新規化合物ウォークマイシン、その製造方法、及びその用途
【課題】細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の提供。
【解決手段】受託番号ＮＩＴＥＰ−７７７のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株が生産する新規な酵素活性阻害剤。
【解決手段】受託番号ＮＩＴＥＰ−７７７のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株が生産する新規な酵素活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、及びその用途、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの抗菌剤が、細菌感染症の治療薬として用いられてきている。これまでに知られる抗菌剤の多くは、細菌の核酸合成、蛋白質合成、ペプチドグリカン合成等を阻害することにより作用する。これらの標的部位は単一で、主として代謝合成経路を阻害することを目的にしているため、これらの抗菌剤に対する耐性菌が出現しやすく、特に近年では複数の抗生物質に対して耐性を示す多剤耐性菌の出現が問題となっている。
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、化膿性疾患、肺炎、食中毒等の起因菌として知られるが、抗生物質メチシリン等の多くの薬剤に対する耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の出現が、臨床上大きな問題となっている。現在、ＭＲＳＡに対する代表的な治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、リネゾリドなどが使用されているが、完全にＭＲＳＡを排除することは一般に困難であるとされており、また、これらのうち、バンコマイシンについては、既にバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の出現が報告されており、その使用には十分な注意が必要であるとされている。
このような薬剤耐性菌の問題を克服するために、従来の抗菌剤とは異なった新しい作用機構による微生物に対する新規抗微生物剤の開発が望まれている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、細菌には、環境に応答してその変化を受容するレセプターとそれぞれの遺伝子発現を制御する情報伝達機構が知られており、その代表例が二成分制御系（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）である。二成分制御系とは、ヒスチジンキナーゼ活性を示すセンサータンパク質とＤＮＡ結合タンパク質であるレギュレーターより構成されている環境応答性の遺伝子発現制御系であり、細菌は様々な環境変化に対応すべく、種々のセンサーとレギュレーターを有している（例えば、非特許文献２参照）。
細菌の二成分制御系としては、グラム陽性菌のＹｙｃＦ（ＷａｌＲともいう）およびＹｙｃＧ（ＷａｌＫともいう）が関与する情報伝達系が存在し、これを阻害すると細菌が死滅することが知られており（例えば、非特許文献３〜６参照）、前記情報伝達系を阻害することによるグラム陽性細菌に抗菌力を示す抗菌剤が期待される。
また、ハクサイ、ジャガイモといった農作物に感染し、農業生産に甚大な被害をもたらす軟腐病菌の病原性は３種の二成分制御系ＰｅｈＳ／ＰｅｈＲ（例えば、非特許文献７参照）、ＰｍｒＢ／ＰｍｒＡ（例えば、非特許文献８参照）、ＥｘｐＳ／ＥｘｐＡ（例えば、非特許文献９参照）によって病原性が調節されていることが知られており、これら病原性を抑制することによる軟腐病菌の防除が期待される。
【０００４】
上記知見があるものの、満足のいく抗菌剤、酵素活性阻害剤は未だ得られておらず、優れた抗菌剤などの開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｉｅｖｅｒｔ ＤＭ，ｅｔ ａｌ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，２００２．ＭＭＷＲ Ｊｕｌｙ ５，２００２；５１：５６５−５６７．
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、第５８巻、第４号
【非特許文献３】Ｆａｂｌｅｔ， Ｃ． ａｎｄ Ｈｏｃｈ， Ａ． Ａ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８０， ６３７５−６３８３， １９９８
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉ， Ｐ． Ｋ．，Ｌｉ， Ｔ．， Ｓｕｎ， Ｄ．， Ｂｉｅｋ， Ｄ． Ｐ． ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ， Ｍ． Ｂ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８１， ３６６６−３６７３， １９９９
【非特許文献５】Ｌａｎｇｅ， Ｒ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｃ．， ＤｅＳａｉｚｉｅｕ， Ａ．， Ｆｌｉｎｔ， Ｎ．， Ｍｏｎｏｓ， Ｊ．， Ｓｔｉｇｅｒ， Ｍ．， Ｃａｓｐｅｒｓ， Ｐ．， Ｋａｍｂｅｒ， Ｍ．， Ｋｅｃｋ ｗｏｌｆｇａｎｇ， Ａｍｒｅｉｎ， Ｋ． Ｅ．， Ｇｅｎｅ， ２３７， ２２３−２３４， １９９９
【非特許文献６】Ｂｅｉｅｒ， Ｄ． ａｎｄ Ｆｒａｎｋ， Ｒ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８２， ２０６８−２０７６， ２０００
【非特許文献７】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｉｒｈｏｎｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １１， ７４３−７５２， １９９８
【非特許文献８】Ｈｙｙｔｉａｉｎｅｎ， Ｈ．， Ｓｊｏｂｌｏｍ， Ｓ．， Ｐａｌｏｍａｋｉ， Ｔ．， Ｔｕｉｋｋａｌａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５０， ７９５−８０７， ２００３
【非特許文献９】Ｆｌｅｇｏ， Ｄ．， Ｍａｒｉｔｓ， Ｒ．， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ｋｏｉｖ， Ｖ．， Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｍ．−Ｂ．， Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １３， ４４７−４５５， ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは、細菌細胞の主要な情報伝達機構である二成分制御系に着目し、鋭意検討した結果、新規な微生物として、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株を分離することに成功し、この菌株が、新規な構造骨格を有し、抗菌活性、若しくは、酵素阻害活性を有する化合物を産生していることを見出した。本発明者らは、前記化合物の化学構造を分析することで、これらが新規化合物であることを確認し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、これらの新規化合物をウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ａ、及びウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｃと命名した。
更に、本発明者らは、前記菌株が産生する既知の化合物の中に、酵素阻害活性を有する化合物があることを見出し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、この化合物をウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｂと命名した。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、下記構造式（Ｃ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｂ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする酵素活性阻害剤である。
【化１】
【化２】
【化３】
＜２＞ ヒスチジンキナーゼ活性を阻害する前記＜１＞に記載の酵素活性阻害剤である。
＜３＞ 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物である。
【化４】
＜４＞ 下記構造式（Ｃ）で表されることを特徴とする化合物である。
【化５】
＜５＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかの製造方法であって、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを採取する採取工程とを含み、
前記培養工程における培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加することを特徴とする化合物の製造方法である。
【化６】
【化７】
＜６＞ ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である前記＜５＞に記載の化合物の製造方法である。
【化８】
【化９】
＜７＞ 分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかが、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの少なくともいずれかである前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の化合物の製造方法である。
＜８＞ 分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかが、イソロイシンである前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の化合物の製造方法である。
＜９＞ ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
【化１０】
【化１１】
＜１０＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である前記＜９＞に記載の微生物である。
＜１１＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
【化１２】
【化１３】
＜１２＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗菌剤である。
【化１４】
【化１５】
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図２】図２は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）のメタノール（０．０５Ｍ ＨＣｌ含有メタノール）中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図３】図３は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）の重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図４】図４は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）の重メタノール中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図５】図５は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図６】図６は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）のメタノール（０．０５Ｍ ＨＣｌ含有メタノール）中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図７】図７は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）の重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図８】図８は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）の重メタノール中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図９】図９は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図１０】図１０は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）のメタノール（０．０５Ｍ ＨＣｌ含有メタノール）中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図１１】図１１は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）の重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図１２】図１２は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）の重メタノール中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（酵素活性阻害剤）
本発明の酵素活性阻害剤は、少なくとも下記構造式（Ａ）で表される化合物、下記構造式（Ｃ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｂ）で表される化合物の少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
前記酵素活性阻害剤は、ヒスチジンキナーゼ活性を好適に阻害することができる。
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【００１２】
＜構造式（Ａ）で表される化合物＞
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物は、本発明の化合物の１つである。下記構造式（Ａ）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「ウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ａ」と称することがある）。
【化１９】
【００１３】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ａ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４３Ｈ４２Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｃ４３Ｈ４３Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２０．５°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７２、２９４７、１６８４、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７９、１３１５、１２１７、１１５３
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３６（３３，７００）、２７７（３５，４００）、３３０（６，６００）、４１２（１３，６００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４６（３３，７００）、２６７（ｓｈ）、３４０（７，１００）、４２９（２０，４００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図３、及び表１に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４、及び表１に示す通りである。
【表１】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、７．７分である。
【００１４】
化合物が、前記構造式（Ａ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００１５】
前記ウォークマイシンＡは、ウォークマイシンＡを生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の、化合物の製造方法により、得られることが好ましい。
【００１６】
前記ウォークマイシンＡは、後述する試験例１〜３に示されるように、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記ウォークマイシンＡは、例えば、前記酵素活性阻害剤、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗菌剤、などの有効成分として、好適に利用可能である。
【００１７】
＜構造式（Ｃ）で表される化合物＞
