメチレン基の消失以外は、化合物(2)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.43 ppm)が、H-4’(6.30 ppm)とH-2’(7.39 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.7 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１２１】
COSYスペクトルは、H-4 (3.68 ppm)とδ 1.81、δ 1.77、δ 1.64及びδ 1.54 (それぞれH-5β、H-7、H-6α及びH-5α)に相関クロスピークが観測された。
【０１２２】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.32及びδ 0.92 (それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 5.56、δ 2.50及びδ 1.77(それぞれH-3、H-7a及びH-7)に観測された。
【０１２３】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(71.9 ppm; C-4)と１つのメチル基(0.92 ppm; H-9)及び２つのメチン基（δ 5.40及びδ 2.50(それぞれH-3及びH-7a)）とに観測された。従って、化合物(2-1)は、化合物(2)のC-4位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１２４】
NOE差スペクトルにおいて、H-4とH-3との間にNOEが観測されることから、OH基の立体化学はα配置と確認した。
【０１２５】
以上の結果から、化合物(2-1)の構造が(-)-(4S)-4-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロンであると確認された。
【０１２６】
実施例12（化合物(2-2)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(2-2)の分子式はC14H18O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3485 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(2-2)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−6位のメチレン基の消失以外は、化合物(2)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.44 ppm)が、H-4’(6.28 ppm)とH-2’(7.38 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.6 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１２７】
COSYスペクトルは、H-6 (3.50 ppm)とδ 1.92、δ 1.74及びδ 1.51 (それぞれH-5β、H-7及びH-5α)に相関クロスピークが観測された。
【０１２８】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.43及びδ 1.00(それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 4.92、δ 2.52及びδ 1.74(それぞれH-3、H-7a及びH-7)に観測された。
【０１２９】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(72.0 ppm; C-6)と１つのメチル基(1.43 ppm; H-8)及び１つのメチン基（δ 2.52(H-7a)）とに観測された。従って、化合物(2-2)は、化合物(2)のC-6位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１３０】
H-7aに照射すると、H-9の面積強度が強調されることから、C-7aの立体化学はNOE差によりα配置と決定した。
【０１３１】
C-7メチンプロトンのアキシアル（α）配置及びC-6メチンプロトンのアキシアル（β）配置は、1H NMRスペクトルにおけるH-7a、H-8及びH-6シグナルから観測されるH-7シグナルのスプリッティングパターン(H-7; ddq, J= 4.8, 7.0, 10.7 Hz)により判断した。
【０１３２】
以上の結果から、化合物(2-2)の構造が(-)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロンであると確認された。
【０１３３】
実施例13（化合物(2-3)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(2-3)の分子式はC14H18O4と確認された。ＩＲスペクトルより、3423 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（−）を示した。化合物(2-3)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−6位のメチレン基の消失以外は、化合物(2)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.43 ppm)が、H-4’(6.28 ppm)とH-2’(7.38 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.6 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１３４】
COSYスペクトルは、H-6 (3.88 ppm)とδ 1.94、δ1.90及びδ1.61 (それぞれH-7、Hβ-5及びHα-5)に相関クロスピークが観測された。
【０１３５】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.46及びδ 0.96(それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 4.99、δ 2.31及びδ 1.94(それぞれH-3、H-7a及びH-7)に観測された。
【０１３６】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(69.6 ppm; C-6)と１つのメチル基(1.46 ppm; H-8)及び１つのメチン基（δ 2.31(H-7a)）とに観測された。従って、化合物(2-3)は、化合物(2)のC-6位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１３７】
H-7aに照射すると、H-9の面積強度が強調されることから、C-7aの立体化学はNOE差によりα配置と決定した。
【０１３８】
C-7メチンプロトンのアキシアル（α）配置及びC-6メチンプロトンのエカトリアル（α）配置は、1H NMRスペクトルにおけるH-5α、H-6、H-7a及びH-8シグナルから観測されるH-7シグナルのスプリッティングパターン(H-7; dddq, J= 2.2, 2.2, 5.2, 7.4 Hz)により判断した。
【０１３９】
以上の結果から、化合物(2-3)の構造が(-)-(6S)-6-ヒドロキシ-7,7a-ジヒドロフラキシネロンであると確認された。
【０１４０】
実施例14（化合物(3)の生物変換）
アスペルギルス・ニガーによる化合物(3)の生物変換の経時変化を調査するために、アスペルギルス・ニガーと共に少量の化合物(3)を１１日間培養した。得られた代謝物は、ＴＬＣ、ＧＣ及びＧＣ−ＭＳスペクトル分析で確認した。化合物(3)から(3-1)への変換の経時変化は、ＴＬＣ及びＧＣ（ガスクロマトグラフィー）による定量測定によってモニターした。結果を図１に示す。１１日後、出発基質である化合物(3)がca37 %変換されたことがわかる。
【０１４１】
これらの代謝物を単離するために、アスペルギルス・ニガーを用いて大スケールで１１日間培養した（実施例３の手順）。生物変換の後、実施例6に記載の通り、培地を抽出し、抽出液から代謝物である化合物(3-1)を得た。スペクトルデータから、化合物(3-1)の構造を確認した（実施例１５）。
【０１４２】
実施例15（化合物(3-1)の構造決定）
高分解能質量分析及びＮＭＲデータから、化合物(3-1)の分子式はC14H16O5と確認された。ＩＲスペクトルより、3273 cm-1に水酸基由来のバンドが確認され、比旋光度は（+）を示した。化合物(3-1)のプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルは、新規のメチン基の出現及びＣ−6位のメチレン基の消失以外は、化合物(3)のものと類似していた。プロトンＮＭＲスペクトルに関しては、H-5’(7.47 ppm)が、H-4’(6.33 ppm)とH-2’(7.48 ppm)との特徴的なカップリング定数（J=1.7 Hz）を有していた。詳細には、二次元ＮＭＲ(COSY、HMQC、HMBC及びNOE)によって確認された。
【０１４３】
