新規化合物ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質、その製造方法、及びその用途
【課題】新規抗菌剤の提供。
【解決手段】特定のアントラキノン骨格を有する化合物が、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有することを見い出した。それらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤。
【解決手段】特定のアントラキノン骨格を有する化合物が、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有することを見い出した。それらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、及びその用途、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの抗菌剤が、細菌感染症の治療薬として用いられてきている。これまでに知られる抗菌剤の多くは、細菌の核酸合成、蛋白質合成、ペプチドグリカン合成等を阻害することにより作用する。これらの標的部位は単一で、主として代謝合成経路を阻害することを目的にしているため、これらの抗菌剤に対する耐性菌が出現しやすく、特に近年では複数の抗生物質に対して耐性を示す多剤耐性菌の出現が問題となっている。
【０００３】
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、化膿性疾患、肺炎、食中毒等の起因菌として知られるが、抗生物質メチシリン等の多くの薬剤に対する耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）の出現が、臨床上大きな問題となっている。現在、ＭＲＳＡに対する代表的な治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、リネゾリドなどが使用されているが、完全にＭＲＳＡを排除することは一般に困難であるとされており、また、これらのうち、バンコマイシンについては、既にバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＶＲＳＡ）の出現が報告されており、その使用には十分な注意が必要であるとされている。
【０００４】
このような薬剤耐性菌の問題を克服するために、従来の抗菌剤とは異なった新しい作用機構による微生物に対する新規抗微生物剤の開発が望まれている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
一方、細菌には、環境に応答してその変化を受容するレセプターとそれぞれの遺伝子発現を制御する情報伝達機構が知られており、その代表例が二成分制御系（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）である。二成分制御系とは、ヒスチジンキナーゼ活性を示すセンサータンパク質とＤＮＡ結合タンパク質であるレギュレーターとにより構成されている環境応答性の遺伝子発現制御系であり、細菌は様々な環境変化に対応すべく、種々のセンサーとレギュレーターとを有している（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
細菌の二成分制御系としては、グラム陽性菌のＹｙｃＦ（ＷａｌＲともいう）及びＹｙｃＧ（ＷａｌＫともいう）が関与する情報伝達系が存在し、これを阻害すると細菌が死滅することが知られており（例えば、非特許文献３〜６参照）、前記情報伝達系を阻害することによるグラム陽性細菌に抗菌力を示す抗菌剤が期待される。
【０００７】
また、ハクサイ、ジャガイモといった農作物に感染し、農業生産に甚大な被害をもたらす軟腐病菌の病原性は、３種の二成分制御系、ＰｅｈＳ／ＰｅｈＲ（例えば、非特許文献７参照）、ＰｍｒＢ／ＰｍｒＡ（例えば、非特許文献８参照）、ＥｘｐＳ／ＥｘｐＡ（例えば、非特許文献９参照）によって病原性が調節されていることが知られており、これら病原性を抑制することによる軟腐病菌の防除が期待される。
【０００８】
上記知見があるものの、満足のいく抗菌剤、酵素活性阻害剤は未だ得られておらず、優れた抗菌剤などの開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｉｅｖｅｒｔ ＤＭ，ｅｔ ａｌ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，２００２．ＭＭＷＲ Ｊｕｌｙ ５，２００２；５１：５６５−５６７．
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、第５８巻、第４号
【非特許文献３】Ｆａｂｌｅｔ， Ｃ． ａｎｄ Ｈｏｃｈ， Ａ． Ａ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８０， ６３７５−６３８３， １９９８
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉ， Ｐ． Ｋ．，Ｌｉ， Ｔ．， Ｓｕｎ， Ｄ．， Ｂｉｅｋ， Ｄ． Ｐ． ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ， Ｍ． Ｂ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８１， ３６６６−３６７３， １９９９
【非特許文献５】Ｌａｎｇｅ， Ｒ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｃ．， ＤｅＳａｉｚｉｅｕ， Ａ．， Ｆｌｉｎｔ， Ｎ．， Ｍｏｎｏｓ， Ｊ．， Ｓｔｉｇｅｒ， Ｍ．， Ｃａｓｐｅｒｓ， Ｐ．， Ｋａｍｂｅｒ， Ｍ．， Ｋｅｃｋ ｗｏｌｆｇａｎｇ， Ａｍｒｅｉｎ， Ｋ． Ｅ．， Ｇｅｎｅ， ２３７， ２２３−２３４， １９９９
【非特許文献６】Ｂｅｉｅｒ， Ｄ． ａｎｄ Ｆｒａｎｋ， Ｒ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８２， ２０６８−２０７６， ２０００
【非特許文献７】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｉｒｈｏｎｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １１， ７４３−７５２， １９９８
【非特許文献８】Ｈｙｙｔｉａｉｎｅｎ， Ｈ．， Ｓｊｏｂｌｏｍ， Ｓ．， Ｐａｌｏｍａｋｉ， Ｔ．， Ｔｕｉｋｋａｌａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５０， ７９５−８０７， ２００３
【非特許文献９】Ｆｌｅｇｏ， Ｄ．， Ｍａｒｉｔｓ， Ｒ．， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ｋｏｉｖ， Ｖ．， Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｍ．−Ｂ．， Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １３， ４４７−４５５， ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは、細菌細胞の主要な情報伝達機構である二成分制御系に着目し、鋭意検討した結果、新規な微生物として、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株を分離することに成功し、この菌株が、新規な構造骨格を有し、抗菌活性、若しくは、酵素阻害活性を有する化合物を産生していることを見出した。本発明者らは、前記化合物の化学構造を分析することで、これが新規化合物であることを確認し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、この新規化合物をＭＫ８４４−ｍＦ１０物質と命名した。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物である。
【化１】
＜２＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
【化２】
＜３＞ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である前記＜２＞に記載の化合物の製造方法である。
【化３】
＜４＞ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
【化４】
＜５＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である前記＜４＞に記載の微生物である。
＜６＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
【化５】
＜７＞ 前記＜６＞に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする抗菌剤である。
＜８＞ 前記＜６＞に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする酵素活性阻害剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図２】図２は、前記構造式で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）のメタノール中、０．００５Ｍ 塩酸含有メタノール中、及び０．００５Ｍ 水酸化ナトリウム含有メタノール中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図３】図３は、前記構造式で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）の重メタノール中で測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図４】図４は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）の重メタノール中で測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（新規化合物）
本発明の化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質」と称することがある）。
【化６】
【００１６】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ａ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ３８Ｈ３８Ｏ１３で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：負イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ７０１．２２４３（Ｍ−Ｈ）−であり、計算値は、ｍ／ｚ ７０１．２２２９（Ｃ３８Ｈ３７Ｏ１３として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝＋１０２．１°（ｃ ０．１５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３，７００〜３，２００、２，９２９、１，７１０、１，６７５、１，６３１、１，５９２、１，２７４、１，１２４、１，０７８
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
メタノール中： ２７５（４３，０００）、２９２（４２，０００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 塩酸含有メタノール中： ２７５（４２，７００）、２９２（４１，８００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 水酸化ナトリウム含有メタノール中： ２７７（３６，０００）、２９５（３８，７００）、３０８（３，４００）、５０９（４，８００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図３に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４に示す通りである。