下記構造式（Ｃ）で表されることを特徴とする化合物は、本発明の化合物の１つである。下記構造式（Ｃ）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「ウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｃ」と称することがある）。
【化２０】
【００１８】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ｃ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４５Ｈ４６Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８８１．２３４０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８８１．２３３７（Ｃ４５Ｈ４７Ｃｌ２Ｏ１４として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−３９．８°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図５に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７０、２９３９、１６８５、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７７、１３１５、１２１９、１１６１
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図６に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３７（２７，７００）、２７６（１１，５００）、３２８（５，５００）、４０５（１０，７００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（２７，５００）、２７１（ｓｈ）、３４１（５，５００）、４２４（１５，０００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図７、及び表２に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図８、及び表２に示す通りである。
【表２】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、１０．０分である。
【００１９】
化合物が、前記構造式（Ｃ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００２０】
前記ウォークマイシンＣは、ウォークマイシンＣを生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の、化合物の製造方法により、得られることが好ましい。
【００２１】
前記ウォークマイシンＣは、後述する試験例１〜３に示されるように、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記ウォークマイシンＣは、例えば、前記酵素活性阻害剤、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗菌剤、などの有効成分として、好適に利用可能である。
【００２２】
＜構造式（Ｂ）で表される化合物＞
前記構造式（Ｂ）で表される化合物（以下、「ウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｂ」と称することがある）の物理化学的性状としては、以下の通りである。
【化２１】
【００２３】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ｂ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４４Ｈ４４Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８１（Ｃ４４Ｈ４５Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２１．７°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図９に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７４、２９４３、１６９１、１６１４、１５８７（ｓｈ）、１４００、１３７５、１３１３、１２２０、１１９６、１１６７
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図１０に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３５（５６，２００）、２７９（５７，６００）、３３１（９，７００）、４２５（２２，０００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（４６，３００）、２６８（４４，６００）、３４１（９，２００）、４３４（２９，３００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図１１、及び表３に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図１２、及び表３に示す通りである。
【表３】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、８．６分である。
【００２４】
化合物が、前記構造式（Ｂ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００２５】
−ウォークマイシンＢの製造−
前記ウォークマイシンＢの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウォークマイシンＢを生産する微生物から製造する方法、化学合成により製造する方法、などが挙げられる。
【００２６】
前記ウォークマイシンＢを微生物から製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む方法が挙げられる。
【００２７】
−−培養工程−−
前記培養工程は、ウォークマイシンＢを生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
【００２８】
前記微生物としては、ウォークマイシンＢを生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７７７）が挙げられる。また、ウォークマイシンＢを生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株を含め、ウォークマイシンＢを生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、ウォークマイシンＢの生産能を高めることも可能である。さらに、遺伝子工学的手法によるウォークマイシンＢの生産も可能である。
【００２９】
前記培養は、ウォークマイシンＢを生産する生産菌を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、ウォークマイシンＢの生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが使用できる。さらに、食塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、ウォークマイシンＢを生産する生産菌が利用し、ウォークマイシンＢの生産に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。
【００３０】
前記培地には、アミノ酸を添加してもよいし、添加しなくてもよいが、アミノ酸を添加しないほうが、ウォークマイシンＢの生産量が多い点で、有利である。
【００３１】
ウォークマイシンＢの生産のための種母培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、ウォークマイシンＢを生産する生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。
【００３２】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、ウォークマイシンＢを生産する生産菌の発育が実質的に阻害されずに、ウォークマイシンＢを生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＢの蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間でウォークマイシンＢの蓄積が最高となる。
【００３３】
前記ウォークマイシンＢは、後述する試験例３に示されるように、優れた酵素阻害活性を有する。
【００３４】
前記酵素活性阻害剤中のウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記酵素活性阻害剤は、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００３５】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記酵素活性阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記酵素活性阻害剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記酵素活性阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００３６】
前記酵素活性阻害剤は、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの少なくともいずれかを含むことから、後述する試験例３に示されるように薬剤耐性菌、植物病原性細菌、などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有する酵素に対して優れた酵素阻害活性を有するものである。
したがって、前記酵素活性阻害剤は、薬剤耐性菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌の病原性を抑制することができ、前記細菌に起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、農園芸用殺菌剤の有効成分としても好適に利用可能である。
【００３７】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記酵素活性阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状等の剤型とすることができる。これらの剤型の前記酵素活性阻害剤は、常法に従い製造することができる。
【００３８】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調整できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（または、乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなど）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネートなど）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類など）、両性型（硫酸エステル塩など）が挙げられるが、もちろんこれらの例示のみに限定されるものではない。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。
【００３９】
−投与−
前記酵素活性阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記酵素活性阻害剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記酵素活性阻害剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記酵素活性阻害剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記酵素活性阻害剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物、即ちウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００４１】
＜培養工程＞
前記培養工程は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
前記培養工程では、培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加する。なお、前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかは、それらの前駆体であってもよい。
【００４２】
前記微生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７７７、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）が挙げられる。また、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株を含め、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産能を高めることも可能である。さらに、遺伝子工学的手法によるウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産も可能である。
【００４３】
前記培養は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する生産菌（以下、単に「ウォークマイシン類生産菌」と称することがある）を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが使用できる。さらに、食塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、ウォークマイシン類生産菌が利用し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。
【００４４】
前記培地には、分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加する。前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加することにより、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産量を増やすことができる。
前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記分岐アミノ酸の具体例としては、バリン、ロイシン、イソロイシンが挙げられる。
前記分岐脂肪酸の具体例としては、３−ｍｅｔｈｙｌ ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、４−ｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、３−ｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄが挙げられる。
前記分岐ケト酸の具体例としては、３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄが挙げられる。
これらの中でも、バリン、ロイシン、イソロイシンが好ましく、イソロイシンがより好ましい。前記イソロイシンであると、前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産量が多い点で、有利である。
【００４５】
前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかの添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培地全体に対して、０．１質量％〜２０質量％が好ましく、０．２５質量％〜５質量％がより好ましく、０．５質量％〜１質量％が特に好ましい。
なお、前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかは、少なくとも前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産させるための培地（以下、「生産培地」と称することがある。）に添加されていればよい。
【００４６】
ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産のための種母培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、ウォークマイシン類生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。
【００４７】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、ウォークマイシン類生産菌の発育が実質的に阻害されずに、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間でウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの蓄積が最高となる。