COSYスペクトルは、H-6 (3.91 ppm)とδ 1.83、δ 1.59、δ 1.51及びδ 1.51 (それぞれHα-5、Hα-4、Hβ-5及びHβ-4)に相関クロスピークが観測された。
【０１４４】
プロトンＮＭＲは、２つのメチル基がδ 1.68及びδ 0.93(それぞれH-8及びH-9)に観測され、メチン基がδ 5.19 (H-3)に観測された。
【０１４５】
HMBCスペクトル相関は、新しいメチン炭素(72.1 ppm; C-6)と１つのメチル基(1.68 ppm; H-8)及び２つのメチレン基（δ 1.83、δ 1.59、δ 1.51及びδ 1.51(それぞれHα-5、Hα-4、Hβ-5及びHβ-4)）とに観測された。従って、化合物(3-1)は、化合物(3)のC-6位をヒドロキシル化して得られるものである。
【０１４６】
C-6位の第２級アルコールの絶対配置を確認するため、上述のKusumi, T.; Fujita, Y.; Ohtani, I.; Kakisawa, H. Tetrahedron Letters. 1991, 32, 2923-2926に記載の手法に従い、化合物(3-1)を(S)-及び(R)-MTPAエステル誘導体に変換した。
【０１４７】
化合物(3-1)の(S)-及び(R)-MTPAエステル誘導体は、Me-8に対してnegative Δδ（=δR-δS）values(- 0.15)及び Hα-5、Hβ-5及びH-4に対してそれぞれpositive values（H-5α(+ 0.11)、H-5β(+ 0.11)及びH-4(+ 0.03)）を与えた。以上の改良モッシャー法（Mosher's method）により、C-6位はR-配置を有することが確認された。
【０１４８】
NOE差による化合物(3-1)の絶対配置の確認は、シグナルがオーバーラップしたことと、それぞれの水素に照射することの困難性により、行うことができなかった。
【０１４９】
以上の結果から、化合物(3-1)の構造が(+)-(6R)-6-ヒドロキシ-7,7a-エポキシ-フラキシネロンであると確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】アスペルギルス・ニガーによる化合物(1)、(2)及び(3)の生物変換の経時変化を示す図である
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ａ）：
【化１】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物。
【請求項２】
一般式（Ａ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（Ａ−１）：
【化２】
［式中、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する］
で表される化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
【請求項５】
害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である請求項４に記載の害虫摂食抑制剤。
【請求項６】
一般式（Ａ）：
【化３】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｂ）
【化４】
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項７】
一般式（Ｃ）：
【化５】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
【請求項８】
一般式（Ｃ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
一般式（Ｃ−１）：
【化６】
［式中、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
【請求項１１】
害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である請求項８に記載の害虫摂食抑制剤。
【請求項１２】
一般式（Ｃ）：
【化７】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｄ）
【化８】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜３及び請求項７〜９のいずれかに記載の化合物を含有する組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物を害虫に適用することを特徴とする害虫防除方法。
【請求項１５】
一般式（Ｂ）
【化９】
及び一般式（Ｄ）
【化１０】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含む害虫摂食抑制剤であって、害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である害虫摂食抑制剤。
【請求項１】
一般式（Ａ）：
【化１】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物。
【請求項２】
一般式（Ａ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（Ａ−１）：
【化２】
［式中、ＯＨ基は４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する］
で表される化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
【請求項５】
害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である請求項４に記載の害虫摂食抑制剤。
【請求項６】
一般式（Ａ）：
【化３】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合する］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｂ）
【化４】
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項７】
一般式（Ｃ）：
【化５】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
【請求項８】
一般式（Ｃ）において、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合する請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
一般式（Ｃ−１）：
【化６】
［式中、ＯＨ基が４位、５位又は６位のいずれか１つの炭素のみに１つ結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む害虫摂食抑制剤。
【請求項１１】
害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である請求項８に記載の害虫摂食抑制剤。
【請求項１２】
一般式（Ｃ）：
【化７】
［式中、ＯＨ基は４位、５位及び６位からなる群から選ばれた少なくとも１種の炭素に結合し、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｄ）
【化８】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物を生物変換することを特徴とする製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜３及び請求項７〜９のいずれかに記載の化合物を含有する組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物を害虫に適用することを特徴とする害虫防除方法。
【請求項１５】
一般式（Ｂ）
【化９】
及び一般式（Ｄ）
【化１０】
［式中、６位と７位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表される化合物からなる群から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含む害虫摂食抑制剤であって、害虫が、鱗翅目、アブラムシ類、ヨコバイ類、カメムシ類、コオロギ類、ハムシ類、ゾウムシ類、オサゾウムシ類、ゴミムシダマシ類、コガネムシ類、ガガンボ類、ウンカ類、バッタ類、イナゴ類からなる群から選ばれた少なくとも１種に属する昆虫である害虫摂食抑制剤。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１７９５９０（Ｐ２００９−１７９５９０Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９５８９（Ｐ２００８−１９５８９）
【出願日】平成２０年１月３０日（２００８．１．３０）
【出願人】（５０８０３１５２０）高砂薬業株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３０日（２００８．１．３０）
【出願人】（５０８０３１５２０）高砂薬業株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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