【００１７】
化合物が、前記構造式（Ａ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル等の分析を行うことにより確認することができる。
【００１８】
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の、化合物の製造方法により得られることが好ましい。
【００１９】
＜用途＞
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、後述する試験例１及び２に示されるように、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、例えば、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗菌剤、酵素活性阻害剤等の有効成分として好適に利用可能である。
【００２０】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物、即ちＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００２１】
＜培養工程＞
前記培養工程は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
【００２２】
前記微生物としては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株（ＮＩＴＥ Ｐ−９０３、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）などが挙げられる。また、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株を含め、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産能を高めることも可能である。更に、遺伝子工学的手法によるＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産も可能である。
【００２３】
前記培養は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する生産菌（以下、単に「ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌」と称することがある）を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪などが使用できる。更に、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌が利用し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００２４】
ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産のための種母培地（以下、「生産培地」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。
【００２５】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌の発育が実質的に阻害されずに、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間でＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の蓄積が最高となる。
【００２６】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を採取する工程である。
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、上述した物理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。
【００２７】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、水と混ざらない溶媒により抽出する方法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーなどを単独、又は組み合わせる方法などが挙げられる。
また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。
【００２８】
以上のようにして前記製造方法を行うことができ、これにより、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を好適に得ることができる。
【００２９】
（微生物）
本発明の微生物は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
このような微生物の中でも、特に、財団法人 微生物化学研究会 微生物化学研究センターにおいて、山梨県北杜市の土壌より分離された放線菌で、ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の菌学的性状は、以下の通りである。
【００３１】
１．形態
ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、分枝した基生菌糸より、直状の気菌糸を伸長する。成熟した胞子鎖は、１０個以上の円筒形の胞子を連鎖する。胞子の大きさは、約０．５μｍ〜０．７μｍ×０．６μｍ〜１．１μｍで、胞子の表面は、平滑あるいはとげ状である。輪生枝、菌糸束、胞子のう、及び運動性胞子は認められない。
【００３２】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）
灰味赤茶［５ ｌｇ， Ｃｏｃｏａ Ｂｒｏｗｎ〜６ １／２ ｎｉ， Ｒｏｓｅ Ｂｒｏｗｎ］の発育上に、茶白［３ ｄｃ， Ｎａｔｕｒａｌ］の気菌糸を着生し、茶［５ ｐｉ， Ｃｏｐｐｅｒ Ｂｒｏｗｎ］の可溶性色素を産生する。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）
茶［５ ｐｉ， Ｃｏｐｐｅｒ Ｂｒｏｗｎ］〜 暗い茶［５ ｎｌ， Ｃｈｏｃｏｌａｔｅ］の発育上に、灰白［１３ ｃｂ， Ｐｅａｒｌ Ｇｒａｙ］の気菌糸を着生する。明るい茶の可溶性色素を産生する。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
茶［５ ｐｉ， Ｃｏｐｐｅｒ Ｂｒｏｗｎ］〜 暗い茶［６ ｐｌ， Ｄｅｅｐ Ｂｒｏｗｎ Ｍａｈｏｇａｎｙ］の発育上に、灰白［１３ ｂａ， Ａｌａｂａｓｔｅｒ Ｔｉｎｔ］の気菌糸を着生する。明るい茶の可溶性色素を産生する。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）
発育は灰味赤茶［５ ｎｉ， Ｃｏｃｏａ Ｂｒｏｗｎ］、気菌糸は着生せず、可溶性色素は茶を帯びる。
（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培養）
発育は明るい茶［４ ｎｇ， Ｌｔ Ｂｒｏｗｎ 〜 ４ ｎｅ， Ｌｕｇｇａｇｅ ｔａｎ］、気菌糸は着生せず、可溶性色素は茶を帯びる。
（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
うす黄［２ ｄｂ， Ｉｖｏｒｙ］の発育上に、茶白［３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素はうすピンクを帯びる。
【００３３】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン １．０質量％、イーストエキス ０．２質量％、ひも寒天 ２．６質量％、ｐＨ７．０）を用い、ｌ０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、及び５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、３７℃、及び５０℃での生育は認められず、２０℃〜３０℃の範囲で生育した。生育至適温度は２４℃〜２７℃である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
スターチの水解性は認められない。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・プロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培地７； いずれも２７℃培養）
いずれの培地でも認められない。
（４）炭素源の利用性（無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４からスターチを抜いた培地；２７℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、及びラムノースを利用して発育し、Ｄ−フルクトース、スクロース、イノシトール、ラフィノース、及びＤ−マンニトールは利用しない。
【００３４】
４．菌体成分
細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型である。
【００３５】
５．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１，４８１ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の塩基配列は以下に示すように、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列と高い相同性を示した。即ち、ストレプトミセス ヨーチョネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｙｅｏｃｈｏｎｅｎｓｉｓ：ＮＢＲＣ １００７８２Ｔと９８％相同）、ストレプトミセス パウシスポレウス（Ｓ．ｐａｕｃｉｓｐｏｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ １４１３Ｔと９８％相同）、ストレプトミセス ホーペイエンシス（Ｓ．ｈｅｂｅｉｅｎｓｉｓ：ＹＩＭ ００１Ｔと９７％相同）などである。なお、括弧内は塩基配列の相同値を表記した。
【００３６】
以上の性状を要約すると、ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、その形態上、よく分枝した基生菌糸より、直状の気菌糸を伸長し、円筒形の胞子を連鎖する。種々の培地で、灰味赤茶〜暗い茶の発育上に茶白の気菌糸を着生する。うすピンク〜茶の可溶性色素を産生する。生育至適温度は２４℃〜２７℃である。スターチの水解性度及びメラニン様色素の生成は陰性である。
ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型である。
ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、公知菌株のデータと比較したところ、ストレプトミセス属放線菌と高い相同性を示した。
【００３７】
以上の結果より、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するものと考えられる。そこで、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株をストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株とした。
なお、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託申請し、平成２２年２月２３日、ＮＩＴＥ Ｐ−９０３として受託された。
【００３８】
なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株に由来する突然変異株（自然発生又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００３９】
（化合物含有組成物）
本発明の化合物含有組成物は、本発明の化合物、即ちＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４０】