【００４８】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを採取する工程である。
前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣは、上述した物理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。
【００４９】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、水と混ざらない溶媒により抽出する方法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーなどを単独、又は組み合わせる方法、などが挙げられる。
また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣを菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。
【００５０】
以上のようにして前記製造方法を行うことができ、これにより、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣを得ることができる。
【００５１】
（微生物）
本発明の微生物は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
このような微生物の中でも、特に、財団法人 微生物化学研究会 微生物化学研究センターにおいて、山梨県北杜市の土壌より分離された放線菌で、ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の菌学的性状は、以下の通りである。
【００５３】
１．形態
ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、分枝した基生菌糸より、比較的長い直状の気菌糸を伸長する。成熟した胞子鎖は、１０個〜５０個の長円形の胞子を連鎖する。胞子の大きさは、約０.５μｍ〜０.６μｍ×１.２μｍ〜１.７μｍで、胞子の表面は平滑である。輪生枝、菌糸束、胞子のう、及び運動性胞子は認められない。
【００５４】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、３０℃培養）
黄［２ ｌｃ， Ｇｏｌｄ］の発育上に、茶白［３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸を着生し、黄の可溶性色素を産生する。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、３０℃培養）
うす黄［１ １／２ ｇｃ， Ｄｕｓｔｙ Ｙｅｌｌｏｗ］の発育上に、明るい茶灰［３ ｄｃ， Ｎａｔｕｒａｌ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、黄を帯びる。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、３０℃培養）
黄［１ １／２ ｌｃ， Ｇｏｌｄ］の発育上に、茶白［５ ｃｂ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、黄を帯びる。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、３０℃培養）
にぶ黄［２ ｌｅ， Ｍｕｓｔａｒｄ］の発育上に、茶白［５ ｃｂ］の気菌糸を着生する。黄の可溶性色素を産生する。発育の色及び可溶性色素は、０.０５モル塩酸の添加及び０.０５モル水酸化ナトリウムの添加による変化は認められない。
（５）シュクロース・硝酸塩寒天培地（３０℃培養）
うす黄［２ ｃａ， Ｌｔ Ｉｖｏｒｙ］の発育上に、茶白［３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、かすかに黄を帯びる。
【００５５】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース １.０%、Ｌ−アスパラギン ０.０５％、リン酸水素二カリウム ０.０５％、ひも寒天 ３.０％、ｐＨ７.０）を用い、７℃、１６℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、及び４５℃の各温度で試験した結果、７℃、及び４５℃での生育は認められず、１６℃〜３７℃の範囲で生育した。生育至適温度は、２７℃〜３０℃である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、３０℃培養）
培養後３日目にはスターチの加水分解が認められ、その作用は中等度である。
【００５６】
４．菌体成分
細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型である。
【００５７】
５．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１４５９ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の塩基配列は以下に示すように、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。即ち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｓｅｕｄｏｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（９９％）、Ｓ． ｎｏｖａｅｃａｅｓａｒｅａｅ（９９％）、Ｓ． ｃａｎｕｓ（９９％）、Ｓ． ｇａｌｉｌａｅｕｓ（９９％）、Ｓ． ｌａｖｏｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（９９％）、Ｓ． ｒｅｇａｌｉｓ（９９％）等である。なお、括弧内は塩基配列の相同値を表記した。
【００５８】
以上の性状を要約すると、ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、その形態上、よく分枝した基生菌糸より、比較的長い直状の気菌糸を伸長し、長円形の胞子を連鎖する。種々の培地で、うす黄〜黄の発育上に茶白〜明るい茶灰の気菌糸を着生する。黄の可溶性色素を産生する。生育至適温度は、２７℃〜３０℃付近である。スターチの水解性は中等度である。
ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型である。
ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、公知菌株のデータと比較したところ、ストレプトマイセス属放線菌と高い相同性を示した。
【００５９】
以上の結果より、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するものと考えられる。そこで、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株とした。
なお、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託申請し、平成２１年７月１日、ＮＩＴＥ Ｐ−７７７として受託された。
【００６０】
なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株に由来する突然変異株（自然発生、又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００６１】
（化合物含有組成物）
本発明の化合物含有組成物は、少なくとも前記ウォークマイシンＡ、及び前記ウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
【００６２】
前記化合物含有組成物中のウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記化合物含有組成物は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００６３】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記化合物含有組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記化合物含有組成物は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００６４】
前記化合物含有組成物は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含むことから、抗菌作用、及び、酵素活性阻害作用の少なくともいずれかを有するものである。
【００６５】
（抗菌剤）
本発明の抗菌剤は、少なくとも前記ウォークマイシンＡ、及び前記ウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
【００６６】
前記抗菌剤中のウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌剤は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００６７】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記抗菌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記抗菌剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗菌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００６８】
前記抗菌剤は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含むことから、後述する試験例１及び２に示されるように薬剤耐性菌などに対して優れた抗菌活性を有するものである。
したがって、前記抗菌剤は、薬剤耐性菌などに起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、前記抗菌剤は、農園芸用殺菌剤としても好適に利用可能である。
【００６９】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状等の剤型とすることができる。これらの剤型の前記化合物含有組成物、及び抗菌剤は、常法に従い製造することができる。
【００７０】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調整できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（または、乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなど）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネートなど）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類など）、両性型（硫酸エステル塩など）が挙げられるが、もちろんこれらの例示のみに限定されるものではない。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。
【００７１】
−投与−
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００７２】
以下に実施例、比較例、及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例、及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例、比較例、及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」を表す。
【００７３】
（実施例１：化合物の製造）
−培養工程−
寒天斜面培地に培養したストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７７７として寄託）を、ガラクトース ２％、デキストリン ２％、グリセリン １％、バクトソイトン（ディフコ社製） １％、コーン・スティープ・リカー ０．５％、硫酸アンモニウム ０．２％、炭酸カルシウム ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分滅菌した培地に接種した。その後に３０℃で２日間回転振とう培養し、種母培養液を得た。
【００７４】
グリセリン ２．０％、デキストリン ２．０％、Ｌ−イソロイシン １．０％、酵母エキス（日本製薬製） ０．３％、バクトソイトン（ディフコ社製） １．０％、硫酸アンモニウム ０．２％、炭酸カルシウム ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分滅菌し、生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液の２体積％量を接種し、２７℃、５日間回転振とう培養した（１８０ｒｐｍ）。
【００７５】
−採取工程−
このようにして得られた培養液５リットルを遠心分離して、培養ろ液と菌体に分離した。続いて、菌体は、２．７リットルのメタノールを加えてよく撹拌し、菌体からウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣをメタノールで抽出し、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣを含む菌体抽出液３リットルを得た。菌体抽出液３リットルを減圧下でメタノールを溜去し、この抽出液に２リットルの精製水を加えた。この抽出物に精製水を合わせ１Ｍの塩酸でｐＨを３．０に調整した後、等量の酢酸エチルを加え、酢酸エチル抽出を行った。酢酸エチル層を分離し、水を加え水洗し、続いて、無水硫酸ナトリウムで脱水を行った後、減圧下で濃縮乾固を行いウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣを含む粗抽出物１．５gを得た。
【００７６】
前記粗抽出物をメタノールで溶解し、セファデックスＬＨ−２０（内径３６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。５５０ｍＬ溶媒を展開した後、１フラクションを３ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３から２１に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、５５．７ｍｇのウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣの混合物を得た。
前記ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣの混合物を少量のメタノールに溶解し、Ｃ１８逆層カラムクロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＵＧ１２０、内径３０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂製）でウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣをそれぞれ分離した。即ち、展開溶媒として、アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝７０：３０：０.００１を用い、流速１５ｍＬ／分でクロマトグラフィーを行うと、ウォークマイシンＡは３６分〜３８分に、ウォークマイシンＢは４１分〜４３分にウォークマイシンＣは４８分〜５１分に溶出し、これらを集めて減圧下で濃縮乾固し、純粋なウォークマイシンＡを３．３ｍｇと、ウォークマイシンＢを６．４ｍｇと、ウォークマイシンＣを３．０ｍｇとを得た。
【００７７】
得られたウォークマイシンＡの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ウォークマイシンＡが、下記構造式（Ａ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４３Ｈ４２Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｃ４３Ｈ４３Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２０．５°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７２、２９４７、１６８４、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７９、１３１５、１２１７、１１５３
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３６（３３，７００）、２７７（３５，４００）、３３０（６，６００）、４１２（１３，６００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４６（３３，７００）、２６７（ｓｈ）、３４０（７，１００）、４２９（２０，４００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図３、及び表４に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４、及び表４に示す通りである。
【表４】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、７．７分である。
【化２２】
【００７８】