前記化合物含有組成物中のＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記化合物含有組成物は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質そのものであってもよい。
【００４１】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記化合物含有組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記化合物含有組成物は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００４２】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記化合物含有組成物の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状などが挙げられる。これらの剤型の前記化合物含有組成物は、常法に従い製造することができる。
【００４３】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調製できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（又は乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル等）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネート等）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類等）、両性型（硫酸エステル塩等）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガム等の各種補助剤を使用することができる。
【００４４】
−投与−
前記化合物含有組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記化合物含有組成物の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記化合物含有組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
＜用途＞
前記化合物含有組成物は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含むことから、抗菌作用、及び、酵素活性阻害作用の少なくともいずれかを有するものである。
【００４６】
（抗菌剤、酵素活性阻害剤）
＜抗菌剤＞
本発明の抗菌剤は、少なくとも本発明の前記化合物含有組成物を含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
【００４７】
前記抗菌剤中の前記化合物含有組成物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌剤は、前記化合物含有組成物そのものであってもよい。
【００４８】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記抗菌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記抗菌剤は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗菌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００４９】
前記抗菌剤は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含むことから、後述する試験例１に示されるように薬剤耐性菌などに対して優れた抗菌活性を有するものである。
したがって、前記抗菌剤は、薬剤耐性菌などに起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、前記抗菌剤は、農園芸用殺菌剤としても好適に利用可能である。
【００５０】
＜酵素活性阻害剤＞
本発明の酵素活性阻害剤は、少なくとも本発明の前記化合物含有組成物を含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
前記酵素活性阻害剤は、ヒスチジンキナーゼ活性を好適に阻害することができる。
【００５１】
前記酵素活性阻害剤中の前記化合物含有組成物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記酵素活性阻害剤は、前記化合物含有組成物そのものであってもよい。
【００５２】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記酵素活性阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記酵素活性阻害剤は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記酵素活性阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００５３】
前記酵素活性阻害剤は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含むことから、後述する試験例２に示されるように薬剤耐性菌、植物病原性細菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有する酵素に対して優れた酵素阻害活性を有するものである。
したがって、前記酵素活性阻害剤は、薬剤耐性菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌の病原性を抑制することができ、前記細菌に起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、農園芸用殺菌剤の有効成分としても好適に利用可能である。
【００５４】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状などが挙げられる。これらの剤型の前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤は、常法に従い製造することができる。
【００５５】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調製できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（又は乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル等）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネート等）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類等）、両性型（硫酸エステル塩等）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。
【００５６】
−投与−
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例、比較例、及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例、及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例、比較例、及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」を表す。
【００５８】
（実施例１：化合物の製造）
−培養工程−
寒天斜面培地に培養したストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株（ＮＩＴＥ Ｐ−９０３として寄託）を、ガラクトース ２％、デキストリン ２％、グリセリン １％、バクトソイトン（ディフコ社製） １％、コーン・スティープ・リカー ０．５％、硫酸アンモニウム ０．２％、炭酸カルシウム ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分間滅菌した培地に接種した。その後に３０℃で２日間回転振とう培養し、種母培養液を得た。
【００５９】
押し麦（ムソー社製） １５ｇ、水 ２５ｇを含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に分注して、常法により１２０℃で２０分間滅菌し、生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液の７ｍＬ／フラスコを接種し、３０℃で１４日間、暗所で静置培養を行った。
【００６０】
−採取工程−
このようにして得られた培養物１，１６０ｇ（フラスコ２９本分）にエタノールを２．２リットル加え、室温で２４時間抽出し、遠心分離して、エタノール抽出液得た。続いて、このエタノール抽出液に、１０リットルの水を加えてよく撹拌し、これをダイアイオンＣＨＰ−２０Ｐ（３００ｍＬ、三菱化学株式会社製）カラムに通過させＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を吸着した。このカラムを５０％メタノール水１．６リットルで洗浄した後、アセトン１．５リットルで溶出した。このＭＫ８４４−ｍＦ１０物質含むアセトン溶出液を濃縮乾固し、ヘキサン７０ｍＬとメタノール５０ｍＬとを加え溶解し十分撹拌した。このヘキサン−メタノール混合液は、静置すると２層に分離しＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は下層に含有された。これを集め減圧下で濃縮乾固を行いＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含む粗抽出物２．６ｇを得た。
【００６１】
前記粗抽出物をメタノールで溶解し、セファデックスＬＨ−２０（内径３６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。５５０ｍＬ溶媒を展開した後、１フラクションを３ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３から２１に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、１．４ｇのＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を得た。
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を少量のクロロホルム−メタノール混合溶媒で溶解し、シリカゲル６０（内径３６ｍｍ×１９０ｍｍ、メルク社製）カラムにのせクロマトグラフィーを行った。クロロホルム：メタノール＝５０：１（体積比）の混合溶媒３００ｍＬを用いカラムを洗浄した後、クロロホルム：メタノール＝９：１（体積比）の混合溶媒を９８０ｍＬ、次いでクロロホルム：メタノール：水＝４：１：０．２（体積比）の混合溶媒を３６０ｍＬ用い溶出した。１フラクションを１８ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３０から７０にかけ溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、１４６ｍｇの純粋なＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を得ることができた。
【００６２】
得られたＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質が、下記構造式（Ａ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ３８Ｈ３８Ｏ１３で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：負イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ７０１．２２４３（Ｍ−Ｈ）−であり、計算値は、ｍ／ｚ ７０１．２２２９（Ｃ３８Ｈ３７Ｏ１３として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝＋１０２．１°（ｃ ０．１５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３，７００〜３，２００、２，９２９、１，７１０、１，６７５、１，６３１、１，５９２、１，２７４、１，１２４、１，０７８
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
メタノール中： ２７５（４３，０００）、２９２（４２，０００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 塩酸含有メタノール中： ２７５（４２，７００）、２９２（４１，８００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 水酸化ナトリウム含有メタノール中： ２７７（３６，０００）、２９５（３８，７００）、３０８（３，４００）、５０９（４，８００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図３に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４に示す通りである。
【化７】
また、実施例１で得られたＭＫ８４４−ｍＦ１０物質について、抗菌活性を以下の試験例１で、また酵素阻害活性を以下の試験例２で確認した。
【００６３】
（試験例１：抗菌活性）
メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＭＳＳＡ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＭＤＲＳＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、及びバンコマイシン低感受性黄色ぶどう球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＶＩＳＡ）に対するに対するＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１の結果から、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌（ＭＤＲＳＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、及びバンコマイシン低感受性黄色ぶどう球菌（ＶＩＳＡ）に対して、抗菌活性を有していることがわかった。
【００６６】
（試験例２：酵素阻害活性）
−（１）ＹｙｃＧヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
枯草菌１６８株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８、東京農業大学より分譲）のＹｙｃＧに対するＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法に従って行った。
ＹｙｃＧのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０７番目のアミノ酸から６１１番目のアミノ酸を含む）（以下、「ｙｙｃＧｔｒｕ」と称することがある。）をＰＣＲ法により枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｙｙｃＧｔｒｕを大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＹｙｃＧのヒスチジンキナーゼ活性ドメインを発現させたタンパク質（以下、「ＹｙｃＧ−２０７−６１１」と称することがある。）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液は、０．５μＭ ＹｙｃＧ−２０７−６１１、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ 塩化カリウム、１００ｍＭ 塩化アンモニウム、及び５ｍＭ 塩化マグネシウムの組成とした。
この反応溶液に所定の濃度のＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を加え、３０℃で５分間インキュベートした。その後、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で１０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことによって、枯草菌のＹｙｃＧに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
なお、コントロールとしては、前記反応溶液にＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を添加せず、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、３０℃で１０分間インキュベートしたものを用いた。結果を表２に示す。
【００６７】
−（２）ＶｉｃＫヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
う蝕菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ（ａｍｅｒｉａｃｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手）のＶｉｃＫに対する、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法を改変して行った。
ＶｉｃＫのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から３１番目のアミノ酸から４５０番目のアミノ酸を含む）（以下、「ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０」と称することがある。）をＰＣＲ法により、う蝕菌の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＶｉｃＫのヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（以下、「ＶｉｃＫ−３１−４５０」と称することがある。）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液は、０．５μＭ ＶｉｃＫ−３１−４５０、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウムの組成とした。
この反応溶液７μＬに、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を１μＬ加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５μＭ ＡＴＰを２μＬ加え（終濃度２．５μＭ）反応を開始し、２５℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、う蝕菌のＶｉｃＫに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
なお、コントロールとしては、前記反応溶液にＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を添加せず、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５μＭ ＡＴＰを２μＬ加え、２５℃で２０分間インキュベートしたものを用いた。結果を表２に示す。
【００６８】
−（３）ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ＭＡＦＦ３０１３９３、農林水産省微生物遺伝資源（ＭＡＦＦ）より入手）のＰｅｈＳに対する、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法に従って行った。
ＰｅｈＳのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０９番目のアミノ酸から４８４番目のアミノ酸を含む）（以下、「ｐｅｈＳｃＭ２−２」と称することがある。）をＰＣＲ法により軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｐｅｈＳｃＭ２−２を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（以下、「ＰｅｈＳ−２０９−４８４」と称することがある。）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液は、４μＭ ＰｅｈＳ−２０９−４８４、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ 塩化カリウム、１００ｍＭ 塩化アンモニウム、５ｍＭ 塩化マグネシウムの組成とした。
この反応溶液に所定の濃度のＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を加え、３０℃で５分間インキュベートした。その後、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことによって、軟腐病菌のＰｅｈＳに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
なお、コントロールとしては、前記反応溶液にＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を添加せず、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、３０℃で２０分間インキュベートしたものを用いた。結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
表２の結果から、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌が有するヒスチジンキナーゼに対して、阻害活性を有していることがわかった。ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、特にＹｙｃＧに対して強い阻害活性を有していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の新規化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）は、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有することから、新たな抗菌剤、及び酵素活性阻害剤として好適に利用できる。
【受託番号】
【００７２】
ＮＩＴＥ Ｐ−９０３
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、及びその用途、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの抗菌剤が、細菌感染症の治療薬として用いられてきている。これまでに知られる抗菌剤の多くは、細菌の核酸合成、蛋白質合成、ペプチドグリカン合成等を阻害することにより作用する。これらの標的部位は単一で、主として代謝合成経路を阻害することを目的にしているため、これらの抗菌剤に対する耐性菌が出現しやすく、特に近年では複数の抗生物質に対して耐性を示す多剤耐性菌の出現が問題となっている。
【０００３】
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、化膿性疾患、肺炎、食中毒等の起因菌として知られるが、抗生物質メチシリン等の多くの薬剤に対する耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）の出現が、臨床上大きな問題となっている。現在、ＭＲＳＡに対する代表的な治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、リネゾリドなどが使用されているが、完全にＭＲＳＡを排除することは一般に困難であるとされており、また、これらのうち、バンコマイシンについては、既にバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＶＲＳＡ）の出現が報告されており、その使用には十分な注意が必要であるとされている。
【０００４】