また、得られたウォークマイシンＣの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ウォークマイシンＣが、下記構造式（Ｃ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４５Ｈ４６Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８８１．２３４０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８８１．２３３７（Ｃ４５Ｈ４７Ｃｌ２Ｏ１４として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−３９．８°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図５に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７０、２９３９、１６８５、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７７、１３１５、１２１９、１１６１
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図６に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３７（２７，７００）、２７６（１１，５００）、３２８（５，５００）、４０５（１０，７００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（２７，５００）、２７１（ｓｈ）、３４１（５，５００）、４２４（１５，０００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図７、及び表５に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図８、及び表５に示す通りである。
【表５】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、１０．０分である。
【化２３】
【００７９】
また、得られたウォークマイシンＢの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ウォークマイシンＢが、下記構造式（Ｂ）で表される構造を有する化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４４Ｈ４４Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８１（Ｃ４４Ｈ４５Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２１．７°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図９に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７４、２９４３、１６９１、１６１４、１５８７（ｓｈ）、１４００、１３７５、１３１３、１２２０、１１９６、１１６７
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図１０に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３５（５６，２００）、２７９（５７，６００）、３３１（９，７００）、４２５（２２，０００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（４６，３００）、２６８（４４，６００）、３４１（９，２００）、４３４（２９，３００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図１１、及び表６に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図１２、及び表６に示す通りである。
【表６】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、８．６分である。
【化２４】
【００８０】
（比較例１：化合物の製造）
−培養工程−
実施例１の培養工程において、生産培地のＬ−イソロイシンを用いなかった以外は、実施例１と同様にして培養工程を行った。
【００８１】
−採取工程−
このようにして得られた培養液５リットルを遠心分離して、培養ろ液と菌体に分離した。続いて、菌体は、２．７リットルのメタノールを加えてよく撹拌し、菌体からウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣをメタノールで抽出し、ウォークマイシンＢと、微量のウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣを含む菌体抽出液３リットルを得た。菌体抽出液３リットルを減圧下でメタノールを溜去し、この抽出液に２リットルの精製水を加えた。この抽出物に精製水を合わせた溶液に等量の酢酸エチルを加え、酢酸エチル抽出を行った。酢酸エチル層を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水を行った後、減圧下で濃縮乾固を行いウォークマイシンＢを含む粗抽出物２．０gを得た。
【００８２】
前記粗抽出物をメタノールで溶解し、セファデックスＬＨ−２０（内径３６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。５５０ｍＬ溶媒を展開した後、１フラクションを３ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３から２３に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、９９．７ｍｇのウォークマイシンＢを含む粗生成物を得た。
前記ウォークマイシンＢを含む粗生成物を少量のメタノール：クロロホルム＝１０：３の混合溶液に加温し溶解した。これを、５℃の条件下で一昼夜静置すると純粋なウォークマイシンＢが析出した。これを集め４４．８ｍｇのウォークマイシンＢを得た。
また、得られたウォークマイシンＢの物理化学的性状を測定したところ、前記実施例１で得られたウォークマイシンＢと同様の結果であり、これらのことから、ウォークマイシンＢが、前記構造式（Ｂ）で表される構造を有する化合物であることが確認された。
なお、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣは、生産量が微量であり、精製することができなかった。
【００８３】
前記実施例１、及び比較例１の結果から、培養工程における培養培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加しなかった比較例１では、ウォークマイシンＢは、精製することが可能な量が生産されたが、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣは、生産量が微量であり、精製物を得ることができないことがわかった。
【００８４】
また、得られたウォークマイシンＡ〜Ｃの抗菌活性、及び酵素阻害活性を、以下の試験例１〜３で確認した。
【００８５】
（試験例１：抗菌活性−１）
バンコマイシン耐性腸球菌、及びバンコマイシン感受性腸球菌に対するウォークマイシンＡ〜Ｃの抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表７に示す。
また、参考として、バンコマイシンでも同様に測定した。結果を表７に示す。
【００８６】
【表７】
【００８７】
（試験例２：抗菌活性−２）
メチシリン耐性ブドウ球菌、バンコマイシン低感受性メチシリン耐性ブドウ球菌、及びメチシリン感受性ブドウ球菌に対するウォークマイシンＡ〜Ｃの抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表８に示す。
また、参考として、オキサシリンでも同様に測定した。結果を表８に示す。
【００８８】
【表８】
【００８９】
表７〜８の結果から、ウォークマイシンＡ〜Ｃは、バンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン感受性腸球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、バンコマイシン低感受性メチシリン耐性ブドウ球菌、及びメチシリン感受性ブドウ球菌に対して、抗菌活性を有していることがわかった。
ウォークマイシンＡ〜Ｃの中でも、ウォークマイシンＡ、及びＣは、ウォークマイシンＢよりも優れた抗菌活性を有していることがわかった。
【００９０】
（試験例３：酵素阻害活性）
−（１）ＹｙｃＧヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
枯草菌１６８株（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）のＹｙｃＧに対する、ウォークマイシンＡ〜Ｃの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法にしたがって行った。
ＹｙｃＧのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０７番目のアミノ酸から６１１番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｙｙｃＧｔｒｕを大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＹｙｃＧのヒスチジンキナーゼ活性ドメインを発現させたタンパク質（ＹｙｃＧ−２０７−６１１）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、０．５μＭ ＹｙｃＧ−２０７−６１１、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２であり、この反応溶液に２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で１０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。阻害活性を調べる際は、ＡＴＰ混合溶液を加える前に所定の濃度のウォークマイシンＡ〜Ｃを反応溶液中に加え、３０℃で５分間インキュベートし、枯草菌のＹｙｃＧに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表９に示す。
【００９１】
−（２）ＶｉｃＫヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
う蝕菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ)のＶｉｃＫに対する、ウォークマイシンＡ〜Ｃの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法を改変して行った。
ＶｉｃＫのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から３１番目のアミノ酸から４５０番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により、う蝕菌の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＶｉｃＫのヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質(ＶｉｃＫ−３１−４５０)を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、０．５μＭ ＶｉｃＫ−３１−４５０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２であり、この反応液 ７μＬにウォークマイシンＡ〜Ｃを １μＬ加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５μＭ ＡＴＰを２μＬ加え（終濃度２．５μＭ）反応を開始し、２５℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、う蝕菌のＶｉｃＫに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表９に示す。
【００９２】
−（３）ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ＭＡＦＦ３０１３９３）のＰｅｈＳに対する、ウォークマイシンＡ〜Ｃの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法にしたがって行った。
ＰｅｈＳのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０９番目のアミノ酸から４８４番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｐｅｈＳｃＭ２−２を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（ＰｅｈＳ−２０９−４８４）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、４μＭ ＰｅｈＳ−２０９−４８４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２であり、この反応溶液に２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。阻害活性を調べる際は、ＡＴＰ混合溶液を加える前に所定の濃度のウォークマイシンＡ〜Ｃを反応溶液中に加え、３０℃で５分間インキュベートし、軟腐病菌のＰｅｈＳに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表９に示す。
【００９３】
【表９】
【００９４】
表９の結果から、ウォークマイシンＡ〜Ｃは、グラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有するヒスチジンキナーゼに対して、阻害活性を有していることがわかった。ウォークマイシンＡ〜Ｃは、特にＹｙｃＧに対して強い阻害活性を有していることがわかった。
また、ウォークマイシンＡ〜Ｃの中でも、ウォークマイシンＡ、及びＣは、ウォークマイシンＢよりも優れた酵素阻害活性を有していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の新規化合物（ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣ）は、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有することから、新たな抗菌剤、酵素活性阻害剤として好適に利用できる。また、本発明の化合物（ウォークマイシンＢ）は、優れた酵素阻害活性を有することから、新たな酵素活性阻害剤として好適に利用できる。
【受託番号】
【００９６】
ＮＩＴＥ Ｐ−７７７
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、及びその用途、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの抗菌剤が、細菌感染症の治療薬として用いられてきている。これまでに知られる抗菌剤の多くは、細菌の核酸合成、蛋白質合成、ペプチドグリカン合成等を阻害することにより作用する。これらの標的部位は単一で、主として代謝合成経路を阻害することを目的にしているため、これらの抗菌剤に対する耐性菌が出現しやすく、特に近年では複数の抗生物質に対して耐性を示す多剤耐性菌の出現が問題となっている。
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、化膿性疾患、肺炎、食中毒等の起因菌として知られるが、抗生物質メチシリン等の多くの薬剤に対する耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の出現が、臨床上大きな問題となっている。現在、ＭＲＳＡに対する代表的な治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、リネゾリドなどが使用されているが、完全にＭＲＳＡを排除することは一般に困難であるとされており、また、これらのうち、バンコマイシンについては、既にバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の出現が報告されており、その使用には十分な注意が必要であるとされている。
このような薬剤耐性菌の問題を克服するために、従来の抗菌剤とは異なった新しい作用機構による微生物に対する新規抗微生物剤の開発が望まれている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、細菌には、環境に応答してその変化を受容するレセプターとそれぞれの遺伝子発現を制御する情報伝達機構が知られており、その代表例が二成分制御系（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）である。二成分制御系とは、ヒスチジンキナーゼ活性を示すセンサータンパク質とＤＮＡ結合タンパク質であるレギュレーターより構成されている環境応答性の遺伝子発現制御系であり、細菌は様々な環境変化に対応すべく、種々のセンサーとレギュレーターを有している（例えば、非特許文献２参照）。