このような薬剤耐性菌の問題を克服するために、従来の抗菌剤とは異なった新しい作用機構による微生物に対する新規抗微生物剤の開発が望まれている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
一方、細菌には、環境に応答してその変化を受容するレセプターとそれぞれの遺伝子発現を制御する情報伝達機構が知られており、その代表例が二成分制御系（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）である。二成分制御系とは、ヒスチジンキナーゼ活性を示すセンサータンパク質とＤＮＡ結合タンパク質であるレギュレーターとにより構成されている環境応答性の遺伝子発現制御系であり、細菌は様々な環境変化に対応すべく、種々のセンサーとレギュレーターとを有している（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
細菌の二成分制御系としては、グラム陽性菌のＹｙｃＦ（ＷａｌＲともいう）及びＹｙｃＧ（ＷａｌＫともいう）が関与する情報伝達系が存在し、これを阻害すると細菌が死滅することが知られており（例えば、非特許文献３〜６参照）、前記情報伝達系を阻害することによるグラム陽性細菌に抗菌力を示す抗菌剤が期待される。
【０００７】
また、ハクサイ、ジャガイモといった農作物に感染し、農業生産に甚大な被害をもたらす軟腐病菌の病原性は、３種の二成分制御系、ＰｅｈＳ／ＰｅｈＲ（例えば、非特許文献７参照）、ＰｍｒＢ／ＰｍｒＡ（例えば、非特許文献８参照）、ＥｘｐＳ／ＥｘｐＡ（例えば、非特許文献９参照）によって病原性が調節されていることが知られており、これら病原性を抑制することによる軟腐病菌の防除が期待される。
【０００８】
上記知見があるものの、満足のいく抗菌剤、酵素活性阻害剤は未だ得られておらず、優れた抗菌剤などの開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｉｅｖｅｒｔ ＤＭ，ｅｔ ａｌ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，２００２．ＭＭＷＲ Ｊｕｌｙ ５，２００２；５１：５６５−５６７．
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、第５８巻、第４号
【非特許文献３】Ｆａｂｌｅｔ， Ｃ． ａｎｄ Ｈｏｃｈ， Ａ． Ａ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８０， ６３７５−６３８３， １９９８
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉ， Ｐ． Ｋ．，Ｌｉ， Ｔ．， Ｓｕｎ， Ｄ．， Ｂｉｅｋ， Ｄ． Ｐ． ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ， Ｍ． Ｂ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８１， ３６６６−３６７３， １９９９
【非特許文献５】Ｌａｎｇｅ， Ｒ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｃ．， ＤｅＳａｉｚｉｅｕ， Ａ．， Ｆｌｉｎｔ， Ｎ．， Ｍｏｎｏｓ， Ｊ．， Ｓｔｉｇｅｒ， Ｍ．， Ｃａｓｐｅｒｓ， Ｐ．， Ｋａｍｂｅｒ， Ｍ．， Ｋｅｃｋ ｗｏｌｆｇａｎｇ， Ａｍｒｅｉｎ， Ｋ． Ｅ．， Ｇｅｎｅ， ２３７， ２２３−２３４， １９９９
【非特許文献６】Ｂｅｉｅｒ， Ｄ． ａｎｄ Ｆｒａｎｋ， Ｒ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８２， ２０６８−２０７６， ２０００
【非特許文献７】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｉｒｈｏｎｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １１， ７４３−７５２， １９９８
【非特許文献８】Ｈｙｙｔｉａｉｎｅｎ， Ｈ．， Ｓｊｏｂｌｏｍ， Ｓ．， Ｐａｌｏｍａｋｉ， Ｔ．， Ｔｕｉｋｋａｌａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５０， ７９５−８０７， ２００３
【非特許文献９】Ｆｌｅｇｏ， Ｄ．， Ｍａｒｉｔｓ， Ｒ．， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｒ． Ｂ．， Ｋｏｉｖ， Ｖ．， Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｍ．−Ｂ．， Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｅ． Ｔ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １３， ４４７−４５５， ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは、細菌細胞の主要な情報伝達機構である二成分制御系に着目し、鋭意検討した結果、新規な微生物として、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株を分離することに成功し、この菌株が、新規な構造骨格を有し、抗菌活性、若しくは、酵素阻害活性を有する化合物を産生していることを見出した。本発明者らは、前記化合物の化学構造を分析することで、これが新規化合物であることを確認し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、この新規化合物をＭＫ８４４−ｍＦ１０物質と命名した。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物である。
【化１】
＜２＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
【化２】
＜３＞ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である前記＜２＞に記載の化合物の製造方法である。
【化３】
＜４＞ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
【化４】
＜５＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である前記＜４＞に記載の微生物である。
＜６＞ 下記構造式（Ａ）で表される化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
【化５】
＜７＞ 前記＜６＞に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする抗菌剤である。
＜８＞ 前記＜６＞に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする酵素活性阻害剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である微生物、及び前記化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図２】図２は、前記構造式で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）のメタノール中、０．００５Ｍ 塩酸含有メタノール中、及び０．００５Ｍ 水酸化ナトリウム含有メタノール中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図３】図３は、前記構造式で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）の重メタノール中で測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図４】図４は、前記構造式（Ａ）で表される化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）の重メタノール中で測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（新規化合物）
本発明の化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質」と称することがある）。
【化６】
【００１６】
−物理化学的性状−
前記構造式（Ａ）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ３８Ｈ３８Ｏ１３で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：負イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ７０１．２２４３（Ｍ−Ｈ）−であり、計算値は、ｍ／ｚ ７０１．２２２９（Ｃ３８Ｈ３７Ｏ１３として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝＋１０２．１°（ｃ ０．１５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３，７００〜３，２００、２，９２９、１，７１０、１，６７５、１，６３１、１，５９２、１，２７４、１，１２４、１，０７８
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
メタノール中： ２７５（４３，０００）、２９２（４２，０００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 塩酸含有メタノール中： ２７５（４２，７００）、２９２（４１，８００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 水酸化ナトリウム含有メタノール中： ２７７（３６，０００）、２９５（３８，７００）、３０８（３，４００）、５０９（４，８００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図３に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４に示す通りである。
【００１７】
化合物が、前記構造式（Ａ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル等の分析を行うことにより確認することができる。
【００１８】
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の、化合物の製造方法により得られることが好ましい。
【００１９】
＜用途＞
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、後述する試験例１及び２に示されるように、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、例えば、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗菌剤、酵素活性阻害剤等の有効成分として好適に利用可能である。
【００２０】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物、即ちＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００２１】
＜培養工程＞
前記培養工程は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
【００２２】
前記微生物としては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株（ＮＩＴＥ Ｐ−９０３、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）などが挙げられる。また、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株を含め、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産能を高めることも可能である。更に、遺伝子工学的手法によるＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産も可能である。
【００２３】