細菌の二成分制御系としては、グラム陽性菌のＹｙｃＦ（ＷａｌＲともいう）およびＹｙｃＧ（ＷａｌＫともいう）が関与する情報伝達系が存在し、これを阻害すると細菌が死滅することが知られており（例えば、非特許文献３〜６参照）、前記情報伝達系を阻害することによるグラム陽性細菌に抗菌力を示す抗菌剤が期待される。
また、ハクサイ、ジャガイモといった農作物に感染し、農業生産に甚大な被害をもたらす軟腐病菌の病原性は３種の二成分制御系ＰｅｈＳ／ＰｅｈＲ（例えば、非特許文献７参照）、ＰｍｒＢ／ＰｍｒＡ（例えば、非特許文献８参照）、ＥｘｐＳ／ＥｘｐＡ（例えば、非特許文献９参照）によって病原性が調節されていることが知られており、これら病原性を抑制することによる軟腐病菌の防除が期待される。
【０００４】
上記知見があるものの、満足のいく抗菌剤、酵素活性阻害剤は未だ得られておらず、優れた抗菌剤などの開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｉｅｖｅｒｔ ＤＭ，ｅｔ ａｌ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，２００２．ＭＭＷＲ Ｊｕｌｙ ５，２００２；５１：５６５−５６７．
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、第５８巻、第４号
【非特許文献３】Ｆａｂｌｅｔ， Ｃ． ａｎｄ Ｈｏｃｈ， Ａ． Ａ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８０， ６３７５−６３８３， １９９８
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉ， Ｐ． Ｋ．，Ｌｉ， Ｔ．， Ｓｕｎ， Ｄ．， Ｂｉｅｋ， Ｄ． Ｐ． ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ， Ｍ． Ｂ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８１， ３６６６−３６７３， １９９９
【非特許文献５】Ｌａｎｇｅ， Ｒ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｃ．， ＤｅＳａｉｚｉｅｕ， Ａ．， Ｆｌｉｎｔ， Ｎ．， Ｍｏｎｏｓ， Ｊ．， Ｓｔｉｇｅｒ， Ｍ．， Ｃａｓｐｅｒｓ， Ｐ．， Ｋａｍｂｅｒ， Ｍ．， Ｋｅｃｋ ｗｏｌｆｇａｎｇ， Ａｍｒｅｉｎ， Ｋ． Ｅ．， Ｇｅｎｅ， ２３７， ２２３−２３４， １９９９
【非特許文献６】Ｂｅｉｅｒ， Ｄ． ａｎｄ Ｆｒａｎｋ， Ｒ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８２， ２０６８−２０７６， ２０００
【非特許文献７】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｉｒｈｏｎｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １１， ７４３−７５２， １９９８
【非特許文献８】Ｈｙｙｔｉａｉｎｅｎ， Ｈ．， Ｓｊｏｂｌｏｍ， Ｓ．， Ｐａｌｏｍａｋｉ， Ｔ．， Ｔｕｉｋｋａｌａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５０， ７９５−８０７， ２００３
【非特許文献９】Ｆｌｅｇｏ， Ｄ．， Ｍａｒｉｔｓ， Ｒ．， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ｋｏｉｖ， Ｖ．， Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｍ．−Ｂ．， Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １３， ４４７−４５５， ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは、細菌細胞の主要な情報伝達機構である二成分制御系に着目し、鋭意検討した結果、新規な微生物として、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株を分離することに成功し、この菌株が、新規な構造骨格を有し、抗菌活性、若しくは、酵素阻害活性を有する化合物を産生していることを見出した。本発明者らは、前記化合物の化学構造を分析することで、これらが新規化合物であることを確認し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、これらの新規化合物をウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ａ、及びウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｃと命名した。
更に、本発明者らは、前記菌株が産生する既知の化合物の中に、酵素阻害活性を有する化合物があることを見出し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、この化合物をウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｂと命名した。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、下記構造式（Ｃ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｂ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする酵素活性阻害剤である。
【化１】
【化２】
【化３】
＜２＞ ヒスチジンキナーゼ活性を阻害する前記＜１＞に記載の酵素活性阻害剤である。
＜３＞ 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物である。
【化４】
＜４＞ 下記構造式（Ｃ）で表されることを特徴とする化合物である。
【化５】
＜５＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかの製造方法であって、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを採取する採取工程とを含み、
前記培養工程における培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加することを特徴とする化合物の製造方法である。
【化６】
【化７】
＜６＞ ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である前記＜５＞に記載の化合物の製造方法である。
【化８】
【化９】
＜７＞ 分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかが、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの少なくともいずれかである前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の化合物の製造方法である。
＜８＞ 分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかが、イソロイシンである前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の化合物の製造方法である。
＜９＞ ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
【化１０】
【化１１】
＜１０＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である前記＜９＞に記載の微生物である。
＜１１＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
【化１２】
【化１３】
＜１２＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗菌剤である。
【化１４】
【化１５】
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図２】図２は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）のメタノール（０．０５Ｍ ＨＣｌ含有メタノール）中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図３】図３は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）の重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図４】図４は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ウォークマイシンＡ）の重メタノール中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図５】図５は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図６】図６は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）のメタノール（０．０５Ｍ ＨＣｌ含有メタノール）中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図７】図７は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）の重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図８】図８は、前記構造式（Ｃ）で表される化合物（ウォークマイシンＣ）の重メタノール中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図９】図９は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図１０】図１０は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）のメタノール（０．０５Ｍ ＨＣｌ含有メタノール）中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図１１】図１１は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）の重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図１２】図１２は、前記構造式（Ｂ）で表される化合物（ウォークマイシンＢ）の重メタノール中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（酵素活性阻害剤）
本発明の酵素活性阻害剤は、少なくとも下記構造式（Ａ）で表される化合物、下記構造式（Ｃ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｂ）で表される化合物の少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
前記酵素活性阻害剤は、ヒスチジンキナーゼ活性を好適に阻害することができる。
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【００１２】
＜構造式（Ａ）で表される化合物＞
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物は、本発明の化合物の１つである。下記構造式（Ａ）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「ウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ａ」と称することがある）。
【化１９】
【００１３】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ａ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４３Ｈ４２Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｃ４３Ｈ４３Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２０．５°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７２、２９４７、１６８４、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７９、１３１５、１２１７、１１５３
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３６（３３，７００）、２７７（３５，４００）、３３０（６，６００）、４１２（１３，６００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４６（３３，７００）、２６７（ｓｈ）、３４０（７，１００）、４２９（２０，４００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図３、及び表１に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４、及び表１に示す通りである。
【表１】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、７．７分である。
【００１４】
化合物が、前記構造式（Ａ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００１５】
前記ウォークマイシンＡは、ウォークマイシンＡを生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の、化合物の製造方法により、得られることが好ましい。
【００１６】
前記ウォークマイシンＡは、後述する試験例１〜３に示されるように、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記ウォークマイシンＡは、例えば、前記酵素活性阻害剤、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗菌剤、などの有効成分として、好適に利用可能である。
【００１７】
＜構造式（Ｃ）で表される化合物＞
下記構造式（Ｃ）で表されることを特徴とする化合物は、本発明の化合物の１つである。下記構造式（Ｃ）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「ウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｃ」と称することがある）。
【化２０】
【００１８】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ｃ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４５Ｈ４６Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８８１．２３４０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８８１．２３３７（Ｃ４５Ｈ４７Ｃｌ２Ｏ１４として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−３９．８°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図５に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７０、２９３９、１６８５、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７７、１３１５、１２１９、１１６１
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図６に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３７（２７，７００）、２７６（１１，５００）、３２８（５，５００）、４０５（１０，７００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（２７，５００）、２７１（ｓｈ）、３４１（５，５００）、４２４（１５，０００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図７、及び表２に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図８、及び表２に示す通りである。
【表２】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、１０．０分である。
【００１９】
化合物が、前記構造式（Ｃ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００２０】
前記ウォークマイシンＣは、ウォークマイシンＣを生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の、化合物の製造方法により、得られることが好ましい。
【００２１】
前記ウォークマイシンＣは、後述する試験例１〜３に示されるように、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記ウォークマイシンＣは、例えば、前記酵素活性阻害剤、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗菌剤、などの有効成分として、好適に利用可能である。