前記培養は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する生産菌（以下、単に「ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌」と称することがある）を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪などが使用できる。更に、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌が利用し、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００２４】
ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産のための種母培地（以下、「生産培地」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。
【００２５】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質類生産菌の発育が実質的に阻害されずに、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間でＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の蓄積が最高となる。
【００２６】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を採取する工程である。
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、上述した物理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。
【００２７】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、水と混ざらない溶媒により抽出する方法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーなどを単独、又は組み合わせる方法などが挙げられる。
また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。
【００２８】
以上のようにして前記製造方法を行うことができ、これにより、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を好適に得ることができる。
【００２９】
（微生物）
本発明の微生物は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
このような微生物の中でも、特に、財団法人 微生物化学研究会 微生物化学研究センターにおいて、山梨県北杜市の土壌より分離された放線菌で、ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の菌学的性状は、以下の通りである。
【００３１】
１．形態
ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、分枝した基生菌糸より、直状の気菌糸を伸長する。成熟した胞子鎖は、１０個以上の円筒形の胞子を連鎖する。胞子の大きさは、約０．５μｍ〜０．７μｍ×０．６μｍ〜１．１μｍで、胞子の表面は、平滑あるいはとげ状である。輪生枝、菌糸束、胞子のう、及び運動性胞子は認められない。
【００３２】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）
灰味赤茶［５ ｌｇ， Ｃｏｃｏａ Ｂｒｏｗｎ〜６ １／２ ｎｉ， Ｒｏｓｅ Ｂｒｏｗｎ］の発育上に、茶白［３ ｄｃ， Ｎａｔｕｒａｌ］の気菌糸を着生し、茶［５ ｐｉ， Ｃｏｐｐｅｒ Ｂｒｏｗｎ］の可溶性色素を産生する。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）
茶［５ ｐｉ， Ｃｏｐｐｅｒ Ｂｒｏｗｎ］〜 暗い茶［５ ｎｌ， Ｃｈｏｃｏｌａｔｅ］の発育上に、灰白［１３ ｃｂ， Ｐｅａｒｌ Ｇｒａｙ］の気菌糸を着生する。明るい茶の可溶性色素を産生する。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
茶［５ ｐｉ， Ｃｏｐｐｅｒ Ｂｒｏｗｎ］〜 暗い茶［６ ｐｌ， Ｄｅｅｐ Ｂｒｏｗｎ Ｍａｈｏｇａｎｙ］の発育上に、灰白［１３ ｂａ， Ａｌａｂａｓｔｅｒ Ｔｉｎｔ］の気菌糸を着生する。明るい茶の可溶性色素を産生する。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）
発育は灰味赤茶［５ ｎｉ， Ｃｏｃｏａ Ｂｒｏｗｎ］、気菌糸は着生せず、可溶性色素は茶を帯びる。
（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培養）
発育は明るい茶［４ ｎｇ， Ｌｔ Ｂｒｏｗｎ 〜 ４ ｎｅ， Ｌｕｇｇａｇｅ ｔａｎ］、気菌糸は着生せず、可溶性色素は茶を帯びる。
（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
うす黄［２ ｄｂ， Ｉｖｏｒｙ］の発育上に、茶白［３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素はうすピンクを帯びる。
【００３３】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン １．０質量％、イーストエキス ０．２質量％、ひも寒天 ２．６質量％、ｐＨ７．０）を用い、ｌ０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、及び５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、３７℃、及び５０℃での生育は認められず、２０℃〜３０℃の範囲で生育した。生育至適温度は２４℃〜２７℃である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
スターチの水解性は認められない。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・プロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培地７； いずれも２７℃培養）
いずれの培地でも認められない。
（４）炭素源の利用性（無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４からスターチを抜いた培地；２７℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、及びラムノースを利用して発育し、Ｄ−フルクトース、スクロース、イノシトール、ラフィノース、及びＤ−マンニトールは利用しない。
【００３４】
４．菌体成分
細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型である。
【００３５】
５．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１，４８１ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の塩基配列は以下に示すように、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列と高い相同性を示した。即ち、ストレプトミセス ヨーチョネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｙｅｏｃｈｏｎｅｎｓｉｓ：ＮＢＲＣ １００７８２Ｔと９８％相同）、ストレプトミセス パウシスポレウス（Ｓ．ｐａｕｃｉｓｐｏｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ １４１３Ｔと９８％相同）、ストレプトミセス ホーペイエンシス（Ｓ．ｈｅｂｅｉｅｎｓｉｓ：ＹＩＭ ００１Ｔと９７％相同）などである。なお、括弧内は塩基配列の相同値を表記した。
【００３６】
以上の性状を要約すると、ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、その形態上、よく分枝した基生菌糸より、直状の気菌糸を伸長し、円筒形の胞子を連鎖する。種々の培地で、灰味赤茶〜暗い茶の発育上に茶白の気菌糸を着生する。うすピンク〜茶の可溶性色素を産生する。生育至適温度は２４℃〜２７℃である。スターチの水解性度及びメラニン様色素の生成は陰性である。
ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型である。
ＭＫ８４４−ｍＦ１０株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、公知菌株のデータと比較したところ、ストレプトミセス属放線菌と高い相同性を示した。
【００３７】
以上の結果より、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するものと考えられる。そこで、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株をストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株とした。
なお、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託申請し、平成２２年２月２３日、ＮＩＴＥ Ｐ−９０３として受託された。
【００３８】
なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０株に由来する突然変異株（自然発生又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００３９】
（化合物含有組成物）
本発明の化合物含有組成物は、本発明の化合物、即ちＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４０】
前記化合物含有組成物中のＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記化合物含有組成物は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質そのものであってもよい。
【００４１】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記化合物含有組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記化合物含有組成物は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００４２】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記化合物含有組成物の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状などが挙げられる。これらの剤型の前記化合物含有組成物は、常法に従い製造することができる。
【００４３】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調製できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（又は乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル等）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネート等）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類等）、両性型（硫酸エステル塩等）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガム等の各種補助剤を使用することができる。
【００４４】
−投与−
前記化合物含有組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記化合物含有組成物の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記化合物含有組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