【００２２】
＜構造式（Ｂ）で表される化合物＞
前記構造式（Ｂ）で表される化合物（以下、「ウォークマイシン（Ｗａｌｋｍｙｃｉｎ）Ｂ」と称することがある）の物理化学的性状としては、以下の通りである。
【化２１】
【００２３】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ｂ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４４Ｈ４４Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８１（Ｃ４４Ｈ４５Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２１．７°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図９に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７４、２９４３、１６９１、１６１４、１５８７（ｓｈ）、１４００、１３７５、１３１３、１２２０、１１９６、１１６７
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図１０に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３５（５６，２００）、２７９（５７，６００）、３３１（９，７００）、４２５（２２，０００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（４６，３００）、２６８（４４，６００）、３４１（９，２００）、４３４（２９，３００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図１１、及び表３に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図１２、及び表３に示す通りである。
【表３】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、８．６分である。
【００２４】
化合物が、前記構造式（Ｂ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００２５】
−ウォークマイシンＢの製造−
前記ウォークマイシンＢの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウォークマイシンＢを生産する微生物から製造する方法、化学合成により製造する方法、などが挙げられる。
【００２６】
前記ウォークマイシンＢを微生物から製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む方法が挙げられる。
【００２７】
−−培養工程−−
前記培養工程は、ウォークマイシンＢを生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
【００２８】
前記微生物としては、ウォークマイシンＢを生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７７７）が挙げられる。また、ウォークマイシンＢを生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株を含め、ウォークマイシンＢを生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、ウォークマイシンＢの生産能を高めることも可能である。さらに、遺伝子工学的手法によるウォークマイシンＢの生産も可能である。
【００２９】
前記培養は、ウォークマイシンＢを生産する生産菌を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、ウォークマイシンＢの生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが使用できる。さらに、食塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、ウォークマイシンＢを生産する生産菌が利用し、ウォークマイシンＢの生産に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。
【００３０】
前記培地には、アミノ酸を添加してもよいし、添加しなくてもよいが、アミノ酸を添加しないほうが、ウォークマイシンＢの生産量が多い点で、有利である。
【００３１】
ウォークマイシンＢの生産のための種母培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、ウォークマイシンＢを生産する生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。
【００３２】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、ウォークマイシンＢを生産する生産菌の発育が実質的に阻害されずに、ウォークマイシンＢを生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＢの蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間でウォークマイシンＢの蓄積が最高となる。
【００３３】
前記ウォークマイシンＢは、後述する試験例３に示されるように、優れた酵素阻害活性を有する。
【００３４】
前記酵素活性阻害剤中のウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記酵素活性阻害剤は、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００３５】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記酵素活性阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記酵素活性阻害剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記酵素活性阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００３６】
前記酵素活性阻害剤は、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＣ、及びウォークマイシンＢの少なくともいずれかを含むことから、後述する試験例３に示されるように薬剤耐性菌、植物病原性細菌、などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有する酵素に対して優れた酵素阻害活性を有するものである。
したがって、前記酵素活性阻害剤は、薬剤耐性菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌の病原性を抑制することができ、前記細菌に起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、農園芸用殺菌剤の有効成分としても好適に利用可能である。
【００３７】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記酵素活性阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状等の剤型とすることができる。これらの剤型の前記酵素活性阻害剤は、常法に従い製造することができる。
【００３８】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調整できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（または、乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなど）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネートなど）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類など）、両性型（硫酸エステル塩など）が挙げられるが、もちろんこれらの例示のみに限定されるものではない。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。
【００３９】
−投与−
前記酵素活性阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記酵素活性阻害剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記酵素活性阻害剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記酵素活性阻害剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記酵素活性阻害剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物、即ちウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００４１】
＜培養工程＞
前記培養工程は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
前記培養工程では、培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加する。なお、前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかは、それらの前駆体であってもよい。
【００４２】
前記微生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７７７、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）が挙げられる。また、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株を含め、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産能を高めることも可能である。さらに、遺伝子工学的手法によるウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産も可能である。
【００４３】
前記培養は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する生産菌（以下、単に「ウォークマイシン類生産菌」と称することがある）を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが使用できる。さらに、食塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、ウォークマイシン類生産菌が利用し、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。
【００４４】
前記培地には、分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加する。前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加することにより、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産量を増やすことができる。
前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記分岐アミノ酸の具体例としては、バリン、ロイシン、イソロイシンが挙げられる。
前記分岐脂肪酸の具体例としては、３−ｍｅｔｈｙｌ ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、４−ｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、３−ｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄが挙げられる。
前記分岐ケト酸の具体例としては、３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄが挙げられる。
これらの中でも、バリン、ロイシン、イソロイシンが好ましく、イソロイシンがより好ましい。前記イソロイシンであると、前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産量が多い点で、有利である。
【００４５】
前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかの添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培地全体に対して、０．１質量％〜２０質量％が好ましく、０．２５質量％〜５質量％がより好ましく、０．５質量％〜１質量％が特に好ましい。
なお、前記分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかは、少なくとも前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産させるための培地（以下、「生産培地」と称することがある。）に添加されていればよい。
【００４６】
ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産のための種母培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、ウォークマイシン類生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。
【００４７】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、ウォークマイシン類生産菌の発育が実質的に阻害されずに、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間でウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの蓄積が最高となる。
【００４８】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを採取する工程である。
前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣは、上述した物理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。
【００４９】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、水と混ざらない溶媒により抽出する方法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーなどを単独、又は組み合わせる方法、などが挙げられる。
また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣを菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。
【００５０】
以上のようにして前記製造方法を行うことができ、これにより、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣを得ることができる。
【００５１】
（微生物）
本発明の微生物は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
このような微生物の中でも、特に、財団法人 微生物化学研究会 微生物化学研究センターにおいて、山梨県北杜市の土壌より分離された放線菌で、ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の菌学的性状は、以下の通りである。
【００５３】
１．形態
ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、分枝した基生菌糸より、比較的長い直状の気菌糸を伸長する。成熟した胞子鎖は、１０個〜５０個の長円形の胞子を連鎖する。胞子の大きさは、約０.５μｍ〜０.６μｍ×１.２μｍ〜１.７μｍで、胞子の表面は平滑である。輪生枝、菌糸束、胞子のう、及び運動性胞子は認められない。
【００５４】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、３０℃培養）
黄［２ ｌｃ， Ｇｏｌｄ］の発育上に、茶白［３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸を着生し、黄の可溶性色素を産生する。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、３０℃培養）
うす黄［１ １／２ ｇｃ， Ｄｕｓｔｙ Ｙｅｌｌｏｗ］の発育上に、明るい茶灰［３ ｄｃ， Ｎａｔｕｒａｌ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、黄を帯びる。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、３０℃培養）
黄［１ １／２ ｌｃ， Ｇｏｌｄ］の発育上に、茶白［５ ｃｂ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、黄を帯びる。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、３０℃培養）
にぶ黄［２ ｌｅ， Ｍｕｓｔａｒｄ］の発育上に、茶白［５ ｃｂ］の気菌糸を着生する。黄の可溶性色素を産生する。発育の色及び可溶性色素は、０.０５モル塩酸の添加及び０.０５モル水酸化ナトリウムの添加による変化は認められない。
（５）シュクロース・硝酸塩寒天培地（３０℃培養）
うす黄［２ ｃａ， Ｌｔ Ｉｖｏｒｙ］の発育上に、茶白［３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、かすかに黄を帯びる。
【００５５】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース １.０%、Ｌ−アスパラギン ０.０５％、リン酸水素二カリウム ０.０５％、ひも寒天 ３.０％、ｐＨ７.０）を用い、７℃、１６℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、及び４５℃の各温度で試験した結果、７℃、及び４５℃での生育は認められず、１６℃〜３７℃の範囲で生育した。生育至適温度は、２７℃〜３０℃である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、３０℃培養）
培養後３日目にはスターチの加水分解が認められ、その作用は中等度である。
【００５６】
４．菌体成分
細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型である。
【００５７】
５．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１４５９ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の塩基配列は以下に示すように、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。即ち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｓｅｕｄｏｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（９９％）、Ｓ． ｎｏｖａｅｃａｅｓａｒｅａｅ（９９％）、Ｓ． ｃａｎｕｓ（９９％）、Ｓ． ｇａｌｉｌａｅｕｓ（９９％）、Ｓ． ｌａｖｏｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（９９％）、Ｓ． ｒｅｇａｌｉｓ（９９％）等である。なお、括弧内は塩基配列の相同値を表記した。
【００５８】
以上の性状を要約すると、ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、その形態上、よく分枝した基生菌糸より、比較的長い直状の気菌糸を伸長し、長円形の胞子を連鎖する。種々の培地で、うす黄〜黄の発育上に茶白〜明るい茶灰の気菌糸を着生する。黄の可溶性色素を産生する。生育至適温度は、２７℃〜３０℃付近である。スターチの水解性は中等度である。
ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型である。
ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、公知菌株のデータと比較したところ、ストレプトマイセス属放線菌と高い相同性を示した。
【００５９】
以上の結果より、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するものと考えられる。そこで、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株とした。
なお、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託申請し、平成２１年７月１日、ＮＩＴＥ Ｐ−７７７として受託された。
【００６０】
なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株に由来する突然変異株（自然発生、又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００６１】
（化合物含有組成物）
本発明の化合物含有組成物は、少なくとも前記ウォークマイシンＡ、及び前記ウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
【００６２】
前記化合物含有組成物中のウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記化合物含有組成物は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００６３】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記化合物含有組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記化合物含有組成物は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００６４】
前記化合物含有組成物は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含むことから、抗菌作用、及び、酵素活性阻害作用の少なくともいずれかを有するものである。
【００６５】
（抗菌剤）
本発明の抗菌剤は、少なくとも前記ウォークマイシンＡ、及び前記ウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
【００６６】
前記抗菌剤中のウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌剤は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００６７】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記抗菌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記抗菌剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗菌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００６８】
前記抗菌剤は、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣの少なくともいずれかを含むことから、後述する試験例１及び２に示されるように薬剤耐性菌などに対して優れた抗菌活性を有するものである。
したがって、前記抗菌剤は、薬剤耐性菌などに起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、前記抗菌剤は、農園芸用殺菌剤としても好適に利用可能である。
【００６９】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状等の剤型とすることができる。これらの剤型の前記化合物含有組成物、及び抗菌剤は、常法に従い製造することができる。
【００７０】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調整できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（または、乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなど）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネートなど）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類など）、両性型（硫酸エステル塩など）が挙げられるが、もちろんこれらの例示のみに限定されるものではない。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。
【００７１】
−投与−
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物、及び抗菌剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００７２】
以下に実施例、比較例、及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例、及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例、比較例、及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」を表す。
【００７３】
（実施例１：化合物の製造）
−培養工程−
寒天斜面培地に培養したストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株（ＮＩＴＥ Ｐ−７７７として寄託）を、ガラクトース ２％、デキストリン ２％、グリセリン １％、バクトソイトン（ディフコ社製） １％、コーン・スティープ・リカー ０．５％、硫酸アンモニウム ０．２％、炭酸カルシウム ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分滅菌した培地に接種した。その後に３０℃で２日間回転振とう培養し、種母培養液を得た。
【００７４】
グリセリン ２．０％、デキストリン ２．０％、Ｌ−イソロイシン １．０％、酵母エキス（日本製薬製） ０．３％、バクトソイトン（ディフコ社製） １．０％、硫酸アンモニウム ０．２％、炭酸カルシウム ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分滅菌し、生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液の２体積％量を接種し、２７℃、５日間回転振とう培養した（１８０ｒｐｍ）。
【００７５】
−採取工程−
このようにして得られた培養液５リットルを遠心分離して、培養ろ液と菌体に分離した。続いて、菌体は、２．７リットルのメタノールを加えてよく撹拌し、菌体からウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣをメタノールで抽出し、ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣを含む菌体抽出液３リットルを得た。菌体抽出液３リットルを減圧下でメタノールを溜去し、この抽出液に２リットルの精製水を加えた。この抽出物に精製水を合わせ１Ｍの塩酸でｐＨを３．０に調整した後、等量の酢酸エチルを加え、酢酸エチル抽出を行った。酢酸エチル層を分離し、水を加え水洗し、続いて、無水硫酸ナトリウムで脱水を行った後、減圧下で濃縮乾固を行いウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣを含む粗抽出物１．５gを得た。
【００７６】
前記粗抽出物をメタノールで溶解し、セファデックスＬＨ−２０（内径３６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。５５０ｍＬ溶媒を展開した後、１フラクションを３ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３から２１に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、５５．７ｍｇのウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣの混合物を得た。
前記ウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣの混合物を少量のメタノールに溶解し、Ｃ１８逆層カラムクロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ ＵＧ１２０、内径３０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂製）でウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣをそれぞれ分離した。即ち、展開溶媒として、アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝７０：３０：０.００１を用い、流速１５ｍＬ／分でクロマトグラフィーを行うと、ウォークマイシンＡは３６分〜３８分に、ウォークマイシンＢは４１分〜４３分にウォークマイシンＣは４８分〜５１分に溶出し、これらを集めて減圧下で濃縮乾固し、純粋なウォークマイシンＡを３．３ｍｇと、ウォークマイシンＢを６．４ｍｇと、ウォークマイシンＣを３．０ｍｇとを得た。
【００７７】
得られたウォークマイシンＡの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ウォークマイシンＡが、下記構造式（Ａ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４３Ｈ４２Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８５３．２０４１（Ｃ４３Ｈ４３Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２０．５°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７２、２９４７、１６８４、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７９、１３１５、１２１７、１１５３
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３６（３３，７００）、２７７（３５，４００）、３３０（６，６００）、４１２（１３，６００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４６（３３，７００）、２６７（ｓｈ）、３４０（７，１００）、４２９（２０，４００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図３、及び表４に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４、及び表４に示す通りである。
【表４】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、７．７分である。
【化２２】
【００７８】
また、得られたウォークマイシンＣの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ウォークマイシンＣが、下記構造式（Ｃ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４５Ｈ４６Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８８１．２３４０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８８１．２３３７（Ｃ４５Ｈ４７Ｃｌ２Ｏ１４として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−３９．８°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図５に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７０、２９３９、１６８５、１６１６、１５９０（ｓｈ）、１４０８、１３７７、１３１５、１２１９、１１６１
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図６に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３７（２７，７００）、２７６（１１，５００）、３２８（５，５００）、４０５（１０，７００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（２７，５００）、２７１（ｓｈ）、３４１（５，５００）、４２４（１５，０００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図７、及び表５に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図８、及び表５に示す通りである。
【表５】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、１０．０分である。
【化２３】
【００７９】
また、得られたウォークマイシンＢの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ウォークマイシンＢが、下記構造式（Ｂ）で表される構造を有する化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ４４Ｈ４４Ｃｌ２Ｏ１４で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８０（Ｍ＋Ｈ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ ８６７．２１８１（Ｃ４４Ｈ４５Ｃｌ２Ｏ１４として)である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−１２１．７°（ｃ ０．０２５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図９に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３７００〜３２００、２９７４、２９４３、１６９１、１６１４、１５８７（ｓｈ）、１４００、１３７５、１３１３、１２２０、１１９６、１１６７