＜用途＞
前記化合物含有組成物は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含むことから、抗菌作用、及び、酵素活性阻害作用の少なくともいずれかを有するものである。
【００４６】
（抗菌剤、酵素活性阻害剤）
＜抗菌剤＞
本発明の抗菌剤は、少なくとも本発明の前記化合物含有組成物を含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
【００４７】
前記抗菌剤中の前記化合物含有組成物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌剤は、前記化合物含有組成物そのものであってもよい。
【００４８】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記抗菌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記抗菌剤は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗菌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００４９】
前記抗菌剤は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含むことから、後述する試験例１に示されるように薬剤耐性菌などに対して優れた抗菌活性を有するものである。
したがって、前記抗菌剤は、薬剤耐性菌などに起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、前記抗菌剤は、農園芸用殺菌剤としても好適に利用可能である。
【００５０】
＜酵素活性阻害剤＞
本発明の酵素活性阻害剤は、少なくとも本発明の前記化合物含有組成物を含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
前記酵素活性阻害剤は、ヒスチジンキナーゼ活性を好適に阻害することができる。
【００５１】
前記酵素活性阻害剤中の前記化合物含有組成物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記酵素活性阻害剤は、前記化合物含有組成物そのものであってもよい。
【００５２】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記酵素活性阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記酵素活性阻害剤は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記酵素活性阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００５３】
前記酵素活性阻害剤は、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含むことから、後述する試験例２に示されるように薬剤耐性菌、植物病原性細菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有する酵素に対して優れた酵素阻害活性を有するものである。
したがって、前記酵素活性阻害剤は、薬剤耐性菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌の病原性を抑制することができ、前記細菌に起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、農園芸用殺菌剤の有効成分としても好適に利用可能である。
【００５４】
＜剤型、投与＞
−剤型−
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状などが挙げられる。これらの剤型の前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤は、常法に従い製造することができる。
【００５５】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調製できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（又は乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル等）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネート等）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類等）、両性型（硫酸エステル塩等）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。
【００５６】
−投与−
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記抗菌剤及び前記酵素活性阻害剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例、比較例、及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例、及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例、比較例、及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」を表す。
【００５８】
（実施例１：化合物の製造）
−培養工程−
寒天斜面培地に培養したストレプトマイセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株（ＮＩＴＥ Ｐ−９０３として寄託）を、ガラクトース ２％、デキストリン ２％、グリセリン １％、バクトソイトン（ディフコ社製） １％、コーン・スティープ・リカー ０．５％、硫酸アンモニウム ０．２％、炭酸カルシウム ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分間滅菌した培地に接種した。その後に３０℃で２日間回転振とう培養し、種母培養液を得た。
【００５９】
押し麦（ムソー社製） １５ｇ、水 ２５ｇを含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に分注して、常法により１２０℃で２０分間滅菌し、生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液の７ｍＬ／フラスコを接種し、３０℃で１４日間、暗所で静置培養を行った。
【００６０】
−採取工程−
このようにして得られた培養物１，１６０ｇ（フラスコ２９本分）にエタノールを２．２リットル加え、室温で２４時間抽出し、遠心分離して、エタノール抽出液得た。続いて、このエタノール抽出液に、１０リットルの水を加えてよく撹拌し、これをダイアイオンＣＨＰ−２０Ｐ（３００ｍＬ、三菱化学株式会社製）カラムに通過させＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を吸着した。このカラムを５０％メタノール水１．６リットルで洗浄した後、アセトン１．５リットルで溶出した。このＭＫ８４４−ｍＦ１０物質含むアセトン溶出液を濃縮乾固し、ヘキサン７０ｍＬとメタノール５０ｍＬとを加え溶解し十分撹拌した。このヘキサン−メタノール混合液は、静置すると２層に分離しＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は下層に含有された。これを集め減圧下で濃縮乾固を行いＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を含む粗抽出物２．６ｇを得た。
【００６１】
前記粗抽出物をメタノールで溶解し、セファデックスＬＨ−２０（内径３６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。５５０ｍＬ溶媒を展開した後、１フラクションを３ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３から２１に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、１．４ｇのＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を得た。
前記ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を少量のクロロホルム−メタノール混合溶媒で溶解し、シリカゲル６０（内径３６ｍｍ×１９０ｍｍ、メルク社製）カラムにのせクロマトグラフィーを行った。クロロホルム：メタノール＝５０：１（体積比）の混合溶媒３００ｍＬを用いカラムを洗浄した後、クロロホルム：メタノール＝９：１（体積比）の混合溶媒を９８０ｍＬ、次いでクロロホルム：メタノール：水＝４：１：０．２（体積比）の混合溶媒を３６０ｍＬ用い溶出した。１フラクションを１８ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション３０から７０にかけ溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、１４６ｍｇの純粋なＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を得ることができた。
【００６２】
得られたＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質が、下記構造式（Ａ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観は、黄色パウダー状である。
（２） 分子式は、Ｃ３８Ｈ３８Ｏ１３で表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：負イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ ７０１．２２４３（Ｍ−Ｈ）−であり、計算値は、ｍ／ｚ ７０１．２２２９（Ｃ３８Ｈ３７Ｏ１３として）である。
（４） 比旋光度は、［α］Ｄ２３＝＋１０２．１°（ｃ ０．１５， ＭｅＯＨ）である。
（５） 赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１ ： ３，７００〜３，２００、２，９２９、１，７１０、１，６７５、１，６３１、１，５９２、１，２７４、１，１２４、１，０７８
（６） 紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
λｍａｘ ｎｍ（ε） ：
メタノール中： ２７５（４３，０００）、２９２（４２，０００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 塩酸含有メタノール中： ２７５（４２，７００）、２９２（４１，８００）、３０５（３，５００）、４０６（５，７００）
０．００５Ｍ 水酸化ナトリウム含有メタノール中： ２７７（３６，０００）、２９５（３８，７００）、３０８（３，４００）、５０９（４，８００）
（７） プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図３に示す通りである。
（８） 炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で測定した炭素１３ＮＭＲスペクトルは、図４に示す通りである。
【化７】
また、実施例１で得られたＭＫ８４４−ｍＦ１０物質について、抗菌活性を以下の試験例１で、また酵素阻害活性を以下の試験例２で確認した。
【００６３】
（試験例１：抗菌活性）
メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＭＳＳＡ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＭＤＲＳＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、及びバンコマイシン低感受性黄色ぶどう球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ：ＶＩＳＡ）に対するに対するＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１の結果から、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌（ＭＤＲＳＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、及びバンコマイシン低感受性黄色ぶどう球菌（ＶＩＳＡ）に対して、抗菌活性を有していることがわかった。