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図１０に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
０．００５Ｍ ＨＣｌ ： ２３５（５６，２００）、２７９（５７，６００）、３３１（９，７００）、４２５（２２，０００）
０．００５Ｍ ＮａＯＨ ： ２４５（４６，３００）、２６８（４４，６００）、３４１（９，２００）、４３４（２９，３００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム：重メタノール＝４：１の混合溶媒中で３０℃にて測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、
図１１、及び表６に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図１２、及び表６に示す通りである。
【表６】
（９） 高速クロマトグラフィーとして、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（粒子径５μｍ， 内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ， 資生堂製）カラム、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．０１、容量比）を用いて流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は、８．６分である。
【化２４】
【００８０】
（比較例１：化合物の製造）
−培養工程−
実施例１の培養工程において、生産培地のＬ−イソロイシンを用いなかった以外は、実施例１と同様にして培養工程を行った。
【００８１】
−採取工程−
このようにして得られた培養液５リットルを遠心分離して、培養ろ液と菌体に分離した。続いて、菌体は、２．７リットルのメタノールを加えてよく撹拌し、菌体からウォークマイシンＡ、ウォークマイシンＢ、及びウォークマイシンＣをメタノールで抽出し、ウォークマイシンＢと、微量のウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣを含む菌体抽出液３リットルを得た。菌体抽出液３リットルを減圧下でメタノールを溜去し、この抽出液に２リットルの精製水を加えた。この抽出物に精製水を合わせた溶液に等量の酢酸エチルを加え、酢酸エチル抽出を行った。酢酸エチル層を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水を行った後、減圧下で濃縮乾固を行いウォークマイシンＢを含む粗抽出物２．０gを得た。
【００８２】
前記粗抽出物をメタノールで溶解し、セファデックスＬＨ−２０（内径３６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。５５０ｍＬ溶媒を展開した後、１フラクションを３ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３から２３に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、９９．７ｍｇのウォークマイシンＢを含む粗生成物を得た。
前記ウォークマイシンＢを含む粗生成物を少量のメタノール：クロロホルム＝１０：３の混合溶液に加温し溶解した。これを、５℃の条件下で一昼夜静置すると純粋なウォークマイシンＢが析出した。これを集め４４．８ｍｇのウォークマイシンＢを得た。
また、得られたウォークマイシンＢの物理化学的性状を測定したところ、前記実施例１で得られたウォークマイシンＢと同様の結果であり、これらのことから、ウォークマイシンＢが、前記構造式（Ｂ）で表される構造を有する化合物であることが確認された。
なお、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣは、生産量が微量であり、精製することができなかった。
【００８３】
前記実施例１、及び比較例１の結果から、培養工程における培養培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加しなかった比較例１では、ウォークマイシンＢは、精製することが可能な量が生産されたが、ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣは、生産量が微量であり、精製物を得ることができないことがわかった。
【００８４】
また、得られたウォークマイシンＡ〜Ｃの抗菌活性、及び酵素阻害活性を、以下の試験例１〜３で確認した。
【００８５】
（試験例１：抗菌活性−１）
バンコマイシン耐性腸球菌、及びバンコマイシン感受性腸球菌に対するウォークマイシンＡ〜Ｃの抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表７に示す。
また、参考として、バンコマイシンでも同様に測定した。結果を表７に示す。
【００８６】
【表７】
【００８７】
（試験例２：抗菌活性−２）
メチシリン耐性ブドウ球菌、バンコマイシン低感受性メチシリン耐性ブドウ球菌、及びメチシリン感受性ブドウ球菌に対するウォークマイシンＡ〜Ｃの抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表８に示す。
また、参考として、オキサシリンでも同様に測定した。結果を表８に示す。
【００８８】
【表８】
【００８９】
表７〜８の結果から、ウォークマイシンＡ〜Ｃは、バンコマイシン耐性腸球菌、バンコマイシン感受性腸球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、バンコマイシン低感受性メチシリン耐性ブドウ球菌、及びメチシリン感受性ブドウ球菌に対して、抗菌活性を有していることがわかった。
ウォークマイシンＡ〜Ｃの中でも、ウォークマイシンＡ、及びＣは、ウォークマイシンＢよりも優れた抗菌活性を有していることがわかった。
【００９０】
（試験例３：酵素阻害活性）
−（１）ＹｙｃＧヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
枯草菌１６８株（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）のＹｙｃＧに対する、ウォークマイシンＡ〜Ｃの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法にしたがって行った。
ＹｙｃＧのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０７番目のアミノ酸から６１１番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｙｙｃＧｔｒｕを大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＹｙｃＧのヒスチジンキナーゼ活性ドメインを発現させたタンパク質（ＹｙｃＧ−２０７−６１１）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、０．５μＭ ＹｙｃＧ−２０７−６１１、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２であり、この反応溶液に２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で１０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。阻害活性を調べる際は、ＡＴＰ混合溶液を加える前に所定の濃度のウォークマイシンＡ〜Ｃを反応溶液中に加え、３０℃で５分間インキュベートし、枯草菌のＹｙｃＧに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表９に示す。
【００９１】
−（２）ＶｉｃＫヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
う蝕菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ)のＶｉｃＫに対する、ウォークマイシンＡ〜Ｃの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法を改変して行った。
ＶｉｃＫのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から３１番目のアミノ酸から４５０番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により、う蝕菌の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＶｉｃＫのヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質(ＶｉｃＫ−３１−４５０)を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、０．５μＭ ＶｉｃＫ−３１−４５０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２であり、この反応液 ７μＬにウォークマイシンＡ〜Ｃを １μＬ加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５μＭ ＡＴＰを２μＬ加え（終濃度２．５μＭ）反応を開始し、２５℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、う蝕菌のＶｉｃＫに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表９に示す。
【００９２】
−（３）ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ＭＡＦＦ３０１３９３）のＰｅｈＳに対する、ウォークマイシンＡ〜Ｃの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法にしたがって行った。
ＰｅｈＳのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０９番目のアミノ酸から４８４番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｐｅｈＳｃＭ２−２を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（ＰｅｈＳ−２０９−４８４）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、４μＭ ＰｅｈＳ−２０９−４８４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２であり、この反応溶液に２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。阻害活性を調べる際は、ＡＴＰ混合溶液を加える前に所定の濃度のウォークマイシンＡ〜Ｃを反応溶液中に加え、３０℃で５分間インキュベートし、軟腐病菌のＰｅｈＳに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表９に示す。
【００９３】
【表９】
【００９４】
表９の結果から、ウォークマイシンＡ〜Ｃは、グラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有するヒスチジンキナーゼに対して、阻害活性を有していることがわかった。ウォークマイシンＡ〜Ｃは、特にＹｙｃＧに対して強い阻害活性を有していることがわかった。
また、ウォークマイシンＡ〜Ｃの中でも、ウォークマイシンＡ、及びＣは、ウォークマイシンＢよりも優れた酵素阻害活性を有していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の新規化合物（ウォークマイシンＡ、及びウォークマイシンＣ）は、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有することから、新たな抗菌剤、酵素活性阻害剤として好適に利用できる。また、本発明の化合物（ウォークマイシンＢ）は、優れた酵素阻害活性を有することから、新たな酵素活性阻害剤として好適に利用できる。
【受託番号】
【００９６】
ＮＩＴＥ Ｐ−７７７
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、下記構造式（Ｃ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｂ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする酵素活性阻害剤。
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【請求項２】
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物。
【化２８】
【請求項３】
下記構造式（Ｃ）で表されることを特徴とする化合物。
【化２９】
【請求項４】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかの製造方法であって、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを採取する採取工程とを含み、
前記培養工程における培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加することを特徴とする化合物の製造方法。
【化３０】
【化３１】
【請求項５】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である請求項４に記載の化合物の製造方法。
【化３２】
【化３３】
【請求項６】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【化３４】
【化３５】
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする化合物含有組成物。
【化３６】
【化３７】
【請求項９】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗菌剤。
【化３８】
【化３９】
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、下記構造式（Ｃ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｂ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする酵素活性阻害剤。
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【請求項２】
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物。
【化２８】
【請求項３】
下記構造式（Ｃ）で表されることを特徴とする化合物。
【化２９】
【請求項４】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかの製造方法であって、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを採取する採取工程とを含み、
前記培養工程における培地に分岐アミノ酸、分岐脂肪酸、及び分岐ケト酸の少なくともいずれかを添加することを特徴とする化合物の製造方法。
【化３０】
【化３１】
【請求項５】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である請求項４に記載の化合物の製造方法。
【化３２】
【化３３】
【請求項６】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【化３４】
【化３５】
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７７７のストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ６３２−１００Ｆ１１株である請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする化合物含有組成物。
【化３６】
【化３７】
【請求項９】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及び下記構造式（Ｃ）で表される化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗菌剤。
【化３８】
【化３９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−３６１８２（Ｐ２０１１−３６１８２Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８６７２４（Ｐ２００９−１８６７２４）
【出願日】平成２１年８月１１日（２００９．８．１１）
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１１日（２００９．８．１１）
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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