【００６６】
（試験例２：酵素阻害活性）
−（１）ＹｙｃＧヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
枯草菌１６８株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８、東京農業大学より分譲）のＹｙｃＧに対するＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法に従って行った。
ＹｙｃＧのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０７番目のアミノ酸から６１１番目のアミノ酸を含む）（以下、「ｙｙｃＧｔｒｕ」と称することがある。）をＰＣＲ法により枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｙｙｃＧｔｒｕを大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＹｙｃＧのヒスチジンキナーゼ活性ドメインを発現させたタンパク質（以下、「ＹｙｃＧ−２０７−６１１」と称することがある。）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液は、０．５μＭ ＹｙｃＧ−２０７−６１１、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ 塩化カリウム、１００ｍＭ 塩化アンモニウム、及び５ｍＭ 塩化マグネシウムの組成とした。
この反応溶液に所定の濃度のＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を加え、３０℃で５分間インキュベートした。その後、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で１０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことによって、枯草菌のＹｙｃＧに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
なお、コントロールとしては、前記反応溶液にＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を添加せず、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、３０℃で１０分間インキュベートしたものを用いた。結果を表２に示す。
【００６７】
−（２）ＶｉｃＫヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
う蝕菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ（ａｍｅｒｉａｃｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手）のＶｉｃＫに対する、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法を改変して行った。
ＶｉｃＫのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から３１番目のアミノ酸から４５０番目のアミノ酸を含む）（以下、「ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０」と称することがある。）をＰＣＲ法により、う蝕菌の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＶｉｃＫのヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（以下、「ＶｉｃＫ−３１−４５０」と称することがある。）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液は、０．５μＭ ＶｉｃＫ−３１−４５０、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウムの組成とした。
この反応溶液７μＬに、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を１μＬ加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５μＭ ＡＴＰを２μＬ加え（終濃度２．５μＭ）反応を開始し、２５℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、う蝕菌のＶｉｃＫに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
なお、コントロールとしては、前記反応溶液にＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を添加せず、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５μＭ ＡＴＰを２μＬ加え、２５℃で２０分間インキュベートしたものを用いた。結果を表２に示す。
【００６８】
−（３）ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ＭＡＦＦ３０１３９３、農林水産省微生物遺伝資源（ＭＡＦＦ）より入手）のＰｅｈＳに対する、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質の酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４， ９１９−９２３， ２０００に報告された方法に従って行った。
ＰｅｈＳのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０９番目のアミノ酸から４８４番目のアミノ酸を含む）（以下、「ｐｅｈＳｃＭ２−２」と称することがある。）をＰＣＲ法により軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｐｅｈＳｃＭ２−２を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（以下、「ＰｅｈＳ−２０９−４８４」と称することがある。）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液は、４μＭ ＰｅｈＳ−２０９−４８４、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ 塩化カリウム、１００ｍＭ 塩化アンモニウム、５ｍＭ 塩化マグネシウムの組成とした。
この反応溶液に所定の濃度のＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を加え、３０℃で５分間インキュベートした。その後、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことによって、軟腐病菌のＰｅｈＳに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
なお、コントロールとしては、前記反応溶液にＭＫ８４４−ｍＦ１０物質を添加せず、２．５μＭ ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、３０℃で２０分間インキュベートしたものを用いた。結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
表２の結果から、ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌が有するヒスチジンキナーゼに対して、阻害活性を有していることがわかった。ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質は、特にＹｙｃＧに対して強い阻害活性を有していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の新規化合物（ＭＫ８４４−ｍＦ１０物質）は、優れた抗菌活性、及び優れた酵素阻害活性を有することから、新たな抗菌剤、及び酵素活性阻害剤として好適に利用できる。
【受託番号】
【００７２】
ＮＩＴＥ Ｐ−９０３
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物。
【化８】
【請求項２】
下記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
【化９】
【請求項３】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である請求項２に記載の化合物の製造方法。
【化１０】
【請求項４】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【化１１】
【請求項５】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
下記構造式（Ａ）で表される化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物。
【化１２】
【請求項７】
請求項６に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする抗菌剤。
【請求項８】
請求項６に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする酵素活性阻害剤。
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物。
【化８】
【請求項２】
下記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
【化９】
【請求項３】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である請求項２に記載の化合物の製造方法。
【化１０】
【請求項４】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【化１１】
【請求項５】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９０３のストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＭＫ８４４−ｍＦ１０株である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
下記構造式（Ａ）で表される化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物。
【化１２】
【請求項７】
請求項６に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする抗菌剤。
【請求項８】
請求項６に記載の化合物含有組成物を含むことを特徴とする酵素活性阻害剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−２０１８４３（Ｐ２０１１−２０１８４３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７３５１３（Ｐ２０１０−７３５１３）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【出願人】（０００１７３９１３）公益財団法人微生物化学研究会 (29)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【出願人】（０００１７３９１３）公益財団法人微生物化学研究会 (29)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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